CN113943739B - 双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE，其制备及在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE，其制备及在抗肿瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含双特异性T细胞激动剂CD3‑FAP/nanoBiTE的多肽，编码该多肽的多核苷酸，所述多肽和多核苷酸的制备方法，及其应用。所述双特异性T细胞激动剂CD3‑FAP/nanoBiTE是基于纳米抗体的新型双特异性T细胞激动剂(bispecific T cell engager，BiTE)‑CD3‑FAP/nanoBiTE，其诱导T细胞靶向肿瘤细胞，发挥抗肿瘤效应，为BiTE的肿瘤细胞免疫靶向治疗提供一种新的策略。

Description

双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE，其制备及在抗肿瘤 中的应用
技术领域
本发明涉及用于治疗肿瘤的生物材料，尤其涉及一种双特异性T细胞激动剂，该双特异性T细胞激动剂的制备方法，及该激动剂在抗肿瘤中的应用。
背景技术
BiTE(bispecific T cell engager)是运用单链抗体技术将两个不同抗体的轻重链可变区通过一条多肽链连接的双特异性抗体，能够有效激活效应细胞T细胞，精确地引导T细胞特异性的杀伤靶细胞。BiTE与其它双特异性抗体相比，最大的不同点在于它的结构，它采用单链抗体技术将两个不同抗体的可变区通过一条短肽连接在一起。与传统抗体相比，它缺少Fc段，分子量较小，免疫原性较低，组织穿透力强。BiTE使T细胞和靶细胞连接在一起，从而发挥抗肿瘤作用。但对于具体的靶向T细胞的抗体、具体的靶向肿瘤细胞的抗体、以及连接二者的连接肽的选择，对所得BiTE双特异性抗体的表达量和生物活性影响很大。
成纤维细胞活化蛋白(FAP)是肿瘤基质中活化成纤维细胞表达的一种表面抗原，在活化的成纤维细胞中含量丰富，可以激活肿瘤基质中的生长因子等，有利于血管生成，从而促进肿瘤生长。成纤维细胞活化蛋白(FAP)在肿瘤的发生，发展及转移中发挥着重要作用，同时，FAP作为一种理想的抗肿瘤靶分子，在90％以上的恶性肿瘤活化成纤维细胞表面都有表达，FAP靶位丰富，局部浓度高且无个体差异性，在肿瘤的免疫治疗中应用前景广阔。
在前期科学研究中，为优化BiTE的水溶性，稳定性及提高生产表达量以提高功能效应，前人已经做过大量探索，然而运用纳米抗体构建BiTE还未见有报道。更没有人研究探索对两种具体纳米抗体以及连接肽的选择。
因此，本发明构建了同时靶向FAP和CD3的纳米抗体的新型双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE，探索其连接序列，以改善传统BiTE的水溶性、稳定性和组织穿透力，提高表达产量，以提高T细胞在肿瘤局部的富集程度，从而进一步提高抗肿瘤效果，从而为BiTE的肿瘤细胞免疫靶向治疗提供新的策略。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
在第一方面，本发明提供了一种编码双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸，所述多核苷酸包含通过(Gly4Ser)3连接肽编码序列连接在一起的CD3纳米抗体的基因序列与FAP纳米抗体的基因序列。
在第一方面所述的编码双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸中，所述多核苷酸的序列为SEQ ID No.2。
在第二方面，本发明提供了一种包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多肽，多肽包含连接肽连接在一起的CD3纳米抗体与FAP纳米抗体。
在第二方面所述的包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多肽中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
在第三方面，本发明提供了一种制备双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)获得一对引物，其中：上游引物为：5′-CGCGGATCCATGGGCACTGCTACCGTTGAG-3′，引入酶切位点KpnI；下游引物为5′-CCAAGCTGGTACAAGAGCTGCTTTGCTTGTG-3′，引入酶切位点HindⅢ；
(2)利用所述一对引物，以重组质粒PUC57-CD3-FAP/nanoBiTE为模板进行PCR扩增；
(3)将PCR产物经KpnI和HindⅢ双酶切消化后，使用T7 DNA连接酶连接到酶切后的pET-30a载体中，构建重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE；
(4)将重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；
(5)诱导CD3-FAP/nanoBiTE蛋白的表达。
在第三方面所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，扩增条件为：92℃预变性:2分钟，循环设定为：92℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸10分钟。
在第三方面所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述热激法为10μL pET-CD3-FAP/nanoBiTE在冰上放置30分钟，42℃水浴热激90秒。
在第三面所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述蛋白表达方法为将阳性菌落在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养OD600至0.6，加入IPTG诱导CD3-FAP/nanoBiTE表达，采用15％SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
在第四方面，本发明提供了一种制备包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸的方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1).扩增纳米抗体anti-CD3 Nb的编码序列；
(2).扩增纳米抗体anti-FAP Nb的编码序列；
(3).将步骤(1)获得的编码序列与步骤(2)获得的编码序列以通过(Gly4Ser)3的编码序列连接。
在第五方面，本发明提供了权利要求1-2所述的多核苷酸和/或权利要求3-4所述的多肽在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
在第五方面的应用，所述肿瘤为表达成纤维细胞活化蛋白(FAP)的肿瘤，例如实体瘤，例如肝癌。
本发明的新型双特异性T细胞激动剂BiTE(bispecific Tcell engager)，将其命名为CD3-FAP/nanoBiTE，能同时结合HepG2-FAP和T细胞，增强抗肝癌效应。
本发明的CD3-FAP/nanoBiTE的两个结合臂之间具有较好的柔韧性，这种柔韧性能更好的促进BiTE与CD3分子和肿瘤靶标的结合。根据本发明，CD3-FAP/nanoBiTE在杀伤肿瘤细胞的过程中，T细胞和靶细胞的比率(T细胞/靶细胞)要明显低于其他形式的双特异性抗体，从而更好地发挥抗肿瘤效果。由于本发明CD3-FAP/nanoBiTE独特的结构形式和特性，因此可以克服其他双特异性抗体在肿瘤治疗上的缺点。
附图说明
图1为BiTE介导T细胞杀伤靶细胞的示意图。
图2为CD3-FAP/nanoBiTE的序列构造示意图，其中克隆策略为：KpnI-Kozak序列-人工引导序列-His标签-nanoBiTE-FAPxCD3-终止密码子-HindⅢ。
图3为重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE的酶切鉴定结果；其中，M.DNA Marker；1.pET-CD3-FAP/nanoBiTE；2.重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE。
图4为CD3-FAP/nanoBiTE蛋白镍亲和层析柱纯化SDS-PAGE结果；其中，M.蛋白Marker；1.纯化后CD3-FAP/nanoBiTE蛋白。
图5为流式细胞仪检测CD3-FAP/nanoBiTE与靶细胞的结合情况。
图6为流式细胞仪检测CD3-FAP/nanoBiTE与T细胞的结合。
图7为CD3-FAP/nanoBiTE不同浓度和效靶比对肿瘤细胞杀伤。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了两条纳米抗体anti-CD3 Nb和anti-FAP Nb通过噬菌体抗体库技术筛选制备，并通过测序获得相应的基因序列，然后通过(Gly4Ser)3连接肽编码序列连接CD3纳米抗体的基因序列与FAP纳米抗体的基因序列，从而获得编码本发明双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸。
因此，本发明的包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多肽包含通过(Gly4Ser)3连接肽连接在一起的CD3纳米抗体与FAP纳米抗体。
在一个实施方式中，编码双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸的序列为SEQ ID No.2。
本发明还提供了一种制备包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸的方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1).扩增纳米抗体anti-CD3 Nb的编码序列；
(2).扩增纳米抗体anti-FAP Nb的编码序列；
(3).将步骤(1)获得的编码序列与步骤(2)获得的编码序列以通过(Gly4Ser)3的编码序列连接。
本发明还提供了一种包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多肽，多肽包含通过(Gly4Ser)3连接肽连接在一起的CD3纳米抗体与FAP纳米抗体。
在一个实施方式中，本发明包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
本发明还提供了一种本发明双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获得一对引物，其中：上游引物为：5′-CGCGGATCCATGGGCACTGCTACCGTTGAG-3′，引入酶切位点KpnI；下游引物为5′-CCAAGCTGGTACAAGAGCTGCTTTGCTTGTG-3′，引入酶切位点HindⅢ；
(2)利用所述一对引物，以重组质粒PUC57-CD3-FAP/nanoBiTE为模板进行PCR扩增；
(3)将PCR产物经KpnI和HindⅢ双酶切消化后，使用T7 DNA连接酶连接到酶切后的pET-30a载体中，构建重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE；
(4)将重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；
(5)诱导CD3-FAP/nanoBiTE蛋白的表达。
在本发明的部分实施方式中，本发明还提供了本发明的双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE编码多核苷酸、和/或双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE多肽在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
所述药物可通过静脉施用。
在本发明的部分实施方式中，所述肿瘤为表达成纤维细胞活化蛋白(FAP)的肿瘤或肿瘤微环境中表达成纤维细胞活化蛋白(FAP)的肿瘤，例如实体瘤，例如肝癌、肺癌、乳腺癌、恶性胶质瘤等。
本发明还提供了一种利用本发明提供的制备方法制得的双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的应用，具体是在制备治疗肿瘤药物中的应用。该双特异性双特异性T细胞激动剂能同时结合HepG2-FAP2和T细胞，增强抗肝癌效应。
实施例
以下是本发明列举的实施例。
下述实施例中人肝癌细胞系HepG2-FAP(ATCC，USA)，RPMI 1640培养基培养(含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)，(GIBCO，USA)。细胞均置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
实施例1
1.1重组表达载体的构建
本组实验所需的两条纳米抗体anti-CD3 Nb和anti-FAP Nb通过噬菌体抗体库技术制备，并通过测序获得相应的基因序列。
对于连接产物构建，采用包括以下步骤的方法进行克隆和表达：
(1)利用PrimerPremier设计一对引物：上游引物为：5′-CGCGGATCCATGGGCACTGCTACCGTTGAG-3′,引入酶切位点KpnI；下游引物为5′-CCAAGCTGGTACAAGAGCTGCTTTGCTTGTG-3′，引入酶切位点HindⅢ。
(2)以重组质粒PUC57-CD3-FAP/nanoBiTE为模板进行PCR扩增后，扩增条件为：92℃预变性:2分钟，循环设定为92℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸10分钟。
(3)将经KpnI和HindⅢ双酶切消化后的PCR产物使用T7DNA连接酶连接到酶切后的pET-30a载体，构建重组质粒。经PCR、双酶切鉴定和测序验证正确的重组质粒分别命名为pET-CD3-连接序列1-FAP/nanoBiTE、pET-CD3-连接序列-FAP/nanoBiTE 2、pET-CD3-连接序列3-FAP/nanoBiTE、pET-CD3-连接序列4-FAP/nanoBiTE、pET-CD3-连接序列5-FAP/nanoBiTE……(以下统称为CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE)。
(4)将各重组质粒CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE转化大肠杆菌BL21(DE3)。
采用热激法对BL21(DE3)感受态细胞进行质粒转化，具体步骤为：
1)各重组质粒各10μL加到50μL感受态细胞管中，冰上放置30分钟，42℃水浴热激90秒；
2)迅速置于冰上2分钟后，加入500μL LB培养基，37℃摇床复苏45分钟；
3)100μL菌液均匀涂于含抗卡那霉素的LB固体培养基平板上，倒置放入37℃培养箱中生长14小时；
4)菌落长出后，每个平板挑4个单克隆菌落放入含抗卡那霉素的LB液体培养基，37℃细菌摇床生长14小时进行扩大培养；
5)去内毒素Plasmidi Kit提取质粒，KpnI和HindHⅢ酶切鉴定各连接产物蛋白CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE的诱导表达。
将阳性菌落在含有卡那霉素(Kana)的LB液体培养基中培养OD600至0.6，加入IPTG诱导各连接产物蛋白CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE表达，采用15％SDS-PAGE检测蛋白表达情况，具体方法如下：
(1)收集诱导表达后的菌液离心(1500rpm/分钟)15分钟收集细菌菌体，弃上清，用PBS将沉淀制成悬液；
(2)超声波细胞粉碎机粉碎菌体，30分钟(粉碎过程中菌体要处于冰水混合物中)；
(3)取200μL诱导前细菌裂解液和200μL诱导后细菌裂解液置于1.5mL的EP管中，每管中加入50μL的上样缓冲液；
(4)沸水煮8分钟，离心(1200rpm/分钟)5分钟，取上清点样；
(5)将制备好的分离胶快速加入制胶板中，用去离子水压平，静置30分钟，倒掉去离子水(注意用滤纸将水吸干净)，加入浓缩胶，插入梳齿板，静置30分钟；
(6)拔掉梳齿板后加入电泳缓冲液，加样，加样速度要慢，以防样品溢出，每孔加样量为10μL；
(7)电泳时浓缩胶电压90KV，分离胶100KV；观察溴酚蓝指示剂，待其至分离胶底部，结束电泳；
(8)先将胶片在沸水中煮1分钟，摇床上振荡5分钟，然后加入考马斯亮蓝染液煮1分钟，振荡5分钟，脱色；
(9)分析结果并拍照保存。
结果：通过将等量培养物中的蛋白变性后通过SDS-PAGE分离，并染色，然后比较各构建体的目标蛋白总表达量。
目标蛋白表达量为4.5mg/L培养物。
分别通过与T细胞和FAP细胞的结合率，来表征构建体所表达的目标蛋白与二者结合的活性。
结合率的具体的测定方法如下，采用FlowJo软件v10.0版本进行分析。
抽取健康志愿者静脉血，用肝素抗凝，Hank`s缓冲液等体积稀释后，用淋巴细胞分离液进行梯度离心(22℃、2200rpm/分钟、20分钟)获取PBMC，充分洗涤后，用(含100mg/L灭活胎牛血清，50g/L谷氨酰胺，1×105U/L青霉素，100mg/L链霉素，50μmol/L二巯基乙醇)RPMI1640完全培养液调整细胞数为2×106/mL。
T细胞用PBS洗1次，加入标记抗人CD4、CD8表面抗体分子，4℃避光染色30分钟,细胞用PBS洗两次，悬浮于500μL PBS中，4℃避光保存，荧光抗体染色后，用流式细胞仪分析。获取细胞不少于100000个，并用FlowJo流式分析软件对结果进行分析。
1)使用250nM浓度FITC标记的CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE，分别与1×106个上述细胞在冰上避光孵育30分钟；
2)用500μLWB充分洗涤3次，使用BB对细胞沉淀进行重悬，之后
进行流式细胞仪上机检测；
3)使用FlowJo软件对检测结果进行叠图处理。
与T细胞的结合率(％)为45.6％，与高表达FAP细胞(例如HepG2-FAP)的结合率(％)为61.7％。
1.3检测各连接产物蛋白CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE与CD3+ T淋巴细胞及靶细胞的结合情况
为考察CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE与靶细胞的特异性，即能特异性结合靶细胞，而与其他细胞结合能力较弱或不结合的特性。本研究利用流式细胞术考察了CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE，对照组CD3-TTE/nanoBiTE与CD4+ T、CD8+ T淋巴细胞及HepG2细胞、293T细胞、HepG2-FAP及293T-FAP(HepG2-FAP及293T-FAP这两株细胞系金斯瑞生物科技有限公司提供，可稳定高表达FAP，货号GM-1013L001)细胞进行结合实验。CD3-TTE/nanoBiTE作为对照的纳米抗体，其多核苷酸序列为SEQ ID No.4，多肽序列为SEQ ID No.3。所述方法的具体操作步骤如下：
抽取健康志愿者静脉血，用肝素抗凝，Hank`s缓冲液等体积稀释后，用淋巴细胞分离液进行梯度离心(22℃、2200rpm/分钟、20分钟)获取PBMC，充分洗涤后，用(含100mg/L灭活胎牛血清，50g/L谷氨酰胺，1×105U/L青霉素，100mg/L链霉素，50μmol/L二巯基乙醇)RPMI1640完全培养液调整细胞数为2×106/mL。
T细胞用PBS洗1次，加入标记抗人CD4、CD8表面抗体分子，4℃避光染色30分钟,细胞用PBS洗两次，悬浮于500μL PBS中，4℃避光保存，荧光抗体染色后，用流式细胞仪分析。获取细胞不少于100000个，并用FlowJo流式分析软件对结果进行分析。
1)使用250nM浓度FITC标记的CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE，分别与1×106个上述细胞在冰上避光孵育30分钟；
2)用500μLWB充分洗涤3次，使用BB对细胞沉淀进行重悬，之后
进行流式细胞仪上机检测；
3)使用FlowJo软件对检测结果进行叠图处理。
1.4 PKH26染色法检测CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE介导T细胞对靶细胞的体外杀伤作用
实验原理：PKH26是能够与活细胞表面的脂质结合的一种红色荧光染料，在488nm激发后可在流式细胞仪第二检测通道探测到染色的细胞。碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)是一种核酸染料，不能透过活细胞的细胞膜，而当细胞处于凋亡或坏死时，PI透过细胞膜与DNA或RNA结合而使细胞着色。
靶细胞：HepG2；HepG2-FAP
浓度：105；104；103；102；101；100
效靶比：0:1；2.5:1；5:1；10:1；20:1
具体步骤如下：
收集对数生长期的靶细胞，用PBS洗一遍后进行PKH26染色；
1)分别收集HepG2和HepG2-FAP，用PBS洗一次，离心800rpm，5分钟；
2)2×PKH26染液配制：1μL PKH26+500μL0.1％BSA-PBS，混匀后，备用；
3)将上述细胞收集后，用1mL PBS重悬细胞，加入配好的2×PKH26染液，混匀后，置于培养箱中反应8分钟，每2分钟摇晃一次；
4)从培养箱中取出细胞，加入1mL血清终止反应，静置1分钟；
5)以RPMI-1640完全培养基5mL清洗3次，每次离心1200rpm，5分钟。洗第二次时，先放入培养箱5分钟后，离心；
6)上述细胞以10mLPBS重悬，计数，离心1200rpm，5分钟，用RPMI-1640完全培养基调整细胞数至5×106个细胞/mL，备用；
7)将染好色的靶细胞铺于24孔板中，每孔5×105细胞；
8)将不同浓度的CD3-连接序列n-FAP/nanoBiTE与T细胞在37℃条件下共孵育30分钟后，按不同效靶比加入到以T细胞作为效应细胞的实验孔中。再按分组所示，将T细胞按不同效靶比加入相应实验孔。每组每个比例设置3个复孔。同时设定自然释放孔(只含靶细胞)，最大释放孔(将靶细胞放置70℃水浴5分钟)。未染色的靶细胞，单染PKH26的靶细胞和高温处理后，单染PI的靶细胞各5×105作为建立流式检测方案调节补偿的对照。铺好的孔板放置培养箱中6h；
9)在避光条件下，收集靶细胞，用PBS洗1次后，移入流式管中，每管细胞用50μLPBS重悬，每管加入1μL PI进行染色，避光4℃孵育30分钟；
10)孵育完毕后，加入500μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测；
11)按照以下公式计算各组细胞的凋亡率：杀伤率＝(实验孔凋亡率-自然释放孔凋亡率)/(100-自然释放孔凋亡率)％。
如图7所示，在不同效靶比下，本发明的CD3-FAP/nanoBiTE介导的T细胞对靶细胞的体外杀伤作用均大于CD3-TTE/nanoBiTE介导的T细胞对靶细胞的体外杀伤作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE，其制备及在抗肿瘤中的应用
<130> GY19100758
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 430
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3-FAP/nanoBiTE的多肽序列
<400> 1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
145 150 155 160
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Glu Pro Gly Gly
165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Thr
180 185 190
Ile Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
195 200 205
Ser Tyr Ile Tyr Pro Asp Gly Thr Val Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val
210 215 220
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Leu Gln Met Asn Met Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
245 250 255
Ala Thr Gly Thr Pro Pro Leu Ala Leu Arg Glu Asp Gly Ser Arg Gly
260 265 270
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
305 310 315 320
Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
325 330 335
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Val Ser Phe Thr Gly Ser
340 345 350
Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
355 360 365
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser
370 375 380
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Thr Cys Ser Ser Arg Trp Arg
385 390 395 400
Gln Gly Glu Cys Ile Gly Asn Asp Tyr Asn Tyr Arg Gly Gln Gly Thr
405 410 415
Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
420 425 430
<210> 2
<211> 849
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸序列
<400> 2
ggtaccgaaa acctgtattt tcagggccag gttcaactgc aagaaagcgg tggcggtctg 60
gaagagccgg gcggtagcct gcgtctgagc tgcgcggcga gcggttttgc gttcagcagc 120
accatcatga cctgggtgcg tcaagcgccg ggcaaaggtc tggagtgggt tagctacatt 180
tatccggacg gcaccgtggt tggttacgcg gatagcgtga agggtcgttt caccatcttt 240
cgtgacaacg cgaagaaaac cctgtatctg cagatgaaca tgctgaaaac cgaggatacc 300
gcggtttact attgcgcgac cggcaccccg ccgctggcgc tgcgtgaaga cggtagccgt 360
ggccaaggca cccaggttac cgttagcagc ggtggcggtg gcagcggtgg cggtggcagc 420
ggtggcggtg gcagccaggt gcaactgcag gaaagcggtg gcggtagcgt tcaagcgggc 480
ggtagcctgc gcttatcttg cgcggcgagc ggtttcacct ttcgtaacta tggtatgagc 540
tgggtgcgtc aggcgccggg caagggtctg gaatgggtga gcggcgttag cttcaccggt 600
agcgcgacct actataccga cagcgttaag ggtcgtttta ccatcagccg tgataacgcg 660
aaaaacaccc tgtacctgca aatgaacagc ctgaagagcg aggacaccgc gctgtactat 720
tgcgcgacct gcagcagccg ttggcgtcag ggcgaatgca ttggtaacga ttataactat 780
cgtggtcaag gcacccaagt taccgttagc agcgactaca aagatgatga tgataaataa 840
tgaaagctt 849
<210> 3
<211> 438
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3-TTE/nanoBiTE的多肽序列
<400> 3
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
145 150 155 160
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
165 170 175
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Gly Ser Thr Gly
180 185 190
Tyr Trp Ala Trp Glu Arg Gln Gly Pro Gly Thr Glu Arg Glu Gly Val
195 200 205
Ala Ala Thr Tyr Thr Ala Gly Ser Ser Thr Ser Met Thr Tyr Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Lys
225 230 235 240
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met
245 250 255
Tyr Arg Cys Ala Ser Thr Arg Phe Ala Gly Arg Trp Tyr Arg Asp Ser
260 265 270
Glu Tyr Arg Ala Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala
275 280 285
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
305 310 315 320
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
325 330 335
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
340 345 350
Ser Gly Val Ser Phe Thr Gly Ser Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
355 360 365
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
370 375 380
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
385 390 395 400
Ala Thr Cys Ser Ser Arg Trp Arg Gln Gly Glu Cys Ile Gly Asn Asp
405 410 415
Tyr Asn Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr
420 425 430
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
435
<210> 4
<211> 875
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CD3-TTE/nanoBiTE的多核苷酸序列
<400> 4
ggtaccgaaa acctgtattt tcagggcatc aggtccagct gcaagagtct ggcggaggct 60
ctgttcaaag tggcggagcc ctgagactga gctgtgtggt gtctggctac acaggcagca 120
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aatgcattgg taacgattat aactatcgtg gtcaaggcac ccaagttacc gttagcagcg 840
actacaaaga tgatgatgat aaataatgaa agctt 875

Claims (6)

1.一种编码双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸，所述多核苷酸包含通过(Gly4Ser)3连接肽编码序列连接在一起的CD3纳米抗体的基因序列与FAP纳米抗体的基因序列，所述多核苷酸的序列为SEQ ID No. 2。
2.一种包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多肽，多肽包含通过(Gly4Ser)3连接肽连接在一起的CD3纳米抗体与FAP纳米抗体，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
3.一种制备双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1) 获得一对引物，其中：上游引物为：5′-CGCGGATCCATGGGCA CTGCTACCGTTGAG-3′，引入酶切位点KpnI；下游引物为5′-CCAAGCTGGTACAAGAGCTGCTTTGCTTGTG-3′，引入酶切位点HindⅢ；
(2) 利用所述一对引物，以重组质粒PUC57-CD3-FAP/nanoBiTE为模板进行PCR扩增；
(3) 将PCR产物经KpnI和HindⅢ双酶切消化后，使用T7 DNA 连接酶连接到酶切后的pET-30a载体中，构建重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE；
(4) 将重组质粒pET-CD3-FAP/nanoBiTE转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；
(5) 诱导CD3-FAP/nanoBiTE蛋白的表达；
其中，所述CD3-FAP/nanoBiTE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 1。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
在步骤(2)中，扩增条件为：92℃预变性: 2分钟，循环设定为：92℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸90 s，30个循环，最后72℃延伸10分钟；
在步骤(4)中采用热激法，所述热激法为10 μL pET-CD3-FAP/nanoBiTE在冰上放置30分钟，42℃水浴热激90秒；和/或
在步骤(5)中，所述蛋白表达方法为将阳性菌落在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养OD600至0.6，加入IPTG诱导CD3-FAP/nanoBiTE表达，采用15% SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
5.一种制备包含双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸的方法，所述制备方法包括如下步骤：
扩增纳米抗体anti-CD3 Nb的编码序列；
扩增纳米抗体anti-FAP Nb的编码序列；
将步骤(1)获得的编码序列与步骤(2)获得的编码序列通过( Gly4Ser )3的编码序列进行连接，
其中，所述双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸序列为SEQ ID No. 2。
6.权利要求1所述的多核苷酸和/或权利要求2所述的多肽在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用；所述肿瘤为表达成纤维细胞活化蛋白的肿瘤；所述肿瘤为实体瘤。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106928363A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 广西医科大学 一种FAP纳米抗体Nb12
CN110218255A (zh) * 2018-03-02 2019-09-10 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb47及其制备方法与应用

Patent Citations (2)

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李翠.纳米抗体双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE抗肿瘤效应研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑.2019,摘要、第17-41页. *

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