JP2005518795A - 癌治療のための細胞抗原をコードするヌクレオチド配列の担体としての微生物 - Google Patents

Abstract

本発明は、１つの細胞抗原をコードする１つのヌクレオチド配列を含む微生物であって、そのゲノム内に次の成分：Ｉ）腫瘍細胞の１つの抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする１つのヌクレオチド配列および／またはそれから腫瘍が発生する組織細胞に対して特異的な１つの抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする１つのヌクレオチド配列；ＩＩ）必要に応じて、免疫系の細胞を刺激する１つのタンパク質をコードする任意の１つのヌクレオチド配列；ＩＩＩＡ）細菌の外面上で成分Ｉ）および随意のＩＩ）の発現産物を発現する、および／または成分Ｉ）および随意のＩＩ）の発現産物を分泌することを可能にする輸送系をコードする１つのヌクレオチド配列；および／またはＩＩＩＢ）哺乳類細胞の細胞質中の微生物を溶解させるため、および溶解した微生物中に含有されるプラスミドを細胞内に遊離させるために使用された１つのタンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列；およびＩＶ）成分Ｉ）からＩＩＩＢ）の１つもしくは複数を発現させるための、微生物中で活性化可能な、組織細胞特異的、または非細胞特異的である活性化配列が導入されていて発現可能であり、このとき成分Ｉ）からＩＶ）の各々は１つまたは複数配列することができる微生物、ならびに薬剤を製造するための当該微生物の使用に関する。

Description

本発明は、異種ヌクレオチド配列を含む微生物、具体的には、ワクチンである薬剤としてのその使用、異種ヌクレオチド配列を含むプラスミド、ならびに当該微生物を作製する方法に関する。

多くが致死性経過をたどる悪性腫瘍疾患の主要原因は、身体固有の防御機構に悪性癌細胞を認識して死滅させる能力が欠如していることにある。癌疾患は、先進諸国において最も死亡率の高い疾患である。ドイツ国内だけでも致死性悪性腫瘍を原因とする死亡者数は年間２１万人を超えており（出典：ＷＨＯ、１９９７年の統計）、これは人口１０万人当たり２５５人を超える年間死亡率に相当する。

本発明の基礎となったのは、致死性悪性腫瘍を引き起こす分子レベルのメカニズムに関する新規の知識である。癌発生のすでに極めて初期段階において、細胞増殖の制御および／または細胞分化の特徴的な変化が発生している（Ｐｏｎｔｅｎ， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ． ３２：５−３５， １９９８）。これらの変化には、近年になって同定された、すべてが腫瘍抗原でもあるシグナル伝達および細胞周期調節を担うタンパク質が本質的に関与している。

腫瘍抗原は大まかには３つのクラスに分類されている（Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４：５２５−５３１， １９９８）：ｉ）例えばＥＧＦ−Ｒ、ＨＥＲ−２等の腫瘍細胞中に突然変異形および／または過剰発現形で存在する腫瘍特異的新規抗原、ｉｉ）ＭＡＧＥタンパク質ファミリーもしくはＣＥＡ等の腫瘍特異的胎児性抗原、ｉｉｉ）チロシナーゼ、Ｍａｒｔ−１／ｍｅｌａｎ−Ａおよびｇｐ１００等の腫瘍組織特異的分化抗原。

腫瘍ワクチンが有効であるためにはＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的に誘導することが決定的に重要である。これは腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を提示することはほとんどなく、細胞内に存在する腫瘍抗原はほとんどがＭＨＣクラスＩに限定されているためである。腫瘍患者においては、自然に存在するＣＤ８＋の集団である細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が腫瘍細胞を認識かつ排除することが不十分であることが明らかにされている（Ｊａｆｆｅｅ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８６：６７−７２， １９９９）。その上、腫瘍特異的Ｔ細胞はしばしば様々なメカニズム（不応、寛容、中和）のために腫瘍組織を効果的に攻撃することができない（Ｓｍｙｔｈら， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：２９３−２９９， ２００１）。そこで良好な結果を得るためには、腫瘍ワクチンは、これらの不応または寛容を破壊し、十分な数の活性化された特異的ＣＴＬならびに特異的抗体を誘導することができなければならない。特異的抗体の役割は、すでに市販で入手可能なＨＥＲ−２に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（ハーセプチン）等の（ａ）群の腫瘍抗原に対して優れた成果が得られるｍＡｂを使用した場合について、実証されている（Ｃｏｌｏｍｅｒら， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １９：４９−５６， ２００１）。

弱毒化された細胞内細菌が、特にいわゆるＴｈ１免疫応答によって抑制できる一定の細菌感染症に対するワクチン担体として適合することはすでに知られている（Ｈｅｓｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎｎ， ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２３：１６５−１７３， １９９９）。この応答は、ＣＴＬならびに特異的ＩＦＮ−ｇ分泌性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）とも言う）が存在する点で特徴的である（Ａｂｂａｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３８３：７８７−７９３， １９９６）。また別の研究グループは、組換え細菌を使用すると異種組織腫瘍から保護できることを証明した（Ｍｅｄｉｎａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：６９３−６９９， １９９９；Ｐａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：５２６４−５２６９， １９９９；Ｗｏｏｄｌｏｃｋら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２２：２５１−２５９， １９９９；Ｐａｇｌｉａら， Ｂｌｏｏｄ ９２：３１７２−３１７６， １９９８；Ｐａｇｌｉａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：１５７０−１５７５， １９９７；Ｐａｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：４７１−４７７， １９９５；Ｐａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：４７７６−４７７９， １９９５）。もっとも、これらの例では動物は代理抗原に対して免疫され、引き続いてこの抗原を発現する腫瘍細胞が投与された。

だがこれらのモデルではこの腫瘍抗原に対する寛容が存在しなかったので、これらの腫瘍系を臨床的腫瘍とは比較することはできない。

少なからぬ数の様々な腫瘍ワクチンについてはすでに臨床試験が実施されている。だが現在までに腫瘍ワクチンやワクチン接種法を用いた腫瘍疾患の治療における飛躍的進歩は達成できていない。これらの背景を考えると、新規腫瘍療法に対する極めて大きな必要が今なお存在する。

細菌内に導入した核酸配列の発現産物をこの細菌の細胞膜上で発現させる、またはこの細菌から分泌させる方法は知られている。この技術の基礎は、グラム陽性菌のＩ型分泌系のプロトタイプである大腸菌溶血素系ＨｌｙＡｓである。ＨｌｙＡｓを用いて、サルモネラ腸炎菌、エルシニア・エンテロコリチカ菌、およびコレラ菌におけるタンパク質抗原の効果的排除を可能にする分泌ベクターが開発された。このような分泌ベクターは、ＨｌｙＡ−シグナルペプチド、溶血素分泌系であるｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ、ならびにｈｌｙ特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列に結合させられた任意のタンパク質抗原のｃＤＮＡを含有している。この分泌ベクターを用いると、この細菌の表面上でタンパク質を発現させることができる。このような遺伝的に修飾された細菌は、ワクチンとして、導入された核酸から発現されたタンパク質が細胞内に残存している細菌よりもはるかに強力な免疫保護を誘導する（Ｄｏｎｎｅｒらの欧州特許出願第１０１５０２３号、Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖら， Ｇｅｎｅ， １７９：１３３−１４０， １９９６；Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２６２１−２６１８， ２００１， Ｈｅｓｓら，ＰＮＡＳ ９３：１４５８−１４６３， １９９６）。だがこの系には、ｈｌｙ特異的プロモーターを使用して細菌の外面上で発現されるタンパク質の量が極めて少ないという欠点がある。

サルモネラ菌やリステリア菌のような担体細菌によって哺乳類細胞内へプラスミド−ＤＮＡをトランスフェクトするための技術が開発された。これらのプラスミドでは、遺伝子を真核生物細胞プロモーターの制御下に配置すると、含まれる遺伝子を哺乳類細胞中でも発現させることができる。リステリア菌株には、任意の真核細胞プロモーターの制御下に任意の抗原をコードする１つのヌクレオチド配列を含有するプラスミドが導入された。特異的溶血遺伝子をコードする１つのヌクレオチド配列を導入することによって、抗原提示細胞の細胞質内のリステリア菌株が溶解してそのプラスミドを遊離することを引き起こし、引き続いてプラスミドによりコードされるタンパク質の発現、プロセッシングおよび提示を導き、このタンパク質の免疫原性が著明に上昇する（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：１８１−１８５， １９９８；Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２５０６−２５１２， ２００１）。

細胞内に定住している細菌の病原性が弱められた変種が開発された。例えば、リステリア菌、ネズミチフス菌およびチフス菌を含むサルモネラ菌、ならびにウシ結核菌のそのような変種は、すでにチフスおよび結核に対する優れた寛容性の生ワクチンとして使用されている。それらの弱毒化変異体を含むこれらの細菌は、一般に免疫刺激されており、十分な細胞性免疫応答を誘発することができる。例えばリステリア菌は、ＴＨ１細胞の活性化を通して細胞毒性リンパ球の増殖を高度に刺激する。これらの細菌は、分泌された抗原を細胞質抗原提示細胞（ＡＰＣ；マクロファージおよび樹状細胞）内へ直接に供給するが、これらのＡＰＣは他方では共刺激された分子を発現してＴ細胞の効果的刺激を誘発する。リステリア菌は一部には食胞区画内で分解されるので、これらの担体細菌から産生された抗原は一方ではＭＨＣクラスＩＩ分子を通して発現され、そのためにＴヘルパー細胞の誘導を導くことができる。他方では、リステリア菌はＡＰＣの細胞質内の食胞から遊離させられた後に複製する；このためこれらの細菌から産生され分泌された抗原は主としてＭＨＣクラスＩ−経路を介して提示され、これによりこれらの抗原に対するＣＴＬ応答が誘導される。さらに、リステリア菌とマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）および好中性顆粒球との相互作用によって、腫瘍に対して有効であることが確認されているサイトカインの発現が誘導される（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２；Ｕｎａｎｕｅ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， ９：３５−４３， １９９７；Ｍａｔａ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：１４４９−１４４５６， １９９９）。同様に、腫瘍抗原を発現させるために形質導入されたリステリア菌の投与によって、実験的腫瘍の増殖を抗原特異的に阻害することができた（Ｐａｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：４７１−４７７， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：５２６４−５２６９， １９９９；Ｖｏｅｓｔら， Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８７：５８１−５８６， １９９５；Ｂｅａｔｔｙ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５：５５０２−５５０８， ２０００）。

腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列が導入されている、病原性が弱められたサルモネラ菌株は、経口投与後には腫瘍抗原を発現する細菌担体として様々な実験的腫瘍に対する特異的保護を引き起こすことができた（Ｍｅｄｉｎａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０：７６８−７７７， ２０００， Ｚｏｌｌｅｒ ｕｎｄ Ｃｈｒｉｓｔ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：３４４０−３４４５０， ２００１；Ｘｉａｎｇら， ＰＮＡＳ ９７：５４９２−５４９７， ２０００）。

組換えサルモネラ菌株は、ウイルス感染症に対する予防的ワクチン（ＨＰＶ）としても（Ｂｅｎｙａｃｏｕｂら， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６７：３６７４−３６７９， １９９９）、そして腫瘍ウイルス（ＨＰＶ）により不死化されたマウス腫瘍を治療するためにも（Ｒｅｖａｚら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７９：３５４−３６０， ２００１）有効であった。

本発明は、特に腫瘍の予防および治療において腫瘍に対する免疫寛容の破壊をもたらす改良されたワクチンである薬剤を提供するという技術的課題に基づいている。

この技術的課題を解決するために、本発明は細胞抗原をコードする１つのヌクレオチド配列を含む微生物を教示するが、該細胞抗原のゲノム内には以下の成分：Ｉ）１つの腫瘍細胞の１つもしくは複数の抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする１つのヌクレオチド配列、および／またはそれから腫瘍が発生する組織細胞に対して特異的な１つもしくは複数の抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする１つのヌクレオチド配列、ＩＩ）必要に応じて、免疫系の細胞を刺激する１つのタンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列、ＩＩＩＡ）細菌の外面上での成分Ｉ）および随意のＩＩ）の発現産物の発現、および／または成分Ｉ）および随意のＩＩ）の発現産物の分泌を可能にする、輸送系をコードする１つのヌクレオチド配列、および／またはＩＩＩＢ）哺乳類細胞の細胞質内で微生物を溶解させるための、そして溶解させた微生物中に含まれるプラスミドを細胞内で遊離させるための１つのタンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列、およびＩＶ）成分Ｉ）からＩＩＩＢ）のうちの１つまたは複数を発現させるために「微生物中で活性化可能な、組織細胞特異的な、および非細胞特異的な活性化配列」からなる群から選択される活性化配列、を導入して発現させることができ、このとき成分Ｉ）からＩＶ）の各々は１つまたは複数で、同一または様々に配列することができる。本発明はさらに、薬剤を製造するためのそのような微生物の使用も教示する。

したがって本発明の目的は、微生物の外膜上で繰り返し発現または分泌される細胞抗原をコードするヌクレオチド配列の担体である微生物、腫瘍に対する免疫寛容を破壊するためのこれらの微生物の使用、ならびに正常細胞および／または腫瘍細胞の細胞抗原をコードするヌクレオチド配列の担体としての微生物を含有する新規腫瘍ワクチンである。本発明によると、最終的には腫瘍に向けられた免疫反応が誘発される。

詳細には、本発明による微生物は次の成分：Ｉ）１つの腫瘍細胞の少なくとも１つの細胞タンパク質の少なくとも１つの抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、および／または必要に応じて、それから腫瘍が発生する組織細胞に対して特異的な少なくとも１つの抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ＩＩ）必要に応じて、免疫系の細胞を刺激する少なくとも１つのタンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ＩＩＩＡ）成分Ｉ）によってコードされる細胞抗原を膜表面発現または分泌させるための、および成分ＩＩ）によってコードされる免疫刺激タンパク質を分泌させるための輸送系をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ＩＩＩＢ）必要に応じて、微生物中に含まれるプラスミドが細胞質中に遊離されるように細胞質内で微生物を溶解させる溶解素をコードする１つのヌクレオチド配列、ＩＶ）成分Ｉ）およびＩＩ）を発現させるために微生物中で活性化可能もしくは細胞非特異的、腫瘍細胞特異的、組織細胞特異的もしくは機能特異的に活性化可能な活性化配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、を含有する。

下記には、本発明による微生物の成分について詳細に記載する。

成分Ｉ）
成分Ｉ）は、１つの腫瘍細胞の少なくとも１つの細胞タンパク質もしくは少なくとも１つの癌遺伝子が突然変異した細胞タンパク質の少なくとも１つの抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列である。細胞タンパク質の癌遺伝子突然変異は、本来の細胞機能の消失または獲得を引き起こす可能性がある。さらに、この細胞タンパク質は、「受容体分子またはその部分、詳細には受容体の細胞外部分、膜貫通部分もしくは細胞内部分；接着分子またはその部分、詳細には接着分子の細胞外部分、膜貫通部分もしくは細胞内部分；シグナル伝達タンパク質；細胞周期調節タンパク質；分化タンパク質；胎児性タンパク質；およびウイルス誘発性タンパク質」からなる群から選択することができる。このような細胞抗原は細胞内では細胞増殖および細胞分割の調節を担っており、例えばＭＨＣクラスＩ分子により正常細胞の細胞膜上で提示される。多くの場合、腫瘍細胞中で、これらの細胞抗原は過剰発現されているか、または特異的に突然変異している。このような突然変異は、結果として癌遺伝子抑制の機能障害またはプロト癌遺伝子から癌遺伝子への活性化をもたらす可能性があり、単独または過剰発現と一緒になって本質的に腫瘍増殖に寄与する可能性がある。このような細胞抗原は腫瘍細胞によって膜上で提示されるので、したがって腫瘍細胞上の抗原であるが、患者の腫瘍疾患に影響を及ぼす免疫反応を誘発することはできない。Ｒａｐｐ（米国特許第５，１５６，８４１号）によって、腫瘍ワクチンのための免疫原としての腫瘍タンパク質、すなわち癌遺伝子の発現産物の使用はすでに記載されている。この参考文献の箇所を明示的に参照する。

本発明による細胞抗原およびその癌遺伝子突然変異の例は以下の通りである：ｉ）例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、ミッドカイン−受容体、ＥＧＦ−受容体、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＴＲＡＩＬ−受容体、ＦＡＳ、ＴＮＦα−受容体等の受容体、ｉｉ）例えばｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｂｆｌ−１、Ｂｒａｇ−１、Ｍｃｌ−１、Ａｌ、Ｂａｘ、ＢＡＤ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｃｒ／ａｂｌ、Ｍｙｂ、Ｃ−Ｍｅｔ、ＩＡＰ１、ＩＡ０２、ＸＩＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ ＬＩＶＩＮ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＡＰＡＦ−１等のシグナル伝達タンパク質およびそれらの癌遺伝子突然変異；ｉｉｉ）例えばサイクリン−Ｄ（１−３）、−Ｅ、−Ａ、−Ｂ、−Ｈ、Ｃｄｋ−１、−２、−４、−６、−７、Ｃｄｃ２５Ｃ、Ｐ１６、ｐ１５、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１８、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｐ１３０、Ｅ２Ｆ（１−５）、ＧＡＡＤ４５、ＭＤＭ２、ＰＣＮＡ、ＡＲＦ、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ、Ｐ５３およびホモログ等の細胞周期調節タンパク質およびそれらの癌遺伝子突然変異、ｉｖ）例えばＣ−Ｍｙｃ、ＮＦｋＢ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｓｐ１等の転写調節因子およびそれらの癌遺伝子突然変異、ｖ）例えば癌胎児性抗原、α−フェトタンパク質、Ｍａｇｅ、ＰＳＣＡ等の胎児性タンパク質、ｖｉ）例えばＭａｒｔ、Ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＲＰ、ＴＣＦ−４等の分化抗原、ｖｉｉ）例えば次のウイルス：ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ等のウイルス抗原。

あるいは、または追加して、成分Ｉ）はそれから各腫瘍が発生する正常組織細胞に対して特異的な少なくとも１つの抗原に対する少なくとも１つのヌクレオチド配列であってよい。そのような特異的抗原は、例えばｉ）例えばアンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、ラクトフェリン受容体等の受容体、ｉｉ）例えば塩基性ミエリン、α−ラクトアルブミン、ＧＦＡＰ、ＰＳＡ、原線維性酸性タンパク質、チロシナーゼＥＧＲ−１、ＭＵＣ１等の分化抗原、である。

成分ＩＩ）
成分ＩＩ）は、免疫系の細胞を刺激する少なくとも１つのタンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列である。タンパク質を選択することによって、成分Ｉ）の発現産物上の免疫反応を増強することができる、および／またはさらにＴｈ１細胞の活性化（細胞性免疫反応に対して）またはＴｈ２細胞の活性化（体液性免疫反応に）へ方向付けることができる。免疫刺激タンパク質は、例えば、ｉ）Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ等のサイトカイン、ｉｉ）ＩＦＮ−α、−β、−γ、ｉｉｉ）ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）等のインターロイキン、ｉｖ）Ｒａｎｔｅｓ、単球化学走化性活性化因子（ＭＣＡＦ）、マクロファージ炎症タンパク質−１（ＭＩＰ−１−α、−β）、好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２）、ＩＬ−８等のケモカイン、である。

成分ＩＩＩＡ）
成分ＩＩＩＡ）は、微生物の外面上での成分Ｉ、および随意のＩＩ）の発現産物の発現を可能にする少なくとも１つの輸送系をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列である。各成分は、このとき選択的に該微生物から分泌させられる、または該微生物の膜上で、つまり膜表面上で発現させられる。このような輸送系は、例えば、ｉ）大腸菌の溶血素輸送シグナル（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢおよびＨｌｙを含有する１つのヌクレオチド配列）；次の輸送シグナルを使用できる：分泌のために−ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤタンパク質の存在下でＣ末端ＨｌｙＡ−輸送シグナル；膜表面発現のために−ＨｌｙＢタンパク質の存在下でＣ−末端ＨｌｙＡ輸送シグナル、ｉｉ）大腸菌の溶血素輸送シグナル（ｈｌｙ非特異的細菌プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤを含有する１つのヌクレオチド配列）、ｉｉｉ）カウロバクター・クレセンタスのＳ−層タンパク質に対する輸送シグナル（ＲｓａＡ）；次の輸送シグナルを使用できる：分泌および膜表面発現のため−Ｃ−末端ＲｓａＡ−輸送シグナル、ｉｖ）大腸菌のＴｏｌＣ−タンパク質のための輸送シグナル；次の輸送シグナルを使用できる：膜表面発現のため−ＴｏｌＣのＮ−末端輸送シグナル（大腸菌の内在性膜タンパク質ＴｏｌＣは、例えばコリシンＥ１の摂取（Ｍｏｒｏｎａら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３：６９３−６９９， １９８３）およびコリシンＶの分泌（Ｆａｔｈら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３：７５４９−７５５６， １９９１）等の機能とともに、Ｕ３−ファージに対する受容体（Ａｕｓｔｉｎら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２：５３１２−５３２５， １９９０）としても機能する大腸菌の外膜の多機能孔形成タンパク質；このタンパク質は大腸菌内だけではなく、多数のグラム陰性菌内でも見いだされる（Ｗｉｅｎｅｒ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ． ８：Ｒ１７１−１７５， ２０００）；ＴｏｌＣは、外膜内で局在かつ広汎に発生することから、例えば免疫応答を誘発する目的で異種抗原を提示させるための理想的候補である、である。

成分ＩＩＩＢ）
成分ＩＩＩＢ）は、細胞質内で哺乳類細胞を発現させて宿主細胞の細胞質内へプラスミドを遊離させる、少なくとも１つの溶解性タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列である。そのような溶解性タンパク質（エンドリシン）は、例えばＰＬＹ５５１等のリステリア菌特異的溶解性タンパク質（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６：１２３１−４１， １９９５）および／またはリステリア菌プロモーターの制御下にあるリステリア菌特異的Ｈｏｌｉｎである。

本発明の好ましい実施形態は、例えば溶解性タンパク質とＨｏｌｉｎとの組み合わせのような様々な成分ＩＩＩＢ）の組み合わせである。

成分ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢは恒常的に活性であってもよい。

成分ＩＶ）
成分ＩＶ）は、成分Ｉ）および随意のＩＩ）を発現させるための少なくとも１つの活性化配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列である。

発現が微生物の外面上の膜表面で生じる場合は、活性化配列は好ましくは微生物中で活性化可能であるように選択されなければならない。このような活性化配列は、例えば、ｉ）大腸菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子またはｔｅｔＡ遺伝子の「リボソーム結合部位」（ＲＢＳ）を備えるプロモーター領域等の恒常的に活性なプロモーター領域（Ｂｕｓｂｙ ａｎｄ Ｅｂｒｉｇｈｔ， Ｃｅｌｌ ７９：７４３−７４６， １９９４）、ｉｉ）誘導可能なプロモーター、好ましくは細胞中へ取り込まれた後に活性となるプロモーター、である。これらに該当するのは、リステリア菌のａｃｔＡプロモーター（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：１８１−１８５， １９９８）またはネズミチフス菌のｐａｇＣプロモーター（Ｂｕｍａｎｎ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６９：７４９３−７５００， ２００１）である。

微生物のプラスミドがそれらの溶解後に該細胞の細胞質内へ遊離させられる場合には、活性化配列は非細胞特異的、組織細胞特異的、細胞周期特異的または機能特異的である。好ましくはマクロファージ内にある活性化配列が選択されると、樹状細胞およびリンパ球が特に活性化される。

本発明の意味における微生物は、該微生物にとって異種であるヌクレオチド配列を導入するために通常利用されるウイルス、細菌または単細胞寄生生物である。

本発明の特定の実施形態では、微生物はグラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、好ましくは例えば大腸菌、サルモネラ菌、エルシニア腸炎菌、コレラ菌、リステリア菌、シゲラ菌等の細菌である。

好ましくは、その病原性が弱められた細菌が使用される。

本発明による成分は、当業者にはよく知られた方法を用いて微生物中に導入される。微生物が細菌である場合は、該成分はプラスミド内へ導入され、該プラスミドは細菌内へ転移させられる。このために適した技術およびプラスミドは、当業者には十分に知られている。

本発明の目的は、本発明による微生物またはこれらの微生物の膜エンベロープを含有する薬剤調製物である。この膜エンベロープの製造は、例えば欧州特許出願第０，５４０，５２５号に記載の方法によって行われる。そのような薬剤調製物は、例えば注射するために適した薬剤師にはよく知られた溶液に溶解させた本発明による微生物の懸濁液である。

本発明のまた別の目的は、本発明による微生物を含有する薬剤調製物の投与である。この投与は、例えば表皮内、皮下組織内、筋内、体腔内、器官内、腫瘍内または血液循環内へのように局所的または全身的に行われる。

本発明の特別な目的は、増殖性疾患を予防および／または治療するための本発明による薬剤調製物の経口投与または直腸投与である。この投与は単回または複数回実施することができる。各投与では、１０から１０⁹個の範囲内の本発明による微生物が投与される。この範囲内の数の本発明による微生物を投与しても十分な免疫反応が発生しない場合は、注射する数を増加させることができる。

本発明による微生物の投与後には、成分Ｉ）が提示する細胞、例えば腫瘍細胞、またはそれから腫瘍が発生する組織細胞に対する寛容が破壊され、そして腫瘍および／またはその組織細胞に向けられた細胞毒性免疫反応が誘発される。

成分Ｉ）の選択に各々したがって、この細胞毒性免疫反応は腫瘍に向けて、またはそれから腫瘍細胞が発生する組織細胞を含む腫瘍細胞に向けて排他的に方向付けられる。

したがって本発明の目的は、増殖性疾患を予防または治療するための本発明による薬剤調製物の投与である。増殖性疾患には、腫瘍疾患、白血病、ウイルス誘発性疾患、慢性炎症、移植臓器拒絶反応および自己免疫疾患を挙げることができる。

成分Ｉ）が１つの腫瘍細胞およびそれから腫瘍が発生する組織細胞によって発現される少なくとも１つの細胞抗原である本発明の特定の実施形態では、甲状腺癌、乳腺癌、胃癌、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌または膀胱癌を予防または治療するための本発明による薬剤調製物が投与される。

以下では、実施形態に示した実施例に基づいて本発明についてより詳細に説明する。

ｃ−Ｒａｆを発現するサルモネラ菌を用いた免疫によるＢｘＢマウスにおける免疫応答の誘導
Ｒａｆは、シグナルカスケードの他のタンパク質と協働して細胞増殖および細胞生残を制御する、通常は細胞質であるセリン／トレオニンキナーゼ（ＰＳＫ）である（Ｋｅｒｋｈｏｆｆ ａｎｄ Ｒａｐｐ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：１４５７−１４６２， １９９８；Ｔｒｏｐｐｍａｉｒ ａｎｄ Ｒａｐｐ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １４３：２４５−２４９， １９９７）。増殖因子が適切な受容体へ結合すると、通常であればＲａｓの活性化、引き続いてＰＳＫ−およびチロシンキナーゼＭＥＫならびにＰＳＫ ＥＲＫを介しての多数のリン酸化ステップを経由するＲａｆの活性化を介して細胞核内の複製機構の活性化が導かれる（Ｋｅｒｋｈｏｆｆ ａｎｄ Ｒａｐｐ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：１４５７−１４６２， １９９８）。小さなＧタンパク質Ｒａｓであるこの鎖の最初の要素は、すべてのヒトの腫瘍の約３０％において変化して存在する（Ｚａｃｈｏｓ ａｎｄ Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２６：６５−７５， １９９７）。Ｒａｆは、Ｒａｓのエフェクターであり、多数のヒト腫瘍において過剰発現して存在する（Ｎａｕｍａｎｎら， Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １４３：２３７−２４４， １９９７）。

マウスモデルにおける試験には、完全な分子または恒常的に活性なキナーゼドメイン（ＢｘＢ）を過剰発現するトランスジェニックマウスが使用されている（Ｋｅｒｋ−ｈｏｆｆら， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． １１：１８５−１９０， ２０００）。そこでこれらのマウスは約半年後には自然に肺癌を発生する。

ワクチンを作製するために、ＨｌｙＡを含むフレーム内ＰＣＲを用いてヒトｃ−Ｒａｆ ｃＤＮＡをプラスミドｐＭＯｈｌｙ１中にクローニングした（図１）。引き続いてプラスミドｐＭＯ−Ｒａｆを、芳香族物質代謝において１つの欠損を有する弱毒化サルモネラ菌（ネズミチフス菌ＳＬ７２０７）中へトランスフェクトした（Ｈｏｉｓｅｔｈ ａｎｄ Ｓｔｏｃｋｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ２９１：２３８−２３９， １９８１）。抗ｃ−Ｒａｆに対して惹起された抗体を用いた免疫ブロッティングでは、細菌溶解液中においても、ｐＭＯｈｙ−ＲａｆでトランスフェクトしたＳＬ７２０７細菌の培養上清中においても、ｃ−Ｒａｆ ＨｌｙＡｓ融合タンパク質を検出することができた。

７から１０週齢のＢｘＢトランスジェニックマウスをサルモネラ菌の経口投与によりで免疫した（用量５×１０⁹個）。接種は５日間の間隔をおいて２回繰り返した。最終免疫の４５日後に、サルモネラ菌（５×１０⁵個）の静脈内投与により追加免疫を実施した。コントロールとしては、マウスに裸のｃ−ＲａｆをコードするＤＮＡを筋内投与した。

最終免疫の５から７日後、血清サンプルを採取し、ウェスタンブロット法を用いて抗体応答について分析した。このために、１：２００に希釈した血清を、ｃ−Ｒａｆトランスフェクトした細菌またはトランスフェクトしていない細菌から分離したタンパク質およびブロッティングしたタンパク質を含む膜に対してハイブリダイズさせた。結合した血清抗体の検出は、マウス−ＩｇＧに対して特異的な抗体を用いて実施した。コントロールマウスとは対照的に、ｐＭｏｈｌｙ−ＲａｆでトランスフェクトしたＳＬ７２０７を用いて免疫したマウスでは、アイソタイプＩｇＧのｃ−Ｒａｆ特異的抗体を誘導することができた。したがって、上記のサルモネラ菌を用いての免疫は自己寛容を破壊することができ、それらの抗体にとってＩｇＧへのアイソタイプ変化が不可欠であるＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することが証明された。

ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を分析するために、Ｃ５７ＢＬ−６マウスを同じプロトコルにしたがって免疫した。最終免疫の７日後、脾細胞を単離し、Ｒａｆ−過剰発現ＥＬ−４細胞を用いてこれらを刺激した。刺激開始１時間後に、小胞輸送をブレフェルジンＡによって遮断し、さらに４時間後にＣＤ８およびＩＦＮ−ｇに特異的な抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した（Ｍｉｔｔｒｕｃｋｅｒら， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ７０：１９９−２０３， ２００２）。Ｒａｆ−特異的抗体応答は、ｐＭＯ−Ｒａｆ免疫マウスでしか検出できなかった。

殺腫瘍活性を検出するために、１０、１２および１４月齢の免疫した、および免疫していないＢｘＢマウスを屠殺し、肺質量を計量した。肺質量は、腫瘍のサイズを表す直接的な尺度である。１４ヵ月後には、ＳＬ−ｐＭＯ−Ｒａｆを用いて免疫した群では、ｃ−Ｒａｆをコードする裸のＤＮＡ（ＳＬ−ｐＣＭＶ−ｒａｆ）を用いて免疫した群を含む対照群より肺質量が著明に減少したマウスの数が多かった。通例、治療されていない動物の腫瘍増殖が逆転することはあり得ない（Ｋｅｒｋｈｏｆｆら， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． １１：１８５−１９０， ２０００）。したがってこれらのデータは、この実験においてＳＬ−ｐＭＯ−Ｒａｆを用いたワクチンが動物を腫瘍発生から保護することができたこと、そして本明細書に記載した発明が腫瘍ワクチンとして適合することを証明している。

これらの実験は広汎に、本発明で示した担体系を用いると原則として自己寛容が破壊され、そしてｃ−Ｒａｆ寛容動物ではｃ−Ｒａｆ特異的抗体応答およびＴ細胞応答を誘導できることを証明している。

同様の実験系を用いると、Ｃ−Ｒａｆのアイソフォーム（例えばＢ−ＲａｆおよびＡ−Ｒａｆ等）、突然変異Ｃ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆもしくはＡ−Ｒａｆ、正常もしくは突然変異Ｃ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆもしくはＡ−Ｒａｆのエピトープ、または正常および／または突然変異Ｃ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆもしくはＡ−Ｒａｆのエピトープの組み合わせを発現するサルモネラ菌をワクチンとして製造することができる。Ｒａｆの活性消失が現れる突然変異の例は、Ｒａｓ−結合ドメイン、キナーゼドメインおよび／またはリン酸化部位の突然変異である。

ＰＳＡを発現するサルモネラ菌を用いた免疫によるＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の誘導
腫瘍細胞から特異的に大量に合成され発現されるような組織特異的抗原の存在は、このマーカーを診断的に使用可能にするとともに、治療アプローチにとっての潜在的攻撃点を作り出す。前立腺癌については、これまでに３種類の特筆すべき抗原であるＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）およびＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）が同定されている。ＰＳＡはすでに腫瘍形成の初期に過剰発現して存在しており（Ｗａｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３１６６−３１７０， １９８６；Ｗａｎｇら， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２：８９−９６， １９８１）、そして癌診断に寄与するが（Ｌａｂｒｉｅら， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １４７：８４６−８５１；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ８５１−８４２， １９９２）、ＰＳＣＡの発現はたいていが腫瘍の局所的進行期、最終分化期および転移期に初めて増加する（Ｇｕら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：１２８８−１２９６， ２０００；Ｒｅｉｔｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１７３５−１７４０， １９９８）。ＰＳＡもＰＳＣＡも器官特異的であるので、前立腺癌に対する免疫療法を開発する際の潜在的標的抗原となる（Ｒｅｉｔｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１７３５−１７４０， １９９８；Ｈｏｄｇｅら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１−２３７， １９９５；Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９：１８１−１９５， １９９３）。

この試験の目的は、ＰＳＡを分泌するサルモネラ菌がＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるベクターｐＭＯＨＬＹ１に基づいて免疫応答を誘導できるかどうかを明らかにすることであった。そこで、標的ベクター内への増幅フラグメントの「フレーム内」への挿入を可能にするために、まず最初にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて２つのＮｓｉＩ制限部位をＰＳＡのｃ−ＤＮＡ配列内に導入した。増幅のために６４５塩基対（ｂｐ）のフラグメントを選択した。プライマーとしては５’−ＧＴＧＧＡＴＴＧ−ＧＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＣＴＣＡＴＣ−３’および５’−ＣＡＧＧＧＣＡＣＡＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡ−３’を使用した。このＰＣＲ産物をまず最初にベクターｐＵＣ１８内の「平滑末端」にクローニングし、その後、ＮｓｉＩ制限部位を介して標的ベクターｐＭＯＨＬＹ１と連結させた。正確な挿入を制限消化を用いてチェックし、シーケンシングによって確認した（図２）。

このサルモネラ菌株を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを１×１０⁷の用量で３週間の間隔をおいて３回、鼻腔内で免疫した。免疫応答を、ウェスタンブロット分析および細胞内サイトカイン染色によって確認した。

Claims (17)

1. １つの細胞抗原をコードする１つのヌクレオチド配列を含む微生物であって、該細胞抗原のゲノム内では次の成分：
   Ｉ）１つの腫瘍細胞の１つもしくは複数の抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする１つのヌクレオチド配列、および／またはそれから腫瘍が発生する組織細胞に対して特異的な１つもしくは複数の抗原の少なくとも１つのエピトープをコードする１つのヌクレオチド配列、
   ＩＩ）必要に応じて、免疫系の細胞を刺激する１つのタンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列、
   ＩＩＩＡ）細菌の外面上での成分Ｉ）および随意のＩＩ）の発現産物の発現、および／または成分Ｉ）および随意のＩＩ）の発現産物の分泌を可能にする、１つの輸送系をコードする１つのヌクレオチド配列、および／または
   ＩＩＩＢ）哺乳類細胞の細胞質内で微生物を溶解させるための、そして溶解された微生物中に含有されるプラスミドを細胞内で遊離させるための１つのタンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列、および
   ＩＶ）成分Ｉ）からＩＩＩＢ）のうちの１つまたは複数を発現させるために「微生物中で活性化可能な、組織細胞特異的な、および非細胞特異的な活性化配列」からなる群から選択される活性化配列、が導入されていて発現可能であり、このとき成分Ｉ）からＩＶ）の各々を１つまたは複数配列することのできる微生物。
2. 微生物が、特別にはグラム陽性菌またはグラム陰性菌、好ましくは大腸菌、サルモネラ菌、エルシニア腸炎菌、コレラ菌、リステリア菌、およびシゲラ菌からなる群から選択されるウイルス、細菌、または単細胞寄生生物であり、好ましくは該微生物の病原性が弱められた、請求項１記載の微生物。
3. 微生物が細菌のエンベロープである、請求項１記載の微生物。
4. 成分Ｉ）が１つの腫瘍細胞の突然変異した１つもしくは複数のタンパク質の１つもしくは複数の抗原のいずれかのエピトープをコードしており、このタンパク質が好ましくは受容体の接着分子の細胞外部分、膜貫通部分もしくは細胞内部分；シグナル伝達タンパク質；細胞分割調節タンパク質；転写調節因子；分化タンパク質；胎児性タンパク質；およびウイルスタンパク質からなる群から選択され、該タンパク質が好ましくは癌遺伝子産物もしくは抑制遺伝子産物、特別にはｃ−Ｒａｆ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆまたはｃ−Ｒａｆ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆの相同タンパク質である、請求項１から３のいずれか一項に記載の微生物。
5. 成分Ｉ）が、特別にはそれから腫瘍が発生する甲状腺、乳腺、唾液腺、リンパ腺、乳腺、胃粘膜、腎臓、卵巣、前立腺、子宮頸部、膀胱粘膜および乳房からなる群から選択される組織細胞に対して特異的な１つの抗原をコードする１つのヌクレオチド配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の微生物。
6. 請求項４記載の成分Ｉ）および請求項５記載の成分Ｉ）を備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の微生物。
7. 成分ＩＩ）が少なくとも１つのサイトカイン、インターロイキン、インターフェロンおよび／またはケモカインをコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載の微生物。
8. 成分ＩＩＩＡ）が大腸菌の溶血素輸送シグナル、カウロバクター・クレセンタスのＳ−層（Ｒｓａ Ａ）タンパク質、または大腸菌のＴｏｌＣ−タンパク質をコードする、請求項１から７記載にいずれか一項に記載の微生物。
9. 成分ＩＩＩＢ）がグラム陽性菌の溶解性タンパク質、リステリア菌の溶解性タンパク質、リステリア菌のＰＬＹ５５１および／またはリステリア菌のＨｏｌｉｎをコードする、請求項１から８記載にいずれか一項に記載の微生物。
10. 成分ＩＶ）が微生物中で活性化可能なアクチベーター配列、特別には腫瘍細胞特異的、組織細胞特異的、マクロファージ特異的、樹状細胞特異的、リンパ球特異的、機能特異的または非細胞特異的に活性化可能なアクチベーター配列をコードする、請求項１から９のいずれか一項に記載の微生物。
11. 成分Ｉ）が少なくとも２つの相違するタンパク質をコードする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の微生物。
12. 特別には制御不能な細胞分割もしくは感染症によって引き起こされる、好ましくは腫瘍疾患、特別には前立腺癌、卵巣癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、甲状腺癌、メラノーマ、子宮頸癌、膀胱癌、唾液腺癌もしくはリンパ腺癌、白血病、ウイルスもしくは細菌感染症、慢性炎症、臓器拒絶反応および／または自己免疫疾患を予防および／または治療するための薬剤を製造するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の微生物の使用。
13. たとえ健常組織であってもそこから腫瘍が発生する組織を切除するための、請求項１２記載の使用。
14. 薬剤が局所投与、非経口投与、経口投与または直腸投与するために調製されている、請求項１２または１３記載の使用。
15. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の微生物が経口投与、筋内（ｉ．ｍ．）投与、静脈内（ｉ．ｖ．）投与、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、直腸投与または局所投与するための１種もしくは複数の生理的に適合する担体物質とともに生理的有効量で製造される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の薬剤の製造方法。
16. 請求項１記載の成分Ｉ）からＩＶ）を含有するプラスミドまたは発現ベクター。
17. 請求項１６記載のプラスミドまたは発現ベクターが作製され、該プラスミドまたは発現ベクターを用いて微生物が形質転換される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の微生物の製造方法。

Images