KR20020073203A - 간세포암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유동물의 암을 예방하거나 치료하기 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 암세포는 세포 표면에서 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키며, 상기 방법은 포유류에게 알파 페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대한 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함하고, 여기서 면역 반응은 암세포에 대한 알파 페토프로테인 펩티드 특이적인 T 림프구를 활성화시키는 것을 포함한다. 본 발명은 알파 페토프로테인의 서열의 적어도 일부분을 갖는 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
Description
원발성 간암은 전세계 암 사망자의 주요 원인이다. 간세포암(HCC)이 가장 보편적인 타입의 원발성 간암이며, 1년에 약 120만 건이 전세계에서 발생한다. 남동아시아 및 사하라 이남 아프리카와 같은 일부 지역에서, 간세포암은 가장 보편적인 타입의 악성종양중 하나이다. 이들 질환의 높은 빈도는 이들 지역에서의 바이러스성 간염의 높은 발생과 관련되는 것 같다.
간세포암의 치료법은 현재 비전이성 질환에 걸린 개체에게 제한되어 있고 간이식의 존재 또는 부재하에 종양의 외과적인 절제와 관련되어 있다. 그러나 외과적 절제 및 이식 조차 절제후 재발로 인해 대부분의 종양을 치료하지 못한다. 치료를 위한 화학치료학적 접근법은 대개 비효과적이었다.
그러므로, 간세포암을 효과적으로 치료할 필요가 있다. 상기 치료는 이상적으로는 상기 질환이 가장 많이 발생하는 후진 개발도상국에 사용하기에 적합해야 한다. 또한, 상기 치료는 절제될 수 없는 종양 및 전이성 질환에 걸린 개체에 사용하기에 적절해야 한다.
발명의 요약
하나의 구체예에서, 본 발명은 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 방법에관한 것이며, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시킨다. 상기 방법은 포유동물에게 알파 페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대한 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역 반응은 암세포에 대한 알파 페토프로테인 펩티드 특이적인 T 림프구를 활성화시키는 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 알파 페토프로테인 펩티드 특이적인 T 림프구는 세포독성 T 림프구이다. 바람직한 구체예에서, 알파 페토프로테인 분자는 SEQ ID NO:2이다. 특히 바람직한 구체예에서, 알파 페토프로테인 분자는 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 구체예에서, 암은 간세포암이다. 또 다른 구체예에서, 포유동물은 사람이다.
바람직한 구체예에서, 면역 반응을 일으키는 단계는 알파 페토단백질 아미노산 서열의 적어도 일부분을 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 9, SEQ ID NO:2의 잔기 178 내지 186, SEQ ID NO:2의 잔기 218 내지 226, SEQ ID NO:2의 잔기 235 내지 243, SEQ ID NO:2의 잔기 306 내지 315, SEQ ID NO:2의 잔기 485 내지 493, SEQ ID NO:2의 잔기 492 내지 500, SEQ ID NO:2의 잔기 507 내지 516, SEQID NO:2의 잔기 547 내지 556 및 SEQ ID NO:2의 잔기 555 내지 563으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 면역 반응을 일으키는 단계는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 형성하는 하나 이상의 펩티드로 펄싱된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 면역 반응을 일으키는 단계는 알파 페토프로테인을 엔코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키고, 상기 방법은 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166 및 SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토단백질 분자의 적어도 일부분을 발현시키고, 상기 방법은 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키고, 상기 방법은 SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 9, SEQ ID NO:2의 잔기 178 내지 186, SEQ ID NO:2의 잔기 218 내지 226, SEQ ID NO:2의 잔기 235 내지 243, SEQ ID NO:2의 잔기 306 내지 315, SEQ ID NO:2의 잔기 485 내지 493, SEQ ID NO:2의 잔기 492 내지 500, SEQ ID NO:2의 잔기 507 내지 516, SEQ ID NO:2의 잔기 547 내지 556 및 SEQ ID NO:2의 잔기 555 내지 563으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키고, 상기 방법은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 형성하는 하나 이상의 펩티드로 펄싱된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함한다. 상기 하나 이상의 펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 325 내지 334 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드로 펄싱된 수상 세포로부터선택된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키고, 상기 방법은 알파 페토프로테인을 엔코딩하는 재조하 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166 및 SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334로 구성된 군으로부터 선택된, 암을 예방하거나 치료하기에 유용한 단리된 펩티드에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 포유동물이 알파 페토프로테인에 대한 면역 반응을 일으키기에 충분한 양으로 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166 및 SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 펩티드중 하나 또는 상기 조성물중 하나를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나치료하기 위한 means를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550에 따른 서열을 갖는, 암을 예방하거나 치료하기에 유용한 단리된 펩티드에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550에 따른 서열을 갖는 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 이러한 펩티드 또는 이들 조성물중 하나를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550에 따른 서열을 갖는 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 means를 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 간세포암을 치료하기 위해 단독 또는 혼합하여 사용될 수 있는 일군의 펩티드에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 단독 또는 혼합하여 투여함으로써 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법, 또는 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 펩티드로 펄싱되거나 알파 페토프로테인을 엔코딩하는 재조합 아데노바이러스(AdV) 벡터로 형질도입된 수상 세포를 투여함으로써 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
약 80%의 간세포암은 알파 페토프로테인 발현을 재활성화시킨다. 뮤린과 사람 둘 모두의 T 세포 레퍼토리는 MHC 클래스 I의 환경에서 AFP-유래된 펩티드 에피토프를 인식할 수 있다. 그러므로, 배 발생 동안 이러한 종양성태아성 단백질의 높은 혈장 레벨에 노출됨에도 불구하고 모든 AFP-특이적 T 세포가 면역계의 개체발생 동안 제거되는 것은 아니다.
본 발명은 HLA-A*0201의 환경에서 프리젠테이션되는 경우 사람 T 세포 레퍼토리에 의해 인식되는 사람 알파 페토프로테인, 즉 SEQ ID NO:2로부터 유래된 펩티드의 동일성의 결정과 관련있다. 하기 표 1에 요약된 바와 같이, 4가지 AFP-유래된 펩티드가 확인되었고, "도미넌트(dominant)" 펩티드로 칭하였다. 이들은 PLFQVPEPV, hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; FMNKFIYEI, hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166; GLSPNLNRFL, hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334; 및 GVALQTMKQ, hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550이다. 각각은 한개 또는 두개의 앵커 잔기를 가지고 있다.
각각의 도미넌트 펩티드는 농도-의존성 클래스 I 결합 검정에서 T2 세포상에 HLA-A*0201을 안정화시켰다. 상기 펩티드는 오프-카이네틱스(off-kinetics) 검정에서 2 내지 6시간 동안 안정하였다. 또한, 각각의 도미넌트 펩티드는 몇가지 정상적인 HLA-A*0201 공여체로부터 시험관내에서 펩티드-특이적 T 세포를 유도시켰다. 중요하게는, 이들 hAFP 펩티드-특이적 T 세포는 또한 세포독성 검정 및 IFNg ELISPOT 검정 둘 모두에서 HLA-A*0201+/AFP 포지티브 종양 세포를 인식할 수 있었다. 이러한 정보를 요약하였다.
표 1
도미넌트 펩티드의 요약
| 펩티드 | 위치 | 서열 | 앵커 | T2 결합 농도 | 상대적인오프 카이네틱스 |
| hAFP137-145 | 137-145 | PLFQVPEPV | 2 | 2.5 mM | 4 시간 |
| hAFP158-166 | 158-166 | FMNKFIYEI | 2 | 0.5 mM | 4 시간 |
| hAFP325-334 | 325-334 | GLSPNLNRFL | 2 | 10 mM | 2 시간 |
| hAFP542-550 | 542-550 | GVALQTMKQ | 1 | > 100 mM | 6 시간 |
본 발명에서 입증되는 바와 같이, 이들 T 세포의 활성화는 전문적인 항원 프리젠테이션 수상 세포에 의한 프리젠테이션을 포함하여, 면역자극 환경에서 이들 도미넌트 펩티드를 프리젠테이션시킴으로써 달성될 수 있다. 알파 페토프로테인 cDNA, 즉 SEQ ID NO:1을 엔코딩하는 재조합 아데노바이러스(AdV) 벡터로 형질도입된 수상 세포는 MHC의 환경에서 4가지 도미넌트 펩티드 에피토프를 프로세싱하여 프리젠테이션시킬 것이고 AFP-특이적 T 세포 활성화를 유도할 것이다. 유사하게 면역화된 HLA-A*0201/Kb마우스는 또한 사이토카인 방출 검정에서 AFP 펩티드-펄싱된 세포를 인식하였다. 또한, AFP 펩티드-자극된 사람 및 HLA-A*0201/Kb마우스 T 세포 반응은 hAFP-조작된 표적을 인식하였고, 조금 덜한 정도로, 천연 AFP-발현 사람 간세포암 세포를 인식하였다. 마지막으로, 질량 스펙트로메트리를 사용하여 HLA-A*0201 + HCC 세포로부터 용리된 펩티드의 복합 혼합물로부터 3가지 이상의 AFP 에피토프를 확인하였다. 따라서, 여러가지 증거는 이들 4가지 도미넌트 펩티드 각각이 면역원성이고 HLA-A*0201의 환경에서 천연적으로 프로세싱되어 프리젠테이션됨을 제공하였다.
그 밖의 10가지 펩티드("서브도미넌트" 펩티드라 칭함)는 약하거나 덜한 재현성있는 반응을 가졌지만 하나 이상의 검정 타입에서 포지티브였다. 이들 10가지 펩티드는 MKWVESIFL, SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 9; ILLWAARYD, SEQ ID NO:2의 잔기 178 내지 186; LLNQHACAV, SEQ ID NO:2의 잔기 218 내지 226; FQAITVTKL, SEQ ID NO:2의 235 내지 243; TTLERGQCII, SEQ ID NO:2의 잔기 306 내지 315; CIRHEMTPV, SEQ ID NO:2의 잔기 485 내지 493; PVNPGVGQC, SEQ ID NO:2의 잔기 492 내지 500; NRRPCFSSLV, SEQ ID NO:2의 잔기 507 내지 516; TMKQEFLINL, SEQ ID NO:2의 잔기 547 내지 556 및 NLVKQKPQI, SEQ ID NO:2의 잔기 555 내지 563이다.
본 발명의 조성물 및 방법을 하나 이상의 도미넌트 펩티드, 즉, hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166; hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325-334; 및 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550를 사용한다는 문맥으로 주로 설명하였지만, 하나 이상의 4가지 도미넌트 펩티드를 대신하거나 이와 함께 하나 이상의 10가지 서브도미넌트 펩티드를 사용하는 것은 본 발명의 범위내에 포함된다.
도미넌트 펩티드 및 서브도미넌트 펩티드의 확인에 대해 더욱 상세하게 논의할 것이다. 우선, hAFP, SEQ ID NO:2로부터의 펩티드 서열들(Genbank 수탁 번호: J00077, J00076 및 V01514)은 HLA-A*0201에 잠재적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 이들 펩티드는 길이가 9 내지 10개의 아미노산이고, 위치 2에 아미노산 이소류신, 류신 및 메티오닌이 존재하거나, 펩티드 길이에 따라 펩티드 위치 9 또는 10에 아미노산 이소류신, 류신 및 발린을 가질수 있거나 둘 모두일 수 있다. 이러한 74개 펩티드를 위스콘신 대학교 유전학 컴퓨터 그룹 프로그램 "파인드 패턴스(find patterns)"를 사용하여 확인하여 hAFP 서열, 즉 SEQ ID NO:2를 스크리닝하였다. 각각의 74개 펩티드를 표준 기술을 사용하여 합성하였다.
각각의 74개 펩티드 후보를 HLA-A*0201 안정화 검정에서 T2 세포에 대한 농도 의존성 결합에 대해 시험하였다. 세포 표면 MHC 클래스 I 분자를 증가시키기 위해 전날밤 실온에서 인큐베이션시킨 T2(TAP 결핍) 세포를 0.1 mM 내지 100 mM의 펩티드 농도로 각 펩티드와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. HLA-A*0201의 안정성을 세포를 안티-HLA-A2 항체(BB7.2) 및 염소 항마우스-FITC를 사용하여 염색시킨 후에 유동 세포계측법에 의해 검정하였다. Flu 매트릭스 펩티드(aa 58-66)(Flu)에 강력하게 결합한 HLA-A*0201을 포지티브 대조군으로서 사용하였다.
다음으로, MHC-펩티드 복합체 안정성을 오프-카이네틱스 검정을 사용하여 결정하였다. HLA-A*0201 LCL을 온화한 pH3.2 시트레이트-포스페이트 산 완충액으로 제거하였다. 각 펩티드를 즉시 실온에서 3 ug/ml의 b2 마이크로글로불린의 존재하에 1시간 동안 200 mM에서 세포상에 펄싱시켰다. 초과 펩티드를 씻어내고 세포를 37℃에서 0, 2, 4 및 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 시간지점이 끝날 때 세포를 세척하고 세포 표면 HLA-A2 발현에 대해 염색한 다음, 유량 세포계측법에 의해 분석하였다. 펩티드-MHC 클래스 I 복합체는 평균 형광 강도가, 제거되었지만 펩티드로 펄싱되지 않은 세포로부터 1.5배 이상 증가한 경우 안정하다고 생각되었다.
그런 다음 4가지 도미넌트 펩티드에 대해 추가적인 면역학적 연구 및 물리화학적 연구를 수행하였다. 이들 연구는 (1) 펩티드 특이적이면서 인식된 네이티브 AFP를 발현 세포인 AFP 펩티드-특이적 사람 T 세포 배양물을 제조하기 위해 펩티드를 사용하고; 및 (2) 도미넌트 펩티드로 펄싱된 AFP 네가티브 세포 뿐만 아니라 AFP 포지티브 세포를 인식하는 AFP 특이적 사람 T 세포를 제조하기 위해 AdVhAFP-형질도입된 수상 세포를 사용하는 시험관내 연구; 및 (1) 펩티드 및 AFP 포지티브 세포를 인식하는 비세포(splenocyte)를 갖는, 펩티드로 면역화된 트랜스제닉 마우스; 및 (2) 도미넌트 펩티드로 펄싱된 AFP 네가티브 세포 뿐만 아니라 AFP 포지티브 세포를 인식하는 AdVhAFP/DC 면역화된 마우스를 사용하는 생체내 연구를 포함하였다. 이들 연구는 도미넌트 펩티드가 면역원성이고, AFP 자체가 면역원성이고, 도미넌트 펩티드가 천연적으로 프로세싱되어 AFP 포지티브 세포의 표면상에 프리젠테이션되고 AFP/DC 또는 도미넌트 펩티드 둘 모두가 사이토카인을 제조하고 AFP 포지티브 세포를 사멸시키는 AFP-특이적 T 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있음을 보여주었다. 또한, 질량 스펙트로스코피를 사용하여 AFP 포지티브 간세포암 세포의 표면으로부터 AFP 펩티드를 물리적으로 확인하였다.
우선, 나이브 HLA-A*0201 사람 T 세포 배양물의 반복적인 펩티드 자극을 수행하여 사람 T 세포 레퍼토리의 환경에서 펩티드 면역원성 및 AFP-트랜스펙션된 표적을 인식하는 펩티드-특이적 T 세포의 능력을 입증하였다. 벌크 T 세포 배양물을 각 도미넌트 AFP-유래된 펩티드(KLH, IL-7 및 IL-2로 보충됨)로 펄싱된 PBMC로부터 생성시키고 펩티드-펄싱된 표적 및 AFP-발현 표적 둘 모두를 인식하는 능력에 대해 3주 내지 7주의 확장을 시험하였다. 이 배양물은 특이적 펩티드-펄싱된 JY 세포의인식시에 IFNg를 분비하는 능력에 의해 입증된 바와 같이 펩티드-특이적 T 세포를 확장시켰고 ELISPOT 검정에서 대조군 MART-127-35펄싱된 JY는 그렇지 않았다. AFP 펩티드-특이적 벌크 T 세포는 또한 IFNg-생성 AFP-특이적 T 세포의 증가된 빈도에 의해 밝혀진 바와 같이 변형되지 않거나 AdVhAFP 없이 형질도입된 모세포와 비교하여 AFP 네가티브 안정하게 트랜스펙션되고 AdVhAFP-형질도입된 HLA-A*0201 흑색종 세포(M202) 둘 모두를 인식하였다. HLA-A*0201+, 천연적으로 AFP-발현 간세포암 세포주 HepG2(HLA-A2-/AFP 포지티브 HCC 라인 Hep3B과 비교하여)를 인식하는 능력을 평가하기 위해, 세포독성 및 ELISPOT 검정 둘 모두를 수행하였다.
또한, CTL을 AdV 형질도입된 수상 세포로부터 생성시켰다. 요약하면, GM-CSF 및 IL-4와 함께 인큐베이션된 PBMC로부터 제조된 수상 세포를 2시간 동안 1,000의 다중감염도(moi)로 AdVhAFP 또는 AdVMART1으로 형질도입시켰다. 형질도입된 수상 세포를 세척하고, 조사시키고 1 내지 2 x 105세포/ml로 플레이팅하여 CTL 생성을 위한 자극제로서 역할하도록 하였다. 자가 비-부착 세포를 마그네틱 비드 디플레션(magnetic bead depletion)에 의해 CD4, CD14, CD19 및 CD56+ 세포를 고갈시켜 CD8+ 부화된 반응 세포(군집 일반적으로 80% CD8+, 자료 제시안함)를 제조하였다. CD8+ 세포를 5% 자가 매질과 IL-7 10 내지 25 ng/ml 중에 형질도입된 수상 세포와 함께 2 x 106세포/ml로 플레이팅하였다. 3 내지 4일 마다 IL-2 10U/ml을 배양물에 보충하였다. CD8+ CTL을 1 수상 세포 대 10 내지 20 CD8+ CTL의 비로 신선한 자가 AdV-형질도입된 수상 세포를 사용하여 매주 재자극시켰다. 대부분의 배양물은 일주일마다 기본으로 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대한 표현형을 나타내었다. 각 도미넌트 펩티드는 몇몇 정상적인 HLA-A*0201 공여체로부터 시험관내에서 펩티드-특이적 T 세포를 유도시켰다.
AdVhAFP/DC 시험관내 자극된 사람 T 세포는 CTL 및 ELISPOT 검정 둘 모두에서 hAFP-트랜스펙션된 표적을 특이적으로 인식했기 때문에, 다음으로 4가지 도미넌트 펩티드가 AdVhAFP/DC 자극된 T 세포에 의해 특이적으로 인식되는 지를 결정하기 위해 이들을 연구하였다. 7일 내지 21일 배양시킨 후에, AdVhAFP/DC로 매주 자극된 CD8-부화된 T 세포를 hAFP 펩티드-특이적 IFNg 사이토카인 생성 세포의 세포독성 및 빈도 둘 모두에 대해 시험하였다. AdVhAFP/DC T 세포 배양물은 4가지 AFP 펩티드 각각에 의해 펄싱된 JY 세포에 대해 세포독성이었고, 이는 이들 펩티드에 대한 CTL이 정상 공여체의 말초혈로부터 확장될 수 있음을 시사한다. 자가 펩티드 펄싱된 LCL 또는 JY 세포로 재자극시킨 후에, 이들 벌크 배양물은 또한 AFP 펩티드에 특이적인 IFNg-분비 세포의 빈도가 MART-127-35에 비해 훨씬 높았으며, 이는 hAFP542-550에 추가적으로, 3가지 다른 도미넌트 펩티드가 또한 AdVhAFP-형질도입된 수상 세포에 의해 천연적으로 프로세싱되어 프리젠테이션됨을 시사한다.
AdVhAFP/DC 자극된 T 세포 배양물은 또한 A*0201+/AFP 포지티브 간세포암 라인 HepG2를 인식하지만 A*0201-/AFP 포지티브 HCC 라인 Hep3B는 인식하지 않는 사이토카인-생성 세포의 빈도가 낮았다. Th1 사이토카인 IFNg 및 TNFa를 합성하는 T 림프구가 검출되었지만, Th2 사이토카인 IL-4는 검출되지 않았다. 또한 IL-10은간세포암 라인이 T 세포 부재하에 플레이팅된 경우 검출되었으며, 이는 이러한 사이토카인의 생성이 종양 세포-유래되었음을 시사한다.
하기와 같이 HLA-A*0201/Kb트랜스제닉 마우스를 사용하여 74개의 펩티드를 스크리닝하고 이들 펩티드중 어떤 것이 면역원성이고, HLA-A*0201의 환경에서 천연적으로 프로세싱되어 프리젠테이션되는 지를 결정하였다. HLA-A*0201/Kb트랜스제닉 암컷 마우스를 처음에 할란-스프라그 돌리(Harlan-Sprague Dawley; Indianapolis, IN US)로부터 구입하였고, 로스 앤젤레스에 소재한 캘리포니아 대학교의 방사선 종양학과의 동물 시설에 의해 현재 사육되고 있다.
펩티드 면역화를 위해, 마우스에 100 ㎍ AFP 또는 완전 프로인트 애쥬번트중에 1:1로 에멀션화된 대조 펩티드를 피하적으로 주입하였다. 완전 프로인트 애쥬번트중에 에멀션화된 각 펩티드로 면역화시킨 후에, 배출된 림프절 세포는 hAFP로 안정하게 트랜스펙션된 세포의 인식시에 IFNg를 생성시켰다. 또한, 알파 페토프로테인 펩티드-특이적 T 세포는 AFP-발현 아데노바이러스(AdVhAFP)로 형질도입된 수상 세포로 면역화된 마우스의 비장에서 확인될 수 있었다. 따라서, 사익 4가지 도미넌트 펩티드는 클래스 I의 환경에서 천연적으로 프로세싱되고 프리젠테이션되며 면역원성이다.
다음으로, 이들 4가지 도미넌트 펩티드의 생체내 면역원성을 확인하였다. HLA-A*0201/Kb마우스를 동계의(syngeneic) 수상 세포상에 펄싱된 각 도미넌트 펩티드로 면역화시켰다. IFNg 특이적 ELISPOT 검정을 면역화 도미넌트 펩티드(또는MART-1 펩티드) 또는 주르카트(Jurkat)/AFP 또는 주르카트/MART 트랜스펙션된 세포주를 사용하여 시험관내에서 재자극된 비세포(splenocyte)를 사용하여 수행하였다. 각 hAFP 펩티드를 사용한 면역화 및 펩티드 또는 주르카트/AFP를 사용한 후속적인 재자극은 다수의 AFP-특이적 IFNg-생성 세포를 유도시켰다. PBS 주입된 마우스로부터의 림프구는 재자극에 상관없이 세포독성이나 IFNg 생성을 보여주지 않았다. MART-127-35펩티드로 면역화된 마우스는 MART-1 특이적 반응을 생성시켰지만 AFP 펩티드 반응은 생성시키지 않았다.
그런 다음, 수상 세포를 GM-CSF에서의 차별화에 의해 골수 선조로부터 제조하였고 hAFP cDNA, 즉 SEQ ID NO:1을 포함하는 재조합 AdV 벡터(AdVhAFP)를 사용하여 형질도입시켰다. 시험관내에서 배양된 수상 세포를 100의 moi로 RPMI/2% FCS에서 형질도입시켰다. 형질도입을 37℃에서 2시간 동안 수행하였다. 그런 다음 수상 세포를 세척하고 주입을 위한 동물 당 0.2 ml PBS 당 5 x 105수상 세포로 재현탁시켰다. 모든 경우에서 생존능력은 95%를 초과하였다. 면역화시킨지 2주 후에, 마우스로부터의 비세포를 hAFP(주르카트/AFP) 또는 MART-1(주르카트/MART)로 안정하게 트랜스펙션된 주르카트 세포로 재자극시켰다. AFP-특이적 IFNg-방출 대 MART-1 특이적 IFNg-방출의 빈도를 p<0.02인 3개의 독립 실험을 평균하여 ELISPOT에 의해 결정하였다. 세포독성을 5시간51Cr-방출 검정에서 주르카트/AFP 및 주르카트/MART에 대해 검정하였다.
다음으로, HPLC 및 질량 스펙트로메트리에 의한 확인을 HLA-A*0201 사람 간세포암 라인으로부터 용리된 도미넌트 펩티드상에서 수행하였다. 이들 분석의 결과의 요약을 하기 표 2에 기재하였다.
펩티드를 용리시키기 위해, HepG2 및 Hep3B 세포를 PBS로 3회 세척한 후에 pH 3.2인 시트레이트-포스페이트 완충액 5 ml과 함께 1분 동안 인큐베이션시켰다. 이 현탁액을 원심분리시키고(800x g, 5분) 무세포 상층액 500 ml 전부를 각 세포주에 대해 수집하였다. 이 재료를 동결건조시키고 -20℃에 보관하였다.
동결된 재료를 물/아세토니트릴/트리플루오로아세트산(W/A/TFA, 95/5/0.1 부피비) 30 ml중에 재용해시켰다. 이 용액을 W/A/TFA중에서 평형화된 분석 역상 HPLC 컬럼(키스톤 사이언티픽(Keystone Scientific) C18베타실, 250 mm x 2 mm, 5 mm 입자 크기, 100 Å 포어 크기)상에 0.2 ml/분의 유속으로 펌핑하였다. 상기 컬럼을 아세토니트릴(시간/% 아세토니트릴 = 0/5, 5/5, 55/100, 60/100)중의 0.1% TFA의 증가하는 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. 컬럼 용리물 흡수치를 215 nm 및 280 nm에서 모니터링하였고 1분 분획을 수집하였다. 면역자극 펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드의 체류 시간을 분리 컬럼상에 동일한 분리 구배를 사용하여 수득하였다.
MALDI-TOF 질량 스펙트로메트리를 수행하여 AFP 생성 간세포암 세포주 HepG2(HLA-A2+) 및 Hep3B(HLA-A2-)로부터 용리된 HPLC 분획화된 펩티드 산을 분석하였다. 장치(Voyager-REACTION PRODUCTS (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-Of-Flight(MALDI-TOF))를 사용하여 질량 스펙트럼을 획득하였다. 상기 장치는 스테인레스강 표적을 사용하며, 그 위에 샘플이 증착되고 건조된다. 모든 스펙트럼을 인슐린을 사용하여 외부적으로 보정하였으며, 그 결과 질량 정확도는 전형적으로 ±0.1% 이내였다. 동결된 HPLC 분획들을 0.1% TFA를 함유한 70% 아세토니트릴 10 ㎕중에 재현탁시켰다. 이 재료 1 ㎕를 매트릭스 a-시아노-4-하이드록시신남산(Sigma, 70% ACN/0.1% TFA중에 10 mg/ml) 1㎕와 함께 점적하였다. 스펙트럼을 m/z 500-7000으로부터의 스캐닝에 의해 수득하였다.
HPLC 분획의 MALDI 분석은 자주 소수의 우세한 시그널을 가졌지만, 거의 모든 분획이 700 내지 1500 Da의 질량의 20종의 상이한 펩티드를 함유함을 확립시켰다. 이러한 복합 혼합물 이외에, 피크는 hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 wksrl 158 sowl 166; hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334; 및 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550의 계산된 모노등방성의 양자화된 분자((M+H)+)에 상응하는 m/z 값을 가진 것으로 확인되었고, hAFP542-550, hAFP158-166및 hAFP325-334는 HepG2 세포로부터 용리된 펩티드 푸울중에 존재한다. m/z 975.6의 펩티드는 HepG2 페티드 푸울로부터의 하나의 HPLC 분획에서 확인되었다. hAFP542-550의 계산된 (M+H)+는 975.5였고 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550에 상응하는 아미노산을 갖는 합성 펩티드의 체류 시간은 21.2 분이었다. 또한, 975.5±1의 m/z에서는 매트릭스를 단독으로 사용한 샘플 및 Hep3B 용리로부터의 HPLC 분획 18 내지 22에서 어떠한 시그널도 관찰되지 않았다. 유사하게, hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166 및 hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334의 계산된 (M+H)+에 사응하는 m/z를 갖는 피크가 표준 펩티드의 양상으로부터 예측된 HepG2로부터 유래된 적합한 분획에서 발견되었다. 이들 피크는 Hep3B로부터 용리된 펩티드 푸울중의 분획에서 부재했었다. 1152.2 m/z에서의 피크가 하나의 분획에서 관찰되었는데, 이는 hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334의 나트륨 첨가생성물의 존재를 시사한다.
그러므로, 잠재적인 질량 후보물질은 HLA-A*0201 포지티브 HepG2 세포로부터 용리된 HPLC 분획화된 펩티드 푸울중의 4가지 펩티드중 3가지에 대해 확인되었지만 HLA-A*0201 네가티브 Hep3B 세포로부터는 확인되지 않았다. 확인된 3가지 펩티드에서, 피크는 점적 샘플의 반복된 스캐닝에서 관찰되었다. m/z 1020.9에서 폭넓은 피크는 HepG2 펩티드 푸울로부터의 하나의 분획에서 관찰되었으며 이는 이러한 물리화학적 분석에 의해 허용된 오차의 한계를 넘은 것이었다. 그러므로, HepG2 세포의 표면상에 hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145의 존재를 입증하는 것은 불가능하였다.
면역학적으로 이들 분획에 도미넌트 펩티드의 존재를 확인하기 위해, HepG2 또는 Hep3B 세포로부터의 각 HPLC 분획 1 ml을 사용하여 ELISPOT 검정에서 AdVhAFP/DC 면역화된 뮤린 비세포를 재자극하였다. 200 내지 250 스팟/106세포가 도미넌트 펩티드를 함유한 분획으로부터 관찰되었고, 100 내지 130 스팟/106세포는다른 분획으로부터 관찰되었고, 최대 50 스팟/106세포는 Hep3B 분획으로부터 관찰되었다. 이것은 도미넌트 펩티드의 질량 스펙트로메트리 확인을 추가로 지지한다.
표 2
| 펩티드1 | 펩티드의HPLC 지체시간 (분)2 | 계산된(M+H)+,3 | HepG2에서관찰된(M+H)+,4 | Hep3B에서관찰된(M+H)+,5 | HPLC분획 #6에서 확인된(M+H)+6 | 면역학적으로반응성인 분획(IFNg ELISPOT)7 | |
| HepG2 | Hep3B | ||||||
| hAFP542-550 | 21.2 | 975.5 | 975.6 | 없음 | 21 | 20, 21 | 0 |
| hAFP158-166 | 28.9 | 1204.6 | 1204.9 | 없음 | 28 | 27, 28, 29 | 0 |
| hAFP137-145 | 28.1 | 1025.6 | 없음 | 없음 | - | 27, 28, 29 | 0 |
| hAFP325-334 | 27.7 | 1130.6 | 1130.1 | 없음 | 28 | 27, 28, 29 | 0 |
주석. 1. 펩티드 확인. 2. 대조 합성 펩티드의 전형적인 HPLC 지체 시간. 3. 예상된 질량/전하 측정치. 4. HepG2로부터의 산-용리된 펩티드에서 관찰된 질량/전하 측정치. 5. Hep3B로부터의 산-용리된 펩티드에서 관찰된 질량/전하 측정치. 6. HepG2로부터의 산-용리된 펩티드에서 관찰된 hAFP 펩티드 질량/전하 측정치의 분획(분). 7. IFNg ELISPOT에 의해 AdVhAFP/DC 프라이밍된 비세포를 재자극할 수 있는 펩티드를 함유하는 분획.
실시예 I
펩티드를 투여함으로써 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법
본 발명의 하나의 구체예에 따라, 간세포암에 걸린 환자를 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 AFP 포지티브 간세포암에 걸린 HLA-A*0201+와 같은 적합한 환자를 선택하는 것을 포함한다. 다음으로, 환자에게 본 발명의 하나이상의 펩티드를 투여한다. 상기 펩티드는 충분한 양으로 투여되고, 바람직하게는, 상기 투여는 여러번 반복됨으로써 AFP에 대한 면역 반응을 일으켜 간세포암에 대한 면역 반응을 일으킨다.
바람직한 구체예에서, 펩티드는 hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166; hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334; 및 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550의 혼합물이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 펩티드가 2회 내지 5회 투여된다. 특히 바람직한 구체예에서, 펩티드는 3회 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 펩티드는 2주 간격으로 3회 투여된다.
바람직한 구체예에서, 상기 펩티드는 피내적으로 투여되지만, 본원의 명세서를 참고로 하여 당업자에게 이해되는 바와 같이 그 밖의 투여 경로도 적합하다.
바람직한 구체예에서, 하나 이상의 펩티드 각각은 4가지 펩티드가 혼합되는 경우, 이들이 몬타니드(Montanide) ISA-51 2 ml 전체에 에멀션화되어 투여되도록, 몬타니드 ISA-51 0.5 ml중에 에멀션화되어 투여된다. 상기 에멀션화된 펩티드 또는 펩티드들을 4개의 동일한 용량으로 나누고 각 용량을 개별적인 부위에 투여하였다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 펩티드를 각각 약 50 ㎍ 내지 2000 ㎍의 용량으로 투여하였다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 펩티드를 각각 약 100 ㎍ 내지 1000 ㎍의 용량으로 투여하였다. 특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 펩티드를 약 500 ㎍의 용량으로 투여하였다.
본 발명의 방법 및 조성물을 AFP 포지티브/A2.1+ 간세포암에 걸린 몇몇 환자를 치료하기 위해 사용하였다. 각 환자를 본 방법에 따라 4가지 펩티드 hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166; hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334; 및 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 면역화시켰다. 상기 펩티드들을 몬타니드 ISA-51 0.5 ml중에 에멀션화시키고 전체 2 ml로 혼합하였다. 에멀션화된 펩티드를 4개의 동일한 용량으로 나누고 각 용량을 개별적인 부위에 투여하였다. 말초 T 세포 반응을 ELISPOT 및 테트라머 검정에 의해 측정하였다. 이들 시도는 4가지 AFP-유래된 펩티드가 면역화 이전에 혈청에서의 AFP 레벨이 극도로 높은 환자에서 조차도 생체내에서 면역원성임을 보여주었다.
AFP-A1으로 지정된 첫번째 환자는 재발성의 절제될 수 없는 AFP 포지티브/A2.1+ 간세포암에 걸려 있었다. 이 환자에게 2주 간격으로 몬타니드 ISA중의 각각의 4가지 펩티드 100 ㎍을 3회 면역화 투여하였다. 대등한 시험관내 PBMC 배양물을 또한 면역화 이전에 첫번째 환자의 혈액으로부터 확립시키고 각 펩티드를 사용하여 반복적으로 펄싱시켰다. ELISPOT에 의해 검사된 제 28일에 배양물의 모든 펩티드의 인식은 시험관내에서 명백하였고 테트라머에 의해서는 3가지 중 2가지, 즉 hAFP137, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; 및 hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334는 그러했지만 hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지166은 그러하지 않았다. AFP542-특이적 T 세포의 존재는 AFP542펩티드 테트라머가 이들 반응물이 제조되는 경우 수월하게 폴딩될 수 없기 때문에 테트라머에 의해 평가될 수 없었다. 생체내에서 반응은 hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166; 및 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550를 명백하게 인식하였고; 제 2 및 제 3 면역화후에는 hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334를 인식하는 경향을 띠는 것으로 나타났다.
AFP-A2로 지정된 두번째 환자는 에탄올-유도된 간경변의 병력을 가진 70세의 백인 남성이었고, B형 간염 및 C형 간염에 대해 네가티브였다. 환자는 부풀어 있는 것으로 보였으며 좌간엽에 8 cm 덩어리가 있는 것으로 밝혀졌다. 프리젠테이션에서 환자의 AFP 레벨은 10,400 ng/ml이었다. 간의 생체검사에 의해 경변성 간에서 잘 구별된 간세포암이 드러났다. 환자에게 항진균제 FV-462를 사용하여 실험적 시도를 수행하였지만 질환은 진행되고 이독성을 나타냈다. 프리젠테이션 6개월 후에, 본 발명에 따른 프로토콜을 사용하여 4가지 펩티드 hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166; hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334; 및 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550의 혼합물을 환자에게 수행하였다. 환자를 2주 간격으로 2회 면역화시켰다. 2회 면역화 이후의 테트라머 및 ELISPOT 데이터는 T 세포 반응이 모든 4 AFP 펩티드 에피토프에 대해 검출되었음을 보여주었다.
그러므로, 이러한 결과는 본 방법이 진행된 간세포암에 걸린 환자의 AFP-특이적 T 세포에 의해 검출할 수 있는 면역 반응을 생성시킴을 시사하였다.
실시예 II
본 발명의 펩티드로 펄싱된 수상 세포를 투여함으로써 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법
본 발명의 하나의 구체예에 따라, 간세포암에 걸린 환자를 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 AFP 포지티브 간세포암에 걸린 HLA-A*0201+환자와 같은 적합한 환자를 선택하는 것을 포함한다. 다음으로, 이 환자에게 본 발명의 하나 이상의 펩티드로 펄싱된 수상 세포를 투여한다. 수상 세포는 충분한 용량으로 투여되며, 바람직하게는, 투여는 AFP에 대한 면역 반응을 생성시키기 위해 여러번 반복되며, 이로써 간세포암에 대한 면역 반응이 생성된다.
바람직한 구체예에서, 수상 세포는 hAFP137-145, SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145; hAFP158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166; hAFP325-334, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334; 및 hAFP542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550의 혼합물로 펄싱된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 2회 내지 5회 투여된다. 특히 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 3회 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 2주 간격으로 3회 투여된다.
바람직한 구체예에서, 수상 세포는 피내적으로 투여되지만, 본 명세서를 참고로 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 그 밖의 투여경로도 적합하다. 하나의 구체예에서, 수상 세포는 약 1 x 105내지 1 x 108의 용량으로 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 약 1 x 106내지 1 x 107의 용량으로 투여된다. 특히 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 약 5 x 106의 용량으로 투여된다.
수상 세포를 당분야에 공지된 기술에 따라 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨-4(IL-4)에 조직 배양액중에서 1주 동안노출된 부착성 자가 말초혈 단핵 세포로부터 제조하였다. 단핵 세포를 Ficoll-Hypaque 원심분리에 의한 단일 백혈구분리반출법으로부터 수득된 세포로부터 단리하였다. 해동된 단핵 세포를 염수중에 1회 세척하고 2.5 내지 5 x 106생세포/ml의 농도로 2 내지 4 x 107세포/25cm2코스타 플라스크(Costar flask)로 플레이팅하였다(RPMI 1640 + 5% 열-불활성화된 자가 혈청 + 젠타마이신). 37℃에서 2시간 동안 부착시킨 후에, 비부착 세포를 염수로 세척함으로써 제거하였다. 부착 세포를 rhGM-CSF(800 U/ml) 및 rhIL-4(500 U/ml)의 존재하에 7일 동안 완전 배지에서 배양하였다. 임상 등급 GM-CSF는 이뮤넥스(Immunex), IL-4는 쉐링-플로프(Schering-Plough)로부터 입수하였다.
환자에게 백혈구분리반출법을 수행하여 2 x 109이상의 PBL을 수득하고, 이를 70% RPMI 1640, 20% 자가 혈청 및 10% DMSO중에 냉동보존하였다. 분취액을 연구하는 날-7, 7 및 21일에 해동시켰다. 자가 혈청을 위한 혈액(60 ml)을 백혈구분리반출법 수행시 및 제 1 면역화 시행일에 해동시키고, 이는 모든 세포 배양물에 대해 충분하였다. 본 발명의 AFP-유래된 면역도미넌트 펩티드를 당분야에 공지된 기술에 따라 제조하고 정제하였다.
환자를 다음과 같이 면역화시켰다. 면역화 제 1일에, 수상 세포를 수집하고, 멸균 염수로 1회 세척하고 1 mL의 무혈청 RPMI 1640 및 각각 별도의 50 mg/ml의 4가지 면역도미넌트 펩티드중에 적절한 농도, 예컨대 106으로 재현탁시켰다. 최소 1시간 인큐베이션 후에, AFP 펩티드/DC를 펠렛화시키고 멸균 염수중에 3회 세척하였다. 세포를 트립판 블루에서 카운팅하고 내피 주입을 위해 0.1 ml 멸균 염수중에 재현탁시켰다.
전체 용량을 투여하기 전에, 피검자는 염수 0.1 ml중의 이들 용량의 1/100을 사용하는 피부 시험을 받을 것이다. 30분 관찰한 후에, 피검자의 겨드랑이 아래 측면부, 또는 서혜부의 아래 또는 위에 염수 0.1 ml중에 피내적으로 투여된 AFP 펩티드-펄싱된 수상 세포의 전체 용량을 투여할 것이다. 환자를 면역화후 2시간 동안 모니터링하였다. 바람직하게는, 환자를 50 mg의 디펜하이드라민 및 650 mg의 타이레놀을 사용하여 경구적으로 전처리하였다.
실시예 III
사람 AFP 아데노바이러스-형질도입된 수상 세포를 투여함으로써 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법
본 발명의 하나의 구체예에 따라, 간세포암에 걸린 환자를 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 AFP 포지티브 간세포암에 걸린 HLA-A*0201+환자와 같은 적합한 환자를 선택하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 환자에게 사람 AFP 아데노바이러스-형질도입된 수상 세포가 투여된다. 수상 세포는 충분한 용량으로 투여되며, 바람직하게는, 투여는 AFP에 대한 면역 반응을 생성시키기 위해 여러번 반복되며, 이로써 간세포암에 대한 면역 반응이 생성된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 2회 내지 5회 투여된다. 특히 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 3회 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 2주 간격으로 3회 투여된다.
바람직한 구체예에서, 수상 세포는 겨드랑이 또는 서혜부 아래 측면 부위에 피내적으로 투여되지만, 본 명세서를 참조로 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 그 밖의 투여경로도 적합하다. 하나의 구체예에서, 수상 세포는 약 1 x 105내지 1 x 108의 용량으로 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 약 1 x 106내지 1 x 107의 용량으로 투여된다. 특히 바람직한 구체예에서, 수상 세포는 약 5 x 106의 용량으로 투여된다.
단핵 세포를 Ficoll-Hypaque 원심분리에 의한 백혈구분리반출 생성물로부터 단리하여 10% DMSO/20% 자가 혈청중에 보관하였다. DC 백신접종 1주일 전에, 세포를 해동시키고, PBS중에 1회 세척하고 2.5 내지 5 x 106생세포/ml(RPMI 1640 + 5%열-불활성화된 자가 혈청)의 농도로 2 내지 4 x 107세포/25cm2코스타 플라스크로 플레이팅하였다. 37℃에서 2시간 동안 부착시킨 후에, 비부착 세포를 PBS로 세척함으로써 온화하게 제거하였다. 부착 세포를 rhGM-CSF (800 U/ml) 및 rhIL-4 (500 U/ml)의 존재하에 7일 동안 완전 배지에서 배양시켰다. 임상 등급 GM-CSF 및 IL-4는 쉐링-플로프로부터 입수하였다.
AdVhAFP는 사람 AFP cDNA가 CMV 인핸서/프로모터에 의해 유래된 E1-결실된 복제-결함 타입 5 아데노바이러스 벡터이다. 각각의 최종 바이러스 생성 로트에 대한 바이러스 역가를 지놈 DNA 정량화 및 감염 역가 둘 모두에 기초하여 제공하였다. 100:1 미만의 바이러스 입자 대 생물학적으로 활성인 바이러스의 생성 비가 허용가능한 비라고 생각되었다.
환자를 다음과 같이 면역화시켰다. 면역화 당일에, 수상 세포를 수집하고 멸균 염수중에 1회 세척하고 2% 자가 혈청-RPMI 1640 1 mL 및 AdVhAFP 109내지 1010pfu/ml중에 106내지 107의 농도로 재현탁시켰다(다중감염도 = 1000:1). 37℃에서 2시간 인큐베이션시킨 후에, AdVhAFP/DC를 RPMI-1640 + 5% 자가 혈청중에 재현탁시켜 비-흡수된 아데노바이러스 벡터를 불활성화시킨 다음, 펠렛화시키고 염수중에 3회 세척하였다. 세포를 트립판 블루에서 카운팅하고 적당한 수(환자 그룹에 따라 1 x 105내지 1 x 108)를 내피적 주입을 위해 멸균 염수중에 재현탁시켰다.
환자에게 겨드랑이 또는 서혜부 아래 측면 부위에 0.1 ml 정상 염수중에 피내적으로 주입된 AdVhAFP 형질도입된 DC를 투여하였다. 환자를 면역화후 2시간 동안 모니터링하였다. 바람직하게는, 환자를 50 mg의 디펜하이드라민 및 650 mg의 타이레놀을 사용하여 경구적으로 전처리하였다.
본 발명이 특정한 바람직한 구체예에 대해 참조로 매우 상세하게 논의되었지만, 그 밖의 구체예들이 가능하다. 그러므로, 첨부된 청구항의 범위는 본 명세서에 포함된 바람직한 구체예들의 설명에 제한되지 않아야 한다.
Claims (38)
- 포유동물에게 알파 페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대한 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함하여, 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키며, 면역 반응은 암세포에 대한 알파 페토프로테인 펩티드 특이적 T 림프구를 활성화시키는 것을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 알파 페토프로테인 펩티드 특이적인 T 림프구가 세포독성 T 림프구임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 알파 페토프로테인 분자가 SEQ ID NO:2임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 알파 페토프로테인 분자의 일부분이 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 암이 간세포암임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 포유동물이 사람임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 면역 반응을 생성시키는 단계가 알파 페토프로테인 아미노산 서열의 적어도 일부분을 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 펩티드가 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334, SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 펩티드가 SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 9, SEQ ID NO:2의 잔기 178 내지 186, SEQ ID NO:2의 잔기 218 내지 226, SEQ ID NO:2의 잔기 235 내지 243, SEQ ID NO:2의 잔기 306 내지 315, SEQ ID NO:2의 잔기 485 내지 493, SEQ ID NO:2의 잔기 492 내지 500, SEQ ID NO:2의 잔기 507 내지 516, SEQ ID NO:2의 잔기 547 내지 556, SEQ ID NO:2의 잔기 555-563 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 면역 반응을 생성시키는 단계가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 형성하는 하나 이상의 펩티드로 펄싱된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 면역 반응을 생성시키는 단계가 알파 페토프로테인을 엔코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334, 및 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550 중 2가지 이상의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함하여, 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키는 방법.
- SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함하여, 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의적어도 일부분을 발현시키는 방법.
- SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 9, SEQ ID NO:2의 잔기 178 내지 186, SEQ ID NO:2의 잔기 218 내지 226, SEQ ID NO:2의 잔기 235 내지 243, SEQ ID NO:2의 잔기 306 내지 315, SEQ ID NO:2의 잔기 485 내지 493, SEQ ID NO:2의 잔기 492 내지 500, SEQ ID NO:2의 잔기 507 내지 516, SEQ ID NO:2의 잔기 547 내지 556 및 SEQ ID NO:2의 잔기 555 내지 563으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함하여, 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키는 방법.
- SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 형성하는 하나 이상의 펩티드로 펄싱된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함하여, 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키는 방법.
- 제 15항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145,SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내ㅣ 334 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드로 펄싱된 수상 세포로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 알파 페토프로테인을 엔코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 수상 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 사람에게 투여함으로써 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 적어도 일부분에 대해 암세포에 대한 알파 페토프로테인 세포독성 T 림프구를 활성화시키는 단계를 포함하여, 사람의 간세포암을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 여기서 암세포는 세포 표면에 알파 페토프로테인 분자의 적어도 일부분을 발현시키는 방법.
- SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145 및 SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334로 구성된 군으로부터 선택된 암을 예방하거나 치료하기에 유용한 단리된 펩티드.
- 포유동물에게 알파 페토프로테인에 대한 면역 반응을 생성시키기에 충분한 양으로 제 18항에 따른 하나 이상의 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 조성물.
- 제 19항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 18항에 따른 펩티드를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 19항에 따른 조성물을 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 20항에 따른 조성물을 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- SEQ ID NO:2의 잔기 137 내지 145, SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166, SEQ ID NO:2의 잔기 325 내지 334 및 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 민즈(means).
- SEQ ID NO:2의 잔기 158 내지 166 또는 SEQ ID NO:2의 잔기 542 내지 550에 따른 서열을 갖는, 암을 예방하거나 치료하기에 유용한 단리된 펩티드.
- 포유동물에게 알파 페토프로테인에 대한 면역 반응을 생성시키기에 충분한 양으로 제 25항에 따른 하나 이상의 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 조성물.
- 제 26항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 25항에 따른 펩티드를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 26항에 따른 조성물을 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 27항에 따른 조성물을 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 19항에 따른 조성물을 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 민즈.
- 제 31항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 민즈.
- 제 31항에 따른 민즈를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 32항에 따른 민즈를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 26항에 따른 조성물을 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위한 민즈.
- 제 35항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 민즈.
- 제 35항에 따른 민즈를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
- 제 36항에 따른 민즈를 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
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