KR20120049206A

KR20120049206A - Ｇｆｐ 특이적 단일 도메인 항체

Info

Publication number: KR20120049206A
Application number: KR1020120044780A
Authority: KR
Inventors: 임명운; 정상희
Original assignee: 주식회사 중겸
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2012-05-16
Also published as: KR101747823B1

Abstract

본 발명은 GFP(green fluorescent protein) 특이적 단일 도메인 항체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GFP(green fluorescent protein) 특이적 단일 도메인 항체는, GFP에 특이적으로 결합하여 GFP의 단점인 열 안정성을 개선시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

ＧＦＰ 특이적 단일 도메인 항체{GFP-specific single domain antibody}

본 발명은 GFP(green fluorescent protein)에 특이적으로 결합할 수 있는 GFP 특이적 단일 도메인 항체에 관한 것이다.

GFP(Green Fluorescent Protein)는 Osamu Shimomura에 의해 1962년에 해파리 (Aequorea victoria)에서 처음으로 보고 (Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. 1962. J. Cell Comp. Physiol. 59: 223-239)된 이후 현재까지 가장 널리 사용되고 있는 형광 단백질이며 65℃까지의 온도와 pH 5.5?12 사이에서도 매우 안정하게 존재한다(Morise, H., Shimomura, O., Johnson, F. H., and Winant, J. 1974. Biochemistry 13:2656-2662). GFP는 밝은 녹색 형광을 내는 특징 때문에 특히 세포 생물학과 분자생물학 분야에서 리포터(reporter) 및 바이오센서(biosensor)로서 광범위한 역할을 하고 있다(Phillips, G. 2001. FEMS Microbiol. Lett 204: 9-18). 그리고 위치-특이적 돌연변이 유도(site-direct mutagenesis)를 통하여 다양한 색의 형광을 방출하는 돌연변이체들을 제조하는데 사용될 수 있으며(Elleberg, J., Lippincott-Schwartx, J., and Presley, J. F. 1999. Trends Cell Biol. 9:52-56) 서로 다른 형광 단백질 사이의 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질과 단백질의 상호작용 등을 연구하는데 사용될 수 있다( Gadella, T. W. J., van der Krogt, G. N. M., and Bisseling, T. 1999. Trends Plant Sci.4:287-291). 특히, 특정 유전자의 바이오센서(biosensor) 기능을 살펴보기 위해 인간을 비롯하여 수많은 세균, 효모, 곰팡이, 어류, 식물, 파리, 포유동물 세포 등에 유전학적으로 형질도입을 시키는 연구가 널리 수행되고 있다.

GFP는 형광현미경의 발달로 세포 생물학 및 기타 생물학적 분야에서 보다 유용하게 이용되고 있는데(Yuste, R. 2005. Nat. Methods 2: 902-4) 이는 살아있는 세포에서 유용한 가장 작은 형광성 입자로 알려진 FITC(Fluorescein Isothiocyanate)보다 살아있는 세포에서 덜 해로운 조명을 방출하고 광학독성이 없는 장점이 있기 때문이다. 이런 장점들 이외에도 GFP는 형태학적 구별이 가능해 다른 구조로 표현이 가능한데 이 특징을 이용하여 DNA와 이들이 암호화하는 단백질을 밝히는데 이용되기도 한다. 그러나 이런 수많은 장점들을 가지고 있음에도 불구하고 UV 파장대인 395nm에서 가장 밝은 형광을 보이는 단점이 있다. UV는 직접 눈으로 볼 수 없는 광이기 때문에 GFP 형광을 직접 눈으로 관찰할 수 없다는 단점이 있으며 특히, 70℃ 이상의 온도에서는 불안정하고 형광의 감광 정도가 다른 형광단백질에 비해 높지 않다는 것이 중요한 단점으로 지적되고 있다. 이러한 단점들을 극복하기 위해 유전학적으로 GFP 유사 형광단백질들이 제조되고 있으나 시간적인 문제, 비용적인 문제 등이 여전히 문제점으로 남아있다.

현재 상업적으로 이용 중인 항체들은 300,000개 이상이라고 보고되어 있지만 주로 고정화된 세포 내에서만 관찰이 가능하며 이러한 점들 때문에 실시간으로 세포 내에서 단백질의 접힘이나 단백질들 간의 상호작용 등을 관찰할 수 없었다. 또한 기존의 항체들은 너무 크거나 화학적으로 불안정하여 살아있는 세포 내에서 유용하게 사용될 수 없었다. 그러나 1993년에 Hamers-Casterman에 의해 낙타과 동물에서 유래한 항체는 기존의 항체(두개의 중쇄(heavy chain)와 두 개의 경쇄(light chain))와는 다른 구조인 중쇄로만 항체가 구성되어 있지만 기능적으로 완전한 항체역할을 하는 단일 도메인 항체가 보고(Hamers-Casterman, C. et al. 1993. Nature 363:446-448)되었다. 기존의 항체들은 150kDa, 재조합 항체들은 25?50kDa이나 낙타, 라마, 상어에서 유래한 단일 도메인 항체는 12?13kDa으로 가장 작은 크기의 항체여서 세포 내로 쉽게 이동이 가능하며(Cortez-Retamozo, V. et al. 2004. Cancer Res. 64:2853-2857,) 유전적 조작이 용이하여 세균과 효모에서 쉽게 발현이 되는 장점이 있다(Arbabi-Ghahroudii, M. et al. 1997. FEBS Lett. 414:521-526). 또한, 단일 도메인 항체는 높은 수용성이며 극도의 pH조건, 90℃까지의 온도 조건에서도 안정적인 특징이 있다(Dumoulin, M. et al. 2002. Protein Sciii. 11:500-515, Dumoulin, M. et al. 2003. Nature 424:783-788).

이처럼 단일 도메인 항체는 기존의 항체와 비교하여 다양한 장점이 있으나, 이를 이용하여 GFP의 단점을 극복하기 위한 연구는 보고된 바 없다. 따라서, 단일 클론 항체를 이용하여 GFP에 특이적으로 결합시킴으로써 GFP의 안정성을 증가시키기 위한 연구가 필요하다.

KR

10-2010-0013470

A

본 발명자들은 GFP(green fluorescent protein)의 안정성을 증가시키고 형광의 감광을 증가시키기 위해 연구하던 중, GFP에 특이적인 단일 도메인 항체를 개발하여 이를 GFP 에 결합시키는 경우 GFP의 열안정성 및 형광 감광이 증가됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GFP 특이적 단일 도메인 항체를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기의 항체가 결합된 열 안정성이 개선된 GFP와 이를 포함하는 면역 센서를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기의 항체를 GFP에 결합시켜 65℃~ 75℃에서 GFP의 형광발현을 유지시키는 것을 특징으로 하는 GFP의 열 안정성 개선 방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 GFP(green fluorescent protein) 특이적 단일 도메인 항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 항체가 결합된 열 안정성이 개선된 GFP와 이를 포함하는 면역 센서를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 항체를 GFP에 결합시켜 65℃~ 75℃에서 GFP의 형광발현을 유지시키는 것을 특징으로 하는 GFP의 열 안정성 개선 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 GFP(green fluorescent protein) 특이적 단일 도메인 항체는, GFP에 특이적으로 결합하여 GFP의 단점인 열안정성을 개선시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 LB 평판 배지상에서 GFP의 발현 결과를 나타낸 도이다[1 (a; GFP/pET28a/BL21DE3, 0mM IPTG, b; GFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 0mM IPTG, c; GFP/pET28a/Rosseta2DE3, 0mM IPTG, d; GFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 0mM IPTG), 2 (a; GFP/pET28a/BL21DE3, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, b; GFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, c; GFP/pET28a/Rosseta2DE3, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, d; GFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양), 3 (a; GFP/pET28a/BL21DE3, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, b; GFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, c; GFP/pET28a/Rosseta2DE3, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, d; GFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양)].
도 2는 LB평판 배지 상에서 RFP의 발현 결과를 나타낸 도이다[1 (a; RFP/pET28a/BL21DE3, 0mM IPTG, b; RFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 0mM IPTG, c; RFP/pET28a/Rosseta2DE3, 0mM IPTG, d; RFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 0mM IPTG), 2 (a; RFP/pET28a/BL21DE3, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, b; RFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, c; RFP/pET28a/Rosseta2DE3, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, d; RFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양), 3 (a; RFP/pET28a/BL21DE3, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, b; RFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, c; RFP/pET28a/Rosseta2DE3, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, d; RFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양)].
도 3은 LB 평판 배지 상에서 YFP의 발현 결과를 나타낸 도이다[1 (a; YFP/pET28a/BL21DE3, 0mM IPTG, b; YFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 0mM IPTG, c; YFP/pET28a/Rosseta2DE3, 0mM IPTG, d; YFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 0mM IPTG), 2 (a; YFP/pET28a/BL21DE3, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, b; YFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, c; YFP/pET28a/Rosseta2DE3, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양, d; YFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 1mM IPTG, 28℃, 20시간 배양), 3 (a; YFP/pET28a/BL21DE3, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, b; YFP/pET28a/BL21DE3pLysS, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, c; YFP/pET28a/Rosseta2DE3, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양, d; YFP/pET28a/Rosseta2DE3pLysS, 1mM IPTG, 37℃, 20시간 배양)].
도 4는 단일 도메인 항체가 되는 단일 도메인 가변영역(VHH domain Fv) 부분의 중합효소연쇄반응 (PCR) 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 GFP에 특이적인 단일 도메인 항체들을 선별하기 위한 ELISA 결과(a) 및 선별된 항체의 항원 RFP, YFP에서의 ELISA 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 6은 GFP에 특이적으로 결합하는 양성 균주들의 중합효소연쇄반응(PCR) 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 GFP에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 52개의 아미노산 서열을 분석하여 정렬(alignment)한 결과를 나타낸 도이다(다른 아미노산 서열을 가지는 그룹을 실선으로 표시하였으며, 단일 도메인 항체의 주요 부분인 CDR 1, 2, 3는 각 서열 상단에 표시하였다).
도 8은 2개의 다른 아미노산 서열을 가지는 GFP에 대한 단일 도메인 항체를 웨스턴 블랏 (western blot) 으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 GFP에 대한 단일 도메인 항체들을 단독, 복합으로 GFP와 혼합하여 열처리하여 나온 결과를 나타낸 도이다[1; GFP + 2×-YT 배지, 2; GFP + GFP negative 단일 도메인 항체 control, 3; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2A12 (1×), 4; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2G2 (1×), 5; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2G9 (1×), 6; GFP + GFP 단일 도메인 항체 10A8 (1×), 7; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2A12 + GFP 단일 도메인 항체 2G2 (1×), 8; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2A12 + GFP 단일 도메인 항체 2G9 (1×), 9; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2A12 + GFP 단일 도메인 항체 10A8 (1×), 10; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2G2 + GFP 단일 도메인 항체 2G9 (1×), 11; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2G2 + GFP 단일 도메인 항체 10A8 (1×), 12; GFP + GFP 단일 도메인 항체 2G9+GFP 단일 도메인 항체 10A8 (1×)].
도 10은 무작위로 선별된 4가지의 단일 도메인 항체를 GFP와 혼합한 후, 70℃에서 10분, 20분, 30분동안 열처리하여 형광도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 23 중에서 선택된 1종의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 GFP(green fluorescent protein) 특이적 단일 도메인 항체를 제공한다.

상기 단일 도메인 항체는 GFP에 특이적으로 결합하여, 70℃ 이상의 온도에서도 GFP의 형광 발현이 유지되도록 GFP의 열 안정성을 개선시킬 수 있다.

상기 단일 도메인 항체는 GFP를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

또한 상기 단일 도메인 항체는 서열번호 12 내지 서열번호 23의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함할 수 있으며 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체일 수 있다.

상기 단일 도메인 항체는 E. coli에서 과발현시켜 적은 비용으로 대량생산이 가능하며, 단일 도메인만으로 유전자 재조합하여 생산하므로 수용액 내에서 용해도가 높은 장점을 가진 항체를 말한다.

상기 단일 도메인 항체에는 기능성 분자가 추가적으로 결합될 수 있으며, 추가적으로 결합가능한 기능성 분자는 화학 물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 무기 입자이고, 보다 바람직하게는 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 무기입자일 수 있다.

본 발명의 서열번호 12 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 구성된 단일 도메인 항체를 암호화하는 염기서열은 각각 서열목록 24 내지 서열번호 35의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 염기서열은 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 포함할 수 있으며, 상기 실질적인 동일성은 염기서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 염기 서열을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 GFP 특이적 단일 도메인 항체가 결합된 열 안정성이 개선된 GFP를 제공한다.

상기 GFP는 65℃까지의 온도에서는 비교적 안정적이나, 70℃ 이상의 온도에서는 불안정하고 형광의 감광 정도가 낮아지는 단점이 있는 형광 단백질로, 본 발명의 GFP 특이적 단일 도메인 항체와 결합된 GFP의 경우, 65~ 75℃ 이상의 온도에서도 열 처리 하지 않은 GFP와 비슷한 정도의 형광을 발현하여 열 안정성이 개선된 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 GFP 특이적 단일 도메인 항체가 결합된 열 안정성이 개선된 GFP를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 센서를 제공한다.

상기 면역 센서란 항원항체 복합체를 형성하는 성질을 이용한 바이오센서의 일종을 의미한다. 이는 항원항체 복합체를 형성함으로써 어떤 변화를 전기신호로 변환, 표시하는 것을 기본으로 하고 있으며, 측정방식의 차이에 따른 비표식 면역센서와 표식면역 센서를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 면역 센서는 바람직하게는 표식 면역 센서를 의미하며, 표식제로부터 항원항체 복합체의 형성을 간접적으로 측정할 수 있는 면역 센서임을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 항체를 GFP에 결합시켜 65℃~ 75℃에서 GFP의 형광발현을 유지시키는 것을 특징으로 하는 GFP의 열 안정성 개선 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 항원 형광단백질 GFP , YFP , RFP 의 제조

항원으로서 사용될 GFP(green fluorescent protein)는 덴마크 소재의 Royal Veterinary and Agricultural University에서 분양받은 mini-Tn7gfp2/ DH5α 균주에서 DNA를 추출한 후, 이를 F-NheI GFP 프라이머(5’-ACGCTAGCATGAGTAAAGGAGAAGAA-3’; 서열번호 1)와 R-GFP BspEI XhoI 프라이머(5’-ACCTCGAGACCGCCTCCGGATTTGTATAGTTCATCCAT-3’; 서열번호 2)로 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭하여 준비하였다. RFP(Red Fluorescent Protein)는 pCMV-tdTomato DNA를 이용하여, F-NheI Tomato 프라이머(5’-ACGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’; 서열번호 3)와 R-Tomato BspEI XhoI 프라이머 (5’-ACCTCGAGACCGCCTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCAT-3'; 서열번호 4)로 중합효소연쇄반응을 통해 증폭하여 준비하였다. YFP(Yellow Fluorescent Protein)는 pPhi-Yellow-B DNA를 이용하여 F-NheI PhiY 프라이머 (5’-ACGCTAGCATGAGAGGATCGGGATCC-3’; 서열번호 5)와 R-PhiY BspEI XhoI 프라이머 (5’-ACCTCGAGACCGCCTCCGGACATGTAGGTCTTGCGGCA-3’; 서열번호 6)로 중합효소연쇄반응을 통해 증폭하여 준비하였다.

각각 증폭된 산물은 아가로오스 겔(agarose gel)상에서 전기영동으로 확인하였으며, 확인한 각 산물을 TA 클로닝 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다. 서열이 확인된 GFP는 NheI/XhoII이 처리된 pET-28a 벡터와 결합시키고, GFP 단백질 발현을 위해 단백질 발현용 E. coli 균주인 BL21DE3, BL21DE3pLysS, Rosseta2DE3, Rosseta2DE3pLysS에 각각 형질전환시켰다.

SDS-PAGE를 통해서 단백질 발현 여부를 확인하고 형광 발현 유무를 관찰하기 위해서 1mM IPTG와 카나마이신이 첨가된 LB 평판배지에 접종하여 28℃, 37℃에서 각각 형광 유무를 관찰하였다. 재조합 균주를 카나마이신이 첨가된 200ml LB 배지에 접종하여 37℃에서 배양하고 흡광도가 약 0.4~0.6이 되었을 때 IPTG를 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가 후, 37℃에서 5시간, 28℃에서 20시간 배양하였다.

결과를 도 1 내지 도3에 나타내었다.

도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, LB 평판 배지 상에서 형광단백질인 GFP(도 1), RFP(도 2), YFP(도 3)의 발현을 확인할 수 있었다.

재조합 균주를 배양한 배양액을 초고속원심분리기(centrifuge)에서 6000rpm으로 20분간 회전시켜 균주를 수거하였다. 수거된 균주에 PBS 완충액(8g NaCl, 0.21g KCl, 1.42 g Na₂HPO₄, 0.27 g KH₂PO₄/1ℓ, pH 7.4)을 20ml 넣고 현탁한 후에 프렌치프레스(FRENCH PRESS)를 이용하여 균주를 파쇄하였다. 파쇄한 균주를 초고속원심분리기에서 10000rpm으로 20분간 회전시켜 파쇄된 균주의 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액은 용해 완충액(50mM NaH₂PO_4,300mM NaCl, 10mM 이미다졸(Imidazole), pH 8.0)으로 평형을 유지시킨 6×히스티딘 친화성 크로마토그래피인 Ni-NTA 세파로오스 컬럼(Shepharose column)에 흡착시키고, 세척 완충액(50mM NaH₂PO_4,300mM NaCl, 20mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여 세척하였다. 용출 완충액(50mM NaH₂PO₄ _,300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여 재조합 단백질을 회수하였고 PBS 완충액으로 투석하였다. 각 정제 과정의 단백질들은 SDS-PAGE에 의해서 확인하였으며, 순도가 높은 정제물을 선별하여 항원용 GFP로 사용하였다.

실시예 2. 낙타에서의 면역반응 유도 및 분리된 백혈구를 이용한 cDNA 합성 및 단일 도메인 항체 라이브러리 구성

정제된 GFP 1mg/ml을 동일한 부피의 프로인트 완전 애주반트(Freund's complete adjuvant)와 혼합하여 안정된 에멀젼(emulsion)을 제조한 후, 낙타(Camelus bacterianus)에 2?4 군데 분산하여 피하투여 하였다. 그 후 2주 간격으로 4 차례 같은 양의 재조합 단백질을 같은 부피의 프로인트 불완전 애주반트 (Freund's incomplete adjuvant)와 혼합하여 같은 방법으로 투여하였다. 최종 투여 1주일 후, 항응고제가 들어있는 수혈팩에 혈액을 채취하였으며, 피콜(Ficoll-Paque PLUS)을 이용하여 백혈구를 분리하였다.

분리된 백혈구부터 트리졸 (trizol)을 이용하여 RNA를 추출한 후 특이적 역방향 프라이머(RT-R; 5'- GGT ACG TGC TGT TGA ACT GTT CC -3’; 서열번호 7)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA의 단일 도메인 항체의 가변영역(variable region; 이하 Fv)부분은 골격-1(framework-1)과 골격-4(framework-4)에 결합하는 프라이머 (Camel_2st_F; 5'- CAT TCC ATG AAG AGC GGC CCA GCC GGC CGA GTC TGG GGG AGG CTC GGT G -3'; 서열번호 8, Camel_2st_R; 5’- AGA TTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T -3’; 서열번호 9)를 이용하여 중합효소연쇄반응[94℃(1분), 58℃(30초), 72℃(1분), 25 회]을 통해 증폭시켰다.

결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 약 350~400bp에서 증폭된 단일도메인(VHH domain) DNA 밴드를 확인할 수 있었다.

실시예 3. 패닝(panning)에 의한 특이적인 항체 선별

증폭 과정을 거친 DNA 밴드는 NcoI과 NotI의 제한효소로 절단하였고, 같은 제한효소로 절단된 pCANTAB5E 벡터에 결합시켰다. 재조합된 벡터를 E. coli TG1에 전기천공법(electorporation)을 이용하여 형질전환시켰으며, 전기천공법은 25uF, 2.5kV, 200 ohms조건에서 시행하였다.

형질 전환된 E. coli TG1을 M13K07 헬퍼 파지(4×10¹⁰pfu)에 감염시키고 하루 동안 배양 후, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)/NaCl 침전법을 이용하여 파지를 침전시켰다. 그 후 GFP가 코팅되어 있는 T25 플라스크를 이용하여 파지를 결합시키고 PBS-T (0.5% Tween20)를 이용하여 10회 세척하였다. 대수기에 있는 E. coli TG1을 넣어 T25 플라스크에 남아있는 파지를 재감염시키고 배양하였다. 이와 같은 과정을 반복함으로서 항원에 특이적으로 결합하는 파지를 증가시켰다.

실시예4 . ELISA 를 통한 양성 클론( clone )의 선별 및 양성 클론들의 YFP , RFP 에 대한 특이도 검정

상기 실시예 3에 의한 각 단계별 패닝(panning) 후, 파지에 감염된 E. coli TG1을 일부 SOBAG 평판배지(Bacto tryptone 20g, Bacto yeast extract 5g, NaCl 0.5g, 1M MgCl₂ 10ml, 2M 글루코오스 55.6ml, Bacto agar 15g/L)에 도말하였다. 배양된 단일 콜로니 (colony)를 무작위적으로 선별하여 새로운 파지에 감염시킨 후 배양하여 그 상등액으로 ELISA를 시행하였다.

96 웰 면역플레이트는 웰당 2㎍의 항원용 GFP를 코팅하고 차단 완충액(blocking buffer)(5% 탈지우유 포함 PBS)로 차단하였다. 그 후 개별 콜로니에서 배양된 파지를 1차적으로 면역플레이트에 붙이고, 2차적으로 항-M13-HRP를 사용하여 발색을 관찰하여 파지가 GFP와 결합하는지 확인하였다. 또한 다른 형광 단백질인 RFP와 YFP에 대한 특이 결합 반응을 확인하기 위하여, RFP와 YFP를 항원으로 하여 위와 동일한 방법으로 ELISA를 실시하였다.

결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, ELISA 결과 총 52개의 GFP에 대한 양성클론(a)을 확보하였으며, 확보한 52개의 양성클론들을 이용하여 RFP와 YFP를 항원으로 하여 수행한 ELISA 결과 14개의 클론들에서만 YFP에 대한 양성결합 반응을 보였으며 RFP에 대해서는 양성반응을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, GFP와 YFP 간 아미노산 서열이 약 55% 유사하고 GFP와 RFP간 아미노산 서열은 약 28% 유사한 점에 비추어 이는 형광 단백질간 유사도에 기인한 것으로 추정되었다.

실시예 5. 양성 클론 반응 확인

ELISA 결과 양성반응으로 나온 52개의 클론들 중, 총 48개의 클론들에 대하여 벡터 프라이머(F_pCANTAB5_R1; 5‘- CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC-3’; 서열번호 10, R_pCANTAB5_R2; 5’-CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCC-3’; 서열번호 11)를 사용하여 중합효소연쇄반응 (PCR) [94℃(1분), 58℃(30초), 72℃(1분), 30 회]을 진행하였으며, 증폭된 산물을 아가로오스 겔상에서 전기영동으로 확인하였다.

결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 48개의 클론들은 약 95%의 양성클론 반응을 나타내었다.

실시예6 . 서열분석을 통한 GFP 에 대한 단일 도메인 항체 확인

GFP에 대한 단일 도메인 항체를 확인하기 위해서 상기 실시예 1 내지 5의 방법으로 단일 도메인 항체들을 가지는 플라스미드를 확보한 후, 이들의 염기서열을 분석하고 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 블라스트 검색을 하여 낙타에서 유래한 단일 도메인 항체들임을 확인하였다. 이들 항체들간의 비교를 위해서 ClustalW2 프로그램으로 서열들을 정렬(alignment)하였다.

결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 확보된 GFP에 대한 단일 도메인 항체 52개의 서열을 정렬하여 분석한 결과 다른 아미노산 서열을 가진 단일 도메인 항체 12가지를 확보하였다. 얻어진 단일 도메인 항체의 아미노산 서열 및 염기 서열을 표 1에 나타내었다.

서열번호	아미노산 서열	서 열번 호	염기서열	항체
12	ESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTVSRGCMAWFRQAPGKEREGVAAINSGDGTTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLEPEDTSIYYCAASRLRCPWNLVSASWYDFWGQGTQVTVSS	24	GAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCGTCAGTCGCGGCTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTAATTCAGGTGACGGTACCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCGGAGGACACTTCCATATACTACTGTGCGGCCTCGCGACTCCGTTGCCCGTGGAACCTGGTCAGCGCATCGTGGTATGACTTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	2A12
13	EWGGSVQAGGSLRLSCSASGFASSPGCMAWFRQAPGKEREGVAEIATRSGSAYYADSVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAIYYCAASRLRCTPAADFSRIPAYAMDYWGKGTQVTVSS	25	GAGTGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTTCCGCCTCTGGATTCGCCAGCAGTCCCGGTTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGAAATTGCTACTCGTAGTGGTAGCGCATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGTGTATCTGCAAATGAATAGTCTGAAACCTGAGGACACTGCCATTTACTACTGTGCGGCGTCCAGACTCCGCTGTACGCCAGCGGCTGATTTTTCGCGGATTCCAGCCTACGCCATGGACTACTGGGGCAAAGGAACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	2G2
14	ESGGGSVQAGGSLRLSCVVSRSTYTSNCMGWFRQAPGKEREEVASIYTGGGITYYADSVKGRFTVSQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAGRGSWSCGMGPDEYKYWGQGTQVTVSS	26	GAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCCCGATCCACCTACACTAGTAACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGAGCGCGAAGAGGTCGCGTCTATTTATACTGGTGGTGGTATCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCCAAGACAACGCCAAGAATACGGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCGGGCCGTGGTAGCTGGAGCTGCGGGATGGGGCCAGATGAGTATAAGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	2G9
15	ESGGGSVQSGGSLRLSCVASGSTDRPAYMAWFRQAPGKEREGVATIYTEFGSQYYADSVKGRFTISQDNAKRTAYLQMNSLKPEDTAMYYCAATTAFRVLGTRKLDAAQYAYWGQGTQVTVSS	27	GAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAATCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATCGACCGACAGACCTGCCTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCGACTATTTATACAGAATTTGGTAGTCAATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGCGCACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGCGCGGCAACGACTGCTTTTCGGGTTCTTGGTACTAGAAAACTCGATGCAGCACAGTATGCGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	3H8
16	SWGGSVQTGGSLGLSCTTSLDGYSSVCMGWFRQTPGKEREGVATIHRAFGDTYYADSVKGRFTISEDSAKNTVYLRMNSLKPEDTGMYYCAAGRPKSGSAWNCRDAEYVYWGQGTQVTVSS	28	AGTTGGGGAGGCTCGGTGCAGACTGGAGGGTCTCTAGGACTCTCCTGCACAACCTCTCTAGACGGCTACAGTAGCGTTTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCGACTATTCATCGTGCTTTTGGTGACACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCGAAGATAGTGCCAAGAACACGGTGTATCTGCGAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGGCATGTACTACTGTGCGGCGGGTCGCCCAAAGTCGGGTAGTGCGTGGAATTGTAGAGATGCCGAGTATGTCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	7C8
17	ESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTVSRGCMAWFRQVPGKEREGVAAINSGDGTTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLEPEDTSIYYCAASRLRCPWNLVSASWYDFWGQGTQVTVSS	29	GAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCGTCAGTCGCGGCTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTAATTCAGGTGACGGTACCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCGGAGGACACTTCCATATACTACTGTGCGGCCTCGCGACTCCGTTGCCCGTGGAACCTGGTCAGCGCATCGTGGTATGACTTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	8B9
18	ESGGGSVQAGGSLRLSCAAPRSTYTSNCMGWFRQAPGKEREEVASIYTGGDITYYADSVKGRFTMSQDNARSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAGRGSWSCGSGPDEYKYWGQGTQVTVSS	30	GAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCCCCCGATCCACCTACACGAGCAACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAAGAGGTCGCGTCTATTTATACTGGTGGTGATATCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATGTCCCAAGACAACGCCAGGAGTACGGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCGGGCCGTGGTAGCTGGAGCTGCGGGAGCGGGCCAGATGAGTATAAGTACTGGGGTCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	8G4
19	SGGGSVQSGGSLRLTCAASGRTSSISYMGWFRQSPGKEREGVAFIDRRDSTTYADLVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARIRGYYSRPALSADFDYWGQGTQVTVSS	31	TCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGTCTGGAGGGTCTCTGAGACTCACCTGTGCAGCCTCTGGGCGCACCTCCAGTATTTCGTACATGGGGTGGTTCCGCCAGAGTCCAGGGAAAGAGCGCGAGGGGGTCGCATTTATTGATAGGCGTGATTCCACAACCTACGCAGACCTCGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAGGAATACGCTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCCCGGATAAGAGGTTACTACTCCCGGCCCGCCCTCTCGGCTGACTTCGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	9H11
20	SLGGGSVQAGGSLRLSCAASGFAMSTYCMAWFRQAPGKEREGVATLSPLGILSHYADSVKGRFTVSRDNAKNTLSLQMNSLIPEDTAMYYCAAMPRPDGGAHGCVSWLAYNFWGQGTQVTVSS	32	AGTCTGGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCAATGAGTACATACTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAACGCTTTCTCCTCTTGGTATATTATCGCACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCCGAGACAACGCCAAGAATACTCTGAGCCTGCAAATGAACAGCCTCATACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCCATGCCGCGCCCCGACGGCGGCGCCCATGGGTGTGTTTCTTGGCTCGCGTATAACTTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	10A8
21	ESGGGSVQSGGSLRLSCSGVTGSDYCLGWFRQAPGREREGVAASSRYGSTYYGDFVRGRFTISRDSAKNTLILQMNNLQPEDTAMYYCAASRRVGSCSTYERVFAYWGQGTQVTVSS	33	GAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGTCTGGGGGATCTCTGAGACTCTCCTGTTCTGGAGTGACCGGCAGTGATTATTGCCTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAGGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCGAGCAGCCGTTATGGTAGTACATACTACGGAGATTTTGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAGCGCCAAAAACACGCTGATTCTGCAAATGAATAACCTACAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCGAGTCGGCGAGTCGGTTCGTGTTCTACTTATGAACGCGTCTTCGCCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	11F5
22	GGGGSVQAGGSLRLSCAASGYISDSHGRNCMGWFRQAPGKEREAVARIYSRLGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMHSLKPEDTAMYYCAAVGGLCIDKETPTDYPFWGQGTQVTVSS	34	GGGGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATACATAAGCGATAGCCACGGTAGAAACTGTATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGCGGTCGCGCGGATTTATAGTCGTCTTGGTACCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGCACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGTCGGAGGATTATGTATCGATAAAGAGACACCAACTGATTACCCTTTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	13C2
23	ESGGGSVQAGGSLKLSCAASGYISSNCMGWFRQAPGKEREGVASIYRGYGNTYYTDSVKGRFTISQDNAKNTIYLQMNSLKPEDTARYYCAAVNCARWPFDREYNYWGQGTQVTVSS	35	GAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACATCAGCAGCAACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCGTCTATTTATCGTGGTTATGGTAACACATACTATACCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAAAACACGATTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCAGGTACTACTGTGCAGCAGTAAACTGTGCCAGGTGGCCTTTTGATCGGGAGTATAATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA	13H2

실시예7 . 웨스턴블랏을 이용한 단일 도메인 항체 확인

분류된 12가지의 단일 도메인 항체를 확인하기 위하여 웨스턴블랏((western blot)을 수행하였다. 항원용 GFP를 SDS-PAGE 시켰으며, 이를 PVDF 막에 전이시킨 후 차단 완충액(bloking buffer)(5% 탈지우유 포함 PBS)으로 차단하였다. 12가지의 다른 아미노산 서열을 가진 단일 도메인 항체를 가지는 균주를 M13K07 헬퍼 파지 (4×10¹⁰pfu)에 감염시키고 하루동안 배양 후 얻어진 상등액을 1차 항체로 사용하였고 2차 항체로는 항-M13-HRP를 사용하였다. ECL 플러스 웨스턴블랏 검출 시약(plus western blotting detection reagents)을 사용하여 필름을 감광시켜 나오는 밴드를 관찰함으로써 단일 도메인 항체를 분비하는 파지가 GFP와 결합하는지 확인하였다.

결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 10가지의 단일 도메인 항체들에서만 GFP 결합 양성 결과를 확인할 수 있었으며, 이는 단백질 접힘(folding) 및 구조적 특징인 것으로 추정되었다.

실시예8 . GFP 에 대한 단일 도메인 항체들을 이용한 열 안정성 검정

확보된 12가지의 GFP에 대한 단일 도메인 항체의 효능을 검정하기 위해 GFP의 가장 큰 단점인 열에 대한 안정성을 확인하였다. 12가지의 단일 도메인 항체 중 4가지의 단일 도메인 항체를 무작위로 선별하여 해당 항체를 가지는 균주를 M13K07 헬퍼 파지 (4×10¹⁰pfu)에 감염시키고, 하루동안 배양 얻어진 상등액을 단일 도메인 항체로 사용하였다. 이 각각의 상등액 100㎕와 정제된 GFP 100㎕ (1mg/ml)를 고르게 혼합하고 상온에서 5분간 방치 후 70℃에서 10분, 20분, 30분간 처리하여 UV 플레이트 하에서 관찰하고 형광검출기(flurometer)(SpectraMax M2E 384, Molecular Devices)를 이용하여 형광수치를 여기(excitation)파장(395nm), 방출(emission) 파장(509nm)에서 측정하였다. 단일 도메인 항체 복합 처리는 위와 동일한 방법으로 실시하였으나 단일 도메인 항체를 전시하는 파지 상등액은 각각 50㎕를 사용하여 총 100㎕에 맞추어서 사용하였다.

결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

도 9및 도 10에 나타낸 바와 같이, 단일도메인 항체를 전시하지 않은 파지에 비해 70℃에서 10분 처리한 GFP와 단일 도메인 항체를 전시하는 파지를 단독으로 처리한 혼합군에서 높은 열 안정성을 보였으며, 단일 도메인 항체를 복합하여 처리한 경우에는 열처리를 하지 않은 GFP 와 유사한 형광 정도 및 수치를 얻을 정도로 높은 열 안정성을 갖는 것을 확인하였다. 따라서, GFP에 대한 단일 도메인 항체가 GFP에 특이적으로 결합하는 경우, GFP를 안정화시킴으로써 열에 대한 안정성을 높일 수 있음을 확인하였다.

<110> JOONGKYEOM <120> GFP-specific single domain antibody <130> 1.7 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-NheI GFP primer <400> 1 acgctagcat gagtaaagga gaagaa 26 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-GFP BspEI XhoI primer <400> 2 acctcgagac cgcctccgga tttgtatagt tcatccat 38 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-NheI Tomato primer <400> 3 acgctagcat ggtgagcaag ggcgag 26 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Tomato BspEI XhoI primer <400> 4 acctcgagac cgcctccgga cttgtacagc tcgtccat 38 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-NheI PhiY primer <400> 5 acgctagcat gagaggatcg ggatcc 26 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-PhiY BspEI XhoI primer <400> 6 acctcgagac cgcctccgga catgtaggtc ttgcggca 38 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-R <400> 7 ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Camel_2st_Forward <400> 8 cattccatga agagcggccc agccggccga gtctggggga ggctcggtg 49 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Camel_2st_Reverse <400> 9 agattagtgc ggccgctgag gagacggtga cctgggt 37 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_pCANTAB5_R1 <400> 10 ccatgattac gccaagcttt ggagcc 26 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_pCANTAB5_R2 <400> 11 cgatctaaag ttttgtcgtc tttcc 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A12 <400> 12 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G2 <400> 13 Glu Trp Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ala Ser Gly Phe Ala Ser Ser Pro Gly Cys Met Ala Trp Phe Arg 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Glu Ile Ala Thr Arg 35 40 45 Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 50 55 60 Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 65 70 75 80 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Arg Leu Arg 85 90 95 Cys Thr Pro Ala Ala Asp Phe Ser Arg Ile Pro Ala Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G9 <400> 14 Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Val Val Ser Arg Ser Thr Tyr Thr Ser Asn Cys Met Gly Trp Phe 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala Ser Ile Tyr Thr 35 40 45 Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55 60 Val Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 65 70 75 80 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Gly 85 90 95 Ser Trp Ser Cys Gly Met Gly Pro Asp Glu Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3H8 <400> 15 Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Val Ala Ser Gly Ser Thr Asp Arg Pro Ala Tyr Met Ala Trp Phe 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Tyr Thr 35 40 45 Glu Phe Gly Ser Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55 60 Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Arg Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 65 70 75 80 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Thr Ala 85 90 95 Phe Arg Val Leu Gly Thr Arg Lys Leu Asp Ala Ala Gln Tyr Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7C8 <400> 16 Ser Trp Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Gly Leu Ser Cys 1 5 10 15 Thr Thr Ser Leu Asp Gly Tyr Ser Ser Val Cys Met Gly Trp Phe Arg 20 25 30 Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile His Arg Ala 35 40 45 Phe Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 50 55 60 Ser Glu Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Arg Met Asn Ser Leu 65 70 75 80 Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Pro Lys 85 90 95 Ser Gly Ser Ala Trp Asn Cys Arg Asp Ala Glu Tyr Val Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8B9 <400> 17 Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Arg Gly Cys Met Ala Trp Phe 20 25 30 Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asn Ser 35 40 45 Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55 60 Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 65 70 75 80 Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ser Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Arg Leu 85 90 95 Arg Cys Pro Trp Asn Leu Val Ser Ala Ser Trp Tyr Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8G4 <400> 18 Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ala Ala Pro Arg Ser Thr Tyr Thr Ser Asn Cys Met Gly Trp Phe 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala Ser Ile Tyr Thr 35 40 45 Gly Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55 60 Met Ser Gln Asp Asn Ala Arg Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 65 70 75 80 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Gly 85 90 95 Ser Trp Ser Cys Gly Ser Gly Pro Asp Glu Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9H11 <400> 19 Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met Gly Trp Phe Arg 20 25 30 Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Phe Ile Asp Arg Arg 35 40 45 Asp Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 50 55 60 Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys 65 70 75 80 Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Ile Arg Gly Tyr 85 90 95 Tyr Ser Arg Pro Ala Leu Ser Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A8 <400> 20 Ser Leu Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Met Ser Thr Tyr Cys Met Ala Trp Phe 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Leu Ser Pro 35 40 45 Leu Gly Ile Leu Ser His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 50 55 60 Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met Asn Ser 65 70 75 80 Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Met Pro Arg 85 90 95 Pro Asp Gly Gly Ala His Gly Cys Val Ser Trp Leu Ala Tyr Asn Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F5 <400> 21 Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ser Gly Val Thr Gly Ser Asp Tyr Cys Leu Gly Trp Phe Arg Gln 20 25 30 Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ser Ser Arg Tyr Gly 35 40 45 Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ile Leu Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Arg Arg Val Gly Ser 85 90 95 Cys Ser Thr Tyr Glu Arg Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13C2 <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Asp Ser His Gly Arg Asn Cys Met Gly 20 25 30 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Arg Ile 35 40 45 Tyr Ser Arg Leu Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Val 85 90 95 Gly Gly Leu Cys Ile Asp Lys Glu Thr Pro Thr Asp Tyr Pro Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13H2 <400> 23 Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Tyr Arg Gly 35 40 45 Tyr Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 50 55 60 Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 65 70 75 80 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Asn Cys Ala 85 90 95 Arg Trp Pro Phe Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A12 <400> 24 gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60 ggatacaccg tcagtcgcgg ctgcatggcc tggttccgcc aggctccagg gaaggagcgc 120 gagggggtcg cagctattaa ttcaggtgac ggtaccacat actatgccga ctccgtgaag 180 ggccgattca ccatctccca agacaacgcc aagaacacgg tgtatctgca aatgaacagc 240 ctggaaccgg aggacacttc catatactac tgtgcggcct cgcgactccg ttgcccgtgg 300 aacctggtca gcgcatcgtg gtatgacttc tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 25 <211> 371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G2 <400> 25 gagtggggag gctcggtgca ggctggaggg tctctgagac tctcctgttc cgcctctgga 60 ttcgccagca gtcccggttg catggcctgg ttccgccagg ctccagggaa ggagcgcgag 120 ggggtcgcag aaattgctac tcgtagtggt agcgcatact atgccgactc cgtgaagggc 180 cgattcacca tctcccaaga caacgccaag aacacgtgta tctgcaaatg aatagtctga 240 aacctgagga cactgccatt tactactgtg cggcgtccag actccgctgt acgccagcgg 300 ctgatttttc gcggattcca gcctacgcca tggactactg gggcaaagga acccaggtca 360 ccgtctcctc a 371 <210> 26 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G9 <400> 26 gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactctcctg tgtagtctcc 60 cgatccacct acactagtaa ctgcatgggc tggttccgcc aggctccggg gaaggagcgc 120 gaagaggtcg cgtctattta tactggtggt ggtatcacat actatgccga ctccgtgaag 180 ggccgattca ccgtctccca agacaacgcc aagaatacgg tatatctgca aatgaacagc 240 ctgaaacctg aggacactgc catgtactac tgtgcggcgg gccgtggtag ctggagctgc 300 gggatggggc cagatgagta taagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 360 <210> 27 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3H8 <400> 27 gagtctggag gaggctcggt gcaatctgga gggtctctga gactctcctg tgtagcctct 60 ggatcgaccg acagacctgc ctacatggcc tggttccgcc aggctccagg gaaggagcgc 120 gagggggtcg cgactattta tacagaattt ggtagtcaat actatgccga ctccgtgaag 180 ggccgattca ccatctccca agacaacgcc aagcgcacgg cgtatctgca aatgaacagc 240 ctgaaacctg aggacactgc catgtactac tgcgcggcaa cgactgcttt tcgggttctt 300 ggtactagaa aactcgatgc agcacagtat gcgtactggg gccaggggac ccaggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 28 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7C8 <400> 28 agttggggag gctcggtgca gactggaggg tctctaggac tctcctgcac aacctctcta 60 gacggctaca gtagcgtttg catgggctgg ttccgccaga ctccagggaa ggagcgcgag 120 ggggtcgcga ctattcatcg tgcttttggt gacacatact atgccgactc cgtgaagggc 180 cgattcacca tctccgaaga tagtgccaag aacacggtgt atctgcgaat gaacagcctg 240 aaacctgagg acactggcat gtactactgt gcggcgggtc gcccaaagtc gggtagtgcg 300 tggaattgta gagatgccga gtatgtctac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 29 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8B9 <400> 29 gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60 ggatacaccg tcagtcgcgg ctgcatggcc tggttccgcc aggttccagg gaaggagcgc 120 gagggggtcg cagctattaa ttcaggtgac ggtaccacat actatgccga ctccgtgaag 180 ggccgattca ccatctccca agacaacgcc aagaacacgg tgtatctgca aatgaacagc 240 ctggaaccgg aggacacttc catatactac tgtgcggcct cgcgactccg ttgcccgtgg 300 aacctggtca gcgcatcgtg gtatgacttc tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 30 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8G4 <400> 30 gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactctcctg tgcagccccc 60 cgatccacct acacgagcaa ctgcatgggc tggttccgcc aggctccagg gaaggagcgc 120 gaagaggtcg cgtctattta tactggtggt gatatcacat actatgccga ctccgtgaag 180 ggccgattca ccatgtccca agacaacgcc aggagtacgg tatatctgca aatgaacagc 240 ctgaaacctg aggacactgc catgtactac tgtgcggcgg gccgtggtag ctggagctgc 300 gggagcgggc cagatgagta taagtactgg ggtcagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 360 <210> 31 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9H11 <400> 31 tctggaggag gctcggtgca gtctggaggg tctctgagac tcacctgtgc agcctctggg 60 cgcacctcca gtatttcgta catggggtgg ttccgccaga gtccagggaa agagcgcgag 120 ggggtcgcat ttattgatag gcgtgattcc acaacctacg cagacctcgt gaagggtcga 180 ttcaccatct cccgagacaa cgccaggaat acgctgtatc tccaaatgaa cagcctgaaa 240 cctgaggaca cggccatgta ttactgtgcg gcccggataa gaggttacta ctcccggccc 300 gccctctcgg ctgacttcga ttactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357 <210> 32 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10A8 <400> 32 agtctgggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60 ggattcgcaa tgagtacata ctgcatggcc tggttccgcc aggctccagg aaaggagcgc 120 gagggggtcg caacgctttc tcctcttggt atattatcgc actatgccga ctccgtgaag 180 ggccgattca ccgtctcccg agacaacgcc aagaatactc tgagcctgca aatgaacagc 240 ctcatacctg aggacactgc catgtactac tgtgcggcca tgccgcgccc cgacggcggc 300 gcccatgggt gtgtttcttg gctcgcgtat aacttctggg gccaggggac ccaggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 33 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F5 <400> 33 gagtctggag gaggctcggt gcagtctggg ggatctctga gactctcctg ttctggagtg 60 accggcagtg attattgcct gggctggttc cgccaggctc cagggaggga gcgcgagggg 120 gtcgcagcga gcagccgtta tggtagtaca tactacggag attttgtgag gggccgattc 180 accatctccc gagacagcgc caaaaacacg ctgattctgc aaatgaataa cctacaacct 240 gaggacacgg ccatgtatta ctgtgcggcg agtcggcgag tcggttcgtg ttctacttat 300 gaacgcgtct tcgcctactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc a 351 <210> 34 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13C2 <400> 34 gggggaggag gctcggtgca ggctggaggg tctctgagac tctcctgtgc agcctctgga 60 tacataagcg atagccacgg tagaaactgt atgggctggt tccgccaggc tccagggaag 120 gagcgcgagg cggtcgcgcg gatttatagt cgtcttggta ccacatacta tgccgactcc 180 gtgaagggcc gattcaccat ctcccgagac aacgccaaga acacgctgta tctgcaaatg 240 cacagcctga aacctgagga cactgccatg tactactgtg cggcagtcgg aggattatgt 300 atcgataaag agacaccaac tgattaccct ttctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 35 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13H2 <400> 35 gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga aactctcctg tgcagcctct 60 ggatacatca gcagcaactg catgggctgg ttccgccagg ctccagggaa ggagcgcgag 120 ggggtcgcgt ctatttatcg tggttatggt aacacatact ataccgactc cgtgaagggc 180 cgattcacca tctcccaaga caacgccaaa aacacgattt atctgcaaat gaacagcctg 240 aaacctgagg acactgccag gtactactgt gcagcagtaa actgtgccag gtggcctttt 300 gatcgggagt ataattactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc a 351

Claims

서열번호 12 내지 서열번호 23 중에서 선택된 1종의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 GFP(green fluorescent protein) 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 12의 아미노산 서열은 서열번호 24의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 13의 아미노산 서열은 서열번호 25의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 14의 아미노산 서열은 서열번호 26의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 15의 아미노산 서열은 서열번호 27의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 16의 아미노산 서열은 서열번호 28의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 17의 아미노산 서열은 서열번호 29의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 18의 아미노산 서열은 서열번호 30의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 19의 아미노산 서열은 서열번호 31의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 20의 아미노산 서열은 서열번호 32의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 21의 아미노산 서열은 서열번호 33의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 22의 아미노산 서열은 서열번호 34의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 23의 아미노산 서열은 서열번호 35의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 GFP 특이적 단일 도메인 항체.
제1항의 항체가 결합된 열 안정성이 개선된 GFP.
제14항의 GFP를 포함하는 면역 센서.
제1항의 항체를 GFP에 결합시켜 65℃~ 75℃에서 GFP의 형광발현을 유지시키는 것을 특징으로 하는 GFP의 열 안정성 개선 방법.