KR102327091B1 - 암의 치료용 살모넬라 균주 및 이의 용도 - Google Patents

암의 치료용 살모넬라 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암의 치료를 위해 암에 선택적으로 작용하는 살모넬라 균주 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명에 따른 살모넬라 균주는 종양억제효과를 가지나 정상기관에서는 생존력이 현저히 낮아 종래 발명보다 현저한 항암효과를 가질 수 있다.

Description

암의 치료용 살모넬라 균주 및 이의 용도 {Salmonella strain for treating cancer and use thereof}
본 발명은 암에 선택적으로 작용하는 살모넬라 균주 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 현재 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로서, 평균 수명의 연장과 암 발생 연령이 낮아짐에 의해 암 발생률은 계속적으로 증가되고 있는 추세이다. 한국의 국립 암센터(National Cancer Center)에서 제공하는 2013년 통계 자료에 따르면, 2010년 암 등록 통계과에 등록된 우리 나라 암 발생 환자는 모두 202,053 명이며 계속적으로 증가되는 추세이다.
따라서, 암에 관해서는 세포수준의 기본연구에서부터 전방위적인 항암치료에 대한 연구가 전 세계적으로 추진되어 왔으나, 아직까지 암의 발생기전이 불명확하고, 재발방지 및 완치가 어려워 항암제에 대한 수요가 폭발적으로 늘어나고 있으며, 막대한 연구비가 연구소 및 기업체에 투자되고 있다. 하지만, 고가의 항암치료 비용은 직접적인 의료비용 뿐만 아니라 발병 이후의 사회 경제활동의 위축, 재활 및 환자 간호에 따른 간접비용이 추가되어 암환자 가족 및 사회 구성원 전체에게 경제적으로 큰 부담이 되고 있으며 저비용의 새로운 기술도입이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 실정에 맞추어, 약 100여 년 전 세균에 의한 암 억제현상이 보고된 후, 많은 연구진들에 의해 항암효과를 가지는 균주들이 개발되고 있으며 일부 연구 그룹에서는 이미 임상단계가 진행 중에 있다.
낮은 산소분압과 풍부한 영양분, 면역반응의 결핍 등으로 대표되는 암조직의 세포환경 체내에서 증식하는 병원성 균주가 선호하는 서식지의 특징이기도 하다. 특히 암조직의 중심에 위치한 네크로틱 영역(necrotic region)은 약물전달이 효율적으로 이루어지지 않고, 암의 전이 등을 유발한다고 알려져 있는데, 클로스트리듐(Clostridium), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 살모넬라(Salmonella) 등은 암조직 중심에 있는 네크로틱 영역의 풍부한 영양분에 집적하여 증식하며, 이 과정에서 암조직의 축소 및 성장억제 등이 관찰되어 예로부터 항암치료를 위한 생균주로 사용되고 있다.
중국의 Dr. Xu 연구팀은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)을 경구 투여하여 신생혈관생성 억제제인 엔도스테틴(endostatin)을 고형암 조직으로 전달하는 시스템을 고안하였으며, 이후 항암성 항생물질인 아드리아마이신(adriamycin)과의 혼합치료 연구 등을 보고하였다(Xu YF, et al., Cancer Gene Ther. 2007, 14(2):1517; Hu B, et al., Cancer Gene Ther. 2009, 16(8):655-63).
이 밖에 미국 국립 암연구소(NCI)를 비롯한 다양한 연구팀에서 살모넬라의 암성장 저해 결과를 발표하였고 살모넬라 티피무리움(S.typhimurium)의 독성을 약화시킨 변이 균주 개발을 포함한 항암치료물질을 탑재한 약독화 살모넬라 재조합 균주의 항암 효과를 보고하였다(Nishikawa H, et al., J Clin Invest. 2006, 116(7):1946-54, Clairmont, C. et al. J.Infect. Dis. 2000, 181:1996-2002. Nguyen VH, et al., Cancer Res. 2010, 1;70(1):18-23, Kim K, et al., PLoS One. 2013, 8(3):e60511,)
그러나, 생균주를 이용한 항암 치료는 종양 조직 이외의 정상 조직에도 장시간 잔류하며 균주에 의한 부작용 발생이 우려되어 왔다. 특히 종양 치료를 위한 재조합 살모넬라의 강력한 항암치료물질 생성은 정상 조직에 잔류하는 살모넬라에 의해서 조직의 손상을 야기시킬 수 있다. 또한, 종양 세포 사멸 후 제거되지 않고 남은 잔류 살모넬라에 의한 만성 감염시, 보균자로서 다른 주변인에게로의 감염 우려가 있고, 면역 기능이 약화된 환자나 노약자에게는 병원성이 약화된 살모넬라에 의해 치명적인 폐혈증 발생이 가능하며, 만성 감염 시 생성된 항체는 자가면역질환(autoimmune disease)을 일으킬 가능성, 예를 들면, 관절염, 안염, 요도염 등이 발생할 우려가 있다. 따라서, 살모넬라를 이용한 항암치료기술개발에서 살모넬라의 종양조직에 대한 증식 특이성을 높이고, 정상 기관에서의 과다한 면역반응과 이로 인한 부작용을 최소화 하기위하여 종양 조직이 아닌 다른 정상 조직에서의 살모넬라 생존 능력을 효율적으로 조절하여, 정상 기관에서 살모넬라 감염 시 신속하게 제거될 수 있는 균주 개발이 필요하다. 살모넬라의 병원성 유전자를 결여시킨 변이 균주는 살모넬라의 약독성 및 생존 능력을 조절한다고 보고되었다. 살모넬라 병원성 유전자군인 SPI-1(Salmonella pathogenicity island-1) 또는 SPI-2(Salmonella pathogenicity island-2)의 불활성화는 살모넬라 갈리나룸의 병원성이 약화된 효과를 보였으며 (특허 1015008050000), 약독화 살모넬라에 병원성 유전자군에 속하는 단일 유전자의 추가 결여는 비장에서 변이 균주의 생존력을 빠르게 감소시켰다. (특허 1017735800000)
그러나, 살모넬라 갈리나룸에서 SPI-1 또는 SPI-2 유전자 군의 결여는 조류상피세포 내 침투 효율성이 감소하여 비병원성을 갖는 결과로 정상 조직에서 잔류 살모넬라의 생존 능력을 확인 할 수 없으며, 약독화 살모넬라에서 병원성 유전자군에 속하는 단일 유전자의 결여에 의한 비장 내 살모넬라 생존력 감소는 림프구와 다양한 면역세포로 구성되어 있는 면역기관인 비장에 의한 살모넬라에 대한 면역반응 감수성의 증대 효과로 볼 수 있어 면역기관이 아닌 생체 내 모든 정상 조직에 대한 살모넬라 생존 능력을 신속하게 조절한다고 보기 어렵다.
이에, 본 연구자들은 종양 조직이 아닌 다른 정상 조직에서의 살모넬라 생존 능력을 효율적으로 조절하고 항암 효과가 뛰어난 살모넬라 균주를 개발하기 위하여 노력한 결과, 기존에 알려진 약독화 살모넬라 균주에 살모넬라 병원성 유전자군을 추가적으로 결여시킨 결과, 정상기관에서의 생존력은 감소하고 종양 성장이 현저히 억제됨을 확인함으로써, 상기 본 발명의 균주를 항암용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 유전자가 결실된 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 제공하는 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 이용한 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-1); 및 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-2); 가 결실된, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-1)은 살모넬라균 감염초기 장상피세포(intestinal epithelial cell) 침투(invasion)에 필요한 제3형 분비계와 독성 단백질의 유전자 전체 군을 가지고 있는 살모넬라 유전체 내의 특정부위이다(Kimbrough TG et al,Microbes Infect, (2002);4(1):75-82).
본 발명에서, 상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(SPI-1)은 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서, 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-2)는 살모넬라균이 상피세포를 통과한 후 장 면역기관이나 비장, 간 등의 면역기관 내의 대식세포에게 식균(phagocytosis)된 후 식포(phagozome)내에서 용균되지 않고 살아남도록 하는 기작에 관여하는 반응기 단백질과 이들 단백질을 분비하도록 하는 제3형 분비계의 유전자군을 포함하는 특정 유전체부위이다(Waterman SR et al, Cell Microbiol, (2003);5(8):501~511, Abrahams GL, Cell Microbiol, (2006);8(5):728-737). 상기 제3형 분비계(Type III secretion system, TTSS)는 그람 음성균에 발달된 병원성 물질 전달 방법으로, 숙주 세포막을 통과하여 직접 세포질로 병원성 활성 단백질을 주입하는 주사기 형태의 기구(Mota LJ et al, Ann Med.(2005);37(4):234-249)로 다중 단백질 복합구조체이다. 살모넬라균의 감염 경로에서는 제3형 분비계를 통한 병원성 물질 전달 과정이 매우 중요하다고 알려져 있다(Schlumberger MC et al, Curr Opin Microbiol, (2006);9(1):46-54). 야생형의 살모넬라는 TTSS 단백질을 이용하여 숙주의 장내 상피세포(epithelial cell)에 부착(adhesion), 침투(invasion)하고, 대식세포(macrophage)의 식균작용(phagocytosis) 중에도 생존하여, 경우에 따라서는 혈류를 타고 전신감염(Systemic infection)을 일으키는 현상을 보이게 된다. 따라서, TTSS 단백질이 정상적으로 기능할 때, 살모넬라 감염이 진행된다.
본 발명에서, 상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(SPI-2)는 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는, 항암 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 "항암 단백질"이란, 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 펩티드로서, 예를 들면 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes) 및 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "독소 단백질"이란, 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 단백질로서, 예를 들면, 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A; ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 사이토라이신 A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 사이토라이신 A 유전자의 도입은 재조합 벡터에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 13으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하여 제작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 사이토라이신 A(Cytolysin A; ClyA) 유전자는 34-kDa의 세포막에 구멍을 형성하여 세포를 용혈시키는 단백질을 코딩하는 유전자로, 대장균, 살모넬라 등에서 발현된다. 상기 사이토라이신 A의 서열은 WaiSN, Lindmark B, Soderblom T, et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell 2003;115:25-35에 기재되어 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 다양한 원핵세포 유래의 것 및 이들의 기능적 변이체가 본원에 사용될 수 있다. 한 구현예에서 사이토라이신 A(ClyA)의 단백질 accession 번호는 ABI83833.1, 유전자 서열은 DQ910780.1이다. 상기 사이토라이신 A 유전자는 서열번호 15로 나타내어지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 상기 "종양억제 단백질"이란, 정상 세포에 존재하면서 기능을 유지하지만, 그 기능이 상실된 경우에는 정상세포가 무분별한 세포의 분열 및 성장이 유도되어 암 세포로 전환되도록 하는 기능을 하는 유전자로서, 예를 들면, RB(Retinoblastoma protein) 단백질, p53 단백질, APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질, PTEN(Phosphatase and tensin homologue) 단백질, CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A) 단백질 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편은 암 세포의 표면 또는 세포질에 특이적으로 발현 수준이 높은 단백질인 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체로서, 예를 들면, 유방암 또는 위암 세포에 특이적으로 발현 수준이 높은 HER2 등에 특이적인 항체와 같은 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 항체는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이라면, 항체의 일부인 경우라도 포함될 수 있고, 모든 종류의 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 또한, 인간화 항체 등의 특수 항체가 포함될 수 있고, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2, Fv 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "항체"란, 본 발명의 상기 암 항원을 암호화하는 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 얻은 뒤에 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 "혈관신생 억제제"란, 암 세포 주변에서 새로운 혈관이 생성되는 것을 억제하여 암 세포의 사멸을 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 단백질 또는 화합물을 의미한다. 바람직하게 상기 혈관신생 억제제는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin), 및 단백 분해효소 억제 단백질 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "암 항원"이란, 암 세포에서는 발현되지만 정상세포에서는 거의 발현되지 않는 단백질을 항원으로 하여, 이를 통해 항 종양 면역반응을 유도함으로써 암 세포의 직접 또는 간접적 사멸을 유도할 수 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 상기 암 항원은 바람직하게는 알파-페토프로테인(α-fetoprotein; AFP), 혈관내피성장인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2; VEGFR2), 서비빈(Survivin), 레구메인(Legumain), 전립선 암 특이적 항원(Prostate cancer specific antigen; PCSA) 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "전구약물 전환 효소" 란, 비활성 약물을 효소반응에 의한 대사를 통해 활성 약물로 전환되도록 하는 기능을 갖는 단백질로서, 이와 같은 전구약물 전환 효소를 이용하는 경우 비활성 약물이 대사 되어 암 세포의 사멸을 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있는 활성 약물로 전환되도록 하여, 암의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 전구 약물 전환 효소는 바람직하게 티미딘 키나제(Thymidine kinase), 시토신 디아미나아제(cytosine deaminase), 니트로리덕타아제(nitroreductase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase), 카르복시펩티다아제 G2(carboxypeptidase G2), 크로메이트 리덕타아제 YieF(chromate reductase YieF), 헤르페스 심플렉스 바이러스 I형 티미딘 키나아제/간시클로비르(herpes simplex virus type I thymidine kinase/ganciclovir; HSV1-TK/GCV), β-글루터로니다아제(β-glucuronidase) 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "전세포사멸 단백질"이란, 암 세포가 성장 또는 유지되는데 필수적인 인자(단백질, 영양분, 올리고 뉴클레오티드 등)가 결핍되도록 함으로써, 암 세포의 직접 또는 간접적인 사멸을 유도하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 상기 전세포사멸 단백질은, 바람직하게는 L-아스나아제(L-ASNase), RNA-결합 모티프 단백질 5(RNA-binding motif protein 5; RBM5) 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 리포터 유전자를 더 포함하여 상기 리포터 유전자는 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주의 이미징이 가능하도록 할 수 있다.
상기 리포터 유전자는 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo, in vitro) 영상 촬영을 가능할 수 있는 단백질을 코딩하는 것으로, 다양한 유래의 생물발광 유전자, 화학발광 유전자, 형광 유전자를 포함하는 것이다.
본 발명에서, 상기 발광 유전자는 원핵 또는 진핵세포 유래의 루시퍼라제 유전자일 수 있다. 상기 원핵세포 유래 루시퍼라제 유전자는 박테리아 루시퍼라제 유전자(lux)일 수 있다. 상기 진핵세포 유래 루시퍼라제 유전자는 파이어플라이 유래의 발광 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유전자는 플라스미드의 형태로 또는 살모넬라의 유전체에 삽입되어 존재할 수 있다.
본 발명에서 상기 발광 유전자는 플라스미드의 형태로 또는 살모넬라의 유전체에 삽입되어 존재할 수 있다.
본 발명에서, 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis), 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi) 및 장티푸스 균(Salmonella typhi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로부터 유래된 것일 수 있다. 나열된 살모넬라(Salmonella) 속 균주들은 그람 음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당 분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주들은 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 것일 수 있다.
상기 살모넬라 티피무륨(살모넬라 티피뮤리움, Salmonella typhimurium)은 살모넬라(Salmonella) 속의 장티푸스를 일으키는 원인균이다. 상기 살모넬라 티피무륨은 막대기 모양의 간균으로 편모가 있고 그람 음성이다. 상기 살모넬라 티피무륨은 열에 약하여 60℃에서 20분만에 사멸하며, 가축, 야생 동물, 보균자 등이나 우유, 계란 등에 의해 1차 오염되고 오염된 생육 등에서 2차 감염을 받기 쉬운 샐러드 등도 원인이 되어 식중독의 일종인 살모넬라증(Salmonellosis)을 유발할 수 있다.
상기 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis)는 살모넬라(Salmonella)속의 돼지 콜레라균으로 잘 알려져 있는 균으로 사람과 동물 모두에게 감염되는 균이다. 상기 살모넬라 콜레라수이스는 살모넬라에 의한 급성패혈증의 주된 원인균이다. 이 균은 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 그람 음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당 분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 발육최적온도 35~37℃이고 증식가능 온도범위는 10~43℃이며, 60℃에서 20분간 가열로 사멸한다. 최적 pH는 7.2~7.4이고, 크기는 0.5~0.8Х3~4μm이다.
상기 살모넬라 엔테리티디스(살모넬라 엔테라이티디스, Salmonella enteritidis)는 살모넬라(Salmonella) 속의 세균성 감염형 식중독의 원인균으로 장염균이라고도 한다. 상기 살모넬라 엔테리티디스는 살모넬라의 대표적인 균으로 모든 동물에서 감염을 일으킬 수 있고 숙주 적응력이 매우 높다. 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 그람 음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당 분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 발육 최적 온도는 35~37℃이고 증식이 가능한 온도 범위는 10~43℃이며, 60℃에서 20분간 가열로 사멸한다. 최적 pH는 7.2~7.4이고, 크기는 0.5~0.8Х3~4μm이다.
상기 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis)는 계란 또는 가금육류에 의해 감염되는 균주이고, 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi) 및 장티푸스 균(Salmonella typhi)은 장티푸스의 원인균주이다.
본 발명에서 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 구아노신 다인산 합성능이 결여된 변이체일 수 있다. 상기 구아노신 다인산은 구아노신-5-이인산-3-이인산(ppGpp)일 수 있다.
본 발명에서 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 ppGpp 합성효소(ppGpp synthase)를 코딩하는 살모넬라 렐에이(Salmonella-relA) 유전자 및 스포티(Salmonella-spoT) 유전자 중 적어도 하나가 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 ppGpp 합성능을 가진 유전자가 결실된 살모넬라(Salmonella) 속 균주는 종양 억제 효과를 나타내지만, 정상 기관과 조직에서도 유의적인 생존력을 나타내어 살모넬라에 의한 감염이 발생할 수 있으며, 또한, 살모넬라 균의 병원성 유전자만을 결실시킨 균주도 정상 기관에서 병원성이 유지되어 치료용 균주로 활용 가능성이 미미하다. 그러나, 본 발명에서와 같이 상기 ppGpp 합성능 유전자가 불활성화된 살모넬라 속 균주에 추가로 SPI-1 및 SPI-2 유전자를 동시에 결실시킨 살모넬라 속 균주는 정상 기관에서는 상기 균주의 생존력이 현저히 낮아, 살모넬라에 의한 감염이 없을 뿐만 아니라, 상기 ppGpp 합성능을 가진 유전자가 결실된 살모넬라 속 균주 보다 항암 효과 또한 현저히 뛰어난 장점이 있다.
본 발명에서, 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 SHJ2037(기탁번호 KCTC 10787BP)에서 유래하는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "유래"는 재조합 플라스미드 내지 재조합 균주가 유전자 재조합 과정을 거치기 전의 기존 플라스미드 내지 균주를 의미한다.
본 발명의 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주의 유전자의 결실 및 불활성화를 위해서 살모넬라(Salmonella) 속 숙주세포에 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 플라스미드 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 플라스미드는 전기천공 방법을 통해 살모넬라 속 균주에 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 전기천공법은 원형질체(protoplast)에 전기 충격을 주어 세포막이 DNA를 받아들이게 하는 방법이다. 세포에 일정한 간격으로 높은 전압의 전기 자극을 주게 되면 세포막의 작은 구멍이 열리게 되는데, 이때 전기영동(electrophoresis) 작용으로 DNA가 이 구멍을 통해 세포 내로 삽입되게 된다.
본 발명의 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 "암"은 변종 세포의 신속하고 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질병으로서, 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종 및 피부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 결장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 종양 조직에 비하여 정상 조직에서 생존력이 낮은 것일 수 있다. 여기서, 상기 정상 조직은 폐, 간 및 비장으로 이루어진 군에서 선택되는 장기의 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 정상 조직에서는 생존력이 현저히 낮아, 살모넬라에 의한 감염이 없을 뿐만 아니라, 종래의 발명보다 항암 효과 또한 현저히 뛰어난 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 살모넬라(Salmonella) 속 균주의 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-1) 및 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(Salmonella pathogenicity island-2; SPI-2) 유전자를 제거하여 형질 전환된 균주를 얻는 단계를 포함하는, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(SPI-1)은 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(SPI-2)는 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(SPI-1) 및 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(SPI-2)의 유전자 제거는 재조합 벡터에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하여 제작된 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 pKD13, pCP20 또는 pJL39 플라스미드에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 pKD13은 3434bp로 이루어져 있고, 베타-락타마제(beta-lactamase), rrnB 전사 종결자(rrnB transcription terminator), 프라이밍 부위 1(priming site 1), 천연 FRT 부위(natural FRT site), 공통 프라이밍 부위 kt(common priming site kt), Tn5 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(Tn5 neomycin phosphotransferase), 공통 프라이밍 부위 k2(common priming site k2), 공통 프라이밍 부위 k1(common priming site k1), 천연 FRT 부위의 원위 35-nt(distal 35-nt of natural FRT site), 프라이밍 부위 4(priming site 4), 람다 종결자(lambda terminator) 및 R6K 감마 복제 원점(R6K gamma replication origin) 유전자를 포함한다.
상기 pCP20 플라스미드는 9497bp로 이루어져 있고, EcoRI, cat, Pstl, HindⅢ, Ci857, flp, bamHi, 베타-락타마제(beta-lactamase), mobA, mob2 및 repA101ts 유전자로 구성된다.
본 발명의 제조 방법은 항암 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 항암 단백질은 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes) 및 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린(Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A; ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 사이토라이신 A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 사이토라이신 A 유전자의 도입은 재조합 벡터에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 사이토라이신 A 유전자의 도입에 사용된 벡터는 SP-1 및 SP-2 유전자 제거에 사용된 벡터와 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 13으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하여 제작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터 중 상기 플라스미드의 도입은 전기천공 방법을 통하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 사이토라이신 A(ClyA) 유전자를 도입하는 단계는 상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(SPI-1) 및 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(SPI-2)의 유전자 제거 전 또는 후에 수행될 수 있으며, 수행 순서를 특별히 제한하지는 않는다.
본 발명에서, 상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주는, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis), 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi) 및 장티푸스 균(Salmonella typhi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주는 구아노신 다인산 합성능이 결여된 변이체인 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주일 수 있다.
본 발명에서, 상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주는 ppGpp 합성효소(ppGpp synthase)를 코딩하는 살모넬라 렐에이(Salmonella-relA) 유전자 또는 스포티(Salmonella-spoT) 유전자가 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명의 제조 방법은, 상기와 같이 형질 전환된 균주를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양하는 단계는 항생제를 포함하는 LB 배지(Lysogeny broth)를 이용하여 수행될 수 있고, 상기 LB 배지는 시겔라(Shigella) 속 균주의 성장과 플라크 형성을 최적화하기 주세페 베르타니(Giuseppe Bertani)에 의해 위해 개발되었고, 일반적인 성분에는 펩티드, 카제인 펩톤, 비타민(B 비타민 포함), 미량 원소(질소, 황, 마그네슘), 무기질이 포함되며, 삼투압은 염화 나트륨으로 조절된다.
본 발명의 제조 방법은, 상기와 같이 형질 전환된 균주를 항생제 배지에 배양하여 변이 균주를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 항생제는 카나마이신 또는 테트라사이클린일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주, 상기 항암 단백질, 상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주들 및 상기 재조합 벡터에 대한 내용은 상기 조성물에 기재된 바와 동일하여 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 유효 성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "암"은 변종 세포의 신속하고 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질병으로서, 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종 및 피부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 결장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "예방"은 본 발명의 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "개선" 또는 "치료"는 본 발명의 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
본 발명의 상기 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는, 상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은 본 발명에 따른 상기 균주를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 균주는 본 발명에 따른 변이 균주가 개체 내에서 암 세포를 표적한 뒤에, 균주 내에 실시간으로 이미징이 가능한 리포터 단백질이 발현되기 때문에, 정상 조직에 대한 노이즈 시그널 없이 암을 실시간으로 진단할 수 있다.
본 발명의 상기 "리포터 단백질"이란, 시각적으로 암이 진단될 수 있도록 하는 기능을 수행하는 단백질로서, 예를 들면, 형광 단백질, 루시퍼라아제(Luciferase) 및 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "형광 단백질은"은, 암이 시각적으로 진단될 수 있도록 자체적으로 형광을 띄는 단백질로서, 예를 들면 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(Modified Green Fluorescent Protein; MGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein; EGFP), 적색 형광 단백질(Red Fluorescent Protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질(Enhanced Red Fluorescent Protein; ERFP), 청색 형광 단백질(Blue Fluorescent Protein; BFP), 증강된 청색 형광 단백질 Enhanced Blue Fluorescent Protein; EBFP), 황색 형광 단백질(Yellow Fluorescent Protein; YFP) 및 증강된 황색 형광 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein; EYFP) 로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질은 예를 들면, 단순포진바이러스의 티미딘인산효소(Herpes simplex virus thymidine kinsease), 도파민수용체(Dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(Somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(Sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스페린 수용체(Transferrin receptor), 페리틴(Ferritin) 및 철 수송체(magA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "진단"이란, 본 발명의 상기 균주가 암을 표적하여 위치될 때, 상기 균주에 도입된 벡터 또는 염색체에 도입된 리포터 단백질에 의해 실시간으로 암의 존재 여부를 모니터링할 수 있는 것을 포함하는 생체 내 암 조직을 확인하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 진단용 조성물에서, 상기 변이 균주, 벡터, 형질전환, 암 등에 대한 내용은, 앞서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 처리하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 본 발명에 따른 상기 변이 균주를 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 균주로부터 리포터 단백질이 발현되는 경우 암으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"란, 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 조직, 세포(cell), 또는 세포 추출물(cell extract)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단을 위한 정보 제공 방법에서 상기 변이 균주, 항암 단백질, 리포터 단백질, 벡터, 균주, 형질전환, 암, 진단 등에 대한 내용은, 상기 리포터 단백질, 벡터, 균주, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
[서열목록]
서열번호 1: Salmonella pathogenicity island-1
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서열번호 2: Salmonella pathogenicity island-2
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서열번호 3: hilD forward primer
tttgtaagtaatagtcatcagcgtcctgccgcagataacttgtaggctggagctgcttc
서열번호 4: hilD reverse primer
agcttccactgtctactgggtgacgaagatataatgttgtcatatgaatatcctcctta
서열번호 5: SPI-1 forward primer
taattatatcatgatgagttcagccaacggtgatatggcctgtaggctggagctgcttc
서열번호 6: SPI-1 reverse primer
gctggaaggatttcctctggcaggcaaccttataatttcacatatgaatatcctcctta
서열번호 7: SPI-2 forward primer
tgcttaataccatcggacgcccctggttaatactctattatgtaggctggagctgcttc
서열번호 8: SPI-2 reverse primer
ctgaagaagcataccaaaagcatttatggtgtttcggtagcatatgaatatcctcctta
서열번호 9: EcoRI(pJL39 plasmid) forward primer
CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG
서열번호 10: PvuII-XbaI(pJL39 plasmid) reverse primer
GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT
서열번호 11: pSF-OXB1 forward primer
CTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTGCT
서열번호 12: pSF-OXB1 reverse primer
TGAATTCCTCCTGCTAGCTAGTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG
서열번호 13: Cytolysin A forward primer
AGTCCATGGTTATGACCGGAATATTTGC
서열번호 14: Cytolysin A reverse primer
GATGTTTAAACTCAGACGTCAGGAACCTC
서열번호 15: Cytolysin A gene
ATGACCGGAATATTTGCAGAACAAACTGTAGAGGTAGTTAAAAGCGCGATCGAAACCGCAGACGGGGCATTAGATCTTTATAACAAATACCTCGACCAGGTCATCCCCTGGAAGACCTTTGATGAAACCATAAAAGAGTTAAGCCGTTTTAAACAGGAGTACTCGCAGGAAGCTTCTGTTTTAGTTGGTGATATTAAAGTTTTGCTTATGGACAGCCAGGACAAGTATTTTGAAGCGACACAAACTGTTTATGAATGGTGTGGTGTCGTGACGCAATTACTCTCAGCGTATATTTTACTATTTGATGAATATAATGAGAAAAAAGCATCAGCCCAGAAAGACATTCTCATTAGGATATTAGATGATGGTGTCAAGAAACTGAATGAAGCGCAAAAATCTCTCCTGACAAGTTCACAAAGTTTCAACAACGCTTCCGGAAAACTGCTGGCATTAGATAGCCAGTTAACTAATGATTTTTCGGAAAAAAGTAGTTATTTCCAGTCACAGGTGGATAGAATTCGTAAGGAAGCTTATGCCGGTGCTGCAGCCGGCATAGTCGCCGGTCCGTTTGGATTAATTATTTCCTATTCTATTGCTGCGGGCGTGATTGAAGGGAAATTGATTCCAGAACTGAATAACAGGCTAAAAACAGTGCAAAATTTCTTTACTAGCTTATCAGCTACAGTGAAACAAGCGAATAAAGATATCGATGCGGCAAAATTGAAATTAGCCACTGAAATAGCAGCAATTGGGGAGATAAAAACGGAAACCGAAACAACCAGATTCTACGTTGATTATGATGATTTAATGCTTTCTTTATTAAAAGGAGCTGCAAAGAAAATGATTAACACCTGTAATGAATACCAACAAAGACACGGTAAGAAGACGCTTTTCGAGGTTCCTGACGTCTAA
본 발명에 따른 유전자가 결실된 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 정상 조직에서는 그 생존력이 매우 낮지만, 암 조직에서는 생존하면서 암 세포의 사멸을 효과적으로 유도하여, 우수한 항암 효과와 함께 살모넬라(Salmonella) 속 균주에 의한 감염의 부작용이 없는 장점이 있다.
도 1은 pJH18 플라스미드 제작을 위한 방법을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는pJH18 플라스미드를 포함하는 재조합 균주 간의 성장속도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 균주 간의 성장속도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 살모넬라 균주의 리포터 단백질의 발현 확인 결과이다.
도 5는 배양된 균주에서 루시퍼라아제(Luciferase) 활성을 측정하기 위해 코엘렌테라진을 첨가하여 이미징을 나타낸 것이다.
도 6은 배양된 균주에서 루시퍼라아제(Luciferase) 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 균주의 혈액 아가에 대한 용혈 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양액의 ATP를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 마우스 간에서 살모넬라 분포도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스 종양에서 살모넬라 분포도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 균주가 처리된 종양 동물 모델의 비장을 적출하는 과정을 나타낸 것이다.
도 12는 균주가 처리된 종양 동물 모델의 비장의 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 균주가 처리된 종양 동물 모델의 비장의 무게를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 CT26을 주사한 종양 동물 모델에 본 발명의 일 실시예인 CNC18과 대조군인 PBS 및 SHJ2037을 접종한 후 종양 크기를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 CT26을 주사한 종양 동물 모델에서 각 균주를 접종한 후 생존율을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 MC38을 주사한 종양 동물 모델에 본 발명의 일 실시예인 CNC18과 대조군인 PBS 및 SHJ2037을 접종한 후 종양 크기를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 MC38을 주사한 종양 동물 모델에서 각 균주를 접종한 후 생존율을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 18은 종양 동물 모델에 균주 주입 후 종양 내 백혈구의 비율을 측정하여 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 종양 동물 모델에 균주 주입 후 종양 내 호중구를 측정하여 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 종양 동물 모델에 균주 주입 후 종양 내 자연살해세포를 측정하여 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 종양 동물 모델에 균주 주입 후 종양 내 CD8+ T 세포를 측정하여 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 22는 종양 동물 모델에 균주 주입 후 림프절 내 수지상세포를 측정하여 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 23은 종양 동물 모델에 균주 주입 후 종양 내 M2 대식세포를 측정하여 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 24는 종양 동물 모델에 균주 주입 후 종양 내 조절 T 세포(Treg cell)를 측정하여 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 25는 종양 동물 모델에 SHJ2037lux와 CNC18lux 균주를 주입한 후 1일째 종양과 장기를 적출하여 in vivo 이미지 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 이용한 이미지를 촬영한 것이다.
도 26은 종양 동물 모델에 SHJ2037lux와 CNC18lux 균주를 주입한 후 3일째 종양과 장기를 적출하여 in vivo 이미지 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 이용한 이미지를 촬영한 것이다.
도 27은 종양 동물 모델에 SHJ2037lux와 CNC18lux 균주를 주입한 후 5일째 종양과 장기를 적출하여 in vivo 이미지 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 이용한 이미지를 촬영한 것이다.
도 28은 다발성 골수종 동물 모델에 SHJ2037lux와 CNC18lux 균주를 주입한 후 in vivo 이미지 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 이용한 이미지를 촬영한 것이다.
도 29는 다발성 골수종 동물 모델에 SHJ2037lux와 CNC18lux 균주를 주입한 후 in vivo 이미지 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 이용한 이미지를 촬영한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[준비예 1] 약독화 살모넬라의 제작
본 발명의 약독화 살모넬라는 SHJ2037 균주를 템플레이트(template)로 하고 병원성에 관련된 유전자 혹은 유전자군을 람다 파지(
Figure 112020062771256-pat00001
phage, lambda phage)를 이용한 상동재조합(homologous recombination) 방법으로 결여시켜 약독화 살모넬라 균주를 제작하였다.
구체적으로, pKD13 플라스미드를 이용하여 각 유전자의 개방해독틀(open reading frame)의 위치에 Kan 카세트를 보유한 DNA 조각을 PCR 증폭하였다. 총 3개 유전자(군)의 제거에 사용된 PCR 프라이머 서열은 하기의 표 1과 같다. PCR 생성물인 pKD46를 세포 내에 포함하고 있는 살모넬라 티피무리움 SMR2130 (SHJ2037, DrelA, DspoT) 현탁액에 전기천공(electroporation) 방법을 통해 도입하고 카나마이신(Kanamycin) 배지에 배양하여 콜로니를 선별했다. 이후 형질 전환된 균주에 pCP20 플라스미드(Datsenko KA, et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2000, 6;97(12):6640-5)를 전기천공을 이용하여 도입하고 FLP 재조합효소(recombinase)를 통해 kan 카세트를 제거하여 균주를 제작하였다.
변이 균주 유전자 프라이머 서열
(전진: 5'에서 3'으로)		 프라이머 서열
(후진: 5'에서 3'으로)
CNC16 hilD 서열번호 3 서열번호 4
CNC17 SPI 1 서열번호 5 서열번호 6
CNC18 SPI 1, 2 서열번호 7 서열번호 8
[준비예 2] 유전자 발현을 위한 재조합 살모넬라 제작
도 1은 pJH18 플라스미드 제작을 위한 방법을 모식도로 나타낸 것이다. pJL39 플라스미드(Mol Ther., 21(11), p. 1985-1995, (2013))를 주형 가닥으로 하여, 제한효소 EcoRI 부위를 포함하도록 제작된 정방향 프라이머(5'-CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG-3'; 서열번호 9) 및 제한 효소 PvuII-XbaI 부위를 포함하도록 제작된 역방향 프라이머(5'-GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT-3'; 서열번호 10)를 이용하여 tetR 유전자를 증폭하였다. 이후, 상기 증폭 산물에 제한효소 EcoRI 및 XbaI을 넣어 절단하고 이를 정제하여, tetR 유전자 증폭 산물을 얻은 뒤에, 이를 pBAD24(카탈로그 번호. ATCC®　87399??, ATCC, 미국) 플라스미드에 도입하는 과정을 통해 pBAD-TetR 플라스미드를 제작하였다.
그런 다음, 상기 pJL39 플라스미드의 PvuⅡ 및 HindⅢ 단편을 통해, 다중 클로닝 사이트를 포함하는 다이버전트(Divergent) 프로모터 영역을 상기 pBAD-TetR 플라스미드에 도입하여 pTetR-BAD 플라스미드를 제작하였다. NheI 및 Pcil 제한효소를 사용하여 상기 pTetR-BAD 플라스미드로부터 araC 및 araBAD 프로모터를 제거하여, pTetⅡ 플라스미드를 제작하였다.
또한, pSF-OXB1 (Oxford Genetics, England)를 주형으로 하여 정방향 프라이머 (5'-CTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTGCT-3'; 서열번호 11) 및 역방향 프라이머 (5'-TGAATTCCTCCTGCTAGCTAGTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3'; 서열번호 12)로 증폭된 항시적 프로모터인 OXB1을 깁슨 어셈블리 방식을 사용하여 상기 pTetⅡ 플라스미드에 도입함으로써 최종적으로 OXB1, tetA 및 tetR 프로모터를 포함하는 pJH18 플라스미드를 제작하였다.
상기 pJH18 플라스미드를 템플레이트로 하여, Rluc8 및 사이토라이신 A(ClyA)를 암호화하는 유전자를 상기 프로모터의 하류에 도 1과 같은 조합으로 도입하는 과정을 통해 pJH18-CR 플라스미드를 제작하였다. 이때 상기 사이토라이신 A(ClyA) 유전자를 도입하기 위해 사용되는 정방향 프라이머는 5′-AGTCCATGGTTATGACCGGAATATTTGC-3'(서열번호 13)이고, 역방향 프라이머는 5′-GATGTTTAAACTCAGACGTCAGGAACCTC-3'(서열번호 14)이다.
[준비예 3] 형질 전환된 살모넬라 속 변이 균주의 제작
상기 준비예 1에서 제작한 살모넬라 균주에 상기 준비예 2에서 제작한 플라스미드를 전기천공법(Electroporation)을 이용하여 형질 전환한 뒤, 100 ㎍/ml의 엠피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 고체 배지를 이용하여 상기 형질 전환된 각각의 균주를 밤새 배양하였다. 그 뒤, 생성된 콜로니를 엠피실린이 포함된 LB 액체 배지로 배양하여 실험에 사용하였다. 이렇게 제작된 살모넬라 속 변이 균주에서의 형질 전환된 내용을 정리하면 하기 표 2와 같다.
구분 변이 균주 결실 유전자 삽입 유전자
비교예 1 SHJ2037 relA, spoT ClyA, Rluc8
비교예 2 CNC16 relA, spoT, hilD ClyA, Rluc8
비교예 3 CNC17 relA, spoT, SPI 1 ClyA, Rluc8
제조예 CNC18 relA, spoT, SPI 1, 2 ClyA, Rluc8
[실험예 1] 재조합 살모넬라의 단백질 발현 및 활성 평가
[1-1] 살모넬라 변이체 균주와 기존 균주의 성장 비교
상기 비교예 1 및 제조예로 제작된 재조합 SHJ2037, CNC18 콜로니를 엠피실린이 포함된 LB 액체배지에 밤새 키운 후 새로운 LB 배지를 사용하여 1:100의 비율로 희석하고, 추가 배양을 통해 OD600 값이 0.5 내지 0.7에 도달할 때, 상기 배양액에 최종 농도가 200 ng/ml으로 되도록 에탄올로 희석된 독시사이클린을 첨가하고 200 rpm 및 37℃의 조건으로 진탕 배양기에서 배양하였다. 배양 시간에 따라 OD600 값을 측정하여 균주의 성장 패턴을 분석하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
한편, 재조합 되지 않은 기존 살모넬라 콜로니를 같은 방식으로 처리하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 2 및 3에서 보는 바와 같이, CNC18 재조합 살모넬라는 기존 약독화 살모넬라인 SHJ2037 및 야생형 살모넬라 균주와 성장 속도 차이가 거의 없으며 독시사이클린을 이용한 단백질 발현 중에도 특별한 성장 저해를 가지고 있지 않았다. 따라서 상기와 같이 제작된 살모넬라 균주의 병원성 유전자 결여가 살모넬라 균주의 성장 및 유전자 발현에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
[1-2] 웨스턴 블롯 분석을 통한 단백질 발현 수준 비교
상기 비교예 1 및 제조예로 제작된 재조합 SHJ2037, CNC18 살모넬라 균주 간의 사이토라이신 A(ClyA) 유전자의 발현 수준을 평가하기 위하여, 상기 실험예 [1-1]과 같이 배양된 균주에서 발현된 Rluc8 단백질을 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 [1-1]의 균주의 배양액을 4 x 107 CFU/ml이 되도록 PBS를 이용하여 희석하고, 13,000rpm에서 5분동안 원심분리 하여 펠렛을 수집하였다. 상기 펠렛 분획을 PBS를 이용하여 세척하고, 0.2% β- 머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) (카탈로그 번호: EBA-1052, ELPIS BIOTECH)이 포함된 SDS 샘플 완충액과 혼합하여 균주 용해물을 수득하였다. 그런 다음, 12% SDS-PAGE에서 상기 균주 용해물을 전기영동 하고, 상기 겔로부터 니트로 셀룰로스 막에 단백질을 옮긴 뒤 5% 탈지유를 이용하여 상온에서 블로킹 하였다. 이후, Rluc8 항체(카탈로그 번호: AB3256, 밀리포어, 미국)를 이용하여 Rluc8 단백질의 발현 수준을 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 두 재조합 SHJ2037, CNC18 살모넬라 균주는Rluc8 유전자를 과발현하였으며 균주 간 발현 수준은 큰 차이가 없음을 확인하였다.
[1-3] 단백질 활성 분석을 통한 기능적 발현 수준 비교
상기 실험예 [1-1]과 같이 배양된 균주에서 루시퍼라아제 활성의 측정을 위해, 도 5와 같이 상기 균주를 1 ml의 PBS에 재현탁 시켰다. 그런 다음, 상기 재현탁된 균주에 기질인 에탄올에 희석된 1 μg/ml의 코엘렌테라진(Coelenterazine)을 첨가한 뒤, NightOWL II LB 983 In Vivo 이미징 시스템(Berthold technologies, GmbH & Co. KG, 독일) 또는 바이오래드 이미저 ChemoDocTM XRS+시스템을 사용하여 1초 노출 시간의 조건으로 루시퍼라아제 활성 값을 측정하였다. 이렇게 측정된 값은 각 균주의 CFU에 의한 표준화를 수행하고, 상대적 발광 유닛(Relative luminescence units; RLU)으로 계산하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, 루시퍼라아제 활성 값은 독시사이클린이 존재하는 경우에서만 확인되었으며 유도체 민감도와 활성 최대값이 유사함을 확인하였다.
또한, PBS에 희석된 상기 준비예 3에 의해 선별된 재조합 살모넬라 균주를 0 또는 20 ng/ml의 독시사이클린이 포함된 혈액 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 배양한 뒤 플레이트 사진을 촬영하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 균주의 혈액 아가의 용혈 활성은 사이토라이신 A를 암호화하는 유전자의 독시사이클린이 포함된 경우(+)에서만 나타나는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 재조합 CNC18 살모넬라 균주는 사이토라이신 A(ClyA) 유전자 발현을 조절할 수 있으며 항암 유전자 전달체로서 기능을 가짐을 확인하였다.
[실험예 2] 재조합 살모넬라 처리에 의한 종양 세포의 DAMP 신호(signal) 분비 확인
재조합 살모넬라 균주가 종양 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해, SHJ2037 및 CNC18 균주가 처리된 종양 세포에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 손상연관분자유형 (Damage-Associated Molecular Pattern; DAMP)의 변화를 확인하였다. DAMP 중에서 세포 외 분비를 하는 ATP를 측정하였다. 구체적으로, 쥐의 CT26 결장암 세포주인 CRL-2638 및 HB-8064(ATCC, 미국)을 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS) 및 1%의 페니실린-스트렙토 마이신이 포함된 고 포도당 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium) 배지(카탈로그 번호: #LM 001-05, 웰진, 한국)을 사용하여, 5% CO2 배양기에서 37℃의 조건으로 배양한 뒤 재조합 살모넬라를 종양 세포에 처리하여 공동 배양하였다. 배양액을 시간에 따라 어쎄이 키트(assay kit)를 이용하여 ATP를 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 종양 세포에서 분비된 ATP 값은 살모넬라를 처리한 경우 증가하였으며, 본 발명에 따른 살모넬라 균주 자체가 종양 치료에 이용될 수 있음을 확인하였다.
[실험예 3] 소동물 종양 모델에서 재조합 살모넬라의 분포도 분석
항암 치료를 위해 연구에서 사용되는 소동물인 마우스 모델에 약독화 살모넬라 균주를 주입하였을 때 숙주 내 균주의 증식 속도와 분포를 확인하였다.
구체적으로, 4 종의 SHJ2037, CNC16, CNC17, 그리고 CNC18 균주를 각각 LB 액체 배지에 배양 후, PBS로 세척 및 희석하였다. 상기 각각의 균주를 최종 균주 농도가 2 x 107 CFU/마우스가 되도록 마우스의 꼬리 정맥에 주입하고, 균주 당 3마리씩의 마우스를 안락사시킨 후, 숙주의 장기들을 적출하여 파쇄 및 희석하여 LB 고체 배지에 도말 배양하여 생균 수를 측정하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한, 종양을 포함한 마우스를 마찬가지 방법으로 처리하여, 숙주의 종양들을 적출하여 파쇄 및 희석하여 LB 고체 배지에 도말 배양하여 생균 수를 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, CNC18 균주는 간에서 매우 낮은 생존력을 보이며 빠르게 사멸하나 종양에는 잔존하여 특이적이고 선택적인 표적 능력을 가짐을 확인하였다.
반면, CNC16 균주는, 도 9에서 나타난 바와 같이, 간에서 SHJ2037 균주보다 높은 생존력을 가지고, CNC18보다 100배 이상 높은 생존력을 가지는 것을 확인하였다. 즉, CNC16 균주는 종양 외 다른 장기에서도 비특이적인 표적 능력을 가짐을 확인하였다.
또한, CNC17도 간에서 SHJ2037 균주보다 높은 생존력을 보였다. 즉, CNC17 균주 역시, 비특이적인 표적 능력을 가짐을 확인하였다.
도 10에서 나타낸 바와 같이, 종양에서 CNC17 균주는 CNC18 균주에 비해 10배 이상 낮은 생존력을 가졌다. 즉, CNC17 균주는 종양에 대해서 CNC18 균주에 비해 낮은 효과를 가짐을 확인하였다.
[실험예 4] 살모넬라 주입에 의한 과염증 반응 분석(1)
1차로 살모넬라 주입에 의한 과염증 반응를 확인하기 위해 CT26 종양 모델 마우스 9마리에 SHJ2037 및 CNC18 균주 및 PBS를 각각 3마리씩 주입한 후 시간에 따른 마우스 각각에 대한 비장의 무게를 측정하여 비교하였다. 도 11과 같이 마우스를 개복하고, 비장을 적출하여 각 마우스 별 비장의 크기를 측정하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 균주 처리군들은 PBS를 처리한 대조군에 비해 비장의 크기가 늘어났으나, CNC18은 균주 처리군은 SHJ2037 균주 처리군에 비해 비장의 크기가 작은 것을 알 수 있었으며, 본 발명에 따른 살모넬라 균주가 과염증 반응을 최소화하는 것을 확인하였다.
[실험예 5] 살모넬라 주입에 의한 과염증 반응 분석(2)
추가로 살모넬라 주입에 의한 과염증 반응을 확인하기 위해, 실험예 4와 같은 방법으로 SHJ2037, CNC16, CNC17, 및 CNC18 균주별로 마우스에 각각 주입한 후 1, 3, 5일째 비장의 무게를 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, SHJ2037, CNC16, CNC17 균주 처리군은 PBS를 처리한 대조군에 비해 비장의 무게가 늘어났으나, CNC18은 균주 처리군 중 가장 증가 폭이 적었다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 약독화 살모넬라 균주는 종양에 강한 표적 능력을 유지하면서 감염 초기부터 모든 정상 장기에서 생존력이 크게 감소하고 빠르게 사멸됨으로써 숙주에게 균주에 의한 부작용을 최소화함을 확인하였다.
[실험예 6] 소동물 종양 모델에서 약독화 살모넬라의 항암 효과 분석(1)
상기 실험예 2와 같이 배양된 종양 세포(CT26 1x106 cell/mice)를 쥐(BALB/C, n=7)의 옆구리에 피하 주사하여, 종양 동물 모델을 구축하였다. 이 모델에 SHJ2037과 CNC18 살모넬라 균주를 꼬리 정맥에 주입하였다. 종양 동물 모델의 항암 효과를 평가하기 위해, 2% 이소플루란(Isoflurane)을 사용하여 마취한 뒤, 종양 크기(mm3)를 (길이 × 높이 × 너비)/2를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 14 및 15에 나타내었다.
도 14 및 15에서 보는 바와 같이, 대조군과 비교하여, 살모넬라 처리군이 암 성장을 저해하고 생존율이 증가됨을 확인하였다. 특히 CNC18 균주는 SHJ2037보다 종양 성장 억제 효과가 현저히 뛰어남을 확인하였다.
따라서 종양에 강한 표적 능력을 유지하면서 감염초기부터 모든 정상 장기에서 생존력이 크게 감소하고 빠르게 사멸되는 CNC18 균주는 숙주 내 감염으로 인한 부작용을 최소화하면서 탁월한 종양 치료 효능을 지니는 것을 확인하였다.
[실험예 7] 소동물 종양 모델에서 약독화 살모넬라의 항암 효과 분석(2)
배양된 종양 세포(MC38, 쥐 결장 선암세포, 1x106 cell/mice)를 쥐(C57BL/6, n=6)의 옆구리에 피하 주사하여, 종양 동물 모델을 구축하였다. 이 모델에 SHJ2037과 CNC18 살모넬라 균주를 꼬리 정맥에 주입하였다. 종양 동물 모델의 항암 효과를 평가하기 위해, 2% 이소플루란(Isoflurane)을 사용하여 마취한 뒤, 종양 크기(mm3)를 (길이 × 높이 × 너비)/2를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 16 및 17에 나타내었다.
도 16 및 17에서 보는 바와 같이, 대조군과 비교하여, 살모넬라 처리군이 암 성장을 저해하고 생존율이 증가됨을 확인하였다. 특히 CNC18 균주는 SHJ2037보다 더 종양 성장을 억제함을 확인하였다.
[실험예 8] 살모넬라 주입에 의한 면역 활성화 효과 확인
살모넬라 주입에 의한 면역 활성화 효과를 확인하기 위해 면역 세포를 측정하여 비교하였다. 상기 실험예 6과 같이 구축된 종양 동물 모델에 SHJ2037과 CNC18 살모넬라 균주를주입하고 3일째에 면역 세포를 채취하였다.면역 세포는 종양 및 종양 주위의 림프절에서 채취하였다. 채취된 상기 면역 세포의 양을 측정한 후, 그 결과를 도 18 내지 24와 같이 나타내었다.
도 18 내지 22에 나타낸 바와 같이, CNC18 균주 처리군이 PBS 대조군 및 SHJ2037 대조군에 비해 백혈구, 호중구, 자연살해세포 및 CD8+ T 세포의 비중이 늘어났고, 림프절에서의 수지상세포 역시 증가하였다. 반면, 도 23 및 24에 나타난 바와 같이, CNC18 균주 처리군이 PBS 대조군 및 SHJ2037 대조군에 비해 면역 억제작용을 하는 M2 대식세포 및 조절 T 세포(Treg cell)는 줄어들었다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 CNC18 약독화 살모넬라 균주는 PBS 대조군 및 SHJ2037 대조군에 비해 면역 기능을 크게 상승시키는 효과를 확인하였다.
[실험예 9] 살모넬라에 의한 종양 영상화 분석(1)
상기 실험예 2와 같이 배양된 종양 세포를 쥐의 옆구리에 피하 주사하여, 종양 동물 모델을 구축하였다. 이 모델에 SHJ2037lux와 CNC18lux 살모넬라 균주를 주입하였다. 여기서, 상기 SHJ2037lux와 CNC18lux 균주는 SHJ2037 균주와 CNC18 균주에 발광 유전자를 도입한 균주이다. 상기 발광 유전자는 박테리아 루시퍼라제 유전자(lux)를 사용하였다.
종양 동물 모델에서 균주의 영상화 효과를 평가하기 위해, 인 비보 이미지 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 이용하여 시간 별로 장기 및 종양을 적출한 후 이미지를 촬영하였으며, 그 결과를 도 25 내지 27에 나타내었다.
도 25 내지 27에서 나타난 것처럼, SHJ2037lux 균주와 같이, CNC18lux 균주를 주입한 경우 종양에 특이적이고 선택적으로 생존능력을 보이며 실시간으로 영상화 할 수 있음을 확인하였다.
[실험예 10] 살모넬라에 의한 종양 영상화 분석(2)
배양된 MOPC 세포를 쥐의 정강이뼈에 주사하여 다발성 골수종(multiple myeloma) 모델을 구축한 뒤, 실험예 9와 마찬가지로 SHJ2037lux와 CNC18lux 살모넬라 균주를 주입하였다. 다음으로 in vivo 이미지 시스템(In Vivo Imaging System; IVIS)을 이용하여 시간별로 이미지를 촬영하였으며, 그 결과를 도 28 및 29에 나타내었다.
도 28 및 29에서 나타난 것처럼, CNC18lux 균주를 주입한 경우 종양에 특이적이고 선택적으로 생존능력을 보이며 실시간으로 영상화 할 수 있음을 확인하였다. 특히, 종양 주변부에 잔류하며 이미지 시그널이 분산된 SHJ2037lux와 달리 CNC18lux 균주의 경우 종양 심부까지 도달하여 더 명확한 영상을 실시간으로 확인할 수 있었다.
상기 실험예 1 내지 10에서 알 수 있는 것처럼, CNC18 균주는 종양에 강한 표적 능력을 유지하면서 감염초기부터 모든 정상 장기에서 생존력이 크게 감소하고 빠르게 사멸되는 CNC18 균주는 숙주 내 감염으로 인한 부작용을 최소화하면서 탁월한 종양 치료 효능을 지니는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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tgacaatatc tgaatttttg ctgctgcaga 660 acaataagcc agaatttata cactatgagc taattttcta ttttaaatca gcaaacacta 720 tgcaagttgg ccaatttaat tagcgggcgg catcagtttc ataatgattg catcaggatt 780 ttgccacccg ctcccggtat tgtttacata ttaaaatgat ttttaactgg tgctgacaac 840 tatgctaaat acgcaggaag tacttaaaga aggagagaag cggaaaatcc gcagcccgga 900 agcatggttt atacagacgt gttccgcgca aaagctgcat atgtcatttt ctgaaagccg 960 acacaatgaa aattgcctga ttcaggaagg cgcgctgctt ttttgcgagc aggccgttgt 1020 cgcaccagta tcaggagacc tggtttttcg accgttaaaa attgaagtac tcagcaaatt 1080 actggcattt atcgatggcg caggattagt ggacacgaca tatgctgaat ccgataaatg 1140 ggttttgctg agtcctgagt ttcgcgctat ttggcaagat cgtaaacgct gcgagtactg 1200 gtttttgcag caaattatta cgccttctcc ggccttcaat aaggtactgg cgctgttacg 1260 aaaaagcgag agttactggt tggttggcta tttactcgct cagtcaacca gcggcaacac 1320 gatgagaatg ctgggagaag actatggcgt ttcttatacc cattttcgtc gtttgtgcag 1380 cagagcgttg ggcggaaaag cgaagagtga attacgaaac tggcgtatgg cgcaatcgct 1440 gctgaatagt gtagaaggcc acgagaacat cacccaatta gccgttaatc atggttactc 1500 atcgccttca catttttcta gtgagatcaa agagctgatc ggcgtttcgc cgcggaaatt 1560 atcaaatatt attcaattgg cagacaaatg aagacacata ttcttttggc cagagtgctg 1620 gcatgtgccg cgcttgttct ggttacacct ggttattcta gtgaaaaaat acctgtaacg 1680 ggaagtgggt ttgttgcgaa agacgatagc ctgcggacat ttttcgatgc catggcgcta 1740 cagctaaagg agcctgtcat tgttagcaaa atggcggcac gaaaaaaaat tacgggcaac 1800 tttgagtttc acgatcctaa cgcattactg gagaagcttt ccctacaact ggggctgatt 1860 tggtatttcg atgggcaggc tatctatatt tatgacgcca gtgaaatgcg caatgccgtg 1920 gtttctttac gcaacgtctc actcaatgag ttcaacaatt ttctaaaacg ctcaggttta 1980 tataacaaaa attacccgct acgtggcgat aaccgtaaag gaacattcta tgtttcaggg 2040 ccacccgtct atgttgatat ggtggtcaac gccgccacca tgatggacaa gcaaaacgat 2100 ggtattgagc tgggacgcca gaaaataggg gtgatgcgtc tgaacaatac cttcgtgggc 2160 gatcgtacct ataatctgcg cgatcagaaa atggttattc ccggtattgc tacggccatt 2220 gaaaggttat tgcagggaga agagcaaccc ttaggtaata ttgtcagtag cgaacccccg 2280 gcgatgccag cgttttcagc gaatggagaa aaaggtaaag cagcaaatta tgccggtggc 2340 atgagtctgc aggaagcttt aaagcaaaat gccgcggcgg gcaatattaa aatcgtggcc 2400 tatccggata ccaacagttt gttagtaaag ggaacggctg agcaggtgca ttttatcgaa 2460 atgctggtta aagcgctgga tgtcgccaaa cgtcacgtag aattatccct gtggattgtc 2520 gatcttaata aaagcgatct ggagcgtttg ggcacttcat ggagcggcag cataactatt 2580 ggggacaaac ttggcgtgtc attaaaccag tcttcaataa gtaccctcga tggcagtcga 2640 ttcatcgccg cggtcaatgc gttagaagag aagaaacagg cgacggtggt ttcgcgcccg 2700 gtattactga ctcaggaaaa tgttcccgct atttttgata acaacagaac gttttacacc 2760 aagctgattg gggaacgtaa tgtggcgctt gagcatgtaa catacggaac aatgatccga 2820 gtgctgcccc gtttttccgc agatggtcag atagaaatgt cgctggacat tgaagatggc 2880 aacgataaga cgccgcaatc tgatactacc acctccgtag atgcgttacc cgaagtcggg 2940 cgaacgttaa ttagcactat tgcgagagtg ccgcacggaa aaagtttgct ggtcgggggt 3000 tatacacggg atgcaaatac cgatactgtc caaagtattc cgtttttagg caaattaccg 3060 cttattggta gcctgttccg ttattccagt aagaataaaa gtaatgttgt tcgtgtgttc 3120 atgattgaac caaaagaaat tgtcgacccg ttaacgccgg atgccagcga atcggtaaac 3180 aatattctga agcaaagcgg tgcctggagt ggggacgata agttacagaa atgggttcgt 3240 gtttatctgg atagaggtca ggaggcaatt aaatgattcc tggctcaacc tccggtattt 3300 cattttccag aatattgtcc cggcagacat ctcatcagga tgcgacccag catactgatg 3360 cgcaacaggc ggaaatacaa caggccgcag aggattcgtc tccaggggcg gaagtacaaa 3420 aatttgtcca gtcgacggac gaaatgtcag cggcgctggc gcaatttcgt aaccgtcgcg 3480 attatgaaaa aaaatccagt aatttatcta acagttttga acgcgtgctg gaggatgagg 3540 ctttaccgaa ggcgaagcaa atcttaaagc taattagcgt acatggcggc gcgttagaag 3600 attttttacg tcaggcgcgt agcttatttc ctgaccccag tgatttagtc cttgtgttac 3660 gcgaattgct tcgtcgtaaa gacctggaag agatcgtgcg gaaaaagctg gagtcgttac 3720 ttaagcacgt tgaagagcaa accgatccga agaccctcaa ggcagggatt aattgtgcgt 3780 tgaaggcccg gctttttggg aaaacattat cgttaaaacc aggcttattg cgcgccagct 3840 atcggcaatt tatccagagt gaatcacatg aagtggagat ttactctgac tggatagcca 3900 gttatggcta tcaacgtcga ctggtggtac tggattttat tgagggttcg ctattaaccg 3960 atattgacgc gaatgacgcc agctgttcgc gcctggagtt tggccagctt ttacgacgcc 4020 tgacgcaact taaaatgttg cgctccgctg acctactgtt tgtgagtaca ttgttgtcgt 4080 attcgtttac caaagcgttt aatgcggagg agtcgtcgtg gttactactg atgctttcgc 4140 tattgcaaca gccacatgaa gtggattcgc tgttagccga tattataggt ttgaatgcgt 4200 tattgcttag tcataaagaa catgcatcct ttttgcagat attttatcaa gtatgtaaag 4260 ccataccctc ttcactcttt tatgaagaat attggcagga agaattgtta atggcgttac 4320 gtagtatgac cgatattgcc tacaagcatg aaatggcaga acagcgtcgt actattgaaa 4380 agctgtctta atttaatatt aacaggatac ctatagtgct gctttctcta cttaacagtg 4440 ctcgtttacg acctgaatta ctgattctgg tactaatggt gatgatcatt tctatgttcg 4500 tcattccatt acctacctat ctggttgatt tcctgatcgc actgaatatc gtactggcga 4560 tattggtgtt tatggggtcg ttctacattg acagaatcct cagtttttca acgtttcctg 4620 cggtactgtt aattaccacg ctctttcgtc tggcattatc gatcagtacc agtcgtctta 4680 tcttgattga agccgatgcc ggtgaaatta tcgccacgtt cgggcaattc gttattggcg 4740 atagcctggc ggtgggtttt gttgtcttct ctattgtcac cgtggtccag tttatcgtta 4800 ttaccaaagg ttcagaacgt gtcgcggaag tcgcggcccg attttctctg gatggtatgc 4860 ccggtaaaca gatgagtatt gatgccgatt tgaaggccgg tattattgat gcggatgccg 4920 cgcgcgaacg gcgaagcgta ctggaaaggg aaagccagct ttacggttcc tttgacggtg 4980 cgatgaagtt tatcaaaggt gacgctattg ccggcatcat tattatcttt gtgaacttta 5040 ttggcggtat ttcggtgggg atgactcgcc atggtatgga tttgtcctcc gccctgtcta 5100 cttataccat gctgaccatt ggtgatggtc ttgtcgccca gatccccgca ttgttgattg 5160 cgattagtgc cggttttatc gtgacccgcg taaatggcga tagcgataat atggggcgga 5220 atatcatgac gcagctgttg aacaacccat ttgtattggt tgttacggct attttgacca 5280 tttcaatggg aactctgccg ggattcccac tgccggtttt tgttatttta tcggtggttt 5340 taagcgtact cttctatttt aaattccgtg aagcaaaacg tagcgccgcc aaacctaaaa 5400 ccagcaaagg cgagcagccg ctcagtattg aggaaaaaga agggtcgtcg ttaggactga 5460 ttggcgatct cgataaagtc tctacagaga ccgtaccgtt gatattactt gtgccgaaga 5520 gccggcgtga agatctggaa aaagctcaac ttgcggagcg tctacgtagt cagttcttta 5580 ttgattatgg cgtgcgcctg ccggaagtat tgttacgaga tggcgagggc ctggacgata 5640 acagcatcgt attgttgatt aatgagatcc gtgttgaaca 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ttagttcgtt ccgcactgga 6540 agtaagtggt tgcgatcctt cattaattgg aggaatagat agccattcaa caattgttct 6600 ggatttattt gcattgccaa gtatctgtat cagcgtcaag gacgatgatg tatggatctg 6660 ggcgcaattg ggtgctgaca gcatggtggt attacaacag cgggcttatg aaatcttaat 6720 gaccataatg gaaggatgcc attttgcccg cggcgggcaa ttactactgg gggagcagaa 6780 tggggagcta acgcttaaag ccttagtgca tccggatttt ttatctgacg gtgaaaagtt 6840 ctctactgcc ttgaatgggt tttacaacta tctggaagtt tttagtcggt cgctaatgag 6900 atgaaaacac ctcgtttact gcaatatctg gcctacccac aaaaaataac cggcccaatt 6960 attgaggcgg aattgcgcga tgtggccatt ggcgaactgt gtgaaatacg ccgtggctgg 7020 caccaaaaac aggttgttgc acgtgcgcag gtggttggct tacagcggga acgcaccgtg 7080 ctgagcctta tcggcaatgc ccaggggctg agccgcgatg tcgtgcttta tcccactgga 7140 cgtgcgttat cggcgtgggt gggatactcg gtattaggcg cggtgttgga tccgacaggg 7200 aaaatcgttg agcgttttac ccctgaagtg gcgccgatta gcgaagaacg cgttattgat 7260 gtcgcaccgc cgtcttacgc ttcacgcgtt ggcgtccgtg aaccgctgat taccggtgtg 7320 cgcgcgattg acgggttatt gacctgtggc gtaggccagc gaatgggcat ttttgcctcc 7380 gcaggatgcg gtaagaccat gctgatgcat atgctgatcg agcaaacgga ggcggatgtc 7440 tttgttatcg gtcttatcgg tgaacgaggc cgtgaggtca ctgaattcgt ggatatgttg 7500 cgcgcttcgc ataagaaaga aaaatgcgtg ctggtttttg ccacttccga tttcccctcg 7560 gtcgatcgct gcaatgcggc gcaactggcg acaaccgtag cggaatattt tcgcgaccag 7620 ggaaaacggg tcgtgctttt tatcgattcc atgacccgtt atgcgcgtgc tttgcgagac 7680 gtggcactgg cgtcgggaga gcgtccggct cgtcgaggtt atcccgcctc cgtattcgat 7740 aatttgcccc gcttgctgga acgcccaggg gcgaccagcg agggaagcat tactgccttt 7800 tatacggtac tgctggaaag cgaggaagag gcggacccga tggcggatga aattcgctct 7860 atccttgacg gtcacctgta tctgagcaga aagctggccg ggcagggaca ttacccggca 7920 atcgatgtac tgaaaagcgt aagccgcgtt tttggacaag tcacgacgcc gacacatgct 7980 gaacaggcat ctgccgtgcg taaattaatg acgcgtttgg aagagctcca gcttttcatt 8040 gacttgggag aatatcgtcc tggcgaaaat atcgataacg atcgggcgat gcagatgcgg 8100 gatagcctga aagcctggtt atgccagccg gtagcgcagt attcatcctt tgatgacacg 8160 ttgagcggta tgaatgcatt cgctgaccag aattaaagta ttgcagcggc gctgtacggt 8220 atttcattca cagtgtgagt cgatattact tcgctatcag gatgaggacc gcgggctgca 8280 ggccgaggag gaggcgatcc ttgaacaaat agcgggtctg aaattgttat tagatacgct 8340 gcgtgcagaa aacagacagc tcagtcgtga ggaaatttat acgttattac gtaagcagtc 8400 tattgttcgc cggcagataa aagatttaga actccagatt atacaaattc aggaaaaacg 8460 gagcgagctg gaaaagaaaa gggaagagtt tcagaaaaaa agtaaatatt ggttgcgcaa 8520 agaagggaac tatcaacgct ggataatccg tcagaaaaga ttctatatcc agcgagagat 8580 acagcaggaa gaggccgagt cagaggagat aatttaatgg gcgatgtgtc agctgtcagt 8640 tcatccggga acattttact gccgcagcag gatgaggttg gcggtttatc agaagcatta 8700 aaaaaagcgg tggaaaaaca taagacagaa tattccggtg ataaaaaaga tcgcgactat 8760 ggcgatgctt tcgtaatgca taaagaaacg gctttaccgt tattactggc ggcatggcga 8820 catggcgcgc cagcgaaatc agaacatcac aatggcaacg tttctggtct gcatcataac 8880 ggaaaaagcg aactcaggat tgctgaaaaa ctgttgaaag tcactgctga aaaatctgtc 8940 ggtttgatct ctgcggaggc caaagtagat aaatccgcag cgttgctatc gtctaaaaat 9000 aggccgttag aaagcgtaag cggtaaaaaa ttatctgctg atttaaaagc tgtggaatcc 9060 gttagtgaag taaccgataa cgccacggga atctctgacg ataatatcaa ggcattgcct 9120 ggggataata aagccatcgc gggcgaaggc gttcgtaaag agggcgcgcc gctggcgcgg 9180 gatgtcgcac ctgcccgaat ggccgcagcc aataccggta agcctgaaga taaagatcat 9240 aaaaaggtta aagatgtttc tcagcttccg ctgcaaccaa ccactatcgc cgatcttagc 9300 caattaaccg gcggcgatga aaaaatgcct ttagcggcgc aatcaaagcc gatgatgact 9360 atttttccca ctgccgatgg cgtgaaagga gaggatagct cgctgactta ccgttttcag 9420 cgctggggaa atgactattc cgtcaatatt caggcgcggc aagcagggga gttttcgtta 9480 ataccgtcaa atacgcaggt tgaacatcgt ttgcatgatc aatggcaaaa cggtaatccc 9540 cagcgctggc acctgacgcg agacgatcaa caaaatccgc agcagcaaca gcacagacag 9600 caatctggcg aggaggatga cgcctgatgt cattgcgtgt gagacagatt gatcgtcgcg 9660 aatggctatt ggcgcaaacc gcgacagaat gccagcgcca tggccgggaa gcgacgctgg 9720 aatatccgac gcgacaggga atgtgggttc ggttgagcga tgcagaaaaa cggtggtcgg 9780 cctggattaa acctggggac tggcttgagc atgtctctcc cgctctggct ggggcggcgg 9840 tttctgctgg cgctgagcac ctggtcgttc cctggcttgc 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tttgttatgt ggcccataat gcatgatgcc 10740 tacgtctatt ttgaggacga agatgtcacc tttaatgata tttcatcatt aagtaaacac 10800 gttgatgaag gtctggatgg ttatcgcgat tatctgatca aatattcaga tcgcgagtta 10860 gttcagtttt ttgaaaacgc gcaactgaag cgtcagtatg gagaagagac cgagacggta 10920 aagcgtgaca aagatgaaat tgaaaaacct tcaatatttg cgttattacc tgcttatgcg 10980 ctgagcgaaa taaaaagcgc gtttaaaatt ggtttttatc tttatttgcc ctttgtcgtc 11040 gtcgacctgg tggtatccag cgtgctactg gcgctgggga tgatgatgat gagtccggtg 11100 acgatatcta cacctattaa gctggtgctt tttgtcgcgc ttgatggctg gaccttactg 11160 tctaagggat tgatattaca gtatatggac attgcaacat gacatcatta cgagacggga 11220 tagttaaatg gatgatttag tgtttgcagg taataaggcg ctctatcttg ttttgatcct 11280 gtcagggtgg ccgacgattg tcgcaacgat tatcggcctc ctggtagggt tattccagac 11340 ggtaacgcaa ttacaggaac agacgctgcc ttttggcatt aaattacttg gcgtgtgttt 11400 atgcttgttt ttactgtctg gctggtatgg cgaagtttta ctctcttacg ggcgtcaggt 11460 gatattcctg gcgttggcta aggggtaaaa aatgttttac gcgttgtact ttgaaattca 11520 tcacctggtt gcgtctgcgg cgctagggtt tgctcgcgtg gcgccgattt ttttcttcct 11580 gccgtttttg aatagcgggg tattaagcgg tgcgccgaga aacgccatta tcatcctggt 11640 ggcattggga gtatggccgc atgcattgaa cgaggcgccg ccgtttttat cggtggcgat 11700 gatcccgtta gttctgcaag aagcggcggt aggcgtcatg ctgggctgtc tgctgtcatg 11760 gcctttttgg gttatgcatg cgctgggttg tattatcgat aaccagcgag gggcaacgct 11820 aagtagtagt atcgatccgg caaacggtat tgatacctcg gaaatggcta atttcctgaa 11880 tatgtttgcc gctgtcgttt atttacaaaa cggcggtctg gtcacgatgg ttgacgtgtt 11940 aaataaaagc tatcagctat gcgatccgat gaacgagtgc acgccttcat taccgccgct 12000 attaacgttt attaatcagg tggctcaaaa cgccttggtt ctggccagtc cggtggtatt 12060 agtgctgttg ctgtcagaag tattcctggg tttattgtcg cgctttgctc cgcaaatgaa 12120 cgcttttgcg atttcactga cggtaaaaag cggtattgcc gttttaatta tgctgcttta 12180 tttctctccg gtactaccgg acaatgtact gcgactctct ttccaggcca cagggttaag 12240 cagttggttt tacgagcgag gggcgacgca tgtcctcgaa taaaacagaa aaaccgacta 12300 aaaaacggct ggaagactcc gctaaaaaag gccagtcatt taaaagtaaa gatctcatta 12360 tcgcctgcct 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ttcaattagc aggattagct 17280 gaacggcctt tagcaaccaa tatgttctgg cggcaaggac aatatgaaac ctatctaaac 17340 tatcataacg gtcgtattca cttatgtcag atactcaagc aaaccttctt agacgaagaa 17400 ctgcttttta aagcgttggc taactggaaa cccgcagcgt tccagggtat tcctcaacga 17460 ttatttttgt tgcgcgatgg gcttgcaatg agttgttctc cacctctttc cagctccgcc 17520 gagctctggt tacgattaca tcatcgacaa ataaaatttc tggagtcgca atgcgttcat 17580 ggttaggtga gggagtcagg gcgcaacagt ggctcagtgt atgcgcgggt cggcaggata 17640 tggttctggc gacggtgtta ttaatcgcta ttgtgatgat gctgttacct ttgccgacct 17700 ggatggttga tatcctgatt actatcaacc ttatgttttc agtgatcctg ctcttaattg 17760 ctatttatct tagtgaccct ctcgatttat cggtatttcc gtctttatta cttattacta 17820 cattatatcg tttgtcactc acaatcagca catcacggct ggtactgtta caacataatg 17880 ccggtaatat tgtggatgct ttcggtaagt ttgtcgtagg aggaaatctc accgttgggt 17940 tggtcgtatt taccatcatt actatcgtgc aatttattgt cattacaaaa ggtatcgaga 18000 gggtggcgga agttagcgca cgtttctcgc ttgatgggat gccaggcaaa caaatgagta 18060 tcgatggcga tttgcgtgcc ggagttatcg atgcagacca tgcccgtaca ttaagacagc 18120 atgtccagca ggaaagccgc tttctcggtg cgatggacgg tgcgatgaaa tttgttaaag 18180 gcgatacgat tgccggtatt attgttgttc tggtgaacat tatcggcggt atcattatcg 18240 ctatcgtaca atatgatatg tcgatgagtg aggctgttca cacttatagc gtactgtcaa 18300 tcggagatgg tttatgtggg caaattccat cgctgctgat ttcccttagc gcgggaatta 18360 ttgtcacccg tgtcccgggt gagaaacgcc agaacctggc gacagagttg agttctcaaa 18420 ttgccagaca acctcagtcg ctcatattaa ccgctgtggt tttaatgctc ctcgctttaa 18480 ttcctggctt tccttttatc actctcgctt tcttttcagc gttgttagca ttgccaatta 18540 tcctcattcg ccgcaaaaag tctgtggttt ccgcaaatgg cgtcgaagca ccggaaaaag 18600 atagtatggt tcccggcgca tgtcctctaa tcttacgtct tagcccgacg ttacattctg 18660 ccgacctgat tcgtgatatt gacgccatga gatggttttt atttgaggat accggcgtcc 18720 ctctccctga ggtgaatatt gaggttttgc ctgaacccac cgaaaaattg acggtactgc 18780 tatatcagga acccgtattt agtttatcta ttcccgctca ggcggattat ttattgatag 18840 gcgcggacgc tagtgtggtg ggtgacagcc agacgttacc gaacgggatg gggcagatct 18900 gttggcttac aaaagacatg gcccataagg cgcaaggttt tggactggac gttttcgcgg 18960 gcagccaacg tatctctgcc ttattaaaat gtgtcctgct tcggcatatg ggagagttta 19020 ttggtgttca ggaaacgcgt tatctaatga atgcgatgga aaaaaactac tctgagctgg 19080 tgaaagagct tcagcgccag ttacccatta ataaaatcgc tgaaactttg caacggcttg 19140 tatcagagcg ggtttctatt agagatttac gtcttatttt cggcacctta attgactggg 19200 cgccacgtga aaaagatgtc ctgatgttga cagaatatgt ccgtatcgcg cttcgtcgtc 19260 atattctgcg tcgtcttaat ccggaaggaa aaccgctgcc gattttgcgg atcggcgaag 19320 gtattgaaaa cctcgtgcgt gaatccattc gccagacggc aatggggacc tatactgcgc 19380 tgtcgtctcg tcataagacg cagatcctgc aacttatcga gcaggcgctg aagcagtcag 19440 ccaaattatt cattgtcact tctgtcgaca cccgacgttt cttgcgaaaa attacagaag 19500 ccaccttgtt cgacgtaccg attttgtcat ggcaggaatt aggagaggag agccttatac 19560 aagtggtaga aagtattgac cttagcgaag aggagttggc ggacaatgaa gaatgaattg 19620 atgcaacgtc tgaggctgaa atatccgccc cccgatggtt attgtcgatg gggccgaatt 19680 caggatgtca gcgcaacgtt gttaaatgcg tggttgcctg gggtatttat gggcgagttg 19740 tgctgtataa agcctggaga agaacttgct gaagtcgtgg ggattaatgg cagcaaagct 19800 ttgctatctc cttttacgag tacaatcggg cttcactgcg ggcagcaagt gatggcctta 19860 aggcgacgcc atcaggttcc cgtgggcgaa gcgttattag ggcgagttat tgatggcttt 19920 ggtcgtcccc ttgatggccg cgaactgccc gacgtctgct ggaaagacta tgatgcaatg 19980 cctcctcccg caatggttcg acagcctatc actcaaccat taatgacggg gattcgcgct 20040 attgatagcg ttgcgacctg tggcgaaggg caacgagtgg gtattttttc tgctcctggc 20100 gtggggaaaa gcacgcttct ggcgatgctg tgtaatgcgc cagacgcaga cagcaatgtt 20160 ctggtgttaa ttggtgaacg tggacgagaa gtccgcgaat tcatcgattt tacactgtct 20220 gaagagaccc gaaaacgttg tgtcattgtt gtcgcaacct ctgacagacc cgccttagag 20280 cgcgtgaggg cgctgtttgt ggccaccacg atagcagaat tttttcgcga taatggaaag 20340 cgagtcgtct tgcttgccga ctcactgacg cgttatgcca gggccgcacg ggaaatcgct 20400 ctggccgccg gagagaccgc ggtttctgga gaatatccgc caggcgtatt tagtgcattg 20460 ccacgacttt tagaacgtac gggaatggga gaaaaaggca gtattaccgc attttatacg 20520 gtactggtgg aaggcgatga tatgaatgag ccgttggcgg atgaagtccg ttcactgctt 20580 gatggacata ttgtactatc ccgacggctt gcagagaggg ggcattatcc tgccattgac 20640 gtgttggcaa cgctcagccg cgtttttcca gtcgttacca gccatgagca tcgtcaactg 20700 gcggcgatat tgcgacggtg cctggcgctt taccaggagg ttgaactgtt aatacgcatt 20760 ggggaatacc agcgaggagt tgatacagat actgacaaag ccattgatac ctatccggat 20820 atttgcacat ttttgcgaca aagtaaggat gaagtatgcg gacccgagct acttatagaa 20880 aaattacacc aaatactcac cgagtgatca tggaaacttt gctggagata atcgcgcggc 20940 gtgaaaagca attacgcggc aagcttaccg tacttgatca gcagcaacag gcgattatta 21000 cggaacagca gatttgccag acgcgcgctt tagcagtgtc taccagactg aaagaattaa 21060 tgggctggca aggtacgtta tcttgtcatt tattgttgga taagaaacaa caaatggccg 21120 ggttattcac tcaggcgcag agctttttga cgcaacggca gcagttagag aatcagtatc 21180 agcagcttgt ctcccggcga agcgaattac agaagaattt taatgcgctt atgaaaaaga 21240 aagaaaaaat tactatggta ttaagcgatg cgtattacca aagttgaggg aagtcttggg 21300 ttgccatgcc agtcttatca ggatgataac gaggcggagg cggaacgtat ggactttgaa 21360 caactcatgc accaggcatt acccattggt gagaataatc ctcctgcagc attgaataag 21420 aacgtggttt tcacgcaacg ttatcgtgtt agtggcggtt atcttgacgg tgtagagtgt 21480 gaagtatgtg aatcaggggg gctaatccag ttaagaatca atgtccctca tcatgaaatt 21540 taccgttcga tgaaagcgct aaagcagtgg ctggagtctc agttgctgca tatggggtat 21600 ataatttccc tggagatatt ctatgttaag aatagcgaat gaagagcgtc cgtgggtgga 21660 gatacttcca acgcaaggcg ctaccattgg tgagctgaca ttgagtatgc aacaatatcc 21720 agtacagcaa gggacattat ttaccataaa ttatcataat gagctgggta gggtgtggat 21780 tgcagaacaa tgctggcagc gctggtgtga agggctaatt ggcaccgcta atcgatcggc 21840 tatcgatcct gaattgctat atggaatagc tgaatggggg ctggcgccgt tattgcaagc 21900 cagtgatgca accctctgtc agaacgagcc gccaacatcc tgcagtaatc taccacatca 21960 gctagcgttg catattaaat ggacagttga agagcatgag ttccatagca ttatttttac 22020 atggccaacg ggttttttgc gcaatatagt cggagagctt tctgctgagc gacaacagat 22080 ttatcctgcc cctcctgtgg tagtccctgt atattcaggc tggtgccagc ttacattaat 22140 cgaacttgag tctatcgaaa tcggcatggg cgttcggatt cattgcttcg gcgacatcag 22200 actcggtttt tttgctattc aactacctgg gggaatctac gcaagggtgt tgctgacaga 22260 ggataacacg atgaaatttg acgaattagt ccaggatatc gaaacgctac ttgcgtcagg 22320 gagcccaatg tcaaagagtg acggaacgtc ttcagtcgaa cttgagcaga taccacaaca 22380 ggtgctcttt gaggtcggac gtgcgagtct ggaaattgga caattacgac aacttaaaac 22440 gggggacgtt ttgcctgtag gtggatgttt tgcgccagag gtgacgataa gagtaaatga 22500 ccgtattatt gggcaaggtg agttgattgc ctgtggcaat gaatttatgg tgcgtattac 22560 acgttggtat ctttgcaaaa atacagcgta aacctgataa gaaaaataat atgcgaacaa 22620 tataatagcg ttccaggtcg tgtcatgaga gatacagtat gtctttaccc gattcgcctt 22680 tgcaactgat tggtatattg tttctgcttt caatactgcc tctcattatc gtcatgggaa 22740 cttctttcct taaactggcg gtggtatttt cgattttacg aaatgctctg ggtattcaac 22800 aagtcccccc aaatatcgca ctgtatggcc ttgcgcttgt actttcctta ttcattatgg 22860 ggccgacgct attagctgta aaagagcgct ggcatccggt tcaggtcgct ggcgctcctt 22920 tctggacgtc tgagtgggac agtaaagcat tagcgcctta tcgacagttt ttgcaaaaaa 22980 actctgaaga gaaggaagcc aattattttc ggaatttgat aaaacgaacc tggcctgaag 23040 acataaaaag aaagataaaa cctgattctt tgctcatatt aattccggca tttacggtga 23100 gtcagttaac gcaggcattt cggattggat tacttattta tcttcccttt ctggctattg 23160 acctgcttat ttcaaatata ctgctggcta tggggatgat gatggtgtcg ccgatgacca 23220 tttcattacc gtttaagctg ctaatatttt tactggcagg cggttgggat ctgacactgg 23280 cgcaattggt acagagcttt tcatgaatga ttctgaattg acgcaatttg taacgcaact 23340 tttatggatc gtccttttta cgtctatgcc ggtagtgttg gtggcatcgg tagttggtgt 23400 catcgtaagc cttgttcagg ccttgactca aatacaggac caaacgctac agttcatgat 23460 taaattattg gcaattgcaa taaccttaat ggtcagctac ccatggctta gcggtatcct 23520 gttgaattat acccggcaga taatgttacg aattggagag catggttgaa tggcacaaca 23580 ggtaaatgag tggcttattg cattggctgt ggcttttatt cgaccattga gcctttcttt 23640 attacttccc ttattaaaaa gtggcagttt aggggccgca cttttacgta atggcgtgct 23700 tatgtcactt acctttccga tattaccaat catttaccag cagaagatta tgatgcatat 23760 tggtaaagat tacagttggt tagggttagt cactggagag gtgattattg gtttttcaat 23820 tgggttttgt gcggcggttc ccttttgggc cgttgatatg gcggggtttc tgcttgatac 23880 tttacgtggc gcgacaatgg gtacgatatt caattctaca atagaagctg aaacctcact 23940 ttttggcttg cttttcagcc agttcttgtg tgttattttc tttataagcg gcggcatgga 24000 gtttatatta aacattctgt atgagtcata tcaatattta ccaccagggc gtactttatt 24060 atttgaccag caatttttaa aatatatcca ggcagagtgg agaacgcttt atcaattatg 24120 tatcagcttc tctcttcctg ccataatatg tatggtatta gccgatctgg ctttaggtct 24180 tttaaatcgg tcggcacaac aattgaatgt gtttttcttc tcaatgccgc tcaaaagtat 24240 attggttcta ctgacgctcc tgatctcatt cccttatgct cttcatcact atttggttga 24300 aagcgataaa ttttatattt atctaaaaga ctggtttcca tctgtatgag cgagaaaaca 24360 gaacagccta cagaaaagaa attacgtgat ggccgtaagg aagggcaggt tgtcaaaagt 24420 attgaaataa catcattatt tcagctgatt gcgctttatt tgtattttca tttctttact 24480 gaaaagatga ttttgatact gattgagtca ataactttca cattacaatt agtaaataaa 24540 ccattttctt atgcattaac gcaattgagt catgctttaa tagagtcact gacttctgca 24600 ctgctgtttc tgggcgctgg ggtaatagtt gctactgtgg gtagcgtgtt tcttcaggtg 24660 ggggtggtta ttgccagcaa ggccattggt tttaaaagcg agcatataaa tccggtaagt 24720 aattttaagc agatattctc tttacatagc gtagtagaat tatgtaaatc cagcctaaaa 24780 gttatcatgc tatctcttat ctttgccttt ttcttttatt attatgccag tacttttcgg 24840 gcgctaccgt actgtgggtt agcctgtggc gtgcttgtgg tttcttcttt aataaaatgg 24900 ttatgggtag gggtgatggt tttttatatc gtcgttggca tactggacta ttcttttcaa 24960 tattataaga ttagaaaaga tctaaaaatg agtaaagatg acgtaaaaca ggagcataaa 25020 gatctggagg gcgaccctca aatgaagacg cggcgtcggg aaatgcagag tgaaatacaa 25080 agtgggagtt tagctcaatc tgttaaacaa tctgttgcgg tagtgcgtaa tccaacgcat 25140 attgcggttt gtcttggcta tcatcccacc gatatgccaa taccacgcgt cctggaaaaa 25200 ggcagtgatg ctcaagctaa ctatattgtt aacatcgctg aacgcaactg catccccgtt 25260 gttgaaaatg ttgagctggc ccgctcatta ttttttgaag tggaacgcgg agataaaatt 25320 cctgaaacgt tatttgaacc cgttgcagcc ttgttacgta tggtgatgaa gatagattat 25380 gcgcattcta ccgaaacacc ataaatgctt ttggtatgct tcttcaggcc actgcgaagg 25440 25440 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hilD forward primer <400> 3 tttgtaagta atagtcatca gcgtcctgcc gcagataact tgtaggctgg agctgcttc 59 <210> 4 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hilD reverse primer <400> 4 agcttccact gtctactggg tgacgaagat ataatgttgt catatgaata tcctcctta 59 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-1 forward primer <400> 5 taattatatc atgatgagtt cagccaacgg tgatatggcc tgtaggctgg agctgcttc 59 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-1 reverse primer <400> 6 gctggaagga tttcctctgg caggcaacct tataatttca catatgaata tcctcctta 59 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-2 forward primer <400> 7 tgcttaatac catcggacgc ccctggttaa tactctatta tgtaggctgg agctgcttc 59 <210> 8 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPI-2 reverse primer <400> 8 ctgaagaagc ataccaaaag catttatggt gtttcggtag catatgaata tcctcctta 59 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI(pJL39 plasmid) forward primer <400> 9 cggaattcac catgtctaga ttagataaaa gtaaagtgat taacag 46 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PvuII-XbaI(pJL39 plasmid) reverse primer <400> 10 gctctagaca gctgttaaga cccactttca catttaagtt gtttttct 48 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSF-OXB1 forward primer <400> 11 ctactccgtc aagccgtcaa gctgttgtga ccgcttgct 39 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSF-OXB1 reverse primer <400> 12 tgaattcctc ctgctagcta gttggtaacg aatcagacgc cgggtaatac cggatag 57 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytolysin A forward primer <400> 13 agtccatggt tatgaccgga atatttgc 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytolysin A reverse primer <400> 14 gatgtttaaa ctcagacgtc aggaacctc 29 <210> 15 <211> 912 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cytolysin A gene <400> 15 atgaccggaa tatttgcaga acaaactgta gaggtagtta aaagcgcgat cgaaaccgca 60 gacggggcat tagatcttta taacaaatac ctcgaccagg tcatcccctg gaagaccttt 120 gatgaaacca taaaagagtt aagccgtttt aaacaggagt actcgcagga agcttctgtt 180 ttagttggtg atattaaagt tttgcttatg gacagccagg acaagtattt tgaagcgaca 240 caaactgttt atgaatggtg tggtgtcgtg acgcaattac tctcagcgta tattttacta 300 tttgatgaat ataatgagaa aaaagcatca gcccagaaag acattctcat taggatatta 360 gatgatggtg tcaagaaact gaatgaagcg caaaaatctc tcctgacaag ttcacaaagt 420 ttcaacaacg cttccggaaa actgctggca ttagatagcc agttaactaa tgatttttcg 480 gaaaaaagta gttatttcca gtcacaggtg gatagaattc gtaaggaagc ttatgccggt 540 gctgcagccg gcatagtcgc cggtccgttt ggattaatta tttcctattc tattgctgcg 600 ggcgtgattg aagggaaatt gattccagaa ctgaataaca ggctaaaaac agtgcaaaat 660 ttctttacta gcttatcagc tacagtgaaa caagcgaata aagatatcga tgcggcaaaa 720 ttgaaattag ccactgaaat agcagcaatt ggggagataa aaacggaaac cgaaacaacc 780 agattctacg ttgattatga tgatttaatg ctttctttat taaaaggagc tgcaaagaaa 840 atgattaaca cctgtaatga ataccaacaa agacacggta agaagacgct tttcgaggtt 900 cctgacgtct aa 912

Claims (32)

  1. 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-1); 및 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(Salmonella pathogenicity island-2; SPI-2);가 결실되고 ppGpp 합성효소(ppGpp synthase)를 코딩하는 살모넬라 렐에이(Salmonella-relA) 유전자 및 스포티(Salmonella-spoT) 유전자 중 적어도 하나가 불활성화된, 항암용 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주로서, 상기 균주는 정상 조직에서는 증식이 억제되어 종양 선택적 표적능력을 가지는, 균주.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(SPI-1)은 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어진, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(SPI-2)는 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어진, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는, 항암 단백질을 암호화하는 유전자가 추가로 도입된 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 항암 단백질은 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes), 및 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A; ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 사이토라이신 A는 서열번호 15로 나타내어지는 염기서열로 이루어진, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 종양억제 단백질은 RB(Retinoblastoma protein) 단백질, p53 단백질, APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질, PTEN(Phosphatase and tensin homologue) 단백질 및 CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 혈관신생 억제제는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 및 단백 분해효소 억제 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  10. 제 5항에 있어서,
    상기 암 항원은 알파-페토프로테인(α-fetoprotein; AFP), 혈관내피성장인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2; VEGFR2), 서비빈(Survivin), 레구메인(Legumain) 및 전립선 암 특이적 항원(Prostate cancer specific antigen; PCSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  11. 제 5항에 있어서,
    상기 전구약물 전환 효소는 티미딘 키나제(Thymidine kinase), 시토신 디아미나아제(cytosine deaminase), 니트로리덕타아제(nitroreductase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase), 카르복시펩티다아제 G2(carboxypeptidase G2), 크로메이트 리덕타아제 YieF(chromate reductase YieF), 헤르페스 심플렉스 바이러스 I형 티미딘 키나아제/간시클로비르(herpes simplex virus type I thymidine kinase/ganciclovir; HSV1-TK/GCV) 및 β-글루터로니다아제(β-glucuronidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  12. 제 5항에 있어서,
    상기 전세포사멸 단백질은 L-아스나아제(L-ASNase) 또는 RNA-결합 모티프 단백질 5(RNA-binding motif protein 5; RBM5)인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis), 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi) 및 장티푸스 균(Salmonella typhi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로부터 유래한, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주는 구아노신 다인산 합성능이 결여된 변이체인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주.
  15. 삭제
  16. 살모넬라(Salmonella) 속 균주의 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-1) 및 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(Salmonella pathogenicity island-1; SPI-2) 유전자를 제거하고, ppGpp 합성효소(ppGpp synthase)를 코딩하는 살모넬라 렐에이(Salmonella-relA) 유전자 및 스포티(Salmonella-spoT) 유전자 중 적어도 하나가 불활성화된, 형질 전환된 균주를 얻는 단계를 포함하는 항암용 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법으로서, 상기 균주는 정상 조직에서는 증식이 억제되어 종양 선택적 표적능력을 가지게 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(SPI-1) 및 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(SPI-2)의 유전자 제거는 재조합 벡터에 의해 수행되는 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-1(SPI-1)은 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어진, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  19. 제 16항에 있어서,
    상기 살모넬라균 병원성 아일랜드-2(SPI-2)는 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어진, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  20. 제 16항에 있어서,
    항암 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하는 단계를 더 포함하는, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 항암 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A; ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 사이토라이신 A를 암호화하는 유전자는 서열번호 15로 나타내어지는 염기서열로 이루어진, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  23. 제 16항에 있어서,
    상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주는, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis), 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi) 및 장티푸스 균(Salmonella typhi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  24. 제 16항에 있어서,
    상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주는 구아노신 다인산 합성능이 결여된 변이체인 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  25. 삭제
  26. 제 16항에 있어서,
    상기 형질 전환된 균주를 배양하는 단계; 를 더 포함하는, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  27. 제 16항에 있어서,
    상기 형질 전환된 균주를 항생제 배지에 배양하여 변이 균주를 선별하는 단계를 더 포함하는, 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  28. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 암은 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 살모넬라(Salmonella) 속 변이 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물.
  31. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 제 1항 내지 제 14항의 균주를 처리하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 균주로부터 리포터 단백질이 발현되는 경우 암으로 진단하는 단계를 더 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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