MXPA04008287A

MXPA04008287A - Microorganismos como portadores de secuencias de nucleotidos que codifican para antigenos celulares utilizados para el tratamiento de tumores.

Info

Publication number: MXPA04008287A
Application number: MXPA04008287A
Authority: MX
Inventors: Joachim Fensterle
Original assignee: Zentaris Gmbh
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-13
Publication date: 2006-04-27
Also published as: CN1650014A; PL372370A1; RU2004128929A; IL163672A0; KR20040104464A; NO20043926L; CA2513190A1; AU2003206664A1; DE10208653A1; ZA200407528B; RU2319741C2; JP2005518795A; WO2003072789A3; BRPI0308119A2; US20060105423A1; EP1478756A2; WO2003072789A2; NZ535312A; RS75604A; HRP20040785A2

Abstract

La invencion se refiere a un microorganismo con una secuencia de nucleotidos que codifica para un antigeno celular en el cual se insertan y se expresan los siguientes componentes: I) una secuencia de nucleotidos que codifica para al menos un epitope de un antigeno de una celula tumoral y/o una secuencia de nucleotidos para al menos un epitope de un antigeno que es especifico para una celula de tejido a partir de la cual se origina el tumor; II) una secuencia de nucleotidos opcional que codifica para una proteina que estimula las celulas del sistema inmune; IIIA) una secuencia de nucleotidos para un sistema de transporte que hace posible expresar el producto de expresion de los componentes de I) y, opcionalmente II) sobre la superficie exterior de la bacteria y/o secreta el producto de expresion del componente I) y opcionalmente del componente II); y/o IIIB) una secuencia de nucleotidos para una proteina utilizada para lisar los microorganismos en el citosol de celulas de mamifero y para liberara intracelularmente los plasmidos que se encuentran contenidos en los microorganismos lisados; y IV) una secuencia de activacion para expresar uno o varios de los componentes I) a IIIB), seleccionandose dicha secuencia de activacion entre el grupo que consiste de una secuencia de activacion que es capaz de activarse en el microorganismo, es especifica de celulas de tejido pero no especificas de celulas. Cada uno de los componentes I) a IV) pueden ordenarse de manera identica o diferente en una manera individual o multiple. Tambien se describen los usos de tal microorganismo para la produccion de un medicamento.

Description

MICROORGANISMOS COMO PORTADORES DE SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PARA ANTIGENOS CELULARES UTILIZADOS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES Campo de la Invención La invención se refiere a un microorganismo con secuencias de nucleótidos extrañas, al uso del mismo como un medicamento, en particular una vacuna, a un plásmido con las secuencias de nucleótidos extrañas y a un método para la producción de tal microorganismo. Antecedentes de la invención y técnica anterior La razón principal, en la mayoría de los casos,; para la consecuencia letal de las enfermedades de tumores malignos, es la incapacidad del sistema corporal de defensa para detectar y destruir las células cancerosas malignas. En los países industrializados, las enfermedades cancerosas corresponden a las enfermedades más comunes con un cursa letal. Solo en Alemania, más de 210,000 personas mueren al año debido a nuevas formaciones malignas (fuente: WHO, cifras de 1997) , lo que corresponde a una tasa anual de más de 255 muertes por cada 100,000 habitantes. Las bases de esta invención son los más novedosos descubrimientos en los mecanismos moleculares que conducen a deformaciones malignas. En una etapa temprana de la formación del cáncer, existen cambios característicos del control del crecimiento celular y/o la diferenciación celular (Pronten, Cáncer Surv. 32:5-35, 1998). Se encuentran esencialmente implicadas en estos cambios las proteínas de la transducción de señal y del control del ciclo celular, que se identificaron en los últimos años, y todas las cuales son también antígenos tumorales. Los antígenos tumorales se dividen aproximadamente en tres grupos (Pardoll, Nat . Med. 4:525-531, 1998): i) neoantígenos específicos del tumor, que existen en la célula tumoral en una forma mutada y/o sobre -expresada, tales como EGF- , HER-2; ii) antígenos embriónicos específicos del tumor, tales como los miembros de la familia de proteína MAGE o CEA; iii) antígenos de diferenciación específicos del tejido tumoral, tales como tirosinasa, Mart-l/Melan-A y gplOO . Para la efectividad de una vacuna tumoral, es decisiva la inducción efectiva de las células T CD8+, debido a que las células Tumorales en la mayoría de los casos, no representan las moléculas MHC clase II, y los antígenos tumorales intracelularmente existentes, en la mayoría de los casos, se encuentran restringidos de MHC clase I. Para los pacientes con tumores, las poblaciones de células T citotóxicos (CTL) CD8+ que se presentan de manera natural, obviamente no son suficientes para detectar y eliminar las células Tumorales (Jaffee, Ann. N.Y. Acad . Sci . 886:67-72, 1999) . Además, las células T específicas del tumor no pueden atacar efec i amente el tejido tumoral debido a varios mecanismos (anergia, tolerancia, neutralización) (Smyth et al., Nat . Immunol . 2:293-299, 2001). Una vacuna exitosa en consecuencia debe romper esta anergia o tolerancia e inducir un número suficiente de CTL activada específica así como de anticuerpos específicos. El papel de los anticuerpos específicos puede observarse por el uso exitoso de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra antígenos tumorales del grupo (a) , tales como la herceptina, ya disponible comercialmente, un mAb contra HER-2 (Colomer et al., C ncer Invest. 19:49-56, 2001). Se sabe ya que las bacterias intracelulares atenuadas son adecuadas como portadores de vacuna contra ciertas infecciones bacteriales, que en particular pueden controlarse por la así llamada respuesta inmune Thl (Hess and Kaufmann, FE S Immunology & Medical Microbiology 23:165-173, 1999) . Esta respuesta se caracteriza por CTL y la presencia de células T CD4+ específicas que secretan IFN-g (también células T cooperadoras, Th) (Abbas et al., Nature 383:787-793, 1996). Otros grupos han mostrado que las bacterias recombinantes pueden proteger contra un tumor heterólogo (Medina et al., Eur. J. Immunol. 29:693-699, 1999; Pan et al., Cáncer Res. 59:5264-5269, 1999; Woodlock et al., J. Immunother. 22:251-259, 1999; Paglia et al., Blood 92:3172-3176, 1998; Paglia et al., Eur. J. Immunol. 27:1570-1575, 1997; Pan et al., Nat . Med. 1:471-477, 1995; Pan et al., Cáncer Res. 55:4776-4779, 1995). Sin embargo, en estos casos se inmunizaron animales contra un antígeno sustituto, y después se aplicaron células Tumorales que expresan este antígeno. Sin embargo, estos sistemas tumorales no pueden compararse con los tumores clínicos, debido a que en estos modelos no hubo tolerancia para el antígeno tumoral . Ya se ha investigado clínicamente un número considerable de diferentes vacunas tumorales. Sin embargo, hasta ahora, no se ha podido lograr un descubrimiento para el tratamiento de enfermedades tumorales con cualquiera de las vacunas tumorales o métodos de vacunación. En vista de estos antecedentes continúa existiendo una necesidad extremadamente alta de nuevos métodos de terapia tumoral. Se conoce en la técnica expresar los productos- de expresión de las secuencias de ácidos nucleicos introducidas en bacterias en la membrana celular de estas bacterias, o secretarlas a partir de estas bacterias. La base de esta técnica es el sistema de hemolisina de Escherichia coli HlyAs que representa el prototipo de un sistema de secreción tipo I de bacterias gram-negativas . Por medio del HlyAs, se desarrollaron vectores de secreción, que permiten una descarga eficiente de los antígenos de proteína en Salmonella entérica, Yersinia enterocolítica y Vibrio cholerae. Tales vectores de secreción contienen el ADNc de un antígeno de proteína arbitrario acoplado a la secuencia de nucleótidos para el péptido de señal HlyA, para el aparato de secreción de hemolisina, hlyB y hlyD y el promotor específico del hly. Por medio de este vector de secreción, puede expresarse una proteína en la superficie de esta bacteria. Tales bacterias genéticamente modificadas inducen como vacunas una protección inmune considerablemente más alta que las bacterias en las cuales la proteína, expresada por el ácido nucleico introducido, permanece dentro de la célula (Donner et al., EP 1015023A; Gentschev et al., Gene 179:133-140, 1996; Vaccine 19:2621-2618, 2001; Hess et al., PNAS 93:1458-1463, 1996. Sin embargo, la desventaja de este sistema es que mediante el uso del promotor específico hly, la cantidad de la proteína expresada en la superficie exterior de las bacterias es extremadamente pequeña . Se desarrolló una técnica para insertar ADN de plásmido en células de mamífero por medio de una bacteria portadora tal como Salmonella y Listeria monocytogenes . Los genes contenidos en estos plásmidos también pudieron expresarse en las células de mamífero, cuando estuvieron bajo el control de un promotor eucariótico. Se introdujeron plásmidos en gérmenes de Listeria monocytogenes, conteniendo dichos plásmidos una secuencia de nucleótidos para un antígeno arbitrario bajo el control de un promotor eucariótico arbitrario. Mediante la introducción de las secuencias de nucleótidos para un gen de lisis específico, se obtuvo que los gérmenes de Listeria monocytogenes se disuelven en el citosol de la célula que presenta antígeno y liberan sus plásmidos, lo que lleva a la subsecuente expresión, procesamiento y presentación de las proteínas codificadas por plásmido y claramente aumenta la inmunogenicidad de estas proteínas (Dietrich et al., Nat . Biotechnol. 16:181-185, 1998; Vaccine 19:2506-2512, 2001). Se desarrollaron bacterias intracelularmente instaladas, de virulencia atenuada. Por ejemplo, tales variantes de Listeria monocytogenes, Salmonella entérica sv. typhimurium y typhi, y Mycobacterium bovis ya se utilizaban como vacunas atenuadas bien toleradas contra tifo y tuberculosis. Estas bacterias, incluyendo sus mutantes atenuados son generalmente estimulantes de la inmunidad y pueden iniciar una respuesta inmune celular adecuada. Por ejemplo, L. monocytogenes, se estimula a un grado especial mediante la activación de las células THl la proliferación de los linfocitos T citotóxicos. Estas bacterias suministran los antígenos secretados directamente dentro del citosol de las células que presentan antígeno (APC; macrófagos y células dendríticas) , que a su vez expresan las moléculas de coestimulación y ocasionan una estimulación eficiente de las células T. Las Listerias se degradan en parte en los compartimentos fagosomales, y los antígenos producidos por estas bacterias portadoras pueden en consecuencia, por una parte, presentarse mediante moléculas MHC clase II y de este modo conducir a la inducción de las células T cooperadores. Por otra parte, la listeria se replica después de liberarse del fagosoma en el citosol de los APCs; antígenos producidos y secretados por estas bacterias se presentan en consecuencia preferentemente mediante la trayectoria de MHC clase I, induciendo así las respuestas de CTL contra estos antígenos. Además podría demostrarse que mediante la interacción de las listerias con los micrófagos, los linfocitos citolíticos naturales (NK) y los granulocitos neutrófilos, se induce la expresión de tales citosinas (TNF-alfa, IFN-gamma, IL-2, IL-12; Unanue, Curr. Opin. Immunol . , 9:35-43, 1997; Mata y Paterson, J. Immunol. 163:1449-14456, 1999), para lo cual se detectó una eficiencia antitumoral. Mediante la administración de L. monocytogenes , transducida para la expresión de los antígenos tumorales, el crecimiento de tumores experimentales pudo inhibirse específicamente por antígeno (Pan et al., Nat . Med. 1:471-477, 1995; Cáncer Res. 59:5264-5269, 1999; Voest et al., Nati. Cáncer Inst . 87:581-586, 1995; Beatty y Paterson, J. Immunol. 165:5502-5508, 2000) . Las cepas de Salmonella entérica de virulencia atenuada, dentro de las cuales se han introducido secuencias de nucleótidos que codifican para antígenos tumorales, como portadores bacteriales que expresan antígeno tumoral , pudieron proporcionar después de la administración oral una protección específica contra diferentes tumores experimentales (Medina et al., Eur. J. Immunol . 30:768-777, 2000; Zoller y Christ, J. Immunol. 166:3440-34450, 2001; Xiang et al., PNAS 97:5492-5497, 2000). Las cepas de Salmonella recombinantes también fueron efectivas como vacunas profilácticas contra infecciones virales (HPV) ; (Benyacoub et al., Infect . Immun. 67:3674-3679, 1999) y para el tratamiento terapéutico de un tumor de ratón inmortalizado por un virus tumoral (HPV) (Revaz et al., Virology 279:354-360, 2001). Objetivo técnico de la invención Es el objetivo de la presente invención proporcionar un medicamento, que en particular representa en la profilaxis del tumor y en la terapia del tumor una vacuna mejorada para romper la tolerancia inmune con respecto a los tumores . Concepto básico de la invención Para lograr este objetivo técnico, la invención muestra un microorganismo con una secuencia de nucleótidos que codifica para un antígeno celular, en cuyo genoma se insertan y son expresables los siguientes componentes: I) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos un epítope de un antígeno o de varios antígenos de una célula tumoral y/o una secuencia de nucleótidos para al menos un epítope de un antígeno o de varios antígenos que es o son específicos para una célula de tejido a partir de la cual se origina el tumor; II) una secuencia de nucleótidos opcional que codifica para una proteína que estimula las células del sistema inmune; IIIA) una secuencia de nucleótidos para un sistema de transporte, que hace posible expresar el producto de expresión de los componentes I) y, opcionalmente, II) en la superficie externa de las bacterias y/o secretar el producto de expresión del componente I) y, opcionalmente del componente II); y/o IIIB) una secuencia de nucleótidos para una proteína utilizada para lisar los microorganismos en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente los plásmidos, que se encuentran contenidos en los microorganismos lisados; y IV) una secuencia de activación para expresar uno o varios de los componentes I) a IIIB) , seleccionándose dicha secuencia de activación entre el grupo que consiste de "una secuencia de activación, que es capaz de activarse en el microorganismo, que es específica de la célula de tejido, pero no específica de la célula", y cada uno de los componentes I) a IV) puede ordenarse en forma idéntica o diferente de una manera individual o múltiple, y los usos de tal microorganismo para la producción de un medicamento.

De este modo, la materia de la invención son los microorganismos, que representan portadores de las secuencias de nucleótidos que codifican para los antígenos celulares, que a su vez se expresan o se secretan en la membrana externa de los microorganismos, y el uso de estos microorganismos para romper la tolerancia inmune contra los tumores, y nuevas vacunas tumorales que contienen microorganismos como portadores de secuencias de nucleótidos que codifican para antígenos celulares de células normales y/o de células tumorales. Mediante la invención, se ocasiona al menos una reacción inmune dirigida contra el tumor. En detalle, los microorganismos de acuerdo con la invención contienen los siguientes componentes: I) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos un epítope de al menos un antígeno de al menos una proteína celular de una célula tumoral y/o, opcionalmente , al menos una secuencia de nucleótidos para al menos un epítope de al menos un antígeno que es específico para la célula de tejido a partir de la cual se origina el tumor; II) opcionalmente, al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una proteína que estimula las células del sistema inmune; IIIA) al menos una secuencia de nucleótidos para un sistema de transporte para expresar o secretar el antígeno celular codificado por el componente I) en la membrana y para secretar la proteína de estimulación inmune codificada por el componente; IIIB) opcionalmente , una secuencia de nucleótidos para una lisina que lisa el microorganismo en el citosol, de modo que los plásmidos, contenidos en el microorganismo, se liberan dentro del citosol; IV) al menos una secuencia de nucleótidos para una secuencia de activación que es capaz de activarse en el microorganismo o no activarse específicamente en la célula, sino específicamente en la célula tumoral , especí icamente en la célula de tejido o específicamente en la función para expresar los componentes I) y II) . Modalidades preferidas A continuación, los componentes de un microorganismo de acuerdo con la invención se describen en detalle . Componente I ) El componente I) representa al menos una secuencia de nucleótidos para al menos un epítope de al menos un antígeno de al menos una proteína celular o al menos una proteína celular oncogénicamente mutada de una célula tumoral . La mutación oncogénica de la proteína celular puede haber causado una pérdida o un aumento de sus funciones celulares originales. Además, esta proteína celular puede seleccionarse de entre el grupo que consiste de "moléculas receptoras o partes de las mismas, es decir partes extracelulares, transmembránicas o intracelulares de los receptores; moléculas de adhesión o partes de las mismas, es decir partes extracelulares , transmembránicas o intracelulares de las moléculas de adhesión, proteínas de la transducción de señal; proteínas del control del ciclo celular; proteínas de diferenciación; proteínas embriónicas; y proteínas inducidas por virus" . Tales antígenos celulares desempeñan en la célula el control del crecimiento celular y de la división celular y se presentan en la membrana celular de células normales, por ejemplo, por medio de la molécula MHC clase I. En células tumorales, estos antígenos celulares se encuentran frecuentemente sobre-expresados o específicamente imitados . Tales mutaciones pueden tener limitaciones de función de los supresores oncógenos o la activación de proto-oncógenos a oncógenos como una consecuencia y pueden encontrarse involucrados solos o en común con las sobre-expresiones en el crecimiento del tumor. Tales antígenos celulares se presentan en la membrana de las células tumorales y de este modo representan los antígenos en las células tumorales, sin embargo, sin ocasionar una reacción inmune que afecta la enfermedad tumoral del paciente. Rapp (US- 5 , 156 , 841 ) ya ha descrito el uso de las oncoproteínas , i.e., los productos de expresión de los oncógenos, como un inmunógeno para vacunas tumorales. Se hace referencia explícitamente a este documento. Ejemplos para antígenos celulares y sus mutaciones oncogénicas de acuerdo con la invención son i) los receptores, tales como Her-2/neu, receptor de andrógeno, receptor de estrógeno, receptor de midkine, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4 , receptor de TRAIL, FAS, receptor de TNFalfa; ii) proteínas de transducción de señal y sus mutaciones oncogénicas, tales como c-Raf (Raf -1) , A-Raf, B-Raf, Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, Al, Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk, Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IA02 , XIAP, ML-IAP LIVIN survivin, APAF-1; iii) proteínas del control del ciclo celular y sus mutaciones oncogénicas, tales como ciclina D(l-3), E, A, B, H, Cdk-1, -2, -4, -6, -7, Cdc25C, P16, pl5, p21, p27, pl8, pRb, pl07, pl30, E2F(l-5), GAAD45 , MDM2 , PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, P53 y homólogos; iv) factores de transcripción y sus mutaciones oncogénicas, tales como C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Spl ; v) proteínas embriónicas, tales como el antígeno carcinoembriónico, alfa-fetoproteína, MAGE, PSCA; vi) antígenos de diferenciación, tales como MART, GplOO, tirosinasa, GRP, TCF-4; vii) antígenos virales, tales como de los siguientes virus: HPV, HCV, HPV, EBV, CMV, HSV. Alternativa o adicionalmente , el componente I) puede representar al menos una secuencia de nucleótidos para al menos un antígeno que es específico para una célula de tejido normal, a partir de la cual se origina el tumor respectivo. Tales antígenos específicos son por ejemplo i) los receptores, tales como los receptores de andrógeno, receptores de estrógeno, receptores de lactoferrina ; ii) antígenos de diferenciación, tales como mielina básica, alfa-lactalbúmina, GFAP, PSA, proteína de ácido fibrilar, tirosinasa, EGR-1, MUC1. Componente II) El componente II) representa al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una proteína, que estimula las células del sistema inmune. Mediante la selección de la proteína, la reacción inmune al producto de expresión del componente I) puede intensificarse y/o orientarse más hacia la activación de las células Thl (para la reacción celular inmune) o hacia la activación de las células Th2 (para la reacción tumoral inmune) . Las proteínas que estimulan la inmunidad son por ejemplo i) citosinas, tales como M-CSF, GM-CSF, G-CSF; ii) interferones , tales como IFN-alfa, beta, gama; iii) interleucinas , tales como IL-1, -2, -3, -4, -5>, -6, -7, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, factor inhibidor de la leucemia humana (LIF) , iv) quimosinas, tales como RA TES, factor quimotáctico y de activación de monocitos (MCAF) , proteína-1 inflamatoria de macrófago (???-1-alfa, beta), proteína-2 de activación de neutrófilos (NAP-2) , IL-8. Componente IIIA) El componente IIIA) es al menos una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos un sistema de transporte, lo que hace posible expresar la expresión de los productos de expresión de los componentes I) y, opcionalmente, II) en la superficie externa del microorganismo. El componente respectivo como opción, puede ya sea secretarse o expresarse en la membrana del microorganismo, i.e., se enlaza a la membrana. Tales sistemas de transporte por ejemplo i) la señal de transporte de hemolisina de E. coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly) ; se utilizan las siguientes señales de transporte: para la secreción - la señal de transporte HlyA de C-terminal, en presencia de las proteínas HlyB y LlyD; para la expresión enlazada a la membrana - la señal de transporte HlyA de C-terminal, en presencia de la proteína HlyB, ii) la señal de transporte de hemolisina de E. coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y LlyD bajo el control de un promotor bacterial no específico, de hly, iii) la señal de transporte para la proteína de capa S (Rsa A) de Caulobacter crescentus; se utilizan las siguientes señales de transporte: para la secreción y la expresión enlazada a la membrana - la señal de transporte RsaA de C-terminal, iv) la señal de transporte para la proteína TolC Escherichia coli; se utilizan las siguientes señales de transporte: para la expresión enlazada a la membrana - la señal de transporte N-terminal de TolC (la proteína TolC de membrana integral de E. coli es una proteína multi- funcional formadora de poro de la membrana externa de E. coli , que sirve - además de sus funciones tales como la recepción de colicina El (Morona et al., J. Bacteriol . 153:693-699, 1983) y la secreción de colicina V (Fath et al., J. Bacteriol. 173:7549-7556, 1991) - también como un receptor para el fago U3 (Austin et al., J. Bacteriol, 172:5312-5325, 1990); esta proteína no solo se encuentra en E. coli sino que también en una multitud de bacterias gram-negativas (Wiener, Structure Fold Des 8:R171-175, 2000); la localización en la membrana externa y la amplia ocurrencia hacen que TolC sea una candidato ideal para los antígenos heterólogos presentes, a fin de e.g., causar una reacción inmune. Componente II IB) El componente IIIB) es una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una proteína lítica, que se expresa en el citosol de una célula de mamífero y lis el microorganismo para liberar los plásmidos en el citosol de la célula huésped. Tales proteínas líticas (endolisinas) son por ejemplo proteínas de lisis específicas de Listeria, tales como PLY551 (Loessner et al., Mol. Microbiol. 16:1231-41, 1995) y/o holin específico de Listeria bajo el control de un promotor listeriano. Una modalidad preferida de esta invención es la combinación de diferentes componentes IIIB) , por ejemplo la combinación de una proteína de lisis y el holin.

Los componentes IIIA y/o IIIB pueden ser constitutivamente activos. Componente IV El componente IV) representa al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una secuencia de activación para la expresión del componente I) y, opcionalmente, el II) . Si la expresión se encuentra enlazada a la membrana en la superficie externa del microorganismo, la secuencia de activación preferentemente tiene que seleccionarse de tal modo que sea capaz de activarse en el microorganismo. Tales secuencias de activación son por ejemplo: i) regiones promotoras constitutivamente activas, tales como la región promotora con "sitio de unión ribosomal" (RBS) del gen beta-lactamasa de E. colí o del gen tetA (Busby y Ebright, Cell 79:743-746, 1994); ii ) promotores , que son capaces de inducirse, preferentemente promotores que se vuelven activos después de la recepción en la célula. A éstos pertenece el promotor actA de L. monocytogenes (Dietrich et al., Nat . Biotechnol . 16:181-185, 1998) o el promotor pagC de S. typhimurium, (Bumann, Infect . Immun. 69:7493-7500, 2001). Si los plásmidos se liberan del microorganismo después de su lisis en el citosol de la célula, la secuencia de activación no es específica de la célula, sino específica del tejido celular, específica del ciclo celular o específica de la función. Preferentemente, se seleccionan tales secuencias de activación que se activan par icularmente en macrófagos , células dendrí icas y linfocitos. Los microorganismos en el significado de la invención, son virus, bacterias o parásitos unicelulares, que se utilizan comúnmente para la transferencia de las secuencias de nucleótidos que son extrañas para el microorganismo . En una modalidad especial de esta invención, los microorganismos representan bacterias gram-positivas o gram-negativas, preferentemente bacterias tales como Escherichia coli, Salmonella, Yersinia enterocolítica, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Shigella. Preferentemente, se utilizan tales bacterias, las cuales se encuentran atenuadas en su virulencia. Los componentes de acuerdo con la invención se introducen en los microorganismos mediante métodos muy conocidos para el experto en la técnica. Si los microorganismos representan bacterias, los componentes se insertan en los plásmidos, y los plásmidos se transfieren dentro de las bacterias. Las técnicas adecuadas para esto y los plásmidos son suficientemente conocidos por el experto en la técnica. La materia de la invención son preparaciones de medicamento que contienen los microorganismos de acuerdo con la invención o de cualquier modo las envolturas de membrana de estos microorganismos. La preparación de estas envolturas de membrana tiene lugar, por ejemplo de acuerdo con el método descrito en la EP-A-0,540 525. Tales preparaciones de medicamento son por ejemplo suspensiones de los microorganismos de acuerdo con la invención en las soluciones familiares para el farmacéutico, adecuadas para inyección. Otra materia de la invención es la administración de una preparación de medicamento que contiene los microorganismos de acuerdo con la invención. La administración se hace localmente o sistémicamente , por ejemplo en la epidermis, en el subcutis, en la musculatura, en una cavidad del cuerpo, en un órgano, en el tumor o en la circulación sanguínea. Una cuestión particular de esta invención es la administración peroral o rectal del medicamento de acuerdo con la invención para la profilaxis y/o terapia de una enfermedad proliferativa . La administración puede hacerse una o varias veces. En cada administración, se administran aproximadamente de 10 a 10A9 microorganismos de acuerdo con la invención. Si la administración de este número de microorganismos de acuerdo con la invención no ocasiona una reacción inmune suficiente, el número a inyectarse tiene que aumentar . Después de la administración de los microorganismos de acuerdo con la invención, la tolerancia para un componente I) que presenta las células, por ejemplo para una célula tumoral, o para una célula de tejido, a partir de la cual se origina el tumor, se rompe, y se activa una reacción citotóxica inmune dirigida contra el tumor y/o sus células de tejido. Dependiendo de la selección del componente I), esta reacción citotóxica inmune se dirige ya sea exclusivamente contra el tumor o también contra las células tumorales que incluyen las células de tejido, a partir de las cuales se originan las células tumorales. La materia de la invención es por tanto la administración de una preparación de medicamento de acuerdo con la invención para la profilaxis o la terapia e una enfermedad proliferativa . Las enfermedades proliferativas son enfermedades tumorales, leucemias, enfermedades viralmente causadas, inflamaciones crónicas, rechazo de órganos trasplantados y enfermedades autoinmunes . En una modalidad especial de esta invención en donde el componente I) representa al menos un antígeno celular, que se expresa por una célula tumoral y las células de tejido, a partir de las cuales se origina el tumor, el medicamento de acuerdo con la invención se administra para la profilaxis o terapia de un tumor de la glándula tiroidea, la mama, el estómago, el riñon, el ovario, el nevo, la próstata, el cerviz o la vejiga urinaria.

A continuación, la invención se explica en más detalle, en base a los ejemplos que representan solo modalidades . Ejemplo 1: Inducción de una respuesta inmune en ratones BxB mediante inmunización con c-raf que expresa salmonella Raf es una cinasa de serina/treonina normalmente citosólica (PSK) , que en conjunto con otras proteínas de cascadas de señal controla el crecimiento y supervivencia celular (Kerkhoff y Rapp, Oncogene 17:1457-1462, 1998; Troppmair y Rapp, Recent Results Cáncer Res. 143:245-249, 1997) . Un enlace de un factor de crecimiento a su receptor respectivo normalmente conduce a través de la activación de Ras, la activación subsecuente de Raf a través de varias etapas de fosforilación a través del PSK y MEK de tirosina cinasa y el PSK ERK a una activación de la maquinaria de replicación en el núcleo celular (Kerkhoff y Rapp. Oncogene 17:1457-1462, 1998) . El primer enlace en esta cadena, el Ras de proteína G pequeña, se encuentra presente en una forma modificada en 30% de todos los tumores humanos (Zachos y Spandidos, Crit . Rev. Oncol . Hematol . 26:65-75, 1997) . Raf es un efector de Ras y se encuentra presente en una forma sobre -expresada en una multitud de tumores humanos (Naumann et al.r Recent Results C ncer Res. 143:237-244, 1997) . Para la prueba en el modelo de ratón, se utilizaron ratones transgénicos , que sobre-expresan la molécula completa o el dominio de cinasa constitutivamente activo (BxB) (Kerkhoff et al., Cell Growth Differ 11:185-190, 2000). Por lo mismo, los ratones desarrollaron espontáneamente tumores pulmonares aproximadamente medio año más tarde . Para la generación de las vacunas, el ADNc de c-Raf humano se clonó por medio de PCR en bloque con HlyA dentro del plásmido pMOhly (Figura 1) . Subsecuentemente, el plásmido p O-Raf se transfectó en salmonella atenuada (S. typhimurium SL7207) , que contiene un defecto en el metabolismo aromático (Hoiseth y Stocker, Nature 291:238-239, 1981) . En la inmunotransferencia por medio de los anticuerpos dirigidos contra c-Raf, la proteína de fusión de HlyAs de c-Raf podría detectarse en el lisado de bacteria así como en el sobrenadante del cultivo de las bacterias SL7207 transíectadas con PMOhy-Raf . Se inmunizaron de manera oral ratones BxB transgénicos a una edad de 7 - 10 semanas con la salmonella (dosis 5 x 10?9) y la vacunación se repitió dos veces en un intervalo de 5 días. 45 días después de la última inmunización, se preparó una nueva vacunación intravenosa con 5 x 10"5 de salmonella. Para propósitos de control, se administró intramuscularmente a los ratones ADN que codifica para c-Raf puro. De 5 - 7 días después de la última inmunización, se tomaron nuevas muestras de suero, y se analizó la respuesta del anticuerpo por medio de inmunotransferencia Western. Para este propósito, el suero diluido a 1:200 se híbrido contra membranas con la proteína separada y la proteína inmunotransferida de bacterias transíectadas con c-Raf o no transfectadas . La detección de los anticuerpos de suero enlazados tuvo lugar por medio de anticuerpos específicos para IgG de ratón. En contraste con los ratones de control, inmunizados con SL7207 transfectado con pMohly-Raf, pudieron inducirse anticuerpos específicos de c-Raf del isotipo IgG. De este modo se ha mostrado que una inmunización con la salmonella descrita puede romper la auto- tolerancia e induce las células T CD4+, que son necesarias para el cambio de isotipo del anticuerpo a IgG. Para el análisis de la respuesta de la célula T CD8+, se inmunizaron ratones C57BL-6 siguiendo el mismo protocolo. 7 días después de la última inmunización,- se aislaron células de bazo y se estimularon con células EL-4 con sobre-expresión de Raf. 1 hora después de iniciar la estimulación, el transporte vesicular se bloqueó mediante Brefeldin A, y después de otras 4 horas, las células se tiñeron con CD8 y los anticuerpos específicos de IFN-g y se analizaron mediante citometría de flujo (Mittrucker et al., Infect. Immun. 70:199-203, 2002) . Solo en un ratón inmunizado con pMO-Raf pudo detectarse una respuesta del anticuerpo específico de Raf.

Para detectar la actividad tumoricida, se sacrificaron ratones BxB de 10, 12 y 14 meses de edad inmunizados y no inmunizados, y se pesó la masa pulmonar. La masa pulmonar es una medida directa para el tamaño del tumor. En el grupo, inmunizado con SL-pMO-Raf, después de 14 meses pudieron encontrarse claramente de manera más frecuente, ratones con una masa pulmonar reducida que en los grupos de control incluyendo el grupo, que se ha inmunizado con ADN puro que codifica para c-Raf (SL-pCMV-raf ) . Normalmente, el crecimiento del tumor en animales no tratados no es reversible (Kerkhoff et al., Cell Grouth Differ. 11:185-190, 2000) . Estos datos muestran en consecuencia que en este experimento una vacunación con animales SL-pMO-Raf podría proteger de la generación de tumores, y la invención descrita en la presente es adecuada como una vacuna tumoral . Estos experimentos muestran además que el sistema portador representado en esta invención puede en principio romper la auto-tolerancia e inducir en los animales tolerantes a c-Raf una respuesta al anticuerpo específico de c-Raf y una respuesta a la célula T. Por medio de los mismos sistemas experimentales, puede producirse salmonella como vacunas, que expresan isoformas de C-Raf (tal como por ejemplo B-Raf y A-Raf) , C-Raf, B-Raf o A-Raf mutados, epítopes de C-Raf, B-Raf o A-Raf normales o mutados , o combinaciones de epítopes de C-Raf, B-Raf o A-Raf normales y/o mutados . Ejemplos para una mutación que viene junto con una pérdida de la actividad de Raf son las mutaciones del dominio de enlace Ras, el dominio de cinasa y/o los sitios de fosforilación. Ejemplo 2: Inducción de una respuesta inmune en ratones BALB/C mediante inmunización con salmonella que expresa PSA. La existencia de antígenos específicos del tejido, en particular de aquellos, que se encuentran sintetizados y expresados a un alto grado mediante células tumorales, es, además de la utilidad diagnóstica de estos marcadores, un punto posible de inicio para procedimientos terapéuticos. Para el carcinoma de próstata, hasta ahora se han identificado tres antígenos dignos de mencionar: PSA (antígeno específico de la próstata) , PSMA (antígeno de membrana específico de la próstata) y PSCA (antígeno de célula germinal de próstata) . Aunque PSA ya existe en formas tempranas del tumor de una manera sobre-expresada (Watt et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 83:3166-3170, 1986; Wang et al., Prostate 2:89-96, 1981) y de este modo contribuye al diagnóstico del carcinoma (Labrie et al., J. Urol . 147:846-851; exposición 851-842, 1992), la expresión de PSCA en la mayoría de los casos solo se incrementó en la etapa tumoral localmente avanzada, no diferenciada y metastasizada (Gu et al., Oncogene 19:1288-1296, 2000; Reiter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:1735-1740, 1998). La especificidad del órgano prepara al PSA así como al PSCA para un antígeno objetivo potencial para el desarrollo de la terapia inmune contra el carcinoma de próstata (Reiter et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 95:1735-1740, 1998; Hodge et al., Int. J. Cáncer 63:231-237, 1995; Armbruster, Clin, Chem. 39:181-195, 1993) . En este primer experimento, se pretendió demostrar si la salmonela que secreta PSA en la base del vector pMOHLY 1 puede inducir una respuesta inmune en ratones BALB/c. Para este propósito, primero se introdujeron dos interfaces Nsil mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) dentro de la secuencia de ADN-c de PSA, a fin de producir una inserción en bloque del fragmento amplificado dentro del vector objetivo posible. Para la amplificación, se seleccionó un fragmento de 645 pares de bases (pb) . Como iniciadores sirvieron 5'-GTGGATTGGTGATGCATCCCTCATC-3 ' y 5 ' -CAGGGCACATGCATCACTGCCCCA-3' . El producto de PCR se clonó primero por extremo cerrado dentro del vector pUC18 y más tarde se ligó a través de las interfaces Nsil con el vector objetivo pMOhlyl. La inserción correcta se controló por medio de digestión por restricción y se confirmó mediante secuenciación (Fig. 2). Por medio de esta cepa de salmonella, los ratones BALB/c se inmunizaron ahora nasalmente tres veces en un intervalo de 3 semanas con una dosis de 1x107. La respuesta inmune se detectó con análisis de inmunotransferencia Western tinción intracelular con citosina.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un microorganismo con una secuencia de nucleótidos que codifica para un antigeno celular, en el genoma del cual se insertan y son expresables los siguientes componentes: I) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos un epítope de un antígeno o de varios antígenos de una célula tumoral y/o una secuencia de nucleótidos para al menos un epítope de un antígeno o de varios antígenos que es o son específicos para una célula de tejido a partir de la cual se origina el tumor; II) una secuencia de nucleótidos opcional que codifica para una proteína que estimula las células del sistema inmune ; IIIA) una secuencia de nucleótidos para un sistema de transporte, que hace posible expresar el producto de expresión de los componentes I) y, opcionalmente , II) en la superficie externa de las bacterias y/o secretar el producto de expresión del componente I) y, opcionalmente del componente II) ; y/o IIIB) una secuencia de nucleótidos para una proteína para lisar los microorganismos en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente los plásmidos, que se encuentran contenidos en los microorganismos lisados; y IV) una secuencia de activación para expresar uno o varios de los componentes I) a IIIB) , seleccionándose dicha secuencia de activación a partir del grupo que consiste de "una secuencia de activación, que es capaz de activarse en el microorganismo, o que es específica de la célula de tejido, o que es no específica de la célula" , en donde cada uno de los componentes I) a IV) puede ser idéntico o diferente y cada uno estar presente una o múltiples veces.
2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es un virus, una bacteria, en particular una bacteria gram-positiva o gram-negativa, preferentemente seleccionada del grupo que consiste de "Escherichia coli, Salmonella, Yersinia enterocolítica, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes , y Shigella" , o es un parásito unicelular, reduciéndose preferentemente la virulencia del microorganismo.
3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es la envoltura de una bacteria.
4. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el componente I) es una secuencia de nucleótidos que codifica para un epítope o varios epítopes de un antígeno o varios antígenos de una proteína o varias proteínas, opcionalmente mutadas, de una célula tumoral , en donde esta proteína se selecciona preferentemente del grupo que consiste de "parte extracelular, transmembránica o intracelular de un receptor; parte extracelular, transmembránica o intracelular de una molécula de adhesión; proteína de la transducción de señal; una proteína que controla el ciclo celular; factor de transcripción; proteínas de diferenciación; proteínas embriónicas; y proteínas virales", siendo la proteína preferentemente un producto oncogénico del gen o un producto supresor del gen, en particular c-raf, A-Raf, B-Raf o una proteína homologa de c-Raf, A-Raf o B-Raf.
5. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el componente I) es una secuencia de nucleótidos que codifica para un antígeno que es específico para la célula del tejido, en particular seleccionado del grupo que consiste de "glándula tiroidea, glándula mamaria, glándula salival, nodulo linfoide, glándula mamaria, túnica mucosa gástrica, riñon, ovario, próstata, cerviz, túnica serosa de la vejiga urinaria y nevo", de los cuales se origina el tumor.
6. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende un componente I) de acuerdo con la reivindicación 4 y un componente I) de acuerdo con la reivindicación 5.
7. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el componente II) codifica para al menos una citosina, interleucina, interferon y/o quimosina .
8. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el componente IIIA) codifica para la señal de transporte de hemolisina de Escherichia coli, para la proteína (Rsa A) de capa S de Caulobacter crescentus o para la proteína TolC de Escherichia coli.
9. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el componente IIIB) codifica para una proteína lítica de bacterias gram-positivas , para una proteína lítica de Listeria monocytogenes, para PLY551 de Listeria monocytogenes y/o para el holin de Listeria monocytogenes .
10. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el componente IV) codifica para una secuencia activadora capaz de activarse en el microorganismo, en particular codifica para una secuencia activadora específica de la célula tumoral, específica de la célula de tejido, específica de macrófago, específica de dendrita, específica de linfocito, específica de la función, o la secuencia de activadora no estando específicamente activada a la célula.
11. El microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el componente I) codifica para al menos dos proteínas diferentes.
12. El uso de un microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11 para la producción de un medicamento, en particular para la profilaxis y/o la terapia de una enfermedad, ocasionada por la división celular no controlada o una infección, preferentemente una enfermedad tumoral , en particular un carcinoma de próstata, un carcinoma ovárico, un carcinoma de mama, un carcinoma de estómago, un tumor renal, un tumor de glándula tiroidea, un melanorrta, un tumor de cerviz, un tumor de vejiga urinaria, un tumor de glándula salival, o un tumor de nodulo linfoide, una leucemia, una infección viral o bacterial, una inflamación crónica, un rechazo de órgano y/o una enfermedad auto- inmune.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 para el retiro de un tumor así como del tejido sano del cual se origina el tumor.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde el medicamento se prepara para la administración local, parenteral, oral o rectal.
15. Un método para la producción de un medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 15, en donde un microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11 se prepara en una dosis fisiológicamente efectiva con una o varias sustancias portadoras fisiológicamente toleradas para la administración oral, IM, IV, IP, rectal o local.
16. Un plásmido o vector de expresión que comprende los componentes I) a IV) de acuerdo con la reivindicación 1.
17. Un método para la producción de un microorganismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en donde se produce un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 16, y un microorganismo se transforma con este plásmido o vector de expresión. RESUMEN La invención se refiere a un microorganismo con una secuencia de nucleotidos que codifica para un antígeno celular en el cual se insertan y se expresan los siguientes componentes: I) una secuencia de nucleotidos que codifica para al menos un epítope de un antígeno de una célula tumoral y/o una secuencia de nucleotidos para al menos un epítope de un antígeno que es específico para una célula de tejido a partir de la cual se origina el tumor; II) una secuencia de nucleotidos opcional que codifica para una proteína que estimula las células del sistema inmune; IIIA) una secuencia de nucleotidos para un sistema de transporte que hace posible expresar el producto de expresión de los componentes de I) y, opcionalmente II) sobre la superficie exterior de la bacteria y/o secreta el producto de expresión del componente I) y opcionalmente del componente II) ; y/o IIIB) una secuencia de nucleotidos para una proteína utilizada para lisar los microorganismos en el citosol de células de mamífero y para liberar intracelularmente los plásmidos que se encuentran contenidos en los microorganismos lisados; y IV) una secuencia de activación para expresar uno o varios de los componentes I) a IIIB) , seleccionándose dicha secuencia de activación entre el grupo que consiste de una secuencia de activación que es capaz de activarse en el microorganismo, es específica de células de tejido pero no específicas de células. Cada uno de los componentes I) a IV) pueden ordenarse de manera idéntica o diferente en una manera individual o múltiple. También se describen los usos de tal microorganismo para la producción de un medicamento.