KR101245335B1 - 세균 전달 시스템 - Google Patents

세균 전달 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR101245335B1
KR101245335B1 KR1020077005856A KR20077005856A KR101245335B1 KR 101245335 B1 KR101245335 B1 KR 101245335B1 KR 1020077005856 A KR1020077005856 A KR 1020077005856A KR 20077005856 A KR20077005856 A KR 20077005856A KR 101245335 B1 KR101245335 B1 KR 101245335B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
helicobacter
variant strain
genus
strain
cell
Prior art date
Application number
KR1020077005856A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070083558A (ko
Inventor
배리 제이. 마샬
Original Assignee
배리 제이. 마샬
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2004904564A external-priority patent/AU2004904564A0/en
Application filed by 배리 제이. 마샬 filed Critical 배리 제이. 마샬
Priority claimed from PCT/AU2005/001211 external-priority patent/WO2006015445A1/en
Publication of KR20070083558A publication Critical patent/KR20070083558A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101245335B1 publication Critical patent/KR101245335B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K2039/106—Vibrio; Campylobacter; Not used, see subgroups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 약리 활성 분자를 포함하는 헬리코박터를 기본으로하는 조제물, 상기 조제물의 제조 방법 및 이용방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 질병에 대한 치료제 및/또는 백신접종에 유용한 약리 활성 분자를 코딩하는 서열을 포함하는, 헬리코박터 필로리 벡터, 벡터 플라스미드 및 재조합 세포를 제공한다. 상기 약리 활성 분자는 위 점막 또는 코 점막과 같은 점막 표면에 전달하여, 약리 활성 물질의 유효하며 연속적인 전달을 제공한다. 또한, 벡터 및 또는 셔틀 벡터 구조체도 제공한다.
헬리코박터, 전달 시스템

Description

세균 전달 시스템{BACTERIAL DELIVERY SYSTEM}
본 발명은 생리 활성 물질의 생체내 전달에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 생체내에서 직접 생리 활성 물질을 해부학적인 부위에 전달하는 세균 시스템을 이용하여 질병을 치료, 완화 또는 예방하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 있어서, 세균 전달 시스템은 이종의 핵산을 동물이나 동물 세포에 전달하기 위한 헬리코박터 특징을 나타내는 세균을 포함하며, 이 시스템에서 상기 이종 핵산이 발현된다. 본 발명의 다른 예에 있어서, 헬리코박터는 이종의 핵산을 코딩하는 DNA 벡터를 포함하도록 조작되어, 감염되면 생리 활성 물질이 동물의 신체, 특히 점막에 전달되도록 상기 핵산 벡터가 발현된다.
선천적인 질환과 후천적인 질환이 있는 환자에게 약제와 면역제의 장기간 계속적인 전달이 필요하다. 이러한 방법에는 대부분의 경우, 1일, 매일 또는 특정 간격으로 치료 화합물을 수 회 반복 투여하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 장기간의 치료 또는 예방 요법이 순응도(compliance), 부작용 및 약물 내성과 같은 문제점을 가지고 있는 것으로 인식되고 있다. 따라서, 100% 효과가 있으며, 부작용이 없고, 저렴한 치료 방법을 찾아내고자 하는 요구가 여전히 존재하고 있다.
최근 다양한 치료제 및 예방제에 대해 연구되고 있는 전달 형태는 미생물을 이용하는 것이다. 세균, 바이러스, 기생 동물 및 포유류를 포함한 다양한 미생물로부터 유래된 대상 유전자를, 미생물에서 외부 단백질을 발현시키거나 또는 임의의 원하는 특성을 부여하기 위한 목적으로, 예컨대 다양한 세균, 바이러스 및 마이코박테리아에 클로닝한다. 이들 미생물은 백신접종(vaccination) 프로그램, 유전자 치환 요법 및 치료 조성물 전달에 사용되고 있다.
또한, 미생물은 동물(숙주) 세포를 생체내에서 형질전환시키는데 사용되고 있다. 숙주 세포 형질전환은 복제 부적격 바이러스(incompetent virus)를 포함하는 유전자 전달 벡터(예, 미국 특허 5,824,544), 네이키드 DNA(naked DNA)(예, 미국 특허 6,261,834), 재조합 발현 카세트를 포함하는 리포좀(예, 미국 특허 6,271,207)을 이용하여 수행할 수 있다. 그외 분자를 기본으로 하는 치료 조성물의 전달 방법은 이종 표면 단백질을 발현하도록 고안한 복제 부적격 재조합 바이러스를 이용하는 방법을 포함한다(예, 미국 특허 6,376,236).
최근, 약학자들은 재조합 유기체 벡터, 무생물 벡터 및 네이키드 DNA를 이용하여 생체내에서 치료 조성물을 발현시키는 방법을 개발하고자 시도하고 있다. 재조합 유기체 벡터의 예로는 재조합 세균(예, 미국 특허 5,547,664)와, 알파바이러스(예, 미국 특허 6,391,632), 백시니아 바이러스(예, 미국 특허 6,267,965), 아데노바이러스(예, 미국 특허 5,698,202) 및 아데노바이러스 조합 바이러스(adenovirus associated virus, AAV)(예, 미국 특허 6,171,597)와 같은 바이러스가 있다. 무생물 바이러스로는 DNA/앙이온성 리포좀 컴플렉스, 중성 또는 음이온성 리포좀에 캡슐화된 DNA, 및 리포좀-포획된, 폴리양이온-축합성 DNA(LPDI 및 LPDII)와 같은, 지질 유전자 전달 벡터 구조체가 있다(Ropert, 1999, Braz J Med Biol Res, 32(2):163-9).
그외 다양한 세균에 의한 유전자 전달의 예로는 시겔라(Shigella)의 침투성 유전자를 정상적으로 비침투적인 E.coli에 클론닝하여 E.coli 침투성을 부여하고, 다라서 백신 균주로서 사용하기에 보다 적합하게 하는 방법, 또는 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)의 말라리아 유전자를 이후 상기 말라리아의 단백질을 발현하게 되는 살모넬라 티피무리움에 클로닝하고, 이 세균을 투여함으로써 말라리아 기회 감염에 대한 마우스의 특이적인 세포독성 T 세포의 면역성 및 방어를 유발하는 방법이 있다(예, Hone et al., 1991, Vaccine, 9:810-816; Tacket et al., 1992, Infect. Immun., 60:536-541; Hone et al., 1992, J. Clin. Invest., 90:412-420; Chatfield et al., 1992, Vaccine, 10:8-11; Tacket et al., 1992, Vaccine, 10:443-446; and Mims et al., 1993, In: Medical Microbiology, Eds., Mosby-Year Book Europe Ltd., London; Sadoff et al., 1988, Science, 240:336-338; Aggrawal et al., 1990, J. Exp. Med., 172:1083-1090).
약독화된 또는 저병독성의 시겔라(예, Noriega et al., 1994, Infect. Immun., 62:5168-5172; 미국 특허 출원번호 20020176848), 살모넬라(예, 미국 특허 6,531,313; 미국 특허 출원번호 20030170211), 리스테리아(예, Schafer et al., 1992, J. Immunol., 149:53-59; 미국 특허 출원번호 20030008839), 및 그외 세균을 경구로 제공하여, 이들 세균의 병독성이 높은 형태에 의한 차후 감염에 대해 면역화 한다. 이처럼, 약독화된 세균 및 마이코박테리아 유기체, 예컨대 칼메트 구에 린 간균(BCG)(Lagranderie et al., 1993, Vaccine, 11:1283-1290; Flynn, 1994, Cell. Molec. Biol., 40(Suppl. 1):31-36)은, 미코박테리아 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 같은 관련 유기체로부터 보호하기 위한 목적으로 비경구로 투여되고 있다.
벡터로 이용되고 있는 다른 일부의 세균 종으로는 예르시니아 엔테로콜라이티카(Yersinia enterocolitica)(van Damme et al., 1992, Gastroenterol., 103:520-531)와 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)(Levine et al., 1994, In: Vibrio cholerae, Molecular to Global Perspective's, Wachsmuth et al., Eds, ASM Press, Washington, D.C., pages 395-414)가 있다.
수많은 연구에도 불구하고, 전술한 세균 전달 시스템은 기술적인 어려움이 있으며, 따라서 생체내에서 사용하기 전에 이러한 어려움을 해결할 필요가 있다. 실제, 대부분의 세균 시스템은, 기능성 분자를 생산하기 위해 세균 그 자체를 필요로하며, 인간에게서 사용하기에 안전하도록 충분히 약독화되어있지만 여전히 생리 활성 물질을 생산할 수 있는, 세균에 의존적이다. 그러나, 기존에 사용되는 약독화된 세균 균주들이 모두 부작용을 야기하지 않으면서 생체내에서 장기간 생존할 수 있는 것은 아니다. 더욱 중요한 점은, 이들 다수의 세균 종들은 동물의 점막 상피 세포에 치료제 또는 예방제를 전달할 수 없다는 것이다. 그러나, 많은 대다수의 중요한 치료제들은 점막을 통해 흡수되므로, 따라서, 생리 활성 물질을 점막에 직접 전달할 수 있는 세균 전달 시스템이 필요한 실정이다.
Powell 등은 미국 특허 5,877,159에서, 감염을 발병으로 전개시키거나 질병 을 야기하지 않으면서 점막 세포에 침입할 수 있으며, 따라서 동물 세포에서 발현될 수 있는 항원을 코딩하는 진핵 발현 카세트를 도입할 수 있는 생세균이 개시되어 있다. 이러한 방법은 개발도상국가에서 백신 전달의 관심사인 용이한 투여를 포함하여 DNA 백신의 점막 표면으로의 전달을 허용하지만, 대상 유전자를 코딩하는 증폭가능한 mRNA를 제공하는 효과는 없다. 또한, Powell 등에 개시된 세균은 약제를 지속적으로 전달할 수 없다.
비-병원성, 비-집락성(non-colonising), 비침투성의 식품-등급 세균인 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)는 종래에 점막에 물질을 전달하기 위해 사용되고 있다(예, UK patent GB-2278358B). 그러나, 락토코커스 락티스는 비-침투성이며, 만성 감염을 확립할 수 없으며, 치료제를 점막 상피 세포에 직접 전달하진 못한다.
따라서, 생리 활성 물질을 종물의 점막 상피 세포에 전달할 수 있도록 이 점막 상피 세포에 근접하여 비침투성인 만성 감염을 확립할 수 있는 전달 시스템이 계속적으로 요구되고 있다. 또한, 점막 표면에 약리 활성 분자를 전달하는 유용하고 이로운 면역 반응을 도출할 정도로 충분히 개선된 전달 메카니즘도 계속적으로 요구되고 있다. 이러한 메카니즘은 약리 활성 물질에 대해 효과적인 생체내 전달 시스템, 및 효과적인 면역화 방법 즉, 일반적인 체액성 및 점막 면역 반응을 도출할 정도로 충분히 항원을 점막 표면에 노출시키는 전달 시스템을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 몇가지 예가 이하 설명되어 있다.
본 발명자들은 만성 감염을 형성할 수 있는 헬리코박터, 특히 헬리코박터 필로리를 사용하여 약물의 연속적인 전달을 이룰 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 본 발명의 헬리코박터는 다양한 시점에 활성화 및 불활성화될 수 있으며, 이의 만성적인 특징으로 인해 헬리코박터룰 사용하여 위 점막을 통해 약물을 전달할 수 있다.
헬리코박터 필로리는 인간의 위 점막에서 거의 광범위로 발견되는 그람 음성의 구형 세균이다. 인간의 위 산도는 본질적으로 헬리코박터 종 이외의 모든 세균의 집락 형성에 유효한 장벽이다.
헬리코박터 필로리는 점막 염증 및 면역 반응 발생에도 불구하고 수년간 인간의 위 점막내에서 집락을 형성 및 생존할 수 있는 독특한 능력을 가지고 있다. 이러한 특징은 헬리코박터 필로리가 점막을 통해 선택 물질을 전달하는데 흥미로운 후보물질이 되게 한다.
일부 측면에서, 본 발명은 프로모터 부위와 비-헬리코박터성 약리 활성 분자를 코딩하는 비-헬리코박터성 서열을 가지는 헬리코박터 서열을 포함하는, 헬리코박터를 기본으로하는 구조체를 제조 및 이용하기 위한, 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 이러한 구조체는 일부 예에서 벡터 또는 플라스미드 벡터로 기재되며, 상기 프로모터 서열은 상기 비-헬리코박터성의 대상 약리 활성 분자의 발현을 통제할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 하나 이상의 생리 활성 물질을 발현하는 헬리코박터 세포 또는 헬리코박터의 특성을 가지는 세균성 세포를 유효량으로, 바람직하기로는 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에게 하나 이상의 생리 활성 물질을 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 측면은 하나 이상의 이종의 생리 활성 물질을 발현하는 비침투적이거나 또는 비-병원성 헬리코박터 세포를 제공한다.
바람직하기로는, 상기 헬리코박터는 헬리코박터 필로리 종이다.
상기 생리 활성 물질은 헬리코박터 속과 상동이거나 또는 전달에 사용되는 헬리코박터 세포의 속이나 종인 세포에 이종적일 수 있다. 이종적인 물질은 진핵이나 원핵 원(source)으로부터 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 상기 헬리코박터를 기본으로 하는 벡터와 벡터 플라스미드 구조체는 생리 활성 물질, 예컨대, 항원, 유기 또는 무기 분자 또는 물질, 약리학적 물질, 예, 유전자 산물 또는 유전자 서열(분리된 핵산)과 같은 치료제 또는 예방제를 포함한다. 예를 들면, 상기 물질은 면역조절 물질, 호르몬, 리간드, 효소 또는 안티센스 RNA, 촉매성 RNA, 단백질, 펩티드 또는 동물이나 동물 세포로 전달될 수 있도록 세균성 세포에 존재하거나 또는 세균성 세포로부터 분비될 수 있는 그외 분자를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 상기 생리 활성 물질은 핵산 분자, 바람직하기로는 분리된 형태로 수득되며, 이후 본 발명의 세균성 전달 비히클에 삽입되는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 당업자라면, 본 발명의 분리된 핵산 분자가 cDNA, 게놈 DNA, RNA, 또는 그의 혼성 분자일 수 있음을 알 것이다. 바람직하기로는, 상기 핵산은 cDNA이다.
예컨대, 대상 단백질 및/또는 펩티드는 그렐린, 아밀린(amylin), 인슐린, 모틸린, β-글루코시다제, 화합물 샤페론(chemical chaperone), 또는 그외 고셰병, 세포 쇠퇴(cell wasting), 인간 면역결핍성 질환(AIDS), 식욕 억제의 치료에 유용한 분자, 당뇨병 치료에 유용한 조제물을 포함할 수 있다.
상기 분리된 핵산은 바람직하기로는 헬리코박터 세포에 형질전환되어 유지될 수 있는 발현 벡터에 병합된다.
따라서, 본 발명의 제3 측면은 필요한 해부학적 부위로 직접 생리 활성 물질을 전달하기 위한 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 헬리코박터 세포는 바람직하기로는 상기 생리 활성 물질을 그 표면에서 분비 및/또는 발현하도록 개조된 것이다.
본 발명의 제4 측면은 유효량의 생리 활성 물질을 생체내로 전달하기 위한 벡터 또는 구조체를 제공하며, 이는
a) 생리 활성 물질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
b) 그것에 작동가능하게 연결된, 상기 벡터를 포함하는 전달 비히클이 개체에 전달되었을때 상기 생리 활성 물질이 생체내에서 생산되도록, 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는 통제 또는 조절 서열을 포함한다.
상기 벡터는 화학적 또는 효소적 처리 방식으로 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생체내 변형되어, 변형된 또는 변이체 벡터를 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 이러한 구조체는 예컨대 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결손 또는 삽입에 의해, 개시된 바과 상이할 수 있지만, 구조체, 핵산 분자, 또는 그것에 의해 코딩된 산물의 원하는 생리 활성은 실질적으로 유지된다.
본 발명의 다른 예로, 헬리코박터 벡터 또는 구조체에는 발현 벡터로 클로닝되는 구성적 프로모터로부터 발현되며, 스크리닝 도구로서 사용되는 리포터 유전자(들)가 갖추어져 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 리포터 유전자의 비제한적인 예로는, 푸른 형광 단백질(GFP), β-갈락토시다제, 아밀라제 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)가 있다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 헬리코박터 세포를 사용하여 이를 필요로하는 개체에게 대상 이종 유전자를 전달한다. 상기 대상 유전자는 치료 산물(트랜스유전자 산물)을 코딩할 수 있으며, 비제한적으로 펩티드 호르몬(비제한적인 예로, α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH), 인슐린, 성장 호르몬 및 부갑상선 호르몬), 인터페론, 인터루킨 (IL)-2, IL-4, IL-10, IL-12, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및 에리트로포이에틴(EPO)과 같은 사이토카인이 포함된다.
또다른 예로, 본 발명은 개체의 질환을 치료, 완화 및 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료 또는 예방 조성물의 사용으로 조장된다. 따라서, 본 발명의 제5 측면은 (a) 생리 활성 물질을 발현 및/또는 분비하는 살아있는 비-병원성 헬리코박터 세포와 (b) 치료학적으로 유효한 담체를 포함하는 약리학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 이를 필요로하는 개체에게 생리 활성 물질을 발현하는 본 발명에 따른 헬리코박터 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 치료, 완화 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 비제한적인 개체의 예는, 영장류, 말, 소, 돼지, 양 및 설치류와 같은 포유류를 포함할 수 있다. 또한, 어류 및 조류도 포함된다.
본 발명의 일예에서, 상기 치료, 완화 또는 예방되는 질환은, 암, 면역/조혈계 질환 또는 증상, 생식계 질환 또는 증상, 근골격계 질환 또는 증상, 심혈관계 질환 또는 증상, 혼합성 태아(mixed fetal)로 설명되는 질환 또는 증상, 배설계 질환 또는 증상, 신경/감각계 질환 또는 증상, 내분비계 질환 또는 증상, 호흡기계 질환 또는 증상, 소화기계 질환 또는 증상, 및 결합/상피 조직 관련 질환 또는 증상, 또는 세균, 바이러스 또는 기생충 감염으로 인한 질환 또는 증상이다.
본 발명은 환자에게 위로, 경구로 또는 비내 전달용으로 제형화된 약리학적으로 허용가능한 다양한 조제물을 제공한다. 특정 예로, 상기 조성물은 점막 표면으로의 전달에 적합하다. 특정 예로, 상기 조성물은 장의 점막 표면에 전달하기에 적합하다.
예로, 점막은 위, 질, 코, 구강 또는 눈 표면의 점막일 수 있거나 또는 침투가능한 점막 표면이나 라이닝(lining)이 존재하는 신체의 모든 점막일 수 있다. 일부 예에서, 상기 점막 표면은 위의 점막 표면이다.
조성물의 다양한 전달 형태는, 특이적인 헬리코박터, 헬리코박터 구조체 및 그외 본원의 전달 비히클의 특정 타입 및 비율, 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, Mack Publishing Company에 개시된 바와 같이 제형 분야에서 공지된 제형 기법을 고려하여, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 용도로 용이하게 제조되며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 특히 포함된다.
전달 시스템은 동물, 특히 인간, 말, 소, 양 및 설치류를 포함한 영장류, 어류 및 조류에 사용할 수 있다. 또한 조제물은 유아 및 성인 모두에, 그리고 임신기 또는 수유기 동물에 비경구로 또는 투여하기 위해 사용할 수 있다. 조제물과 방법은 수컷과 암컷 모두에 적합한 것으로 추가적으로 설명할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 동물에게 백신접종(vaccinating)하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 상기 방법은 헬리코박터를 기본으로하는 플라스미드 벡터 및/또는 본원에 개시된 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포를 포함하는 백신을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 동물의 질병이나 생리적인 증상을 소거 또는 저해하는데 충분하거나, 또는 대상 약리 활성 분자에 대한 특이적인 면역 반응을 도출하는데 충분한, 대상 약리 활성 분자의 유효량을 전달하는 방법을 제공한다.
예로, 백신에 유용한 대상 비-헬리코박터성 약리 활성 분자는 포유류의 단백질, 펩티드, 효소, 호르몬 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 상기 대상 약리학적 활성 분자는 대상 인간의 약리 활성 분자로서 추가적으로 정의된다. 일부 예에서, 상기 대상 약리학적 활성 분자는 인간 병원체 분자/항원, 인간 단백질 항원, 예, 아밀린, 이의 유사체 또는 이의 유도체, 또는 그렐린, 이의 유사체 또는 이의 유도체이다.
특정 예에서, 백신은 인간 병원체, 에볼라 바이러스, HIV 바이러스, 마르부르크 바이러스, 인플루엔자 바이러스 등에 대항하여 면역성을 전달한다. Jones et al. (2005, Nat. Med. 11: 786-90)는 약독화된 재조합 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 벡터를 기초로한 복제 컴피턴트 백신(replication competent vaccine)을 개시하였는데, 이는 에볼라의 당단백질과 마르부르크의 당단백질을 함유하고 있다. 그러므로, 이들이나 그외 인간 병원체에 조합된 당단백질을 가진 헬리코박터를 기본으로하는 벡터 시스템 및 플라스미드 벡터 시스템을 이용하는 구조체 역시 본 명세서에 개시된 내용과 함께 본 발명에 따라 제공될 수 있다.
용어 정의
본 발명을 설명하기 전에, 이후 사용될 용어의 정의를 설명하여 본 발명의 이해를 도울 수 있다.
본원에서 "항생제 내성 유전자"는 벡터에 제공된, 그리고 선별 시스템으로서 사용된 이종의 핵산 서열을 포함한다. 용어 "항생제 내성 유전자"는 자연적으로 형성되는 미생물총 유기체(micro-flora organism)에 항생제 내성을 부여하는 그외 기작 또는 유전자는 포함되지 않는다.
용어 "약독화된"은 본원에서 세균 균주, 특히 E. coli 또는 헬리코박터 필로리와 같은 헬리코박터 균주를 설명하기 위해 사용되는 것으로서, 병독성 및 독성(침투성)이 낮은 천연, 야생형 타입의 세균 균주로서 정의된다.
용어 "생물학적으로 활성인"은 생물학적 기능을 수행할 수 있는 능력을 의미하며, 폴리펩티드와 관련하여 폴리펩티드가 그것의 본래 구조와 동일하거나 매우 유사한 안정적인 구조("folded form")를 채택하는 것을 포함한다. 예컨대, 적절한 폴딩 유닛, α-나선, β-시트, 도메인, 이황화 결합 등이 있으며, 폴딩이 정확하게 또는 실질적으로 정확하게 이루어졌을 때, 폴리펩티드는 그것의 본래 기능을 수행할 수 있는 능력을 가져야 한다. 일반적으로, 폴리펩티드에서 기능 유닛은 도메인이다.
면역 반응의 도출을 수반 또는 수반하지 않으면서 항체 또는 그외 리셉터에 결합하는 단순한 능력은 수동(passive)이거나, 또는 "생물학적 활성"을 구성하지 않는다. 임의의 항원은 항체에 결합되는 능력을 가지지만, 반드시 생물학적 활성을 가지는 것은 아니다.
"임상 등급의 벡터"는 본원에서 헬리코박터 또는 헬리코박터의 특징을 가지도록 조작된 비-병원성 세균에서 발현될 수 있는 플라스미드 또는 그외 발현 벡터를 의미한다. 본 발명의 임상 등급의 벡터는 선별용 항생제 내성 마커를 사용하지 않으며/않거나, 자살 벡터와 같이 숙주 이외엥서의 복제를 방지하기 위해 변형한다.
헬리코박터 필로리에서의 자살 시스템의 예는 Panthel et al. 2003(Infection & Immunity, 71: 109-116)에 개시되어 있다. 이 시스템에서는 플라스미드를 PhiX174 세포 용해 유전자 E가 함유된 헬리코박터 필로리에 도입한다. 균주를 제거하기 위해서는, 42℃에서 5시간동안 배양하면 된다. 생체내에서 이는 위의 환경 온도를 42℃ 보다 높게 상승시키기 위해 45-50℃의 음료를 동물에게 마시게하는 것을 의미한다.
두번째 예는 L-Dap 선별 시스템으로, 통상적으로 이를 사용하여 보충된 플레이트에서의 세균 돌연변이의 생존을 가능하게 한다(예, Kirata et al. 1997 (Infection & Immunity, 65: 4158-4164). 이러한 시스템에서, DapE 결손 헬리코박터 필로리 돌연변이의 생존을 위하여, 기질, 즉 디아미노-피멜릭산(diamino-pimelic-acid (DAP))이 없는 식이를 동물에게 제공하여야 한다. 이를 제거하기 위해서는, 이후, DAP 소비를 중지시키면 된다.
세번째 가능한 시스템은 그것의 rdxA 유전자로 인한 헬리코박터 필로리의 메트로니다졸 민감성에 관한 것이다. rdxA 유전자의 과도한 복제는 포유류 세포와 E. coli에 해롭다. 그러나, 복제는 세균에게는 허용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 헬리코박터 종들을 조작하여, 정상적인 돌연변이 의존적인 rdxA 소실을 방지하는 2 카피의 rdxA를 함유하게 할 수 있다. 2 이상의 기능적인 rdxA 유전자를 헬리코박터 게놈에 도입하면, 헬리코박터 균주는 메트로니다졸에 영구적으로 민감하게 된다. Jeong et al. 2000(J. Bacteriol., 182: 5082-5090)는 기능적 rdxA 유전자에 의해 생산된 니트로리덕타제가 프로드럭으로부터 메트로니다졸을 살세균 화합물로 변환시킨다는 것을 입증하였다. 이 활성 화합물의 작용 모드는 헬리코박터 게놈의 DNA 파괴를 유발하는 것이다.
"검출가능한 면역 반응"은 본원에서 일반적인 실험 방법을 이용하여 측정할 수 있는 항원에 대한 반응으로 동물에 형성되는 항체(체액성) 또는 세포독성(세로성) 반응 중 어느 하나이며, 상기 실험 방법은 비제한적으로 ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), RIA(radio-immune assay), ELISPOT(Enzyme-linked ImmunoSPOT), IFA(immunofluorescent assay), CF(complement fixation assay), 웨스턴 블롯(WB) 또는 이의 동급 방법을 포함한다.
"대상 유전자"는 본원에서 발현되는 것이 적합한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 대상 유전자는 프로모터 또는 그외 조절 성분을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 또한, 대상 유전자는 안티센스 RNA를 생산할 수 있는 구조체를 포함한다.
"유전자 요법"은 본원에서 재조합 벡터를 이용하여 대상 유전자를 이를 필요로 하는 동물에 전달하는 것으로서 정의된다. 대상 유전자는 치료 또는 예방적 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스유전자일 수 있으며, 비제한적으로는, 사이토카인, 항-염증제, 항-증식제, 항생제, 대사 저해제/활성화제 및 면역 활성 물질 및 그것의 단편을 포함한다. 나아가, 본원에서 "유전자 요법"은 또한 선천 및 후천적인 질환 모두에 대한 유전자 치환 기술을 포함한다.
용어 헬리코박터는 헬리코박터 필로리 및 헬리코박터 무스텔라(H. mustelae)를 포함한 헬리코박터 속의 모든 세균을 포함한다. 또한, 상기 용어는 영장류의 위 점막에 기주할 수 있으며/있거나 만성적으로 있을 수 있으며, 점막 감염에서 분리된다는 점에서 헬리코박터 필로리와 유사한 생태를 가지는 세균을 포함한다. 또한, 상기 용어는 세균이 위 점막에 거주할 수 있는 것과 같은 헬리코박터 필로리의 특성을 가지도록 변형된 세균을 내포한다.
"이종" 폴리펩티드는 헬리코박터에는 선천적이지 않은, 즉 본래 헬리코박터에서는 발현되지 않거나 또는 헬리코박터에 도입하기 전에 또는 이의 시조(ancestor)에서는 발현되지 않는, 생리 활성 물질에 대한 핵산을 코딩하는 폴리펩티드이다.
"숙주"는 본원에서 본 발명의 치료 조성물에 대한 정해진 수여체를 의미한다. 숙주는 모든 동물을 포함한다. 특히, 숙주는 비제한적으로, 영장류(인간 포함), 소, 말, 개, 고양이, 돼지, 소, 토끼, 설치류, 조류 및 어류를 포함한다.
"면역학적으로 무활성"은 본원에서 그것의 숙주에서는 유의한 면역 반응을 일으키지 않는 미생물총과 같은 미생물을 포함한, 임의의 물질을 의미한다. 본원에서 면역학적으로 무활성인 물질의 예로는 스테인레스 스틸, 생체친화성 폴리머, 예컨대 폴리-L-락티드, 의료 등급의 플라스틱 및 본 발명의 미생물총의 유기체를 포함한다. "유의한 면역" 반응은 본 발명의 기재된 바에 따라 사용되는 물질 또는 유기체의 생체내 이용을 한정 또는 제한하는 임의의 면역 반응이다. 검출가능한 면역 반응이 반드시 "유의한 면역 반응"인 것은 아니다.
"분리된 핵산"은 천연적으로 형성되는 핵산의 구조 또는 4개 이상의 분리된 유전자가 연결된(spanning) 천연적으로 발생되는 게놈 핵산의 임의 단편 구조와 동일하지 않는 핵산 구조이다. 따라서, 상기 용어는, 예컨대 (a) 자연적으로 발생되는 유기체의 게놈에서 분자의 부분에 측면으로 있는 코딩 서열의 양측이 측면에 있지 않는, 자연적으로 발생되는 게놈 DNA 분자의 일부 서열을 가지는 DNA 분자; (b) 제조되는 분자가 임의의 자연적으로 발생되는 벡터 또는 게놈 DNA과 동일하지 않도록 하는 방식으로 원핵 또는 진핵의 게놈 DNA나 또는 벡터로 병합된 핵산; (c) cDNA, 게놈 단편, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 형성된 단편, 또는 제한 단편과 같은 분리된 분자; 및 (d) 혼성 유전자, 즉 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오티드 서열을 포괄한다. 이러한 정의에서, (i) DNA 분자, (ii) 형질감염된 세포 및 (iii) 세포 클론, 예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리와 같은 DNA 라이브러리에서 이루어지는 바와 같이, 이들의 혼합에서 존재하는 핵산은 특히 제외된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 "상동성%(상동)"은 Karlin and Altschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)과 같이 변형된, Karlin 및 Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 병합된다. BLSAT 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드길이=12로 수행하여, 본 발명의 핵산 분자와 상동한 뉴클레오티드 서열을 구한다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3으로 수행하여, 참조 폴리펩티드(예, 서열번호 2)와 상동한 아미노산 서열을 구한다. 비교하기 위한 목적으로 갭이 채워진 정렬(gapped alignment)을 얻기 위해, Altschul et al.(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)에 개시된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 해당 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용된다. 이들은 월드 와이드 웹, URL "ncbi.nim.nih.gov"에서 볼 수 있다.
"리포터 유전자"는 본원에서 대상 유전자를 코딩하는 이종 핵산에(또는 인접하게) 병합된 대상 유전자, 동정가능한 표현형을 발현하는 형질전환된 벡터를 제공하는 핵산 서열이다. 리포터 유전자의 비제한적인 예로는 GFP, β-갈락토시다제, 아밀라제 및 CAT가 있다.
"스크리닝 마커"는 본원에서 본 발명에 기재된 바에 따라 제조한 형질전환된 벡터에 제공된, 동정 특징(표면형)을 의미한다. 본 발명의 일예에서, 상기 스크리닝 마커는 리포터 유전자이다.
"선별 마커", "선별 유전자", "리포터 유전자" 및 "리포터 마커"(이하 "선별 마커"라 함)은 본원에서 형질전환된 세균성 벡터의 신속한 동정과 분리를 허용하는 표현형 특성을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에 기재된 바에 따라 제조되며 "임상 등급"으로 간주된 세균성 벡터는 항생제 내성을 코딩하지 않는 선별 마커를 가지고 있는 벡터이다.
"트랜스유전자"는 본원에서 cDNA 기술을 이용하여 그것의 기능, 복제 및 유전(transmission)을 정상 유전자로서 확보하는 방식으로 세포에 삽입되는 유전자를 의미한다.
"형질전환성 핵산 서열"은 본원에서 대상 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 함유하고 있는 플라스미드 또는 그외 발현 카세트를 의미한다. 본 발명의 일부 예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 치료제를 코딩할 수 있다. "형질전환성 핵산 서열"은 또한 본 발명의 특정 예에 따라 "트랜스유전자"를 나타내는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 상기 형질전환성 핵산 서열은 프로모터 및/또는 다른 조절 요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
용어 "암"은 본원에서 신생물 질환(예, 백혈병, 암 및 "과다증식성 질환")을 의미한다. 신생물(neoplasm)은 결장, 복부, 뼈, ㅇ방, 소화기계, 간, 이자, 전립선, 복막, 폐, 혈액(예, 백혈병), 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 자궁, 눈, 두경부, 신경(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 지라, 흉부 및 비뇨 생식기로 이루어진 군으로부터 선택된 조직내에 위치될 수 있다.
일 예로, 용어 "암"은 또한 과형성(hyperplasia)(예, 자궁내막 증식증), 화생(metaplasia)(예, 결합 조직 화생) 및/또는 형성 장애(dysplasia)(예, 자궁막 형성 장애 및 기관지폐 형성 장애)로 이루어진 군으로부터 선택된 전-암 증상(pre-neoplastic condition)을 포함한다.
다른 예로, 용어 "암"은 또한 양성 종양, 섬유낭종성 증상 및 조직 비대(tissue hypertrophy)로 이루어진 군으로부터 선택된 양성 증식이상 질환(benign dysproliferative disorder)을 포함한다.
용어 "면역/조혈계 질환 또는 증상"은 빈혈, 범혈구 감소증, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 백혈병, 홉킨스 질환, 비-홉킨스 림프종, 급성 림프구성 빈혈(ALL), 형질세포종(plasmacytomas), 다발성 골수종, 버키트 림프종, 관절염, 천식, AIDS, 자가면역 질환, 류마티스 관절염, 육아종성 질환, 면역 결핍증, 염증성 장 질환, 패혈증, 호중구 감소증, 호중구 증가증, 건선, 이식한 기관 및 조직의 면역 반응, 홍반성 전신 루푸스, 혈우병, 과응고증(hypercoagulation), 당뇨병, 심내막염, 뇌막염, 림 질환(Lyme Disease), 소아지방변증 및 알레르기로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "생식기계 질환 또는 증상"은 본원에서 잠복고환증, 전립선염, 서혜 헤르니아, 고환정맥류, 간질세포(leydig cell) 종양, 사마귀성 종양(verrucous carcinoma), 전립선염, 연화판증, 페이로니병(Peyronie's disease), 음경암, 편평세포 증식증, 월경통, 난소 선암종, 터너 증후군, 점액농성 자궁경부염(mucopurulent cervicitis), Sertoli-leydig 종양, 난소암, 자궁암, 골반염증성 질환, 고환암, 전립선암, 클라인펠터 증후군, 영 증후군(Young's syndrome), 조루증(premature ejaculation), 당뇨병, 낭성 섬유증, 카타제너 증후군, 고환 위축증(testicular atrophy), 고환 여성화(testicular feminization), 무고환증(anorchia), 이소성 고환(ectopic testis), 부고환염(epididymitis), 고환염, 임질, 매독, 고환염전(testicular torsion), 정관염 결절성(vasitis nodosa), 배아종(germ cell tumour), 기질종양(stromal tumour), 월경통(dysmenorrhea), 자궁후굴(retroverted uterus), 자궁내막증, 섬유양(fibroids), 샘근육증(adenomyosis), 무배란성 출혈(anovulatory bleeding), 무월경(amenorrhoea), 쿠싱 증후군, 포상기태(hydatidiform mole), 아셔만 증후군(Asherman's syndrome), 조기 폐경(premature menopause), 성조숙(precocious puberty), 자궁 용종(uterine polyp), 기능장애 자궁 출혈(dysfunctional uterine bleeding), 자궁경부염(cervicitis), 만성 자궁경부염, 점액 자궁경부염(mucopurulent cervicitis), 자궁목형성이상(cervical dysplasia), 경관폴립(cervical polyp), 나보트낭(Nabothian cyst), 자궁경부미란(cervical erosion), 자궁경부무력증(cervical incompetence), 자궁경부 종양(cervical neoplasm), 가성 반음양증(pseudohermaphroditism) 및 월경전증후군(premenstrual syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "근골격계 질환 또는 증상"은 본원에서 골암(예, 골연골종(osteochondromas), 양성 연골종(benign chondromas), 연골모세포종(chondroblastoma), 연골점액유사 섬유종(chondromyxoid fibroma), 유골골종(osteoid osteom), 거대세포종(giant cell tumor), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골육종(osteosarcoma), 파제트 질병, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 골수염, 림 질환, 통풍(gout), 윤활낭염(bursitis), 건염(tendonitis), 골다공증, 골관절염, 근육 퇴행 위축(muscular dystrophy), 사립체 근육병증(mitochondrial myopathy), 악액질(cachexia) 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "심혈관계 질환 또는 증상"은 본원에서 점액종(myxoma), 섬유종(fibroma), 횡문근종(rhabdomyoma), 심혈관이상증(예, 선천성 심내 결손증(congenital heart defect), 대뇌 동정맥 기형(cerebral arteriovenous malformation), 중격 결손증(septal defect)), 심장병(예, 심장기능상실, 울혈성 심장 질환(congestive heart disease), 부정맥(arrhythmia), 빈맥(tachycardia), 세동(fibrillation), 심낭질환(pericardial disease), 심내막염(endocarditis)), 심장 정지, 심장 판막 질환(예, 협착증, 역류(regurgitation), 탈출증(prolapse)), 혈관병(예, 고혈압, 관상 동맥 질환, 앙기나(angina), 혈관류(aneurism), 동맥경화증(arteriosclerosis), 말초 혈관 질환), 저나트륨혈증(hyponatremia), 고나트륨혈증(hypernatremia), 저칼륨증(hypokalemia) 및 고칼륨혈증(hyperkalemia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "혼합성 태아(mixed fetal)로 설명되는 질환 또는 증상"은 본원에서 척추 갈림증(spina bifida), 무뇌수두증(hydranencephaly), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 태아 알코올 증후군(fetal alcohol syndrome), 당뇨병, PKU, 다운 증후군, 파타우 증후군, 에드워드 증후군, 터너 증후군, 에이퍼트 증후군(Apert syndrome), 카펜터 증후군(Carpenter syndrome), 콘라디 증후군(Conradi syndrome), 크로존 증후군(Crouzon syndrome), 이완 피부증(cutis laxa), 코넬리아 디란지 증후군(Cornelia de Lange syndrome), 엘리스-반 크레벨트 증후군(Ellis-van Creveld syndrome), 홀트-오람 증후군(Holt-Oram syndrome), 카타제너 증후군(Kartagener syndrome), 멕켈-그루버 증후군(Meckel-Gruber syndrome), 누난 증후군(Noonan syndrome), 팔리스터-홀 증후군(Pallister-Hall syndrome), 루빈스타인-타비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome), 만도 증후군(Scimitar syndrome), 스미스-렘리-오피쯔 증후군(Smith-Lemli-Opitz syndrome), 저혈소판 요골 무형성(TAR) 증후군(thromocytopenia-absent radius syndrome), 트리처 콜린스 증후군(Treacher Collins syndrome), 윌리암스 증후군, 휘르쉬스프룽병(Hirschsprung's disease), 멕켈게실암(Meckel's diverticulum), 다낭포성 신장질환(polycystic kidney disease), 터너 증후군 및 성선이발생증(gonadal dysgenesis), 클리펠-파일 증후군(Klippel-Feil syndrome), 불완전 골형성증(Ostogenesis imperfecta), 근육퇴행위축증(muscular dystrophy), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 윌름씨 종양(Wilm's tumour), 신경모세포종(neuroblastoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "배설계 질환 또는 증상"은 본원에서 방광암, 전립선암, 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia), 방광 장애(예, 요실금(urinary incontinence), 요폐(urinary retention), 요로폐색(urinary obstruction), 요로감염증(urinary tract Infection), 사이질 방광염(interstitial cystitis), 전립선염, 신경성 방광(neurogenic bladder), 혈뇨), 신장 장애(예, 수신증(hydronephrosis), 단백뇨(proteinuria), 신부전(renal failure), 신우신염(pyelonephritis), 요석증(urolithiasis), 역류성 신병변(reflux nephropathy), 편측 폐쇄성 요로병증(unilateral obstructive uropathy))으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "신경/감각 시스템 질환 또는 증상"은 본원에서 뇌암(예, 뇌줄기 신경아교종(brain stem glioma), 뇌 종양, 중추 신경계(원발성) 림프종, 중추신경계 림프종, 소뇌별아교세포종(cerebellar astrocytoma), 및 뇌신경모세포종(cerebral astrocytoma)), 신경퇴행성(예, 알츠하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease), 파킨슨 질환 및 특발성 초로성 치매(Idiopathic Presenile Dementia)), 뇌척수염(encephalomyelitis), 대뇌 말라리아(cerebral malaria), 수막염(meningitis), 대사성 뇌 질환(예, 페닐케톤뇨증(phenylketonuria) 및 피루베이트 카르복실라제 결핍증), 소뇌 조화운동 불능(cerebellar ataxia), 모세혈관 확장성 조화운동 불능(ataxia telangiectasia) 및 후천성 면역결핍증-치매복합증(AIDS-Dementia Complex), 정신분열증, 주의력 결핍 장애(attention deficit disorder), 주의결핍 과잉활동 장애(hyperactive attention deficit disorder), 자폐증 및 강박 장애(obsessive compulsive disorder)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "호흡기계 질환 또는 증상"은 본원에서 후두암(larynx cancer), 인두암(pharynx cancer), 기관암(trachea cancer), 후두개암(epiglottis cancer), 폐암, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 소세포(귀리 세포) 암종, 거대세포 암종 및 선암종과 같은 호흡기계 암, 알레르기 반응, 낭성 섬유종, 사코이드증(sarcoidosis), 조직구증 X(histiocytosis X), 침윤성 폐 질환(예, 폐섬유증 및 림프양 간질성 폐렴(lymphoid interstitial pneumonia), 폐쇄성 기도 질환(예, 천식, 기종, 만성 또는 급성 기관지염), 직업성 폐 질환(occupational lung)(예, 규폐증 및 석면증), 폐렴 및 늑막염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "내분비계 질환 또는 증상"은 본원에서 내분비 조직 및 기관의 암(예, 시상하부, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 이자, 부신, 난소 및 고환의 암), 당뇨병(예, 요붕증, 1형 및 2형 당뇨병), 비만, 뇌하수체 관련 장애(예, 뇌하수체항진증(hyperpituitarism), 뇌하수체저하증(hypopituitarism) 및 하수체 소인증(pituitary dwarfism)), 갑상선기능저하증(hypothyroidism), 갑상선기능항진증(hyperthyroidism), 갑상선종(goiter), 생식 장애(예, 남성 및 여성 불임증), 부신 관련 장애(예, 애디슨 질환(Addison's Disease), 코르티코스테로이드 결핍증(corticosteroid deficiency), 및 쿠싱 증후군(Cushing's Syndrome)), 신장암(예, 하이페메프로마(hypemephroma), 이행세포암(transitional cell cancer) 및 윌름암(Wilm's tumour)), 당뇨병성 신장병증(diabetic nephropathy), 간질성 신장염(interstitial nephritis), 다낭신장병, 사구체신염(glomerulonephritis)(예, IgM 혈관간세포 증식 사구체 신염(IgM mesangial proliferative glomerulonephritis) 및 자가면역 장애로 인한 사구체신염, 예컨대 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome)) 및 신장석회증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "소화기계 질환 또는 증상"은 본원에서 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 충수염, 크론씨 질환, 간염, 간성 뇌병증(hepatic encephalopathy), 문맥고혈압(portal hypertension), 담석증(cholelithiasis), 소화기계 암(예, 담관암, 위암(stomach cancer), 결장암, 위암(gastric cancer), 췌장암, 담관암(cancer of the bile duct), 결장 종양(예, 용종 또는 암) 및 경화증(cirrhosis)), 이자염(pancreatitis), 궤양 질환(ulcerative disease), 유문협착(pyloric stenosis), 위창자염(gastroenteritis), 위염(gastritis), 위 위축증(gastric atrophy), 십이지장의 양성 종양(benign tumours of the duodenum), 과잉팽창(distension), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 흡수장애(malabsorption), 선천성 소장 질환, 세균 감염증, 기생충 감염, 큰결장증(megacolon), 히르슈슈프룽병(Hirschsprung's disease), 선천 큰결장증(aganglionic megacolon), 후천성 큰결장증, 결장염, 항문곧창자 장애(anorectal disorder)(예, 치루(anal fistula), 치핵), 선천성 간 질환(예, 윌슨 질환, 혈색소침착증(hemochromatosis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 담도폐쇄증(biliary atresia) 및 알파 1-항트립신 결핍증), 문맥고혈압(portal hypertension), 담석증(cholelithiasis) 및 황달로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "결합/상피 질환 또는 증상"은 본원에서 결합조직 화생(connective tissue metaplasia), 혼합성 결합조직 질환, 국소 상피 증식증(focal epithelial hyperplasia), 상피 화생, 상피 이형성(mucoepithelial dysplasia), 이식 편대 숙주 질환, 다발근육염(polymyositis), 낭성 증식증(cystic hyperplasia), 대뇌 이형성(cerebral dysplasia), 조직 비대증(tissue hypertrophy), 알츠하이머 질환, 림프세포 증식 질환(lymphoproliferative disorder), 발덴스트론 마크로글로불린혈증(Waldenstron's macroglobulinemia), 크론씨 질환, 악성 빈혈(pernicious anaemia), 특발성 애디슨 질환(idiopathic Addison's disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 쇼그렌 증후군, 당뇨병, 낭성 섬유증, 골모세포종(osteoblastoma), 파골세포종(osteoclastoma), 골육종(osteosarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골다공증, 골관절염(osteoarthritis), 치주병(periodontal disease), 상처 치유, 재발성 다발연골염(relapsing polychondritis), 혈관염(vasculitis), 결절다발동맥염(polyarteritis nodosa), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 연조직염(cellulitis), 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 원판상 홍반 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 공피증(scleroderma), CREST 증후군, 쇼그렌 증후군, 다발근육염(polymyositis), 피부근육염(dermatomyositis), 혼합성 결합조직 질환, 재발성 다발연골염(relapsing polychondritis), 맥관염, 헤노흐-쇤라인 증후군(Henoch-Schonlein syndrome), 결절 홍반(erythema nodosum), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 측두(거대 세포) 동맥염(temporal (giant cell) arteritis), 타카야수 대동맥염(Takayasu's arteritis), 베게너 육아종증, 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 베체트 증후군(Behcet's syndrome), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 연조직염(cellulitis), 켈로이드(keloid), 엘러스-단로스 증후군, 마르판 증후군(Marfan syndrome), 탄성섬유가황색종(pseudoxantoma elasticum), 골형성 부전증(osteogenese imperfecta), 연골형성장애(chondrodysplasia), 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa), 알포트 증후군(Alport syndrome) 및 이완피부증(cutis laxa)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
본 발명에서 용어 "하나(a)" 및 "그(the)"는 하나(단수) 및 2이상(복수) 모두를 포함한다.
본원에서 "치료학적 유효량"의 활성 물질 또는 물질들의 조합은 원하는 반응을 유도하기에는 충분하지만 독성 반응을 초래하기에는 불충분한 함량을 포함하는 것으로 이해된다. 원하는 반응을, 예컨대 혈액 샘플내 충분한 및/또는 허용가능한 검출성 항체 역가 수치를 형성할 수 있다. 환자에게 투여되는 조제물의 치료 투여량 및 기간은 치료가 필요한 환자의 주치 의학자가 결정할 것이며, 나이, 성별, 체중, 기존 질병 상태 및/또는 개체의 조직 손상 정도, 및 헬리코박터의 특이 제형 및 개체 치료로서 사용중인 대상 산물의 유전자를 고려할 것이다.
표현 "유효 수준"은 분자의 원하는 활성 수준을 의미하며, 반드시 다수의 분자들을 한정하는 것은 아니다. 예컨대, 아밀린의 유효 수준은 환자에게 존재하는 유리 아밀린의 함량의 필수적인 감소 수반없이, 아밀린 길항제를 이용함으로써 그렐린 분비를 자극하기 위해 낮아질 수 있다.
표현 "그렐린 관련 질환 및 장애"는 그렐린의 활성 조절을 통해 치료, 예방 또는 완화될 수 있는 임의 증상을 의미한다. 이러한 증상은 그렐린, 예컨대 성장 호르몬 분비에 의해 증강, 악화 또는 자극되거나 또는 식이로 유도되는 증상이다. 그렐린의 생리 작용은 예컨대, 성장 호르몬의 분비 자극, 프로락틴분비 세포(lactotroph) 및 부신피질자극 세포(corticotrope)의 호르몬 분비 자극, 식욕유발성 및 심혈관 기능, 갑상선과 유방 종양에 대한 항-증식성 효과, 및 미주 신경 매개(vagal mediation)를 통한 위 운동 및 산 분비의 조절의 방식에 의한 것을 포함하는 것으로 간주된다(WO 2005021026 참조).
문맥상 필요하지 않는다면, 명세서에 용어 "포함한다(comprise)" 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형 형태는 언급한 완전체 또는 완전체의 그룹의 포함을 내포하며, 임의의 그외 완전체 또는 완전체의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
용어의 정의는 용어의 일반적인 사용 의미와 상이한 경우, 출원인은 특별히 언급하지 않는다면, 본 명세서에 제기된 정의를 이용하는 것으로 의도된다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 특별히 예시된 방법으로 제한되지 않으며, 변경가능한 것으로 이해된다 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 구체적인 예를 설명하기 위한 것일 뿐 한정하려는 의도는 아니며, 단지 첨부된 청구범위로만 한정될 것이다.
본원에 상기 또는 하기에 인용된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 원용에 의해 본원에 병합된다. 그러나, 본원에 개시된 공개문헌은 공개문헌에 기재되어 있으며 본 발명에서도 사용될 수 있는 프로토콜, 반응물질 및 벡터를 설명 및 개시하고자 하는 목적으로 언급된다. 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시된 내용을 선행하는 것으로 인정되지 않는다는 것으로는 해석되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시에 있어, 별도로 언급되어 있지 않다면, 당업자 범위내의 기존의 면역학적 및 분자생물학적 기법과 약리학을 사용한다. 이러한 기법은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌에서도 충분히 설명되어 있다. 예로, Coligan et al. "Current protocols in Protein Science." (1999) Volume I and II (John Wiley & Sons Inc.); Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd & 3rd Editions, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989) (2001); 및 Bailey, J.E. and Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986을 참조한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, "하나(a)", "하나(an)" 및 "그(the)"는 문맥에서 명확하게 지시되지 않는다면 복수 지시를 포함한다. 따라서, 예로, "핵산"은 복수의 핵산을 포함하며, "분리된 펩티드"는 하나 이상의 펩티드 등을 나타낸다. 별도로 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법을 본 발명을 실시거나 테스트하는데 사용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법은 지금 설명한다.
동물 체내 특정 표적부에 치료 조성물 및 핵산을 전달하는 것은 약물 개발 회사에서 직면하고 있는 진행중인 시도이다. 본 발명의 발명자들은 생리 활성 물질을 코딩하고 있는 벡터를 수송할 수 있는 헬리코박터를 토대로한(헬리코박터) 세균성 전달 시스템을 개발하였으며, 상기한 생리 활성 물질은 세균의 표면에서 발현되거나 그로부터 분비된다. 일 예에서, 상기 세균은 헬리코박터 종이다. 더 바람직하기로는, 헬리코박터 필로리이다. 일부 예에서, 헬리코박터 필로리의 균주는 분야에서 공지된 임의 균주일 수 있다. 일부 예에서, 헬리코박터 균주는 게놈 균주 26695와 같은 비-병원성 균주이다.
다른 예에서, 위 점막이나 또는 위장관, 요로, 기관지 상피 영역이나 그외 점막 기관에 숙주에 대한 유의한 독성없이도 장기간 집락화할 수 있는 능력을 포함하는 헬리코박터 또는 헬리코박터 필로리의 특징을 가지도록 유전학적으로 변형된, 헬리코박터 이외의 세균을 이용한다.
일 예에서, 헬리코박터 필로리는 일부 병원성 특징이 제거 및/또는 약독화되도록 조작된다. 예컨대, 헬리코박터 필로리가 저병원성이도록 베큐얼레이팅(vacuolating) 세포 독소 및 cag 병원성 섬 유전자(island gene)를 제거한다. 일 예로, 헬리코박터 필로리는 일부 병원성 특징이 제거 및/또는 약독화되도록 조작된다. 예컨대, 베큐얼레이팅 세포독소 및 cag 병원성 섬 유전자는 헬리코박터 필로리가 저병원성이 되도록 제거될 수 있다. 약독화 돌연변이는 비특이적인 돌연변이 유발을 이용하거나, 또는 화학적으로 N-메틸-N-니트로-N-니트로소퀴아니딘이나 재조합 DNA 기술중 어느 하나를 이용하여 헬리코박터에 도입할 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법을 다양한 생리 활성 물질을 전달하기 위해 사용할 수 있음을 인지할 것이다. 적합한 물질의 예로는 국소 또는 전신 기능할 수 있는 물질, 예컨대 국소 또는 전신 대사에 작용하는 내분비물의 활성을 발휘할 수 있는 물질, 및/또는, 면역/조혈계에 속하는 세포의 활성을 조절할 수 있는 물질, 및/또는 체내에서 다양한 정상 또는 종양 세포의 생존, 증식 및 분화에 작용할 수 있거나 또는 상해 및 감염에 대한 급성 염증 반응의 유도 또는 면역 조절에 작용할 수 있는 물질, 및/또는 그것의 표적 세포 리셉터상에 작용하는 케모카인에 의해 매개된 세포 및 조직의 감염에 대한 내성 또는 상피 세포의 증식 또는 상처 치유 촉진을 증강 또는 유발할 수 있는 물질, 및/또는 체내 세포에 의한 물질의 발현이나 생산을 조절하는 물질이 있다.
이러한 생리 활성 물질의 특정 예로는, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관활성의 소장 폴리펩티드(vasoactive intestinal polypeptide), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL 또는 IFN α/β와 같은 정반대 방향의 4 α나선 번들 구조(antiparallel 4 α helical bundle)를 채택하고 있는 구조 그룹 1 사이토카인(structural group 1 cytokine), 세포 표면과 조합되어 있는 구조 그룹 2 사이토카인, 형태 대칭성 동형삼형체(homotrimer), 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리의 사이토카인과 같은 특정 바이러스 코트 단백질에서 나타나는 β-젤리 롤 구조를 취하는 서브유닛, 예컨대, TNF α, TNF β, CD40, CD27 또는 FAS 리간드, IL-1 패일리의 사이토카인, 섬유아세포 성장 인자 패밀리, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 β 및 신경 성장 인자, 세포외 부위에서 하나 이상의 표피 성장 인자(EGF)를 각각 포함하는 거대 트랜스멤브레인 전구체 분자로서 생산되는 단쇄 α/β 분자를 포함하는 구조 그룹 3 사이토카인, 예컨대 EGF 패밀리 사이토카인, 보존된 시스테인 잔기(C--C 또는 C--X--C 케모타인 서브그룹)를 둘러싼 형태로 그룹화된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 케모카인, 또는 인슐린 관련 사이토카인, 상이한 도메인으로 구성된 헤레굴린(heregulin) 또는 뉴레굴린(neuregulin)과 같은 모자이크 구조를 나타내는 구조 그룹 4 사이토카인, 예컨대, EGF, 면역글로불린 유사 및 크링글 도메인(kringle domain)을 포함한다.
대안적으로, 생리 활성 물질은 전술한 바와 같이 리셉터 또는 생리 활성 물질에 대한 길항제일 수 있다.
일부 예에서, 헬리코박터 필로리를 기본으로한 벡터 및/또는 벡터 플라스미드 구조체(예, E.coli 또는 헬리코박터 세포)를 사용하여, 형질전환된 세포 조제물이 투여된 숙주의 점막 표면에서 이에 함유된 분리 핵산 분자로부터 생리 활성 물질의 발현 및/또는 분비를 허용하는 형질전환된 세포를 만든다. 형질전환된 세포 (또는 벡터)에 함유된 분리된 핵산은 생리 활성 물질을 코딩하는 핵산이 헬리코박터 필로리에서 적정 발현 조절 서열의 통제하에 있는 하나 이상의 핵산 구조체를 포함할 수 있다.
헬리코박터 필로리로 도입하기 위한 핵산을 포함하는 적합한 벡터 및 셔틀 벡터 서열은, 프로모터 서열, 종결자 단편, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 그외 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 포함하도록 선택 또는 구축될 수 있다. 벡터는 적절하다면 플라스미드, 바이러스, 예컨대 파지 또는 파지미드(phagemid)일 수 있다. 보다 구체적으로, 예컨대 전술한 Sambrook 등에서 볼 수 있다. 공지된 많은 핵산 조작 기법 및 프로토콜, 예컨대 핵산 구조체의 제조, 돌연변이 유발, 서열분석, DNA를 세포로 도입, 유전자 발현, 및 단백질 분석에 있어서의 기법 및 프로토콜들은 Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992에 구체적으로 기재되어 있다. 상기 Sambrook et al. supra 및 Ausubel et al.의 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
일부 예에서, 생리 활성 물질에 대한 코딩 서열은 오페론, 즉 다중 유전자 발현(multi-cistronic expression)용 핵산 구조체에 포함된다. 오페론에서, 프로모터로부터의 전사를 통해 각각 적합하게 위치된 라이보좀 결합부 상류를 가지는 2이상의 코딩 서열을 포함하는 mRNA가 형성된다. 따라서, 2 이상의 물질이 단일 mRNA로부터 번역될 수 있다. 오페론의 사용은 조절되는(coordinated) 생리 활성 물질의 발현을 가능하게 한다.
본 발명의 생리 활성 물질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체 또는 벡터는 바람직하기로는 헬리코박터 필로리에서 발현용 프로모터의 통제하에 있다.
일 예에서, 본 발명에 따라 사용되는 프로모터는 헬리코박터 필로리에서 구성적으로 발현된다. 구성적인 프로모터를 사용함으로써 발현이 이루어지도록 하기 위한 유도체 또는 그외 조절 신호를 제공할 필요가 없게 된다. 바람직하기로는, 프로모터는 증식이 억제되더라도 헬리코박터 숙주 세포가 생존, 즉 일부 대사 활성을 유지하는 수준으로 발현되게 한다. 이롭기로는, 이러한 발현은 낮은 수준일 수 있다. 예컨대, 발현 산물이 세포내에 축적되는 경우, 발현 수준은 세포 단백질의 약 10% 미만으로, 바람직하기로는 약 5% 또는 5% 미만, 예컨대 약 1-3%로 발현 산물이 축적되도록 유도할 수 있다.
프로모터는 헬리코박터 필로리 균주에서 사용되는, 즉 원래 헬리코박터 필로리의 균주에서 발견되는 프로모터와 상동일 수 있다. 일부 예에서, 프로모터는 아라비노스 유발성 프로모터이다. 그외 프로모터로는 FlaB sigma 54 프로모터(Josenhans et al., 1998, FEMS Microbiol Lett, 161(2): 263-73), T7 프로모터 및 살모넬라의 nir B 프로모터(Chatfield et al., 1992, Biotechnology, 10(8): 888-92)가 있다.
다른 예에서, 프로모터는 유도가능하다. 임상 등급의 벡터에 사용할 수 있는 유도성 프로모터로는, Kullen 등의 미국 특허 6,242,194에 개시된 바와 같이 pH 유도성 프로모터, E.coli 플라스미드에서 사용되는 것과 같은 락토스 유도성 프로모터(예, pBluescript™, Stratagene), 또는 락토바실러스의 내인성 락토스 프로모터; Aristarkhov et al., 1999, J. Bacteriology, Vol. 178(14), 4327-4332에 개시된 바와 같이, 알코올 디하이드로게나제(adhE) 프로모터와 같은 혐기 배양중에 유도되는 프로모터가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
일 예에서, 본 발명의 구조체는 또한 독성 유전자를 포함한다. 이러한 독성 유전자는 치료 완료시, 상기 독성 유전자의 발현 유도에 의해 본 발명의 헬리코박터를 쉽게 제거할 수 있도록, 유도성 프로모터의 통제하에 있는 것이 바람직하다. 독성 유전자의 비제한적인 예로는 유도성 프로모터의 통제하의 세균성 자기 분해제(autolysin)를 포함한다. 이러한 자기 분해성 유전자는 이후 바로 위에 기술한 하나 이상의 유도성 프로모터를 사용함으로써 위장관에서 적정 시기 및 위치에서 촉발될 수 있다.
일부 예에서, 조작된 헬리코박터 벡터 및 플라스미드 벡터 구조체는 산소에 민감하다. 이러한 산소 민감성은 본 발명의 임상 등급 벡터의 보급을 제한하는 다른 방법이다. 인간의 장내 환경은 산소가 매우 적어, 혐기성 및 미호기성(microaerophilic)인 헬리코박터를 포함한 미생물의 생장에 적합하다. 따라서, 헬리코박터 전달 비히클을 제거하는 효과적인 방법은, 장의 폐기물이 산소가 풍부한 외부 환경으로 배출될때 인체에서 나가므로, 산소 민감성을 부여하는 유전자를 형질전환된 미생물에 조작하는 방법이다.
본 발명의 핵산 구조체 또는 구조체는 분비 신호 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 생리 활성 물질, 예, 비-헬리코박터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열을 상기 분자(폴리펩티드)를 코딩한는 핵산 서열과 적절하게 커플링함으로써, 세포 막에서의 물질의 분비를 제공할 수 있다. 상기 핵산을 가지는 헬리코박터가 폴리펩티드를 분비하는 능력은 헬리코박터의 생존성을 유지하는 배양 조건에서 시험관내에서 테스트할 수 있다.
적합한 분비 신호 서열은 에셰리키아, 클렙시엘라 및 살모넬라와 같은 그람 음성 유기체에서 활성을 가지는 임의의 것을 포함한다. 분비 신호 서열은 일부 스타필로코커스 균주에서 분비된 스타필로키나제 효소의 분비 리더를 포함할 수 있으며, 이는 그람 양성 및 그람 음성 숙주에서 기능하는 것으로 알려져 있다("Gene Expression Using Bacillus", Rapoport (1990) Curr Opin Biotech 1:21-27).
그외 사용할 수 있는 분비 신호 서열로는, 예컨대 β-락타마제 유전자(Talmadge et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3369-3373) 또는 장침투성(enteroinvasive) E. coli 헤몰라이신(hemolysin) A(hlyA)(Su et al., 1992, Microbial Pathogen, 13:465-476)가 있다. 분비 신호 서열의 예는, Pugsley, 1988, Protein secretion across the outer membrane of gram-negative bacteria. In: Protein Transfer and organelle Biogenesis, R. C. Dand and P. W. Robbins (eds), Academic Press, Inc., San Diego, pp 607-652에 나열되어 있다. .
선별 마커는 혼합된 집단에서 형질전환된지 않은 미생물로부터 형질전환된 미생물을 구별하는 일반적인 수단을 연구자 및 기술자들에게 제공한다. 형질전환된 유기체를 동정하는 방법은 대상 유전자를 포함하는 플라스미드에 선별 마커 핵산 서열을 병합하는 것이다. 선별 마커 서열은 일반적으로 대상 유전자의 하위에 삽입하며, 동일한 프로모터로부터 조정된다. 그 결과, 대상 유전자가 성공적으로 형질전환된 세포는 또한 선별 마커 핵산 서열로 형질전환될 수 있을 것이다. 항생제 내성을 선별 마커로 사용하였을때, 형질전환된 세포만 항생제가 함유된 배지에서 생존 및/또는 증식할 것이다.
따라서, 항생제 내성은 형질전환체가 발생되었을때 일반적으로 많이 사용되는 표현형이다. 그러나, 항생제 내성 유전자를 선별 마커로서 가지는 벡터는 다른 유기체에게 항생제 내성 표현형을 부여할 수 있는 수평적인 유전자 전이가 가능하다. 이러한 위험은 헬리코박터를 치료 벡터의 일부로서 사용할때 특히 심각하다.
동물에 대한 유전자 전달 시스템으로서 헬리코박터를 사용하기 위하여, 본 발명은, 일부 예에서, 항생제 선별 마커를 이용하지 않는 임상 등급의 벡터 시스템을 사용한다. 본 발명의 전달 시스템에 의해 제시되는 항생제 내성 유전자 이용의 대안책중 하나는, 필수적인 하우스-키핑 유전자에 염색체 결손 또는 치사성 돌연변이가 있는 임상 등급의 유전자이다. 다음으로, 기능적으로 유사한 하우스-키핑 유전자를 대상 유전자를 코딩하는 플라스미드에 삽입한다. 따라서, "하우스-키핑 유전자"는 형질전환체의 신속한 분리 및 동정이 가능한 선별 마커가 된다.
필수적인 "하우스-키핑" 유전자의 예로는, 다수의 대사 조절자 및/또는 효소를 코딩하는 유전자가 있으며, 그 예로는 카나제, 프로테아제, 신테타제, 디하이드로게나제 및 그외의 것이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 제공되는 항생제 내성 유전자에 대한 대안은 대상 유전자를 함유하고 있는 플라스미드에 병합된 리포터 유전자를 가지고 있는 임상 등급의 벡터이다. 본 발명에 따라 사용되는 리포터 유전자의 비제한적인 예로는 푸른 형광 단백질(green fluorescent Protein (GFP)), β-갈락토시다제 및 아밀라제가 있다.
일 예에서, 생리 활성 폴리펩티드는 바람직하기로는 사이토카인 활성을 가진다. 사이토카인은 "The Cytokine Facts Book", Callard and Gearing (1994), Academic Press에 논의되어 있다. 사이토카인 활성을 가지는 바람직한 폴리펩티드로는 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-6(IL-6)을 포함하는, 인터루킨이 있다.
일부 예에서, 헬리코박터 전달 시스템, 벡터 또는 벡터 플라스미드 시스템은 형질전환된 세포를 제공하기 위하여, 헬리코박터 또는 그외 적합한 숙주 세포로 도입되는 상기와 같은 핵산 구조체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 비-병원성 헬리코박터에 개시된 바와 같이 핵산을 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 헬리코박터와 같은 숙주 세포 배양물의 형질전환에는 임의의 이용가능한 기술을 적용할 수 있다. 헬리코박터 필로리 세포의 경우, 적합한 기법으로는 칼슘 클로라이드 형질전환, 전기충격 및 박테리오파지를 이용한 형질감염이 있을 수 있다.
벡터 플라스미드를 헬리코박터 세포로 도입하며, 예컨대 유전자가 발현되는 조건하에서 헬리코박터 필로리를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 유발 또는 허용할 수 있다. 생리 활성 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서 헬리코박터를 배양함으로써, 헬리코박터가 코딩 핵산을 포함하며, 코딩된 물질을 생산할 수 있음을 검증할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 치료 또는 예방학적 투여량의 생리 활성 물질을 생체내에서 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 비-병원성 헬리코박터 필로리 조제물 및 본 발명의 백신을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법 및 본원에 기재된 바와 같이 비-침투적이거나 비-병원성인 헬리코박터의 사용은, 당업자가 예컨대 개체의 면역 반응을 조작할 수 있는 광범위한 치료 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 일측면은 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 생존, 증식, 분화, 작용자 기능 또는 감염 감수성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 본원에 개시된 바와 같이, 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포 또는 점막 표면 또는 인접하거나 떨어져 있는 조직에서 집락을 이루는 감염에 대한 면역 반응을 부스팅하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원성 감염 물질에 대한 (항체 대 세포 매개성) 면역 반응 타입을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증 또는 종양 세포를 이용한 정상 조직의 침윤을 조절하는 방법을 제공한다.
일부 측면은, 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 증식율, 침투율 또는 생존율을 통제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은, 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양세포에 세포자살을 유도하는 방법을 제공한다.
다른 측면은 생리 활성 물질을 발현하는 비침투성 또는 비-병원성 세균을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 하향 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 생리 활성 물질을 발현하는 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 알레르기성 자가면역 또는 그외 면역 조절 부전 질환 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 영장류, 말, 소, 돼지, 양, 설치류, 조류 또는 어류일 수 있다. 일 예에서, 상기 개체는 인간이다. 투여는 통상적으로 코 또는 경구일 수 있다.
치료에 있어서, 즉 개체에게 생리 활성 물질 전달의 생물학적 효과가 기체에게 이로운 경우, 바람직하기로는 "치료학적 유효량"의 투여하는 경우, 이는 개체에서 이로운 효과를 나타내는데 충분한 함량이다. 이러한 이로운 효과는 한가지 이상의 증상의 심각도 또는 발생의 적어도 일정 이상을 완화 또는 감소일 수 있다. 예방 차원에서, 함량은 예컨대 면역 반응 증강에 의한 이후의 병원체 접종 개체에서, 해로운 효과를 감소시키는데 충분할 수 있다. 투여되는 실제 함량과 투여 속도 및 시간은 투여 목적, 예컨대 접종(challenge)의 성질 및 심각도 측면에서 얻고자하는 생리학적 효과에 의존적일 것이며, 일반적인 최적화의 논제이다. 예방학적 백신 접종을 포함하는 치료 처방, 예컨대 투여량 결정은 일반적인 실무자 및 그외 의사의 책무에 속한다.
헬리코박터를 포함하는 조성물은 본 발명에 따라 단독으로 또는 그외 치료제와 병용하여, 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 개시된 바와 같이 헬리코박터를 포함하는 약리학적 조성물을 제공한다. 이러한 약리학적 조성물은 점막에 적용하기에 매우 적합하다.
본 발명에 따른 및 본 발명에 따라 이용하기 위한 약리학적 조성물은, 헬리코박터 뿐만 아니라, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충액, 안정화제 또는 당업계에 공지된 그외 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 무독성이어야 하며, 상기 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 그외 물질의 명확한 특성은 투여 경로에 의존적일 수 있다. 경구 투여에 있어서는, 적합한 pH, 등장성(isotonicity) 및 안정성을 가지며, 피로겐(pyrogen)이 없는 비경구 허용가능한 수용액을 사용할 수 있다. 본 기술분야의 당업자들은 적합한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 그외 첨가제를 필요에 따라 포함할 수 있다. 논의한 바와 같이, 본 발명에 따른 투여용 헬리코박터를 포함하는 약리학적 조성물은 하나 이상의 영양 물질, 예컨대 글루코스와 같은 에너지원, 아미노산 등을 포함할 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 개체에게 투여하기에 적합한 적정 담체 매질을 이용하여, 기재된 바와 같이 헬리코박터를 제형화하는 단계를 포함하는, 약학적 제형의 제조 방법을 제공한다. 일 예로, 상기 약제는 개체의 점막에 적용하기에 적합하다.
다른 예로, 본 발명은 약리학적인 이용을 위한, 예컨대 예방("백신접종")을 포함하여 수술 또는 치료로 인간 또는 동물 신체를 치료하는 방법에 이용하기 위하여, 이종의 생리 활성 펩티드를 발현하는 비-병원성 헬리코박터를 제공한다.
일 예로, 본 발명의 방법은 암과 같은 질환을 치료, 예방 또는 완화시키기 위해 사용할 수 있다. 또한, 상기 방법 및 전달 시스템을 사용하여, 면역/조혈계 질환 또는 증상, 생식계 질환 또는 증상, 근골격계 질환 또는 증상, 심혈관계 질환 또는 증상, 혼합성 태아로 나타나는 질환 또는 증상, 배설기계 질환 또는 증상, 신경/감각기계 질환 또는 증상, 내분비계 질환 또는 증상, 호흡기계 질환 또는 증상, 소화기계 질환 또는 증상, 및 결합/상피 조직 관련 질환 또는 증상이나 세균, 바이러스 또는 기생충 감염으로 인한 질환 또는 증상을 치료 또는 예방할 수 있다.
다른 예로, 헬리코박터 전달 시스템은 본원에서 본원에 기재된 바와 같이 다수의 증상 또는 질환을 치료할 수 있는 산물을 코딩하는 상이한 핵산 분자 다수를 동시에 또는 연속 전달할 수 있다. 또한, 바람직한 전달 시스템은 식욕 억제 또는 증진과 같이 부가적으로 바람직한 생리 효과를 형성할 수 있는 조성물을 전달한다.
헬리코박터 필로리에서 자살 시스템의 예는 Panthel et al. 2003 (Infection & Immunity, 71: 109-116)에 기재되어 있다. 이 시스템은 플라스미드를 PhiXl74 라이시스 유전자 E를 함유하는 헬리코박터 필로리에 도입한다. 균주를 박멸하기 위해, 5시간동안 42℃에서 배양한다. 생체내에서, 이는 위 환경을 42 ℃ 보다 높게 승온시키기 위해 45-50℃의 음료를 동물이 섭취하는 것을 의미한다.
두번째 예는 L-Dap 선별 시스템으로, 통상적으로 이를 사용하여 보충된 플레이트에서의 세균 돌연변이의 생존을 가능하게 한다(예, Kirata et al. 1997 (Infection & Immunity, 65: 4158-4164). 이러한 시스템에서, DapE 결손 헬리코박터 필로리 돌연변이의 생존을 위하여, 기질, 즉 디아미노-피멜릭산(diamino-pimelic-acid (DAP))이 없는 식이를 동물에게 제공하여야 한다. 이를 제거하기 위해서는, 이후, DAP 소비를 중지시키면 된다.
세번째 가능한 시스템은 그것의 rdxA 유전자로 인한 헬리코박터 필로리의 메트로니다졸 민감성에 관한 것이다. rdxA 유전자의 과도한 복제는 포유류 세포와 E. coli에 해롭다. 그러나, 복제는 세균에게는 허용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 헬리코박터 종들을 조작하여, 정상적인 돌연변이 의존적인 rdxA 소실을 방지하는 2 카피의 rdxA를 함유하게 할 수 있다. 2 이상의 기능적인 rdxA 유전자를 헬리코박터 게놈에 도입하면, 헬리코박터 균주는 메트로니다졸에 영구적으로 민감하게 된다. Jeong et al. 2000(J. Bacteriol., 182: 5082-5090)는 기능적 rdxA 유전자에 의해 생산된 니트로리덕타제가 프로드럭으로부터 메트로니다졸을 살세균 화합물로 변환시킨다는 것을 입증하였다. 이 활성 화합물의 작용 모드는 헬리코박터 게놈의 DNA 파괴를 유발하는 것이다.
본 발명은 아래 비제한적인 예를 들어 상세히 설명된다. 그러나, 하기 실시예들은 설명하기 위한 것으로, 본원에 기재된 본 발명의 일반성을 제한하는 방식으로 취하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 특히, 본 발명은 특정 헬리코박터 필로리 균주의 사용을 들어 상세하게 설명되지만, 본 발명의 내용은 상기 균주로 한정되지 않는 것으로 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 플라스미드 구조체 pHPA1(2.8kb)의 개략도이다.
도 2는 플라스미드 구조체 pHP3(3.4kb)의 개략도이다.
도 3은 플라스미드 구조체 pTMI03-8의 개략도이다.
도 4는 설파살라진의 구조(SSN)를 나타낸다.
도 5는 염료(Azure-A)가 접합된 이온 교환 수지(Amberlite XE-96)의 사용을 나타낸 개략도이다.
서열목록의 간단한 설명
하기 핵산 및 아미노산 서열은 본 발명의 설명에서 참조된다.
서열번호 1 - 플라스미드 pHP1(2796 nucleotides)의 뉴클레오티드 서열;
서열번호 2 - 플라스미드 pHP1(2796 nucleotides)의 뉴클레오티드 서열;
서열번호 3 - 플라스미드 pHP3(3444 nucleotides)의 뉴클레오티드 서열;
서열번호 4 - C형 간염 바이러스는 항원(HCV) 뉴클레오티드 서열;
서열번호 5 - C형 간염 바이러스(HCV) 코어 항원을 코딩하는 면역원성 서열, 뉴클레오티드 서열 135 bp(45개 아미노산)
서열번호 6 - 헬리코박터 필로리의 HopE 유전자의 표면에 노출된 루프에 해당되는 뉴클레오티드 서열(위치: 뉴클레오티드 504번, 아미노산 168번);
서열번호 7 - 상류 프라이머(29개);
서열번호 8 - 하류 프라이머(28개);
서열번호 9 - 올리고뉴클레오티드 프라이머(15개).
실시예 1 외부 단백질의 안정적인 발현용 벡터 및
형질전환 헬리코박터 필로리 유기체
헬리코박터 필로리의 유전자 조작은 보기 드문 것이다. 본 실시예는 유전자 형질전환된 헬리코박터, 특히 형질전환된 헬리코박터 필로리를 제공하기 위한 본 발명의 이용을 개시한다. 형질전환된 세균은 헬리코박터로부터 유래된 플라스미드 및 플라스미드 벡터를 이용하여 제조되며, 이는 E.coli와 같은 비-헬리코박터 유기체에 이미 조작된바 있다.
문헌에 개시된 수종의 헬리코박터 필로리 플라스미드를 헬리코박터 필로리/E.coli 셔틀 벡터로 성공적으로 변환시켰다. 수종의 E.coli 균주는 DNA 획득(uptake)에 선천적으로 적합한 것으로 보고되어 있다. 스트렙토마이신, 리팜핀 및 메트로니다졸에 대한 내성 마커 역시 대부분의 헬리코박터 필로리 균주로 성공적으로 형질전환되었다. 그러나, E.coli 및 다른 유기체 유래의 플라스미드 DNA도 헬리코박터 필로리로 도입될 수 있지만, 이들 플라스미드는 안정적으로 유지될 수 없다. 또한, 헬리코박터 필로리 플라스미드는 E.coli 또는 헬리코박터 종에 형질전환시킬 수 없다. 따라서, 헬리코박터 필로리 셔틀 벡터를 구축하여야 한다.
헬리코박터 유래 2종의 플라스미드를 도 1 및 2에 개략적으로 나타내었다. 벡터 pHPA1(2.8kb)(도 1) 및 pHP3(3.4kb)(도 2)를 서열 분석하였고, pHPA1이 플라스미드 복제 세타(theta) 모드를 통해 복제되는 것으로 확인하였다. 롤링-서클 복제 플라스미드와는 반대로, 세타 플라스미드는 복제하는 동안 단일가닥의 DNA 중간체를 만들지 않으며, 이들은 변칙 재조합(illegitimate recombination)을 겪는 경향이 낮으므로, 더욱 안정적인 벡터 후보체이다. 나아가, pHPA1 복제 오리진(ori)은 복제 통제 및 안정적인 카피수 유지에 관여하는 일련의 직접 반복 서열(direct repeat sequence, "iterons")을 함유하고 있다. 벡터 pHP623은 이러한 특성의 많은 부분을 공유하고 있다.
이들 2종의 벡터의 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타낸다.
(1) 플라스미드 pHP1은 이종 가닥 형태로 나타내었다(위쪽 가닥은 서열번호 1이고, 아랫쪽 가닥은 서열번호 2임):
Figure 112007020311019-pct00001
Figure 112007020311019-pct00002
(2) 플라스미드 pHp3은 단일가닥 형태로 나타내었다(서열번호 3):
Figure 112007020311019-pct00003
클로닝된 추가적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로 기재하며, 이는 45개의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 코딩하는 135 bp 단편을 포함한다(서열번호 5). 이처럼 작은 45개의 아미노산 펩티드는 C형 간염 바이러스(HCV) 코어 항원의 면역원 폴리펩티드이다. 45개의 아미노산 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 하기에 나타내며, 135개의 뉴클레오티드는 밑줄로 표시하였다(서열번호 5).
Figure 112007020311019-pct00004
서열번호 4
Figure 112007020311019-pct00005
서열번호 5
서열번호 4의 핵산을 헬리코박터 필로리 26695의 hopE 유전자(서열번호 6, 하기 기재)를 서열번호 4의 504번(굵은체/밑줄로 표시/ 단백질 산물의 아미노산 잔기 168번에 해당)에 클로닝하여, 발현된 산물은 HopE 유전자 산물의 표면 노출된 루프의 일부로서 위치될 것이다. 이러한 구조체, 벡터 pTMI03-8(도 6)을 E. coli의 표면에서 발현시켰다.
Figure 112007020311019-pct00006
Figure 112007020311019-pct00007
(서열번호 6)
간략하게는, hopE 유전자 분리를 수행하는 한가지 방법은 Taq DNA 중합효소를 이용하여 헬리코박터 필로리 22695로부터 증폭시키는 것이다. 상류 프라이머는 BamHI 부위를 포함하는 5'AAGGATCCGATAGGAATGTAAAGGAATGG-3'(서열번호 7)이고, 하류 프라이머는 EcoRI 부위를 포함하는 5'CCGAATTCTAAAGGCATGAACGCTTGCA-3'(서열번호 8)으로, 이들은 Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc. model 332(ABI; Mississauga, Ontario, Canada)와 같은 DNA 합성기로 구축할 수 있다. 제조되는 PCR 단편은 lac 프로모터와 동일한 배위로 pBluescript II KS(+)의 EcoRV 부위에 블런트-엔드 클로닝할 수 있다.
이후, C형 감염 바이러스(HCV) 코어 항원의 135bp 면역원 코딩 서열을 삽입하기 위해, hopE 유전자에 2가지 고유한 제한효소 부위를 삽입을 위한 PCR 프라이 머를 제작할 수 있다. Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR 증폭은 다음과 같이 터치다운(touchdown) 증폭 공정으로 수행할 수 있다. PCR 써모사이클러(thermocycler)는 96℃에서 4분간 첫번째 변성 단계, 이후의 65℃(90초) 첫번째 어닐링, 이는 연속적인 각 사이클에서 0.5℃ 감온, 72℃에서 6분간 연장 단계, 및 96℃에서 1분간 변성 단계로 이루어진 18회의 사이클이 수행되도록 프로그래밍되어 있다. 처음 18번의 사이클이 끝나면, 72℃ 연장, 96℃ 변성 및 일정한 55℃에서의 어닐링으로, 추가적인 14번의 증폭 사이클을 수행할 수 있다. 수득되는 증폭물은 컬럼으로 정제하고, 에탄올을 이용하여 침전시킨 다음, DNA 중합효소의 클레나우 절편으로 절단하여 블런트를 만든다. PCR 산물은 제한 효소로 절단하여, 주형 DNA를 제거할 수 있으며, pTM103.8과 같은 적정 벡터에 아라비노스 유도성 프로모터의 통제하에 다시 연결시키고, 이를 E. coli JM105에 형질전환할 수 있다.
재조합 클론은 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-AGATCTAAGGACGTC-3'(서열번호9) 및 증폭 반응에서의 역방향 시퀀싱 프라이머를 이용하여 동정할 수 있다. 동정한 클론은 서열 분석하여, 삽입된 제한 엔도뉴클레아제 부위가 인프래임이고, hopE 유전자에 실수없이 도입되었음을 검증할 수 있다. C형 간염 바이러스(HCV) 코어 항원의 135 bp 면역원 코딩 서열은 이후 표준 기법으로 삽입할 수 잇다.
벡터 pTMI03-8이 만들어졌으며, 이를 E. coli를 형질전환 시킨 다음 37℃에서 증식시켰다. 이후, 세포를 회수하여, HCV 삽입체의 발현을 웨스턴 블롯으로 검증하였다.
간략하게는, 이러한 공정은 다음과 같다. 약 20개의 플레이트에서 세포를 회수하여, 10mM Tris-HCl (pH8.0) 중의 50mg의 DNase I(Boehringer Mannheim)이 함유된 20% 슈크로스 용액에 재현탁하였다. 이후, 고압력 세포 파쇄기(French pressure cell)를 이용하여 15,000 lb/in2에서 세포를 파괴시켰다. 파괴된 세포는 10mM Tris-HCl(pH8.0) 중의 70% 1ml과 70% 6ml의 슈크로스로 구성된 슈크로스 단계 농도 구배위에 적층하였다. 외막 분획을 수집하여 150,000 xg에서 펠렛화한 다음, 펠렛은 증류수 100㎕에 재현탁하였다.
대안적으로, 대수기 배양물 500ml로부터 수득한 외막을 10mM Tris-HCl(pH 8.0)-3% n-옥틸-폴리옥시에틸렌에 용해시키고, 23℃에서 1시간 배양한 다음, 173,000 xg에서 30분간 원심분리하였다. 펠렛은 10mM Tris-HCl-3% n-옥틸-폴리옥시에틸렌--5mM EDTA(pH8.0)에 현탁하여, 23℃에서 1시간 배양한 다음, 173,000 xg에서 30분간 원심분리하여, 상층액을 회수하였다. 웨스턴 면역블롯에서 두번째 용해 단계의 상층액에 HCV/hopE가 존재하는 것으로 나타났다. HCV/hopE를 함유하는 상층액을 동일 부피의 0.125 M Tris-HCl(pH 6.8), 4%(wt/vol) 소듐 도데실 설페이트(SDS) 및 20% (vol/vol) 글리세롤과 혼합하여, SDS-12% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 수행하였다. 필요한 경우, HCV/hopE 밴드를 겔의 염색되지 않은 부위에서 적출하여, 4℃에서 하룻밤동안 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0) 및 100mM NaCl로 용출시킬 수 있다. 용출 상층액은 이후 순도를 확인하기 위해, SDS-PAGE 겔상에 전기영동하고, 표준적인 기술로 웨스턴 면역블롯을 수행할 수 있다. 예컨대, 분리된 외막은 15㎍/레인의 농도로 로딩할 수 있다. 이후 불연속적인 12% 폴리아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE를 수행한다. 단백질은 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한다. 웨스턴 면역블롯팅을 위해, 염색되지 않은 겔을 Immobilon-P membranes(Millipore, Bedford, Mass.) 상으로 전기블롯팅할 수 있다. PBS(phosphate-buffered saline) 중의 3% 소 혈청 알부민(BSA; Boehringer Mannheim)-0.1% 트윈20(Sigma)으로 막을 23℃에서 2시간 블롯킹한 다음, PBS 중에서, 1% BSA - 0.05% 트윈20 중의 항-HCV 토끼 항혈청 1/10,000 희석물과 함께, 37℃에서 한시간 반응시켰다. 이후, 막은 PBS로 세정하고, 알칼라인 포스파타제가 접합된 이차 항체(Bio-Rad, Richmond, Calif.)의 1/5,000 희석물과 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 결합된 항체는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(BCIP, Calbiochem, La Jolla, Calif.) 및 니트로블루 테트라졸륨(NBT, Sigma)으로 검출한다.
실시예 2 안정적인 발현을 위한 발현 벡터 및 항원 선택
HopE는 헬리코박터 필로리의 천연 단백질이고, 이 유기체에서 허용되기 때문에, 헬리코박터 필로리에서 외부 항원 또는 그외 이종 유전자 산물을 발현하는데 유용한 구조체를 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이 쉽게 개발가능한 그외 헬리코박터 필로리/E. coli 셔틀 벡터로는, 예컨대 2종의 플라스미드 ori 부위와 각 숙주 에서 안정적인 마커를 포함하는 벡터가 있다. 마커는 E. coli 및 헬리코박터 필로리의 전사 시스템 모두에서 인지될 수 있는 프로모터 뿐만 아니라 클로람페니콜/카나마이신 내성에 대한 유전자를 포함할 수도 있다.
E. coli 복제에 필요한 사항은 공지된 다수의 E. coli 플라스미드(예, pBR322)를 이용하여 충족될 수 있다.
구축한 셔틀 벡터는 E. coli와 헬리코박터 필로리 둘다에서 시험관내 복제를 테스트할 수 있으며, 문헌에 개시된 기존 셔틀 플라스미드와 비교할 수 있다.
발현되는 항원 또는 그외 이종 유전자 산물의 선택은 헬리코박터 필로리 및 E. coli에 무독하며, 동물의 선택부에 전달하였을때 면역원성이 높은(또는 다른 바람직한 특성을 가진) 것이 이상적이다. 포유류의 면역화를 위한 발현 항원은 경우, 상기 부위는 점막 부위일 수 있다.
실시예 1에 개시한 바와 같이, hopE/HCV 코어 항원 융합 단백질은 E. coli 표면에서 발현시킬 수 있다. pTMI03-8(도 3)의 산물은 바람직하기로는 헬리코박터 필로리의 외막을 표적화하여, 점막 환경에서 HCV 코어 항원을 노출시킬 것이다.
파상풍 톡소이드(TT)는 인간에서의 항원으로서 널리 연구되었으며, 그것에 대한 면역 반응도 잘 알려져 있다. TT는 세균 포자의 표면에 노출되었을때 경구 또는 비내 투여시 우수한 점막성 면역 반응을 도출한다(Duc & Cutting, 2003, Expert Opinion Biol Ther, 3(8), 1263-70). 파상풍 독소 C 단편은 전술한 바와 같이 hopE 유전자 산물에 융합하거나, 또는 막 고정(abchor) 및 세포 표면 표적 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 이러한 시스템의 이점은 백신접종의 효과를 판 단할 수 있는 매우 잘 특정화된 뮤라인 모델이 있다는 것이지만, HCV 경우는 공지의 뮤라인 모델은 전형적으로 면역 결핍성 마우스에 의존한다. 사이토메갈로바이러스(CMV)의 gB 단백질은 gB 항원을 발현하는 조작된 백시나(Vaccinia) 바이러스의 치사량에 대하여 마우스를 면역화하는 것으로 입증되었다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은, HCV 항원 대신 gB 항원을 포함하는 셔틀 벡터를 실시예 1의 프로토콜을 이용하여 구축할 수 있다.
셔틀 벡터에 다수의 프로모터를 사용할 수 있다. 이상적으로, 사용되는 프로모터는 헬리코박터의 생체내 천연 집락화 메카니즘이나 소모될 수 있는 무해한 영양소 또는 화합물을 이용하여 유도함으로써 유도가능하다. 예컨대, 산성 pH에 의해 유도되는 것으로 보고되었으며, 위 점막에서의 집락화와 관련된 유독성 인자일 수 있는, 헬리코박터 필로리 히스티딘 키나제 HP165의 프로모터는, 이러한 프로모터 중 하나이다. 이러한 프로모터의 이점은 위 점막의 산성 환경에 노출되었을때에만 발현되기 시작하는 외부 항원이 있는 구조체를 시험관내에서 제조할 수 있다는 것이다.
다른 프로모터로는 pTMI03.8에 사용된 아라비노스 유도성 프로모터, FlaB sigma 54 프로모터(Josenhans et al., 1998, FEMS Microbial Lett., 161(2), 263-73), 많은 구성적인 및 유도성 E. coli 시스템에서 사용되는 널리 연구된 T7 프로모터, 혐기성 환경에서 유도되는 살모넬라의 nir B 프로모터(Chatfield et al., 1992, Biotechnology, 10(8): 888-92)가 있다. 이들 프로모터의 헬리코박터에서 기능하는 능력은 헬리코박터 필로리 플라스미드 벡터에서 프로모터 활성의 판독으 로서 CAT 및 GFP 리포터를 이용하는, Angelini et al. (2004) (Plasmid, 51:101-107)가 개발한 시스템으로 테스트할 수 있다.
표적 부위의 발현은 항원 또는 그외 사용되는 유전자 산물에 따라 결정될 것이다. 초기 연구는 발현된 폴리펩티드(예, 항원)을 헬리코박터 필로리의 세포 표면으로 표적화하는 HopE 단백질 및 융합 폴리펩티드에 집중되었다.
또한, 플라스미드 안정성 역시 매우 중요하며, 플라스미드 유지에 대한 선택적인 결정인자로서 항생제 내성 유전자를 시험관내에서 사용하는 것이 유용하지만, 생체내에서는 실용성이 낮다. 대안책은 안정된-치사 시스템(balanced-lethal system)이며, 그 예로는 살모넬라에서 불활성화에 사용되는 asd 유전자가 있다. asd 유전자는 본래 헬리코박터 필로리에 존재하는 것으로, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 디하이드로게나제(그람 음성 세균의 세포 벽 펩티도글리칸의 필수 구성인 디아미노피멜릭산(DAP)의 생합성 경로 효소)를 코딩한다. DAP가 없으면, asd 돌연변이는 라이시스된다. DAP는 포유류 조직에 존재하지 않기 때문에, 상기 안정된-치사 시스템은 헬리코박터 필로리의 모든 생존 요건을 이용하여 재조합 asd 유전자 함유 플라스미드를 수송한다.
asd 유전자 시스템을 이용하기 위해, asd 유전자의 게놈 카피는 표준 유전자 낫아웃 프로토콜로 불활성화한다. 이러한 헬리코박터 필로리 균주는 DAP 공급시에만 또는 asd 유전자를 함유하는 플라스미드 존재시에만 증식할 것이다.
유사한 목적으로 사용할 수 있는 그외 시스템으로는 점막 보강제로서 E. coli 장독소(enterotoxin) 또는 콜레라 독소(CT)가 있다. 또한, 보강제를 사용하 여 점막 면역 반응을 부스트할 수 있다. 이러한 2종의 보강제는 CT 및 E. coli 장독소(LT)이며, 발현된 항원은 그것의 강력한 점막 보강제 특성을 유지하지만 독성은 현저하게 감소된 LTB 및 CTB 돌연변이에 융합되어 있다.
실시예 3 유독성, LD 50
실시예 1 및 2에 개시된 바와 같이, pHP3 및 pHP1과 같은 헬리코박터를 기초로한 벡터는 마우스 또는 인간과 같은 포유류 감염에 대한 방어를 제공할 수 있다. 본 실시예에서는, 뮤라인 모델을 사용하여 인간을 포함하는 포유류에 대상 약리 활성 분자의 전달을 제공하는데 있어 헬리코박터를 기초로한 시스템을 이용하는 활용성을 설명한다. 뮤라인 모델을 채택하여, 생체내에서 발현된 표면 항원에 대하여 혈청학적 반응을 도출하는 헬리코박터 필로리의 형질전환 균주의 활성을 설명한다.
천연형 헬리코박터 필로리로 마우스를 감염시키고, 나머지 마우스에는 실시예 2와 같이 온도에 민감한 헬리코박터 필로리를 섭식(gavage)으로 접종하였다. 대조군 및 실험 동물 모두에서 혈청을 취하여 항체를 분석하고, 표 1에 기재된 계획에 따라 치사시킨 동물의 위 조직을 분석하였다. 마우스 요소 호기 검사(mouse urea breath test)도 또한 실시하였다.
표 2에서, 유독성은 50%(75 % 내지 40%) 감소하였다. 특이적인 항체 역가는 베이스라인보다 4배 증가하였는데, 이는 혈청학적 반응을 시사한다. 혈청 샘플을 베이스라인, 12, 24, 48주에 취하였다. 이러한 시간대에, 10 및 20마리의 동물을 죽여 위 조직을 분석하였다.
표 1
생체내 실험
주 남아있는 마우스* 사용한 마우스 혈청 조직 조정
0 50 0 40 0 0
12 50 10 40 10 109.2
24 40 10 30 10 218.4
48 30 30 20 20 1310.4
49 0
총 50 130 40
*C57BL/6J 암컷, 40 실험군 및 10 대조군
표 2
파워 계산(POWER CALCULATION) 유독성 연구
α=0.05 및 파워=80%에서, 헬리코박터 필로리의 여러가지 감염율
정상=75% vs TSHP=50%, 각 군의 마우스는 n=58
정상=75% vs TSHP=40%, 각 군의 마우스는 n=30
샘플 수 20은 단지 37% 파워: 차이(75% vs 50%) 검정, 및 62% 파워: 차이(75% vs 40%) 검정을 제공할 것이다.
샘플 수 20을 사용하기 위해, TSHP 감염율이 32% 이상 또는 그 이하(80% 파워 및 α=0.05)이어야 한다.
실시예 4 온도에 민감한 수종의 헬리코박터 균주들의 유독성 및 항원성 비교
외막 단백질의 발현/변형과 연관된 유독성에 있어 주된 변화를 검출하기 위해, 마우스에 실시예 3과 같이 온도에 민감한 헬리코박터 필로리를 접종하였다. 동일 크기의 마우스 대조군에는 천연형 헬리코박터 필로리 균주를 감염시켰다. 비침투적인 수단을 이용하여 헬리코박터 필로리의 존재 또는 부재를 확인하였다. 항체 측정을 위해 6 및 6달째에 마우스로부터 채혈하였다. 죽인 후, 조직 분석을 수 행하여, 위염을 분석하고, 집락화를 검증하였다. 표 3은 사용한 마우스의 혈청학 및 조직학 결과를 나타낸다.
표 3
유독성 및 혈청학 비교 실험
주 남아있는 마우스 사용 마우스 혈청학 조직학 조정
0 180 180
24 180 180
48 180 180 180 180 7862.4
49 0
총 180 540 180
실시예 5 폐렴 쌍구균 항원에 대한 온도 민감성 헬리코박터 필로리 백신의 효능을 평가하기 위한 LD 50 실험
표준적인 병원체(폐렴 쌍구균)로부터 헬리코박터를 토대로한 백신의 방어 효과를 확인하기 위해, 마우스에 온도 민감성 헬리코박터 필로리를 섭식으로 접종하였다. 동일 크기의 대조군에는 천연형 헬리코박터 필로리 균주를 감염시켰다. 비침투적인 방법을 이용하여 실시예 4와 같이 헬리코박터 필로리의 존재 또는 부재를 결정하였다. 감염 6개월 후에, Aaberge et al. (1995, Microb. Pathog. 18:141-52)에 따라, 마우스 모두에 유독성의 살아있는 폐렴 쌍구균 타입 4의 10배의 LD50(~20 CFU/mouse)을 복막내 접종하였다.
표 4에서, 대조군은 75%의 치사율을 보이며, 사망율 50% 감소(75% vs 50%)를 검출하기 위한 실험의 파워는 0.8이다.
표 4
면역화된 마우스에 대한 폐렴 쌍구균 LD 50
주 남아있는 마우스 사용 마우스 혈청학 조직학 조정
0 60 0 0
24 60 0
25 60 60 0 0 1365
26 0
총 60 0 0
실시예 6 마우스의 헬리코박터 필로리 상태 결정: 호기 검사 방법
본 실시예에서는, 인간에서 행해지는 요소 호기 검사를 마우스에 적용하였다.
10마리의 마우스에 유레아제가 없는 식이(uncooked soy)를 제공하였다. 이후 마우스에 섭식에 의해 200㎕의 향이나는 사이트레이트(flavoured citrate) 중의 3.7 kBq(14) 요소를 투여하고, 20분간 공기가 충진된 2L 플라스틱 지퍼락 백에 위치시켰다. 이후, 백내 공기 교환없이 마우스를 이동시켰다. 에탄올 중의 히아민 0.1 mmol을 투입하고, 신틸런트(scintillant)를 상기 히아민 용액에 첨가한 다음, 10분 또는 카운트 1,000 dpm가 될때까지 카운트하였다.
실시예 7 인간 실험
인간에 대한 유독성 및 항체 반응을 확인하기 위해, 헬리코박터 필로리 유사 "베일러 균주(Baylor Strain)"를 사용하였고, 하기 기준을 적용하였다:
1. 감염된 개체에는 증상이 없으며, 가벼운 조직 손상 이상의 손상이 없으며, 간염 바이러스 또는 HIV로 감염된 증거가 없다.
2. 분리물은 단일 균주, cagA 음성, 및 메트로니다졸, 클라리트로마이신(clarithromycin), 테트라사이클린 및 아목시실린(amoxicillin)에 민감성이다.
3. 시험감염을 투여받은 지원자는 정상적인 위 조직력을 가진 건강한 사람으로, 소화궤양 병력이 없으며, 집에 어린이가 없으며, 어린이와 주기적으로 접촉하지 않으며, 감염증 치료에 필요할 수 있는 항생제에 알레르기가 없다.
시험감염은 취침시의 40mg의 파모티딘(famotidine) 투여 및 아침에 비프 브로스중의 헬리코박터 필로리의 경구 투여로 구성된다. 개체에게 14일간 매일 투여하였다. 7일 및 14일 후에 13C-UBT을 수행하였고, 2주 및 3개월 후에 내시경 검사, 정량 배양 및 조직학 검사를 실시하였다. 항생제를 사용하여, 감염증을 치료하였다.
실시예 8 천연형 및/또는 TSHP의 생체내 검출용 외인성 화합물 마커 개발
천연형 또는 TSHP를 생체내에서 검출하기 위해 사용할 수 있는 화합물 마커의 예는 도 2의 구조로 표시되는 설파살라진(SSN)이다. 무균 마우스와 일반적인 랫 연구에서, 장내 세균이 디아조본드(diazo-bond) 환원에 단독 원인이어서, 설파피리딘 및 5-아미노살리실레이트의 분지 및 SSN의 환원성 이화작용을 발생시킨다. 이러한 반응을 촉매하는 효소(들)를 디아조리덕타제(들)(동의어 아조리덕타제(들)이라 한다. SSN을 투여한 일반적인 랫은 뇨와 변으로 5-아미노살리실레이트와 설 파피리딘(및 그와 관련된 접합체)를 배출하였지만, 무균 랫은 SSN 분해 증거를 보이지 않았다.
수종의 세균 종들이 디아조리덕타제(AZR's)를 가지는 것으로 알려져 있다. 예비적인 바이오인포메틱스 연구를 통해, 헬리토박터 필로리가 AZR 유전자를 함유하지 않을 수 있다는 것이 시사되었다. 또한, 비슷한 유사 서열이 존재하여도 음성적인 결과가 나타난다. 이러한 상황에서, 생활가능하고, 기능적인 아조리덕타제(azr + TSHP)를 가지는 헬리코박터 필로리 형질전환 균주(TSHP)를 사용하여, 이러한 마커의 사용을 조사할 수 있었다.
플라스미드 pTMI03-02를 EcoRI 및 HindIII로 절단하여, EcoRI 및 HindIII로 절단한 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)의 아조리덕타제(AZR)에 연결하여, pTMI03-azr라고 하는 HopE 168aa 및 AZR을 함유하는 벡터를 제조한다. 이 플라스미드를 E.coli에 형질전환시켜, HopE 168aa 및 바실러스 섭틸리스의 AZR 발현 여부를 조사하였다. pTMI02는, 전장 C형 간염 코어 항원(HCCA)으로 유사하게 처리하였을때, 웨스턴 블롯 및 항-HopE Abs를 적용한 E. coli 외막으로의 HopE::HCCA 전달을 나타내었다.
섭식을 통해 azr + TSHP를 마우스(n =30)에 감염시키고, 뇨와 변에서 5-아미노살리실레이트 및 설파피리딘(및 그와 관련된 접합체)를 생산하기 위한 생체내 AZR 발현이 확인되면, 인간에게 시도해볼 수 있다.
실시예 9 마커로서 미아그넥스 블루(DIAGNEX BLUE)의 사용
진단제 "디아그넥스 블루"는 염료(Azure-A)가 접합된 이온 교환 수지(Amberlite XE-96)로 구성되어 있다. 이 검사는 pH 2.5 미만에서 수지-염료 조합이 분해되는 사실을 이용한 것으로, 염료는 흡수된 후 뇨에서 나타난다. 뇨에 염료가 없는 사람은 무산증(achlorhydric)이다. 이러한 원칙은 도 5에 나타낸다.
동일한 원칙을 사용하여 헬리코박터 필로리를 테스트할 수 있다. 예컨대, pH >7.0에서 분해되는 염료-수지 조합은 수지를 요소와 함께 제공한다면 유레아제를 검출할 수 있다. 이는 헬리코박터 필로리가 거주하여 염료를 분비하는 점막 층에 pH>7.0을 형성한다.
마우스(n = 30)에 천연형 헬리코박터 필로리를 접종하고, 무균 마우스(n =30)는 대조군(Pilot study)으로 사용하였다. 헬리코박터 필로리가 활성 감염으로 확립되는 최적의 기간이 경과된 후, 실험군과 대조군에 섭식에 의해 정해진 함량의 수지-염료 복합체를 투여하였다. 이후 요소 용액을 투여하였다(Range 0.01M 내지 0.5M). 마우스를 메타볼릭 케이지(metabolic cage)에 사육하고, 아주레(azure) 염료 배출을 모니터링하여 정량하였다. 여러가지 비율의 수지 및 요소 농도를 테스트하여, 사용되는 최적 조합을 검증하였다.
실시예 10 전달 제형
에어로졸에 의한 투여를 위해, 본 발명에서는 가압 팩 또는 분사기로부터 적정 추진제를 이용하여 에어로졸 스프레이 프리젠테이션(presentation) 형태로 전달할 수 있다. 가압 에어로졸 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 측정할 수 있다. 제형은 흡입에 의한 투여용 분말로서 제조된다. 흡입에 의한 투여는 또한 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 원자화 용액(atomizing solution) 또는 현탁액에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 정맥내 조제물로서 개체에 투여하기 위한 경구 소화용 액체 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 여러가지 조제물은 적절하다면 추가적인 적합한 약학 보조제를 이용하여, 당업자에게 친숙한 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 헬리코박터 종을 단독으로 또는 그외 적합한 성분과 조합하여 포함하는 것이 이롭다.
상기 단독 또는 헬리코박터 제형의 조합은 본 발명에 따른 약리학적으로 허용가능한 조성물을 포함하는 약리학적 조성물내에 함유될 수 있다. 본원에서 약리학적 조성물은 고형(예, 분말, 입자, 과립, 사케트, 정제, 캡슐 등), 반고형(젤, 페이스트 등), 또는 액체(용액, 분산액, 현탁액, 에멀젼, 혼합물 등) 형태일 수 있으며, 예컨대 위장관 및 위 점막을 통해 투여하기 위해 고안될 수 있다. 따라서, 약리학적 조성물은 사용하기 전에 수계 매질에 분산시키도록 고안된 분말 또는 미립자 형태일 수 있다.
액체 형태의 약리학적 조성물은 헬리코박터 조성물과 예컨대 생리 조건에 순응된 조성물, 예컨대 생리학적으로 허용가능한 용액과 같은 전해액을 포함하는 분산액 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약리학적 조성물은 다른 치료학적, 예방학적 및/또는 진단학적으로 활성인 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 제1 및 제2 용기를 포함하는 약학 키트에 관한 것으로, 제1 용기는 본 발명에 따른 플라스미드 및/또는 플라스미드 벡터를 포함하는 재조합 헬리코박터 조성물을 포함하며, 제2 용기는 헬리코박터 조성물에 대한 분산 매질을 포함하며, 사용하기 전에 상기 분산 매질에 상기 헬리코박터 조성물을 투여 및/또는 투약하기 위한 설명서가 수반된다.
상기 키트에 함유된 본 발명에 따른 헬리코박터 조성물은 분말 또는 미립자 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 키트는 헬리코박터 조성물을 분산 매질중에 분산한 후 투여하는 과정의 시간 간격에 대한 추천사항이 기재된 설명서를 포함할 수 있다.
실시예 11 헬리코박터 백신 조제물을 이용한 면역 조절
TH1 반응(T-헬퍼 세포 타입 1)은 세포 매개성 반응이다. 상기 반응의 과도한 활성은 류마티스 관절염(RA) 및 루푸스와 같인 질환의 원인으로 추정된다. 대조적으로, TH-2는 백신의 특징적인 항체 타입 혈청 반응이다. 본 실시예는 본 발명에 따라 헬리코박터를 토대로한 백신 치료 조제물을 처리하였을때 동물에서 TH-2 반응을 얻기 위한 기법을 제공한다.
본원에서, 헬리코박터 벡터 및 벡터 플라스미드 시스템을 사용하여, 동물에서 항체 반응을 유발할 수 있다. 예컨대, 세균, 클로스트리듐의 형질전환을 위해 제공된 구조체에서 유전자 발현 카세트를 이용하는 시스템, 이후 형질전환된 클로 스트리듐의 표면으로부터 단백질(S-layer 단백질)의 분비, 점막 백신접종 개시가 WO0194599에 개시되어 있으며, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다. 이들 구조체는 또한 ORF1, ORF3, ORF5-7., ORF7 및 ORF11 중에서 선택된 분비 리더 서열을 포함할 수 있다.
일부 백신 예에 있어서, 헬리코박터를 토대로한 벡터 및 벡터 플라스미드는 세균 표면 층 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 표면 층 단백질은 본원에서 단백질(proteinaceous) 특성의 임의 분자로서 정의되며, 예컨대 단백질, 당단백질 또는 세균의 외막에서 형성되고 세균의 막에 노출될 수 있는 리포단백질을 포함한다. S-층 단백질은 세포에서 다른 단백질 클래스 보다 다량으로 연속적으로 및 자발적으로 생산될 수 있다.
S-층 단백질을 가지는 그람 음성 숙주 세포, 클로스트리듐을 포함하는 재조합 세포 조제물의 제조 공정은 또한 WO-97/28263에 개시되어 있다. 공정은 변형될 수 있으며, 이후 본원에 기재된 과정에 따라 본 발명의 헬리코박터 구조체의 일부로서 S-단백질을 병합할 수 있다.
따라서, 일부 벡터 및 벡터 플라스미드 구조체에서, 대상 비-헬리코박터성 약리 활성 분자와 헬리코박터 서열을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 본 발명의 헬리코박터 구조체를 채택하고 있는 백신의 면역원성을 증강하기 위해, 융합 단백질의 헬리코박터 서열은 S-층 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 일부로서 S-층 단백질을 포함하는 바실러스 구조체는 바실러스 표면에 S-층 단백질을 발현하는 것으로 보고되었으며(WO-95/19371, Bacillus sphaericus), 따라서 조제물의 면역원성을 증강시킨다.
점막 면역화는 이미 일부 질환에 대해 제공되고 있으며, 그 예로를 경구 폴리오 백신과 콜레라와 E.coli에 의한 설사에 대한 경구(음용의) 백신(불활성화 백신)이 있다. 일부 예들에서, 본 발명의 백신은 불활성화된 백신을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은 단회 투여를 제공하며, 운반 유기체, 헬리코박터가 계속적으로 항원, 즉 대상 비-헬리코박터성 약리 활성 분자를 계속적으로 생산하므로, 장기간 백신 효과가 지속되고(vaccination), 생체내 부스트 면역될 수 있는 생백신을 포함한다. 또한, 백신은 보강제와 병용 투여될 것이다. 이러한 보강제는 투여된 부분의 제거가 강한 부위를 서행시킴으로써 백신 노출 시간을 증가시키는 알루미늄 하이드록사이드나 지질 소포와 같은 분자를 포함한다. 또한, 보강제는 사이토카인 및 케모카인이라고 하는 면역조절 펩티드의 생산을 유발함으로써 작용한다(Brewer et al. 1997, J. Cytokines Cell Mol. Ther., 4:223-246). 따라서, 본 발명의 백신은 면역 반응을 강화하기 위해 사이토카인 보강제를 포함할 수 있다. 인간 또는 동물과 같은 포유류에 경구 투여하였을때, 형질전환된 헬리코박터 또는 E. coli 세균은 위장에 집락화되고, 본래 집락화되는 부위인 위벽 도처에 원하는 폴리펩티드가 생산 및 존재될 것이다. 위장관은 다양한 타입의 면역 반응 증가에 특수화된 거대한 면역 장치에 의해 둘러싸여 있다. 따라서, 재조합 헬리코박터 백신이나 펩티드 생산 균주에 의한 위장 집락화는 전통적인 백신접종보다 장기간 면역을 자극할 수 있다. 부가적으로, 항원은 장벽이나 루멘에 선호적으로 존재될 수 있다.
실시예 12 헬리코박터 및 그것의 식욕 억제제로서의 용도
본 실시예는 식욕 억제를 제공하는 조제 및 치료 요법에 헬리코박터를 채택하는 방법으로서, 본 발명의 이용성을 설명한다. 특히, 약독화된 헬리코박터와 그렐린(호르몬) 또는 그렐린 작용제의 수준을 조절하는 대상 비-헬리코박터의 약리학적으로 활성인 분자와 함께 포함하는 구조체를 장 점막에 전달하는 것은, 식욕과 정신을 조절하는 장-뇌 축의 억제를 제공하는 유효한 수단을 제공하는 것으로 예상된다.
연구를 통해, 그렐린이 식욕 자극제인 것으로 시사되며, 즉 그렐린이 마우스에서 식품 섭취를 증가시킨다(Asakawa et al. 2003, Gut, 52(7):947-52). 또한, 그렐린은 설치류의 지방 조직에서의 지방 이용성을 감소시키고(Tschop et al., 2000, Nature, 407: 908-13), 랫의 지방세포 형성(adipogenesis)에 관여하는 것으로 보고되었다(Choi et al. (2003), Endocrinology, 144 (3):751-9). 또한, 그렐린은 영양분 이용성이 낮을때 개체의 음식 섭취를 촉진시키는 공복 신호인 것으로 보고되었다.
성장 호르몬 분비 촉진 리셉터(growth hormone secretagogue receptor (GHS-R))에 대한 내인성 리간드인 그렐린은, 투여량 의존적인 양식으로 배양된 뇌하수체 세포로부터 성장 호르몬(GH) 분비를 자극하며, 주로 위 바닥(gastric fundus)의 산분비선(oxyntic gland)에서 발견되는 A 유사 세포에서 생산 및 분비된다. 그렐린은 현재 GH 분비 뿐만 아니라 식욕 및 체중을 조절하는데 작용하는 것으로 알려져 있다.
비경구 및 뇌실내(intracerebro)- 심실 투여된 그렐린은 식품에 자유롭게 접근할 수 있는 상태에서 GH 결핍된 경우에서도 마우스와 랫의 식품 섭취를 자극하고 체중을 증가시키는 것으로 확인되었다. 식욕 및 체중 조적은 GH 분비와는 독립적일 수 있다.
28개의 아미노산 펩티드인 그렐린은 이의 3번째 세린 잔기가 n-옥타노익산에 의해 아실화되었을때 활성화되며, GHS-R은 전체 그렐린 펩티드의 옥타닐화된 세린 잔기를 포함하는 첫번째, 네번깨 또는 다섯번째 잔기에 반응성을 갖는다. GHS-R은 뇌하수체, 시상하부, 부신, 갑상선, 이자, 심근, 비장 및 고환에 존재하는 것으로 확인되었다. 그렐린은 시상하부에서 NPY 및 AGRP mRNA의 발현을 자극한다. 그렐린의 중추 식욕유발(orexigenic) 효과는 시상하부의 NPY/AGRP-발현 신경에 의해 매개된다. 또한, 그렐린은 미주신경 구심 활성(vagal afferent activity)을 억제하는 것으로 보고된 바 있다. 그렐린의 말초 식욕유발 효과는 적어도 일정 부분 이상으로 미주신경 구심 활성에 대한 억제 효과에 의해 매개될 수 있다. IL-1β는 렙틴의 발현 및 분비를 자극함으로써, 및/또는 렙틴으로부터 과도한 음성적인 피드백 시그널링의 시상하부에 대한 효과를 모방함으로써, 악액질(cachectic) 과정을 매개하는, 전염증성 사이토카인이다.
그렐린 길항제가 동물의 장 점막에 제공된다면, 동물의 식품 섭취를 감소시키고, 체중 증가를 감소시킬 것으로 제시된다.
실시예 13 세포 쇠퇴를 수반하는 암 및 AIDS
본 실시예는 세포 쇠퇴, 특히 AIDS 및 암의 질환 상태와 관련있는 세포 쇠퇴를 예방 또는 저해하는, 조제물로서 이용하기 위한 본 발명의 이용성을 설명한다.
악액질은 쇠퇴, 쇠약, 연약, 영양 실조(inanition)를 특징으로 하는 증상이다. 이는 최근 암 악액질 마우스 모델에서 그렐린 펩티드 및 그렐린 mRNA 모두의 수준이 위에서 상향 조절된 것으로 보고되었다. IL-1β의 혈장 수준이 증가된 악액질 마우스에서, 그렐린의 농도 역시 악액질의 진행에 따라 증가되었다. 이러한 결과는, 그렐린 동태 및 IL-1에 의해 매개된 악액질 과정 사이에 밀접한 관계가 존재하는 것으로 시사한다. IL-1β는 CCK, 렙틴, 게스트린 관련 단백질 및 봄베신(bombesin)과 같은 식욕 억제성 물질이며, 그렐린의 작용을 길항한다.
Asakawa 등은 비경구 투여한 IL-1β는 시상하부에서의 NPY mRNA 발현과 위에서의 프리-프로그렐린 mRNA 발현을 억제하며, 복막내 투여한 그렐린은 심각한 IL-1β-유발성 식욕 감퇴를 저해하는 것으로 보고하였다. 헬리코박터 필로리 감염은 위염, 위궤양 질환 및 위 악성 종양의 발병에 주된 병원성 인자인 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 필로리가 위의 점막에 부착되면, IL-1β를 포함한 다양한 사이토카인의 분비와 관련있는 염증이 유발된다.
헬리코박터 필로리 근절은 종종 체중, 혈청내 총 콜레스테롤, 총 단백질 및 알부민 수치와 같은 일부 영양성 파라미터의 개선을 이끄는 것으로 임상적으로 관찰되고 있다. 헬리코박터 필로리 감염은 몽골리아 저빌(Mongolian gerbil)에서의 혈장 및 위의 그렐린 동태를 변형시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 인 간에서는, 헬리코박터 필로리의 근절이 혈장내 그렐린 수치의 증가와 관련있는 것으로 일부 관찰되었지만, 헬리코박터 필로리 감염은 혈장내 그렐린 수치의 어떠한 변화와도 관련성이 없는 것으로 보고되고 있다.
헬리코박터 필로리를 캐리어로서 사용하여, 위 점막에 그렐린 분비를 제공하는 것으로 작용함으로써, 이를 필요로하는 환자에게 아밀린을 제공할 수 있는 것으로 추측된다. 일부 예에서, 그렐린 수준을 감소시키기 위해, 아밀린, 아밀린 유사체 및/또는 그의 유도체, 및 아밀린 작용제(칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 및 그의 유사체 포함함)을 코딩하는 서열을 포함하는 헬리코박터 벡터를 구축할 것이다.
아밀린 길항제는 그렐린 수치를 증가시킬 수 있다. 아밀린, 아밀린 작용제, 또는 아밀린의 유효 수준을 감소시키는 그외 유사 화합물을 이용하여 아밀린의 유효 수준을 조정하여, 길항제 및 항체, 그렐린 분비를 저해 또는 자극할 수 있다. 따라서, 상기 방법의 일부 예는 체내 아밀린 또는 아밀린 작용제의 유효 수준을 증가시킴으로써, 직접 또는 간접적인 수단에 의해, 또는 아밀린 길항제를 이용하여 아밀린의 유효 수준을 낮춤으로써 또는 아밀린 생산을 저해함으로써, 그렐린의 내인적인 수준을 조정한다.
실시예 14 고셰병의 치료
본 실시예는 고셰병과 같은 효소 결핍증으로 유발되는 질환의 치료제로서 사용하기 위한 본 발명의 이용성을 설명한다. 고셰병은 가장 일반적인 인간의 리소 솜 축적 질환(lysosomal storage disorder)이며, 글루코세레브로사이드(GC)라는 효소의 결핍에 의해 발생된다(Nolta et al., (1992), J. Clin. Invest. 90 (2):342-348).
효소 치환 요법은 화학 샤페론 또는 글루코세레브로사이드를 코딩하는 서열을 포함하는 헬리코박터 백신 구조체와 함께 제공된다(Sawker et al., (2002), PNAS USA 99(24): 15428-15433). 따라서, 기능적인 β-글리코시드(β-Glu, 글루코세레브로사이드)의 증강된 수준을 수득할 수 있다. 특히, 화학 샤페론 데옥시노기리마이신을 코딩하는 서열을 헬리코박터 필로리 구조체에서 사용될 수 있으며, 환자에게 경구 또는 위내로 투여될 수 있다.
또다른 예의 일부로서, 글루코세레브로사이다제(GC)를 코딩하는, 대상 비-헬리코박터성 약리 활성 분자를 가지는 벡터를 포함하는 헬리코박터를 토대로한 구조체를 제공한다. 배양된 고셰 골수에 글루코세레브로시다제의 레트로바이러스 매개 전달 방법은 Nolta et al. (1992)에서 고셰 질환을 치료하는 한가지 방법으로서 개시되어 있다. 그러나, 이러한 방법은 매우 침투적이다. 결핍성 효소, 글루코세레브로시다제에 대한 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 헬리코박터를 토대로한 구조체를 채택하는 다른 효소 치환 요법은, 이러한 요법에 비해 보다 더 매력적이고 저렴한 대안책이다.
실시예 16
본 실시예는 본원에서 헬리코박터 벡터 및/또는 플라스미드 벡터를 포함하는 백신 접종 조제물을 이용하여, 림프종, 특히 MALT 림프종과 같은 세균 유발성 악성 종양을 치료 및/또는 저해하는데 적합한 이용한 조제물을 제공하기 위한 본 발명의 이용성을 설명한다.
Sutton et al.(2004)(Vaccine, 22 (20): 2541-6)은 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis)에 대한 동물의 백신접종/면역화 결과로서, 세균 유발성 악성 종양, 특히 원발성 위 MALT 림프종에 대한 방어를 보고하였다. 따라서, 헬리코박터 팰리스 이외의 것에 대한 면역화 조제물을 제공하기에 적합한 벡터 및/또는 플라스미드 벡터를 포함하는 본 발명의 개시된 헬리코박터 필로리 구조체를 사용하여, 세균 유발성 악성 종양, 특히 원발성 위 MALT 림프종에 대한 백신접종 방어를 제공할 수 있다.
본 출원에 인용된 모든 문헌, 특허, 저널 및 그외 자료는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 여러가지 예를 함께 들어 충분히 설명되지만, 당업자들에게 여러가지 수정 및 변형은 자명한 것이다. 이러한 수정 및 변형은 본 발명을 벗어나지 않는 한 첨부된 청구항에 의해 규정된 바와 같이 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해된다.
BIBLIOGRAPHY
하기 참조문헌은 원용에 의해 본원에 특히 포함된다.
Figure 112007020311019-pct00008
Figure 112007020311019-pct00009
Figure 112007020311019-pct00010
SEQUENCE LISTING <110> Marshall, Barry <120> BACTERIAL DELIVERY SYSTEM <130> FP22313 <140> AU 2004904564 <141> 2005-08-12 <150> AU 2004904564 <151> 2004-08-13 <150> US 60/602,859 <151> 2004-08-20 <160> 9 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2796 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 1 gtcatgcgcg ttgtttttaa ttacatttta aacaacttgt tgttgttttt acatgtttta 60 ctcgcatgcg cgcgcgtgag ggattggggg ttgcaacccc ctaaataacg aagctgtagg 120 gtttctcatt tttgtggtga aaatgaataa aacagaactt cttgccaaca ctaacagaac 180 ttcttgccaa cactaacaga acttcttgcc aacactaaca gaacttcttg ccaacactaa 240 cagaacttct ttattttaaa gttatgatta ttaacaattt ttagacataa taacagcgtg 300 tgaagatact tttgtagcgg tatttcctat gtgcggcaaa atttggagca attagcttga 360 cttggttgag ttagtgggtt ggaggataga gagggcgaca cctcgttagg aggtatcaat 420 gtgaaagtat ttgtcgtatt agttctagta ttagtaattc tcgcacaatt gctatattag 480 gcttattcgt ggtctaaccc cttgtttatg ggggttggct cgttataagc atactgatac 540 gatcacactt attatacacc aaaagataag gagtatagag tggaatttga tcaatcagat 600 ttacaaaaag cgttgaaaat attagataca ctcccacaaa ccccacaaat tgagctacaa 660 aaacaagaaa tacaaaaccg catcaacaaa ataacagaga caatcattaa agaattacta 720 tcaaagcatg aaatcaagaa agaagaacta gaacccactc taaccccaaa acccacacca 780 ctcaaagagc cacaaaccac cccaacacca tgcaaagatt tagtggttag cacccctaaa 840 gataaaacct aatatcacct accacaataa cgctaataag gtcaatctag ggaaattgag 900 cgaaagggaa gccaatcttt tattcgctat ttttcaaaaa ctcaaagccc aagggaatac 960 cctcattcgt tttgaaccgc aagatttgaa acgcatgcta aacatagata tttctaatga 1020 gcgcttatca gaagtcgtta ttaagctgtg ggatagcatt aaaaccgctg atttttggaa 1080 aattagcgaa accgaaactt caatcattca agaaaattac atgcttttta gtcggtgtaa 1140 aattgaattg aacaaaccga gtaaagattt gaagtattta gaaatccaac tcaacgataa 1200 ctatcaagac ttactcaaca atctgggcat gggtcaatac acttctttca atctgttaga 1260 atttcaaaga gtgaggggta aatacgctaa aacgctctat cgcttgctca agcaatacaa 1320 aagcacaggg attttgagcg tggaatggac tcaattcagg gagcttttag acattccaaa 1380 agactacaaa atggaaaaca tcgatcaaaa agtcttaacc ccctctctca aagaactcag 1440 aaaaatctac ccttttgaac acttgagcta taaaaaagaa cgcaaaagcc attacaagcg 1500 caaagtaacc cacattgatt tttattttga gcaatttcct taaggcgaaa ataagaaaca 1560 aaacaaagcc gacaagcaac gcgctcaaag ggacatcaag cttgtagcat gggatattca 1620 caaccaaatc gctaaaagaa acgcaaaagc cactatggaa gctaggtttc ttgaattgaa 1680 aactttgatc ggctatcagt tcaggaacaa tgacagtagg aacaaattaa agattgacaa 1740 caccactttt gaaagaatca aatgtattta catgtatctt aaccctaaaa ataagcataa 1800 cccccaaaaa ttccttgtat ccaacaagac attcgcattg gaactactat atatcaatag 1860 atacagccta aaaaaaagac aacttgctag aagaatttaa ccccccaaaa tccaccctat 1920 caccaacgaa cctatcaagg aatttgcaga atacatcggc aaaacgatta acatcaccaa 1980 cttcaatgtg gatcaatgcc atgagggaat cagcaactac ctgacaatca ctaggatcgt 2040 gaactggacg taatcggatc tgtatttggt ccagatgtgg ataagcctgg gacttctcaa 2100 gcctttcatt gctaaagtga gaaaatttgg ggattggttc aagaacacta caggtgaaaa 2160 gacagatgca tgctgactaa actcatagaa aaactgaatc acgaaagaaa gaatgcaagc 2220 agaaaacaaa cacctaaaag aacaaggact agaaaaaatc tacactcaaa aagactacga 2280 gcagttaaaa gaacagcatt tgaaagaaat tgaagcactc aaaaaagaaa tccaaaaaac 2340 caagcaagaa acatacacgc aaccaaaaga atgtagccat ttagcgcatt cttttagccc 2400 taattcattc tttcaatcaa aatccgacta attcatcggc taaacgctaa aaatcgctta 2460 aaacgaaaaa tacaaagcaa aaaacttcat tcccctttta gtcgttaacc atttagccaa 2520 tctaactagt ttagcatcta aaggcgaatc tatcttgtgt tagacatcca accttaccaa 2580 aaccgcagag cgagcttaag agagattcaa gcggttttgc acgattgttt gctgccaaga 2640 aaaccaacaa gcgaagtaag gcgcatagac aaaagcgcat cgcagtttga aagcgtaggc 2700 gtcagaagtg gtttgcgtta gaatcaaaca agatagcgca aacctggcgt taggctaaaa 2760 aacccctaaa aactaaaacc ccaaaatatg tagtgc 2796 <210> 2 <211> 2796 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 2 cagtacgcgc aacaaaaatt aatgtaaaat ttgttgaaca acaacaaaaa tgtacaaaat 60 gagcgtacgc gcgcgcactc cctaaccccc aacgttgggg gatttattgc ttcgacatcc 120 caaagagtaa aaacaccact tttacttatt ttgtcttgaa gaacggttgt gattgtcttg 180 aagaacggtt gtgattgtct tgaagaacgg ttgtgattgt cttgaagaac ggttgtgatt 240 gtcttgaaga aataaaattt caatactaat aattgttaaa aatctgtatt attgtcgcac 300 acttctatga aaacatcgcc ataaaggata cacgccgttt taaacctcgt taatcgaact 360 gaaccaactc aatcacccaa cctcctatct ctcccgctgt ggagcaatcc tccatagtta 420 cactttcata aacagcataa tcaagatcat aatcattaag agcgtgttaa cgatataatc 480 cgaataagca ccagattggg gaacaaatac ccccaaccga gcaatattcg tatgactatg 540 ctagtgtgaa taatatgtgg ttttctattc ctcatatctc accttaaact agttagtcta 600 aatgtttttc gcaactttta taatctatgt gagggtgttt ggggtgttta actcgatgtt 660 tttgttcttt atgttttggc gtagttgttt tattgtctct gttagtaatt tcttaatgat 720 agtttcgtac tttagttctt tcttcttgat cttgggtgag attggggttt tgggtgtggt 780 gagtttctcg gtgtttggtg gggttgtggt acgtttctaa atcaccaatc gtggggattt 840 ctattttgga ttatagtgga tggtgttatt gcgattattc cagttagatc cctttaactc 900 gctttccctt cggttagaaa ataagcgata aaaagttttt gagtttcggg ttcccttatg 960 ggagtaagca aaacttggcg ttctaaactt tgcgtacgat ttgtatctat aaagattact 1020 cgcgaatagt cttcagcaat aattcgacac cctatcgtaa ttttggcgac taaaaacctt 1080 ttaatcgctt tggctttgaa gttagtaagt tcttttaatg tacgaaaaat cagccacatt 1140 ttaacttaac ttgtttggct catttctaaa cttcataaat ctttaggttg agttgctatt 1200 gatagttctg aatgagttgt tagacccgta cccagttatg tgaagaaagt tagacaatct 1260 taaagtttct cactccccat ttatgcgatt ttgcgagata gcgaacgagt tcgttatgtt 1320 ttcgtgtccc taaaactcgc accttacctg agttaagtcc ctcgaaaatc tgtaaggttt 1380 tctgatgttt taccttttgt agctagtttt tcagaattgg gggagagagt ttcttgagtc 1440 tttttagatg ggaaaacttg tgaactcgat attttttctt gcgttttcgg taatgttcgc 1500 gtttcattgg gtgtaactaa aaataaaact cgttaaagga attccgcttt tattctttgt 1560 tttgtttcgg ctgttcgttg cgcgagtttc cctgtagttc gaacatcgta ccctataagt 1620 gttggtttag cgattttctt tgcgttttcg gtgatacctt cgatccaaag aacttaactt 1680 ttgaaactag ccgatagtca agtccttgtt actgtcatcc ttgtttaatt tctaactgtt 1740 gtggtgaaaa ctttcttagt ttacataaat gtacatagaa ttgggatttt tattcgtatt 1800 gggggttttt aaggaacata ggttgttctg taagcgtaac cttgatgata tatagttatc 1860 tatgtcggat tttttttctg ttgaacgatc ttcttaaatt ggggggtttt aggtgggata 1920 gtggttgctt ggatagttcc ttaaacgtct tatgtagccg ttttgctaat tgtagtggtt 1980 gaagttacac ctagttacgg tactccctta gtcgttgatg gactgttagt gatcctagca 2040 cttgacctgc attagcctag acataaacca ggtctacacc tattcggacc ctgaagagtt 2100 cggaaagtaa cgatttcact cttttaaacc cctaaccaag ttcttgtgat gtccactttt 2160 ctgtctacgt acgactgatt tgagtatctt tttgacttag tgctttcttt cttacgttcg 2220 tcttttgttt gtggattttc ttgttcctga tcttttttag atgtgagttt ttctgatgct 2280 cgtcaatttt cttgtcgtaa actttcttta acttcgtgag ttttttcttt aggttttttg 2340 gttcgttctt tgtatgtgcg ttggttttct tacatcggta aatcgcgtaa gaaaatcggg 2400 attaagtaag aaagttagtt ttaggctgat taagtagccg atttgcgatt tttagcgaat 2460 tttgcttttt atgtttcgtt ttttgaagta aggggaaaat cagcaattgg taaatcggtt 2520 agattgatca aatcgtagat ttccgcttag atagaacaca atctgtaggt tggaatggtt 2580 ttggcgtctc gctcgaattc tctctaagtt cgccaaaacg tgctaacaaa cgacggttct 2640 tttggttgtt cgcttcattc cgcgtatctg ttttcgcgta gcgtcaaact ttcgcatccg 2700 cagtcttcac caaacgcaat cttagtttgt tctatcgcgt ttggaccgca atccgatttt 2760 ttggggattt ttgattttgg ggttttatac atcacg 2796 <210> 3 <211> 3444 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 3 tctacacaat taacaatctt tagctacaat aacagcgtgt gaagatgctt tcacagcggt 60 atttcctatg tgcggcaaaa tttggagcaa ttaacttgac ttggttgggt tagtgggttg 120 gaggatagag agggcgacac ctcgttagga ggtatcaatg tgaaagtatt tgtcgtatta 180 gttctagtat tagtaattct cgcacaattg ctatattagg cttatttgtg gtctaacccc 240 ttgtttatgg gggttagatc cttataagca tactgatacg atcacactta ttatacacca 300 aaagataagg agtatagagt ggaatttgat caattagaat cacaaagatc agacttacaa 360 aaagtgttaa aagaattaga tacactccca aaaaccccac aaattgagct acaaaaacaa 420 gaaatacaaa accgcatcaa caaaataaca gacacaatca ttaaagaatt actatcaaaa 480 catgaaatca aaaaagaaga actagaaccc actctaaccc caaaacccac accaacaaaa 540 gagccacaaa ccacccccac accatgcaaa aatttagtgg ttagcacccc taaagataaa 600 acctatatca cctaccacaa taacgctaat aaggtcaatc tagggaaatt gagcgaaagg 660 gaagccaatc ttttattcgc tatttttcaa aggcttaaag atcaagggaa taccctcatt 720 cgttttgaac cgcaagattt aaaacgcatg atcatggtca aatccaactt aaccaacagg 780 caattattgc aagtcttaaa aaatttgctt gacaacatta gcggtgctaa tttttggatc 840 aattagagag catgttgaaa atggcgaaat ctatgaagat cacactagct acatgctttt 900 caaacaattt gaaatccgca tccataagcc aacacaaact atagaatact tagatgtcca 960 actcaatgat agctatcaat acttgctcaa caatctagga atgggcggtc aatacacttc 1020 tttcaatctc ttagaatttc aaagggtgag gggcaaatag tgagagcgtt aaatttcccc 1080 cccctattcc ccttaaaaag gacccttatc ccagggaatt tttggcccca atacaattag 1140 ggccaaaaac ccggtccctt ccatggctta accaacccaa ttgggggatt ccaatttccc 1200 ctggatggga ataacccaag gctttttttg aaaattccac ctaccatttg gtccaaaatt 1260 ggatggacaa ttccaaattc caaatcttct tttccaagaa tgggggccaa cccttgacaa 1320 actccttaaa ccttttcatt cggctaaaag gttgaaaaac atttggaaga tttggtttaa 1380 ggaaatattt atcgggtgaa aagaccagat gcatggctaa cttaaactcc atagaaaaac 1440 tgaatcacga aagaaagaat gctatcaaaa atggcattta ccacttgatc caaatcaaat 1500 tttcttacaa ctccaatcgc attgaaggaa gcggtttgac ttatgaacaa accgctcata 1560 tttttgacaa atccgttctc ataactgaaa aaaacaccaa tatcaaactt gatgatattt 1620 ttgaaactat caatcatttt gaatgcgtga attacttgct tgaaagctat aaagaacctt 1680 tgagtttaga atactttaag aatttacaca aaatcttgaa aaagaattgt tctgatgaag 1740 ttattggtga ttttaaaaaa cgccctaatt ttgtaggcaa tagcgccaca acaagaccca 1800 aattagttga aagcgaattg acaaatcttg tgaaaaatta tcaacgcaac cttgaagtga 1860 gtttgaaaaa caatatcatg cctttcatca tagaaaacga acacaaagcc ttttactaca 1920 ggggcatcaa agaatatgac aacacaaaag gctacttgaa agacaccatt ttgcaaagtc 1980 aagacaattt caatgaaatg gttagctatt tcttttcttg agtgaaaccg cttatttttg 2040 cttgtgtgct tttgtttttt gcgtttttag ttgtaggtgg taagaaatat cggttttttg 2100 cttttcgttg gttgtaggcg attttagata gcaaaaaaca gctaaaaaat ccaagcaacc 2160 taattgattt caaaccaact tcatttccct tttagtcgtt agccatttag ccaatctaac 2220 tagtttagca tctaaaagcg catataactt gagttagcaa tccaaccaat actaaaaccg 2280 cctagcgaag cgttagcgag caaaataagc ggttttagac cgattgtttg ctgacaagca 2340 aacaccaata agcgagcgtt agcgagcatg gacaaaagcg catcgcagtt tgaaagcgta 2400 ggcgttagcc gaagctgttt tgcgtaagca aatcaaacaa gatagcgcaa gccgaggtgc 2460 agcccaagaa tttgaattaa tccatgcggt gtttagggcg ttttagcgtg atcgctttat 2520 tacatgtttt aaacagcatg ctgtttttta catgttttac tcgcatgcgc gcgcgctagg 2580 tattggtggt tggaatagcc taaataacgc agctgtatgg tttctcattt ttcggtgaca 2640 atgaataagg ggtagttctt gcgagtcata agtgtagttc ttgcgagtca taagtgtagt 2700 tcttgcgagt cataagtgta gttcttgcga gtcataagtg tagttctctt cacaatatct 2760 acacaattca caatctctag ctacaataac agcgtgtgaa gatgctttca cagcggtatt 2820 tcctatgtgc ggcaaaattt ggagcaatta gctttaaaag ctagtgggtt gggagtttgt 2880 agcgggtatg cactccgtta ggaggcacac catgaaagca tttttgatag tagtgatttt 2940 agtggtaatc ttgacacagc cactatatta aaaccttagc gttttaataa cccttataag 3000 tccgccaaga cttcttaagg gtttcactcc tgttattata tcgtcttttg aaaaataagc 3060 attaaaaggc gcttaaatgc ccatgaatac gaattttgaa cagcttagaa aacaagaatt 3120 ggaattacga aaattattag aagaattaga aacgctccca caaaccccac aaattaaact 3180 gcaaaaacaa aaaatacaaa cttacataga caagataaca ccaagtattt tgagcggttt 3240 tgatcaaaaa ttcaaagaaa ttatagaaaa tctatcaaat gaatttgaaa aagaaaaatc 3300 cacaccactc aaagagccac aaaccacccc cacaccatgc aaagatttag tggttagcac 3360 ccctaaagat aacacctata ccacctacca caataacgct aataaggtca atctagggaa 3420 attgagcgaa agggaagcca atct 3444 <210> 4 <211> 580 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 4 catgagcacg aatcctaaac ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gtcgcccaca 60 ggacgtcaag ttcccgggtg gcggtcagat cgttggtgga gtttacttgt tgccgcgcag 120 gggccctaga ttgggtgtgc gcgcgacgag gaagacttcc gagcggtcgc aacctcgagg 180 tagacgtcag cctatcccca aggcacgtcg gcccgagggc aggacctggg ctcagcccgg 240 gtacccttgg cccctctatg gcaatgaggg ttgcgggtgg gcgggatggc tcctgtctcc 300 ccgtggctct cggcctagct ggggccccac agacccccgg cgtaggtcgc gcaatttggg 360 taaggtcatc gataccctta cgtgcggctt cgccgacctc atggggtaca taccgctcgt 420 cggcgcccct cttggaggcg ctgccagggc cctggcgcat ggcgtccggg ttctggaaga 480 cggcgtgaac tatgcaacag ggaaccttcc tggttgctct ttctctatct tccttctggc 540 cctgctctct tgcctgactg tgcccgcttc agcctaccaa 580 <210> 5 <211> 135 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 5 aatcctaaac ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gtcgcccaca ggacgtcaag 60 ttcccgggtg gcggtcagat cgttggtgga gtttacttgt tgccgcgcag gggccctaga 120 ttgggtgtgc gcgcg 135 <210> 6 <211> 1108 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 6 atgccatagc atttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac 60 tctctactgt ttctccatac ccgttttttg ggctaacagg aggaattaac catggaattt 120 atgaaaaagt ttgtagcttt agggcttcta tccgcagttt taagctcttc gttgttagcc 180 gaaggtgatg gtgtttatat agggactaat tatcagcttg gacaagcccg tttgaatagt 240 aatatttata atacagggga ttgcacaggg agtgttgtag gttgcccccc aggtcttacc 300 gctaataagc ataatccagg aggcaccaat atcaattggc atgctaaata cgctaatggg 360 gctttgaatg gtcttgggtt gaatgtgggt tataagaagt tcttccagtt caagtctttt 420 gatatgacaa gcaagtggtt tggttttaga gtgtatgggc tttttgatta tgggcatgcc 480 actttaggca agcaagttta tgcacctaat aaaatccagt tggatatggt ctcttggggt 540 gtggggagcg atttgttagc tgatattatt gataacgata acgcttcttt tggtattttt 600 ggtggggtcg ctatcggcgg taacacttgg aaaagctcag cggcaaacta ttggaaagag 660 caaatcattg aagctaaggg tcctgatgtt tgtaccccta cttattgtaa ccctaacgct 720 ccttatagca ccaaaacttc aaccgtcgct tttcaggtat ggttgaattt tggggtgaga 780 gccaatattt acaagcataa tggcgtagag tttggcgtga gagtgccgct actcatcaac 840 aagtttttga gtgcgggtcc taacgctact aatctttatt accatttgaa acgggattat 900 tcgctttatt tagggtataa ctacactttt tctcgagatc tgcagctggt acgatatggg 960 aattcgaagc tttctagaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaata gcgccgtcga 1020 ccatcatcat catcattgag tttaacggtc tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga 1080 agattttcag cctgatacag attaaatc 1108 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 7 aaggatccga taggaatgta aaggaatgg 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 8 ccgaattcta aaggcatgaa cgcttgca 28 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 9 agatctaagg acgtc 15

Claims (35)

  1. 헬리코박터 속 변이체 균주로서, 상기 헬리코박터 속 변이체 균주 세포는
    (a) 분비 신호 펩티드에 연결된 비-헬리코박터성 약리 활성 분자를 코딩하는 하나 이상의 비-헬리코박터 서열; 및
    (b) 헬리코박터 속 세포 내에서 비-헬리코박터 서열의 발현 조절이 가능한, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 히스티딘 키나아제 HP165 프로모터 및 FlaB 시그마 54 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조절 서열
    을 포함하는 핵산을 포함하며,
    여기서 상기 헬리코박터 속 변이체 균주는 Dap E 변이체 균주가 아닌, 헬리코박터 속 변이체 균주.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 약리 활성 분자는 헬리코박터 필로리 종에 이종적인 것을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 서열은 플라스미드 벡터 내에 있음을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  7. 제 1항에 있어서, 약제학적 조성물의 제조에 활성 성분으로서 사용됨을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 속 변이체 균주 세포는 면역조절 폴리펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 분자를 더 포함함을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 속 변이체 균주 세포는 약독화된 헬리코박터 속 세포임을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 속 변이체 균주 세포는 비-침투성임을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 속 변이체 균주 세포는 비-병원성임을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 핵산은 비-항생제 내성 유전자 마커를 더 코딩함을 특징으로 하는 헬리코박터 속 변이체 균주.
  14. 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 변이체 균주로서, 상기 헬리코박터 필로리 변이체 균주 세포는
    (a) 분비 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된 비-헬리코박터성 약리 활성 분자를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열; 및
    (b) 헬리코박터 필로리 히스티딘 키나아제 HP165 프로모터 및 FlaB 시그마 54 프로모터로 구성된 그룹에서 선택되는 유도성 프로모터 서열
    을 포함하는 핵산을 포함하며,
    여기서 상기 헬리코박터 필로리 변이체 균주 세포는 Dap E 변이체 균주가 아닌, 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 서열은 플라스미드 벡터 내에 있음 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  16. 제 14항에 있어서, 약제학적 조성물의 제조에 활성 성분으로서 사용됨을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 변이체 균주 세포는 면역조절 폴리펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 분자를 더 포함함을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  18. 삭제
  19. 제 14항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 변이체 균주 세포는 약독화된 헬리코박터 필로리 세포임을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  20. 제 14항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 변이체 균주 세포는 비-침투성임을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  21. 제 14항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 변이체 균주 세포는 비-병원성임을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  22. 제 14항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 변이체 균주는 균주 26695임을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  23. 제 14항에 있어서, 상기 융합 단백질은 헬리코박터 서열을 포함함을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  24. 제 14항에 있어서, 상기 융합 단백질은 표면 층 단백질(surface layer protein) 서열을 포함함을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 표면 층 단백질은 HopE임을 특징으로 하는 헬리코박터 필로리 변이체 균주.
  26. (a) 플라스미드 벡터가 형질전환될 수 있는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 세포를 포함하는 배양물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 배양물에,
    (i) 분비 신호 펩티드에 연결된 비-헬리코박터성 면역원를 코딩하는 하나 이상의 비-헬리코박터 서열; 및
    (ii) 헬리코박터 필로리 세포 내에서 비-헬리코박터 서열의 발현 조절이 가능한, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 히스티딘 키나아제 HP165 프로모터 및 FlaB 시그마 54 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조절 서열
    을 포함하는 핵산을 포함하는 플라스미드 벡터를 적정 조건하에서 도입하여, 형질전환된 헬리코박터 필로리 세포를 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 비-헬리코박터성 면역원을 발현하는 형질전환된 세포를 선별하여, 면역원성 조성물을 제공하는 단계;를 포함하며,
    여기서 상기 헬리코박터 필로리 세포는 Dap E 변이체 균주가 아닌,
    비-헬리코박터성 면역원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 비-항생제 내성 유전자 마커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리는 균주 26695인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pHP1 (SEQ ID NO. 1 및 2)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pHP3 (SEQ ID NO. 3)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
KR1020077005856A 2004-08-13 2005-08-12 세균 전달 시스템 KR101245335B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2004904564A AU2004904564A0 (en) 2004-08-13 Bacterial delivery system
AU2004904564 2004-08-13
US60285904P 2004-08-20 2004-08-20
US60/602,859 2004-08-20
PCT/AU2005/001211 WO2006015445A1 (en) 2004-08-13 2005-08-12 Bacterial delivery system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070083558A KR20070083558A (ko) 2007-08-24
KR101245335B1 true KR101245335B1 (ko) 2013-03-19

Family

ID=35839077

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077005856A KR101245335B1 (ko) 2004-08-13 2005-08-12 세균 전달 시스템

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101245335B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006015445A1 (en) * 2004-08-13 2006-02-16 Marshall Barry J Bacterial delivery system

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006015445A1 (en) * 2004-08-13 2006-02-16 Marshall Barry J Bacterial delivery system

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070083558A (ko) 2007-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1789094B1 (en) Bacterial delivery system
US8029777B2 (en) Helicobacter system and uses thereof
JP2002524077A (ja) 抗原キャリヤーとしての弱毒化サルモネラｓｐｉ２突然変異体
JPH04504204A (ja) 病原性のないｐｈｏＰ型微生物を含有するワクチン
US20110200638A1 (en) Bacterial vaccine
KR101030792B1 (ko) 돼지 써코바이러스２(ｐｃｖ２) 유전자의 표면발현용 벡터 및 이로 형질전환된 살모넬라 백신 균주
KR101151004B1 (ko) 소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물
WO2012009774A2 (pt) Microrganismos recombinantes, métodos de preparação de linhagens vacinais, antígenos, composições vacinais vetorizadas, seus usos, anticorpos, kit de diagnóstico e métodos de tratamento e/ou profilaxia
EP2069493B1 (en) Methods and devices for the delivery of peptides into the gastric mucosa
KR20040101258A (ko) 세균성 포자
KR101245335B1 (ko) 세균 전달 시스템
AU2005270660B2 (en) Bacterial delivery system
US7700091B2 (en) Modified bacteria and methods of use to transform eukaryotic cells
US6825028B1 (en) Recombinant listeria
Curtiss 3rd Antigen delivery system II: development of live attenuated bacterial vectors
Liu et al. Construction and characterization of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing the babA2/ureI fusion gene of Helicobacter pylori
JP2003518933A (ja) 感染症の治療のための弱毒化微生物
WO1999011284A1 (en) Oral vaccine
CZ123699A3 (cs) Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee