KR101104077B1 - Ｅｇｒ－１의 발현을 증가시키는 활성을 갖는 신규한 엔터로박테리아속에 속하는 신규균주 및 그 균주를 포함하는 조성물의 항암제로서의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002)에 속하는 신규균주 및 그 균주를 포함하는 조성물에 대한 발명으로, 더욱 상세하게는 Early Growth Response-1(Egr-1)의 발현을 증가시키는 활성을 갖는 미생물 KACC 91399P 또는 그 균주 배양물의 항암제로서의 이용에 대한 발명이다.
항암제, Egr-1

Description

Ｅｇｒ－１의 발현을 증가시키는 활성을 갖는 신규한 엔터로박테리아속에 속하는 신규균주 및 그 균주를 포함하는 조성물의 항암제로서의 용도 {A novel Enterobacteriaceae sp. Ahn002 and use of anti-cancer agent comprising the strain showing regulatory effect on Early Growth Response-1}
본 발명은 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002)에 속하는 신규균주 및 그 균주를 포함하는 조성물에 대한 발명으로, 더욱 상세하게는 Early Growth Response-1(Egr-1)의 발현을 증가시키는 활성을 갖는 미생물 KACC 91399P 또는 그 균주 배양물의 항암제로서의 이용에 대한 발명이다.
일반적으로 Early Growth Response-1 (Egr-1)은 세포의 성장과 분화를 조절하는 전사 인자(transcription factor)이다. 이는 TGF-β1, p21, p53, PTEN, fibronectin 등의 다양한 암 억제 유전자들을 상위에서 직접적으로 유도함으로서 세포성장을 조절하여 암 발생을 억제하는 기능을 가진다 (Krones-Herzig et al. Cancer Res 2005;65:5133, Baron et al. Cancer Gene Ther 2006;13:115).
Egr-1의 발현은 많은 종류의 암세포의 성장을 현저하게 감소시키며, 발암성(tumorigenesis)을 저해시킨다(세포성장을 조절하여 암 발생을 억제하는 기능을 가진다 (Krones-Herzig et al. Cancer Res 2005;65:5133, Baron et al. Cancer Gene Ther 2006;13:115). 다양한 암세포에서 Egr-1의 발현 정도는 적거나 전혀 발현되지 않으며, Egr-1의 부족은 암을 형성하는데 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다(Huang et al. Int J Cancer 1997;72:102, Huang et al. Cancer Res 1995;55:5054). 사람 섬유성 육종 HT1080 세포, 골육종 SaOS2 세포, 신경교아세포종 U251 세포, 유방암 ZR75-1 세포 등에 Egr-1을 과발현 시키면 암세포에서의 DNA 합성능이 감소되고 세포성장 속도가 억제되었으며 (Huang et al. Cancer Res 1995;55:5054), 사람 섬유성 육종 HT1080 세포에 Egr-1 유전자를 도입시키면 TGFβ1과 fibronectin, plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)들의 유전자 발현이 증가되어 암세포 성장이 정지되고 전이능이 감소된다 (Liu et al. J Biol Chem 1999;274:4400). 따라서 Egr-1은 암치료제 개발의 유효한 표적물질이라 하겠다.
본 발명의 목적은 상기의 상기의 필요성에 의하여 도출된 것으로서 본 발명의 목적은 암 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 본 발명은 Egr(Early Growth Response)-1 발현 증가에 활성을 나타내는 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp. Ahn002)에 속하는 미생물 균주를 제공한다.
본 발명의 균주는 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp. Ahn002) KACC 91399P인 것이 바람직하며, 2008년 10월 07일 대한민국 농업생명공학원구원(경기도 수원시 권선구 서둔동 225 (우)441-707)에 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002)Ahn 002라는 균주명과 기탁번호 KACC 91399P로 기탁하였다.
또한 본 발명은 Egr-1 발현 증가에 활성을 나타내는 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.)에 속하는 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제제를 제공한다.
본 발명에서 사용된 균주는 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.) KACC 91399P인 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 Egr-1 유전자 프로모터의 발현 증가 현상이 암 세포의 진행을 억제하는 주요한 요인으로 작용하는 것에 착안하여 Egr-1 유전자 프로모터의 발현 증가에 효과적인 조성물을 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.)에 속하는 신규균주 및 그 균주를 포함하는 조성물에서 찾고자 예의 노력한 결과 미생물 KACC 91399P 배양액이 Egr-1의 발현에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 첫째, 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002) KACC 91399P균을 제공하고,
둘째, 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.) KACC 91399P균의 16S rRNA의 유전자 염기배열 구조가 하기와 같은 특이한 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002) KACC 91399P균을 제공하며, - 전체염기서열의 상동성 : Shigella flexneri와 99%의 상동성을 가진다.
셋째, 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002) KACC 91399P균의 배양액 제조 방법을 제공하며,
넷째, 항암제로서의 사용을 위해서 상기 배양액의 처리를 특징으로 하는 항암제 조성물을 제공한다.
일반적으로 Enterobacteriaceae 계열은 포도당을 발효할 수 있는 작은, 그램-음성, 옥시데이즈 음성인 포자를 형성하지 아니하는 간균이다. 이들 균주들은 장관, 물, 토양, 야채 및 육류 및 유류 가공품과 같은 식품 원료 등에서 서식하는 것으로 발견된다. 이중 대장균, 살모넬라 및 시겔라와 같은 인간 병원성인 것도 알려졌다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 세균의 성질에 따른 적당한 조건하에서 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 15 ～ 45℃에서 배양할 수 있지만, 바람직하게는 20 ～ 42℃, 더욱 바람직하게는 25℃ ～ 38℃ 에서 배양하는 것이 좋다.
또한, 배양 방법은 정치 배양, 왕복동식 진탕 배양, 회전동식 진탕 배양, 자 퍼멘터 (jar fermenter) 배양 등에 의한 액체 배양법이나 고체 배양법을 사용할 수 있다.
배양에 사용하는 배지 성분도 특별히 제한되지 않고, 탄소원으로서 글루코오스, 갈락토오스, 락토오스, 아라비노오스, 만노오스, 수크로오스, 전분, 전분 가수분해물, 당밀 등의 당류, 시트르산 등의 유기산류, 글리세린 등의 알코올류를, 질소원으로서 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 등의 암모늄염류나 질산염류들, 또한 염화나트륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 질산칼슘, 염화망간, 황산제일철 등의 무기 염류, 펩톤, 대두분, 탈지 대두 지게미, 고기 엑기스, 효모 엑기스 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용된 벤넷 배지는 0.1% 효모추출물(yeast extract), 0.1% 쇠고기 추출물(beef extract), 0.2% 트립톤(tryptone), 1% 포도당(glucose), 1.5% 한천(agar, pH 7.2, 숙성해수:증류수=7:3), ISP-2(International Streptomyces Project-2, 3.74%, pH 7.2, 숙성해수:증류수=7:3, Difco, USA), ISP-4 (International Streptomyces Project-4, 3.74%, pH 7.2, 숙성해수: 증류수=7:3), Starch-casein KNO3, 1% 가용성 전분(soluble starch), 0.03% 카제인(casein), 0.2% 질산칼륨(KNO3), 0.2% 제2인산칼륨(K2HPO4), 0.2% 염화나트륨(NaCl), 황산제일철 수화물(FeSO47H2O), 황산마그네슘 수화물(MgSO47H2O) 및 탄산칼슘(CaCO3)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp. Ahn002) KACC 91399P균의 배양액을 항암제로서 사용할 수 있음을 보여주고 있다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시 예를 통하여 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
신규한 엔터로박테리아속 ( Enterobacteriaceae sp. Ahn002) KACC 91399P균의 배양을 위한 선택 배지 선정
선발된 균주 KACC 91399P는 현탁배양을 위해 nutrient배지를 이용하였다. 배지의 조성은 Agar 15 g/L, Beef extract 3 g/L, peptone 3 g/L로 조성되며, 배양온도는 28℃, pH 7.2에서 진탕시키며 10일간 배양한다.
[실시예 2]
신규한 엔터로박테리아속 ( Enterobacteriaceae sp. Ahn002) KACC 91399P균의 형태적 관찰
순수 분리한 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002) KACC 91399P균주를 Bennet 배지에서 배양하여 주사현미경 (Scanning Electron Microscope)으로 형태를 관찰하였다 (도 1).
[실시예 3]
신규한 엔터로박테리아속 ( Enterobacteriaceae sp. Ahn002) KACC 91399P균의 16S rRNA 유전자염기서열 분석
신규 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.) KACC 91399P균의 유전적 분석을 실시하고, 이를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열분석을 다음과 같이 수행하였다. DNA 추출을 위하여 Bennet 배지에 7일간 현탁배양한 후 배양액을 원심분리 하여 cell을 분리하였다. DNA 추출은 Genomic DNA Extraction Kit (Intron)를 이용하여 추출하였다. PCR은 반응용액(10 mM Tris, pH 8.3; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 1 unit Taq DNA polymerase)에 0.2ug genomic DNA , 0.25 uM 16S rRNA 유전자 primer 4 쌍이 표 1과 같이 조합하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편의 크기가 A조합은 900 base-pair (bp), B조합은 480 bp, C조합은 1200 bp, D조합은 800 bp가 되도록 하였다. PCR 반응 (초기 94℃ 5분 1회; 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분, 35cycle; 72℃ 5분 1회)한 후 증폭된 16S rRNA 유전자 일부분을 pGEM-T Easy vector (promega)에 ligation한 후, 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균은 선발배지(1.5% agar, 50mg/L ampicillin, 100uM IPTG, 50mg/L X-gal)에 도발하여 37℃에서 12 시간 배양하였다. 증폭된 16S rRNA 유전자조각의 vector로의 삽입은 blue/white colony로 1차 선발하고, 이중 white colony만을 LB배지에 접종하여 배양하였다. 배양액은 plasmid분리를 위하여 원심분리한 후 Alkaline lysis방법을 이용하였다. 분리된 plasmid는 제한효소 EcoR1으로 절단 후 전기영동을 통하여 증폭된 16S rRNA 유전자조각의 삽입을 확인하였다 (도 2).
증폭된 16S rRNA 유전자 염기서열의 확인을 위하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 이용하여 homology를 확인하였고 그 결과 엔터로박테리아 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002) Shigella flexneri 와 99%의 상동성을 보였다.
Primer pair 염 기 서 열
A 5‘-CAAGCGTTGTCCGGAATTAT(서열정보1)
5‘-TTCGGGTGTTACCGACTTTC(서열정보2)
B 5‘-CAAGCGTTGTCCGGAATTAT(서열정보1)
5‘-ATCTCTGGATGTTTCCGGT(서열정보3)
C 5‘-GATACGACTCAGGACCGCAT(서열정보4)
5‘-TTCGGGTGTTACCGACTTTC(서열정보2)
D 5‘-GATACGACTCAGGACCGCAT(서열정보4)
5‘-ATCTCTGGATGTTTCCGGT(서열정보3)
상기 표 1은 16S rRNA 유전자의 PCR 및 염기서열분석에 사용된 primer에 대한 서열이다.
[실시예 4]
EGR-1 유전자 프로모터 분석
본 발명은 Egr-1 발현에 대한 미생물 KACC 91399P 배양액의 활성 증가 효과 여부를 관찰하기 위하여, 플라스미드 DNA (0.5μg Egr-1 프로모터 부위가 클로닝되어있는 플라스미드로써, 리포터인 루시퍼라제 효소 발현을 유도시킴으로써, 유전자 프로모터 활성을 측정하기 위한 플라스미드)를 U-87MG 세포에 트랜스팩션한 후, KACC 91399P 미생물배양액을 처리하면, 미생물배양액에 존재하는 생리 활성 물질에 의해 U-87MG 세포에 주입된 플라스미드에 삽입되어 있는 EGR-1 프로모터 부위가 활성화되어 루시퍼라제 효소 단백질이 생성되고, 이후 루시퍼린을 투여하여 생성된 루시퍼라제 효소는 기질인 루시페린을 산화시켜 형광을 발생시키게 하고 이 발현된 형광 양의 정도를 측정하였다. 재현성을 위해 실험을 두 번 반복하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 미생물 KACC 91399P 배양액을 처리한 후 Egr-1 유전자 발현이 약 7배 정도 증가함을 알 수 있었다. 미생물배양액을 처리하였을때 형광이 발생된다는 사실은 미생물배양액에 Egr-1 유전자 프로모터 활성을 촉진시키는 물질이 존재하는 것으로 간주되며, Egr-1 프로모터 활성 증가는 Egr-1 유전자 발현 증가를 의미하게 된다. 따라서, 형광의 발광 정도는 Egr-1 유전자 발현 정도를 의미하게 된다.
삭제
도 1은 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp. Ahn002)KACC 91399P균주를 Bennet 배지에서 배양하여 주사현미경 (Scanning Electron Microscope)으로 관찰한 결과이다.
도 2는 신규한 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002) KACC 91399P균주의 16S rRNA 유전자분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.Ahn002) KACC 91399P균주의 배양액을 처리한 후 Egr-1의 발현 활성 효과를 알아보기 위한 유전자 프로모터 분석을 나타낸 결과이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A novel Enterobacteriaceae sp. Ahn002 and use of anti-cancer agent comprising the strain showing regulatory effect on Early Growth Response-1 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer A <400> 1 caagcgttgt ccggaattat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer A <400> 2 ttcgggtgtt accgactttc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B <400> 3 atctctggat gtttccggt 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer C <400> 4 gatacgactc aggaccgcat 20

Claims (4)

  1. 엔터로박테리아속 (Enterobacteriaceae sp.) Ahn002 KACC 91399P 균주 자체 배양액을 이용하여 초기 성장 반응인자(Early Growth Response)-1 유전자 발현 활성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
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