KR20110095528A

KR20110095528A - 살모넬라 균주를 포함하는 종양 특이적 치료영상제

Info

Publication number: KR20110095528A
Application number: KR1020100015048A
Authority: KR
Inventors: 민정준; 최현일; 홍영진
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-02-19
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2011-08-25

Abstract

본원은 종양에서 특이적으로 발현되는 프로모터, 이에 연결된 세포독성 유전자를 포함하는 플라스미드, 이를 포함하는 변형된 살모넬라 균주를 포함하는 종양 치료영상제 및 이를 이용한 암치료 방법에 관한 것이다. 본원의 치료영상제는 종양을 특이적 인식하고, 이에 포함된 치료제의 암 특이적 또는 유도성 발현을 통해 암의 효과적 치료는 물론 영상촬영을 통한 암의 진단/모니터링을 동시에 가능하게 한다.

Description

살모넬라 균주를 포함하는 종양 특이적 치료영상제 {Tumour specific imageable therapeutic probes comprising Salmonella strain}

본 발명은 종양 치료 및 치료제 전달 분야에 관한 것이다.

기존 암의 치료는 암 세포가 갖는 특성, 즉 빠른 세포분열 및 암조직 주변의 혈관신생의 억제에 집중되어 왔다. 세포의 분열을 저해하기 위한 약물 및 방사선 치료, 혈관신생 억제용 약물 등이 개발되었으나, 속도의 차이는 있으나 이들 치료법은 비정상적인 세포는 물론 정상적으로 분열이 수반되는 조직의 파괴와 같은 많은 부작용도 또한 가져왔다. 이러한 부작용을 극복하기 위해 종양 세포만을 표적으로 하는 나노전달 시스템 및 이에 항암제를 결합시킨 시스템 등이 등장하고 있으나 기존의 치료법을 대체할 만한 것은 아직 개발되지 않고 있다. 나아가, 치료제와 영상제를 겸하여, 치료제를 종양 세포에 특이적으로 전달함과 동시에 종양세포를 가시화하여 진단/모니터링까지 할 수 있는 종양 치료제의 개발이 요구된다.

본원은 치료제의 종양 특이적 전달, 영상화 및 치료가 가능한 시스템을 개발하고자 한다.

한 양태에서, 본원은 유도성 또는 종양특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 세포독성 유전자 및/또는 발광 유전자를 포함하는, ppGpp가 결손된 살모넬라 균주를 포함하는 종양 치료영상제를 제공한다.

다른 양태에서 상기 세포독성 유전자 및 상기 발광 유전자는 플라스미드 또는 상기 살모넬라 균주의 유전체에 삽입되어 있는 것인 종양 치료영상제를 제공한다.

다른 양태에서 상기 발광 유전자는 루시퍼라제 유전자인 종양 치료영상제를 제공한다.

다른 양태에서 상기 세포독성 유전자는 ClyA 유전자인 종양 치료영상제를 제공한다.

다른 양태에서 상기 종양 특이적 프로모터는 ansB, pflE, 또는 pepT인 종양 치료영상제를 제공한다.

다른 양태에서 유도성 프로모터는 pBAD, 또는 pTET인 종양 치료영상제를 제공한다.

다른 양태에서 상기 발광유전자는 루시퍼라제 유전자이며, 상기 세포독성 유전자는 ClyA 유전자이며, 상기 종양 특이적 프로모터는 ansB, pflE, 또는 pepT이며, 상기 유도성 프로모터는 pBAD, 또는 pTET인 종양 치료영상제를 제공한다.

또다른 양태에서 상기 유도성 또는 종양특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 세포독성 유전자 및 발광 유전자를 포함하는, ppGpp가 결손된 살모넬라 균주를 제공한다.

다른 양태에서 상기 발광유전자는 루시퍼라제 유전자이며, 상기 세포독성 유전자는 ClyA 유전자이며, 상기 종양 특이적 프로모터는 ansB, pflE, 또는 pepT이며, 상기 유도성 프로모터는 pBAD, 또는 pTET인 것인 살모넬라 균주를 제공한다.

또다른 양태에서 본원은 ansB, pflE 또는 pepT로부터 선택되는 종양 특이적 프로모터, 또는 pBAD 또는 pTET로부터 선택되는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 ClyA 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.

다른 양태에서 상기 플라스미드는 도 1A, 또는 도 8 A 내지 8 C에 기재된 것인 플라스미드를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 ansB, pflE 또는 pepT로부터 선택되는 종양 특이적 프로모터, 또는 pBAD 또는 pTET로부터 선택되는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 루시퍼라제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.

다른 양태에서 상기 플라스미드는, 9 A 내지 9 C에 기재된 것인 플라스미드를 제공한다.

또다른 양태에서 본원은 적어도 하나의 상기 플라스미드를 포함하는 ppGpp가 결손된 살모넬라 균주를 제공한다.

또다른 양태에서 본원은 상기 치료영상제 또는 살모넬라 균주의 투여를 포함하는 암 치료 및 영상화 방법을 제공한다.

본원의 치료영상제는 종양을 특이적으로 인식하고, 이에 포함된 치료제의 암 특이적 또는 유도성 발현을 통해 암의 효과적 치료는 물론 영상촬영을 통한 암의 모니터링/진단을 동시에 가능하게 한다.

도 1A는 유도성 프로모터와 이에 의해 조절되는 세포독성 유전자 ClyA를 포함하는 플라스미드의 모식도이다.
도 1B는 도 1A의 플라스미드로 형질전환된 살모넬라 균주에서 ClyA 유전자의 아라비노스 농도 의존적 발현을 보여주는 웨스턴블랏의 결과이다.
도 1C는 도 1B에서 발현된 ClyA 단백질이 분비되는 것을 보여주는 웨스턴블랏의 결과이다.
도 1D는 도 1A의 플라스미드로 형질전환된 균주의 성장이 이를 포함하지 않는 대조군 균주와 차이가 없음을 보여주는 성장분석 결과이다.
도 2A는 유도성 프로모터와 이에 의해 조절되는 파이어플라이 루시퍼라제 유전자를 포함하는 플라스미드의 모식도이다.
도 2B는 도 2A의 플라스미드로 형질전환된 살모넬라 균주에서 루시퍼라제 유전자의 아라비노스 농도 의존적 발현을 보여주는 웨스턴블랏의 결과이다.
도 2C는 도 2A의 플라스미드로 형질전환된 살모넬라 균주에서 루시퍼라제 유전자의 아라비노스 농도 의존적 활성을 보여주는 결과이다.
도 2D는 도 2A의 플라스미드로 형질전환된 살모넬라 균주를 마우스에 처리한후 촬영한 생체발광(in vivo bioluminescence) 결과로, 살모넬라 균주의 종양 특이적 유도 및 아라비노스 의존적 발현을 보여준다.
도 3A는 종양 마우스에 ClyA 유전자를 포함하는 도 1A의 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주 및 도면에 표시된 대조군으로 처리한 후 시간경과에 따른 종양의 크기변화를 보여주는 결과이다.
도 3B는 도 3A와 동일하나 마우스를 희생시키지 않고 생체발광으로 관찰한 시간경과에 따른 종양의 크기변화를 보여주는 결과이다.
도 3C는 도 3A의 종양의 크기를 측정한 그래프이다.
도 3D는 도 3A와 같이 처리된 마우스의 생존 곡선을 보여준다.
도 3E는 3A 마우스의 종양 조직에서의 ClyA의 발현을 보여주는 웨스턴블랏 결과이다.
도 4A는 도 3A와 같이 처리한 후 4일 및 6일째 종양 조직의 H&E 염색결과이다.
도 4B는 도 4A와 동일한 조직을 면역형광법으로 관찰한 결과이다.
도 5A는 폐전이 마우스모델 (왼쪽)에 ClyA 유전자를 포함하는 도 1A의 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주를 처리한 후 (오른쪽) 생체발광으로 촬영한 결과이다.
도 5B는 폐전이 마우스모델 (왼쪽)에 ClyA 유전자를 포함하는 도 1A의 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주 및 도면에 표시에 대조군으로 처리한 후 적출한 폐의 사진이다.
도 5C는 5B의 폐의 무게를 측정한 결과이다.
도 5D는 5B의 폐 전이 스코어를 측정한 결과이다.
도 6A 및 B는 ClyA 유전자를 포함하는 도 1A의 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주를 정상 마우스(A) 및 종양 마우스(B)에 처리한 후 성장 정도를 비교한 독성테스트 결과이다.
도 7은 폐전이 종양 마우스 모델 살모넬라 균주로 처리된 마우스를 희생한 한 후 폐 및 각 장기(L(폐), Li(간), S(이자), H(심장))를 육안 및 생체발광으로 관찰한 결과이다.
도 8은 종양특이적 프로모터와 이에 연결된 ClyA 유전자를 포함하는 플라스미드의 모식도이다.
도 9는 종양특이적 프로모터와 이에 연결된 루시퍼라제 유전자를 포함하는 플라스미드의 모식도이다.
도 10은 종양 특이적 프로모터의 산소 및 저산소상태에서의 루시퍼라제의 차별적 발현을 보여주는 루시퍼라제 분석결과이다.
도 11은 종양 특이적 프로모터의 산소 및 저산소상태에서의 ClyA의 차별적 발현을 보여주는 웨스턴블랏의 결과이다.
도 12는 저산소상태에서 발현되는 종양 특이적 프로모터의 기관 특이적 발현을 루시퍼라제의 활성으로 측정한 결과이다
도 13은 저산소상태에서 발현되는 종양 특이적 프로모터의 종양 특이적 발현을 보여주는 생체발광 측정 결과이다.
도 14는 종양 마우스에 도 8의 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주 또는 대조군으로 처리한 후 시간 경과에 따라 종양 조직을 생체발광으로 촬영한 결과이다.
도 15는 도 14의 종양 조직의 크기를 측정한 그래프이다.

한 양태에서, 본원은 유도성 또는 종양특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 세포독성 유전자 및 발광 유전자를 포함하는, ppGpp가 결손된 살모넬라 균주를 포함하는 종양 치료영상제에 관한 것이다.

본원의 치료영상제란, 암 치료약제에 영상기능을 부여하여 암의 치료와 영상촬영을 통한 암의 모니터링을 동시에 할 수 있는 시각화가 가능한 치료용 탐사물질(imageable therapeutic probe)을 의미한다. 또한 치료(therapy)와 진단(diagnosis)이 한번에 가능하여 치료진단제(theragnosis)를 의미하는 것이기도 하다.

본원에서 사용된 용어 “프로모터”는 당업계에 널리 알려진 용어로서 일반적으로 이의 3‘ 쪽에 연결된 유전자(코딩서열)의 발현(전사)을 조절/제어하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 프로모터를 이루는 뉴클레오타이드 서열은 원핵 또는 진핵세포의 특성에 따라 이에 특이적인 오퍼레이터, 인핸서, 전사개시서열, 및/또는 번역개시서열을 포함한다. 본원에서 사용된 용어“작동가능하게 연결된”은 하나의 뉴클레오타이드 단편이 다른 뉴클레오타이드 단편에 영향을 미치도록 두 개 이상의 뉴클레오타이드 단편이 하나로 연결된 것을 의미한다. 예를 들면 프로모터는 코딩서열에 작동가능하게 연결되면 코딩서열의 발현(전사)를 조절하게 된다.

본원의 유도성 프로모터는 특정 화학적 또는 물리적 조건하에서만 이에 연결된 유전자를 전사하는 프로모터이다. 예를 들면 특정 물질의 존재 또는 부재와 같은 화학적 조건 또는 온도, 빛과 같은 물리적 조건하에서만 이에 연결된 유전자를 전사하는 프로모터이다. 프로모터의 구체적 서열은 같은 종류의 것이라도 사용되는 숙주세포, 플라스미드 또는 원하는 발현 정도에 따라 뉴클레오타이드가 치환, 결실 및/또는 추가된 다양한 것일 수 있으며, 당업자라면 원하는 목적에 따라 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

본원의 한 구현예에서는 IPTG(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)와 같은 갈락토스의 존재하에서 발현되는 LacZ 유전자의 프로모터, L-아라비노스의 존재 하에서만 발현되는 아라비노스 오페론 araBAD 프로모터, 테트라사이클린에 의해 발현이 조절되는 Tet on/off 프로모터를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원의 한 구현예에서 유도성 프로모터는 Tet on/off 이며, 이는 당업자라면 이러한 프로모터를 포함하는 예를 들면 Clontech사의 벡터시스템 (Tet-on and Tet-off gene expression system)과 같은 시중의 시스템에서 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 상기 벡터 시스템에서 Tet 프로모터를 적절한 효소로 잘라내거나, 적절한 효소부위를 포함하도록 프라이머를 디지인하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 후에 본원 도 1A 또는 도 2A에 기재된 플라스미드의 BAD 프로모터 자리에 넣을 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본원의 다른 구현예에서, 상기 프로모터는 araBAD 프로모터이며, 당업자라며 적절한 araBAD 프로모터를 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원에 사용될 수 있는 araBAD 프로모터는 실시예에 기재된 것 및 도 1A에 기재된 플라스미드에 포함된 것 및 이의 기능적 변이체를 포함한다. 기능적 변이체란 서열이 치환, 결실 및 또는 추가 등에 의해 변화되었으나, 변화되기 전의 것과 본질적으로 동일한 기능을 수행하는 것을 의미한다.

본원의 종양 특이적 프로모터는 저산소(hypoxia) 상태에서만 발현되는 프로모터이다. 종양은 하나의 조직에 이질적인 미세 환경을 포함하며, 빠른 세포분열로 인해 세포의 산소의 공급이 부족하여 저산소 상태에 처하게 된다. 종양부위의 산소농도는 10 mmHg인 반면 정상조직의 산소농도는 50-60 mmHg 이다 (Wei M. Q., et al., Facultative or obligate anaerobic bacteria have the potential for multi modality therapy of solid tumours.Eur J Cancer.,2007.43(3):p.490-496). 저산소상태에서 유전자의 발현을 유도하는 다양한 프로모터가 본 발명에 포함되며, 당업자라면 사용하는 숙주에 따라 적절한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 한 구현예에서 이러한 저산소상태에서 발현되는 프로모터는 pepT (tripeptidase 코딩), pflE (pyruvate-formate-lyase activating enzyme 코딩), 및 ansB (asparaginase 코딩) 유전자의 프로모터를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 유전자 및 프로모터의 서열에 관하여는 Mengesha A., et al., Development of a Flexible and Potent Hypoxia-Inducible Promoter for Tumor-Targeted Gene Expressionin Attenuated Salmonella. Cancer Biol Ther.,2006.5(9):p.1120-1128 및 Arrach N., et al., Salmonella Promoters Preferentially Activated Inside Tumors.Cancer Res.,2008.68(12):p.4827-4832에 기재된 바와 같다. 다른 구현예에서, pepT, pflE, 및 ansB 프로모터는 실시예 1의 표에 기재된 프로모터를 이용하여 살모넬라 균주에서 증폭된 서열을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 이의 다양한 기능적 변이체도 포함한다.

본원의 발광 유전자는 생체내(in vivo) 또는 생체외(ex vivo, in vitro) 영상 촬영을 가능할 수 있는 단백질을 코딩하는 것으로, 다양한 유래의 생물발광 유전자, 화학발광 유전자, 형광유전자를 포함하는 것이다. 한 구현예에서 상기 발광 유전자는 원핵 또는 진핵세포 유래의 루시퍼라제 유전자이다. 다른 구현예에서, 상기 발광유전자는 박테리아 유래의 루시퍼라제 유전자이다. 다른 구현예에서 상기 발광 유전자는 파이어플라이 (Photinus pyralis)유래의 루시퍼라제 유전자이다. 이러한 유전자는 당업계에 공지되어 있으며 (Gould SJ, Subramani S, 1988. Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology. Anal. Biochem. 175 (1): 5-13; Baldwin TO, et al., 1984. Cloning of the luciferase structural genes from Vibrio harveyi and the expression of bioluminescence in Escherichia coli. Biochemistry 23: 3663-3667; Baldwin TO, et al., 1989. The complete nucleotide-sequence of the lux regulon of Vibrio fischeri and the luxABN region of Photobacterium leiognathi and the mechanism of control of bacterial bioluminescence. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 4: 326-341; 및 Baldwin TO, Ziegler MM. 1992. The biochemistry and molecular biology of bacterial bioluminescence. In: Muller F , ed. Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes III. Boca Raton, Florida: CRC Press. pp 467-530) 있거나 또는 본원 실시예에 기재된 프라이머 및 조건을 사용하여 증폭, 클로닝하여 사용될 수 있다. 상기 유전자에 의해 발현되는 발광현상의 촬영장비는 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 이를 적절하게 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 본원의 실시예에 기재된 것과 같은 장비가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 세포독성 유전자는 예를 들면 병원성 박테리아에서 생산되는 것으로 숙주세포에 감염 시 세포를 죽이는 독소를 생산하며, 진핵세포를 죽일 수 있는 박테리아 유래의 다양한 독소가 본원에 사용될 수 있다. 예를 들면 세포독성 독소 (cytolytic toxin)는 표적 세포의 막에 작용하며, 기전에 따라 효소형, 계면활성제형, 및 막공 형성형으로 나눌 수 있는데, 모두 본원에 사용될 수 있다. 예를 들면 이로 제한하는 것이 아니나, 헤모라이신(HlyA) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)를 포함한다. 한 구현예에서 ClyA이다. ClyA는 34-kDa의 세포막에 구멍을 형성하여 세포를 용혈시키는 단백질로 대장균, 살모넬라 등에서 발현된다. ClyA의 서열은 Wai SN, Lindmark B, Soderblom T, et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell 2003;115:25-35에 기재되어 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 다양한 원핵세포 유래의 것 및 이들의 기능적 변이체가 본원에 사용될 수 있다. 한 구현예에서 본원의 ClyA은 실시예 1에서와 같이 증폭된 서열 및 이의 기능적 변이체를 포함한다. 한 구현예에서 ClyA의 단백질 accession 번호는 ABI83833.1, 유전자 서열은 DQ910780.1이다.

본원에서 상기 세포독성 유전자 및/또는 발광유전자는 상기 언급한 발현 조절성 프로모터에 연결되며, 예를 들면 세포독성 유전자는 종양특이적 프로모터에, 발광유전자는 유도성 프로모터에 연결될 수 있으나, 반드시 이러한 조합으로 제한하는 것은 아니다. 이러한 프로모터 및 유전자는 이어 원핵세포에서 작용할 수 있거나 또는 원핵 및 진핵세포에서 모두 작용할 수 있는 셔틀벡터 등 다양한 플라스미드에 클로닝 될 수 있다. 이러한 플라스미드는 당업계에 공지되어 있으며 시중에서 구입할 수 있다. 예를 들면 pGEM-T와 같은 것을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

이러한 단백질을 암세포에 적용하기 위해서는 암세포에서만 발현되거나 또는 발현을 조절할 수 있는 프로모터 하에서 조절되는 것이 중요하다. 따라서 본원에서는 상기 세포독성 유전자 및 발광유전자를 유도성 또는 저산소 상태에서만 발현하는 프로모터에 연결한 결과, 실시예 및 도면에 기재된 바와 같이 종양 특이적 발현 유도할 수 있었다. 나아가, 발광유전자의 암세포 특이적 발현을 통한 암조직의 영상촬영도 가능하다.

본원의 세포독성 및 발광 유전자는 각 각 별개의 플라스미드에 클로닝되어 본원의 살모넬라 균주에 형질전환되어 사용될 수 있거나, 또는 세포독성 유전자는 플라스미드에 그리고 발광유전자는 살모넬라 균주의 유전체에 삽입된 상태로 존재할 수 있거나, 또는 세포독성 유전자 및 발광 유전자 모두가 살모넬라 균주의 유전체에 삽입되어 사용될 수 있다. 상기 살모넬라 균주는 하기 기술한 바와 같이 ppGpp가 결손된 살모넬라 균주이다. 한 구현예에서, 세포독성 유전자는 플라스미드에 발광유전자는 살모넬라 균주의 유전체에 삽입되어 있다. 박테리아의 형질전환방법 및 유전체에 유전자를 삽입하는 방법은 당업계에 공지되어 있거나, 하기 제공한 참고문헌을 참조할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 상기 개시된 프로모터에 작동가능하게 연결된 세포독성유전자 또는 발광유전자를 포함하는 플라스미드 및 이러한 플라스미드를 포함하는 ppGpp가 결손된 살모넬라 균주를 제공한다. 한 구현예에서, ansB, pflE 또는 pepT로부터 선택되는 종양 특이적 프로모터, 또는 pBAD 또는 pTET로부터 선택되는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 ClyA 유전자를 포함하는 플라스미드이다. 다른 구현예에서, 상기 플라스미드는 도 1A, 또는 도 8 A 내지 8 C에 기재된 것인 플라스미드이다. 또다른 구현예에서, ansB, pflE 또는 pepT로부터 선택되는 종양 특이적 프로모터, 또는 pBAD 또는 pTET로부터 선택되는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 루시퍼라제 유전자를 포함하는 플라스미드이다. 다른 구현예에서, 상기 플라스미드는, 9 A 내지 9 C에 기재된 것인 플라스미드이다. 상기 ClyA를 포함하는 플라스미드 및/또는 발광유전자를 포함하는 ppGpp가 결손된 살모넬라 균주를 또한 제공한다. 한 구현예에서 살모넬라 균주는 상기 ClyA를 포함하는 플라스미드 및 상기 발광유전자를 발현하는 플라스미드를 모두 포함한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 유전자를 포함하는 변형된 살모넬라 균주를 제공한다. 변형된 살모넬라 균주는 ppGpp (guanosine 3',5'-bispyrophosphate) 합성을 할 수 없도록 유전자가 변형된 ppGpp가 결손된 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 균주이다. 또한 상기 균주는 이미징이 가능하도록 발광유전자, 이로 제한하는 것은 아니나, 박테리아 루시퍼라제 유전자(lux) 또는 파이어플라이 유래의 발광 유전자를 포함할 수 있다. 상기 유전자는 플라스미드의 형태로 또는 살모넬라의 유전체에 삽입되어 존재할 수 있다. 이러한 균주는 한국 공개특허 2006-0103971에 기재된 것 (SHJ2037 수탁번호 KCTC 10787BP) 또는 Song M, Kim HJ, Kim EY, et al. ppGpp-dependent stationary phase induction of genes on Salmonella pathogenicity island 1.J Biol Chem 2004; 279:34183-90에 기재된 S.typhimurium, SHJ2037(relA::cat, spoT::kan)을 포함한다. ppGpp는 세포내 신호전달 물질로서 살모넬라의 독성을 나타내도록 하는 유전자(살모넬라 Pathogen Island(SPI-1))의 발현을 유도한다. ppGpp는 relA 및 spoT 유전자에 의해 코딩되며 상기 살모넬라는 이러한 유전자가 결실된 것이다.(Song M., et al., ppGpp-dependent stationary phase induction of genes on Salmonella pathogenicity.J Biol Chem.,2004.279(33):p.34183-90; Na H. S., et al., Immune response induced by Salmonella typhimurium defective in ppGpp synthesis. Vaccine, 2006.24(12):p.2027-2034). 이러한 살모넬라는 독성이 야생형 살모넬라보다 백만 배 이상 약화되어있다 (ibid). Balb/c 마우스에 실험시 ppGpp가 결손된 살모넬라의 치사량 (LD50)은 약 9 x 10⁷CFU이다.

본원의 변형된 살모넬라 균주는 종양의 치료 및 영상 진단제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본원의 유도성 또는 종양 특이적 프로모터하에서 세포독성 유전자 및 발광 유전자를 발현하는 ppGpp가 결손된 살모넬라 균주는 종양을 특이적 인식하여, 종양세포에만 치료제의 전달을 가능하게 하고, 또한 종양에 전달된 세포독성 유전자의 종양 특이적 발현 또는 일정한 시기에 유도성 발현을 통하여 암 조직이외의 정상 장기의 피해를 최소화한다. 나아가 실시예 및 도면에 기재된 바와 같이 종양의 시각화(도 2, 3, 5, 7, 12 및 13 참조)가 가능하여, 암 세포들을 직접 눈으로 보면서 치료하여 모니터링이 가능하여 정확도 및 치료 효과를 높일 수 있다. 본원의 치료영상제와 사용될 수 있는 영상장비는 사용하는 발광유전자의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 선택한 발광유전자에 따라 적절한 것을 선택할 수 있을 것이며, 본원 실시예에서와 같은 조합이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원의 치료영상제가 적용될 수 있는 종양은 특정 종양으로 제한되지 않으며, 살모넬라 균주가 인식할 수 있는 다양한 종양이 본원에 포함된다. 한 구현예에서 상기 종양은 고형암이다. 다른 구현예에서, 상기 종양은 원발암 또는 다른 장기로 전이된 암이다. 살모넬라 균주는 그람음성의 균주로 산소가 있거나 없는 상태에서 모두 자랄 수 있기 때문에 저산소 유도성 프로모터의 사용을 가능하게 한다.

나아가 본원은 본원의 치료영상제 또는 살모넬라 균주의 투여를 포함하는 동물에서의 암 치료 및 영상화 방법을 제공한다. 본 방법은 암의 치료와 시각화가 동시에 가능하다. 예를 들면 본원의 실시예에 기재된 것과 같은 in vivo 촬영 장치를 사용하면 암의 치료와 동시에 암의 조직을 볼 수 있다. 동물은 다양한 포유류를 모두 포함하는 것이다. 인간에 사용되는 제품으로 개발되기 전까지 규제의 정도가 덜한 인간을 제외한 동물들, 예를 들면 가축, 동물원에서 사용되는 가축, 및 고양이, 개와 같은 각종 애완동물의 암치료에 우선 사용될 수 있다. 본원에서는 개에 본 치료영상제를 투여하여 우수한 암 치료 효과를 수득하였다 (결과는 나타내지 않음).

본원에 따른 치료영상제는 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 본원의 치료영상제는 약학조성물의 형태로 제조될 수 있으며, 본원의 특성을 갖는 살모넬라 균주에 더하여 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, USA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 치료영상제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 정맥내 주사 및 복강 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하다. 전형적으로 투약단위체는 예를 들어 약 10⁴ 내지 10⁹CFU를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 10⁴ 내지 10¹⁰CFU일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 동물의 경우 1회, Kg 당 1 내지 5x10⁷ CFU를 처리할 수 있다. 본 발명의 치료영상제는 독성테스트 결과 안정성이 입증되었으며, 결과는 실시예에 기재된 바와 같다.

본원은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술, 및 면역학 분야의 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다. 또한 Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley &Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt &Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley &Sons 1998)을 참조할 수 있다. 세포배양 및 배지에 관한 일반적 기술에 관하여는 Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251)을 참조할 수 있다. 또한 하기의 실험방법은 기본적으로 Nguyen VH, Kim HS, Ha JM, Hong Y, Choy HE and Min JJ, Genetically Engineered Salmonella typhimurium as an imageable Therapeutic Probe for Cancer, Cancer Research, 2010; 70(1): 18-23)에 기재된 방법을 참조하여 수행되었다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 유도성 및 종양특이적 프로모터 하에서 발현되는 세포독성 ClyA 단백질을 코딩하는 플라스미드 구축 및 형질전환체 제조

(1) 유도성 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 ClyA 유전자를 포함하는 플라스미드 제작

루시퍼라제를 발현하는 pBAD-RLuc8은 종전에 기술된 바와 같다 (Loening AM et al., Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and lightout put.Protein Eng Des Sel 2006;19:391-400). 상기 플라스미드는 아라비노스에 의해 유도되는 araBAD 프로모터를 포함하며, 아라비노스의 존재시에 이에 연결된 유전자를 발현한다. ClyA를 코딩하는 유전자는 5’-AGT CCA TGG TTA TGA CCG GAA TAT TTG C-3’(forward primer) and 5’-GAT GTT TAA ACT CAG ACG TCA GGA ACC TC-3’ (reverse primer)를 프라이머로 하여 S. typhi 유전체를 주형으로 하여 Piao HH, Seong J, Song MK, et al. The bacterial surface expression of SARS viral epitope using Salmonella typhi Cyotolysin A.J Bacteriol Virol 2009;39:103-12에 기재된 되로 증폭하여 사용하였다. NcoI 및 PmeI으로 효소를 사용하여 pBAD-RLuc8 처리하여 RLuc8을 잘라낸 후 여기에 상기 증폭된 DNA (NcoI 및 PmeI으로 처리)를 클로닝하여 pBAD-ClyA(pBC)를 제작하였다. 결과는 도 1A에 있다.

(2)종양 특이적 프로모터 및 이에 작동가능하게 연결된 루시퍼라제 또는 ClyA 유전자를 포함하는 플라스미드 제작

Promoter	Primer Sequence (F- forward , R- reverse ) PCR 산물크기
pepT pepT pflE pflE ansB ansB	F 5’GACTTAGCTTAGCGCTCAGAAAGCGTGTCA 115bp R 5’TGAGGGTGACTCC ATG GATAAACTACTTG F 5’GGATCCAGACGCAAAGCCAGCTTACCCA 223bp R 5’TGAAGACC ATG GACGGCCTCTCTTATTTCATATA F 5’GGATCCTGAAGTAATCTTTCCTTTTTAAAC 250bp R 5’AAAACTCC ATG GTATATCTCCAGTTATGTCA

본 실시예에서 종양 특이적 프로모터로는 저산소상태에서 발현되는 pepT, ansB 및 pflE 유전자의 프로모터를 사용하였다. 프로모터는 S.티피뮤리움의 유전체를 추출하여 이를 주형으로 하여, 하기의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭하였다 (95℃ 10분 후, 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 -30회, 72℃ 10분 1회, AmpliTaq Gold).

다음으로 pGEMT.easy vector(Promega, USA)의 Lac promoter 부분에 NcoI 효소부위를 (F :5' CAGGAAACAGCCATGGCCATGATTACGCC,

R: 5' GGCGTAATCATGGCCATGGCTGTTTCCTG를 프라이머 세트로하여 PCR로 증폭한 후 삽입하여 pGEMT.Nco.Mutant vector를 제작하였다. 한편 pBAD-Rluc8 vector(Loening AM, Fenn TD, Wu AM, Gambhir SS, Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output Protein Engineering , Design and Selection 19:391-400, 2006)와 pGEMT.Nco.Mutant vector를 ScaI과 NcoI 효소로 잘라내어 전자에서 Rluc8 부분과 후자에서 pLac 부분을 라이게이션하여 pLac-Rluc8 vector를 제작하였다. 리포터 유전자로서 파이어플라이 루시퍼라제 (Fluc)를 코딩하는 유전자를 (Fluc-NcoI-F 5'GCG CCA CCA TGG AAG ACG,

Fluc-PmeI-R 5' GATGTTTAAACGAATTACACGGCGATC )를 프라이머 세트로하여 파이어플라이 유전체를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. 이를 pLac-Rluc8 의 (NcoI) 및 (PmeI) 효소부위에 클로닝하여 pLac-Fluc를 제작하였다.

이어 상기 pLac-Fluc는 NcoI 및 Pme I, pPepT-Fluc의 경우는 AfeI과 NcoI, pPflE-Fluc 및 pAnsB-Fluc은 BamHI과 NcoI 효소로 처리하여 Lac 프로모터를 잘라내고, 여기에 상기 증폭한 프로모터를 클로닝하여 pPepT-Fluc, pPflE-Fluc 및 pAnsB-Fluc를 제작하였다(도 8 참조). 이어, 상기 pPepT-Fluc, pPflE-Fluc 및 pAnsB-Fluc를 NcoI 및 PmeI으로 절단하여 Fluc를 잘라낸 후 여기에 상기 (1)에서 증폭한 ClyA 유전자를 클로닝하여 pPepT-ClyA, pPflE-ClyA 및 pAnsB-ClyA를 제작하였다 (도 9 참조). 대조군으로서 프로모터가 없거나(O::Fluc, O::ClyA), Lac프로모터를 갖는(Lac::Fluc, Lac::ClyA) 플라스미드로 제작하였다.

(3) 형질 전환체의 제조 및 프로모터 특이적 발현양상의 확인

이어 상기 루시퍼라제를 발현하는 플라스미드는 ppGpp가 결손된 S.typhi에, ClyA를 발현하는 플라스미드는 박테리아 루시퍼라제를 발현하고 ppGpp가 결손된 S.typh/lux에 전기천공법(BioRad)을 사용하여 제조자의 지시대로 형질전환하였다. 형질전환에 사용된 균주로 전자(lux를 발현하지 않는 균주)는 Na et al., Immune response induced by Salmonella typhimurium defective in ppGpp synthesis, Vaccine 2006; 24:2027-34에 기재된 것을 사용하였으며, 후자 S.typhimurium, SHJ2037(relA::cat, spoT::kan)은 Song M, Kim HJ, Kim EY, et al. ppGpp-dependent stationary phase induction of genes on Salmonella pathogenicity island 1.J Biol Chem 2004; 279:34183-90에 기술된 것을 사용하였다. 전기천공법을 요약하면 80㎕의 형질전환능(competent)을 갖는 S.typhi와 10ng의 각 플라스미드를 전기천공 큐벳에서 혼합한 후, 2초간 1.8kV의 전기를 가한 후 LB 배지 (Baxter, USA)에서 배양한 후, 앰피실린(S.typhi) 또는 앰피실린과 카나마이신(S.typhi/lux)를 넣은 LB-agar 플레이트 또는 에 도말한 후 형질전환된 클론을 선별한 후 사용 전까지 25%의 글리세롤을 넣어 -80℃에 보관하였다.

아리비노스 유도성 프로모터를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 경우, 박테리아의 농도가 OD₆₀₀ 0.5-0.7이 되었을 때 L-아라비노스를 도 1 b에 기재된 양으로 첨가하였다. 3시간 후에, 약 4x10⁷CFU의 박테리아를 원심분리한 후 웨스턴블랏을 위한 단백질 로딩 버퍼 (Protein 2X Sample Buffer, Elpis Biotech) 20와 혼합한 후 100에서 5분간 끓인 후 얼음에 2분간 두어 단백질을 변성하였다. 이어 상기 단백질 약 180μg을 12% SDS-Polyacrylamide gel에 분리한 후, 나이트로셀룰로스 막(Bio-Rad, USA)에 제조자의 지시대로 전달하였다. 이어 상기 막을 5% 탈지유를 포함하는 TBS에서 블로킹 한 후 여기에 C 1:250으로 희석된 토끼 항-ClyA 항체(Santa Cruz, USA)와 1시간 반응시킨 후, Tween-20을 포함하는 TBS(TBS-T)로 3회 세척 후에 2차 항체로 1;2000 희석된 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG(Dako, Denmark)를 첨가한 후 실온에서 1시간 반응시키고, TBS-T로 3회 세척 후 여기에 루미놀시약 (Santa Cruz, USA)를 제조자의 지시대로 첨가하여 발색시킨 후, LAS3000 장비 (Fujifilm, Japan)를 이용하여 판독하였다. 결과는 도 1b에 있다. 도 1b에 나타난 바와 같이 34 KDa의 ClyA 단백질은 아라비노스의 부재하에서는 전혀 발현되지 않으며, 아라비노스를 첨가한 경우, 이의 농도에 의존적으로 발현됨을 알 수 있다. 이는 발현되는 ClyA 단백질의 양을 아라비노스 양에 따라 조절할 수 있다는 것을 나타낸다. pBAD-RLuc8도 상기와 동일하게 실험하였으며, 첨가하는 아라비노스의 양에 의존적으로 루시퍼라제가 발현(도 2A 내지 C)되며, 실시예 2와 같이 종양이 유도된 마우스에 처리시 종양 부위에서만 특이적으로 발현되는 것을 알 수 있다 (도 2D). 형질전환된 박테리아의 펠렛과 배지 모두에서 웨스턴블랏으로 ClyA가 검출되었으며 (도 1C), 이러한 유도성 플라스미드 (pBAD-RLuc8 및 pBAD-ClyA)는 이를 포함하는 박테리아의 생장에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다 (도 1d). 이를 위해 형질전환된 박테리아를 2시간 배양 후, 여기에 0.2% L-아라비노스를 첨가하고 도 1d에 기재된 시간에 박테리아의 OD₆₀₀을 측정하였다. 측정 결과 상기 플라스미드를 포함하는 박테리아의 성장과 이를 포함하지 않은 박테리아의 성장에 차이가 없었다.

저산소상태에서 발현되는 종양 특이적 프로모터의 특이성을 다음과 같이 확인하였다. 상기 플라스미드로 형질전환된 상기 박테리아의 경우, 정상(Normoxic) 조건의 경우에는 50ml의 코니칼튜브 (Nalgene,USA)에서 배양 (200rpm, 37℃)하고, 저산소 상태의 경우는 10ml의 유리관을 끝까지 채운 상태에서 이를 파라필름(3M, USA)으로 밀봉한 상태에서 배양하였다. 배양 후 클로닝된 유전자에 따라 루시퍼라제 분석 및 웨스턴블랏을 수행하였다. 우선 루시퍼라제 분석을 위해, 상기 각 조건에서 배양된 박테리아의 농도를 OD₆₀₀=0.05로 맞춘 후, 원심분리하고, 이를 20㎕의 PBS로 재현탁하고 96웰 플레이트에서 1mg/ml 농도의 D-루시페린과 반응시킨 후, 루미노미터(MicroLumat Plus LB 96V, Berthold)에서 판독하였다 (560nm, 10sec exposure time). 결과는 도 10에 있다. 도 10에서 보는 바와 같이, 정상 상태 (0hr)에서는 상태에서는 루시퍼라제가 발현되지 않으며, 저산소상태(hypoxia)가 유도된 경우에는 PflE, AnsB 및 PepT 프로모터가 활성을 나타냈으며, 음성대조군인 Lac 프로모터는 차이가 없었다.

나아가 저산소 및 정상 상태에서 배양한 박테리아 8x10⁵ CFU (OD₆₀₀=0.05)개의 박테리아를 원심분리한 후 여기에 20㎕의 단백질 로딩버퍼(Protein 2x, Elpis Biotech)를 넣어준 후, 상기와 같은 방식으로 웨스턴블랏을 수행하였다. 결과는 도 11에 있다. 도 10의 결과와 일치하게, 저산소상태가 유도된 경우에만 ClyA 단백질이 발현되었으며, 음성대조군인 Lac 프로모터는 차이가 없이 상시 발현되었다.

이러한 결과는 저산소 상태에서만 발현되는 상기 프로모터의 특이적 발현을 확인하는 것이다.

실시예 2: ClyA 및 루시퍼라제를 발현하는 살모넬라 균주를 이용한 종양의 시각화 및 종양 치료효과

(1) 동물모델

동물실험을 위한 마우스 (4내지 6주령의 수컷 BALB/c 및 BALB/c athymic nu^-/nu^-mice, 체중 2030g)는 오리엔트바이오사 (대한민국)에서 구입하였다. 마우스 12시간을 명암주기로 하고 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 우선 상기 마우스에 CT-26 (ATCC CRL-2638) 또는 Hep3B2.1-7 (ATCC HB-8064) 세포를 피하주사 (각 세포 종류당 5마리)하여 종양을 만들었다. 상기 세포는 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양하였다 (37℃, 5% CO₂). 종양의 크기는 칼리퍼를 사용하여 종양세포 주입 후 매 4일마다 측정하였다. 종양의 부피가 130 mm³로 자랐을 때 상기 마우스를 실시예 1에서 제조된 종양특이적 및 유도성 프로모터 하에 조절되는 ClyA 단백질을 발현하는 플라스미드를 포함하는 형질전환체 (실시예 1)로 다음에서 기술하는 바와 같이 처리하였다.

(2) 유도성 프로모터하에 조절되는 ClyA 및 루시퍼라제를 발현하는 살모넬라에 의한 종양의 시각화 및 치료 효과

먼저 유도성 프로모터하에서 발현되는 ClyA를 포함하는 형질전환체의 종양치료효과를 확인하였다. 상기 종양이 유도된 마우스를 PBS, 실시예 1에 기술된 것과 같은 박테리아 루시퍼라제만 발현하는 박테리아(S.t.Lux), 이에 더하여 ClyA를 발현하는 박테리아 (S.t. Lux +pBC(Ara-) (100㎕의 PBS에 10⁶ CFU로 현탁)를 마우스의 오른쪽 대퇴부에 피하주사하였다. 별개의 그룹에서는 상기와 동일하나 60mg의 L-아라비노스를 상기 박테라아 주사 후 4일 후에 매일 정맥 주사하였다[S. typhi Lux +pBC(Ara+)]. 결과는 도 3에 기재되어 있다. 도 3a는 종양세포 주입 후 시간 경과 (12, 16, 20, 25 및 36일) 후 마우스를 희생시킨 후 몸에 자란 종양의 모습을 찍은 사진이다. 도 3b는 이와는 달리, 마우스를 희생시키지 않고, 살아있는 상태에서 루시퍼라제 발광을 이용하여 in vivo 영상 촬영(bioluminescence imaging)을 한 것이다. 촬영을 위해 D-루시페린(30mg/ml)을 복강주입하고 5분 후에 CCD 카메라가 장착된 Xenogen In Vivo Imaging System 장비 (Caliper Life Science, USA)를 사용하였으며 영상 데이터는 Living Imagae software 2.51 (Caliper Life Science)으로 분석하였다.

도 3a 및 b에서 보는 바와 같이 ClyA 처리시 시간이 지남에 따라 종양의 크기가 줄어들어 36일째는 종양이 사라졌다. 반면 PBS 또는 루시퍼라제만 발현하는 박테리아 또는 ClyA를 발현하나 발현이 유도되지 않은 경우에서는 종양의 크기는 줄어들지 않았다. 또한 PBS만을 처리한 경우보다 후자의 두 경우 종양이 약간 줄어들기는 하였으나, 종양이 재발하는 경향이 있으며, 여전히 ClyA를 처리한 경우보다는 종양의 크기가 컸는데, 이는 살모넬라 만으로는 종양치료가 충분하지 않음을 나타낸다. 도 3b에서 보는 바와 같이 In vivo 영상촬영 결과 루시퍼라제를 발현하는 살모넬라 균주가 정확하게 종양부위에서만 검출되며, 다른 부위에서는 전혀 검출되지 않았다. ClyA에 의해 종양이 줄어든 경우, 루시퍼라제도 검출되지 않았으며, 이는 살모넬라가 숙주의 면역시스템에 의해 제거되었음을 나타낸다. 이러한 결과는 본 시스템의 종양 특이적 전달 능력 및 종양 억제효과가 살모넬라 균주에 포함된 ClyA에 의한 것임을 보여준다. 도 3a 및 b의 시간에 따른 종양의 크기를 칼리퍼로 측정하여 도 3c에 그래프로 표시하였다 (도 3c, CT26세포 및 Hep3B2.1-7, PBS (■), S.t.Lux(◆), S.t.Lux+pBC(Ara-)(○), and S.t.Lux+pBC(Ara+)(●)). 도 3d는 CT-26세포로 종양이 유도된 마우스의 카플란-마이어의 생존커브 (Kaplan, E.L. & Meier, P. (1958). "Nonparametric estimation from incomplete observations". Journal of the American Statistical Association 53: 457481. 여기서 n=5이며 * P<0.05,** P < 0.01 이다. 도 3e 는 종양조직을 적출한 후 실시예 1과 같이 웨스턴블랏을 실시한 결과 아라비노스로 유도된 경우에만 ClyA가 발현됨을 보여준다. 이러한 결과는 본원의 전달시스템의 우수한 표적성, 시각화 및 치료효과를 보여주는 것으로, 암의 검출/진단과 치료가 동시에 가능함을 증명하는 것이다.

(3) 종양특이적 프로모터하에 조절되는 ClyA 를 및 루시퍼라제를 발현하는 살모넬라에 의한 종양의 시각화 및 치료 효과

우선, 실시예 1에서 제조된 종양특이적 프로모터하에서 Fluc를 포함하는 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주를 정상 마우스에 처리하여 조건 특이적 발현을 조사하였다. (1)의 정상 마우스에 4.5x10⁷ CFU로 실시예 1에서 제조된 종양특이적 프로모터하에서 Fluc를 포함하는 플라스미드를 포함하는 살모넬라 균주를 정맥주사하고, 하루 후에 D-루시페린(30mg/ml)을 복강 주사 한 후, 5분후에 마우스를 희생시켜 간, 폐, 이자를 적출하였다. In vivo 영상 촬영은 (2)와 동일하게 수행하였다. 동일한 실험을 (1)에서와 같이 종양이 유도된 마우스를 사용하여 수행하였다. 결과는 도 12 및 13에 있다. 도 12에서 보는 바와 같이 음성대조군으로서 Lac 프로모터하의 루시퍼라제는 발현이 되나, 종양특이적 프로모터 PepT, PflE, AnsB 하의 루시퍼라제는 정상 조직에서는 전혀 발현되지 않는 것을 알 수 있다. 반면 도 13에서 보는 바와 같이 종양이 유도된 경우에는 종양 조직에서 루시퍼라제가 발현되는 것을 알 수 있다. 본원의 프로모터의 종양특이적 발현 및 종양의 시각화를 증명하는 것이다.

다음으로 종양에 대한 치료효과를 보기 위하여, 상기와 동일한 실험 ClyA를 발현하는 살모넬라 균주(S.typhi/lux)를 이용하여 수행하였다. 결과는 도 14에 있다. (1)에서와 같이 종양세포 주사 후 매일 (2)에서와 같이 영상분석을 하였다. 도 14에서 보는 바와 같이, 음성 대조군으로서 PBS 또는 프로모터가 없는 pO-ClyA로 처리한 경우, 종양의 크기가 점차 증가하였으나, 종양 특이적 프로모터의 경우, 양성대조군 (pLac-ClyA) 수준으로 종양이 성장되지 않은 것을 알 수 있다. 종양의 크기를 (2)에서와 같이 칼리퍼로 측정하여 그래프로 나타낸 것이 도 15이다.

실시예 3: 조직분석을 통한 종양세포의 괴사 확인

종양세포의 괴사를 확인하기 위하여 종양 조직에 대한 면역분석을 수행하였다. 우선 실시예 2에서와 같이 마우스 종양모델(CT-26)에 박테리아[S.t.Lux+pBC(Ara-) 및 S.t.Lux+pBC(Ara+)]를 처리한 후 4일 및 6일 후에 세포의 형태를 관찰하기 위하여 H&E (Hematoxylin-Eosin) 염색을 수행하였다. 염색을 위해 종양조직을 적출한 후 4% 파라포름알데히드에서 하루 동안 고정한 후 95% 알코올로 각 1시간씩 2회, 100% 알콜로 각 1시간씩 2회의 탈수를 거친 후 자일렌에서 1시간 동안 클리어링을 한 후 파라핀에 포매하고, 4μM의 두께로 연속절편을 잘라내었다. 이어 절편을 슬라이드글라스 상에 떠서 60℃에서 건조시킨 후, 자일렌에서 파라핀을 녹인 후 일련의 상이한 농도의 알콜을 사용하여 함수하고(100%, 95%, 및 80% 에탄올에서 각 10분씩 2회), 증류수에서 재수화시킨 후, 헤마토실린과 에오신(Sigma-Aldrich) 염색약을 사용하여 상기 조직을 제조자의 권고대로 염색한 후 광학현미경하에서 x100의 배율로 관찰하였다. 결과는 도 4A에 있으며, ClyA의 발현이 유도된 경우 박테리아로 처리된 세포는 괴사(N, Necrotic region)되었으며, 주변의 부위는 여전히 종양세포가 증식(P, proliferative region)하고 있음을 알 수 있다.

나아가 세포가 괴사된 조직에서의 ClyA 발현을 보기위하여 상기 조직에 대하여 면역형광분석을 수행하였다. 상기 제조된 파라핀 블록을 앞서 언급한 바와 같이 탈파라핀화/재수화하고, 이어서 항원노출을 증가시키기 위하여 소디움사이트레이트(pH 6.0)중에서 마이크로웨이브를 이용하여 5분 동안 가열하였다. 2.5% 소혈청알부민 및 2% 정상 토끼 혈청을 포함하는 PBS(pH 7.4) 용액에서 1시간 동안 비특이적부위를 블록킹한 후, 블록킹 버퍼에서 래빗 항-ClyA 항체 (Nguyen et al., Cancer Research 2009, 1:80 희석)을 추가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 FITC로 표지된 2차 항체 (염소 항-래빗 IgG 항체)를 첨가한 후 실온에서 30 분간 반응시킨 후, PBS로 3회 세척한 후 DAPI로 카운터 염색을 한 후 형광현미경(Olympus)하에서 (x400 ) 배율로 관찰하였다. 결과는 도 4B에 있으며, 이에 나타난 바와 같이, ClyA의 발현이 유도된 경우에만 형광이 검출되었으며, DAPI 염색과 겹쳐서 관찰한 경우, ClyA의 발현은 괴사가 일어나는 부위 (N, necrotic)와 증식(P, proliferative region) 사이에 있음을 알 수 있다. 괴사가 일어난 부분은 조직의 유약성(fragile)으로 인해 단백질의 존재 유무는 확인하기가 어렵다.

실시예 4: 폐로 전이된 종양에 대한 치료 효과

폐로 종양이 전이된 마우스를 만들기 위하여, BALB/c 마우스(n=5)에 5x10⁵ 개의 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하는 CT-26 세포(CT-26 FLuc)를 정맥 주사하였다. 5일 후에 복강에 750μg의 D-루시페린(Sigma)를 주사한 후, 실시예 2에 기재된 바와 같이 in vivo 영상 촬영을 하였다 (도 5A 왼편). 영상 촬영 후 즉시 실시예 1 내지 3에서 사용한 박테리아 루시퍼라제를 발현하는 살모넬라 균주를 정맥주사 하였다. 이어서 2dpi에서 추가의 루시페린 없이 영상촬영을 하였다 (도 5A 오른편). 도 5A에서와 같이 종양의 위치와 살모넬라의 위치가 정확하게 일치함을 알 수 있으며, 살모넬라가 정확하게 종양부위로 이동함을 나타내는 것이다. 이어 상기 마우스를 희생한 후 폐로 전이된 종양을 육안 및 생체발광으로 관찰하였다. 결과는 도 7에 있다. 도 7에서 보는 바와 같이 종양이 발생한 폐에서만 정확하게 살모넬라균이 관찰되는 것을 알 수 있다.

이어 종양치료효과를 보기 위하여, 상기와 같이 폐전이가 유도된 마우스 (n=9)(종양세포 주사 후 5일 후)에 앞서 기재된 바와 같이 PBS, 또는 4.5x10⁵CFU의 S.t Lux+PBC(Ara-) 또는 S.t Lux+PBC(Ara+)를 정맥주사하고, 이어 7일 후에 마우스를 희생하여 폐를 적출한 후, 무게를 측정(도 5B)하고, 사진촬영(도 5C)을 한 후, Loeffler M, Le'Negrate G, Krajewska M, Reed JC. Inhibition of tumor growth using Salmonella expressing Fas ligand. J Natl Cancer Inst 2008;100:1113-6에 기재된 방법으로 전이 스코어(도 5D)를 측정하였다. 스코어 측정은 전이로 덮힌 폐 표면 퍼센트로 결정하였으며, 0 = 0%, 1 = < 20%, 2 = 2050%, 3 = > 50%. *=P<0.05 및 **=P <0.01를 나타낸다. 도 5B - D로 부터 ClyA를 발현하는 살모넬라 균주로 처리한 경우, 폐로 전이된 종양이 PBS (p<0.01) 및 아라비노스로 유도되지 않은 경우 (p<0.05)와 비교하여 현저하게 감소되었음을 알 수 있다.

실시예 5: 독성테스트

상기 실시예의 ClyA를 발현 살모넬라 균주의 독성테스트를 수행하였다. 이를 위해, 종양이 유도되지 않은 마우스 (A)와 실시예 2와 같이 CT26 세포로 종양이 유도되어 그 부피가 130mm³에 달한 마우스(B)에 각각 4.5x10⁷ CFU의 ClyA를 발현 살모넬라 균주를 정맥주사하였다. 4일 후부터 매일 60mg의 L-아라비노스를 주사하여 ClyA 발현을 유도한 후 도 6에 기재된 바와 같이 시간 경과에 따른 체중변화를 비교하였다. 각 군에서 음성대조군으로서 PBS를 주사하였다. 각 군 당 테스트된 마우스는 5마리였다. 도 6에 기재된 바와 같이 본원의 박테리아를 처리한 경우와 처리하지 않은 대조군의 체중을 비교한 결과 양 그룹에서 유의적 체중 차이를 보이지 않았으며, 이는 ClyA를 발현하는 살모넬라의 처리가 종양 성장을 억제하지만, 독성은 없음을 증명하는 것이다. PBS (■); S.t.Lux+pBC(Ara+)(●). 치사량 (LD₅₀)은 9 x 10⁷CFU로 확인되었다.

Claims

유도성 또는 종양특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 세포독성 유전자 및 발광 유전자를 포함하는, ppGpp가 결손된 살모넬라 균주를 포함하는 종양 치료영상제.
제 1 항에 있어서, 상기 세포독성 유전자 및 상기 발광 유전자는 플라스미드 또는 상기 살모넬라 균주의 유전체에 삽입되어 있는 것인 종양 치료영상제.
제 1 항에 있어서, 상기 발광 유전자는 루시퍼라제 유전자인 종양 치료영상제.
제 1 항에 있어서, 상기 세포독성 유전자는 ClyA 유전자인 종양 치료영상제.
제 1 항에 있어서, 종양 특이적 프로모터는 ansB, pflE, 또는 pepT이며, 상기 유도성 프로모터는 pBAD, 또는 pTET인 종양 치료영상제.
제 1 항에 있어서, 상기 발광유전자는 루시퍼라제 유전자이며, 상기 세포독성 유전자는 ClyA 유전자이며, 상기 종양 특이적 프로모터는 ansB, pflE, 또는 pepT이며, 상기 유도성 프로모터는 pBAD, 또는 pTET인 종양 치료영상제.
유도성 또는 종양특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 세포독성 유전자 및 발광 유전자를 포함하는, ppGpp가 결손된 살모넬라 균주.
제 7 항에 있어서, 상기 종양 특이적 프로모터는 ansB, pflE, 또는 pepT이며, 상기 유도성 프로모터는 pBAD, 또는 pTET이고, 상기 발광유전자는 루시퍼라제 유전자이고, 상기 세포독성 유전자는 ClyA 유전자인 살모넬라 균주.
ansB, pflE 또는 pepT로부터 선택되는 종양 특이적 프로모터, 또는 pBAD 또는 pTET로부터 선택되는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 ClyA 유전자를 포함하는 플라스미드.
제 9 항에 있어서, 상기 플라스미드는 도 1A, 또는 도 8 A 내지 8 C에 기재된 것인 플라스미드.
ansB, pflE 또는 pepT로부터 선택되는 종양 특이적 프로모터, 또는 pBAD 또는 pTET로부터 선택되는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 루시퍼라제 유전자를 포함하는 플라스미드.
제 11 항에 있어서, 상기 플라스미드는, 9 A 내지 9 C에 기재된 것인 플라스미드.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 플라스미드를 포함하는 ppGpp가 결손된 살모넬라 균주.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 치료영상제의 투여를 포함하는 인간을 제외한 동물의 암의 치료 및 영상화 방법.
제 7 항, 제 8 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 살모넬라 균주의 투여를 포함하는 인간을 제외한 동물의 암의 치료 및 영상화 방법.