CN107406822A - 包含肽微基因表达系统的基于李斯特菌的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供包含含有微基因表达构建体的李斯特菌递送载体的组合物，以及将所述组合物用于诱导针对抗原表达性肿瘤或癌症的免疫应答和用于治疗所述肿瘤或癌症的方法，和针对具有所述肿瘤的受试者中的肿瘤进行疫苗接种的方法。

Description

包含肽微基因表达系统的基于李斯特菌的组合物及其使用 方法
技术领域
本文公开了包含含有微基因表达构建体的李斯特菌递送载体的组合物，以及将所述组合物用于诱导针对抗原表达性肿瘤或癌症的免疫应答和用于治疗所述肿瘤或癌症的方法，和针对具有所述肿瘤或癌症的受试者中的肿瘤或癌症进行疫苗接种的方法。
背景技术
单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是主要感染抗原呈递细胞并且已适应在这些细胞的细胞质中生活的细胞内病原体。宿主细胞诸如巨噬细胞、主动吞噬细胞单核细胞增多性李斯特菌和大部分细菌在吞噬溶酶体中降解。一些细菌通过溶血素、李斯特菌溶血素O(LLO)的作用刺穿噬菌溶酶体膜而逃入宿主胞质溶胶。一旦处于胞质溶胶中，单核细胞增多性李斯特菌即可使宿主肌动蛋白聚合，并且直接从细胞传递到细胞，从而进一步入侵宿主免疫系统并产生可忽略的对单核细胞增多性李斯特菌的抗体应答。
从李斯特菌进行的重组蛋白表达已涉及将编码包含所关注的抗原性序列的全长蛋白或大多肽的DNA序列引入，但是这在希望从异源性来源表达多个肽决定簇的情况下是不可能的。在此情况下，肽作为包含被不同长度的氨基酸接头分开的所关注肽的单个多肽构建体而表达，并且这些肽需要蛋白酶体活性以产生MHC I类结合肽决定簇。这可导致抗原呈递的丧失。
因此，需要避开蛋白酶体活性并增强抗原呈递，以便提升免疫应答。本公开通过提供基于李斯特菌的组合物而解决这一需求，所述组合物包含核酸序列的“微基因”表达系统，所述核酸序列编码最小肽决定簇以通过MHC I类分子呈递。这些微基因可通过紧接在ubiquitin部分之后的肽(Ub-肽)表达，并且这样的话，该系统就规避了对抗原进入抗原加工通路的需求，从而使得肽抗原可直接表达进被重组李斯特菌感染的细胞的胞质溶胶中。另外，且如本文所公开的具体实施方式中所述，本公开的微基因系统提供使得可以使用单个李斯特菌递送载体将多个肽载入细胞中的优点。
发明内容
在一个方面，本公开提供包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌菌株，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列；
b.泛素(Ub)蛋白；
c.肽；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置。
在另一方面，本公开提供引起具有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤或抗癌应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列；
b.泛素(Ub)蛋白；
c.肽；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。
在一个方面，本公开提供治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列；
b.泛素(Ub)蛋白；
c.肽；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个用彩色表现的附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。被视为本公开的主题在说明书的结论部分特别指出并明确要求进行保护。然而，在结合附图阅读时，通过参考以下具体实施方式，可以最好地理解本发明(对组织和操作方法来说皆是如此)及其目的、特征和优点，在附图中：
图1A-B显示Lm-E7和Lm-LLO-E7使用不同的表达系统来表达和分泌E7。通过将基因盒引入单核细胞增多性李斯特菌基因组的orfZ域中来产生Lm-E7(图1A)。hly启动子驱动hly信号序列和LLO的前五个氨基酸(AA)以及随后的HPV-16E7的表达(图1B)。通过以质粒pGG-55转化prfA-菌株XFL-7来产生Lm-LLO-E7。pGG-55具有驱动LLO-E7非溶血性融合体的表达的hly启动子。pGG-55也含有prfA基因，以选择XFL-7在体内对质粒的保留。
图2显示Lm-E7和Lm-LLO-E7分泌E7。使Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)和10403S(泳道6)在Luria-Bertoni液体培养基中于37℃生长过夜。沉淀相等数目的细菌(通过600nm处吸光度OD确定)，并将18ml的每种上清液进行TCA沉淀。通过Western印迹分析E7表达。用抗E7mAb、随后用HRP-偶联的抗小鼠(Amersham)探测该印迹，接着使用ECL检测试剂显影。
图3显示LLO-E7融合体的肿瘤免疫治疗功效。显示了肿瘤接种后第7、第14、第21、第28和第56天小鼠中以毫米计的肿瘤大小。未暴露的小鼠：空心圆圈；Lm-LLO-E7：实心圆圈；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；和Lm-LLO-NP：实心三角形。
图4显示来自Lm-LLO-E7-免疫的小鼠的脾细胞在暴露于TC-1细胞时增殖。将C57BL/6小鼠用Lm-LLO-E7、Lm-E7或对照rLm菌株免疫和强化。在强化后6天收获脾细胞，并以显示的比率与经照射的TC-1细胞一起铺板。将细胞用3H胸苷脉冲处理并收获。将Cpm定义为(实验cpm)-(无TC-1对照)。
图5A显示，(A)Western印迹证实Lm-ActA-E7分泌E7。泳道1：Lm-LLO-E7；泳道2：Lm-ActA-E7.001；泳道3；Lm-ActA-E7-2.5.3；泳道4：Lm-ActA-E7-2.5.4。
图5B显示施用Lm-ActA-E7(矩形)、Lm-E7(椭圆形)、Lm-LLO-E7(X)和未暴露的小鼠(未接种疫苗；实心三角形)的小鼠中的肿瘤大小。
图6A显示用于制备4种LM疫苗的质粒插入片段的示意图。Lm-LLO-E7插入片段含有所有使用的李斯特菌基因。它含有hly启动子、hly基因(其编码蛋白LLO)的前1.3kb和HPV-16E7基因。hly的该前1.3kb包括信号序列(ss)和PEST区域。Lm-PEST-E7包括hly启动子、信号序列以及PEST和E7序列，但是不包括截短的LLO基因的剩余部分。Lm-ΔPEST-E7不包括PEST区域，但是含有hly启动子、信号序列、E7和截短的LLO的剩余部分。Lm-E7epi仅具有hly启动子、信号序列和E7。
图6B上部插图：含有PEST区域的李斯特菌构建体诱导肿瘤消退。下部插图：在2个单独实验中肿瘤挑战后第28天时的平均肿瘤大小。
图6C显示含有PEST区域的李斯特菌构建体在脾中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。显示了来自3个实验的数据的平均值和SE。
图7A显示，在施用TC-1肿瘤细胞并随后以Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7施用的或无疫苗(未暴露的)的小鼠中，脾中E7特异性的分泌IFN-γ的CD8+T细胞的诱导和浸润肿瘤的数目。
图7B显示，针对(A)描述的小鼠的脾和肿瘤中E7特异性的CD8+细胞的诱导和浸润。
图8A-B显示，含有PEST区域的李斯特菌构建体在肿瘤中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。(图8A)来自1个实验的代表性数据。(图8B)来自所有3个实验的数据的平均值和SE。
图9A显示了大肠杆菌(E.coli)-李斯特菌穿梭质粒pGG55的示意图谱。CAT(-)：大肠杆菌氯霉素转移酶；CAT(+)：李斯特菌氯霉素转移酶；Ori Lm：李斯特菌的复制起点；OriEc：大肠杆菌的p15复制起点；prfA：李斯特菌致病性调节因子A；LLO：C末端截短的李斯特菌溶血素O，包括其启动子；E7：HPV E7。还描绘了所选的限制位点。
图9B显示了大肠杆菌-李斯特菌穿梭质粒pTV3的示意图谱(下图)。CAT(-)：大肠杆菌氯霉素转移酶；CAT(+)：李斯特菌氯霉素转移酶；Ori Lm：李斯特菌的复制起点；Ori Ec：大肠杆菌的p15复制起点；prfA：李斯特菌致病性调节因子A；LLO：C末端截短的李斯特菌溶血素O，包括其启动子；E7：HPV E7；p60-dal：p60启动子和李斯特菌dal基因的表达盒。还描绘了所选的限制位点。
图10显示了存在于李斯特菌菌株ECG的基因组上的inlC区域的上游和下游的DNA序列(SEQ ID NO:74)。DNA-上游(红色)、inlC基因(蓝色)和DNA-下游(黑色)。
图11显示了在温敏质粒pKSV7中克隆以形成inl C缺失突变体的DNA序列(SEQ IDNO:75)。用于克隆这些区域的限制性酶位点用大写字母表示且标有下划线。GAATTC-EcoRI、GGATCC-BamHI和CTGCAg-PstI。EcoRI-PstI插入片段克隆进该载体pKSV7中。
图12显示了Lm-dd和Lm-dd actA菌株的示意图。凝胶显示了使用寡聚物的1/2和寡聚物的3/4将菌株Lm-dd和Lm-ddΔactA的e染色体DNA作为模板得到的PCR产物的大小。
图13显示了存在于李斯特菌染色体中的actA基因的上游和下游的DNA序列(SEQID NO:57)。以斜体字显示的区域含有存在于LmddΔactA菌株中的残余actA序列元件。标有下划线的序列gtcgac代表XhoI的限制位点，其为actA的N-T和C-T区域之间的连接处。
图14显示了响应于LM疫苗菌株(A)的施用而引起的肿瘤消退。圆圈代表未暴露的小鼠，倒三角形代表施用Lmdd-TV3的小鼠，十字叉代表施用Lm-LLOE7的小鼠。
图15A-B显示了(图15A)pAdv164的质粒图谱，其具有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)dal基因，该基因受组成型李斯特菌p60启动子的控制，以用于补充LmddA菌株中的染色体dal-dat缺失。它还含有截短的LLO(1-441)与嵌合人Her2/neu基因的融合体，该融合体通过直接融合3个片段Her2/neu：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)和ICI(aa 679-808)的直接融合而构建。(图15B)通过对用抗LLO抗体印迹的TCA沉淀细胞培养上清液进行的Western印迹分析检测了Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中tLLO-ChHer2的表达和分泌。～104KD的差异条带对应于tLLO-ChHer2。检测到内源性LLO为58KD条带。李斯特菌对照缺乏ChHer2表达。
图16A-C.(图16A)将NT-2细胞用作刺激物，将3T3/neu细胞用作靶标，测试了Her2/neu基于李斯特菌的疫苗在来自经免疫小鼠的脾细胞中引起的细胞毒性T细胞应答。Lm-对照基于在各个方面相同但表达不相关抗原(HPV16-E7)的LmddA背景。(图16B)免疫FVB/N小鼠的脾细胞分泌进细胞培养基中的IFN-g在使用丝裂霉素C处理的NT-2细胞体外刺激24小时后通过ELISA测定。(图16C)嵌合疫苗免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞响应于来自蛋白不同区域的肽的体外温育而分泌IFN-g。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽组构成阴性对照，如图例中所列出。使用72小时共温育后收集的细胞培养上清液进行ELISA分析，以测定IFN-γ分泌。每个数据点为一式三份数据的平均值+/-标准误差。*P值<0.001。
图17代表了来自Her2/neu转基因小鼠的结果，该Her2/neu转基因小鼠经每种重组李斯特菌-ChHer2或对照李斯特菌疫苗注射六次。免疫在6周龄开始，每三周一次延续直到第21周。每周监测肿瘤的外观并以无肿瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，N＝9只每组。
图18显示了以1×106个NT-2细胞皮下接种FVB/N小鼠，并且用每种疫苗以一周的间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集脾脏。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。来自代表性实验的Treg的点图示出CD25+/FoxP3+T细胞的频率，以不同治疗组之间总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分比表示。
图19A-B显示了以1×106个NT-2细胞皮下接种FVB/N小鼠，并且用每种疫苗以一周的间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集肿瘤。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。(图19A).来自代表性实验的Treg的点图。(图19B).CD25+/FoxP3+T细胞的频率，以不同治疗组之间总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分比(左插图)和肿瘤内CD8/Treg比率(右插图)表示。数据以2个独立实验获得的平均值±SEM表示。
图20A-C表示重组李斯特菌蛋白微基因构建体的示意性图谱。(图20A)表示产生卵清蛋白源SIINFEKL肽的构建体。(图20B)表示可比较的重组蛋白，其中已通过PCR克隆将GBM源肽引入，以代替SIINFEKL。(图20C)表示被设计为由李斯特菌菌株表达4种单独的肽抗原的构建体。
将领会的是，为了阐述的简洁和清楚，显示在图中的要素未必是按比率绘制的。例如，为了清楚，一些要素的尺寸可以是相对其他要素而放大的。另外，在认为适合时，附图标记可以在附图之间重复，以指出对应的或类似的要素。
具体实施方式
在以下具体实施方式中，陈述了多个具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况中，为避免使本发明复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
在一个实施例中，本文公开了用于引起抗肿瘤或抗癌应答的组合物和方法。
在一个方面，本公开提供包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌菌株，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列；
b.泛素(Ub)蛋白；
c.肽；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置。
在一个实施例中，李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。
在另一个实施例中，重组李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。在另一个实施例中，每个开放阅读框包含不同的肽。
在另一方面，本公开提供引起具有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤或抗癌应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含含有开放阅读框的微基因核酸构建体，所述开放阅读框编码嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列；
b.泛素(Ub)蛋白；
c.肽；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。
在一个方面，本公开提供治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含含有开放阅读框的微基因核酸构建体，所述开放阅读框编码嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列；
b.泛素(Ub)蛋白；
c.肽；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。
在一个实施例中，术语“核酸分子”、“核酸构建体”和“微基因核酸构建体”在本文可互换使用。
技术人员将领会的是，术语“核酸”及其语法等同形式可以指可包括但不限于原核序列、真核mRNA、得自真核mRNA的cDNA、得自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成DNA序列的分子。该术语还指包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。
在另一个实施例中，使用本文所公开的方法生成的融合肽还连接到HIS标签或SIINFECKL标签。可以表达这些标签并呈递抗原表位，从而使得临床医生可以通过跟踪对这些“标签”序列肽的免疫应答而跟踪所分泌的肽的免疫原性。这样的免疫应答可使用多种试剂包括但不限于单克隆抗体和这些标签特异性的DNA或RNA探针来监测。技术人员将领会的是，这些标签的序列可并入编码融合肽序列的核酸序列中。在另一个实施例中，本文所公开的载体诸如质粒或噬菌体载体包含编码本文所公开的融合肽或嵌合蛋白的核酸序列。
技术人员将领会的是，本文所用的术语“癌症”和“肿瘤”可具有完全相同的含义和性质。
在另一个实施例中，本文公开了用于引起针对肿瘤抗原的免疫应答的组合物和方法。在另一个实施例中，肿瘤抗原是异源性抗原。在另一个实施例中，肿瘤抗原是自身抗原。在另一个实施例中，本文公开了用于引起针对感染性疾病抗原的免疫应答的组合物和方法。在另一个实施例中，感染性疾病抗原是异源性抗原。在另一个实施例中，本公开的组合物和方法用于针对肿瘤或癌症进行疫苗接种。
在又一个实施例中，本公开的组合物和方法防止治疗后发生逃避突变。在另一个实施例中，本文公开了用于向罹患肿瘤或癌症的受试者提供无进展存活的组合物和方法。在另一个实施例中，本文公开了用于使受试者对癌症或肿瘤免疫的组合物和方法。在另一个实施例中，本文公开了用于使受试者对癌症或肿瘤免疫的组合物和方法。在另一个实施例中，癌症为转移。
重组李斯特菌菌株
在一个实施例中，本文公开了包含编码嵌合蛋白的核酸构建体的重组减毒李斯特菌菌株。在另一个实施例中，核酸构建体为重组核酸构建体。在另一个实施例中，本文公开了包含重组核酸构建体的重组减毒李斯特菌菌株，所述构建体包含编码细菌分泌信号序列(SS)、泛素(Ub)蛋白和肽序列的开放阅读框。在另一个实施例中，该核酸构建体编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含细菌分泌信号序列、泛素蛋白和肽序列。在一个实施例中，该嵌合蛋白按以下方式(SS-Ub-肽)布置：
在一个实施例中，包含对应于肽部分的羧基末端的密码子的核酸构建体后面跟着两个终止密码子，以确保蛋白合成的终止。
在一个实施例中，编码本文所公开的重组多肽的核酸还包含信号肽或序列。在一个实施例中，由本文所公开的核酸构建体编码的细菌分泌信号序列是李斯特菌分泌信号序列。在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的融合蛋白包含来自李斯特菌溶血素O(LLO)的LLO信号序列。在一个实施例中，异源抗原可以通过使用信号序列(诸如李斯特菌信号序列，例如溶血素(hly)信号序列或actA信号序列)来表达。或者，例如，外源基因可在单核细胞增多性李斯特菌启动子下游表达，而不形成融合蛋白。在另一个实施例中，信号肽是细菌的(李斯特菌的或非李斯特菌的)。在一个实施例中，信号肽是细菌天然的。在另一个实施例中，信号肽是细菌外源的。在另一个实施例中，信号肽是单核细胞增多性李斯特菌的信号肽，诸如secA1信号肽。在另一个实施例中，信号肽是来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的Usp45信号肽，或者来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的保护性抗原信号肽。在另一个实施例中，信号肽是secA2信号肽，例如单核细胞增多性李斯特菌的p60信号肽。此外，重组核酸分子任选地包含编码p60或其片段的第三多核苷酸序列。在另一个实施例中，信号肽是Tat信号肽，诸如枯草芽孢杆菌Tat信号肽(如，PhoD)。在一个实施例中，信号肽在编码重组多肽的相同翻译阅读框中。
出于本文的所有目的，术语“重组多肽”、“融合蛋白”、“重组蛋白”和“嵌合蛋白”在本文可互换使用。
在另一个实施例中，分泌信号序列来自李斯特菌蛋白。在另一个实施例中，分泌信号为ActA300分泌信号。在另一个实施例中，分泌信号为ActA100分泌信号。
在一个实施例中，核酸构建体包含编码泛素蛋白的开放阅读框。在一个实施例中，泛素为全长蛋白。技术人员将领会的是，在本文所公开的表达构建体中的泛素(从本文所公开的核酸构建体表达的)在进入宿主细胞的胞质溶胶时通过水解酶的作用而在羧基端与从核酸构建体表达的重组嵌合蛋白的其余部分切开。这释放出肽部分的氨基末端，从而在宿主细胞的胞质溶胶中产生肽(长度取决于特定的肽)。
在一个实施例中，由本文所公开的核酸构建体编码的肽的长度为8-10个氨基酸(AA)。在另一个实施例中，肽的长度为10-20个AA。在另一个实施例中，肽的长度为21-30个AA。在另一个实施例中，肽的长度为31-50个AA。在另一个实施例中，肽的长度为51-100个AA。
在一个实施例中，肽是抗原性肽。在另一个实施例中，肽衍生自肿瘤抗原。在另一个实施例中，肽衍生自感染性疾病抗原。在另一个实施例中，肽衍生自自身抗原。在另一个实施例中，肽衍生自血管新生抗原。
在一个实施例中，本文所公开的肽衍生自的抗原来源于真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫或病毒。在另一个实施例中，本文的肽所衍生自的抗原选自破伤风类毒素、来自流感病毒的血凝素分子、白喉类毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙门氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞体病毒抗原、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、黑素瘤相关抗原(TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、来自HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35或HPV-45型人乳头瘤病毒的人乳头瘤病毒抗原E1和E2、肿瘤抗原CEA、突变或者其他形式的ras蛋白、突变或者其他形式的p53蛋白、Muc1、间皮素、EGFRVIII或pSA。
在其他实施例中，肽衍生自与以下疾病之一相关的抗原：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脑灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳、黄热病、来自爱迪生氏病的免疫原和抗原、过敏症、过敏反应、布鲁顿综合征、癌症、包括实体和血源性肿瘤、湿疹、桥本氏甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥、例如肾、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植物、格雷夫斯病、多内分泌自身免疫病、肝炎、显微镜下多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、血管球性肾炎、风湿病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊椎关节病、鼻炎、Sjogren综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳氏肉芽肿、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化症、脑脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征、巩膜、巩膜外层、色素层炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、风疹、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X-连锁高IgM综合征、斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血、淀粉样变性、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、疟疾circumsporozite蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原以及李斯特菌病。
在另一个实施例中，本文所公开的肽所衍生自的抗原为肿瘤相关抗原，其在一个实施例中为以下肿瘤抗原之一：MAGE(黑素瘤相关抗原E)蛋白，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE3、MAGE 4、酪氨酸酶；突变体ras蛋白；突变体p53蛋白；p97黑素瘤抗原、与晚期癌症相关的ras肽或p53肽；与宫颈癌相关的HPV 16/18抗原、与乳腺癌相关的KLH抗原、与结肠直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)、gp100、与黑素瘤相关的MART1抗原或与前列腺癌相关的PSA抗原。在另一个实施例中，用于如本文所公开的组合物和方法的抗原为黑素瘤相关抗原，其在一个实施例中为TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、HSP-70、β-HCG或它们的组合。本发明还构思了本领域已知的其他肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，肽衍生自在美国专利申请序列号12/945,386中描述的嵌合Her2抗原，该专利全文据此以引用方式并入。
在另一个实施例中，肽衍生自选自HPV-E7(来自HPV16或HPV18菌株)、HPV-E6(来自HPV16或HPV18菌株)、Her-2/neu、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、SCCE、CEA、LMP-1、p53、碳酸酐酶IX(CAIX)、PSMA、前列腺干细胞抗原(PSCA)、HMW-MAA、WT-1、HIV-1 Gag、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、PSA(前列腺特异性抗原)、EGFR-III、生存素、凋亡重复序列包含棒状病毒抑制因子5(BIRC5)、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、Muc1、PSA(前列腺特异性抗原)或它们的组合的抗原。
在一个实施例中，本公开的李斯特菌表达的多肽可为神经肽生长因子拮抗剂，其在一个实施例中为[D-Arg1,D-Phe5,D-Trp7,9,Leu11]物质P、[Arg6,D-Trp7,9,NmePhe8]物质P(6-11)。这些实施例和相关的实施例是本领域技术人员可理解的。
在另一个实施例中，该异源性抗原是感染性疾病抗原。在一个实施例中，抗原是自体抗原或自身抗原。
在一个实施例中，肽能够加载到MHC I类分子上。在一个实施例中，肽能够加载到MHC II类分子上。在另一个实施例中，肽为MHC I类肽。在另一个实施例中，肽为MHC II类肽。在另一个实施例中，当结合到宿主细胞表面上的MHC I类分子时，肽可由CD8+T细胞上的T细胞受体识别。在另一个实施例中，当结合到宿主细胞表面上的MHC II类分子时，肽可由CD4+T细胞上的T细胞受体识别。在另一个实施例中，当结合到宿主细胞表面上的MHC I类或MHC II类分子时，肽可由存在于对于结合该肽而言为特异性的效应CD4+或CD8+细胞表面上的抗体或小分子识别。
在一个实施例中，本文所公开的表达系统包括使用编码本文所公开的嵌合蛋白的核酸构建体。在另一个实施例中，该表达系统被设计成有利于在羧基端包含不同肽部分的成组的重组蛋白。这在一个实施例中通过将编码细菌分泌信号序列-泛素-肽(SS-Ub-肽)构建体之一的序列用作模板而进行的PCR反应来实现。在一个实施例中，使用延伸到Ub序列的羧基末端区域中的引物并在该引物的3’端引入所需肽序列的密码子，可以在单个PCR反应中生成新的SS-Ub-肽序列(参见本文的实例)。编码细菌启动子的5’引物和细菌分泌信号序列的前几个核苷酸对于所有构建体而言可以是相同的。该构建体的示意图在本文的图1中提供。
在一个实施例中，重组李斯特菌包含含有编码代谢酶的开放阅读框的第二核酸分子或构建体，其中该代谢酶补充在李斯特菌的内源性基因中的突变、缺失或失活。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中缺乏的内源性基因。在另一个实施例中，第二核酸分子包含编码第二代谢酶的开放阅读框，该第二代谢酶补充在李斯特菌的内源性基因中的突变。在另一个实施例中，第二核酸分子包含编码第二代谢酶的开放阅读框，该第二代谢酶补充在重组李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
对于全长蛋白或多肽而言，术语“片段”是指比全长蛋白或多肽更短或包含更少氨基酸的蛋白或多肽。
在一个实施例中，片段具有10-20个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有超过5个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有100-200个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有100-500个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有50-200个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有10-250个核酸或氨基酸。
在另一个实施例中，核酸构建体或核酸分子从至少一个游离型载体或质粒载体表达。在另一个实施例中，质粒载体在不存在抗生素选择的情况下稳定保持在重组李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，该质粒不赋予重组李斯特菌抗生素抗性。在一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株缺乏抗生素抗性基因。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含质粒，该质粒包含编码抗生素抗性基因的核酸。
在一个实施例中，重组李斯特菌包含携带本文所公开的核酸构建体的游离型载体。在另一个实施例中，游离型载体是染色体外的，因为其不整合进李斯特菌的基因组。在另一个实施例中，重组李斯特菌包含携带本文所公开的核酸构建体的质粒载体。在另一个实施例中，质粒载体包含用于整合进李斯特菌染色体的整合序列。在另一个实施例中，术语“基因组”和“染色体”在本文可互换使用。
在另一个实施例中，本文所公开的是用于本文所公开的组合物和方法的LLO蛋白。在另一个实施例中，将LLO蛋白的片段用于本文所公开的组合物和方法。在另一个实施例中，该片段为功能性片段。在另一个实施例中，该片段为免疫原性片段。
在另一个实施例中，用于构建本公开的疫苗的LLO蛋白具有以下序列：
(GenBank登录号P13128；SEQ ID NO:1；核酸序列在GenBank登录号X15127中列出)。在另一个实施例中，LLO蛋白具有GenBank登录号DQ054589.1中列出的序列，该序列是指来自李斯特菌10403S的hly基因。对应于该序列的前蛋白的前25个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从LLO切割。因此，在本实施例中，全长的活性LLO蛋白为504个残基长。在另一个实施例中，将以上LLO片段用作并入本发明的疫苗中的LLO片段的来源。
在另一个实施例中，用于本公开的组合物和方法的LLO蛋白的N末端片段具有以下序列：
(SEQ ID NO:2)。
在另一个实施例中，该LLO片段对应于本文所用的LLO蛋白的约AA 20-442。
在另一个实施例中，该LLO片段具有以下序列：
(SEQ ID NO:3)。
在一个实施例中，该LLO信号肽或信号序列包含以下氨基酸：MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAK(SEQ ID NO:4)。
如本文所用，“截短的LLO”、“tLLO”或“ΔLLO”是指包含PEST样域的LLO片段。在另一个实施例中，该术语是指包含PEST序列的LLO片段。在另一个实施例中，“ΔLLO”是指如上所定义的416AA LLO片段。
在另一个实施例中，术语截短的LLO、tLLO或ΔLLO是指不含氨基末端的活化域并且不含胱氨酸484的LLO片段。在另一个实施例中，该术语是指非溶血性LLO片段。在另一个实施例中，该LLO片段因活化域的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，该LLO片段因半胱氨酸484的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，该LLO片段因另一位置的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，该LLO因胆固醇结合域(CBD)的缺失或突变而成为非溶血性的，如美国专利No.8,771,702中所述，该专利以引用方式并入本文。
在另一个实施例中，该LLO片段由LLO蛋白的大约前441个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段由LLO的大约前420个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段为LLO蛋白的非溶血形式。
在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-425构成。
在另一个实施例中，该LLO片段包含对应于以上AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源LLO蛋白相对于本文所用的LLO蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。其他LLO片段是本领域已知的。
在另一个实施例中，该LLO片段由LLO蛋白的大约前441个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段由LLO的大约前420个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段为LLO蛋白的非溶血形式。
在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-425构成。
在另一个实施例中，该LLO片段包含对应于以上AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源LLO蛋白相对于本文所用的LLO蛋白具有插入或缺失，则可相应地调整该残基编号。其他LLO片段是本领域已知的。
在另一个实施例中，同源LLO是指与LLO序列(如，与SEQ ID No:1-3之一)的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源LLO是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:1-3之一的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-34之一的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:1-3之一的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:1-3之一的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:1-3之一的同一性为100％。
在一个实施例中，ActA蛋白由SEQ ID NO:5
(SEQ ID NO:5)所示的序列编码。在另一个实施例中，ActA蛋白包含SEQ ID NO:5。对应于该序列的前蛋白的前29个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从ActA蛋白切割。在一个实施例中，ActA多肽或肽包含信号序列，即以上SEQ ID NO:5的AA 1-29。在另一个实施例中，ActA多肽或肽不含信号序列，即以上SEQ ID NO:5的AA 1-29。
在另一个实施例中，编码本文所公开的截短ActA蛋白的重组核苷酸包含SEQ IDNO:6
(SEQ ID NO:6)所示的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸具有SEQ ID NO:6所示的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸包含任何其他的编码ActA蛋白的片段的序列。
在另一个实施例中，ActA蛋白包含SEQ ID NO:7
(SEQ ID NO:7)所示的序列。对应于该序列的前蛋白的前29个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从ActA蛋白切割。
在一个实施例中，ActA多肽或肽包含信号序列，即SEQ ID NO:7的AA 1-29。在另一个实施例中，ActA多肽或肽不含信号序列，即SEQ ID NO:7的AA 1-29。在一个实施例中，截短的ActA蛋白包含ActA蛋白的N末端片段。在另一个实施例中，截短的ActA蛋白是ActA蛋白的N末端片段。
在一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:8
(SEQ ID NO:8)所示的序列。在另一个实施例中，ActA片段包含SEQ ID NO:8所示的序列。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:9:(SEQ ID NO:9)所示的序列。
在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的任何其他ActA片段。
在一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:10
(SEQ ID NO:10)所示的序列。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:11:
(SEQ ID NO:11)所示的序列。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:12
(SEQ ID NO:12)所示的序列。在另一个实施例中，如SEQ ID NO:12所示的截短的ActA称为ActA/PEST1。在另一个实施例中，截短的ActA包含全长ActA序列的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:12包含全长ActA序列的从第30到112个氨基酸。在另一个实施例中，截短的ActA包含SEQ ID NO:7的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:12包含SEQ ID NO:7的从第30到122个氨基酸。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:13
(SEQ ID NO:13)所示的序列。在另一个实施例中，如SEQ ID NO:12所示的截短的ActA称为ActA/PEST1。在另一个实施例中，截短的ActA包含全长ActA序列的从第1到130个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:13包含全长ActA序列的从第1到130个氨基酸。在另一个实施例中，截短的ActA包含SEQ ID NO:7的从第1到130个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:13包含SEQ ID NO:7的从第30到122个氨基酸。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:14
(SEQ ID NO:14)所示的序列。在另一个实施例中，如SEQ ID NO:14所示的截短的ActA称为ActA/PEST1。在另一个实施例中，截短的ActA包含全长ActA序列的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:14包含全长ActA序列的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，截短的ActA包含SEQ ID NO:7的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:14包含SEQ ID NO:7的从第30到第122个氨基酸。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:15
(SEQ ID NO:15)所示的序列。在另一个实施例中，如SEQ ID NO:15所示的截短的ActA称为ActA/PEST1。在另一个实施例中，截短的ActA包含全长ActA序列的从第30到229个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:15包含全长ActA序列的从约第30到约229个氨基酸。在另一个实施例中，截短的ActA包含SEQ ID NO:7的从约第30到229个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:15包含SEQ ID NO:7的从第30到229个氨基酸。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:16
(SEQ ID NO:16)所示的序列。在另一个实施例中，如SEQ ID NO:16所示的截短的ActA称为ActA/PEST3。在另一个实施例中，该截短的ActA包含全长ActA序列的从第30到332个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:16包含全长ActA序列的从第30到332个氨基酸。在另一个实施例中，截短的ActA包含SEQ ID NO:7的从约第30到332个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:16包含SEQ ID NO:7的从第30到332个氨基酸。
在另一个实施例中，截短的ActA蛋白包含SEQ ID NO:17
(SEQ ID NO:17)所示的序列。在另一个实施例中，如SEQ ID NO:17所示的截短的ActA称为ActA/PEST4。在另一个实施例中，该截短的ActA包含全长ActA序列的从第30到399个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:25包含全长ActA序列的从第30到399个氨基酸。在另一个实施例中，截短的ActA包含SEQ ID NO:7的从第30到399个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:17包含SEQ ID NO:7的从第30到399个氨基酸。
在另一个实施例中，本文所公开的截短的ActA序列还在N端融合到hly信号肽。在另一个实施例中，融合到hly信号肽的截短的ActA包含SEQ ID NO:18
在另一个实施例中，如SEQ ID NO:18所示的截短的ActA称为“LA229”。
在另一个实施例中，融合到hly信号肽的截短的ActA由包含SEQ ID NO:19(SEQ IDNO:19)的序列编码。在另一个实施例中，SEQ ID NO:19包含编码接头区(参见粗体、斜体文本)的序列，其用于形成XbaI的独特限制酶位点，以使得可在信号序列后克隆不同的多肽、异源性抗原等。因此，技术人员将领会的是，信号肽酶作用于接头区之前的序列，以切割信号肽。
在另一个实施例中，编码截短的ActA蛋白的重组核苷酸包含SEQ ID NO:20
(SEQ ID NO:20)所示的序列。
在另一个实施例中，重组核苷酸具有SEQ ID NO:18所示的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸包含编码ActA蛋白的片段的其他序列。
在另一个实施例中，术语“截短的ActA”、“N末端ActA片段”或“ΔActA”在本文可互换使用并指包含PEST域的ActA片段。在另一个实施例中，该术语是指包含PEST序列的ActA片段。在另一个实施例中，该术语是指ActA蛋白的免疫原性片段。在另一个实施例中，该术语是指由本文所公开的SEQ ID NO:8-18编码的截短的ActA片段。
本发明的方法和组合物的N末端ActA蛋白片段在一个实施例中包含选自SEQ IDNo:8-18的序列。在另一个实施例中，该ActA片段包含ActA信号肽。在另一个实施例中，该ActA片段大致由选自SEQ ID NO:8-18的序列组成。在另一个实施例中，该ActA片段基本上由选自SEQ ID NO:8-18的序列组成。在另一个实施例中，该ActA片段对应于选自SEQ IDNO:8-18的序列。在另一个实施例中，该ActA片段与选自SEQ ID NO:8-18的序列同源。
在另一个实施例中，该PEST序列为源自原核生物体的另一PEST AA序列。PEST AA序列可以是本领域已知的其他PEST序列。
在另一个实施例中，该ActA片段由ActA蛋白的大约前100个AA构成。
在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-29构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-338构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-450构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-500构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-550构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-600构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-639构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-100构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-125构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-150构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-175构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-200构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-225构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-250构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-275构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-300构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-325构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-338构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-350构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-375构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-400构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-450构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-500构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-550构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-600构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-604构成。
在另一个实施例中，该ActA片段含有对应于以上AA范围之一的同源ActA蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源ActA蛋白相对于本文所用的ActA蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。其他ActA片段是本领域已知的。
在另一个实施例中，同源ActA是指与ActA序列(如，与SEQ ID No:5、7-18之一)的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:5、7-18之一的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:5、7-18之一的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:5、7-18之一的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:5、7-18之一的同一性为100％。
如本文所用，当提及本文所公开的任何核酸序列时，术语“同源性”是指候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
可通过用于序列比对的计算机算法、通过本领域中充分描述的方法来确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括使用多种可用软件包，比如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL软件包。
在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文所公开的序列的序列的同一性大于68％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文所公开的序列的序列的同一性大于70％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文所公开的序列的序列的同一性大于72％。在另一个实施例中，该同一性大于75％。在另一个实施例中，该同一性大于78％。在另一个实施例中，该同一性大于80％。在另一个实施例中，该同一性大于82％。在另一个实施例中，该同一性大于83％。在另一个实施例中，该同一性大于85％。在另一个实施例中，该同一性大于87％。在另一个实施例中，该同一性大于88％。在另一个实施例中，该同一性大于90％。在另一个实施例中，该同一性大于92％。在另一个实施例中，该同一性大于93％。在另一个实施例中，该同一性大于95％。在另一个实施例中，该同一性大于96％。在另一个实施例中，该同一性大于97％。在另一个实施例中，该同一性大于98％。在另一个实施例中，该同一性大于99％。在另一个实施例中，该同一性为100％。
在另一个实施例中，本公开的LLO蛋白、ActA蛋白或其片段不需要精确地如本文所示的序列那样，而是可以作出其他保持如本文其他地方所示的LLO或ActA蛋白的功能特性的改变、修饰或变化。在另一个实施例中，本公开利用LLO蛋白、ActA蛋白或其片段的类似物。类似物在另一个实施例中与天然存在的蛋白或肽的不同之处在于保守氨基酸序列差异或不对序列产生影响的修饰或以上两者。
在另一个实施例中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见，例如“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1985)；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人,1989,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。例如，可在中等至严格条件下进行与编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列杂交的方法。杂交条件为例如在包含以下物质的溶液中42℃下温育过夜：10-20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/mL变性的经剪切的鲑鱼精DNA。
在一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌能够逃离吞噬溶酶体。
在一个实施例中，编码异源性抗原或其抗原性部分的核酸序列同框整合到李斯特菌染色体中。在另一个实施例中，编码异源性抗原的整合核酸序列在ActA基因座处与ActA同框整合。在另一个实施例中，编码ActA的染色体核酸被包含编码抗原的序列的核酸分子替代。在另一个实施例中，该抗原是本文所公开的且在本领域已知的任何抗原。
在一个实施例中，本文所公开的第二核酸分子或构建体包含编码代谢酶的开放阅读框。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中缺乏的内源性基因。在另一个实施例中，由开放阅读框编码的代谢酶为丙氨酸消旋酶(dal)。在另一个实施例中，由开放阅读框编码的代谢酶为D-氨基酸转移酶(dat)。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌菌株在内源性dal/dat基因中包含突变。在另一个实施例中，该李斯特菌缺乏dal/dat基因。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本文所公开的每个开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本文所公开的开放阅读框中的每一个的表达由单个启动子/调控序列驱动。
在一个实施例中，hly启动子和hly信号序列可操作地连接以便驱动本文所公开的嵌合蛋白的表达。在另一个实施例中，actA启动子和actA信号序列可操作地连接以便驱动本文所述的嵌合蛋白的表达。
“代谢酶”是指参与宿主细菌所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，酶为营养物的合成所需。
在另一个实施例中，该重组李斯特菌为减毒的营养缺陷型菌株。
在一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。LmddA基于李斯特菌疫苗载体，该载体因缺失毒力基因actA而为减毒的并通过补充dal基因而保持体内和体外质粒表达。
在另一个实施例中，该减毒菌株为LmddA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔactA。在另一个实施例中，该该减毒菌株为LmΔprfA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔplcB。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔplcA。在另一个实施例中，该菌株为任何上文提及的菌株的双突变体或三突变体。在另一个实施例中，该菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。在另一个实施例中，该菌株从EGD李斯特菌骨架构建。在另一个实施例中，用于本公开的菌株为表达基因组溶血LLO的李斯特菌菌株。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株为营养缺陷型突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码维生素合成基因的基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码泛酸合酶的基因缺陷的。
在一个实施例中，该李斯特菌菌株是氨基酸(AA)代谢酶缺陷的。在一个实施例中，D-丙氨酸缺陷的李斯特菌营养缺陷型菌株的生成例如可以按本领域的技术人员熟知的多种方式实现，这些方式包括缺失诱变、插入诱变、以及导致生成移码突变的诱变、导致蛋白的提前终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。在另一个实施例中，诱变可使用重组DNA技术或使用传统诱变技术实现，所述传统诱变技术使用诱变化学品或辐射，随后选择突变体。在另一个实施例中，由于伴随的营养缺陷型表型反转的可能性很低，缺失突变体是优选的。在另一个实施例中，可在简单的实验室培养分析中测试根据本文提供的方案生成的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下的生长能力。在另一个实施例中，选择在不存在该化合物的情况下不能生长的那些突变体进行进一步研究。
在另一个实施例中，除上述D-丙氨酸相关基因之外，如本文所公开的涉及代谢酶合成的其他基因可用作李斯特菌诱变的靶标。
在另一个实施例中，代谢酶补充重组细菌菌株的染色体其余部分中缺乏的内源性代谢基因。在另一个实施例中，内源性代谢基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，内源性代谢基因从染色体缺失。在另一个实施例中，代谢酶为氨基酸代谢酶。在另一个实施例中，代谢酶催化用于重组李斯特菌菌株中的细胞壁合成的氨基酸的形成。在另一个实施例中，代谢酶为丙氨酸消旋酶。在另一个实施例中，代谢酶为D-氨基酸转移酶。
在一个实施例中，营养缺陷型李斯特菌菌株包含游离型表达载体，该游离型表达载体包含补充营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷体的代谢酶。在另一个实施例中，该构建体以游离型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，外源抗原或肽从重组李斯特菌菌株携带的载体表达。在另一个实施例中，游离型表达载体缺乏抗生素抗性标记。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是D-谷氨酸合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dat基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dal基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dga基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是二氨基庚二酸合成中涉及到的基因缺陷的。CysK.在另一个实施例中，该基因为维生素-B12非依赖性甲硫氨酸合酶。在另一个实施例中，该基因为trpA。在另一个实施例中，该基因为trpB。在另一个实施例中，该基因为trpE。在另一个实施例中，该基因为asnB。在另一个实施例中，该基因为gltD。在另一个实施例中，该基因为gltB。在另一个实施例中，该基因为leuA。在另一个实施例中，该基因为argG。在另一个实施例中，该基因为thrC。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是一个或多个上文描述的基因缺陷的。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该基因为氨基酸合成基因。在另一个实施例中，该基因为folP。在另一个实施例中，该基因为二氢尿苷合酶家族蛋白。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为ispF。在另一个实施例中，该基因为磷酸烯醇丙酮酸合酶。在另一个实施例中，该基因为hisF。在另一个实施例中，该基因为hisH。在另一个实施例中，该基因为fliI。在另一个实施例中，该基因为核糖体大亚基假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为双功能GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为cobS。在另一个实施例中，该基因为cobB。在另一个实施例中，该基因为cbiD。在另一个实施例中，该基因为尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合酶。在另一个实施例中，该基因为cobQ。在另一个实施例中，该基因为uppS。在另一个实施例中，该基因为truB。在另一个实施例中，该基因为dxs。在另一个实施例中，该基因为mvaS。在另一个实施例中，该基因为dapA。在另一个实施例中，该基因为ispG。在另一个实施例中，该基因为folC。在另一个实施例中，该基因为柠檬酸合酶。在另一个实施例中，该基因为argJ。在另一个实施例中，该基因为3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为吲哚-3-甘油-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为邻氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺氨基转移酶组分。在另一个实施例中，该基因为menB。在另一个实施例中，该基因为甲基萘醌特异的异分支酸合酶。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶I或II。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶。在另一个实施例中，该基因为carB。在另一个实施例中，该基因为carA。在另一个实施例中，该基因为thyA。在另一个实施例中，该基因为mgsA。在另一个实施例中，该基因为aroB。在另一个实施例中，该基因为hepB。在另一个实施例中，该基因为rluB。在另一个实施例中，该基因为ilvB。在另一个实施例中，该基因为ilvN。在另一个实施例中，该基因为alsS。在另一个实施例中，该基因为fabF。在另一个实施例中，该基因为fabH。在另一个实施例中，该基因为假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为pyrG。在另一个实施例中，该基因为truA。在另一个实施例中，该基因为pabB。在另一个实施例中，该基因为atp合酶基因(例如，atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。
在另一个实施例中，该基因为phoP。在另一个实施例中，该基因为aroA。在另一个实施例中，该基因为aroC。在另一个实施例中，该基因为aroD。在另一个实施例中，该基因为plcB。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是肽转运蛋白缺陷的。在另一个实施例中，该基因为ABC转运蛋白/ATP结合/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/寡肽结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为锌ABC转运蛋白/锌结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为糖ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为ZIP锌转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为EmrB/QacA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为硫酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为质子依赖性寡肽转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为镁转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甲酸/硝酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为亚精胺/腐胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Na/Pi-协同转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸糖转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为谷氨酰胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为主要协助家族转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钼ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷壁酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钴ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铵转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为氨基酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为细胞分裂ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为锰ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铁化合物ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Bcr/CflA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为上述蛋白之一的亚基。
在一个实施例中，本文公开了核酸分子，该核酸分子用于转化李斯特菌以便获得重组李斯特菌。在另一个实施例中，本文公开的用于转化李斯特菌的核酸缺乏毒力基因。在另一个实施例中，该核酸分子整合进李斯特菌基因组并携带非功能性毒力基因。在另一个实施例中，该毒力基因在该重组李斯特菌中是突变的。在又一个实施例中，该核酸分子用于使李斯特菌基因组中存在的内源性基因失活。在又一个实施例中，该毒力基因为actA基因、inlA基因和inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因或prfA基因。技术人员应当理解，该毒力基因可为本领域已知的任何与重组李斯特菌中的毒力相关的基因。
在又一个实施例中，李斯特菌菌株为inlA突变体、inlB突变体、inlC突变体、inlJ突变体、prfA突变体、actA突变体、dal/dat突变体、plcB缺失突变体、或缺乏plcA和plcB的双突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌包含这些基因的缺失或突变，无论是单独的，还是组合的。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌缺乏所述基因的每一个。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌缺乏至少1个且最多10个本文所公开的任何基因，包括actA、prfA和dal/dat基因。在另一个实施例中，prfA突变体为D133V prfA突变体。
在一个实施例中，减毒活李斯特菌为重组李斯特菌。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组内化素C(inlC)基因的突变或缺失。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组actA基因和基因组内化素C基因的突变或缺失。在一个实施例中，李斯特菌向邻近细胞的迁移通过参与该过程的actA基因和/或inlC基因的缺失而被抑制，由此产生出乎意料的高水平减毒，具有增加的免疫原性，并用作疫苗的骨架。
在一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等在李斯特菌菌株的基因组中缺乏。在另一个实施例中，毒力基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，毒力基因从染色体缺失。在另一个实施例中，毒力基因在染色体中失活。
在一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株为减毒的。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏actA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏prfA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏inlB基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌同时缺乏actA和inlB基因。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株包含以下基因中任何单个基因或组合中的失活突变：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。在一个实施例中，当提及基因组毒力基因时，术语“缺乏”指该毒力基因或者是缺失的(部分或完全缺失)，或者说是未从染色体有功能地表达。该术语还可以涵盖该毒力基因在染色体中的部分缺失或全部基因缺失。
技术人员将领会的是，术语“突变”及其语法等同形式包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的突变或修饰，并包括氨基酸缺失突变、取代、置换、截短、失活、破坏或易位。这些类型的突变是本领域众所周知的。
在一个实施例中，为了选择包含编码代谢酶或补充本文所公开的基因的质粒的营养缺陷型细菌，使转化的营养缺陷型细菌在将会选择氨基酸代谢基因或补充基因的表达的培养基上生长。在另一个实施例中，用包含用于D-谷氨酸合成的基因的质粒转化D-谷氨酸合成缺陷型细菌，并且该营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而未被该质粒转化或者不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施例中，如果本公开的质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离的核酸，D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌当被转化且表达所述质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基(其包含或缺少必需生长因子、补充剂、氨基酸、维生素、抗生素等)的方法是本领域熟知的，且可商购获得(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。
在另一个实施例中，一旦在适当培养基上选择了包含本公开的质粒的营养缺陷型细菌，细菌即可在存在选择压力的情况下繁殖。这样的繁殖包括使细菌在无营养缺陷因子的培养基中生长。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细菌中的存在将确保，该质粒将与该细菌一起复制，从而连续地选择携带该质粒的细菌。技术人员在获知本文的公开内容和方法后将能够容易地通过调整培养基(包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长)的体积来放大李斯特菌疫苗载体的生产。
技术人员将领会的是，在另一个实施例中，其他营养缺陷型菌株和互补系统适合与本发明一起使用。
在一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株表达本文所公开的嵌合蛋白。在另一个实施例中，该重组李斯特菌菌株包含编码嵌合蛋白的质粒。在另一个实施例中，本文所公开的重组核酸在本文所公开的重组李斯特菌菌株的质粒中。在另一个实施例中，该质粒是不整合进重组李斯特菌菌株染色体中的游离型质粒。在另一个实施例中，该质粒为多拷贝质粒。在另一个实施例中，该质粒是整合进李斯特菌菌株染色体中的整合型质粒。
在一个实施例中，如本文所公开的重组李斯特菌菌株包含编码肿瘤相关肽的核酸分子。
在另一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含可操作地整合进李斯特菌基因组中与内源性ActA序列一起作为开放读框的核酸分子。在另一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含游离型表达载体，所述载体包含编码嵌合蛋白的核酸分子，所述嵌合蛋白包含在氨基末端上融合到泛素蛋白的肽抗原。在一个实施例中，肽抗原的表达和分泌受actA启动子和ActA信号序列的控制，并且其作为与ActA的1-233号氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施例中，抗原的表达和分泌受actA启动子和ActA信号序列的控制，并且其作为与ActA的1-100号氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施例中，抗原的表达和分泌受actA启动子和ActA信号序列的控制，并且其作为与ActA的1-300号氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施例中，截短的ActA由野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，如美国专利No.7,655,238中所述，该专利以引用方式全文并入本文。在另一个实施例中，截短的ActA是ActA-N100或其修饰型式(称为ActA-N100*)，其中PEST基序缺失，并且包含非保守的QDNKR置换，如美国专利公布No.2014/0186387中所述。
在另一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含可操作地整合进李斯特菌基因组中与内源性LLO序列一起作为开放阅读框的核酸分子。在另一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含游离型表达载体，所述载体包含编码嵌合蛋白的核酸分子，所述嵌合蛋白包含在氨基末端上融合到泛素蛋白的肽抗原。在一个实施例中，肽抗原的表达和分泌受LLO启动子和LLO信号序列的控制，并且其作为与LLO的1-50号氨基酸(截短的LLO或tLLO)的融合体而表达。在另一个实施例中，肽抗原的表达和分泌受LLO启动子和LLO信号序列的控制，并且其作为与LLO的1-100号氨基酸(截短的LLO或tLLO)的融合体而表达。在另一个实施例中，肽抗原的表达和分泌受LLO启动子和LLO信号序列的控制，并且其作为与LLO的1-300号氨基酸(截短的LLO或tLLO)的融合体而表达。在另一个实施例中，截短的LLO由野生型LLO的前420个氨基酸组成。
在一个实施例中，在未暴露的动物(animal)或不相关李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性。而在另一个实施例中，表达本文所公开的嵌合蛋白的减毒营养缺陷型菌株能够刺激IFN-γ的分泌并引起抗肿瘤免疫应答。
在另一个实施例中，李斯特菌菌株发挥强烈的和抗原特异性的抗肿瘤应答，能够打破对肽抗原的耐受性。
在一个实施例中，dal/dat/actA菌株是高度减毒的，并且具有比前一代李斯特菌疫苗更高的安全谱，因为它能更迅速地从免疫小鼠的脾脏清除。在另一个实施例中，李斯特菌菌株使肿瘤内调节性T细胞(Treg)显著减少。在另一个实施例中，LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。
在一个实施例中，术语“肽抗原”可与以下术语互换使用：“抗原”、“抗原片段”、“抗原性肽”或“抗原肽”。技术人员将理解的是，术语“肽抗原”涵盖当在主要组织相容性复合体(MHC)分子的背景下呈递给抗原呈递细胞(APC)时能够引起免疫应答的异源性抗原或其片段。
在一个实施例中，通过本领域充分描述的方法确定蛋白和/或肽对本文列出的任何氨基酸序列的同源性，包括免疫印迹分析，或通过建立的方法采用多种可用软件包中的任一种通过氨基酸序列的计算机算法分析进行。例如，这些软件包中的一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps软件包，并且可利用Smith和Waterman算法，和/或整体/局部或BLOCKS比对用于分析。
在另一个实施例中，本文所公开的构建体或核酸分子使用同源重组整合进李斯特菌染色体。用于同源重组的技术是本领域熟知的，并且例如在Baloglu S,Boyle SM等人(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing eitherListeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomalL7/L12protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7)和Jiang LL,Song HH等人(Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing greenfluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一个实施例中，如美国专利No.6,855,320所述进行同源重组。在这种情况下，通过hly启动子控制下的E7基因的染色体整合，制备表达E7的重组Lm菌株，并且包含hly信号序列以确保基因产物的分泌，从而产生称作Lm-AZ/E7的重组体。在另一个实施例中，将温敏质粒用于选择重组体。
在另一个实施例中，该构建体或核酸分子采用转座子插入整合进李斯特菌染色体。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun等人(Infection and Immunity1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。在另一个实施例中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优点，但缺点是外源基因在基因组中的插入位置是未知的。
在另一个实施例中，使用噬菌体整合位点将该构建体或核酸分子整合进李斯特菌染色体(Lauer P,Chow MY等人,Construction,characterization,and use of twoListeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.JBacteriol2002；184(15):4177-86)。在该方法的某些实施例中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的连接位点，该连接位点可以是基因组中的任何适当的位点(例如comK，或arg tRNA基因的3’端)。在另一个实施例中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的连接位点解离。在另一个实施例中，这种方法产生单拷贝的整合体。在另一个实施例中，本公开还包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中可使用必需酶(包括但不限于d-丙氨酸消旋酶)营养缺陷的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施例中，为了避免“噬菌体解离步骤”，使用基于PSA的噬菌体整合系统。这在另一个实施例中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施例中，本公开使得能建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。作为替代，可补充营养缺陷型宿主菌株。
在如本文所公开的方法和组合物的一个实施例中，术语“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指核酸分子中的碱基序列，该序列可被重组酶(在一些情况下连同相关蛋白)识别，该重组酶介导位于重组位点侧翼的核酸片段的交换或切除。重组酶及相关蛋白统称为“重组蛋白”，参见例如Landy,A.,(Current Opinion in Genetics&Development)3:699-707；1993)。
技术人员将领会的是，术语“载体”可涵盖质粒。在另一个实施例中，该术语是指这样一种整合载体，其能够以允许所述载体包含的基因进行表达的方式转化到李斯特菌宿主中且并入李斯特菌的染色体中。在另一个实施例中，该术语是指不整合在李斯特菌的染色体中而是存在于所述李斯特菌的细胞质中的非整合载体。在另一个实施例中，该术语是指包含整合载体的质粒。在另一个实施例中，整合载体是位点特异性整合载体。
技术人员在了解本公开内容和本文所公开的方法时，将易于理解不同的转录启动子、终止子、载体或特定基因序列(如，市售的克隆载体中的那些)可成功地用于本发明的方法和组合物。如本发明所构思，这些功能在例如称为pUC系列的市售载体中提供。在另一个实施例中，移除非必需DNA序列(如，抗生素抗性基因)。在另一个实施例中，本发明使用市售的质粒。此类质粒可从多个来源获得，例如Invitrogen(La Jolla,CA)、Stratagene(LaJolla,CA)、Clontech(Palo Alto,CA)，或可使用本领域熟知的方法构建。
另一个实施例是诸如pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)的质粒，该质粒是具有原核复制起点和启动子/调控元件以便有利于在原核生物体中表达的原核表达载体。在另一个实施例中，移除外源性核苷酸序列以减小质粒的大小并增加可置于其中的盒的大小。
此类方法是本领域熟知的，并且在例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)和Ausubei等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green&Wiley,New York)中有所描述。
将抗生素抗性基因用于分子生物学和疫苗制备通常使用的常规选择和克隆工艺。在公开中考虑的抗生素抗性基因包括但不限于这样的基因产物：其赋予对氨苄西林、青霉素、甲氧西林、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素、庆大霉素和本领域公知的其他抗生素的抗性。
可用在本公开中的质粒和其他表达载体在本文其他地方有描述，并可包括诸如启动子/调控序列、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的复制起点、编码融合蛋白的分离的核酸以及编码氨基酸代谢基因的分离的核酸等特征。另外，编码融合蛋白和氨基酸代谢基因的分离的核酸将具有适用于驱动此类分离的核酸的表达的启动子。用于驱动在细菌系统中表达的启动子是本领域熟知的，并且包括噬菌体λ、pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子和pBR325的氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的另外例子包括：噬菌体λ的主要右和左启动子(PL和PR)，大肠杆菌的trp、recA、lacZ、lad和gal启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(Ulmanen等人,1985.J.Bacteriol.162:176-182)和S28特异性启动子(Gilman等人,1984Gene 32:11-20)，芽孢杆菌属的噬菌体的启动子(Gryczan,1982,In:TheMolecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York)以及链霉菌属启动子(Ward等人,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478)。在本公开中考虑的另外的原核启动子例如在Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282)、Cenatiempo(1986,Biochimie,68:505-516)和Gottesman(1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442)中进行了综述。在本公开中考虑的启动子/调控元件的另外例子包括但不限于：李斯特菌prfA启动子、李斯特菌hly启动子、李斯特菌p60启动子和李斯特菌ActA启动子(GenBank登录号NC_003210)或其片段。
在另一个实施例中，方法和组合物的质粒包含被切割的子序列和使用适当的限制性酶克隆的适当子序列。在另一个实施例中，然后连接片段生成所需的DNA序列。在另一个实施例中，编码抗原的DNA使用DNA扩增法例如聚合酶链式反应(PCR)制备，聚合酶链式反应是一种本领域熟知的技术。
“噬菌体表达载体”或“噬粒”指用于在体外或体内在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中组成型或诱导型表达如本文所公开的方法和组合物的核酸序列的目的的任何基于噬菌体的重组表达系统。噬菌体表达载体通常既可在细菌细胞中繁殖，又可在适合条件下产生噬菌体颗粒。该术语还包括线状或环状表达系统，并涵盖保持游离或者整合进宿主细胞基因组的两种基于噬菌体的表达载体。
在另一个实施例中，本公开还包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统。使用必需酶(包括但不限于D-丙氨酸消旋酶)营养缺陷型宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施例中，为避免“噬菌体治愈步骤”(phage curing step)，使用基于PSA的噬菌体整合系统(Lauer等人,2002 J Bacteriol,184:4177-4186)。这在另一个实施例中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施例中，本公开使得能建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。相反，营养缺陷型宿主菌株将是互补的。
在另一个实施例中，使用重组DNA方法合成本公开的嵌合蛋白。在一个实施例中，这涉及形成编码嵌合蛋白的DNA序列，将DNA置于具体启动子/调控元件的控制下的表达盒(诸如本发明的质粒)中，以及表达蛋白。在另一个实施例中，通过任何适当的方法制备编码本公开的嵌合蛋白(例如SS-Ub-肽)的DNA，所述方法包括例如克隆和限制性酶切适当的序列，或者通过以下方法直接化学合成：诸如Narang等人(1979,Meth.Enzymol.68:90-99)的磷酸三酯法、Brown等人(1979,Meth.Enzymol 68:109-151)的磷酸二酯法、Beaucage等人(1981,Tetra.Lett.,22:15 1859-1862)的二乙基亚磷酰胺法和美国专利No.4,458,066的固相载体法。
在另一个实施例中，使用DNA扩增法诸如聚合酶链式反应(PCR)克隆编码本公开的嵌合蛋白或重组蛋白的DNA。在另一个实施例中，将化学合成用于产生单链寡核苷酸。在各种实施例中，该单链寡核苷酸通过与互补序列杂交或使用单链作为模板通过DNA聚合酶聚合转换为双链DNA。本领域的技术人员将认识到，虽然DNA的化学合成仅限于约100个碱基的序列，但较长的序列可通过较短的序列的连接获得。在另一个实施例中，克隆子序列，并使用适当的限制性酶切割适当的子序列。然后连接片段以制备所需的DNA序列。
在一个实施例中，将编码本文所公开的嵌合蛋白的核酸序列转化至多种宿主细胞，包括大肠杆菌、其他细菌宿主诸如李斯特菌、酵母和各种高等真核细胞诸如COS、CHO和HeLa细胞系以及骨髓瘤细胞系。编码本文所公开的嵌合蛋白的核酸序列可操作地连接到针对每个宿主的适当的表达控制序列。启动子/调控序列在本文别处详细描述。在另一个实施例中，编码本文所公开的嵌合蛋白的质粒还包含另外的启动子调控元件，以及核糖体结合位点和转录终止信号。对于真核细胞，调控序列将包括启动子和来源于如免疫球蛋白基因、SV40、细胞巨化病毒等的增强子，以及聚腺苷酸化序列。在另一个实施例中，序列包括剪接供体和受体序列。
在一个实施例中，本文所公开的质粒包含允许编码如本文所公开的至少一种嵌合蛋白的至少一个核糖体结合位点和至少一个转录终止信号，所述蛋白各自包含不同的肽抗原。在一个实施例中，本文所公开的质粒包含允许编码如本文所公开的1至4种嵌合蛋白的1至4个核糖体结合位点和1至4个转录终止信号，所述蛋白各自包含不同的肽抗原。在一个实施例中，本文所公开的质粒包含允许编码如本文所公开的5至10种嵌合蛋白的5至10个核糖体结合位点和5至10个转录终止信号，所述蛋白各自包含不同的肽抗原。在一个实施例中，本文所公开的质粒包含允许编码如本文所公开的11至20种嵌合蛋白的11至20个核糖体结合位点和11至20个转录终止信号，所述蛋白各自包含不同的肽抗原。在一个实施例中，本文所公开的质粒包含允许编码如本文所公开的21至30种嵌合蛋白的21至30个核糖体结合位点和21至30个转录终止信号，所述蛋白各自包含不同的肽抗原。在另一个实施例中，核糖体结合位点是shine dalgarno核糖体结合位点。
在一个实施例中，术语“可操作地连接”意味着将转录和翻译调控核酸相对于任何编码序列以使得引发转录的方式定位。一般来讲，这意味着将启动子和转录引发或起始序列定位在编码区的5'。在另一个实施例中，术语“可操作地连接”指并列连接，其中如此描述的组件的关系允许它们以其预期方式起作用。与编码序列“可操作地连接”的控制序列是以这样的方式连接，使得在与该控制序列相容的条件下实现该编码序列的表达。在另一个实施例中，术语“可操作地连接”是指在转录单元中的若干开放阅读框的连接，每个开放阅读框编码蛋白或肽，以导致按预期发挥作用的嵌合蛋白或多肽的表达。
在一个实施例中，“开放阅读框”或“ORF”为生物体基因组的一部分，其含有可潜在地编码蛋白的碱基序列。在另一个实施例中，该ORF的开始和结束端不等同于mRNA的末端，但它们通常包含在该mRNA内。在一个实施例中，ORF位于基因的开始密码子序列(起始密码子)和结束密码子序列(终止密码子)之间。因此，比如，作为带有内源多肽的开放阅读框可操作地整合进基因组的核酸分子为已整合进基因组中与内源多肽处于相同开放阅读框中的核酸分子。
在一个实施例中，本公开提供包含接头序列的融合多肽。技术人员将理解的是，“接头序列”可以涵盖连接两个异源性多肽或其片段或域的氨基酸序列。一般来讲，接头是共价连接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。接头通常包含在从展示载体移除报告基因后从剩余重组信号翻译的氨基酸，以产生包含由开放阅读框编码的氨基酸序列和展示蛋白的融合蛋白。如本领域技术人员将领会的是，接头可包含另外的氨基酸，诸如甘氨酸和其他小中性氨基酸。
在一个实施例中，“内源性”描述已在参考生物体内发育或起源的或因参考生物体内的成因而产生的某物。例如，内源性是指天然的。
本文所公开的重组或嵌合蛋白可通过任何合适的方法制备，这些方法包括例如克隆和限制性酶切适当的序列或通过下文讨论的方法直接化学合成。或者，可克隆子序列并使用适当的限制性酶切割适当的子序列。然后可连接片段以制备所需的DNA序列。在一个实施例中，编码所述抗原的DNA可使用DNA扩增法例如聚合酶链式反应(PCR)制备。首先，在天然DNA片段的新末端的任一侧单独扩增。一个扩增的序列的5'端编码肽接头，而另一个扩增的序列的3'端也编码肽接头。由于第一片段的5'端与第二片段的3'端互补，两个片段(在部分纯化后，如在LMP琼脂糖上)可在第三PCR反应中用作重叠模板。扩增的序列将包含密码子、开口位点羧基侧上的片段(现在形成氨基序列)、接头和开口位点氨基侧上的序列(现在形成羧基序列)。将抗原连接至质粒。
“稳定保持”是指核酸分子或质粒在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的损失。在另一个实施例中，周期为15代。在另一个实施例中，周期为20代。在另一个实施例中，周期为25代。在另一个实施例中，周期为30代。在另一个实施例中，周期为40代。在另一个实施例中，周期为50代。在另一个实施例中，周期为60代。在另一个实施例中，周期为80代。在另一个实施例中，周期为100代。在另一个实施例中，周期为150代。在另一个实施例中，周期为200代。在另一个实施例中，周期为300代。在另一个实施例中，周期为500代。在另一个实施例中，周期为更多代。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外(例如培养物中)稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体内稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外和体内都稳定保持。
“功能性片段”是免疫原性片段，当向受试者单独地或以本文所公开的治疗性组合物施用时引起免疫应答。例如，功能性片段具有生物学活性，如技术人员将理解的并且如本文所进一步公开。如本文所用，术语“功能片段”与术语“免疫原性片段”可互换使用。
技术人员将理解的是，术语“免疫原性”、“免疫原性的”或其语法等同形式是指当蛋白、肽、核酸、抗原或生物体被施用给人类或非人类动物时所述蛋白、肽、核酸、抗原或生物体在人类或非人类动物中引起免疫应答的固有能力。因此，“增强免疫原性”可以指提高当蛋白、肽、核酸、抗原或生物体被施用给动物时所述蛋白、肽、核酸、抗原或生物体在所述动物内引起免疫应答的能力。在一个实施例中，可通过如下方面测量蛋白、肽、核酸、抗原或生物体引起免疫应答的能力的提高：更大量的针对蛋白、肽、核酸、抗原或生物体的抗体、更具多样性的针对抗原或生物体的抗体、更大量的特异于蛋白、肽、核酸、抗原或生物体的T细胞、针对蛋白、肽、核酸、抗原或生物体的更强的细胞毒性或辅助T细胞应答等等。
本公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株在另一个实施例中是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组格雷李斯特菌(Listeriagrayi)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组伊万诺夫李斯特菌(Listeriaivanovii)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组默里李斯特菌(Listeriamurrayi)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组威耳逊李斯特菌(Listeriawelshimeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是另一种李斯特菌属菌种的重组菌株。
在一个实施例中，将减毒李斯特菌菌株诸如LMδ-actA突变体(Brundage等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894)、单核细胞增多性李斯特菌δ-plcA(Camilli等人,1991,J.Exp.Med.,173:751-754)或δ-ActA、δINL-b(Brockstedt等人,2004,PNAS,101:13832–13837)用于本发明。在另一个实施例中，减毒李斯特菌菌株通过引入一个或多个减毒突变构建，如本领域的普通技术人员了解本文的公开内容时所理解。此类菌株的例子包括但不限于芳族氨基酸营养缺陷型李斯特菌菌株(Alexander等人,1993,Infection and Immunity 10 61:2245-2248)和形成脂磷壁酸的突变体(Abachin等人,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)以及因缺乏毒力基因而减毒的那些(参见本文的实例)。
在另一个实施例中，本公开的重组李斯特菌菌株已在动物宿主中传代。在另一个实施例中，该传代让该菌株作为疫苗载体的效能最佳化。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代除去李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施例中，该传代降低李斯特菌菌株的不稳定亚株的普遍性。在另一个实施例中，该传代如本文所述进行。在另一个实施例中，该传代通过本领域已知的其他方法进行。
在一个实施例中，李斯特菌菌株包含本文所公开的微基因核酸构建体的基因组插入。在另一个实施例中，李斯特菌菌株携带包含本文所公开的微基因核酸构建体的质粒。
在另一个实施例中，本公开的重组核酸可操作地连接至驱动编码肽在李斯特菌菌株中表达的启动子/调控序列。可用于驱动基因的组成型表达的启动子/调控序列是本领域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的PhlyA、PActA和p60启动子，链球菌(Streptococcus)bac启动子，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)sgiA启动子以及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)phaZ启动子。
在另一个实施例中，编码本公开的肽的核酸的诱导型和组织特异性表达通过将编码该肽的核酸置于诱导型或组织特异性启动子/调控序列的调控下实现。可用于此目的的组织特异性或诱导型启动子/调控序列的例子包括但不限于MMTV LTR诱导型启动子和SV40晚期增强子/启动子。在另一个实施例中，采用响应于诱导剂(诸如金属、糖皮质素等等)而诱导的启动子。因此，将领会的是，本公开包括使用任何已知或未知的并且能够驱动与其可操作地连接的所需蛋白的表达的启动子/调控序列。
技术人员将领会的是，术语“异源性”涵盖源自与参考物种不同的物种的核酸、氨基酸、肽、多肽、肽或蛋白。因此，例如，表达异源性多肽的李斯特菌菌株在一个实施例中将表达不是该李斯特菌菌株天然的或内源性的多肽，或在另一个实施例中，通常不由该李斯特菌菌株表达的多肽，或在另一个实施例中，来自该李斯特菌菌株之外的来源的多肽。在另一个实施例中，异源性可用于描述源自同一物种内的不同生物体的某物。
技术人员将领会的是，术语“游离型表达载体”涵盖这样的核酸载体，其可以为线性的或环状的，并且其通常为双链的形式且在染色体外，因为其存在于宿主细菌或细胞的细胞质中，而不是整合进细菌或细胞的基因组。在一个实施例中，游离型表达载体包含所关注的基因。在另一个实施例中，游离型载体在细菌细胞质中保持多个拷贝，从而导致所关注的基因的扩增，该所关注的基因在一个实施例中为本文所公开的核酸分子或构建体。在另一个实施例中，在必要时提供病毒反式作用因子。游离型表达载体在本文可被称为质粒。“整合型质粒”包含这样的序列，该序列将该质粒的插入或所携带的所关注基因的插入靶向宿主基因组内。在另一个实施例中，插入的所关注基因不中断，或不受到通常因整合进细胞DNA中而发生的调控约束。在另一个实施例中，存在所插入的异源性基因不导致细胞自身重要区域的重排或中断。在另一个实施例中，在稳定的转染程序中，使用游离型载体通常导致比使用染色体整合质粒更高的转染效率(Belt,P.B.G.M.等人(1991)Efficient cDNAcloning by direct phenotypic correction of a mutant human cell line(HPRT2)using an Epstein-Barr virus-derived cDNA expression vector.Nucleic AcidsRes.19,4861-4866；Mazda,O.等人(1997)Extremely efficient gene transfection intolympho-hematopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-basedvectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的游离型表达载体可通过用于将DNA分子递送到细胞的多种方法中的任一种递送到体内、离体、体外细胞。载体也可以单独地或以增强向受试者细胞递送的药物组合物的形式递送。
技术人员将领会的是，术语“融合”可涵盖通过共价键合可操作地连接。在一个实施例中，该术语涵盖(核酸序列或其开放阅读框的)重组融合。在另一个实施例中，该术语涵盖化学偶联。
将理解的是，术语“转化”可以涵盖将细菌细胞工程化为吸收质粒或其他异源性DNA分子。“转化”还可以指将细菌细胞工程化为表达质粒的基因或其他异源性DNA分子。
用于转化细菌的方法是本领域熟知的，并包括基于氯化钙感受态细胞的方法、电穿孔方法、噬菌体介导的转导、化学和物理转化技术(de Boer等人,1989,Cell56:641-649；Miller等人,1995,FASEB J.,9:190-199；Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel等人,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York；Gerhardt等人编,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society forMicrobiology,Washington,DC；Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一个实施例中，本公开的李斯特菌疫苗株通过电穿孔转化。
在另一个实施例中，使用接合将遗传物质和/或质粒引入细菌中。接合的方法是本领域熟知的，并例如在Nikodinovic J.等人(A second generation snp-derivedEscherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generallytransferable by conjugation.Plasmid.2006 Nov；56(3):223-7)和Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellularsignaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35):12554-9)中有所描述。
技术人员将领会的是，术语“减毒”可涵盖细菌在动物中的致病能力降低。换句话讲，减毒李斯特菌菌株的病原学特性与野生型李斯特菌相比已降低，虽然减毒李斯特菌能够在培养中生长和维持。例如，使用减毒李斯特菌对Balb/c小鼠的静脉内接种，50％的接种动物存活所处的致死剂量(LD50)优选地比野生型李斯特菌的LD50升高至少约10倍，更优选地至少约100倍，更优选地至少约1,000倍，甚至更优选地至少约10,000倍，最优选地至少约100,000倍。李斯特菌的减毒菌株因此是不杀死施用该菌株的动物的菌株，或是仅当施用的细菌数远高于杀死相同动物所需的野生型非减毒细菌数时才杀死动物的菌株。减毒细菌还应被解释为意指不能够在一般环境中复制的细菌，因为在该环境中不存在其生长所需的营养物。因此，该细菌在提供了所需营养物的受控环境中以受限方式复制。本公开的减毒菌株因此是环境安全的，因为它们不能以不可控制的方式复制。
组合物
在另一个实施例中，本文公开了包含重组李斯特菌的药物组合物，所述重组李斯特菌包含编码本文所公开的嵌合蛋白的微基因核酸构建体，并且其中将所述药物组合物施用给具有疾病(包括癌症)的受试者可治疗、改善所述疾病或所述癌症。在另一个实施例中，本文公开了包含编码本文所公开的嵌合蛋白的微基因核酸构建体的药物组合物。在另一个实施例中，药物组合物与佐剂一起施用。
在一个实施例中，本公开的组合物为免疫原性组合物。在一个实施例中，本公开的组合物诱导强烈的干扰素-γ先天刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质。在一个实施例中，本公开的李斯特菌诱导强烈的干扰素-γ先天刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质(Dominiecki等人,Cancer Immunol Immunother.2005年5月；54(5):477-88.2004年10月6日电子版，以引用方式全文并入本文；Beatty和Paterson,JImmunol.2001年2月15日；166(4):2276-82，以引用方式全文并入本文)。在一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD4+T细胞介导(Beatty和Paterson，2001)。在另一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD8+T细胞介导。在另一个实施例中，因李斯特菌疫苗接种导致的IFN-γ分泌由NK细胞、NKT细胞、Th1 CD4+T细胞、TC1 CD8+T细胞或它们的组合介导。
在另一个实施例中，本公开的组合物的施用诱导一种或多种抗血管新生蛋白或因子的生成。在一个实施例中，该抗血管新生蛋白为IFN-γ。在另一个实施例中，该抗血管新生蛋白为色素上皮衍生因子(PEDF)、血管新生抑制素、内皮抑素、fms样酪氨酸激酶(sFlt)-1或可溶性内皮因子(sEng)。在一个实施例中，本公开的李斯特菌参与抗血管新生因子的释放，由此，在一个实施例中，除了作为用于将抗原引入受试者的载体之外还具有治疗性作用。在一个实施例中，本公开的组合物的施用刺激宿主中的干扰素基因刺激蛋白(STING)通路。
如本文所公开的方法和组合物所诱导的免疫应答在另一个实施例中为T细胞应答。在另一个实施例中，免疫应答包括T细胞应答。在另一个实施例中，应答为CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，该应答包括CD8+T细胞应答。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物引起的免疫应答包括CD8+T细胞介导的应答。在另一个实施例中，免疫应答主要由CD8+T细胞介导的应答组成。在另一个实施例中，免疫应答的仅有可检测组成部分是CD8+T细胞介导的应答。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物引起的免疫应答包括CD4+T细胞介导的应答。在另一个实施例中，免疫应答主要由CD4+T细胞介导的应答组成。在另一个实施例中，免疫应答的仅有可检测组成部分是CD4+T细胞介导的应答。在另一个实施例中，CD4+T细胞介导的应答伴有对抗原的可测定抗体应答。在另一个实施例中，CD4+T细胞介导的应答不伴有对抗原的可测定抗体应答。
在另一个实施例中，本公开提供诱导受试者中针对抗原的次优势CD8+T细胞表位的CD8+T细胞介导的免疫应答的方法。
在一个实施例中，本文公开了提高肿瘤内CD8+/调节性T细胞比率的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括向受试者施用包含本发明的嵌合蛋白、重组李斯特菌或重组载体的组合物的步骤。
在另一个实施例中，本文公开了提高肿瘤内CD8+/调节性T细胞比率的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括向受试者施用包含本发明的嵌合蛋白、重组李斯特菌或重组载体的组合物的步骤。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物引起的免疫应答包括对抗原的至少一个次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，免疫应答不包括对次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，免疫应答主要由对至少一个次优势表位的免疫应答组成。在另一个实施例中，免疫应答的仅有可测定组成部分是对至少一个次优势表位的免疫应答。
在另一个实施例中，施用本公开的组合物增加抗原特异性T细胞的数量。在另一个实施例中，施用组合物激活T细胞上的共刺激受体。在另一个实施例中，施用组合物诱导记忆和/或效应T细胞的增殖。在另一个实施例中，施用组合物增加T细胞的增殖。
本公开的组合物可用于本公开的方法，以便引发受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答，以便抑制受试者中的肿瘤介导的免疫抑制，或用于提高受试者的脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率，或它们的任何组合。
在另一个实施例中，包含本发明的李斯特菌菌株的组合物还包含佐剂。在一个实施例中，本公开的组合物还包含佐剂。在另一个实施例中，本公开的方法和组合物中所用的佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一个实施例中，该佐剂包含GM-CSF蛋白。在另一个实施例中，该佐剂为编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为包含编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂包含皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂为单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂包含单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂为SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂包含SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂为含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂包含含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂为免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂包含免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂为编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂包含编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为或包含刺糖苷(quillglycoside)。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌有丝分裂原。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌毒素。其他佐剂是本领域已知的。
在一个实施例中，本公开提供表达肽抗原的重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本公开提供包含本文所公开的重组李斯特菌的疫苗和免疫原性组合物。在另一个实施例中，本公开提供包含本文所公开的重组李斯特菌的药物组合物。
在一个实施例中，本公开的免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含编码本文所公开的嵌合蛋白的核酸分子。
在一些实施例中，另外的多肽或另外的佐剂多肽以与LLO类似的方式增强抗原呈递和免疫。
在一个实施例中，本文所公开的药物组合物与另外的疗法共施用。在另一个实施例中，该另外的疗法是手术、化疗、放疗、免疫疗法或它们的组合。在另一个实施例中，该另外的疗法在包含重组李斯特菌的药物组合物的施用之前。在另一个实施例中，该另外的疗法在包含重组李斯特菌的药物组合物的施用之后。在另一个实施例中，该另外的疗法是抗体疗法。在另一个实施例中，该抗体疗法是抗PD1、抗CTLA4。在另一个实施例中，包含重组李斯特菌的药物组合物以渐增剂量施用，以提高效应T细胞与调节性T细胞的比率，并产生更强大的抗肿瘤免疫应答。技术人员将领会的是，抗肿瘤免疫应答可通过给患有肿瘤的受试者提供细胞因子进一步增强，该细胞因子包括但不限于IFN-γ、TNF-α以及本领域已知的增强细胞免疫应答的其他细胞因子，这些细胞因子中的一些可见于美国专利No.6,991,785，该专利以引用方式并入本文。
在一个实施例中，本文公开了包含本发明的重组李斯特菌的疫苗。在另一个实施例中，本文公开了包含表达本发明的微基因构建体的重组减毒李斯特菌的疫苗。
在另一个实施例中，本文公开了包含本发明的重组李斯特菌的药物组合物。在另一个实施例中，本文公开了包含表达本发明的微基因构建体的重组减毒李斯特菌的药物组合物。
在另一个实施例中，本文公开了包含重组多肽或编码所述重组多肽的核酸构建体或编码本发明的核酸构建体的重组李斯特菌的免疫原性组合物。
在另一个实施例中，本文公开了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的药物组合物。
在另一个实施例中，本文公开了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的载体。
在另一个实施例中，本文公开了包含本发明的核苷酸分子的李斯特菌的重组形式。
在另一个实施例中，本文公开了包含本发明的李斯特菌的重组形式的疫苗。在另一个实施例中，本文公开了包含本发明的李斯特菌的重组形式的药物组合物。
在另一个实施例中，本文公开了本发明的李斯特菌的重组形式的培养物。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。在另一个实施例中，李斯特菌是伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)。在另一个实施例中，李斯特菌是威耳逊李斯特菌。在另一个实施例中，李斯特菌是西尔李斯特菌。
抗原
术语“抗原”、“抗原性多肽”、“抗原片段”在本文可互换使用，并且如技术人员将领会的那样，可以涵盖这样的多肽或肽(包括重组肽)：在宿主细胞表面上的MHC I类和/或II类分子上加载并呈递且可由宿主免疫细胞识别或检测，从而导致产生针对多肽、肽或呈递所述肽的细胞的免疫应答。类似地，免疫应答也可以延伸到宿主内的表达相同多肽或肽的其他细胞，包括患病细胞，诸如肿瘤细胞或癌细胞。
技术人员还将领会的是，关于蛋白、肽或多肽的术语“其抗原性部分”、“其片段”和“其免疫原性部分”在本文可互换使用并且可以涵盖这样的蛋白、多肽、肽(包括其重组形式)：如本文所述，其包含当单独地或以融合蛋白的形式存在于宿主中时或在一些实施例中由宿主检测时导致发生免疫应答的域或区段。
技术人员将领会的是，术语“异源性”涵盖源自与参考物种不同的物种的核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白。因此，例如，表达异源多肽的李斯特菌菌株在一个实施例中将表达不是该李斯特菌菌株天然的或内源性的多肽，或在另一个实施例中，通常不由该李斯特菌菌株表达的多肽，或在另一个实施例中，来自该李斯特菌菌株之外的来源的多肽。在另一个实施例中，异源性可用于描述源自同一物种内的不同生物体的某物。在另一个实施例中，异源性抗原由李斯特菌的重组菌株表达，并在哺乳动物细胞被该重组菌株感染后加工且呈递到细胞毒性T细胞。在另一个实施例中，由李斯特菌菌种表达的异源性抗原不需要与肿瘤细胞或传染原中对应的未修饰的抗原或蛋白精确匹配，只要其导致可识别在哺乳动物中天然表达的未修饰抗原或蛋白的T细胞应答即可。在一个实施例中，术语“抗原性多肽”、“蛋白抗原”、“抗原”在本文可互换使用。
在一个实施例中，抗原可以是外来的，即宿主异源性的，并在本文称为“异源性抗原”。在另一个实施例中，抗原是存在于宿主中但宿主因免疫耐受而不引起对该抗原的免疫应答的自身抗原。技术人员将领会的是，异源性抗原以及自身抗原可涵盖肿瘤抗原、肿瘤相关抗原或血管新生抗原。此外，异源性抗原可以涵盖感染性疾病抗原。在另一个实施例中，该抗原是血管新生抗原。
在一个实施例中，本文所公开的肽衍生自肿瘤相关抗原。在一个实施例中，肿瘤相关抗原选自HPV-E7、HPV-E6、Her-2、NY-ESO-1、高分子量黑素瘤相关(HMW-MAA)抗原或其片段、hepsin、存活素、PSG4、VEGFR-2片段、存活素、B细胞受体抗体、酪氨酸酶相关蛋白2或PSA(前列腺特异性抗原)或其组合。在另一个实施例中，抗原是感染性疾病抗原，诸如HIV-1Gag；MAGE(黑素瘤相关抗原E)蛋白，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4；酪氨酸酶；突变体ras蛋白；突变体p53蛋白；p97黑素瘤抗原；与晚期癌症相关的ras肽或p53肽；与宫颈癌相关的HPV 16/18抗原；与乳腺癌相关的KLH抗原；癌胚抗原(CEA)；gp100；与黑素瘤相关的MART1抗原；白介素-13受体α(IR13-Rα)；端粒酶(TERT)；角化层糜蛋白酶(SCCE)抗原；CEA；LMP-1；p53；蛋白酶3；滑膜肉瘤；碳酸酐酶IX(CAIX)；存活素；GP100；睾蛋白(testisin)肽；PSMA；前列腺干细胞抗原(PSCA)；或肾母细胞瘤(wilm's tumor)(WT-1)抗原。将理解的是，本发明也涵盖本文所公开的或本领域所公开的任何抗原的片段。
在一个实施例中，本文所公开的疾病为感染性疾病。在一个实施例中，感染性疾病是由但不限于以下病原体中的任一种导致的疾病：利什曼虫、阿米巴原虫(Entamoebahistolytica)(其导致阿米巴病)、鞭虫、BCG/结核病、疟疾、恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、轮状病毒、霍乱、白喉-破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、乙型肝炎、人乳头瘤病毒、季节性流感)、A型流感(H1N1)流行病、麻疹和风疹、腮腺炎、脑膜炎球菌A+C、口服脊髓灰质炎疫苗(单价、二价和三价)、肺炎球菌、狂犬病、破伤风类毒素、黄热病、炭疽芽孢杆菌(炭疽)、肉毒棱状芽孢杆菌毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶尔森菌(瘟疫)、重型天花(天花)和其他有关的痘病毒、土拉热弗朗西丝菌(土拉菌病)、病毒性出血热、沙粒病毒(LCM、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒、拉沙热)、布尼亚病毒(汉坦病毒属、裂谷热)、黄病毒属(登革热)、线状病毒(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、假鼻疽伯克霍尔德菌、伯内特考克斯体(Q热)、布鲁杆菌属种(布鲁杆菌病)、鼻疽伯克霍尔德菌(鼻疽)、鹦鹉衣原体(鹦鹉热)、蓖麻蛋白毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒热(普氏立克次体)、其他立克次体、食品和水传播的病原体、细菌(致腹泻性的大肠杆菌、致病性的弧菌属、志贺氏菌属种、沙门氏菌属BCG/、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎、西尼罗病毒、LaCrosse、加利福尼亚脑炎、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、尼帕病毒、汉坦病毒属、蜱传出血热病毒、切昆贡亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱传脑炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、原生动物(小隐孢子虫、卡晏环孢子虫、兰伯贾第虫、溶组织内阿米巴、弓形虫属)、真菌(微孢子目)、黄热病、结核病(包括耐药的TB)、狂犬病、朊病毒、严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)、Coccidioides posadasii、粗球孢子菌、细菌性阴道病、沙眼衣原体、巨细胞病毒、腹股沟肉芽肿、杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、阴道毛滴虫或本领域已知的在本文中没有列出的任何其他感染性疾病。
在一个实施例中，病原性原生动物和寄生虫感染包括：
阿米巴病、疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形虫病、卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)、巴贝虫病、贾第虫病、旋毛虫病、丝虫病、血吸虫病、线虫、吸虫和绦虫感染。
在一个实施例中，本文所公开的HPV抗原诸如E6或E7抗原选自HPV 6株和HPV 11株、HPV 16株、HPV-18株、HPV-31株、HPV-35株、HPV-39株、HPV-45株、HPV-51株、HPV-52株、HPV-58株或HPV-59株。在另一个实施例中，HPV抗原选自高风险HPV株。在另一个实施例中，HPV株为粘膜HPV型。在另一个实施例中，HPV抗原可选自所有HPV株，包括导致疣和发育异常的非致癌HPV，诸如6型、11型等。
在一个实施例中，代替HPV-18 E6和E7或与之组合，使用HPV-16 E6和E7。在这样的实施例中，重组李斯特菌可从染色体表达HPV-16 E6和E7并从质粒表达HPV-18 E6和E7，或反之亦然。在另一个实施例中，HPV-16 E6和E7抗原以及HPV-18 E6和E7抗原从存在于本文所公开的重组李斯特菌中的质粒表达。在另一个实施例中，HPV-16 E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原从本文所公开的重组李斯特菌的染色体表达。在另一个实施例中，HPV-16 E6和E7抗原以及HPV-18 E6和E7抗原在以上实施例的任何组合中表达，包括其中得自各HPV株的各E6和E7抗原从质粒或染色体表达的实施例。
在一个实施例中，抗原是在美国专利申请序列号12/945,386中描述的嵌合Her2抗原，该专利全文据此以引用方式并入。
在其他实施例中，抗原与以下疾病之一相关：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脑灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳、黄热病、来自爱迪生氏病的免疫原和抗原、过敏症、过敏反应、布鲁顿综合征、癌症、包括实体和血源性肿瘤、湿疹、桥本氏甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥、例如肾、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植物、格雷夫斯病、多内分泌自身免疫病、肝炎、显微镜下多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、血管球性肾炎、风湿病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊椎关节病、鼻炎、Sjogren综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳氏肉芽肿、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化症、脑脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征、巩膜、巩膜外层、色素层炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、风疹、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X-连锁高IgM综合征、斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血、淀粉样变性、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、疟疾circumsporozite蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原以及李斯特菌病。
在另一个实施例中，本文所公开的病症为发育异常。在另一个实施例中，疾病为瘤变。在另一个实施例中，疾病为肛门上皮内瘤变(AIN)。在另一个实施例中，疾病为阴道上皮内瘤变(VIN)。在另一个实施例中，疾病为宫颈上皮内瘤样病变(CIN)。
在另一个实施例中，本文所公开的病症为癌前病症或者如果不进行治疗将转变成慢性或急性疾病的病症。
在另一个实施例中，本文所公开的肿瘤相关抗原为血管新生抗原，该血管新生抗原在肿瘤新生血管中的活化周细胞和周细胞两者上表达，这与体内新血管形成相关。血管新生抗原是本领域已知的，参见例如以引用方式并入本文的WO2010/102140。例如，血管新生因子可选自：血管生成素-1(Ang1)、血管生成素3、血管生成素4、血管生成素6；Del-1；成纤维细胞生长因子：酸性(aFGF)和碱性(bFGF)；卵泡抑素；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(SF)；白细胞介素-8(IL-8)；痩素；中期因子；胎盘生长因子；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)；多效生长因子(PTN)；颗粒蛋白前体；增殖素；存活素；转化生长因子-α(TGF-α)；转化生长因子-β(TGF-β)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)/血管渗透因子(VPF)。在另一个实施例中，血管生成因子为血管生成蛋白。在一个实施例中，生长因子为血管生成蛋白。在一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的血管新生蛋白是：成纤维细胞生长因子(FGF)、VEGF、VEGFR和神经菌毛素1(NRP-1)、Tie2、血小板源生长因子(PDGF、BB-同二聚体)和PDGFR、转化生长因子-β(TGF-β)、内皮因子和TGF-β受体、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、整合素αVβ3、αVβ5和α5β1、VE-钙粘素和CD31、肝配蛋白(ephrin)、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、一氧化氮合酶(NOS)和COX-2、AC133或Id1/Id3，一种TGFβ共受体或内皮因子(也称为CD105、EDG、HHT1、ORW或ORW1)。
在一个实施例中，如在以下美国专利申请任一者中所公开的那样生成和获得新表位：USSN 62/166,591、USSN 62/174,692、USSN 62/218,936、USSN 62/184,125，它们均全文以引用方式并入本文。
在一个实施例中，本文公开了防止在施用基于李斯特菌的免疫疗法方案后在受试者体内的组织上存在李斯特菌菌株的方法，该方法包括在施用所述基于重组李斯特菌的免疫疗法后施用有效量的抗生素方案的步骤，从而防止所述李斯特菌菌株在所述受试者贴体内的所述存在。
在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码一个或多肽肽的开放阅读框，所述一个或多个肽编码一个或多个新表位，其中所述一个或多个肽融合到免疫原性蛋白或肽。在另一个实施例中，免疫原性蛋白或肽包含截短的LLO(tLLO)、截短的ActA(tActA)或PEST氨基酸序列肽。
在一个实施例中，本文公开了重组减毒李斯特菌菌株，其中所述李斯特菌菌株包含核酸序列，所述核酸序列包含一个或多个开放阅读框，所述一个或多个开放阅读框编码包含一个或多个个性化新表位的一个或多个肽，其中所述新表位包含存在于具有疾病或病症的受试者的患有疾病或病症的组织或细胞中的免疫原性表位。在另一个实施例中，一个或多个新表位存在于具有疾病或病症的受试者的患有疾病或病症的组织或细胞中。
在另一个实施例中，向具有所述疾病或病症的受试者施用李斯特菌菌株产生针对受试者的疾病或病症的免疫应答。
在另一个实施例中，该菌株是针对所述受试者的疾病或病症的用于所述受试者的个性化免疫疗法载体。
在另一个实施例中，肽包含至少两个不同的新表位氨基酸序列。
在另一个实施例中，肽包含相同氨基酸序列的一个或多个新表位重复片段。
在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含一个新表位。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含约1-100范围内的新表位。或者，李斯特菌菌株包含约1-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40,40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、5-15、5-20、5-25、15-20、15-25、15-30、15-35、20-25、20-35、20-45、30-45、30-55,40-55、40-65、50-65、50-75、60-75、60-85、70-85、70-95、80-95、80-105或95-105范围内的新表位。或者，李斯特菌菌株包含约50-100范围内的新表位。或者，李斯特菌菌株包含最多约100个新表位。
在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含超过约100个新表位。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含最多约10个新表位。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含最多约20个新表位。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含最多约50个新表位。或者，李斯特菌菌株包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个新表位。
在本文所述的一个实施例中，在所检测的突变的每一侧上并入约5-30个氨基酸范围内的氨基酸。另外或另选地，插入长度在约8-27个氨基酸序列范围内的不同大小的新表位插入片段。另外或另选地，插入长度在约5-50个氨基酸序列范围内的不同大小的新表位插入片段。
在另一个实施例中，新表位序列是肿瘤特异性的、转移特异性的、细菌感染特异性的、病毒感染特异性的以及它们的任意组合。另外或另选地，新表位序列是炎症特异性的、免疫调节分子表位特异性的、T细胞特异性的、自身免疫疾病特异性的、移植物抗宿主病(GvHD)特异性的以及它们的任意组合。
在另一个实施例中，一个或多个新表位包括线性新表位。另外或另选地，一个或多个新表位包括暴露于溶剂的表位。
在另一个实施例中，一个或多个新表位包括T细胞表位。
治疗方法及用于治疗方法的组合物
在另一个实施例中，本公开提供用于治疗疾病或病症(包括肿瘤或癌症)的如上文所述的免疫原性组合物。例如，用在本公开的方法中的免疫原性组合物包含表达如本文所述的微基因核酸构建体的李斯特菌菌株。
在一个实施例中，本文所公开的病症为发育异常。在另一个实施例中，疾病为瘤变。在另一个实施例中，疾病为肛门上皮内瘤变(AIN)。在另一个实施例中，疾病为阴道上皮内瘤变(VIN)。在另一个实施例中，疾病为宫颈上皮内瘤样病变(CIN)。
在另一个实施例中，本文所公开的病症为癌前病症或者如果不进行治疗将转变成慢性或急性疾病的病症。
在一个实施例中，本文所公开的癌症是乳腺癌、中枢神经系统(CNS)癌、头颈癌、骨肉瘤(OSA)、犬骨肉瘤(OSA)、结直肠癌、肾细胞癌、胰腺导管腺癌、尤因氏肉瘤(ES)、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌性病变、肺腺癌、结直肠腺癌、肺鳞腺癌、胃腺癌、卵巢表面上皮赘生物(例如，其良性、增生性或恶性形式)、口腔鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、CNS癌、子宫内膜癌、膀胱癌、间皮瘤、恶性间皮瘤(MM)、前列腺癌、黑素瘤或本领域已知的任何其他癌症。在另一个实施例中，癌症为淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在另一个实施例中，淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤。在另一个实施例中，淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为多发性黑素瘤。
在又一个实施例中，癌症为急性淋巴细胞白血病(ALL)。在另一个实施例中，癌症为急性髓性白血病(AML)。在另一个实施例中，癌症为慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在另一个实施例中，癌症为毛细胞白血病(HCL)。在另一个实施例中，癌症为T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)。在另一个实施例中，癌症为大颗粒淋巴细胞白血病。在另一个实施例中，癌症为成人T细胞白血病。在另一个实施例中，癌症为慢性髓性白血病(CML)。在另一个实施例中，癌症为慢性粒单核细胞白血病(CMML)。在另一个实施例中，癌症为淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为皮肤淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为霍奇金病。在另一个实施例中，癌症为非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在另一个实施例中，癌症为低级NHL。在另一个实施例中，癌症为弥漫性大B细胞淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为低级NHL。在另一个实施例中，癌症为前体T细胞淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为外周T细胞淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为外周套细胞淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为多发性骨髓瘤。在另一个实施例中，癌症为滤泡性淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为免疫增殖性疾病。在另一个实施例中，癌症为B细胞慢性淋巴细胞白血病。在另一个实施例中，癌症为伯基特淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为MALT淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为蕈样真菌病。在另一个实施例中，癌症为结节硬化。在另一个实施例中，癌症为低级淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为上述类型的淋巴瘤或白血病之一的残留病。在另一个实施例中，癌症为本领域已知的任何其他类型的淋巴瘤或白血病。在另一个实施例中，癌症为表达存活素的任何其他已知类型的淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为骨髓增生异常综合征。在另一个实施例中，癌症为表达存活素的血癌。在另一个实施例中，所述癌症或实体肿瘤是复发或转移性疾病的结果。在另一个实施例中，癌症为难治性的。在另一个实施例中，癌症为晚期的。在另一个实施例中，癌症为转移。
在另一个实施例中，肿瘤是骨肉瘤、乳腺肿瘤、头颈部肿瘤或可进展成本文所公开且本领域已知的任何癌症的任何其他肿瘤。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物靶向的肿瘤细胞表达与本文所公开的重组李斯特菌疫苗所表达的肽相关的抗原。在另一个实施例中，肽抗原与血管新生肿瘤抗原(例如HMW-MAA)相关。在施用本文所公开的免疫原性组合物之后，本文所公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致肿瘤部位存在的效应T细胞增加。在另一个实施例中，本文所公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致外周存在的效应T细胞增加。效应T细胞的这种扩增导致外周中和肿瘤部位的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量。技术人员将领会的是，外周淋巴器官包括但不限于脾脏、培氏斑、淋巴结、腺状肿等。在一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周中，而不影响Treg的数量。在另一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周、淋巴器官和肿瘤部位，而不影响这些部位的Treg数量。在另一个实施例中，效应T细胞的比率提高降低Treg的频率，而非这些部位的Treg总数。
在另一个实施例中，本文公开了防止受试者中的癌症的方法，该方法包括施用包含编码嵌合蛋白的微基因核酸构建体的重组李斯特菌的步骤，其中所述嵌合蛋白包含肿瘤抗原相关肽。在另一个实施例中，本文公开了防止受试者中的肿瘤生长的方法，该方法包括施用包含重组李斯特菌的组合物的步骤，所述李斯特菌包含编码嵌合蛋白的微基因核酸构建体，其中所述嵌合蛋白包含肿瘤抗原相关肽。
在一个实施例中，本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括施用包含重组李斯特菌的组合物的步骤，所述李斯特菌包含编码嵌合蛋白的微基因核酸构建体，其中所述嵌合蛋白包含肿瘤抗原相关肽。在一个实施例中，本文公开了治疗受试者中的肿瘤生长的方法，该方法包括施用重组李斯特菌的步骤，所述李斯特菌包含编码嵌合蛋白的微基因核酸构建体，其中所述嵌合蛋白包含肿瘤抗原相关肽。
在一个实施例中，本文公开了延长具有癌症的受试者的存活的方法，该方法包括施用包含重组李斯特菌的组合物的步骤，所述李斯特菌包含编码嵌合蛋白的微基因核酸构建体，其中所述嵌合蛋白包含肿瘤抗原相关肽。在一个实施例中，本文公开了延长具有肿瘤生长的受试者的存活的方法，该方法包括施用包含重组李斯特菌的组合物的步骤，所述李斯特菌包含编码嵌合蛋白的微基因核酸构建体，其中所述嵌合蛋白包含肿瘤抗原相关肽。
在一个实施例中，本文公开了抑制、阻碍或延迟具有疾病的受试者中的转移性疾病的方法，该方法包括施用包含重组李斯特菌的组合物的步骤，所述李斯特菌包含编码嵌合蛋白的微基因核酸构建体，其中所述嵌合蛋白包含与所述疾病相关的肽。在一个实施例中，本公开提供诱导受试者中的抗肿瘤或抗癌免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本发明的组合物。
在另一个实施例中，本文公开了诱导受试者中的肿瘤或癌症消退的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的组合物的步骤。
在一个实施例中，本文公开了降低肿瘤内调节性T细胞的频率的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的组合物的步骤。
在一个实施例中，本文公开了降低肿瘤内髓源性抑制细胞的频率的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的组合物的步骤。
在一个实施例中，本文公开了降低髓源性抑制细胞(MDSC)的频率的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌疫苗株的组合物的步骤。
在另一个实施例中，本文公开了治疗受试者中的转移性肿瘤或癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的组合物的步骤。
在一个实施例中，本公开的方法打破受试者中对所述受试者中的肿瘤或癌症的耐受性，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的组合物的步骤。
在另一个实施例中，本公开提供了阻碍受试者中的肿瘤或癌症的生长的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的组合物，从而阻碍受试者中肿瘤或癌症的生长。
在另一个实施例中，本公开提供降低癌症发生率的方法，该方法包括施用本发明的包含重组李斯特菌的组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供改善癌症的方法，该方法包括施用本发明的包含重组李斯特菌的组合物的步骤。
在一个实施例中，包含本文所述的李斯特菌菌株的本文所公开的任何组合物均可用于本发明的方法。
在一个实施例中，本文公开了施用本发明的组合物的方法。在另一个实施例中，本文公开了施用本发明的包含重组李斯特菌的疫苗的方法。在另一个实施例中，本文公开了施用本发明的重组多肽的方法。在另一个实施例中，本文公开了施用本发明的编码重组多肽的核酸构建体的方法。在另一个实施例中，施用通过不同的减毒细菌载体进行。在另一个实施例中，施用通过不同的减毒单核细胞增多性李斯特菌载体进行。在另一个实施例中，施用通过DNA疫苗(如，裸DNA疫苗)进行。在另一个实施例中，本公开的重组多肽的施用通过重组生成蛋白，然后将重组蛋白施用给受试者来进行。
在一个实施例中，本公开提供用于肿瘤的“表位扩展”的方法。在另一个实施例中，使用本文所公开的组合物和方法的免疫诱导具有除本发明的疫苗携带的抗原之外的抗原的其他肿瘤上的表位扩展。这导致抗肿瘤应答延伸到其他肿瘤。
在另一个实施例中，优势表位或次优势表位在进行治疗的受试者中分别是优势的或次优势的。在另一个实施例中，优势表位或次优势表位在进行治疗的群体中是优势的或次优势的。
在一个实施例中，本文公开了通过表位扩展来治疗、阻遏或抑制受试者的癌症或肿瘤生长的方法，其中并且在另一个实施例中，所述癌症与本发明的组合物中包含的抗原或其片段的表达相关。在另一个实施例中，方法包括向所述受试者施用包含本发明的重组多肽、重组李斯特菌或重组载体的组合物。在又一个实施例中，受试者产生对抗原表达性癌症或抗原表达性肿瘤的免疫应答，从而治疗、阻遏或抑制受试者的癌症或肿瘤生长。
在一个实施例中，术语“优势CD8+T细胞表位”或“优势表位”是指蛋白或包含蛋白的病原体或癌细胞的疫苗接种、感染或恶性生长引起的超过30％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指由此引起的超过35％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过40％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过45％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过50％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过55％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过60％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过65％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过70％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过75％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过80％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过85％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过90％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过95％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过96％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过97％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过98％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。
在一个实施例中，术语“次优势CD8+T细胞表位”或“次优势表位”是指蛋白或包含蛋白的病原体或癌细胞的疫苗接种、感染或恶性生长引起的少于30％的抗原特异性CD8+T细胞所识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于28％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过26％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于24％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过22％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于20％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过18％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于16％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过14％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过12％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于10％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过8％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于6％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于5％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过4％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于3％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于2％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于1％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于0.5％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。
在一个实施例中，本公开的方法和组合物中的包含肽的抗原以可检测水平在受试者非肿瘤细胞上表达。在另一个实施例中，抗原以可检测水平在至少某一百分比(如，0.01％、0.03％、0.1％、0.3％、1％、2％、3％或5％)的受试者非肿瘤细胞上表达。在一个实施例中，“非肿瘤细胞”是指肿瘤体外的细胞。在另一个实施例中，“非肿瘤细胞”是指非恶性细胞。在另一个实施例中，“非肿瘤细胞”是指未转化的细胞。在另一个实施例中，非肿瘤细胞是体细胞。在另一个实施例中，非肿瘤细胞是生殖细胞。
“可检测水平”是指当使用标准分析时可检测的水平。在一个实施例中，分析是免疫分析。在一个实施例中，分析是酶联免疫分析(ELISA)。在另一个实施例中，分析是Western印迹。在另一个实施例中，分析是FACS。在另一个实施例中，分析是基因表达分析。技术人员将理解的是，本文所公开的方法可使用本领域可用的其他分析。在另一个实施例中，可检测水平相对于具体分析的背景水平确定。执行这些技术中的每一种的方法是本领域技术人员熟知的。
在一个实施例中，使用重组抗原表达性LM进行疫苗接种诱导了表位扩展。
在一个实施例中，本公开提供抗肿瘤应答的“表位扩展”方法。在另一个实施例中，使用本文所公开的组合物和方法进行的免疫诱导表位扩展到其他肿瘤上。
在另一个实施例中，优势表位或次优势表位在进行治疗的受试者中分别是优势的或次优势的。在另一个实施例中，优势表位或次优势表位在进行治疗的群体中是优势的或次优势的。
在一个实施例中，本文公开了通过表位扩展来治疗、阻遏或抑制受试者的癌症或肿瘤生长的方法，其中并且在另一个实施例中，所述癌症与本发明的组合物中包含的抗原或其片段的表达相关。在另一个实施例中，方法包括向所述受试者施用包含本发明的重组多肽、重组李斯特菌或重组载体的组合物。在又一个实施例中，受试者产生对抗原表达性癌症或抗原表达性肿瘤的免疫应答，从而治疗、阻遏或抑制受试者的癌症或肿瘤生长。
在另一个实施例中，本公开提供诱导在患有癌症的宿主中形成细胞毒性T细胞的方法，该方法包括向宿主施用本发明的组合物，从而诱导在患有癌症的宿主中形成细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，将组合物离体施用给受试者的细胞；在另一个实施例中，将组合物离体施用给供体的细胞；在另一个实施例中，将组合物体内施用给供体的细胞，然后转移到受试者。
在本发明的方法的另一个实施例中，受试者产生对抗原表达性肿瘤或靶抗原的免疫应答，从而介导抗肿瘤效应。
在一个实施例中，本公开的组合物的重复施用(强化剂量)可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤消退。在另一个实施例中，重复剂量可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤生长的抑制。评估可通过本领域已知的任何技术确定，包括诊断方法诸如成像技术、血清肿瘤标志物分析、活组织检查、肿瘤相关症状的存在、不存在或改善。
在一个实施例中，本文公开了提高受试者脾脏和肿瘤微环境中的效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，包括施用本文提供的免疫原性组合物。在另一个实施例中，提高受试者的脾脏和肿瘤微环境中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率使得受试者中可以实现更明显的抗肿瘤应答。在另一个实施例中，调节性T细胞是CD4+FoxP3+T细胞。
在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。
在一个实施例中，本公开提供治疗肿瘤、防御肿瘤以及诱导对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施例中，本公开提供防止或治疗人类受试者中的肿瘤或癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，该免疫应答是T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-和CD8+T细胞应答。
在另一个实施例中，本公开提供避免受试者罹患肿瘤或癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供诱导受试者中的肿瘤消退的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供减少肿瘤或癌症的发生或复发的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供阻遏受试者中的肿瘤形成的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供诱导受试者中的癌症缓解的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施例中，包含编码如本文所公开的嵌合肽的开放阅读框的微基因核酸构建体整合进李斯特菌基因组。在另一个实施例中，该微基因构建体在重组李斯特菌疫苗株的质粒中。在另一个实施例中，该微基因构建体在所述李斯特菌的染色体外质粒中。在另一个实施例中，该构建体从所述李斯特菌中的染色体外质粒表达。
在另一个实施例中，治疗方法减小淋巴结大小。淋巴结大小的减小可以是部分的或100％。在另一个实施例中，本公开的方法将淋巴结大小减小90％。在另一个实施例中，本公开的方法将淋巴结大小减小80％。在另一个实施例中，方法将淋巴结大小减小70％。在另一个实施例中，方法将淋巴结大小减小60％。在另一个实施例中，方法将淋巴结大小减小50％。
在另一个实施例中，治疗方法延长疾病进展时间。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少2个月。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少4个月。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少6个月。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少1年。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少2年。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少3年。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少4年。在一个实施例中，与未治疗的受试者相比，疾病进展时间延长至少5年。
在一个实施例中，所述方法包括将重组李斯特菌与另外的疗法共施用的步骤。在另一个实施例中，该另外的疗法是手术、化疗、免疫疗法、放疗、基于抗体的免疫疗法或它们的组合。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之前进行。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之后进行。在另一个实施例中，该另外的疗法是抗体疗法。在另一个实施例中，该重组李斯特菌以增大剂量施用，以提高效应T细胞与调节性T细胞的比率，并产生更强大的抗肿瘤免疫应答。技术人员将领会的是，抗肿瘤免疫应答可通过给患有肿瘤的受试者提供细胞因子进一步增强，该细胞因子包括但不限于IFN-γ、TNF-α以及本领域已知的增强细胞免疫应答的其他细胞因子，这些细胞因子中的一些可见于美国专利No.6,991,785，该专利以引用方式并入本文。
在一个实施例中，本文所公开的方法还包括将本文所公开的免疫原性组合物与在所述受试者中增强抗肿瘤免疫应答的抗体或其功能片段共施用的步骤。
在另一个实施例中，本文公开了延长罹患癌症或肿瘤的受试者的存活的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌疫苗株的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施例中，本文公开了增加罹患癌症或肿瘤的受试者中的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌疫苗的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施例中，本公开的处理方案为治疗性的。在另一个实施例中，该方案为预防性的。在另一个实施例中，将本公开的组合物用于保护人们免于诸如乳腺癌的癌症或其他类型的肿瘤的风险，因为家族性遗传或其他情况使得他们易于罹患这些类型的疾病，如技术人员将理解的那样。在另一个实施例中，所述组合物在通过手术、常规化疗或放疗摧毁肿瘤生长后用作癌症免疫疗法。在这些治疗后，施用本公开的组合物，以使得对疫苗的肿瘤抗原的细胞毒性T细胞(CTL)应答破坏剩余的转移并延长该癌症的缓解。在另一个实施例中，组合物与手术、常规化疗或放疗联合用作癌症免疫疗法。在另一个实施例中，将本公开的组合物用于影响之前建立的肿瘤的生长并杀死现有的肿瘤细胞。
本发明构思了剂量范围的各种实施例。在一个实施例中，就疫苗载体而言，剂量在0.4LD50/剂的范围内。在另一个实施例中，剂量为约0.4-4.9LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.5-0.59LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.6-0.69LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.7-0.79LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.8LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为0.4LD50/剂至0.8LD50/剂。
在另一个实施例中，剂量为107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为4×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为4×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为5×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为5×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为5×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×1011个细菌/剂。
本发明还构思了各种施用方案。在一个实施例中，将包含如本公开中所述的细菌的药物组合物施用一次。在另一个实施例中，将该组合物施用不止一次。在另一个实施例中，将该组合物施用两次，施用之间间隔一周。在另一个实施例中，将该组合物施用两次，施用之间间隔两周。在另一个实施例中，将该组合物施用两次，施用之间间隔三周。在另一个实施例中，将该组合物施用三次，施用之间间隔一周。在另一个实施例中，将该组合物施用三次，施用之间间隔两周。在另一个实施例中，将该组合物施用三次，施用之间间隔三周。在另一个实施例中，任何上述方案之后接着进一步的施用。在一些实施例中，进一步的施用为预防性的。在另一个实施例中，当受试者癌症复发时，进行进一步的强化施用。在另一个实施例中，当受试者癌症缓解时，进行进一步的强化施用。在一些实施例中，强化方案包括组合物的每月一次施用。在另一个实施例中，强化方案包括组合物的每两月一次施用。在又一个实施例中，强化方案包括以两个或更多个月为间隔施用组合物。在其他实施例中，强化方案包括一次另外的施用。在另一个实施例中，强化方案包括不止一次另外的施用。在又一个实施例中，强化方案包括两次另外的施用。在又一个实施例中，强化方案包括三次另外的施用。在另一个实施例中，后续施用方案包括不止三次另外的施用。
在另一个实施例中，本公开的方法还包括用包含本文所公开的减毒李斯特菌菌株的免疫原性组合物强化受试者。在另一个实施例中，本公开的方法包括施用强化剂量的免疫原性组合物的步骤，该组合物包含本文所公开的减毒李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本公开的方法还包括向受试者施用强化免疫原性组合物的步骤。在一个实施例中，该强化剂量在所述免疫原性组合物的单次初免剂量之后。在另一个实施例中，单次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，两次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，三次强化剂量在初免剂量后施用。在一个实施例中，包含本文所公开的减毒李斯特菌的免疫原性组合物的初免和强化剂量之间的周期由技术人员以实验方法确定。
在另一个实施例中，强化剂量是包含本文所公开的李斯特菌的免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施例中，强化剂量包含本文所公开的免疫原性组合物和佐剂。异源性“初免强化”策略对于增强免疫应答和防御众多病原体已是有效的。Schneider等人,Immunol.Rev.170:29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2:239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人,Strain 20:1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和强化注射中提供似乎使对该抗原的免疫应答最大化。以DNA菌株初免，接着以佐剂中的蛋白或者通过病毒载体递送编码抗原的DNA来强化似乎是改善抗原特异性抗体以及各自的CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答的最有效方式。ShiverJ.W.等人,Nature 415:331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人,Strain 20:1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人,Strain 19:95-102(2000)；Sin,J.I.等人,DNA Cell Biol.18:771-9(1999)。最近的来自猴疫苗接种研究的数据提示，当以HIV gag DNA对猴进行初免接种后接着以表达HIV gag的腺病毒载体(Ad5-gag)强化时，向编码HIV gag抗原的DNA添加CRL1005泊洛沙姆(12kDa,5％POE)增强了T细胞应答。针对DNA/泊洛沙姆初免和随后的Ad5-gag强化的细胞免疫应答强于以DNA(无泊洛沙姆)初免和随后进行Ad5-gag强化所诱导的应答或者针对单独的Ad5-gag的应答。Shiver,J.W.等人Nature 415:331-5(2002)。美国专利申请公开US 2002/0165172A1描述了以编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的该免疫原性部分的蛋白同时施用，由此产生免疫应答。该文献仅限于乙型肝炎抗原和HIV抗原。此外，美国专利No.6,500,432涉及通过以所关注的多核苷酸和多肽同时施用来增强核酸疫苗接种的免疫应答的方法。根据该专利，同时施用意指在相同的免疫应答期间，优选地在彼此的0-10天或3-7天内施用多核苷酸和多肽。所构思的抗原包括：肝炎(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎、流感、寄生虫(例如，来自疟原虫(Plasmodium)属)和病原菌(包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、衣原体(Chlamydia)、志贺氏菌(Shigella)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、伤寒沙门氏菌(S.typhosa)、幽门螺杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、百日咳杆菌(B.pertussis)等)抗原等。通过引用将以上所有文献全文并入本文。
在一个实施例中，将本公开的疫苗或免疫原性组合物单独施用给受试者。在另一个实施例中，将所述疫苗或免疫原性组合物与另一种癌症疗法一起施用，所述癌症疗法诸如但不限于放疗、化疗或检查点抑制剂(诸如抗PD-1抗体、IDO通路抑制剂等)或其组合。
在一个实施例中，本公开的处理方案为治疗性的。在另一个实施例中，该方案为预防性的。在另一个实施例中，将本公开的组合物用于保护人们免于诸如乳腺癌的癌症或其他类型的肿瘤的风险，因为家族性遗传或其他情况使得他们易于罹患这些类型的疾病，如技术人员将理解的那样。在另一个实施例中，所述疫苗或免疫原性组合物在通过手术、常规化疗或放疗摧毁肿瘤生长后用作癌症免疫疗法。在这些治疗后，施用本公开的疫苗，以使得对疫苗的肿瘤抗原的CTL应答破坏剩余的转移并延长癌症的缓解。在另一个实施例中，将本公开的疫苗用于影响之前建立的肿瘤的生长并杀死现有的肿瘤细胞。
如本文所用，除非上下文明确地相反指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数含义。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括它们的混合物。
遍及本申请，本公开的各个实施例可以以范围的形式表示。应理解，以范围形式描述仅是出于方便和简洁，而不应认为是对发明范围的呆板限制。因此，对范围的描述应认为是已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应理解为已具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。这种适用性与范围的广度无关。
每当在本文中指出数值范围时，其旨在包括该指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数和第二指定数“之间的范围”和“从”第一指定数“至”第二指定数的“范围”在本文中可互换使用，旨在包括第一和第二指定数以及它们之间的所有分数和整数。
技术人员将理解的是，术语“方法”涵盖用于实现给定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知的或易于从已知的方式、手段、技术和工序开发的那些方式、手段、技术和工序。
在以下实例中，陈述了多个具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况中，为避免使本发明复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
药物制剂和施用
本公开的包含疫苗、免疫原性组合物或重组李斯特菌的药物组合物在另一个实施例中通过本领域的技术人员已知的任何方法(诸如肠胃外、癌旁侧、经粘膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、经口、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内)施用给受试者。
在一个实施例中，本文公开了治疗、阻遏或抑制受试者的至少一种癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。
在一个实施例中，可在已知易感特定癌症或肿瘤的特定群体中通过施用本文所公开的免疫原性组合物而预防癌症或肿瘤。在一个实施例中，这种易感性可归因于环境因素，例如吸烟，其在一个实施例中可导致群体遭受肺癌，而在另一个实施例中，这种易感性可归因于遗传因素，例如具有BRCA1/2突变的群体在一个实施例中可能易感乳腺癌，在另一个实施例中易感卵巢癌。在另一个实施例中，染色体8q24，染色体17q12和染色体17q24.3上的一种或多种突变可增加对前列腺癌的易感性，如本领域已知的。促成癌症易感性的其他遗传和环境因素是本领域已知的。
在本文所公开的方法和组合物的另一个实施例中，该疫苗或组合物经口施用，并因此将其被配制为适合经口施用的形式，即，作为固体或液体制备物。适合的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的另一个实施例中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施例，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本公开的组合物还包括硬明胶胶囊。
在另一个实施例中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制备物来以疫苗或组合物施用。适合的液体制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物肌肉内施用，因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。
术语“免疫原性组合物”、“组合物”和“药物组合物”可以互换使用。例如，在一个实施例中，本公开的组合物可以包含本文描述的重组李斯特菌和佐剂。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本文所公开的重组李斯特菌。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本领域已知的或如本文所公开的佐剂。还应理解的是，这些组合物的施用增强免疫应答或增加T效应细胞与调节性T细胞比率或者引起抗肿瘤免疫应答，如本文进一步公开的。
术语“药物组合物”涵盖治疗有效量的一种或多种活性成分，包括李斯特菌菌株，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
技术人员应当理解，术语“施用”涵盖使受试者与本发明的组合物接触。在一个实施例中，施用可在体外即在试管中实现，或在体内即活生物体(例如人)的细胞或组织内实现。在一个实施例中，本公开涵盖向受试者施用本公开的李斯特菌菌株及其组合物。
在一个实施例中，术语“治疗”是指治愈疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指防止疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指减少疾病的发生。在另一个实施例中，“治疗”是指改善疾病的症状。在另一个实施例中，“治疗”是指提高患者的无进展存活期或总体存活期。在另一个实施例中，“治疗”是指稳定疾病的进展。在另一个实施例中，“治疗”是指诱导缓解。在另一个实施例中，“治疗”是指减缓疾病的进展。在另一个实施例中，“治疗”当提及肿瘤或癌症时是指诱导肿瘤或癌症消退。术语“减少”、“阻遏”和“抑制”是指减轻或降低。
技术人员将理解的是，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是防止或减轻如本文所述的目标病理性病症或障碍。因此，在一个实施例中，治疗可以包括直接影响或治愈、遏制、抑制、预防疾病、障碍或病症，降低其严重程度，延缓其发作，减少与其相关的症状，或它们的组合。因此，在一个实施例中，“治疗”尤其是指延缓进展、加快缓解、引起缓解、增强缓解、加快恢复、提高替代治疗剂的功效或减小对其的抗性、或它们的组合。在一个实施例中，“预防”或“阻遏”尤其是指延缓症状的发作、防止疾病的复发、降低复发事件的次数或频率、延长有症状事件之间的潜伏期、或它们的组合。在一个实施例中，“遏制”或“抑制”尤其是指降低症状的严重程度、降低急性事件的严重程度、减少症状的数量、降低疾病相关症状的发病率、缩短症状的潜伏期、改善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活期、或它们的组合。
在一个实施例中，症状是原发性的，而在另一个实施例中，症状是继发性的。在一个实施例中，“原发性的”是指作为特定疾病或障碍的直接结果的症状，而在一个实施例中，“继发性的”是指由原发性原因产生或引起的症状。在一个实施例中，用于本公开的化合物治疗原发性或继发性症状或继发性并发症。在另一个实施例中，“症状”可以是疾病或病理性病症的任何表现。
如本文所用，术语“约”是数量术语，意指加或减5％，或在另一个实施例中，加或减10％，或在另一个实施例中，加或减15％，或在另一个实施例中，加或减20％。
技术人员理解，术语“受试者”可涵盖哺乳动物，包括需要治疗病症或其后遗症或易受其影响的人类成人或儿童、少年或青少年，并且还可包括非人类哺乳动物，诸如狗、猫、猪、乳牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠。还将领会的是，该术语可以涵盖家畜。术语”受试者”不排除在所有方面都正常的个体。
技术人员将领会的是，出于治疗目的，术语“哺乳动物”是指被归为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农畜以及动物园、比赛动物或宠物，诸如包括狗的犬科动物和马、猫、黄牛、猪、绵羊等。
涉及肿瘤治疗的“治疗有效量”是指能够产生一种或多种以下效应的量：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全生长停滞；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)减小肿瘤的大小；(4)抑制(即，减少、缓解或完全阻止)肿瘤细胞浸润外周器官；(5)抑制(即，减少、缓解或完全阻止)转移；(6)增强抗肿瘤免疫应答，这可以(但不一定)导致肿瘤消退或排斥；和/或(7)在一定程度上减轻与失调相关的一个或多个症状。出于肿瘤治疗的目的，本文所公开的疫苗的“治疗有效量”可凭经验以及以惯例方式确定。
在以下实例中，陈述了许多具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况中，为避免使本发明复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。因此，这些实例绝不应解释为限制本发明的广泛范围。
实例
(A)材料和实验方法(实例1-2)
(B)实例1：LLO-抗原融合体诱导抗肿瘤免疫
细胞系
C57BL/6同基因TC-1肿瘤经HPV-16 E6和E7永生化并以c-Ha-ras癌基因转化。T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore,MD)提供的TC-1为高度致瘤的肺上皮细胞，该细胞表达低水平的HPV-16 E6和E7，并被c-Ha-ras癌基因转化。让TC-1于37℃及10％CO2下生长在RPMI 1640、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、50微摩尔(mcM)2-ME、400微克(mcg)/ml G418以及10％国家典型菌种保藏中心-109培养基(National Collection TypeCulture-109medium)中。C3为来自C57BL/6小鼠的小鼠胚胎细胞，该细胞经完整HPV 16基因组永生化并经pEJ-ras转化。EL-4/E7为经E7逆转录病毒转导的胸腺瘤EL-4。
单核细胞增多性李斯特菌菌株和繁殖
所用的李斯特菌菌株为Lm-LLO-E7(在游离型表达系统中的hly-E7融合基因；图1A)、Lm-E7(整合进李斯特菌基因组中的单拷贝E7基因盒)、Lm-LLO-NP(“DP-L2028”；在游离型表达系统中的hly-NP融合基因)和Lm-Gag(“ZY-18”；整合进染色体中的单拷贝HIV-1Gag基因盒)。将E7用引物5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID No:21；XhoI位点标有下划线)和5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID No:21；SpeI位点标有下划线)通过PCR扩增并连接进pCR2.1(Invitrogen,San Diego,CA)。通过XhoI/SpeI消化从pCR2.1切离E7，并将其连接进pGG-55。将hly-E7融合基因和多能转录因子prfA克隆进pAM401，即一种多拷贝穿梭质粒(Wirth R等人,J Bacteriol,165:831,1986)，从而生成pGG-55。hly启动子驱动hly基因产物的前441个氨基酸(缺乏溶血性C-端，在下文中被称作“ΔLLO”)的表达，其通过XhoI位点连接至E7基因，从而产生hly-E7融合基因，该基因被转录和分泌成LLO-E7。用为了在体内保留质粒而选择的pGG-55转化prfA阴性李斯特菌菌株XFL-7(由Hao Shen博士提供，University of Pennsylvania)(图1A-B)。使用引物5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ ID No:23；NheI位点标有下划线)和5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID No:24；XhoI位点标有下划线)生成hly启动子和基因片段。将prfA基因用引物5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(SEQ ID No:25；XbaI位点标有下划线)和5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID No:26；SalI位点标有下划线)进行PCR扩增。通过将含有驱动E7的表达和分泌的hly启动子和信号序列的表达盒引入LM基因组的orfZ域中，产生Lm-E7。将E7用引物5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQ ID No:27；BamHI位点标有下划线)和5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQ ID No:28；XbaI位点标有下划线)通过PCR扩增。然后将E7连接进pZY-21穿梭载体。用得到的质粒pZY-21-E7转化LM菌株10403S，该质粒包括插入在与LM基因组的orfX、Y、Z域对应的1.6-kb序列的中央的表达盒。该同源域允许E7基因盒通过同源重组插入orfZ域中。针对E7基因盒在orfZ域中的整合，筛选克隆。在含有(Lm-LLO-E7和Lm-LLO-NP)或不含(Lm-E7和ZY-18)氯霉素(20μg/ml)的脑心浸液培养基中培养细菌。在-80℃以等分试样冷冻细菌。通过Western印迹法验证表达(图2)。
Western印迹法
使李斯特菌菌株在Luria-Bertoni培养基中于37℃生长，并在600nm处测得的相同光密度下收获。将上清液TCA沉淀，并重悬于补充了0.1N NaOH的1x样品缓冲液中。将相同量的每种细胞沉淀物或每种经TCA沉淀的上清液上样至4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(NOVEX,San Diego,CA)。将凝胶转移至聚偏二氟乙烯，并用抗-E7单克隆抗体(mAb)(ZymedLaboratories,South San Francisco,CA)探测，然后与HRP-偶联的抗小鼠二抗(AmershamPharmacia Biotech,Little Chalfont,U.K.)一起温育，用Amersham ECL检测试剂显影，并暴露于Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)。
肿瘤生长的测量
每隔一天用卡尺跨最短和最长表面直径测量肿瘤。将这两个测量结果的平均值作为平均肿瘤直径(以毫米计)相对于不同时间点作图。当肿瘤直径达到20mm时，处死小鼠。仅显示存活小鼠在每个时间点的肿瘤测量结果。
李斯特菌重组体对建立的肿瘤生长的影响
6-8周龄C57BL/6小鼠(Charles River)在左胁腹皮下接受2×105个TC-1细胞。肿瘤接种后一周，肿瘤已经达到直径为4-5mm的可触知大小。然后在第7和14天用0.1LD50腹膜内Lm-LLO-E7(107个CFU)、Lm-E7(106个CFU)、Lm-LLO-NP(107个CFU)或Lm-Gag(5×105个CFU)处理8只小鼠的组。
51Cr释放测定
以0.1LD50Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜内免疫6-8周龄C57BL/6小鼠。免疫接种后十天，收获脾。将经照射的TC-1细胞作为饲养细胞，在培养物中建立脾细胞(100:1，脾细胞:TC-1)；在体外刺激5天，然后用在标准51Cr释放测定中，其中使用下述靶标：EL-4、EL-4/E7或经E7H-2b肽(RAHYNIVTF)(SEQ ID NO:29)脉冲处理的EL-4。一式三份地进行的E:T细胞比率为：80:1、40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1。在37℃温育4h以后，将细胞沉淀，并从每个孔取出50μl上清液。以Wallac 1450闪烁计数器(Gaithersburg,MD)测定样品。将特异性裂解百分比确定为[(每分钟的实验计数(cpm)-自发cpm)/(总cpm-自发cpm)]×100。
TC-1特异性增殖
将C57BL/6小鼠用0.1LD50免疫，并在20天后通过腹膜内注射1LD50Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag进行强化。强化后六天，从经免疫的小鼠和未暴露的小鼠收获脾。以2.5×104、1.25×104、6×103或3×103个经照射的TC-1细胞/孔作为E7Ag的来源，或不用TC-1细胞或用10μg/ml Con A，在平底96孔平板中以5×105个/孔在培养物中建立脾细胞。45h后以0.5μCi[3H]胸苷/孔脉冲处理细胞。18h以后，采用Tomtec采集器96(Orange,CT)收获平板，并用Wallac 1450闪烁计数器评估增殖。将以cpm计的变化计算为实验cpm–无Ag cpm。
流式细胞术分析
将C57BL/6小鼠用0.1LD50Lm-LLO-E7或Lm-E7静脉内(i.v.)免疫，并在30天后强化。采用带软件(Becton Dickinson,Mountain View,CA)的流式细胞计对CD8(53-6.7，PE偶联的)、CD62配体(CD62L；MEL-14，APC偶联的)和E7H-2Db四聚体进行三色流式细胞术。将强化后第5天收获的脾细胞在室温(rt)用负载了E7肽(RAHYNIVTF)(SEQ ID NO:29)或对照(HIV-Gag)肽的H-2Db四聚体染色。以1/200稀释度使用四聚体，其由Larry R.Pease博士(Mayo Clinic,Rochester,MN)以及由NIAID Tetramer Core Facility和NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供。分析了四聚体+、CD8+、CD62L低细胞。
B16F0-Ova实验
给24只C57BL/6小鼠接种5×105个B16F0-Ova细胞。在第3、10和17天，将8只小鼠的组用0.1LD50Lm-OVA(106个cfu)、Lm-LLO-OVA(108个cfu)免疫，另八只动物保持不处理。
统计
为了对比肿瘤直径，确定每个组的肿瘤大小的平均值和SD，并通过学生t检验确定统计显著性。p≤0.05视作显著的。
结果
对比了Lm-E7和Lm-LLO-E7影响TC-1生长的能力。在C57BL/6小鼠的左胁腹上建立皮下肿瘤。七天后，肿瘤已经达到可触知的大小(4-5mm)。在第7和14天，给小鼠接种0.1LD50Lm-E7、Lm-LLO-E7或作为对照的Lm-Gag和Lm-LLO-NP。Lm-LLO-E7诱导75％的建立的TC-1肿瘤的完全消退，而在该组中的其他2只小鼠中控制了肿瘤生长(图3)。相反，使用Lm-E7和Lm-Gag的免疫接种没有诱导肿瘤消退。该实验重复多次，总是得到非常类似的结果。另外，在不同的免疫方案下，Lm-LLO-E7也得到了类似的结果。在另一实验中，单次免疫能够治愈小鼠建立的5mm TC-1肿瘤。
在其他实验中，用另外2个表达E7的肿瘤细胞系得到了类似的结果：C3和EL-4/E7。为了确认以Lm-LLO-E7接种的效力，分别在第60天或第40天用TC-1或EL-4/E7肿瘤细胞重新挑战已经消除了它们的肿瘤的动物。经Lm-LLO-E7免疫的动物保持无肿瘤直到实验终止(就TC-1而言，第124天；就EL-4/E7而言，第54天)。
因此，抗原作为与ΔLLO的融合蛋白的表达会增强所述抗原的免疫原性。
实例2：LM-LLO-E7处理引起TC-1特异性脾细胞增殖
为了用Lm-LLO-E7测量Lm-E7对T细胞的诱导，在经免疫的小鼠中测量了E7特异性增殖性应答(抗原特异性免疫活性的度量)。来自经Lm-LLO-E7免疫的小鼠的脾细胞当以20:1、40:1、80:1和160:1的脾细胞:TC-1比率暴露于经照射的TC-1细胞(作为E7的来源)时发生增殖(图4)。反之，来自经Lm-E7和rLm对照免疫的小鼠的脾细胞仅表现出背景水平的增殖。
实例3：ActA-E7和PEST-E7融合体赋予抗肿瘤免疫
材料和实验方法
Lm-ActA-E7的构建
Lm-ActA-E7是LM的重组菌株，其包含表达与截短形式的actA蛋白融合的E7蛋白的质粒。通过将质粒载体pDD-1引入李斯特菌而生成Lm-actA-E7，所述质粒载体通过修改pDP-2028而构建。pDD-1包含表达310bp hly启动子和hly信号序列(ss)的拷贝的表达盒，该表达盒驱动ActA-E7的表达和分泌；包含四个PEST序列的1170bp actA基因(截短的ActA多肽由分子的前390个AA组成)、300bp HPV E7基因、1019bp prfA基因(控制毒力基因的表达)和CAT基因(氯霉素抗性基因)用于选择所转化的细菌克隆(Sewell等人(2004),Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,130:92-97)。
使用引物5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(Xba I位点标有下划线；SEQID NO:30)和引物5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3(Not I位点标有下划线；前18个核苷酸为ActA基因重叠；SEQ ID NO:31)从pGG55(实例1)对hly启动子(pHly)和基因片段进行PCR扩增。使用引物5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3'(NotI位点标有下划线；SEQ IDNO:32)和引物5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3'(XhoI位点标有下划线；SEQ ID NO:33)从LM 10403s野生型基因组对actA基因进行PCR扩增。使用引物5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(XhoI位点标有下划线；SEQ ID NO:34)和引物5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(XmaI位点标有下划线；SEQ ID NO:35)从pGG55(pLLO-E7)对E7基因进行PCR扩增。使用引物5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(XmaI位点标有下划线；SEQ ID NO:36)和引物5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SalI位点标有下划线；SEQ ID NO:37)从LM 10403s野生型基因组对prfA基因进行PCR扩增。通过PCR生成hly启动子-actA基因融合体(pHly-actA)，并使用上游pHly引物(SEQ ID NO:30)和下游actA引物(SEQ ID NO:33)从纯化的pHly DNA和纯化的actA DNA进行扩增。
通过PCR生成与prfA基因融合的E7基因(E7-prfA)，并使用上游E7引物(SEQ IDNO:34)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:37)从纯化的E7DNA和纯化的prfA DNA进行扩增。
通过PCR产生与E7-prfA融合产物融合的pHly-actA融合产物，并使用上游pHly引物(SEQ ID NO:30)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:37)从纯化的融合pHly-actA DNA基因产物和纯化的融合E7-prfA DNA产物进行扩增，且连接到pCRII(Invitrogen,La Jolla,Calif.)中。用pCRII-ActAE7转化感受态大肠杆菌(TOP10'F,Invitrogen,La Jolla,Calif.)。在裂解和分离后，使用BamHI(预期片段大小770bp和6400bp(或当插入片段逆向插入载体时：2500bp和4100bp))和BstXI(预期片段大小2800bp和3900bp)通过限制性分析筛选质粒，并且还使用上游pHly引物(SEQ ID NO:30)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:37)通过PCR分析进行了筛选。
将pHly-actA-E7-prfA DNA插入片段通过用Xba I和Sal I双重消化而从pCRII切割，并连接进也用Xba I和Sal I消化的pDP-2028。在用表达系统pActAE7转化TOP10'F感受态大肠杆菌(Invitrogen,La Jolla,Calif.)后，使用上游pHly引物(SEQ ID NO:30)和下游PrfA基因引物(SEQ ID NO:37)通过PCR分析来筛选耐氯霉素克隆。使包含pActAE7的克隆在脑心浸液培养基(具有氯霉素(20mcg(微克)/ml(毫升)，Difco,Detroit,Mich.)中生长，并使用小量提取DNA纯化系统试剂盒(midiprep DNA purification system kit)(Promega,Madison,Wis.)分离pActAE7。将经青霉素处理的李斯特菌的prfA阴性菌株(菌株XFL-7)用表达系统pActAE7转化，如在Ikonomidis等人(1994,J.Exp.Med.180:2209-2218)中所描述的，并针对体内质粒保留来选择克隆。于37℃在含有氯霉素(20mcg/ml)的脑心浸液中培养克隆。在-80℃在等分试样中冷冻细菌。
抗原表达的免疫印迹验证
为了验证Lm-ActA-E7分泌ActA-E7(约64kD)，使李斯特菌菌株在Luria-Bertoni(LB)培养基中在37℃培养。用三氯乙酸(TCA)从培养物上清液中沉淀蛋白，重悬于含有0.1N氢氧化钠的1x样品缓冲液中。将相等量的每种经TCA沉淀的上清液加样至4％至20％Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(NOVEX,San Diego,Calif)。将凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，并用1:2500抗-E7单克隆抗体(Zymed Laboratories,South San Francisco,Calif)探测，然后用1:5000辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG(Amersham PharmaciaBiotech,Little Chalfont,England)探测。将印迹用Amersham增强的化学发光检测试剂显影，并暴露于放射自显影胶片(Amersham)(图5A)。
Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi的构建(图6A)
Lm-PEST-E7与Lm-LLO-E7相同，但是它仅含有hly基因的启动子和PEST序列，具体而言，LLO的前50个氨基酸。为了构建Lm-PEST-E7，使用SOE(通过重叠延伸实现的基因剪接)PCR技术，让hly启动子和PEST区域与全长E7基因融合。从质粒pGG-55(其含有LLO的前441个氨基酸)扩增E7基因和hly-PEST基因片段，并通过常规PCR技术剪接到一起。为了建立最终的质粒pVS16.5，将hly-PEST-E7片段和prfA基因亚克隆进质粒pAM401(其包括用于体外选择的氯霉素抗性基因)中，并使用得到的质粒转化XFL-7。
Lm-ΔPEST-E7是与Lm-LLO-E7相同的重组李斯特菌菌株，但是它缺少PEST序列。基本上如针对Lm-PEST-E7所描述的那样进行制备，但是使用设计成从hly-E7融合基因除去含有PEST的区域(bp 333-387)的引物来构建游离型表达系统。Lm-E7epi是分泌不含PEST区域或LLO的E7的重组菌株。用于转化该菌株的质粒含有与E7基因融合的hly启动子和信号序列的基因片段。该构建体不同于原始的Lm-E7，该Lm-E7表达整合进染色体中的单个拷贝的E7基因。除了表达的E7抗原的形式以外，Lm-E7epi是与Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7和Lm-ΔPEST-E7完全同基因的。
结果
为了对比Lm-ActA-E7相对于Lm-LLO-E7诱导的抗肿瘤免疫，将2×105个TC-1肿瘤细胞皮下植入小鼠中，并让其生长至可触知的大小(大约5毫米[mm])。在第7和14天，用1LD50的Lm-ActA-E7(5×108个CFU)(十字叉)、Lm-LLO-E7(108个CFU)(正方形)或Lm-E7(106个CFU)(圆形)腹膜内免疫小鼠。到第26天，在Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7中的所有动物都没有肿瘤且保持如此，而所有未暴露的动物(三角形)和用Lm-E7免疫的动物生长出大肿瘤(图5B)。因而，使用ActA-E7融合体的接种造成肿瘤消退。
另外，针对它们引起表达E7的肿瘤的消退的能力，对比了Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi。在40只C57BL/6小鼠的左胁腹上建立皮下TC-1肿瘤。在肿瘤已经达到4-5mm后，将小鼠分成5组，每组8只。每组用4种重组LM疫苗之一处理，1个组保持不处理。Lm-LLO-E7和Lm-PEST-E7分别在5/8和3/8的病例中诱导了建立的肿瘤的消退。在任何时间点在用Lm-PEST-E7或Lm-LLO-E7处理的小鼠的平均肿瘤大小之间没有统计差异。但是，表达不含PEST序列的E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi的疫苗在除了一只以外的所有小鼠中没有造成肿瘤消退(图6B，上方插图)。这代表2个实验，其中在用Lm-LLO-E7或Lm-PEST-E7处理的肿瘤与用Lm-E7epi或Lm-ΔPEST-E7处理的肿瘤之间，观察到在第28天时平均肿瘤大小的统计上显著的差异；P<0.001，学生t检验；图6B，下方插图)。另外，在经含有PEST的疫苗接种的小鼠的脾中，在3个实验中可再现地观察到四聚体阳性脾细胞的增加的百分比(图6C)。因而，使用PEST-E7融合体的接种造成肿瘤消退。
实例4：E7与LLO、ActA或PEST样序列的融合增强E7特异性免疫并产生浸润肿瘤的 E7特异性CD8+细胞
材料和实验方法
在12只C57BL/6小鼠(n＝3)的左胁腹皮下植入500mcl(微升)其包含100微升的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2×105个TC-1肿瘤细胞和400微升的(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)。在第7、14和21天腹膜内免疫小鼠，并在第28天收获脾和肿瘤。将肿瘤MATRIGEL从小鼠取出，并在含有2毫升(ml)RP 10培养基的试管中在冰上4℃温育过夜。将肿瘤用镊子切碎，切成2mm块，并与3ml酶混合物(PBS中0.2mg/ml胶原酶P、1mg/ml DNAse-1)一起在37℃温育1小时。将组织悬液穿过尼龙网过滤，并用5％胎牛血清+0.05％的NaN3在PBS中的溶液洗涤，以用于四聚体和IFN-γ染色。
在存在布雷菲德菌素A的情况下以107个细胞/ml将脾细胞和肿瘤细胞与1微摩尔(mcm)E7肽一起温育5小时。将细胞洗涤两次，并在50微升的抗小鼠Fc受体上清液(2.4G2)中4℃温育1小时或过夜。针对表面分子CD8和CD62L将细胞染色，渗透化，使用渗透化试剂盒Golgi-或Golgi-(Pharmingen,San Diego,Calif.)固定，并针对IFN-γ染色。使用双激光流式细胞计FACSCalibur获取500,000个事件，并使用Cellquest软件(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)分析。计算活化的(CD62L低)CD8+T细胞内的IFN-γ分泌细胞的百分比。
对于四聚体染色，让H-2Db四聚体负载藻红蛋白(PE)偶联的E7肽(RAHYNIVTF,SEQID NO:27)，在室温染色1小时，并用抗别藻蓝蛋白(APC)偶联的MEL-14(CD62L)和FITC偶联的CD8+在4℃染色30min。通过对比脾中和肿瘤中的四聚体+CD8+CD62L低细胞来分析细胞。
结果
为了分析Lm-ActA-E7增强抗原特异性免疫的能力，给小鼠植入TC-1肿瘤细胞，并用Lm-LLO-E7(1×107个CFU)、Lm-E7(1×106个CFU)或Lm-ActA-E7(2×108个CFU)免疫，或者不处理(未暴露的)。来自Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7组的小鼠肿瘤含有比在Lm-E7或未暴露的小鼠中更高百分比的分泌IFN-γ的CD8+细胞(图7A)和四聚体特异性CD8+细胞(图7B)。
在另一个实验中，给荷瘤小鼠施用Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7或Lm-E7epi，并测量肿瘤内的E7特异性淋巴细胞的水平。在第7和14天用0.1LD50的4种疫苗处理小鼠。在第21天收获肿瘤，并用针对CD62L、CD8的抗体和用E7/Db四聚体染色。在接种Lm-LLO-E7和Lm-PEST-E7的小鼠中观察到四聚体阳性的淋巴细胞在肿瘤内增加的百分比(图8A)。该结果在三个实验中是可再现的(图8B)。
因而，Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7和Lm-PEST-E7各自有效地诱导浸润肿瘤的CD8+T细胞和肿瘤消退。
材料和实验方法(实例5-10)
细菌菌株、转化和筛选
采用标准方案，将大肠杆菌菌株MB2159用于转化。通过以H2O洗涤，将细菌细胞制备为用于电穿孔。
大肠杆菌菌株MB2159(Strych U等人,FEMS Microbiol Lett.2001年3月15日；196(2):93-8)是不能合成D-丙氨酸消旋酶的alr(-)/dadX(-)缺陷型突变体。类似地，李斯特菌菌株Lm dal(-)/dat(-)(Lmdd)由于dal和dat基因的部分缺失，也不能合成D-丙氨酸消旋酶。
质粒构建
使用已公开的plcA基因序列(Mengaud等人,Infect.Immun.198957,3695-3701)，将PCR用于从染色体DNA扩增基因。然后使用SalI和XbaI产生的DNA末端将扩增产物连接进pAM401中，以产生pDP1462。
如下构建含有单独prfA的质粒pDP1500：在用XbaI和PstI限制酶切后，从pDP1462删除plcA基因，即碱基429-1349(Mengaud等人，出处同上)，用T4DNA聚合酶处理DNA末端以使它们成为平末端，并进行分子内连接。
如下构建含有plcA启动子和plcA的3'端的一部分的质粒pDP1499：在用PstI和NsiI限制酶切并分子内连接后，从pDP1339删除plcA内部片段，即碱基428-882(Mengaud等人,Infect.Immun.198957,3695-3701)。
通过单次连接下述三部分而构建pDP1526(pKSV7::ΔplcA)：用BAMHI和XbaI限制酶切的pKSV7；XbaI和NsiI从pAM401::plcA产生的468bp片段，其含有plcA的5'端(碱基882-1351；Mengaud等人，出处同上)；以及PstI-和BamHI从pAM401::plcA prfA产生的501bp片段，其含有plcA的3'末端(碱基77至429；Mengaud等人，出处同上)。
通过EcoRI和PstI双重消化pDP1462，分离出prfA启动子，即碱基1-429(Mengaud等人，出处同上)，随后将该片段连接进EcoRI和PstI限制酶切的pKSV7中，以产生pDP1498。将两个随机的HindIII产生的10403S染色体DNA片段(长度为大约3kb)连接进HindIII限制酶切的pKSV7中，以产生随机整合对照质粒pDP1519和pDP1521。
单核细胞增多性李斯特菌突变菌株的构建
从SLCC 5764的Tn917-LTV3库分离出作为具有减少的卵磷脂酶(PC-PLC)的突变体的单核细胞增多性李斯特菌菌株DP-L1387，所述库按之前所描述的进行构建(Camilli等人,J.Bacteriol.1990,172,3738-3744)。如之前所描述的(Sun等人,Infect.Immun.199058,3770-3778)，通过对一个转座子-染色体DNA连接处测序来确定Tn917-LTV3插入位点。如之前所描述的(Camilli等人，出处同上)，用质粒DNA转化单核细胞增多性李斯特菌。在每ml培养基有10μg氯霉素存在下，施加用于在单核细胞增多性李斯特菌中维持pAM401、pKSV7和它们的衍生物的选择压力。另外，pKSV7衍生物的维持需要在30℃(革兰氏阳性细菌中质粒复制的许可温度)生长。
pKSV7衍生物向单核细胞增多性李斯特菌染色体中的整合，通过质粒上的单核细胞增多性李斯特菌DNA序列和它们的对应染色体等位基因之间的同源重组而发生。通过在每ml培养基含有10μg氯霉素的脑心浸液(BHI)液体培养基中于40℃(pKSV7复制的非许可温度)生长大约30代，富集整合突变体。随后在每ml培养基含有10μg氯霉素的BHI琼脂上集落纯化每个整合菌株，并在40℃温育。从每个整合菌株分离出的染色体DNA的Southern印迹分析证实了整合的质粒的存在。
如上所述，通过pKSV7衍生物pDP1526的整合，实现DP-L1552的构建，以产生部分二倍体中间体。整合的质粒通过分子内同源重组实现的自发切除以低频率发生。通过在BHI液体培养基中于30℃生长大约50代，富集质粒已从染色体切离的细菌。在该步骤中的选择压力的性质是未知的，但是可能是由于含有整合的温敏质粒的菌株的轻微生长缺陷。大约50％的切除事件，即，由缺失的3'侧的序列之间的同源重组产生的那些事件，导致ΔplcA对染色体上的野生型等位基因的等位基因交换。
通过使所述细菌在BHI中于40℃生长大约30代，消除切离的质粒。通过以下方面鉴定在染色体上保留ΔplcA等位基因的消除了质粒的细菌：在含有5ml BHI琼脂/2.5％蛋黄/2.5％磷酸盐缓冲盐水(PBS)的覆盖层(BHI/蛋黄琼脂)的BHI琼脂平板上培养以后，它们不能在集落周围产生浑浊带。浑浊带源自蛋黄中PI的PI-PLC水解，从而产生不溶性的二酰甘油沉淀物。通过使用PCR扩增缺失的等位基因和跨缺失测序，证实在单核细胞增多性李斯特菌染色体上的正确plcA缺失。
因而，根据本公开，可以使用PI-PLC阴性突变体(plcA缺失突变体)来产生减毒的单核细胞增多性李斯特菌疫苗。使用相同方法制备其他突变体，即actA缺失突变体、plcB缺失突变体和缺乏plcA和plcB二者的双重突变体，它们也都可以根据本公开内容用于产生减毒的单核细胞增多性李斯特菌疫苗。鉴于本公开内容，本领域技术人员将能够制备除了上述那些以外的其他减毒突变体。
Lmdd的构建
首先借助于染色体基因和温敏穿梭质粒pKSV7之间的双等位基因交换(Smith K等人,Biochimie.1992年7-8月；74(7-8):705-11)，将dal基因灭活，该穿梭质粒携带在来自原始850-bp dal基因PCR产物的5'端的450bp片段和来自dal基因PCR产物的3'端的450bp片段之间的红霉素抗性基因。随后，通过与pKSV7的类似交换反应来构建覆盖82％基因的dal缺失突变体，该pKSV7携带来自期望的缺失周围的完整基因(包括所述基因的上游和下游序列)的5'和3'端的同源性区域。使用PCR分析确认该染色体缺失的结构。
通过类似的等位基因交换反应，让染色体dat基因失活。将pKSV7修饰成携带450bp片段，该片段通过PCR衍生自完整dat基因(包括该基因的上游和下游序列)的5'和3'末端。通过适当PCR连接这两个片段。该构建体向染色体中的交换导致dat基因的30％中央碱基的缺失，这通过PCR分析进行证实。
李斯特菌的细菌培养物和体内传代
按照标准方法，培养大肠杆菌。使李斯特菌在含有50μg/ml链霉素的LB培养基(Difco,Detroit,MI)中于37℃、250rpm摇动下生长，并在指数生长期中收获。对于Lm-LLOE7，将37μg/ml氯霉素加入培养基中。对于生长动力学确定，使细菌在10ml LB+抗生素中生长16小时。测量OD600nm，并将培养物密度在菌株之间归一化。将培养物1:50稀释进LB+合适的抗生素和D-丙氨酸(如果适用的话)中。
LM在小鼠中的传代
将1×108个CFU腹膜内(i.p.)注射进C57BL/6小鼠。在第三天，分离脾，并在PBS中匀化。将脾悬液的等分试样铺板在含有抗生素(如果适用的话)的LB平板上。扩增几个集落，并混合以建立注射储备液。
不含抗生素抗性因子的质粒pTV3的构建
p60-dal盒的构建。构建不含抗生素抗性基因的载体的第一步是构建截短的p60启动子与dal基因的融合体。通过PCR扩增从LM菌株10403S分离LM丙氨酸消旋酶(dal)基因(正向引物：5'-CCA TGG TGA CAG GCT GGC ATC-3'；SEQ ID NO:38)(反向引物：5'-GCT AGCCTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG-3'；SEQ ID NO:39)和最小p60启动子序列(正向引物：5'-TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC-3'；SEQ ID No:40)(反向引物：5'-GAC GAT GCCAGC CTG TCA CCA TGG AAA ACT CCT CTC-3'；SEQ ID No:41)。这些引物会引入p60序列上游的PacI位点、dal序列下游的NheI位点(限制位点以粗体显示)和p60启动子下游的重叠dal序列(前18bp)，以用于随后通过剪接重叠延伸(SOE)PCR来融合p60和dal。截短的p60启动子的序列为：CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAGCCTTTGGAGTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGAGTTTTCC(SEQ ID NO:42)(Kohler等人,J Bacteriol 173:4668-74,1991)。采用SOE-PCR，将p60和dal的PCR产物融合并克隆进载体pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)中。
从pGG55除去抗生素抗性基因。从pGG55除去氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因和引入p60-dal盒的后续克隆策略也会间断地导致革兰氏阳性复制区域的移除(oriRep；Brantl等人,Nucleic Acid Res 18:4783-4790,1990)。为了重新引入该革兰氏阳性oriRep，使用在该序列上游添加NarI/EheI位点的5'-引物(GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG,SEQ ID NO:43)和在该序列下游添加NheI位点的3'-引物(GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG,SEQ ID NO:44)从pGG55对oriRep进行PCR扩增。将PCR产物克隆进克隆载体pCR2.1中，并验证序列。
为了将p60-dal序列并入pGG55载体中，通过PacI/NheI双重消化，从pCR-p60dal切离p60-dal表达盒。将pGG55中的革兰氏阳性菌的复制区从pCR-oriRep通过PCR(引物1，5'-GTC GAC GGT CAC CGG CGC CAC TAA CTC AAC GCT AGT AG-3'；SEQ ID No:45；引物2，5'-TTA ATT AAG CTA GCC AGC AAA GAA AAA CAA ACA CG-3'；SEQ ID No:46)进行扩增，以引入EheI和NheI的另外限制位点。将PCR产物连接进pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中，并验证序列。通过EheI/NheI消化切离复制区域，并用EheI和NheI双重消化载体pGG55，从而从质粒同时除去两个CAT基因。将两个插入片段即p60-dal和oriRep与pGG55片段连接在一起，产生pTV3(图9)。pTV3也含有prfA(致病性调节因子A)基因。该基因不是pTV3的功能所必需的，但是可以用于这样的情形：其中需要或期望另外的选择标志物。
用于实时PCR的DNA的制备
使用Total DNA试剂盒(Epicentre,Madison,WI)，制备全李斯特菌DNA。将李斯特菌在25ml Luria-Bertoni液体培养基(LB)中在37℃和250rpm摇动下培养24小时。通过离心让细菌细胞沉淀，重悬于补充了5mg/ml溶菌酶的PBS中，并在37℃温育20分钟，此后分离DNA。
为了获得用于实时PCR的标准靶标DNA，从pGG55(5'-ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTAC-3'(SEQ ID NO:47)；5'-GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTGGTTTCTG AGAACAGATG-3'(SEQ ID NO:48))对LLO-E7基因进行PCR扩增，并克隆进载体pETblue1(Novagen,SanDiego,CA)。类似地，将plcA扩增子克隆进pCR2.1。分别用pET-LLOE7和pCR-plcA转化大肠杆菌，并制备纯化的质粒DNA用于实时PCR。
实时PCR
采用下列引物：5'-GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG-3'(SEQ ID NO:49)、5'-TGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3'(SEQ ID NO:50)、5'-FAM-TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC-TAMRA-3'(SEQ ID NO:51)和单拷贝基因plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG-3'(SEQ ID NO:52)、5'-GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC-3'(SEQID NO:53)、5'-TET-TTAATGTCCATGTTA TGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA-TAMRA-3'(SEQ ID NO:54))作为李斯特菌基因组靶标，采用ABI PrimerExpress软件(Applied Biosystems)，以E7作为质粒靶标，设计Taqman引物-探针组(Applied Biosystems,Foster City,CA)。
按照生产商的推荐，将0.4μM引物和0.05mM探针与PuRE Taq RTG PCR珠(Amersham,Piscataway,NJ)混合。使用纯化的质粒DNA、pET-LLOE7和pCR-plcA(内标)，制备每种靶标的标准曲线，并用于计算未知样品中的基因拷贝数。基于标准曲线计算E7拷贝/plcA拷贝的平均比率，并通过将针对Lmdd-TV3和Lm-LLOE7的结果除以来自Lm-E7(含有整合进基因组中的单个拷贝的E7基因的李斯特菌属菌株)的结果来进行校准。在每个重复三次的qPCR测定中，一式三份地运行所有样品。使用KyPlot软件，通过双因素方差分析(Two-WayANOVA)，分析样品之间的差异。如果p<0.05，则将结果视作统计上显著的。
生长测定
在Luria Bertani(LB)培养基+/-100微克(μg)/ml D-丙氨酸和/或37μg/ml氯霉素中，使细菌在37℃、250rpm摇动下生长。基于OD600nm测量结果，调节起始接种物至所有菌株为相同值。
溶血裂解测定
解冻4×109个CFU的李斯特菌，通过离心(1分钟,14000rpm)进行沉淀，并重悬于100μl含有1M半胱氨酸的PBS(pH5.5)中。将细菌进行1:2系列稀释，并在37℃温育45分钟，以便活化分泌的LLO。将去纤维蛋白的全绵羊血(Cedarlane,Hornby,Ontario,Canada)用5倍体积的PBS洗涤两次，并用6倍体积的PBS-半胱氨酸洗涤三至四次，直到上清液保持澄清，在洗涤步骤之间将细胞以3000x g沉淀8分钟，然后在PBS-半胱氨酸中重悬至10％(v/v)的终浓度。将100μl的10％经洗涤血细胞与100μl李斯特菌悬液混合，并在37℃再温育45分钟。然后通过离心(10分钟,1000x g)，沉淀未裂解的血细胞。将100μl上清液转移进新平板，并测定OD530nm，且相对于样品稀释度绘图。
Lmdd-Tv3的治疗效果
将105个TC-1(ATCC,Manassas,VA)皮下植入C57BL/6小鼠(n＝8)中，并让其生长约7天，此后肿瘤是可触知的。TC-1是经HPV E6和E7永生化并用活化的ras转化的C57BL/6上皮细胞系，其在皮下植入后形成肿瘤。在肿瘤细胞植入后第7和14天，用0.1LD50的适当李斯特菌属菌株免疫小鼠。还包括未免疫的对照组(未暴露的)。用电子卡尺测量肿瘤生长。
ActA缺失突变体的制备
通过毒力因子ActA的不可逆缺失，使菌株Lm dal dat(Lmdd)减毒。构建actA在Lmdaldat(Lmdd)背景下的框内缺失，以避免对下游基因的表达的任何极化效应。Lm daldatΔactA含有在N末端处的前19个氨基酸和C-端的28个氨基酸残基，缺失了ActA的591个氨基酸。使用在actA缺失区域的外部退火的引物，验证该基因在染色体位置中的缺失。这些是引物3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc)(SEQ ID NO:55)和4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg)(SEQ ID NO:56)，如图12中所示。在分离自Lmdd和Lm-ddΔactA的染色体DNA上进行PCR分析。预期在Lm-dd染色体DNA中用两组不同的引物对1、2和3、4扩增以后的DNA片段的大小为3.0Kb和3.4Kb。但是，对于Lm-ddΔactA，使用引物对1、2和3、4的PCR的预期大小为1.2Kb和1.6Kb。因而，在图12中的PCR分析证实了actA的1.8kb区域在菌株Lm-ddΔactA中的缺失。还对PCR产物进行了DNA测序，以证实含有actA的区域在菌株Lm-ddΔactA中的缺失(图13，SEQ ID NO:57)。
(SEQ ID NO:57)。
炎性细胞因子的产生：
以诸如Lm prfA-(pGG55)、Lm dal dat、Lm dal dat actA、Lm dal dat actAΔinlC和Lm dal datΔinlC的不同李斯特菌骨架感染巨噬细胞如RAW264.7，并在不同的时间点收获上清液，以使用不同的基于ELISA的试剂盒定量不同细胞因子的水平。所定量的细胞因子包括IFN-γ、TNF-α和IL-6。
体内细胞因子产生：
为了测量体内细胞因子的产生和嗜中性粒细胞的募集，向C57BL/6小鼠腹膜内注射不同的108个CFU的Lm prfA-(pGG55)、Lm dal dat、Lm dal dat actA、Lm dal dat actAΔinlC和Lm dal datΔinlC、李斯特菌或等体积的盐水。12h后，杀死小鼠，用2mL PBS洗涤腹膜腔。在生长培养基上铺板以后，检查腹膜洗液的细菌载量，并分析促炎细胞因子，如MIP-1α、KC、MCP等。采用流式细胞术，在诸如Gr-1、CD11b和F4/80的标志物染色后确定中性粒细胞和巨噬细胞的数量，并采用CellQuest软件进一步定量这些细胞群体。
Transwell迁移测定：
进行该测定，以确定在用inlC缺失菌株感染骨髓源巨噬细胞或树突细胞以后，是否存在嗜中性粒细胞迁移的增加。从诸如C57BL/6的小鼠分离骨髓源巨噬细胞或树突状细胞，并以inlC缺失突变体或对照李斯特菌感染。使用感染的细胞，采用corning costarTranswell平板，建立transwell测定。最初使用3、5或8微米孔transwell平板将测定标准化。为了试验嗜中性粒细胞迁移，将经感染的APC铺板在平板的底部，并将嗜中性粒细胞铺板在室内孔的顶部。在不同的时间点对细胞计数，以确定已迁移至底部的嗜中性粒细胞的数目。
Lm dal dat actAΔinlC突变体的治疗效果：
为了确定inlC突变体的治疗效果，使用人前列腺特异性抗原(PSA)作为肿瘤抗原，用作概念性验证。以含有人PSA表达盒的质粒pAdv142转化骨架Lm dal dat actA inlC，得到LmddAinlC142。对菌株LmddAinlC142表征融合蛋白tLLO-PSA的表达和分泌。此外，将菌株LmddAinlC142在小鼠体内传代两次，并针对融合蛋白tLLO-PSA的表达和分泌，检查在两次体内传代以后得到的集落。从第二次体内传代后得到的集落制备疫苗工作储备液，并将其用于评估治疗效果和免疫原性。-
对肿瘤微环境的影响：
确定LmddA、LmddAΔactA、LmddAΔPlcA、LmddAΔPlcB、LmddAΔprfA、LmddAinlC142、LmddA142以及其他对照菌株引起免疫细胞在肿瘤微环境中浸润的能力。在该研究中，在第0天向小鼠接种1×106个TPSA23肿瘤细胞，并在第7、14和21天接种108个CFU的LmddAinlC142、LmddA142和其他对照菌株。在第28天收获肿瘤，并进行处理以用于以诸如Gr-1、CD11b、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、NK1.1和CD62L的不同细胞表面标志物进一步染色。采用这些标志物，所检查的细胞群包括巨噬细胞(CD11b+)、NK细胞(NK1.1+)、中性粒细胞(Gr-1+CD11b+)、髓源性抑制细胞(MDSC)(Gr-1+CD11b+)、调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+)以及效应T细胞(CD8+CD3+CD62L低)。此外，表征了效应T细胞产生诸如IFN-γ、TNF-α和IL-2的效应细胞因子的功能性能力。测试了瘤内调节性T细胞和MDSC造成T细胞增殖受到抑制的能力。
结果
实例5：含有氨基酸代谢酶而不是抗生素抗性基因的质粒在体外和在体内都被保 留在大肠杆菌和LM中
使用基于D-丙氨酸消旋酶的营养缺陷型互补系统来介导质粒在LM中的保留，而不使用抗生素抗性基因。大肠杆菌菌株MB2159是不能合成D-丙氨酸消旋酶的alr(-)/dadX(-)缺陷型突变体。类似地，李斯特菌菌株Lm dal(-)/dat(-)(Lmdd)由于dal和dat基因的部分缺失，也不能合成D-丙氨酸消旋酶。通过除去两个CAT基因，并用在李斯特菌p60启动子控制下的p60-dal表达盒替换它们，来修饰基于大肠杆菌-李斯特菌穿梭载体pAM401的质粒pGG55，以产生pTV3(图9)。从几个集落纯化DNA。
实例6：含有代谢酶的质粒不增加细菌的毒力
因为毒力与LLO功能有关，所以对比了Lmdd-TV3和Lm-LLOE7之间的溶血裂解活性。该测定通过红血细胞的裂解来测试LLO功能，且可用培养物上清液、纯化的LLO或细菌细胞进行。Lmdd-TV3展示出比Lm-LLOE7更高的溶血裂解活性。
还通过确定LD50值来测量体内毒力，这是一种更直接的因此更准确的测量毒力的方式。Lmdd-TV3(0.75×109)的LD50非常接近于Lm-LLOE7(1×109)的，表明含有代谢酶的质粒不增加细菌毒力。
实例7：通过含有代谢酶的质粒诱导抗肿瘤免疫
在肿瘤消退模型中确定了含有代谢酶的质粒作为癌症疫苗的效力。使用TC-1细胞系模型，其针对HPV疫苗开发进行了充分表征，且允许受控地对比在Lmdd-TV3或Lm-LLOE7免疫以后建立的类似大小的肿瘤的消退。在两个分开的实验中，Lmdd-TV3和Lm-LLOE7对小鼠的免疫导致类似的肿瘤消退(图14)，在接种疫苗的组之间没有统计上显著的差异(p<0.05)。所有经免疫的小鼠在63天后仍然存活，而未经免疫的小鼠在它们的肿瘤达到20mm直径时必须处死。直至实验结束，治愈的小鼠保持无肿瘤。
因而，含有代谢酶的质粒作为治疗性癌症疫苗是有效的。因为治疗性癌症疫苗需要的免疫应答强于预防性癌症疫苗需要的免疫应答，所以这些结果证实了作为预防性癌症疫苗的同样的实用性。
实例8：inlC缺失突变体产生显著高水平的趋化因子和细胞因子。
inlC缺失突变体产生显著高水平的趋化因子,如MIP-1α、KC(IL-8的小鼠同系物)、MCP，从而导致嗜中性粒细胞和白细胞向感染部位的浸润。因此，当腹膜内施用不同的李斯特菌菌株时，inlC突变体表现出这些细胞因子和趋化因子的产生的增加，它们将嗜中性粒细胞和巨噬细胞吸引到注射后12h得到的腹膜液中。此外，当与对照菌株相比，inlC缺失突变体产生显著高水平的炎性细胞因子。
实例9：inlC缺失突变体诱导嗜中性粒细胞迁移
当与其他对照菌株比较，被inlC缺失突变体感染的巨噬细胞在不同的时间点表现出嗜中性粒细胞迁移的显著增加。该实验的结果有力地支持了该菌株在感染过程中吸引诸如嗜中性粒细胞的免疫细胞的能力。
实例10：inlC缺失突变体实现治疗性抗肿瘤应答
使用LmddA142和LmddAinlC142的抗肿瘤研究的结果彼此非常相当，且观察到肿瘤的治疗性消退。此外，两剂LmddAinlC142与三剂菌株LmddA142相当，因为它能够产生高水平的先天性应答并增加促炎细胞因子分泌。
材料与方法(实例11-16)
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成，DNA测序由Genewiz Inc,SouthPlainfield,NJ进行。流式细胞术试剂购自Becton Dickinson Biosciences(BD,SanDiego,CA)。除非另外指明，否则细胞培养基、补充剂和所有其他试剂均购自Sigma(St.Louise,MO)。由EZbiolabs(Westfield,IN)合成Her2/neu HLA-A2肽。完全RPMI 1640(C-RPMI)培养基包含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素/链霉素、Hepes(25mM)。之前描述了多克隆抗LLO抗体，抗Her2/neu抗体购自Sigma。
小鼠和细胞系
所有动物实验均根据University of Pennsylvania或Rutgers University的IACUC批准的方案进行。FVB/N小鼠购自Jackson laboratories(Bar Harbor,ME)。在University of Pennsylvania的动物中心机构安置和饲养FVB/N Her2/neu转基因小鼠，其过表达大鼠Her2/neu肿瘤蛋白。NT-2肿瘤细胞系表达高水平的大鼠Her2/neu蛋白，源自这些小鼠中的自发性乳腺肿瘤，并按之前的描述生长。DHFR-G8(3T3/neu)细胞得自ATCC并且根据ATCC推荐方案生长。EMT6-Luc细胞系由John Ohlfest博士(University ofMinnesota,MN)慷慨赠送，并在完全C-RPMI培养基中生长。生物荧光工作在University ofPennsylvania(Philadelphia,PA)的Small Animal Imaging Facility(SAIF)的指导下进行。
李斯特菌构建体和抗原表达
Her2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania的Mark Greene博士友好提供，并含有克隆进pGEM7Z质粒(Promega,Madison WI)中的全长人Her2/neu(hHer2)基因。将该质粒用作模板，以使用表1所示的pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和寡聚物，通过PCR扩增hHer-2/neu的三个区段，即EC1、EC2和IC1。
表1：用于克隆人her-2嵌合体的引物
通过SOEing PCR方法，并将每个单独的hHer-2/neu区段作为模板，通过直接融合产生Her-2/neu嵌合构建体。引物在表2中示出。
用于扩增不同区段人Her2区域的引物的序列。
用于扩增不同区段人Her2区域的引物的序列。
使用XhoI和SpeI限制性酶从pAdv138切离ChHer2基因，并将其与LLO的截短的、非溶血性片段同框克隆进Lmdd穿梭载体pAdv134中。插入序列LLO和hly启动子通过DNA测序分析确认。将该质粒电穿孔转化至电感受态actA、dal、dat突变单核细胞增多性李斯特菌菌株，在包含链霉素(250μg/ml)的脑心浸液(BHI)琼脂平板上选择LmddA和阳性克隆。在一些实验中，表达hHer2/neu(Lm-hHer2)片段的类似李斯特菌菌株用于对比目的。这些内容在上文有所描述。在所有研究中，包括不相关李斯特菌构建体(Lm-对照)，以考虑到李斯特菌对免疫系统的抗原非依赖性效应。Lm-对照基于与ADXS31-164相同的李斯特菌平台，但表达不同的抗原，诸如HPV16-E7或NY-ESO-1。测试李斯特菌的融合蛋白的表达和分泌。每个构建体体内传代两次。
细胞毒性分析
以3-5只FVB/N小鼠为一组，使用1×108个集落形成单位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2ICI或Lm-对照(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。使NT-2细胞体外生长，通过胰蛋白酶脱壁，并用丝裂霉素C(250μg/ml，溶于无血清C-RPMI培养基)在37℃下处理45分钟。在洗涤5次后，将其与从免疫或未暴露的动物收集的脾细胞以1:5(刺激因子:应答细胞)的比率在37℃和5％CO2下一起温育5天。标准细胞毒性分析使用铕标记的3T3/neu(DHFR-G8)细胞作为靶标根据前述方法进行。在4小时温育后使用分光光度计(Perkin Elmer，Victor2)在590nm下测定从杀死的靶细胞释放的铕。特异性裂解的百分比定义为(实验组的裂解-自发性裂解)/(最大裂解-自发性裂解)。
得自免疫小鼠的脾细胞的干扰素-γ分泌
以3-5只FVB/N或HLA-A2转基因小鼠为一组，使用1×108个CFU的阴性李斯特菌对照ADXS31-164(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。在最后免疫后一周分离FVB/N小鼠的脾细胞，并以5×106个细胞/孔在24孔板中的C-RPMI培养基中在存在丝裂霉素C处理的NT-2细胞的情况下共培养。在1μM HLA-A2特异性肽或1μg/ml重组His-标记的ChHer2蛋白(大肠杆菌中产生并且通过基于镍的亲和色谱系统纯化)存在下，温育来自HLA-A2转基因小鼠的脾细胞。在24或72小时后从上清液获得样品，使用小鼠IFN-γ酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒根据制造商的推荐方案测试干扰素-γ(IFN-γ)的存在。
Her2转基因动物中的肿瘤研究
用5×108个CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm对照免疫六周龄FVB/N大鼠Her2/neu转基因小鼠(9-14只/组)6次。每周观察自发性乳腺肿瘤的出现两次，使用电子卡尺测量肿瘤，最多52周。当平均直径大小达到1cm2时切下逃逸的肿瘤，在-20℃下保存于RNAlater中°。为了确定Her2/neu蛋白中的突变对这些肿瘤逃逸的影响，使用基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA并且测序。
ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞的作用
将小鼠皮下(s.c.)植入1×106个NT-2细胞。在第7、14和21天，使用1×108个CFU的ADXS31-164、LmddA-对照对它们进行免疫或保持未暴露的。在第28天提取肿瘤和脾脏并通过FACS分析测试CD3+/CD4+/FoxP3+Treg的存在。简而言之，通过在C-RPMI培养基中匀化两个载玻片之间的脾脏而分离脾细胞。使用无菌刀片切碎肿瘤，并用包含DNA酶(12U/ml)和溶于PBS的胶原酶(2mg/ml)的缓冲液消化。在室温下搅拌温育60min后，通过猛烈吹打而分离细胞。用RBC裂解缓冲液裂解红细胞，然后用包含10％FBS的完全RPMI-1640培养基洗涤多次。在通过尼龙网过滤后，将肿瘤细胞和脾细胞重悬于FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中，用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗体染色，然后进行透化和抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)进行流式细胞分析，使用cell quest软件(BD)分析数据。
统计学分析
将对数秩卡方检验用于存活期数据，并将学生t-检验用于CTL和ELISA分析，所述分析一式三份地进行。在这些分析中，小于0.05的p-值(以*标记)被视为具有统计学上的显著性。所有统计学分析均使用Prism软件V.4.0a(2006)或SPSS软件V.15.0(2006)进行。除非另有说明，否则对于所有的FVB/N大鼠Her2/neu转基因研究，我们均使用8-14只小鼠/组，对于所有野生型FVB/N研究，我们均使用至少8只小鼠/组。除了在Her2/neu转基因小鼠模型中的长期肿瘤研究以外，所有研究重复至少一次。
结果
实例11：分泌与Her-2片段融合的LLO片段的单核细胞增多性李斯特菌菌株的制 备：ADXS31-164的构建。
之前描述了嵌合的Her2/neu基因(ChHer2)的构建。简而言之，通过SOEing PCR方法，通过直接融合Her2/neu蛋白的两个胞外片段(氨基酸40-170和氨基酸359-433)和一个胞内片段(氨基酸678-808)，制备ChHer2基因。嵌合蛋白具有蛋白的大部分已知的人MHC I类表位。从质粒pAdv138(其用于构建Lm-LLO-ChHer2)切离ChHer2基因，并克隆进LmddA穿梭质粒，从而产生质粒pAdv164(图15A)。这两个质粒骨架之间有两个主要差异。1)pAdv138使用氯霉素抗性标记(cat)进行重组细菌的体外选择，而pAdv164具有枯草芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，它使用缺乏dal-dat基因的LmddA菌株中的体外选择和体内质粒保持的代谢互补途径。此疫苗平台被设计和开发成解决FDA对工程化李斯特菌疫苗株的抗生素抗性的关注。2)不同于pAdv138，pAdv164在质粒中没有prfA基因拷贝(参见下面的序列和图15A)，因为这对于Lmdd菌株的体内互补而言不是必需的。LmddA疫苗株还缺乏actA基因(负责李斯特菌的胞内移动和细胞间播散)，因此来源于此骨架的重组疫苗株的毒性比来源于其亲代菌株Lmdd的那些小100倍。基于LmddA的疫苗从免疫小鼠脾脏的清除也比基于Lmdd的疫苗快(在不到48小时内)。体外生长8小时之后经TCA沉淀的细胞培养物上清液中，来自该菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(图15B)，因为使用Western印迹分析通过抗LLO抗体检测到～104KD的带。仅表达tLLO的李斯特菌骨架菌株用作阴性对照。
pAdv164序列(7075个碱基对)(参加图15):
(SEQ ID NO:70)
实例12：ADXS31-164的免疫原性与LM-LLO-ChHER2一样。
在标准CTL测定中，将ADXS31-164在产生抗Her2/neu特异性细胞毒性T细胞方面的免疫原性性质与Lm-LLO-ChHer2疫苗的进行比较。两种疫苗引起对由3T3/neu靶细胞表达的Her2/neu抗原强烈的但是相当的细胞毒性T细胞应答。因此，使用仅表达融合至LLO的Her2胞内片段的李斯特菌免疫的小鼠显示出比包含多个MHC I类表位的嵌合体更低的裂解活性。在未暴露的动物或注射不相关李斯特菌疫苗的小鼠中没有检测到CTL活性(图16A)。ADXS31-164也能够刺激得自野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ(图16B)。这在与经丝裂霉素C处理的表达高水平的Her2/neu抗原的NT-2细胞共培养的这些细胞的培养物上清液中检测到(图19C)。
在HLA-A2小鼠中测试了ADXS31-164免疫后人MHC I类表位的适当处理和呈递。将来自经免疫的HLA-A2转基因动物的脾细胞与对应于标绘的HLA-A2限制性表位的肽一起温育72小时，所述HLA-A2限制性表位位于Her2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO:71或KIFGSLAFL SEQ ID NO:72)或胞内(RLLQETELV SEQ ID NO:73)域(图16C)。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽作为阴性对照。来自该实验的数据表明：ADXS31-164能够引起针对位于靶抗原的不同域处的人表位的抗Her2/neu特异性免疫应答。
实例13：ADXS31-164抑制自发性乳腺肿瘤的发病比LM-LLO-ChHER2更有效。
对比了ADXS31-164与Lm-LLO-ChHer2在Her2/neu转基因动物中的抗肿瘤效果，该转基因动物在20-25周龄时产生缓慢生长的、自发性乳腺肿瘤。所有使用不相关李斯特菌对照疫苗免疫的动物在21-25周内患上乳腺肿瘤并且在第33周前处死。相比而言，李斯特菌-Her2/neu重组疫苗导致乳腺肿瘤形成的明显延迟。在第45周，超过50％的ADXS31-164疫苗接种的小鼠(9只中的5只)仍无肿瘤，相比之下，使用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠只有25％。在第52周，8只经ADXS31-164免疫的小鼠中的2只仍保持无肿瘤，而来自其他实验组的所有小鼠均已死于它们的疾病(图17)。这些结果指出：尽管ADXS31-164更加减毒，但是其在Her2/neu转基因动物中预防自发性乳腺肿瘤的发作方面比Lm-LLO-ChHer2更有效。
实例14：ADXS31-164免疫时HER2/NEU基因的突变。
Her2/neu的MHC I类表位中的突变已被认为是造成以小片段疫苗或曲妥珠单抗(赫赛汀，一种靶向Her2/neu的胞外域中的表位的单克隆抗体)免疫后的肿瘤逃逸的原因。为评估该作用，从转基因动物中的逃逸肿瘤提取基因组物质，并对嵌合或对照疫苗免疫的肿瘤中neu基因的对应片段进行测序。在任何接种疫苗的肿瘤样品的Her-2/neu基因中均未观察到突变，这提示替代性逃逸机制(数据未显示)。
实例15：ADXS31-164使肿瘤内调节性T细胞显著减少。
为阐明ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞频率的影响，将NT-2肿瘤细胞植入小鼠。在三次免疫后分离脾细胞和肿瘤内淋巴细胞并对Treg染色，Treg定义为CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+细胞，但是当单独分析时，FoxP3或CD25标记获得了类似的结果。结果指出：与不相关李斯特菌疫苗或未暴露的动物相比，ADXS31-164免疫对脾中Treg的频率没有影响(参见图18)。相反地，以李斯特菌疫苗进行免疫对肿瘤中Treg的存在造成了明显的影响(图19A)。然而在未处理肿瘤中所有CD3+T细胞中平均19.0％是Treg，该频率对于不相关疫苗而言下降至4.2％，并且对于ADXS31-164而言下降至3.4％，肿瘤内Treg的频率下降了5倍(图19B)。任一LmddA疫苗治疗的小鼠中肿瘤内Treg的频率降低不能归因于肿瘤大小的差异。在代表性实验中，ADXS31-164免疫的小鼠的肿瘤显著小于[平均直径(mm)±SD，6.71±0.43，n＝5]未治疗的小鼠(8.69±0.98,n＝5,p<0.01)或不相关疫苗治疗的小鼠(8.41±1.47,n＝5,p＝0.04)的肿瘤，而最后两组的比较未显示出肿瘤大小的统计学上的显著差异(p＝0.73)。LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。然而，只有表达靶抗原HER2/neu的疫苗(ADXS31-164)能够减缓肿瘤生长，表明Treg的减少仅在肿瘤中存在抗原特异性应答的情况下具有作用。
实例16：肽“微基因”表达系统
材料和方法
该表达系统被设计成有利于在羧基端包含不同肽部分的成组的重组蛋白的克隆。这通过将编码SS-Ub-肽构建体之一的序列用作模板而进行的简单PCR反应来实现。通过使用延伸到Ub序列的羧基末端区域中的引物并在该引物的3’端引入所需肽序列的密码子，可以在单个PCR反应中生成新的SS-Ub-肽序列。编码细菌启动子的5’引物和ActA信号序列的前几个核苷酸对于所有构建体而言是相同的。使用该策略生成的构建体在图1中示意性地示出。在该实例中，描述两个构建体。一个构建体包含在小鼠MHC I类上呈递的模型肽抗原，第二个构建体指明治疗性相关肽(诸如源自人胶质母细胞瘤(GBM)TAA的肽)将被取代的位置。对了清楚起见，我们设计了在图1中图示为包含ActA1-100分泌信号的构建体。然而，可以用基于LLO的分泌信号代替而获得等同效果。
所提出的系统的优点之一在于将可能使用单个李斯特菌载体构建体来加载具有多个肽的细胞。使用对上述单肽表达系统的修改，可以将多个肽引入重组减毒李斯特菌(例如，prfA突变体李斯特菌或dal/dat/actA突变体李斯特菌)。编码多个不同肽的嵌合蛋白来自在一个插入片段中编码的顺序SS-Ub-肽序列。在每个SS-Ub-肽编码序列之前引入Shine-Dalgarno核糖体结合位点，以使得能够单独翻译每个肽构建体。图1C说明了被设计为由重组李斯特菌的一个菌株表达4种单独的肽抗原的构建体的示意图。由于这严格上讲是一般表达策略的表示，我们包括了源自已知小鼠或人肿瘤相关抗原或感染性疾病抗原的4种不同的MHC I类结合肽。
虽然本文已示出和描述了本公开的某些特征，但现在本领域的普通技术人员将想到许多修改、置换、变化和等同形式。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落在本发明的真实精神范围内的所有此类修改和变化。
序列表
<110> 阿德瓦希斯公司
<120> 包含肽微基因表达系统的基于李斯特菌的组合物及其使用方法
<130> P-78709-PC
<150> 包含肽微基因表达系统的基于李斯特菌的组合物及其使用方法
<151> 2015-03-03
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> LLO蛋白
<400> 1
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 2
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> LLO蛋白的N末端片段
<400> 2
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 3
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> LLO片段
<400> 3
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> LLO信号肽
<400> 4
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys
20 25
<210> 5
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 编码ActA蛋白的序列
<400> 5
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly Pro Asn Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu
100 105 110
Asn Ala Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile
115 120 125
Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu
130 135 140
Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val
165 170 175
Ala Lys Glu Ser Val Ala Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser
180 185 190
Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln
195 200 205
Gln Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys
210 215 220
Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys
245 250 255
Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu
260 265 270
Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn
275 280 285
Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro
290 295 300
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
305 310 315 320
Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
325 330 335
Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser
340 345 350
Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn
355 360 365
Ala Ile Asn Arg His Ser Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro
370 375 380
Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu
385 390 395 400
Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu
405 410 415
Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly
420 425 430
Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe
435 440 445
Ala Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Ser Pro Lys Val Ser Lys Ile Ser
450 455 460
Asp Arg Ala Leu Ile Ser Asp Ile Thr Lys Lys Thr Pro Phe Lys Asn
465 470 475 480
Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr
485 490 495
Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu
500 505 510
Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr
515 520 525
Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met
530 535 540
Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu
545 550 555 560
Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser
565 570 575
Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly
580 585 590
Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro
595 600 605
Gly Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe
610 615 620
Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
625 630 635
<210> 6
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 编码截短的ActA蛋白的重组核苷酸
<400> 6
atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300
aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360
gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480
aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600
aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840
tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020
atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080
agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 7
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> ActA蛋白
<400> 7
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly
100 105 110
Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu
115 120 125
Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu
130 135 140
Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val
165 170 175
Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser
180 185 190
Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln
195 200 205
Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys
210 215 220
Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys
245 250 255
Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu
260 265 270
Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn
275 280 285
Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro
290 295 300
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
305 310 315 320
Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
325 330 335
Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro
340 345 350
Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser
355 360 365
Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro
370 375 380
Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu
385 390 395 400
Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu
405 410 415
Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly
420 425 430
Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe
435 440 445
Ile Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser
450 455 460
Ala Pro Ala Leu Ile Ser Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn
465 470 475 480
Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr
485 490 495
Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu
500 505 510
Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr
515 520 525
Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met
530 535 540
Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu
545 550 555 560
Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser
565 570 575
Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly
580 585 590
Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro
595 600 605
Gly Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe
610 615 620
Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
625 630 635
<210> 8
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 8
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Arg Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu Asn Ala Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Ala
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe
340 345 350
Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro
385 390
<210> 9
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 9
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly
100
<210> 10
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 10
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Arg Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu Asn Ala Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Ala
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe
340 345 350
Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro
385 390
<210> 11
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 11
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly
100
<210> 12
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 12
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly
85 90
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 13
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val
115 120
<210> 14
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 14
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
85 90 95
Pro Thr Leu Gln Val
100
<210> 15
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 15
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
85 90 95
Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser
115 120 125
Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys
195 200
<210> 16
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 16
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
85 90 95
Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser
115 120 125
Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys
195 200 205
Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro
225 230 235 240
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
245 250 255
Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
260 265 270
Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro
275 280 285
Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser
290 295 300
<210> 17
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 17
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
85 90 95
Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser
115 120 125
Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys
195 200 205
Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro
225 230 235 240
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
245 250 255
Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
260 265 270
Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro
275 280 285
Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe
290 295 300
Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu
305 310 315 320
Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser
325 330 335
Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro
340 345 350
Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr
355 360 365
Ser Glu
370
<210> 18
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 融合至hly信号肽的截短的ActA
<400> 18
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Ser Arg Ala Thr Asp Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln
35 40 45
Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val
50 55 60
Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn
65 70 75 80
Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys
85 90 95
Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala
100 105 110
Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu
115 120 125
Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys
130 135 140
Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu
165 170 175
Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser
180 185 190
Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe
195 200 205
Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg
210 215 220
Asp Lys
225
<210> 19
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 编码融合至hly信号肽的截短的ActA的序列
<400> 19
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag catctagagc gacagatagc gaagattcca gtctaaacac agatgaatgg 120
gaagaagaaa aaacagaaga gcagccaagc gaggtaaata cgggaccaag atacgaaact 180
gcacgtgaag taagttcacg tgatattgag gaactagaaa aatcgaataa agtgaaaaat 240
acgaacaaag cagacctaat agcaatgttg aaagcaaaag cagagaaagg tccgaataac 300
aataataaca acggtgagca aacaggaaat gtggctataa atgaagaggc ttcaggagtc 360
gaccgaccaa ctctgcaagt ggagcgtcgt catccaggtc tgtcatcgga tagcgcagcg 420
gaaattaaaa aaagaagaaa agccatagcg tcgtcggata gtgagcttga aagccttact 480
tatccagata aaccaacaaa agcaaataag agaaaagtgg cgaaagagtc agttgtggat 540
gcttctgaaa gtgacttaga ttctagcatg cagtcagcag acgagtctac accacaacct 600
ttaaaagcaa atcaaaaacc atttttccct aaagtattta aaaaaataaa agatgcgggg 660
aaatgggtac gtgataaa 678
<210> 20
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 编码截短的ActA蛋白的重组核苷酸
<400> 20
atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300
aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360
gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480
aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600
aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840
tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020
atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080
agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 21
ggctcgagca tggagataca cc 22
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 22
ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 23
gggggctagc cctcctttga ttagtatatt c 31
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 24
ctccctcgag atcataattt acttcatc 28
<210> 25
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 25
gactacaagg acgatgaccg acaagtgata acccgggatc taaataaatc cgttt 55
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 26
cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag 27
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 27
gcggatccca tggagataca cctac 25
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 28
gctctagatt atggtttctg ag 22
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 29
ggggtctaga cctcctttga ttagtatatt c 31
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 30
atcttcgcta tctgtcgccg cggcgcgtgc ttcagtttgt tgcgc 45
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 31
gcgcaacaaa ctgaagcagc ggccgcggcg acagatagcg aagat 45
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 32
tgtaggtgta tctccatgct cgagagctag gcgatcaatt tc 42
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 33
ggaattgatc gcctagctct cgagcatgga gatacaccta ca 42
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 34
aaacggattt atttagatcc cgggttatgg tttctgagaa ca 42
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 35
tgttctcaga aaccataacc cgggatctaa ataaatccgt tt 42
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 36
gggggtcgac cagctcttct tggtgaag 28
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 37
ccatggtgac aggctggcat c 21
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 38
gctagcctaa tggatgtatt ttctagg 27
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 39
ttaattaaca aatagttggt atagtcc 27
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 40
gacgatgcca gcctgtcacc atggaaaact cctctc 36
<210> 41
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 截短的p60启动子
<400> 41
caaatagttg gtatagtcct ctttagcctt tggagtatta tctcatcatt tgttttttag 60
gtgaaaactg ggtaaactta gtattatcaa tataaaatta attctcaaat acttaattac 120
gtactgggat tttctgaaaa aagagaggag ttttcc 156
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 序列NarI/EheI位点在上游添加
<400> 42
ggcgccacta actcaacgct agtag 25
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 序列NarI/EheI位点在下游添加
<400> 43
gctagccagc aaagaaaaac aaacacg 27
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 44
gtcgacggtc accggcgcca ctaactcaac gctagtag 38
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 45
ttaattaagc tagccagcaa agaaaaacaa acacg 35
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 46
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattac 29
<210> 47
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 47
gcggccgctt aatgatgatg atgatgatgt ggtttctgag aacagatg 48
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 48
gcaagtgtga ctctacgctt cg 22
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 49
tgcccattaa caggtcttcc a 21
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 50
tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt ac 32
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 51
tgacatcgtt tgtgtttgag ctag 24
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 52
gcagcgctct ctataccagg tac 23
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 53
ttaatgtcca tgttatgtct ccgttatagc tcatcgta 38
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 54
tgggatggcc aagaaattc 19
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 55
ctaccatgtc ttccgttgct tg 22
<210> 56
<211> 1256
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> Lm-dd?actA
<400> 56
gcgccaaatc attggttgat tggtgaggat gtctgtgtgc gtgggtcgcg agatgggcga 60
ataagaagca ttaaagatcc tgacaaatat aatcaagcgg ctcatatgaa agattacgaa 120
tcgcttccac tcacagagga aggcgactgg ggcggagttc attataatag tggtatcccg 180
aataaagcag cctataatac tatcactaaa cttggaaaag aaaaaacaga acagctttat 240
tttcgcgcct taaagtacta tttaacgaaa aaatcccagt ttaccgatgc gaaaaaagcg 300
cttcaacaag cagcgaaaga tttatatggt gaagatgctt ctaaaaaagt tgctgaagct 360
tgggaagcag ttggggttaa ctgattaaca aatgttagag aaaaattaat tctccaagtg 420
atattcttaa aataattcat gaatattttt tcttatatta gctaattaag aagataacta 480
actgctaatc caatttttaa cggaacaaat tagtgaaaat gaaggccgaa ttttccttgt 540
tctaaaaagg ttgtattagc gtatcacgag gagggagtat aagtgggatt aaacagattt 600
atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacgtc 660
gacccatacg acgttaattc ttgcaatgtt agctattggc gtgttctctt taggggcgtt 720
tatcaaaatt attcaattaa gaaaaaataa ttaaaaacac agaacgaaag aaaaagtgag 780
gtgaatgata tgaaattcaa aaaggtggtt ctaggtatgt gcttgatcgc aagtgttcta 840
gtctttccgg taacgataaa agcaaatgcc tgttgtgatg aatacttaca aacacccgca 900
gctccgcatg atattgacag caaattacca cataaactta gttggtccgc ggataacccg 960
acaaatactg acgtaaatac gcactattgg ctttttaaac aagcggaaaa aatactagct 1020
aaagatgtaa atcatatgcg agctaattta atgaatgaac ttaaaaaatt cgataaacaa 1080
atagctcaag gaatatatga tgcggatcat aaaaatccat attatgatac tagtacattt 1140
ttatctcatt tttataatcc tgatagagat aatacttatt tgccgggttt tgctaatgcg 1200
aaaataacag gagcaaagta tttcaatcaa tcggtgactg attaccgaga agggaa 1256
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 57
tgatctcgag acccacctgg acatgctc 28
<210> 58
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 58
ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgc 49
<210> 59
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 59
gcagccagca aactcctgga tattcttcca caaaatcgtg tcctggtag 49
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 60
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcagca gaagatccgg aagtacacga 50
<210> 61
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 61
tcgtgtactt ccggatcttc tgctgccctc gggcgcacag ctggtggcag 50
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 62
gtggcccggg tctagattag tctaagaggc agccatagg 39
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 63
ccgcctcgag gccgcgagca cccaagtg 28
<210> 64
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 64
cgcgactagt ttaatcctct gctgtcacct c 31
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 65
ccgcctcgag tacctttcta cggacgtg 28
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 66
cgcgactagt ttactctggc cggttggcag 30
<210> 67
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 67
ccgcctcgag cagcagaaga tccggaagta c 31
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 68
cgcgactagt ttaagcccct tcggagggtg 30
<210> 69
<211> 7075
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> pAdv164
<400> 69
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagaccca cctggacatg ctccgccacc tctaccaggg ctgccaggtg gtgcagggaa 2460
acctggaact cacctacctg cccaccaatg ccagcctgtc cttcctgcag gatatccagg 2520
aggtgcaggg ctacgtgctc atcgctcaca accaagtgag gcaggtccca ctgcagaggc 2580
tgcggattgt gcgaggcacc cagctctttg aggacaacta tgccctggcc gtgctagaca 2640
atggagaccc gctgaacaat accacccctg tcacaggggc ctccccagga ggcctgcggg 2700
agctgcagct tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc cagcggaacc 2760
cccagctctg ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgca 2820
agaagatctt tgggagcctg gcatttctgc cggagagctt tgatggggac ccagcctcca 2880
acactgcccc gctccagcca gagcagctcc aagtgtttga gactctggaa gagatcacag 2940
gttacctata catctcagca tggccggaca gcctgcctga cctcagcgtc ttccagaacc 3000
tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca atggcgccta ctcgctgacc ctgcaagggc 3060
tgggcatcag ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact gggcagtgga ctggccctca 3120
tccaccataa cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc ctgggaccag ctctttcgga 3180
acccgcacca agctctgctc cacactgcca accggccaga ggacgagtgt gtgggcgagg 3240
gcctggcctg ccaccagctg tgcgcccgag ggcagcagaa gatccggaag tacacgatgc 3300
ggagactgct gcaggaaacg gagctggtgg agccgctgac acctagcgga gcgatgccca 3360
accaggcgca gatgcggatc ctgaaagaga cggagctgag gaaggtgaag gtgcttggat 3420
ctggcgcttt tggcacagtc tacaagggca tctggatccc tgatggggag aatgtgaaaa 3480
ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa acacatcccc caaagccaac aaagaaatct 3540
tagacgaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata tgtctcccgc cttctgggca 3600
tctgcctgac atccacggtg cagctggtga cacagcttat gccctatggc tgcctcttag 3660
actaatctag acccgggcca ctaactcaac gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc 3720
aacagaacca gaaccagaaa cagaacaagt aacattggag ttagaaatgg aagaagaaaa 3780
aagcaatgat ttcgtgtgaa taatgcacga aatcattgct tattttttta aaaagcgata 3840
tactagatat aacgaaacaa cgaactgaat aaagaataca aaaaaagagc cacgaccagt 3900
taaagcctga gaaactttaa ctgcgagcct taattgatta ccaccaatca attaaagaag 3960
tcgagaccca aaatttggta aagtatttaa ttactttatt aatcagatac ttaaatatct 4020
gtaaacccat tatatcgggt ttttgagggg atttcaagtc tttaagaaga taccaggcaa 4080
tcaattaaga aaaacttagt tgattgcctt ttttgttgtg attcaacttt gatcgtagct 4140
tctaactaat taattttcgt aagaaaggag aacagctgaa tgaatatccc ttttgttgta 4200
gaaactgtgc ttcatgacgg cttgttaaag tacaaattta aaaatagtaa aattcgctca 4260
atcactacca agccaggtaa aagtaaaggg gctatttttg cgtatcgctc aaaaaaaagc 4320
atgattggcg gacgtggcgt tgttctgact tccgaagaag cgattcacga aaatcaagat 4380
acatttacgc attggacacc aaacgtttat cgttatggta cgtatgcaga cgaaaaccgt 4440
tcatacacta aaggacattc tgaaaacaat ttaagacaaa tcaatacctt ctttattgat 4500
tttgatattc acacggaaaa agaaactatt tcagcaagcg atattttaac aacagctatt 4560
gatttaggtt ttatgcctac gttaattatc aaatctgata aaggttatca agcatatttt 4620
gttttagaaa cgccagtcta tgtgacttca aaatcagaat ttaaatctgt caaagcagcc 4680
aaaataatct cgcaaaatat ccgagaatat tttggaaagt ctttgccagt tgatctaacg 4740
tgcaatcatt ttgggattgc tcgtatacca agaacggaca atgtagaatt ttttgatccc 4800
aattaccgtt attctttcaa agaatggcaa gattggtctt tcaaacaaac agataataag 4860
ggctttactc gttcaagtct aacggtttta agcggtacag aaggcaaaaa acaagtagat 4920
gaaccctggt ttaatctctt attgcacgaa acgaaatttt caggagaaaa gggtttagta 4980
gggcgcaata gcgttatgtt taccctctct ttagcctact ttagttcagg ctattcaatc 5040
gaaacgtgcg aatataatat gtttgagttt aataatcgat tagatcaacc cttagaagaa 5100
aaagaagtaa tcaaaattgt tagaagtgcc tattcagaaa actatcaagg ggctaatagg 5160
gaatacatta ccattctttg caaagcttgg gtatcaagtg atttaaccag taaagattta 5220
tttgtccgtc aagggtggtt taaattcaag aaaaaaagaa gcgaacgtca acgtgttcat 5280
ttgtcagaat ggaaagaaga tttaatggct tatattagcg aaaaaagcga tgtatacaag 5340
ccttatttag cgacgaccaa aaaagagatt agagaagtgc taggcattcc tgaacggaca 5400
ttagataaat tgctgaaggt actgaaggcg aatcaggaaa ttttctttaa gattaaacca 5460
ggaagaaatg gtggcattca acttgctagt gttaaatcat tgttgctatc gatcattaaa 5520
ttaaaaaaag aagaacgaga aagctatata aaggcgctga cagcttcgtt taatttagaa 5580
cgtacattta ttcaagaaac tctaaacaaa ttggcagaac gccccaaaac ggacccacaa 5640
ctcgatttgt ttagctacga tacaggctga aaataaaacc cgcactatgc cattacattt 5700
atatctatga tacgtgtttg tttttctttg ctggctagct taattgctta tatttacctg 5760
caataaagga tttcttactt ccattatact cccattttcc aaaaacatac ggggaacacg 5820
ggaacttatt gtacaggcca cctcatagtt aatggtttcg agccttcctg caatctcatc 5880
catggaaata tattcatccc cctgccggcc tattaatgtg acttttgtgc ccggcggata 5940
ttcctgatcc agctccacca taaattggtc catgcaaatt cggccggcaa ttttcaggcg 6000
ttttcccttc acaaggatgt cggtcccttt caattttcgg agccagccgt ccgcatagcc 6060
tacaggcacc gtcccgatcc atgtgtcttt ttccgctgtg tactcggctc cgtagctgac 6120
gctctcgcct tttctgatca gtttgacatg tgacagtgtc gaatgcaggg taaatgccgg 6180
acgcagctga aacggtatct cgtccgacat gtcagcagac gggcgaaggc catacatgcc 6240
gatgccgaat ctgactgcat taaaaaagcc ttttttcagc cggagtccag cggcgctgtt 6300
cgcgcagtgg accattagat tctttaacgg cagcggagca atcagctctt taaagcgctc 6360
aaactgcatt aagaaatagc ctctttcttt ttcatccgct gtcgcaaaat gggtaaatac 6420
ccctttgcac tttaaacgag ggttgcggtc aagaattgcc atcacgttct gaacttcttc 6480
ctctgttttt acaccaagtc tgttcatccc cgtatcgacc ttcagatgaa aatgaagaga 6540
accttttttc gtgtggcggg ctgcctcctg aagccattca acagaataac ctgttaaggt 6600
cacgtcatac tcagcagcga ttgccacata ctccggggga accgcgccaa gcaccaatat 6660
aggcgccttc aatccctttt tgcgcagtga aatcgcttca tccaaaatgg ccacggccaa 6720
gcatgaagca cctgcgtcaa gagcagcctt tgctgtttct gcatcaccat gcccgtaggc 6780
gtttgctttc acaactgcca tcaagtggac atgttcaccg atatgttttt tcatattgct 6840
gacattttcc tttatcgcgg acaagtcaat ttccgcccac gtatctctgt aaaaaggttt 6900
tgtgctcatg gaaaactcct ctcttttttc agaaaatccc agtacgtaat taagtatttg 6960
agaattaatt ttatattgat taatactaag tttacccagt tttcacctaa aaaacaaatg 7020
atgagataat agctccaaag gctaaagagg actataccaa ctatttgtta attaa 7075
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> HLA-A2限制性表位
<400> 70
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu
1 5
<210> 71
<211> 2015
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 存在于李斯特菌菌株基因组上的inlC区域上游和下游的DNA序列
<400> 71
atggcgcggg atggtatact atacaagcgt atggttcaaa aagatacttt gaattaagaa 60
gtacaataaa gttaacttca ttagacaaaa agaaaaaaca aggaagaata gtacatagtt 120
ataaatactt ggagagtgag gtgtaatatg ggggcagctg atttttgggg tttcatatat 180
gtagtttcaa gattagccat tgttgcggca gtagtttact tcttatactt attgagaaaa 240
attgcaaata aatagaaaaa aagccttgtc aaacgaggct ttttttatgc aaaaaatacg 300
acgaatgaag ccatgtgaga caatttggaa tagcagacaa caaggaaggt agaacatgtt 360
ttgaaaaatt tactgatttt cgattattat taacgcttgt taatttaaac atctcttatt 420
tttgctaaca tataagtata caaagggaca taaaaaggtt aacagcgttt gttaaatagg 480
aagtatatga aaatcctctt ttgtgtttct aaatttattt ttaaggagtg gagaatgttg 540
aaaaaaaata attggttaca aaatgcagta atagcaatgc tagtgttaat tgtaggtctg 600
tgcattaata tgggttctgg aacaaaagta caagctgaga gtattcaacg accaacgcct 660
attaaccaag tttttccaga tcccggccta gcgaatgcag tgaaacaaaa tttagggaag 720
caaagtgtta cagaccttgt atcacaaaag gaactatctg gagtacaaaa tttcaatgga 780
gataatagca acattcaatc tcttgcggga atgcaatttt tcactaattt aaaagaactt 840
catctatccc ataatcaaat aagtgacctt agtcctttaa aggatctaac taagttagaa 900
gagctatctg tgaatagaaa cagactgaaa aatttaaacg gaattccaag tgcttgttta 960
tctcgcttgt ttttagataa caacgaactc agagatactg actcgcttat tcatttgaaa 1020
aatctagaaa tcttatctat tcgtaataat aagttaaaaa gtattgtgat gcttggtttt 1080
ttatcaaaac tagaggtatt agatttgcat ggtaatgaaa taacaaatac aggtggacta 1140
actagattga agaaagttaa ctggatagat ttaactggtc agaaatgtgt gaatgaacca 1200
gtaaaatacc aaccagaatt gtatataaca aatactgtca aagacccaga tggaagatgg 1260
atatctccat attacatcag taatggtggg agttatgtag atggttgtgt cctgtgggaa 1320
ttgccagttt atacagatga agtaagctat aagtttagcg aatatataaa cgttggggag 1380
actgaggcta tatttgatgg aacagttaca caacctatca agaattagga cttgtgcaca 1440
cctgtatact ttgagctctc gtataatcac gagagctttt taaatatgta agtcttaatt 1500
atctcttgac aaaaagaacg tttattcgta taaggttacc aagagatgaa gaaactattt 1560
tatttacaat tcaccttgac accaaaaact ccatatgata tagtaaataa ggttattaaa 1620
caagaaagaa gaagcaaccc gcttctcgcc tcgttaacac gaacgttttc aggcaaaaaa 1680
ttcaaacttt cgtcgcgtag cttacgcgat tttgaatgtg cgggattgct gaaaagcagc 1740
ccgttttttt atggcctccg aacgaatgag ttagcaggcc gcagatttga acagctattt 1800
tctatcttgt tgtaacaaaa ttaagtggag gtggctcacc attagcaaag acatgttggt 1860
aaacgatggg attcgtgcac gtgaagtaag attgatcgac caagacggtg aacaattagg 1920
cgtgaagagt aaaatcgatg cgcttcaaat tgctgaaaag gctaatcttg atctagtgct 1980
tgttgctcca acagcgaaac cgccagtagc tcgta 2015
<210> 72
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 在温敏质粒pKSV7中克隆以形成inlC缺失突变体的DNA
<400> 72
gaattcatgg cgcgggatgg tatactatac aagcgtatgg ttcaaaaaga tactttgaat 60
taagaagtac aataaagtta acttcattag acaaaaagaa aaaacaagga agaatagtac 120
atagttataa atacttggag agtgaggtgt aatatggggg cagctgattt ttggggtttc 180
atatatgtag tttcaagatt agccattgtt gcggcagtag tttacttctt atacttattg 240
agaaaaattg caaataaata gaaaaaaagc cttgtcaaac gaggcttttt ttatgcaaaa 300
aatacgacga atgaagccat gtgagacaat ttggaatagc agacaacaag gaaggtagaa 360
catgttttga aaaatttact gattttcgat tattattaac gcttgttaat ttaaacatct 420
cttatttttg ctaacatata agtatacaaa gggacataaa aaggttaaca gcgtttgtta 480
aataggaagt atatgaaaat cctcttttgt gtttctaaat ttatttttaa ggagtggaga 540
ggatccggac ttgtgcacac ctgtatactt tgagctctcg tataatcacg agagcttttt 600
aaatatgtaa gtcttaatta tctcttgaca aaaagaacgt ttattcgtat aaggttacca 660
agagatgaag aaactatttt atttacaatt caccttgaca ccaaaaactc catatgatat 720
agtaaataag gttattaaac aagaaagaag aagcaacccg cttctcgcct cgttaacacg 780
aacgttttca ggcaaaaaat tcaaactttc gtcgcgtagc ttacgcgatt ttgaatgtgc 840
gggattgctg aaaagcagcc cgttttttta tggcctccga acgaatgagt tagcaggccg 900
cagatttgaa cagctatttt ctatcttgtt gtaacaaaat taagtggagg tggctcacca 960
ttagcaaaga catgttggta aacgatggga ttcgtgcacg tgaagtaaga ttgatcgacc 1020
aagacggtga acaattaggc gtgaagagta aaatcgatgc gcttcaaatt gctgaaaagg 1080
ctaatcttga tctagtgctt gttgctccaa cagcgaaacc gccagtagct cgtactgcag 1140

Claims (118)

1.一种包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌菌株，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列，
b.泛素(Ub)蛋白，
c.肽，
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置。
2.根据权利要求1所述的重组李斯特菌，其中所述李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述肽包含一个或多个新表位。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组李斯特菌，其中每个开放阅读框包含不同的肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述微基因构建体还包含驱动所述核酸构建体的表达的5’细菌启动子。
7.根据权利要求6所述的重组李斯特菌，其中所述启动子为actA启动子、hly启动子或p60启动子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述细菌分泌信号序列编码包含ActA蛋白信号序列的前100个氨基酸的ActA100信号序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述细菌分泌信号序列为包含SEQ ID NO:4的得自李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的分泌信号序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在D-丙氨酸消旋酶(dal)和D-氨基酸转移酶(dat)基因中包含基因组突变或缺失。
11.根据权利要求10所述的重组李斯特菌，其中李斯特菌还包含含有编码代谢酶的第一开放阅读框的核酸分子，并且其中所述代谢酶补充所述dal/dat基因组突变或缺失。
12.根据权利要求11所述的重组李斯特菌，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
13.根据权利要求11所述的重组李斯特菌，其中所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述微基因构建体整合进所述李斯特菌基因组或在所述李斯特菌的染色体外质粒中。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在actA基因中包含基因组突变或缺失。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在inlB基因中包含基因组突变或缺失。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在prfA基因中包含基因组突变或缺失。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组减毒李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
20.一种药物组合物，包含根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌和药学上可接受的载体。
21.一种引起具有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤或抗癌应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列，
b.泛素(Ub)蛋白，
c.肽，
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述肽包含一个或多个新表位。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中每个开放阅读框包含不同的肽。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述微基因构建体还包含驱动所述核酸构建体的表达的5’细菌启动子。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述启动子为actA启动子、hly启动子或p60启动子。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列编码包含ActA蛋白信号序列的前100个氨基酸的ActA100信号序列。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列为得自李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的分泌信号序列。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在D-丙氨酸消旋酶(dal)和D-氨基酸转移酶(dat)基因中包含基因组突变。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述李斯特菌还包含含有编码代谢酶的第一开放阅读框的核酸分子，并且其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌菌株的染色体中突变或缺失的内源性基因。
32.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
33.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
35.根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中所述微基因构建体整合进所述李斯特菌基因组或在所述李斯特菌的染色体外质粒中。
36.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在actA基因中包含基因组突变或缺失。
37.根据权利要求21至36中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在inlB基因中包含基因组突变或缺失。
38.根据权利要求21至37中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在prfA基因中包含基因组突变或缺失。
39.根据权利要求21至38中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
40.根据权利要求21至39中任一项所述的方法，还包括施用独立的佐剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
42.根据权利要求21至41中任一项所述的方法，其中所述癌症包括淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、胰腺导管腺癌、骨肉瘤、胃癌、非小细胞肺癌或骨癌。
43.根据权利要求21至42中任一项所述的方法，其中所述癌症为难治性癌症。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述淋巴瘤为多发性骨髓瘤。
46.一种治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列，
b.泛素(Ub)蛋白，
c.肽，
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述肽包含一个或多个新表位。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的方法，其中每个开放阅读框包含不同的肽。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述微基因表达核酸构建体还包含驱动所述核酸构建体的表达的5’细菌启动子。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述启动子为actA启动子、hly启动子或p60启动子。
53.根据权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列编码包含ActA蛋白信号序列的前100个氨基酸的ActA100信号序列。
54.根据权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列为得自李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的分泌信号序列。
55.根据权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在D-丙氨酸消旋酶(dal)和D-氨基酸转移酶(dat)基因中包含基因组突变。
56.根据权利要求46至55中任一项所述的方法，其中李斯特菌还包含含有编码代谢酶的第一开放阅读框的核酸分子，并且其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌菌株的染色体中突变或缺失的内源性基因。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
60.根据权利要求46至59中任一项所述的方法，其中所述微基因表达核酸构建体整合进所述李斯特菌基因组或在所述李斯特菌的染色体外质粒中。
61.根据权利要求46至60中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在actA基因中包含基因组突变。
62.根据权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在inlB基因中包含基因组突变。
63.根据权利要求46至62中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在prfA基因中包含基因组突变。
64.根据权利要求46至63中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
65.根据权利要求46至64中任一项所述的方法，还包括施用独立的佐剂。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
67.根据权利要求46至66中任一项所述的方法，其中所述癌症包括淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、胰腺导管腺癌、骨肉瘤、胃癌、非小细胞肺癌或骨癌。
68.根据权利要求46至67中任一项所述的方法，其中所述癌症为难治性癌症。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述淋巴瘤为多发性骨髓瘤。
71.根据权利要求21至70中任一项所述的方法，其中所述施用包括至少两次施用所述重组减毒李斯特菌。
72.根据权利要求21至71中任一项所述的方法，还包括在所述受试者中在所述癌症复发或转移后施用所述重组减毒李斯特菌的步骤。
73.根据权利要求21至72中任一项所述的方法，还包括施用强化注射。
74.根据权利要求21至73中任一项所述的方法，其中所述免疫应答为CD8+T细胞免疫应答。
75.根据权利要求46至74中任一项所述的方法，其中所述治疗延迟转移性疾病。
76.根据权利要求46至75中任一项所述的方法，其中所述治疗减小淋巴结大小。
77.根据权利要求46至76中任一项所述的方法，其中所述治疗导致无进展存活。
78.根据权利要求46至76中任一项所述的方法，其中所述治疗导致疾病进展时间延长。
79.一种阻遏或延迟受试者中的肿瘤或癌症形成的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌或根据权利要求20所述的药物组合物的步骤。
80.一种打破对自身抗原的耐受性的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌或根据权利要求20所述的药物组合物的步骤。
81.一种诱导受试者中的癌症消退的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌或根据权利要求20所述的药物组合物的步骤。
82.一种延长受试者存活的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌或根据权利要求20所述的药物组合物的步骤。
83.重组李斯特菌引起具有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤或抗癌应答的用途，所述用途包括向具有所述肿瘤或癌症的所述受试者施用所述李斯特菌的步骤，其中所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
a.细菌分泌信号序列，
b.泛素(Ub)蛋白，
c.肽，
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置。
84.根据权利要求83所述的用途，其中所述李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。
85.根据权利要求83所述的用途，其中所述李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的用途，其中所述肽包含一个或多个新表位。
87.根据权利要求83至86中任一项所述的用途，其中每个开放阅读框包含不同的肽。
88.根据权利要求83至87中任一项所述的用途，其中所述微基因构建体还包含驱动所述核酸构建体的表达的5’细菌启动子。
89.根据权利要求88所述的用途，其中所述启动子为actA启动子、hly启动子或p60启动子。
90.根据权利要求83至89中任一项所述的用途，其中所述细菌分泌信号序列编码包含ActA蛋白信号序列的前100个氨基酸的ActA100信号序列。
91.根据权利要求83至90中任一项所述的用途，其中所述细菌分泌信号序列为得自李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的分泌信号序列。
92.根据权利要求83至91中任一项所述的用途，其中所述重组李斯特菌在D-丙氨酸消旋酶(dal)和D-氨基酸转移酶(dat)基因中包含基因组突变。
93.根据权利要求88所述的用途，其中李斯特菌还包含含有编码代谢酶的第一开放阅读框的核酸分子，并且其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌菌株的染色体中缺失或突变的内源性基因。
94.根据权利要求93所述的用途，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
95.根据权利要求93所述的用途，其中所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。
96.根据权利要求93至95中任一项所述的用途，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
97.根据权利要求83至96中任一项所述的用途，其中所述微基因构建体整合进所述李斯特菌基因组或在所述李斯特菌的染色体外质粒中。
98.根据权利要求83至97中任一项所述的用途，其中所述重组李斯特菌在actA基因中包含基因组突变。
99.根据权利要求83至98中任一项所述的用途，其中所述重组李斯特菌在inlB基因中包含基因组突变。
100.根据权利要求83至99中任一项所述的用途，其中所述重组李斯特菌在prfA基因中包含基因组突变。
101.根据权利要求83至100中任一项所述的用途，其中所述重组减毒李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
102.根据权利要求83至101中任一项所述的用途，还包括施用独立的佐剂。
103.根据权利要求102所述的用途，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
104.根据权利要求83至103中任一项所述的用途，其中所述免疫应答为CD8+T细胞免疫应答。
105.根据权利要求83至104中任一项所述的用途，用于治疗受试者中的肿瘤或癌症。
106.根据权利要求83至105中任一项所述的用途，其中所述癌症包括淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、胰腺导管腺癌、骨肉瘤、胃癌、非小细胞肺癌或骨癌。
107.根据权利要求83至106中任一项所述的用途，其中所述癌症为难治性癌症。
108.根据权利要求106所述的用途，其中所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
109.根据权利要求105至108中任一项所述的用途，还包括在所述受试者中在所述癌症复发或转移后施用所述重组减毒李斯特菌的步骤。
110.根据权利要求104至109中任一项所述的用途，还包括施用强化注射。
111.根据权利要求104至110中任一项所述的用途，其中所述治疗延迟转移性疾病。
112.根据权利要求104至111中任一项所述的用途，其中所述治疗减小淋巴结大小。
113.根据权利要求104至112中任一项所述的用途，其中所述治疗导致无进展存活。
114.根据权利要求104至113中任一项所述的用途，其中所述治疗导致疾病进展时间延长。
115.根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌或根据权利要求20所述的药物组合物用于阻遏或延迟受试者中的肿瘤或癌症的形成的用途，所述用途包括向所述受试者施用所述重组李斯特菌或所述药物组合物的步骤。
116.根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌或根据权利要求20所述的药物组合物用于打破对自身抗原的耐受性的用途，所述用途包括向所述受试者施用所述重组李斯特菌或所述药物组合物的步骤。
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