JP2003522195A - 肝細胞癌の治療のための方法及び組成物 - Google Patents
肝細胞癌の治療のための方法及び組成物Info
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Abstract
Description
でなされた。アメリカ合衆国政府はこの発明に一定の権利を有している。
法及び組成物と題される米国特許出願第60/181,966号の優先権を主張し;及び本
出願は、2000年9月12日に出願され、置換されたαフェトプロテインを用いた肝
細胞癌治療と題される米国特許出願第09/660,252号の一部継続出願であり;及び
2000年9月14日に出願され、αフェトプロテインcDNAを用いた肝細胞癌治療
と題される米国特許出願第09/662,505号の一部継続出願であり;出典明示により
内容の全体をここに取り込む。
は、全世界で一年に約120万の症例の発生数を有する、最も一般的な型の原発
性肝癌である。世界のいくつかの地域、例えば、東南アジア及びサブサハラアフ
リカでは、肝細胞癌は、最も一般的な型の悪性疾患の1つである。この疾患の高
い頻度は、これらの地域における肝炎の高い発生数に関連するようである。 肝細胞癌の治癒的治療は、現在非転移性疾患を有する個体に制限されており、
肝移植を伴うか又は伴わない、腫瘍の外科的切除を含む。しかしながら、外科的
切除及び移植でさえも、切除後の再発のために、大部分の腫瘍が治癒しない。治
療に対する化学療法剤のアプローチは、たいてい無効であった。 従って、依然として肝細胞癌の有効な治療についての必要性がある。治療は、
理想的には、この疾患の最高発生数を有する非先進国における使用に適切である
べきである。さらに、治療は、切除不可能な腫瘍及び転移性疾患を有する個体に
おける使用に適切であるべきである。
なくとも一部を発現する、哺乳動物の癌の予防又は治療のための方法である。そ
の方法は、αフェトプロテイン分子のアミノ酸配列の少なくとも一部に対する哺
乳動物の免疫応答を引き起こす工程を含み、該免疫応答は癌細胞に対するαフェ
トプロテインペプチド特異的Tリンパ球の活性化を含む。一実施態様では、αフ
ェトプロテインペプチド特異的Tリンパ球は、細胞障害性Tリンパ球である。好
ましい実施態様では、αフェトプロテイン分子は配列番号:2である。特に好ま
しい実施態様では、αフェトプロテイン分子は配列番号:2の残基137−14
5、配列番号:2の残基158−166、配列番号:2の残基325−334及
び配列番号:2の残基542−550からなる群から選択される。一実施態様で
は、癌は肝細胞癌である。他の実施態様では、哺乳動物はヒトである。 好ましい実施態様において、免疫応答を引き起こす工程はαフェトプロテイン
アミノ酸配列の少なくとも一部を含んでなるペプチドを含む一又は複数の組成物
を哺乳動物に投与することを含む。特に好ましい実施態様では、ペプチドは配列
番号:2の残基137−145、配列番号:2の残基158−166、配列番号
:2の残基325−334及び配列番号:2の残基542−550からなる群か
ら選択される。他の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号:2の残基1−
9、配列番号:2の残基178−186、配列番号:2の残基218−226、
配列番号:2の残基235−243、配列番号:2の残基306−315、配列
番号:2の残基485−493、配列番号:2の残基492−500、配列番号
:2の残基507−516、配列番号:2の残基547−556及び配列番号:
2の残基555−563からなる群から選択される。
ミノ酸配列の少なくとも一部を形成する一又は複数のペプチドをパルスした樹状
細胞を含む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む。更に他の好ま
しい実施態様では、免疫応答を引き起こす工程は、αフェトプロテインをコード
する組み換えアデノウィルス性ベクターを導入した樹状細胞を含む一又は複数の
組成物を哺乳動物に投与することを含む。 他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の
少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療する方法であって、
該方法は配列番号:2の残基137−145、配列番号:2の残基158−16
6及び配列番号:2の残基325−334からなる群から選択されるペプチドを
含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号:2のアミノ酸
配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性
Tリンパ球を活性化する工程を含む。 他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の
少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であ
って、該方法は、配列番号:2の残基542−550からなる群から選択される
ペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号:2
のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン
細胞障害性Tリンパ球を活性化する工程を含む。
少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であ
って、該方法は、配列番号:2の残基1−9、配列番号:2の残基178−18
6、配列番号:2の残基218−226、配列番号:2の残基235−243、
配列番号:2の残基306−315、配列番号:2の残基485−493、配列
番号:2の残基492−500、配列番号:2の残基507−516、配列番号
:2の残基547−556及び配列番号:2の残基555−563からなる群か
ら選択されるペプチドを含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、
配列番号:2のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェ
トプロテイン細胞障害性Tリンパ球を活性化する工程を含む。 他の実施態様では、本発明は、癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の
少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であ
って、該方法は、配列番号:2のアミノ酸配列の少なくとも一部を形成する一又
は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与
することにより、配列番号:2のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細
胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Tリンパ球を活性化する工程を含む。
一又は複数のペプチドは、配列番号:2の残基137−145、配列番号:2の
残基158−166、配列番号:2の残基325−334及び配列番号:2の残
基542−550からなる群から選択される一又は複数のペプチドをパルスした
樹状細胞から選択される。
少なくとも一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であ
って、該方法は、αフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルスベク
ターを導入した樹状細胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより
、配列番号:2のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフ
ェトプロテイン細胞障害性Tリンパ球を活性化する工程を含む。 他の実施態様では、本発明は、配列番号:2の残基137−145、配列番号
:2の残基158−166、及び配列番号:2の残基325−334からなる群
から選択される、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチドである。好
ましい実施態様では、本発明は、哺乳動物のαフェトプロテインに対する免疫応
答を引き起こすのに十分な量の配列番号:2の残基137−145、配列番号:
2の残基158−166、及び配列番号:2の残基325−334からなる群か
ら選択される一又は複数のペプチドを含む、癌の予防又は治療のための組成物で
ある。該組成物は更にアジュバントを含むことができる。他の実施態様では、本
発明はこれらのペプチドの1つ又はこれらの組成物の1つをヒトに投与する工程
を含むヒトの癌を予防又は治療する方法である。
8−166、配列番号:2の残基325−334及び配列番号:2の残基542
−550からなる群から選択される一又は複数のペプチドを含む、癌を予防又は
治療するための手段を包含する。 他の実施態様では、本発明は配列番号:2の残基542−550に従う配列を
有する、癌の予防又は治療に利用される単離されたペプチドである。好ましい実
施態様では、本発明は配列番号:2の残基542−550に従う配列を有するペ
プチドを含む、癌の予防又は治療のための組成物である。組成物は更にアジュバ
ントを含有することができる。他の実施態様では、本発明はこれらのペプチド又
はこれらの組成物の1つをヒトに投与する工程を含む、ヒトの癌の予防又は治療
方法である。 本発明はまた、配列番号:2の残基542−550に従う配列を有するペプチ
ドを含む、癌の予防又は治療の手段を包含する。
れうるペプチド群である。他の実施態様では、本発明は、本発明の一又は複数の
ペプチドを単独で又は組み合わせて、あるいは本発明の一又は複数のペプチドを
含む組成物を投与することにより肝細胞癌を予防又は治療するための方法である
。他の実施態様では、本発明は、本発明の一又は複数のペプチドをパルスした、
あるいはαフェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルス(AdV)ベ
クターを導入した樹状細胞を投与することにより、肝細胞癌を予防又は治療する
ための方法である。 肝細胞癌の約80%がαフェトプロテイン発現を再活性化する。マウス及びヒ
トの両方のT細胞レパートリーが、MHCクラスIによってAFP誘導ペプチド
エピトープを認識することができる。従って、胚発生の間、高い血漿レベルのこ
の癌胎児性タンパク質に暴露されるにもかかわらず、免疫系の個体発生の間にA
FP特異的T細胞の全てが消失するわけではない。
により認識されるヒトαフェトプロテイン、配列番号:2から誘導されるペプチ
ドの同一性の決定を包含する。以下の表1にまとめられているように、4つのA
FP誘導ペプチドを同定し、「ドミナントな」ペプチドが示された。それらはP
LFQVPEPV、hAFP137−145、配列番号:2の残基137−14
5;FMNKFIYEI、hAFP158−166、配列番号:2の残基158
−166;GLSPNLNRFL、hAFP325−334、配列番号:2の残
基325−334;及びGVALQTMKQ、hAFP542−550、配列番
号:2の残基542−550である。それぞれ、1つ又は2つのアンカー残基を
有する。 ドミナントなペプチドのそれぞれが、濃度依存性クラスI結合アッセイでT2
細胞上にHLA-A*0201を安定化した。ペプチドをオフ速度論アッセイで2
〜6時間安定化した。更に、各ドミナントペプチドは、いくつかの通常HLA-
A*0201ドナーからインビトロにおいてペプチド特異的T細胞を誘導した。
重要なことには、これらのhAFPペプチド特異的T細胞はまた、細胞毒性アッ
セイ及びIFNg ELISPOTアッセイの両方でHLA-A*0201+/A
FPポジティブ腫瘍細胞を認識することができる。この情報をまとめた。
れらのドミナントなペプチドを存在させることにより行うことができ、プロフェ
ッショナル抗原提示樹状細胞による提示を含む。αフェトプロテインcDNA、
配列番号:1をコードする組み換えアデノウィルス(AdV)ベクターを導入し
た樹状細胞は、MHCによって4つのドミナントなペプチドエピトープを処理及
び提示し、またAFP特異的T細胞の活性化を誘導しうる。同様に免疫化したH
LA-A*0201/Kbマウスもまた、サイトカイン放出アッセイでAFPペプ
チドをパルスした細胞を認識する。更にAFPペプチドで刺激したヒト及びHL
A-A*0201/KbマウスT細胞は、認識したhAFP操作標的に応答し、よ
り低い程度で天然AFP発現ヒト肝細胞癌細胞に応答する。最後に、質量分析を
用いて、HLA-A*0201+HCC細胞から溶出したペプチドの複合混合物か
らの少なくとも3つのAFPエピトープを同定した。従って、実証された複数の
ラインは、これら4つのドミナントなペプチドのそれぞれが免疫原性を有し、H
LA-A*0201により自然に処理及び提示されることを示す。 「サブドミナント」ペプチドと称される他の10のペプチドは、弱い又は低い
再現性のある応答を有するが、1以上のタイプのアッセイでポジティブであった
。これら10のペプチドは、MKWVESIFL、配列番号:2の残基1−9;
ILLWAARYD、配列番号:2の残基178−186;LLNQHACAV
、配列番号:2の残基218−226;FQAITVTKL、配列番号:2の残
基235−243;TTLERGQCII、配列番号:2の残基306−315
;CIRHEMTPV、配列番号:2の残基485−493;PVNPGVGQ
C、配列番号:2の残基492−500;NRRPCFSSLV、配列番号:2
の残基507−516;TMKQEFLINL、配列番号:2の残基547−5
56;及びNLVKQKPQI、配列番号:2の残基555−563である。
の残基325−334;及びhAFP542−550、配列番号:2の残基54
2−550の使用により開示されるが、所定位置にある、あるいは一又は複数の
4つのドミナントペプチドと連結している10のサブドミナントペプチドの一又
は複数を使用することも本発明の範囲内である。 ドミナントペプチド及びサブドミナントペプチドの同定は、ここに詳細に議論
されるであろう。第1に、hAFP由来のペプチド配列、配列番号:2(Genban
k受託番号:J00077、J00076及びV01514)は、HLA-A*0201に潜在的に結
合するものであろうことが同定された。これらのペプチドは9又は10のアミノ
酸長の間に、2位にアミノ酸イソロイシン、ロイシン及びメチオニン有し、又は
ペプチドの長さによるがペプチド位置9又は10にアミノ酸イソロイシン、ロイ
シン及びバリンを有することもあり、あるいはその両方を有する。74のこのよ
うなペプチドをWisconsin大学のGenetics Computer Groupプログラム「find pat
terns」を用いて同定し、hAFP配列、配列番号:2をスクリーニングした。
74の各ペプチドは標準的な技術を用いて合成した。 74ペプチド候補のそれぞれを、HLA-A*0201安定化アッセイのT2細
胞に対する濃度による結合を試験した。細胞表面MHCクラスI分子発現を増加
させるために前の晩に室温でインキュベートしておいたT2(TAP欠損)細胞
を、次いでペプチド濃度0.1mM-100mMの範囲にわたって各ペプチドと共に一晩イ
ンキュベートした。抗HLA-A2抗体(BB7.2)とヤギ抗マウスFITC
で細胞を染色した後に、HLA-A*0201の安定性をフローサイトメトリーに
よってアッセイした。
HLA-A*0201LCLを、穏やかなpH3.2のクエン酸-リン酸酸性緩衝
液で剥離した。各ペプチドを、3μg/mlのb2ミクログロブリンの存在下、室温
で1時間、200mMで細胞上に直接パルスした。過剰なペプチドを洗浄除去し、細
胞を37℃で0、2、4及び6時間インキュベートした。細胞を各時点の終わり
に洗浄し、細胞表面HLA-A2発現について染色し、次いで、フローサイトメ
トリーで分析した。ペプチドMHCクラスI複合体は、剥離はされたがペプチド
をパルスされなかった細胞から少なくとも1.5倍増加した平均蛍光強度である
場合を、安定であると判断した。4つのドミナントペプチドの全てが、オフ速度
論アッセイで2〜6時間、安定であった。 次いで4つのドミナントペプチドについて、更なる免疫学的及び物理化学的研
究を実施した。これらの研究は(1)ペプチドを使用して、ペプチド特異的で天
然AFP発現細胞を認識するAFPペプチド特異的ヒトT細胞培地を作成する;
(2)AdVhAFP-導入樹状細胞を使用して、AFPポジティブ細胞、並び
にドミナントペプチドをパルスしたAFPネガティブ細胞を認識するAFP特異
的ヒトT細胞を作成する;インビトロ研究、及び(1)ペプチドで免疫化したト
ランスジェニックマウスが、ペプチド及びAFPポジティブ細胞を認識する脾細
胞を有する;及び(2)AdVhAFP/DC免疫化マウスがAFPポジティブ
細胞、並びにドミナントペプチドをパルスしたAFPネガティブ細胞を認識する
、インビボ研究を含んでいた。これらの研究は、ドミナントペプチドが免疫原性
を有し、AFP自体が免疫原性を有し、ドミナントペプチドがAFPポジティブ
細胞の表面上で自然に処理及び提示され、さらにAFP/DC又はドミナントペ
プチドの両方がサイトカインの生成及びAFPポジティブ細胞の殺傷を行うAF
P特異的T細胞を生成するのに利用できることを示した。更に、質量分析はAF
Pポジティブ肝細胞癌細胞の表面由来のAFPペプチドを物理的に同定するのに
使用された。
い、ヒトT細胞レパートリーにおけるペプチド免疫原性と、AFPトランスフェ
クト標的を認識するペプチド特異的T細胞の能力を提示した。バルクT細胞培地
を、各ドミナントAFP由来ペプチドをパルスしたPBMCから生成し(KLH
、IL-7及びIL-2を補った)、増殖の3〜7週、ペプチドをパルスした標的
とAFPを発現する標的の両方を認識する能力を試験した。これらの培地はペプ
チド特異的T細胞を増殖させ、ELISPOTアッセイにおいてコントロールM
ART-127-35をパルスルJYは認識せず、特異的ペプチドをパルスしたJ
Y細胞を認識することによってIFNgを分泌する能力により明らかになった。
AFPペプチド特異的バルクT細胞はまた、INFg産生AFP特異的T細胞の
増加した頻度により示されるような修飾していない又は空のAdVRR5導入親
細胞に比べ、安定にトランスフェクトしたAFPネガティブ及びAdVhAFP
を導入したHLA-A*0201メラノーマ細胞(M202)の両方を認識した。
HLA-A*0201+、天然AFP発現肝細胞癌細胞株HepG2を(HLA-
A2-/AFPポジティブHCC株Hep3Bと比較して)認識する能力を評価す
るために、細胞障害性とELISPOTアッセイを実施した。
FとIL-4と共にインキュベートしたPBMCから作成した樹状細胞に、2時
間1000の感染効率(moi)でAdVhAFP又はAdVMART1を導入
した。導入した樹状細胞を洗浄し、照射し、1-2×105細胞/mlで撒いて、C
TL生成のための刺激剤とした。自己非接着細胞は、磁気ビーズ枯渇によって、
CD4、CD14、CD19及びCD56+細胞を枯渇し、CD8+強化キラー
細胞(一般に80%CD8+の濃度、示さない)を作成した。CD8+細胞を、
10-25ng/mlのIL-7を添加した5%自己培地に2×106細胞/mlで導入樹状細
胞と共に撒いた。培地には、3-4日毎に10U/mlでIL-2を補った。CD8+C
TLは、10-20のCD8+CTLに1樹状細胞の率で新しい自己AdV導入
樹状細胞により毎週再刺激された。多くの培地は、一週ベースでCD4+及びC
D8+細胞表現型であった。各ドミナントペプチドは、いくつかの通常HLA-
A*0201ドナーからインビトロでペプチド特異的T細胞を誘導した。
Tアッセイの両方でhAFPトランスフェクト標的を特異的に認識したので、次
に4つのドミナントペプチドは、AdVhAFP/DC刺激T細胞により特異的
に認識されるかどうかを決定するための研究がなされた。培養の7〜21日後、
AdVhAFP/DCで毎週刺激したCD8強化T細胞を、細胞障害性及びhA
FPペプチド特異的IFNgサイトカイン産生細胞の頻度を試験した。AdVh
AFP/DC T細胞培地は、4つのAFPペプチドのそれぞれをパルスしたJY
細胞に細胞障害性があり、これらのペプチドに対するCTLは通常のドナーの末
梢血から広がりうることが示唆される。自己ペプチドパルスLCL又はJY細胞
を再刺激した後、これらのバルク培地はまた、MART-127−35に比較し
て非常に高い頻度のAFPペプチドに特異的なIFNg分泌細胞を含んでおり、
hAFP542−550に加えて、3つの他のドミナントペプチドもまた、Ad
VhAFP-導入樹状細胞により自然に処理及び提示されることが示唆された。 AdVhAFP/DC刺激T細胞培地はまた、A*0201+/AFPポジティ
ブ肝細胞癌株HepG2を認識するが、A*0201−/AFPポジティブHCC
株Hep3Bは認識しない低頻度のサイトカイン産生細胞を有していた。Th1
サイトカインIFNg及びTNFaを合成するTリンパ球は検出されたが、Th
2サイトカインIL-4は検出されなかった。また、IL-10は肝細胞癌株がT
細胞無しに撒かれたときに検出されたが、このサイトカインの産生は腫瘍細胞を
誘導することが示唆される。
ーニングに使用して、これらのペプチドの何れが免疫原性が有り、次のようなH
LA-A*0201で自然に処理及び提示されるのかを決定した。HLA-A*02
01/KbトランスジェニックメスマウスはもともとHarlan-Sprague Dawley(In
dianapolis, IN US)から購入し、現在カリフォルニア大学、ロサンゼルスの放
射腺腫瘍学部の動物施設で育てられている。 ペプチドの免疫化のために、マウスに、完全フロインドアジュバント中1:1
でエマルジョン化した100μgのAFP又はコントロールペプチドを皮下注し
た。完全フロインドアジュバンド中にエマルジョン化した各ペプチドで免疫化し
た後、流入領域リンパ節細胞は、hAFPを安定にトランスフェクトした細胞の
認識によりIFNgを産生した。更に、αフェトプロテインペプチド特異的T細
胞は、AFP発現アデノウィルス(AdVhAFP)を導入した樹状細胞で免疫
化したマウスの脾臓で同定することができた。従って、4つのドミナントペプチ
ドはクラスIで自然に処理及び提示され、免疫原性を有する。
A-A*0201/Kbマウスを、同系の樹状細胞上にパルスした各ドミナントペ
プチドで免疫化した。IFNg特異的ELISPOTアッセイを、免疫化ドミナ
ントペプチド(又はMART-1ペプチド)又はジャーカット/AFP又はジャー
カット/MARTトランスフェクト細胞株のいずれかでインビトロで再刺激した
脾細胞で実施した。各hAFPペプチドでの免疫化とそれに続く何れかのペプチ
ド又はジャーカット/AFPでの再刺激は、多くのAFP特異的IFNg産生細
胞を誘導した。PBS注入マウス由来のリンパ球は、再刺激に関係なく細胞障害
性もIFNg産生も示さなかった。MART-127−35ペプチドで免疫化し
たマウスは、MART-1特異的応答を生成したが、AFPペプチド応答は生成
しなかった。 次いで、GM-CSF及びIL-4の分化により骨髄前駆体から樹状細胞を作成
し、hAFPcDNA、配列番号:1を誘導する組み換えAdVベクター(Ad
VhAFP)を導入した。インビボ培養した樹状細胞を100の感染効率でRP
MI/2%FCSに導入した。導入は、37℃で2時間実施した。次いで樹状細
胞を洗浄し、注入のための動物につき0.2mlPBS当たり樹状細胞5×105で
再懸濁した。全ての場合において実行可能性が95%を超えた。免疫化の2週間
後、マウスからの脾細胞をhAFP(ジャーカット/AFP)又はMART-1(
ジャーカット/MART)を安定にトランスフェクトしたジャーカット細胞で再
刺激した。MART特異的に対するAFP特異的IFNg放出の頻度を、3つの
独立した実験(ここでp<0.02)を平均化するELISPOTにより決定し
た。細胞障害性を、5時間の51Cr放出アッセイでジャーカット/AFP及び
ジャーカット/MARTに対してアッセイした。
ついてHPLC及び質量分析同定を実施した。これらの分析の結果の概要は、以
下の表2に示される。 ペプチドを抽出するために、HepG2及びHep3B細胞をPBSで3回洗
浄してから、5mlのpH3.2のクエン酸-リン酸緩衝液で1分間インキュベート
した。懸濁液を遠心分離(800xgで5分間)し、全体で500mlの細胞無しの
上清を各細胞株から回収した。その物質を凍結乾燥して−20℃で保存した。 凍結乾燥した物質を30mlの水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸(W/A/TF
A、全て容量で95/5/0.1)に再溶解した。この溶液を、W/A/TFAで平
衡にした分析逆相HPLCカラム(Keystone Scientific C18 Betasil、250mm x
2mm、5mm粒径、100Å孔径)に0.2ml/分の流速で投入した。カラムは、アセトニ
トリル中の0.1%TFAの増加直線勾配を用いて溶出させた(時間/%アセト
ニトリル=0/5、5/5、55/100、60/100)。カラム溶出液の吸光度
を215と280nmで測定し、1分間分で回収された。免疫賦活ペプチドに相
当するアミノ酸配列を有する合成ペプチドの保持時間は分離カラムの同一の分離
勾配を用いて得られた。 AFP産生肝細胞癌細胞株HepG2(HLA-A2+)及びHep3B(H
LA-A2−)由来のHPLC画分ペプチド酸溶出物を分析するために、MAL
DI-TOF質量分析を実施した。ボイジャーのREACTION PRODUCTS(PerSeptive
Biosystems, Framingham, MA)Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
/Time-Of-Flight(MALDI-TOF)の器具を使用して、質量スペクトルを得た。器具
はサンプルが沈着乾燥したステンレススチール標的を使用する。全てのスペクト
ルをインシュリンで外面的に較正し、典型的な±0.1%内の質量精度となった
。凍結乾燥したHPLC分画を0.1%TFAを含む10μlの70%アセトニ
トリルに再懸濁した。この物質の1μlを、1μlの基質a-シアノ-4-ヒドロ
キシケイ皮酸(Sigma、70%ACN/0.1%TFAに10mg/ml)と共にスポットした。スペク
トルをm/z500−7000のスキャンニングで得た。
0Daの20の異なるペプチドを含むが、しばしば小数のドミナントペプチドを
有することを明らかにした。この複合混合物以外に、ピークは、hAFP158 −166 、配列番号:2の残基158−166;hAFP325−334、配列
番号:2の残基325−334;及びhAFP542−550、配列番号:2の
残基542−550、HepG2細胞から抽出したペプチドプールのhAFP1 58−166 及びhAFP325−334の算出されるモノ等方性プロトン化分
子((M+H)+)に相当するm/z値と同一であった。m/z975.6のペプ
チドをHepG2ペプチドプール由来の1つのHPLC分画で同定した。hAF
P542−550の算出された(M+H)+は975.5であり、hAFP542 −550 、配列番号:2の残基542−550に相当するアミノ酸を有する合成
ペプチドの反応時間は21.2分であった。更に、マトリックスのみを有するサ
ンプル中で、及びHep3B抽出物由来のHPLC分画18〜22で975.5
±1のm/zでのシグナルは得られなかった。同様に、hAFP158−166 、配列番号:2の残基158−166及びhAFP325−334、配列番号:
2の残基325−334の算出された(M+H)+に相当するm/zを有するピー
クはまた、標準ペプチドの作用から予測されるHepG2から誘導される適切な
分画に見られる。これらのピークはHep3Bから抽出されたペプチドプールの
分画にはなかった。1152.2m/zのピークは1つの分画で見られ、hAF
P325−334、配列番号:2の残基325−334のナトリウム付加物の存
在を示唆する。
細胞の由来以外の、HLA-A*0201ポジティブHepG2細胞から抽出され
たHPLC分画化ペプチドプールの4つのペプチドの3つを同定した。同定され
た3つのペプチドでは、スポットしたサンプルの繰り返しスキャンでピークが見
られた。この物理化学分析で許容される誤差の限界を超えたHepG2ペプチド
プール由来の1つの分画において、m/z1020.9で広範なピークが見られ
た。従って、HepG2細胞の表面上のhAFP137−145、配列番号:2
の残基137−145の存在を立証することができなかった。 これらの分画のドミナントペプチドの存在を免疫学的に確認するために、He
pG2又はHep3Bからの1mlの各HPLC分画を使用して、ELISPOT
アッセイでAdVhAFP/DC免疫化マウス脾細胞を再刺激した。ドミナント
ペプチドを含む分画から200-250スポット/106細胞が観察され、他の分
画から100-130スポット/106細胞が観察され、Hep3B分画から最大
50スポット/106細胞が観察された。これは更に、ドミナントペプチドの質
量分析測定を裏付けする。
持時間。3.予測される質量/電荷測定値。4.HepG2由来の酸抽出ペプチ
ドの観察された質量/電荷測定値。5.Hep3B由来の酸抽出ペプチドの観察
された質量/電荷測定値。6.HepG2由来の酸抽出ペプチドの観察されたh
AFPペプチド質量の分画(分)/電荷測定値。7.IFNg ELISPOTに
よりAdVhAFP/DCで初回刺激した脾細胞を再刺激することができるペプ
チドを含む分画。
供することがある。本方法は、適した患者、例えばAFPポジティブ肝細胞癌を
有するHLA-A*0201+患者の選択を含む。次に、患者に一又は複数の本発
明のペプチドを投与する。ペプチドは十分な量で投与され、好ましくは、投与は
複数回繰り返して、AFPに対する免疫応答を引き起こし、それによって肝細胞
癌に対する免疫反応を引き起こす。 好ましい実施態様では、ペプチドは、hAFP137−145、配列番号:2
の残基137−145;hAFP158−166、配列番号:2の残基158−
166;hAFP325−334、配列番号:2の残基325−334;及びh
AFP542−550、配列番号:2の残基542−550の組み合わせであり
、一又は複数のペプチドを2回〜5回投与する。特に好ましい実施態様では、ペ
プチドを3回投与する。他の好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドを2
週間間隔で3回投与する。
開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。 好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドのそれぞれは、0.5mlのMontani
de ISA-51にエマルジョン化して投与され、4つのペプチドの組み合わせの場合
には、全体で2mlのMontanide ISA-51にエマルジョン化して投与する。エマルジ
ョン化ペプチドは4等分され、各分量を離れた部位に投与する。好ましい実施態
様では、一又は複数のペプチドをそれぞれ約50μg〜2000μgの用量で投与する。
好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドをそれぞれ約100μg〜1000μgの
用量で投与する。特に好ましい実施態様では、一又は複数のペプチドを約500μ
gの用量で投与する。 本発明の方法及び組成物を使用してAFPポジティブ/A2.1+肝細胞癌を
有する数人の患者を治療した。各患者は、本方法に従って4つのペプチド、hA
FP137−145、配列番号:2の残基137−145;hAFP158−1 66 、配列番号:2の残基158−166;hAFP325−334、配列番号
:2の残基325−334;及びhAFP542−550、配列番号:2の残基
542−550で免疫化した。ペプチドを0.5mlのMontanide ISA-51でエマルジ
ョン化して、全体で2mlになるように組み合わせた。エマルジョン化したペプチ
ドを4等分して、各分量を離れた部位に投与した。末梢T細胞応答をELISP
OT及び4量体アッセイで測定した。これらの試験は、4つのAFP誘導ペプチ
ドがインビボで検疫原性を有し、さらに患者の血清のAFPのレベルが免疫化前
に非常に高かったことを示す。
2.1+肝細胞癌を有していた。彼に、2週間隔でMontanide ISA中の4つのペ
プチドの各100μgを3回免疫化投与した。平行なインビトロPMBC培地をまた
、免疫化前に第1の患者の血液から確立し、各ペプチドを繰り返しパルスした。
ELISPOTにより試験した28日目の培地の全てのペプチド、及び4量体に
よる3つのうち2つのhAFP158−166、配列番号:2の残基158−1
66以外のhAFP137−145、配列番号:2の残基137−145;及び
hAFP325−334、配列番号:2の残基325−334のインビトロ認識
を明確化する。AFP542ペプチドテトラマーがこれらの試薬を調製する装置
にホールドできなかったので、AFP542特異的T細胞の存在は、テトラマー
により評価することができなかった。インビボ反応は、第2及び第3の免疫化の
後にhAFP137−145、配列番号:2の残基137−145;hAFP1 58−166 、配列番号:2の残基158−166;及びhAFP542−55 0 、配列番号:2の残基542−550の明確な認識;及びhAFP325−3 34 、配列番号:2の残基325−334の認識の傾向を示した。
型及びC型肝炎の両方に陰性である70歳のコーカサス人男性であった。彼は、
腫れを伴っており、肝臓の左葉に8cmマス有していることが分かった。彼のAF
P提示レベルは10,400ng/mlであった。肝臓バイオプシーは硬変肝臓のよく分化
した肝細胞癌を示した。彼に対し、抗真菌剤FV-462実験を開始したが、病
気の進行と聴器毒性があった。提示の数ヶ月後、次に彼は、本発明に従うプロト
コールを用いた4つのペプチドhAFP137−145、配列番号:2の残基1
37−145;hAFP158−166、配列番号:2の残基158−166;
hAFP325−334、配列番号:2の残基325−334;及びhAFP5 42−550 、配列番号:2の残基542−550の組み合わせで開始した。彼
は、2週間隔で2回の免疫化を受けた。2回の免疫化に続く4量体及びELIS
POTデータは4つ全てのAFPペプチドエピトープを検出した。 従って、これらの結果は、本方法が進行型の肝細胞癌を有する患者のAFP特
異的T細胞により検出可能な免疫応答を引き起こすことを示す。
の予防の方法 本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提
供することがある。本方法は、適した患者、例えばAFPポジティブ肝細胞癌を
有するHLA-A*0201+患者の選択を含む。次に、患者に一又は複数の本発
明のペプチドをパルスした樹状細胞を投与する。樹状細胞は十分な量で投与され
、好ましくは、投与は複数回繰り返して、AFPに対する免疫応答を引き起こし
、それによって肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。 好ましい実施態様では、樹状細胞は、hAFP137−145、配列番号:2
の残基137−145;hAFP158−166、配列番号:2の残基158−
166;hAFP325−334、配列番号:2の残基325−334;及びh
AFP542−550、配列番号:2の残基542−550の組み合わせがパル
スされる。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を2回〜5回投与する。特に好
ましい実施態様では、樹状細胞を3回投与する。他の好ましい実施態様では、樹
状細胞を2週間隔で3回投与する。
開示に関する分野の技術者に理解されうるように適している。一実施態様では、
樹状細胞は約1×105〜1×108の用量で投与される。他の好ましい実施態
様では、樹状細胞は約1×106〜1×107の用量で投与される。特に好まし
い実施態様では、樹状細胞は約5×106の用量で投与される。 樹状細胞は、当業者に既知の技術に従って、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子(GM-CSF)及びインターロイキン4(IL-4)に組織培地に1週間
さらした付着性の自己末梢血単核細胞から調製される。Ficoll-Hypaqueによる単
一の白血球アフェレーシス(Leukapheresis)から得られた細胞由来の単核細胞
を単離し、樹状細胞の生成に使用されるまで液体窒素で凍結して保存する。解凍
した単核細胞を生理食塩水で1回洗浄し、2-4×107細胞/25cm2Costerフラ
スコで、2.5-5×106生細胞/ml(RPMI1640+5%熱失活自己血清
+ゲンタマイシン)の濃度に撒く。37度で2時間付着させた後、付着しなかっ
た細胞を生理食塩水で洗浄して取り除く。付着細胞をrhGM-CSF(800U/ml
)及びrhIL-4(500U/ml)の存在下で7日間、完全培地で培養する。臨床グ
レードのGM-CSFはImmunexにより及びIL-4はSchering-Ploughにより提供
された。
て、70%のRPMI1640、20%の自己血清及び10%のDMSO中に低
温保存する。等分したものを研究の−7、7及び21日目に解凍する。自己血清
の血液(60ml)は白血球アフェレーシスの時と第1の免疫化の日に、全ての細胞
培養に十分であるように採られる。本発明のAFP誘導免疫優性ペプチドを調製
し、当業者に既知の技術で精製する。 続いて患者を免疫化する。免疫化の日に、樹状細胞を回収し、無菌生理食塩水
溶液で1回洗浄して、適切な濃度、例えば1mLの無血清RPMI1640に10
6及び4つの免疫優性ペプチドそれぞれについて50mg/mlで再懸濁する。インキ
ュベーションの最低1時間後にAFPペプチド/DCをペレット化し、無菌生理
食塩水で3回洗浄する。細胞をトリパンブルーで数え、皮内注射のために0.1ml
の無菌食塩水に再懸濁する。 全量を投与する前に、被験者は0.1mlの生理食塩水中に1/100の分量で皮膚
テストを受けうる。30分の観察期間の後、腋下、又は鼠径部下又は上付近に、
0.1mlの生理食塩水中の皮内注射されるAFPペプチドをパルスした樹状細胞の
全量を接種されうる。免疫化後2時間、患者を監視する。好ましくは、患者は、
50mgのジフェンヒドラミンと650mgのタイレノールで両方とも経口的に前処置さ
れる。
の予防の方法 本発明の一実施態様には、肝細胞癌を有する患者を予防又は治療する方法を提
供することがある。本方法は、適した患者、例えばAFPポジティブ肝細胞癌を
有するHLA-A*0201+患者の選択を含む。次に、患者にヒトAFPアデノ
ウィルス導入樹状細胞を投与する。樹状細胞は十分な量で投与され、好ましくは
、投与は複数回繰り返して、AFPに対する免疫応答を引き起こし、それによっ
て肝細胞癌に対する免疫反応を引き起こす。 他の好ましい実施態様では、樹状細胞を2回〜5回投与する。特に好ましい実
施態様では、樹状細胞を3回投与する。他の好ましい実施態様では、樹状細胞を
2週間隔で3回投与する。 好ましい実施態様では、樹状細胞は腋下あるいは鼠径部付近に直接投与される
が、投与の他の経路もこの開示に関する分野の技術者に理解されうるように適し
ている。一実施態様では、樹状細胞は約1×105〜1×108の用量で投与さ
れる。他の好ましい実施態様では、樹状細胞は約1×106〜1×107の用量
で投与される。特に好ましい実施態様では、樹状細胞は約5×106の用量で投
与される。
0%のDMSO/20%の自己血清で保存する。DCワクチン接種の1週間前に
細胞を解凍し、PBSで1回洗浄し、2-4×107細胞/25cm2Costerフラスコ
で、2.5-5×106生細胞/ml(RPMI1640+5%熱欠活自己血清)の
濃度に撒く。37度で2時間付着させた後、付着しなかった細胞をPBSで洗浄
して穏やかに取り除く。付着細胞をrhGM-CSF(800U/ml)及びrhIL-
4(500U/ml)の存在下で7日間、完全培地で培養する。臨床グレードのGM-C
SF及びIL-4はSchering-Ploughによりの提供される。 AdVhAFPは、ヒトAFP cDNAがCMVエンハンサー/プロモーター
により制御されるE1-欠損非増殖型5アデノウィルスベクターである。それぞ
れの最終ウィルス生産ロットのウィルス価は、ゲノムDNA定量と感染価の両方
に基づいて得られる。ウィルス粒子と生物活性ウィルスの生成率が100:1未
満のとき、条件を満たしていると判断する。 続いて患者を免疫化する。免疫化の日に、樹状細胞を回収し、無菌生理食塩水
溶液で1回洗浄して、1mLの2%自己血清RPMI1640に106-107の濃
度及び109−1010pfu/mlのAdVhAFP(感染効率=1000:1)で
再懸濁する。37℃でのインキュベーションの2時間後に、AdVhAFP/D
CをRPMI-1640+5%自己血清に再懸濁して吸収されなかったアデノウ
ィルスベクターを不活性化し、次いでペレット化し、無菌生理食塩水で3回洗浄
する。細胞をトリパンブルーで数え、適した数(患者のグループに応じて1×1
05〜1×108)を皮内注射のために無菌食塩水に再懸濁する。 患者は腋又は鼠径部の下付近に、0.1mlの標準生理食塩水中の皮内注射される
AdVhAFP導入DCを投与される。免疫化後2時間、患者を監視する。好ま
しくは、患者は、50mgのジフェンヒドラミンと650mgのタイレノールで両方とも
経口的に前処置される。 本発明は特定の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に議論したが、他の実
施態様も可能である。従って、添付の請求の範囲の範囲は、本明細書中に含まれ
る好ましい実施態様の記載に制限されるべきではない。
予防又は治療する方法。
Claims (38)
- 【請求項1】 癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも一
部を発現する、哺乳動物の癌の予防又は治療のための方法であって、αフェトプ
ロテイン分子のアミノ酸配列の少なくとも一部に対する哺乳動物の免疫応答を引
き起こす工程を含み、該免疫応答が癌細胞に対するαフェトプロテインペプチド
特異的Tリンパ球の活性化を含む方法。 - 【請求項2】 αフェトプロテインペプチド特異的Tリンパ球が細胞障害性
Tリンパ球である請求項1の方法。 - 【請求項3】 αフェトプロテイン分子が配列番号:2である請求項1の方
法。 - 【請求項4】 αフェトプロテイン分子の一部が、配列番号:2の残基13
7−145、配列番号:2の残基158−166、配列番号:2の残基325−
334、配列番号:2の残基542−550及び前記の組み合わせからなる群か
ら選択される請求項1の方法。 - 【請求項5】 癌が肝細胞癌である請求項1の方法。
- 【請求項6】 哺乳動物がヒトである請求項1の方法。
- 【請求項7】 免疫応答を引き起こす工程が、αフェトプロテインアミノ酸
配列の少なくとも一部を含んでなるペプチドを含む一又は複数の組成物を、哺乳
動物に投与することを含む、請求項1の方法。 - 【請求項8】 ペプチドが、配列番号:2の残基137−145、配列番号
:2の残基158−166、配列番号:2の残基325−334、配列番号:2
の残基542−550及び前記の組み合わせからなる群から選択される、請求項
7の方法。 - 【請求項9】 ペプチドが、配列番号:2の残基1−9、配列番号:2の残
基178−186、配列番号:2の残基218−226、配列番号:2の残基2
35−243、配列番号:2の残基306−315、配列番号:2の残基485
−493、配列番号:2の残基492−500、配列番号:2の残基507−5
16、配列番号:2の残基547−556、配列番号:2の残基555−563
及び前記の組み合わせからなる群から選択される、請求項7の方法。 - 【請求項10】 免疫応答を引き起こす工程が、配列番号:2のアミノ酸配
列の少なくとも一部を形成する一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞を含
む一又は複数の組成物を哺乳動物に投与することを含む、請求項1の方法。 - 【請求項11】 免疫応答を引き起こす工程が、αフェトプロテインをコー
ドする組み換えアデノウィルス性ベクターを導入した樹状細胞を含む一又は複数
の組成物を、哺乳動物に投与することを含む、請求項1の方法。 - 【請求項12】 癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも
一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療する方法であって、配列番号:
2の残基137−145、配列番号:2の残基325−334、及び配列番号:
2の残基137−145、配列番号:2の残基158−166、配列番号:2の
残基325−334及び配列番号:2の残基542−550からなる群から選択
される一又は複数のペプチドをヒトに投与することにより、配列番号:2のアミ
ノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障
害性Tリンパ球を活性化する工程を含む方法。 - 【請求項13】 癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも
一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、配列
番号:2の残基158−166及び配列番号:2の残基542−550からなる
群から選択される一又は複数のペプチドをヒトに投与することにより、配列番号
:2のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテ
イン細胞障害性Tリンパ球を活性化する工程を含む方法。 - 【請求項14】 癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも
一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、配列
番号:2の残基1−9、配列番号:2の残基178−186、配列番号:2の残
基218−226、配列番号:2の残基235−243、配列番号:2の残基3
06−315、配列番号:2の残基485−493、配列番号:2の残基492
−500、配列番号:2の残基507−516、配列番号:2の残基547−5
56、及び配列番号:2の残基555−563からなる群から選択される一又は
複数のペプチドをヒトに投与することにより、配列番号:2のアミノ酸配列の少
なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障害性Tリンパ
球を活性化する工程を含む方法。 - 【請求項15】 癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも
一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、配列
番号:2のアミノ酸配列の少なくとも一部を形成する一又は複数のペプチドをパ
ルスした樹状細胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列
番号:2のアミノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプ
ロテイン細胞障害性Tリンパ球を活性化する工程を含む方法。 - 【請求項16】 一又は複数のペプチドをパルスした樹状細胞から選択され
る一又は複数のペプチドが、配列番号:2の残基137−145、配列番号:2
の残基158−166、配列番号:2の残基325−334及び配列番号:2の
残基542−550からなる群から選択される、請求項15の方法。 - 【請求項17】 癌細胞が細胞表面でαフェトプロテイン分子の少なくとも
一部を発現する、ヒトの肝細胞癌を予防又は治療するための方法であって、αフ
ェトプロテインをコードする組み換えアデノウィルスベクターを導入した樹状細
胞を含む一又は複数の組成物をヒトに投与することにより、配列番号:2のアミ
ノ酸配列の少なくとも一部に対して、癌細胞に抗するαフェトプロテイン細胞障
害性Tリンパ球を活性化する工程を含む方法。 - 【請求項18】 配列番号:2の残基137−145、及び配列番号:2の
残基325−334からなる群から選択される、癌の予防又は治療に利用される
単離されたペプチド。 - 【請求項19】 哺乳動物のαフェトプロテインに対する免疫応答を引き起
こすのに十分な量で請求項18の一又は複数のペプチドを含む、癌の予防又は治
療のための組成物。 - 【請求項20】 更にアジュバントを含む請求項19の組成物。
- 【請求項21】 請求項18のペプチドをヒトに投与する工程を含む、ヒト
の癌を予防又は治療する方法。 - 【請求項22】 請求項19の組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒトの
癌を予防又は治療する方法。 - 【請求項23】 請求項20の組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒトの
癌を予防又は治療する方法。 - 【請求項24】 配列番号:2の残基137−145、配列番号:2の残基
158−166、配列番号:2の残基325−334及び配列番号:2の残基5
42−550からなる群から選択される一又は複数のペプチドを含む、癌を予防
又は治療するための手段。 - 【請求項25】 配列番号:2の残基158−166、配列番号:2の残基
542−550に従う配列を有する、癌の予防又は治療に利用される単離された
ペプチド。 - 【請求項26】 哺乳動物のαフェトプロテインに対する免疫応答を引き起
こすのに十分な量で、一又は複数の請求項25のペプチドを含む、癌の予防又は
治療のための組成物。 - 【請求項27】 更にアジュバントを含有する請求項26の組成物。
- 【請求項28】 請求項25のペプチドをヒトに投与する工程を含む、ヒト
の癌を予防又は治療する方法。 - 【請求項29】 請求項26の組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒトの
癌を予防又は治療する方法。 - 【請求項30】 請求項27の組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒトの
癌を予防又は治療する方法。 - 【請求項31】 請求項19の組成物を含む、癌を予防又は治療する手段。
- 【請求項32】 更にアジュバントを含有する請求項31の手段。
- 【請求項33】 請求項31の手段をヒトに投与する工程を含むヒトの癌を
予防又は治療する方法。 - 【請求項34】 請求項32の手段をヒトに投与する工程を含むヒトの癌を
予防又は治療する方法。 - 【請求項35】 請求項26の組成物を含む、癌を予防又は治療するための
手段。 - 【請求項36】 更にアジュバントを含有する請求項35の手段。
- 【請求項37】 請求項35の手段をヒトに投与する工程を含むヒトの癌を
予防又は治療する方法。 - 【請求項38】 請求項36の手段をヒトに投与する工程を含むヒトの癌を
予防又は治療する方法。
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