JP2004526437A - 低減された免疫原性を有する修飾されたケラチノサイト成長因子（ｋｇｆ） - Google Patents

Abstract

本発明は、特にヒトに投与され、特に治療用のポリペプチドに関する。このポリペプチドは修飾されたポリペプチドであり、この修飾により、ポリペプチドをヒトに投与した際に免疫反応を誘発する傾向が低減されるという結果をもたらす。本発明は特に、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べ免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質の変異体をもたらすケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の修飾に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にヒトに投与され、そしてとりわけ治療に使用するポリペプチドに関する。このポリペプチドは修飾されたポリペプチドであり、この修飾により、ポリペプチドがヒトに投与された際に免疫反応を誘発する傾向が低減するという結果をもたらす。本発明は特に、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べて免疫原性が低い、または実質的に非免疫原性である、ＫＧＦタンパク質の変異体をもたらすヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の修飾に関する。本発明はさらに、前記非修飾タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチドに関し、これにより免疫原性の低減された修飾ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）変異体の作成を可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が著しく誘導するため失敗したケースもある［Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：８７９−８８５；Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５］。モノクローナル抗体については、ＨＡＭＡ反応を低減させようと多数の技術が開発されている［ＷＯ ８９／０９６２２；ＥＰ ０２３９４００；ＥＰ ０４３８３１０；ＷＯ ９１／０６６６７］。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった［Ｉｓｓａｃｓ Ｊ．Ｄ．（１９９０）Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４９，４５６；Ｒｅｂｅｌｌｏ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１４１７−１４２０］。
【０００３】
抗体は、治療剤として投与した際にそれに対して免疫反応が発動し得る唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１３５３−１３６１］やインターフェロンアルファ２［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．３１８：１４０９−１４１３］の治療上の使用が挙げられる。
【０００４】
免疫反応誘導の主要な要因は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上での提示を介してＴ細胞活性を刺激し得るペプチド、いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」がタンパク質内に存在することである。このような潜在的Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ結合を確立することで測定できる。暗黙にではあるが、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合する際、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識され、少なくとも原理的には、ＴＣＲと結びつきＴ細胞応答を促進することによって、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが判明しているある種のペプチドはタンパク質配列中に保持されているものと通常理解されており、このようなペプチドは、最終タンパク質が投与される有機体内で「自己」として認識される。
【０００５】
これらのＴ細胞エピトープペプチドのある種は、細胞内でのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され得るものであり、続いてＴ−細胞の活性化を起動すべく主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されることが知られている。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドの結果として、Ｔ細胞のこのような活性化は、次いで、例えばＢ細胞の直接の刺激による抗体応答を引き起こし、そうした抗体を産生する。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）はこのグループタンパク質で優性なアイソタイプで、本発明の主な着目点である。しかしながら、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たし、したがって本発明はこれらにも等しく適用可能である。ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子は、アルファ鎖およびベータ鎖で形成され、それらのＣ末端は細胞膜を通して挿入される。各ヘテロダイマーは、９〜２０個の範囲のアミノ酸長のペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高１１個のアミノ酸である。リガンド結合領域は、アルファ鎖の１〜８５個のアミノ酸およびベータ鎖の１〜９４個のアミノ酸が含まれる。ＤＱ分子は、相同的な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）構造を有することが最近示されており、ＤＰ族タンパク質も非常に類似していると予想される。ヒトでは、ＤＲアイソタイプのおよそ７０種類の異なるアロタイプが知られており、ＤＱについては３０種類の異なるアロタイプが、また、ＤＰについては４７種類の異なるアロタイプが知られている。各個人は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、それらの構造は、ペプチドの疎水性残基（ポケット残基）と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝を指している［Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：３３；Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２１５］。
【０００７】
クラスＩＩ分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。リガンド結合領域には相当な量の多型が存在し、これは異なる地理的な集団および民族グループ内で区別される「ファミリー」を備えている。この多型は、ペプチド結合領域の結合特性に影響し、したがって、ＤＲ分子の異なる「ファミリー」は、幾分かは重複があるかもしれないが、異なる配列特性を備えたペプチドに対して特異性を有するであろう。この特異性は、Ｔｈ細胞エピトープの認識（クラスＩＩ Ｔ細胞反応）を決定し、これは最終的には、Ｔｈ細胞エピトープが由来するのと同じタンパク質上に存在するβ細胞エピトープに対する抗体反応を駆動する原因となる。したがって、個人におけるタンパク質への免疫反応は、その個人のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性によって決まるＴ細胞エピトープ認識によって重大な影響を受ける。ゆえに、世界的な人口レベルにおいてタンパク質またはペプチド内のＴ細胞エピトープを識別するためには、ＨＬＡ−ＤＲアロタイプのできるだけ多様なセット（それにより世界人口のできるだけ高い割合をカバーする）の結合特性を考慮することが望ましい。
【０００８】
本発明の対象であるタンパク質などの治療のタンパク質に対する免疫反応は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド提示経路経由で進行する。ここに外来タンパク質は、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子と連携した提示のために飲み込まれ処理される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、とりわけマクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現される。Ｔ細胞表面上の同族のＴ細胞レセプターによるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の結合は、ＣＤ４分子などの他のある種のコレセプターの相互結合を伴って、Ｔ細胞内での活性化状態を引き起こすことができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、Ｂ細胞などの他のリンパ細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、完全な細胞性免疫反応としてＴリンパ球を活性化する。ペプチドがＡＰＣ表面における提示用の所与のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する能力は、多数の要因（最も顕著にはその１次配列）に依存する。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合溝（ｃｌｅｆｔ）内でのタンパク質分解による切断およびその結合親和性の両者に影響を及ぼすことになる。ＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、特別なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が、露出したペプチド残基およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方によって提供される決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を認識することができるように結合面を提示する。
【０００９】
当技術分野では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できる合成ペプチドを識別するための操作手順が存在する（例えば、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７）。そのようなペプチドは、必ずしもすべての状況下で（特にインビボでは処理経路または他の現象により）Ｔ細胞エピトープとして特に機能しないかもしれない。Ｔ細胞エピトープ識別はエピトープ除去に向けての最初のステップである。タンパク質からの潜在的なＴ細胞エピトープの識別および除去はすでに示されている。当技術分野では、通常、実験的に決定されたＴ細胞エピトープ中で認識された配列モチーフを走査する計算手段により、あるいはＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドおよび特にＤＲ結合ペプチドクラスを予想するために計算上の技術を用いることにより、Ｔ細胞エピトープの検知を可能にする方法が提供された。
【００１０】
ＷＯ９８／５２９７６とＷＯ００／３４３１７は、ポリペプチド配列がヒトのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのサブセットに結合する可能性を識別するための計算によるスレッディング（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）手法を教示する。これらの教示では、予想されたＴ細胞エピトープは、ヒト由来および非ヒト由来の治療用抗体または非抗体タンパク質の１次配列内で慎重なアミノ酸置換を用いることによって除去される。
【００１１】
合成ペプチドとの組合せで、ヒトまたは実験動物の末梢血試料から得られたＴ細胞クローンと結合し得る組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を開発する他の技術が、当技術分野で使用され［Ｋｅｒｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９７５−９７８；Ｋｗｏｋ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ ａｌ（２００１）ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｏｌｏｇｙ ２２：５８３−５８８］、さらにエピトープ識別戦略において開発されるかもしれない。
【００１２】
上記のように、およびその結果として、基本的に治療上価値があるが本来は免疫原性であるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質からＴ細胞エピトープを識別しさらに除去または少なくとも低減することが望ましいであろう。
【００１３】
これらの治療上有益な分子のうちの１つは「ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）」である。ＫＧＦは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）／ヘパリン−結合成長因子のタンパク質ファミリーのメンバーである。それは肺で主に発現している糖タンパク質分泌物であり、ケラチノサイトおよび他の上皮細胞の成長を活性化することによる創傷治癒をもたらす［Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ２４：７５２−７５５；Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８０２−８０６］。成熟（加工）型の糖タンパク質は１６３アミノ酸残基を含み、そして条件培地から特定の細胞株の培養に伴い単離される［Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ，（１９８９）同書］か、もしくは組換え技術を用いて生産される「Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８」。上記タンパク質は、数多くの重大な疾病および損傷修復の設定において上皮細胞の成長を活性化することにより、治療上有益である。この開示は特に１６３アミノ酸残基の成熟（加工）型であるヒトＫＧＦタンパク質に関する。
【００１４】
他にもＫＧＦ分子を提供するものはあり［例えば米国特許第６００８３２８号；ＷＯ９０／０８７７１；］、修飾されたＫＧＦを含む［Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）同書；ＷＯ９５０１４３４］。しかしながら、その教示はタンパク質の免疫原特性に対するＴ細胞エピトープの重要性を認識するものではないし、本発明のスキームに従って特異的かつ制御されたかたちでこうした特性に直接影響を及ぼすとは考えられていない。
【００１５】
ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）のアミノ酸配列（１文字コードで示す）は以下の通りである：
【００１６】
【表１】

【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、特性の強化されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）類似体には継続的な需要がある。強化が望まれている点としては、前記治療剤の発現および精製のための別スキームおよび精製の様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）が含まれるが、また特に、タンパク質の生物学的特性における改良も含まれる。ヒトに投与した際のインビボ特性の改善は特に必要である。この点では、ヒトに免疫反応を引き起こす可能性が低減されているか可能性のないケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の提供が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、「ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）」の修飾形（潜在的なＴ細胞エピトープの数の低減または除去によって免疫の特性は修正されているもの）を提供する。本発明は、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを除去したヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）修飾形を提供する。他の哺乳動物種または脊椎動物種で同定されたＫＧＦタンパク質は、一般に本発明の多くのペプチド配列を有し、開示されているリストと実質的に同じペプチド配列を多数有する。そのようなタンパク質配列は従って等しく本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ結合能力により潜在的なＴ細胞エピトープであるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）１次配列内に識別された配列を開示する。この開示は特に１６３アミノ酸残基からなるヒトＫＧＦタンパク質に関する。
【００２０】
本発明は、基本的に生物活性に影響することなく、特定のアミノ酸の置換、付加または欠失によって変更されなければならない、本発明による分子の１次配列内の特定の位置も開示する。免疫原性の喪失が生物活性の喪失と同時にのみ成される場合は、タンパク質のアミノ酸配列内のさらなる変更によって前記活性を回復することが可能である。
【００２１】
本発明は、このような修飾された分子を生産する方法をさらに開示し、とりわけ免疫原性部位を低減するか除去するために変更しなければならないＴ細胞エピトープを識別する方法を開示する。本発明は、実質的にここに示されたものと同じ１次アミノ酸配列を有する任意のＫＧＦ分子種にも適用でき、従って、遺伝子工学手段および他の方法によって誘導されたＫＧＦ分子も含み、１６３個のアミノ酸残基を含まなくてもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によるタンパク質は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、慢性または再発性の疾病状態（例えば、多数のケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を示すような場合）において特に有益であろう。本発明は、インビボで増強された特性を示すと期待されるＫＧＦタンパク質の修飾形を提供する。修飾されたＫＧＦ分子は医薬組成物において使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
要約すると、本発明は以下の対象となる事項に関する：
・ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の生物活性を有し、インビボで使用した時に実質的に免疫原性でないか、同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さい修飾された分子；
・これに応じた特定の分子（本来の非修飾分子に由来する１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、前記免疫原性の喪失が達成されているもの）；
・これに応じた特定の分子（前記分子に由来するペプチドを結合し得る多数のＭＨＣアロタイプの低減により、前記免疫原性の喪失が達成されるもの）；
・これに応じた特定の分子（１つのＴ細胞エピトープが除去されているもの）；
・これに応じた特定の分子（もともと存在するＴ細胞エピトープがクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激するか結合する能力を示すＭＨＣクラスＩＩリガンドであるかペプチド配列であるもの）；
・これに応じた特定の分子（前記ペプチド配列が表１に記載される群から選択されるもの）；
・これに応じた特定の分子（１〜９個のアミノ酸残基、好ましくは本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれか１つのアミノ酸残基が変更されたもの）；
・これに応じた特定の分子（アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失したもの）；
・これに応じた特定の分子（１つまたは複数のアミノ酸残基の置換が表２に示すようにして行われるもの）；
・これに応じた特定の分子（（さらに）１つまたは複数のアミノ酸残基の置換が表３に示すようにして行われ、前記分子から誘導されるペプチドを結合することができるＭＨＣアロタイプの数が低減しているもの）；
・これに応じた特定の分子（必要であれば、加えて、特定のアミノ酸の通常、置換、付加または欠失によるさらなる変更が、前記分子の生物活性を回復するようにされているもの）；
・上記および下記に特定されるような該修飾された分子のうちのいずれかをコードするＤＮＡ配列または分子；
・上記および／または特許請求の範囲に定義されるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の生物活性を有する修飾された分子を、場合により薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物；
・以下のステップを含む、上に引用した特許請求の範囲の請求項のいずれかに定義されるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の生物活性を有する修飾された分子の製造方法：（ｉ）ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；（ｉｉ）インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）技術を用いるか生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；（ｉｉｉ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いて測定されたペプチドのＭＨＣ分子への結合により示されるＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内において１つまたは複数のアミノ酸が修飾（変更）された新規な配列変異体を設計すること；（ｉｖ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること；および（ｖ）場合によってはステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと；
・ステップ（ｉｉｉ）が本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失により行われる、これに応じた特定の方法；
・変更が、同族体タンパク質配列に関して、および／またはインシリコモデリング技術において行われる、これに応じた特定の方法；
・これに応じた特定の方法であって、上記のステップ（ｉｉ）が以下のステップ：（ａ）既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；（ｂ）予め定義した均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを選択された領域から連続的にサンプリングすること；（ｃ）サンプリングされた前記セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対し割り当てられた値を合計することにより、サンプリングされた前記セグメントの各々についてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および（ｄ）実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別することにより実行され；ステップ（ｃ）を、好ましくは、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド立体構造のエネルギー項を含むように修飾されたベームスコアリング関数（Ｂｏｅｈｍ ｓｃｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用い、（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；（５）サンプリングされた各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；（６）サンプリングされた各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する方法；
・潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、免疫遺伝学的に非修飾ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）から作成され、表１に記載された群から選択される１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチド、および、インビボで使用した時に、同一の生物活性を有する非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるＫＧＦの製造のためのその使用；
・上記１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチドのうち少なくとも９個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド配列、および、インビボで使用した時に、同一の生物活性を有する非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるＫＧＦ製造のためのその使用。
【００２４】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、本発明についての理解によれば、ＭＣＨ ＩＩを結合可能で、Ｔ細胞を刺激するおよび／または（必ずしも測定可能な程度に活性化せずに）Ｔ細胞を複合体中でＭＨＣ ＩＩに結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【００２５】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合（以下に定義される）によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる２０個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ−配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えばアミノ酸単位が１０個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば１００個以上を含み「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上無制限である。
【００２６】
「アルファ炭素（Ｃα）」はペプチド鎖中の炭素水素（ＣＨ）部分の炭素原子である。「側鎖」はＣαへの吊り下がり（ペンダント）基であり、ペプチドの寸法と比較して著しく変動幅の広い物理的な寸法を有する、単純もしくは複雑な基または部分を含むことができる。
【００２７】
本発明は、実質的にここに示されたものと同じ１次アミノ酸配列を有する任意のケラチノサイト成長因子分子種に適用でき、したがって、遺伝子工学的手段その他の方法によって誘導されたケラチノサイト成長因子分子を含み、１６３個のアミノ酸残基を含まなくてもよい。
【００２８】
他の哺乳類由来から識別されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質は、共通して、本開示のペプチド配列の多数を有し、また、開示されたペプチド配列と実質的に同じ配列を有する多数のペプチド配列を共通に有する。したがって、このようなタンパク質配列も等しく本発明の範囲内に入る。本発明は、同種の有機体に導入された可溶性タンパク質が免疫反応を引き起こし、その可溶性タンパク質に結合する宿主抗体の進行をもたらしうるという、実際ある現実を克服することを想定している。とりわけ１つの例を挙げれば、このタンパク質が内生的に生産されるという事実にもかかわらず、ある割合のヒト患者が抗体を作る、インターフェロンアルファ２である［上掲Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９６）；上掲Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（１９８８）］。同じ状況はケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の治療的使用に関係があると思われ、本発明は、ヒト宿主への投与において免疫反応を誘導する傾向性が変更されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質を供給することにより、この問題の解決を図る。
【００２９】
修飾されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）をもたらす本発明の一般的な方法は、次のステップを含む：
（ａ）ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
（ｂ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
（ｃ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定したＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸を用いて新規な配列変異体を設計する。このような配列変異体は、そのような新しい潜在的なＴ細胞エピトープが、設計毎に、Ｔ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように修飾されないのであれば、配列変化によって新しい潜在的なＴ細胞エピトープの生成を回避する方法で作成される。そして、（ｄ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体をよく知られた組換えＤＮＡ技術によって試験する。
【００３０】
ステップ（ｂ）による潜在的なＴ細胞エピトープの識別は従来法によって実行することができる。適当な方法はＷＯ ９８／５９２４４；ＷＯ ９８／５２９７６；ＷＯ ００／３４３１７に開示されており、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）から誘導されるペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合性向を識別するために好適に使用できる。
【００３１】
計算によってＴ細胞エピトープを識別する別の非常に効果的な方法は、この発明によって好ましい実施形態である実施例に記述される。
【００３２】
実際上、多数の異なるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質が生産され、所望の免疫特性および機能特性に関して試験される。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）断片の化学合成を含む他の操作手順も考え得るが、最も好ましくは変異体タンパク質は組換えＤＮＡ技術によって生産される。
【００３３】
１６３個のアミノ酸残基からなるヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質配列についての上記スキームのステップ（ｂ）による分析結果を表１に示す。
【００３４】
【表２】

ペプチドは１３ｍｅｒｓであり、アミノ酸は１文字コードを用いて表してある。
【００３５】
上記スキームのステップ（ｃ）および（ｄ）に従い本発明の修飾された分子に関する構築および設計の結果を、表２および３に示す。
【００３６】
【表３】

【００３７】
【表４】

【００３８】
【表５】

本発明は、１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープ活性の実質的な低減またはタンパク質からの除去をもたらす位置で少なくとも１つのアミノ酸残基を置換したケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）類似体に関する。表１に識別された潜在的なＭＨＣクラスＩＩリガンドのうちのいずれかの特定のポイントにおいて、１または複数のアミノ酸置換を行うことで、ヒト宿主に治療剤として投与した際、低減された免疫原の可能性を有するケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）分子をもたらすことができる。好ましくは、アミノ酸置換は、Ｔ細胞エピトープの活性の実質的な低減または除去を達成すると予想されるペプチド配列内の適切なポイントで行われる。実際上、適切なポイントは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内に与えられる疎水性ポケットのうちの１つにおいて結合するアミノ酸残基と一致することが好ましいであろう。
【００３９】
ペプチドのいわゆるＰ１またはＰ１アンカー位置で溝の第１のポケット内に結合するものを変更することが最も好ましい。ペプチドのＰ１アンカー残基と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝第１ポケットとの間の結合相互作用の特性は、ペプチド全体に対する総合的な結合親和性の主な決定要素であると認められる。ペプチドのこの位置での適切な置換は、ポケット内にはより収容されにくい残基のためであり、例えばより親水性の大きな残基への置換である。ＭＨＣ結合溝内の他のポケット領域内での結合と同等な位置でのペプチド中のアミノ酸残基も考慮され、本発明の範囲に入る。
【００４０】
所与の潜在的Ｔ細胞エピトープ内の単一のアミノ酸置換が、エピトープ除去の最も好ましいルートであることが理解される。単一のエピトープ内での置換の組合せも考えられ、例えば、個別に定義されたエピトープが互いに重複する場合には特に適切になものとなり得る。さらに、所与のエピトープ内における単一のアミノ酸置換または単一のエピトープ内における置換の組合せは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に関して「ポケットペプチド」と同等な位置でなくともペプチド配列内のどのポイントでされていてもよい。置換は、同族体構造に関してか当技術分野で知られたインシリコ技術を用いて生成する構造的方法で行われてもよいし、本発明による分子の公知の構造上の特徴に基づくものでもよい。そのような置換はすべて本発明の範囲内に入る。
【００４１】
特に、リストに挙げたペプチド内で行われた置換と組み合わせて行う場合、上に識別されたペプチド内以外のアミノ酸置換を考えてもよい。例えば、変異体分子の構造や生物活性を回復するために変更を考えることができる。そのような補償的変更およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）ポリペプチドからの特定のアミノ酸残基の除去または付加を含む変更は、所望の活性で、かつ開示するペプチドのうちのいずれかの変化と組み合わせた変異体をもたらし、本発明の範囲内に入る。
【００４２】
本発明の修飾されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）に関する限り、そのような修飾されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質または修飾されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質の断片を含む組成物および関連する組成物は、本発明の範囲内と考えるべきである。別の実施態様では、本発明は修飾されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）実在物をコードする核酸に関する。別の実施態様では、本発明は修飾されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）タンパク質を使用するヒトの治療方法に関する。
【実施例】
【００４３】
タンパク質やポリペプチドの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−ＣＯＮＨ−基を含む有機化合物の任意の基である。
【００４４】
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【００４５】
【化１】

Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）および水素（Ｈ）原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【００４６】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると（立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である）、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φ_iおよびψ_i（ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す）はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８）、特に２８５−９４ページ参照（これらのページは言及によって本願に組み込まれる）。
【００４７】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置８６でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：４９４６−４９５６（１９９４）。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸（疎水性脂肪族は以下のものである：バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）は、ポケット内に収容され得る（芳香族側鎖が優先される）。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する（例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である）。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、（全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば）Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【００４８】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
（１）予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。（２）疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる（例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる）。（３）ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント（ウィンドウ）に対する値の合計を、セグメント（ウィンドウ）の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント（ウィンドウ）の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント（ウィンドウ）内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。（４）上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。（５）予め定義した値（例えば値１）のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【００４９】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも４２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素（Ｃα）位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用において重要な位置での２０個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック（ｄｏｃｋ）のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容（ｄｏｃｋ）された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【００５０】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ．から入手可能）と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア（Ｍｏｄｅｌｌｅｒ，Ｓａｌｉ Ａ．＆ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＴＬ．、１９９３．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２３４：７７９−８１５）によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【００５１】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｗ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、１（３）：１５７−１６２）（１９９５）や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し（ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する）次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ Ｔ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７（６）：５５５−５６１（１９９９）と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【００５２】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法（これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している）と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する１１個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数（現在１３個）の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ”−□についてのＲＭＳ数値は、５０％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス５０％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。最小のＲＭＳ偏差を有するＣα（これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の１１個の残基の位置２と等価である）を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１ Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【００５３】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜２０アミノ酸の範囲で長さが変化する（もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく）可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める（上記データベースから得られる）。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【００５４】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜２０個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ”−□原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド（したがって対象タンパク質）でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用（水素結合、静電気的相互作用、疎水性（親油性）相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない）を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。
【００５５】
ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素（例えばＣ＝ＮＨ−）などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは３〜７ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。
【００５６】
水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約２．８Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。親油性（脂肪親和性）相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが（約０．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【００５７】
１つの実施形態では、ベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ１手法）が結合定数を評価するために使用される（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８（３）：２４３−２５６（１９９４）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。別の実施形態では、スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ２手法）が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、１２（４）：３０９−３２３（１９９８）、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる）。しかし、上記の文献に記述されているベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム（Ｂｏｅｈｍ）関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数を使用して評価される。修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー（ΔＧ_bind）は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド（ΔＧ_o）の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与（ΔＧ_hb）；摂動のないイオン間相互作用（ΔＧ_ionic）からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用（ΔＧ_lipo）；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する（ΔＧ_rot）；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー（Ｅ_vdW）。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
（ΔＧ_bind）＝（ΔＧ_o）＋（ΔＧ_hbｘＮ_hb）＋（ΔＧ_ionicｘＮ_ionic）＋（ΔＧ_lipoｘＮ_lipo）＋（ΔＧ_rot＋Ｎ_rot）＋（Ｅ_vdW）
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧ_o、ΔＧ_hb、ΔＧ_ionic、ΔＧ_lipoおよびΔＧ_rotは、それぞれ５．４、−４．７、−４．７、−０．１７および１．４の値を与えられる定数である。
【００５８】
Ｎ_hbは方程式２：
Ｎ_hb＝Σ_h-bondsｆ（ΔＲ，Δα）×ｆ（Ｎ_neighb）×ｆ_pcs
によって計算される。
【００５９】
ｆ（ΔＲ，Δα）は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ（ΔＲ，Δ−□）＝ｆ１（ΔＲ）×ｆ２（Δα）
ここで、ｆ１（ΔＲ）＝１（ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合）、
または ＝１−（ΔＲ−ＴＯＬ）／０．４（ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合）、
または ＝０（ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合）。
さらに、ｆ２（Δα）＝１（Δα＜３０°の場合）
または ＝１−（Δα−３０）／５０（Δα＜＝８０°の場合）
または ＝０（Δα＞８０°の場合）。
【００６０】
ＴＯＬは水素結合長さ（＝０．２５Å）で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値（＝１．９Å）からの偏差、
Δαは水素結合角度∠_N/O-H,O/Nの理想的な値（＝１８０°）からの偏差、
ｆ（Ｎ_neighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ（Ｎ_neighb）＝（Ｎ_neighb／Ｎ_neighb,0）α（ここで、α＝０．５）
によって計算される。
【００６１】
Ｎ_neighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎ_neighb,0＝定数２５である。
【００６２】
ｆ_pcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆ_pcs＝β（Ａ_polar／Ｎ_HB＜１０Ųの場合）、
またはｆ_pcs＝１（Ａ_polar／Ｎ_HB＞１０Ųの場合）
Ａ_polarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
Ｎ_HBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【００６３】
修正されたベーム（Ｂｏｅｈｍ）スコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧ_ionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する（同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【００６４】
Ｎ_lipo項は方程式５によって計算される：
Ｎ_lipo＝Σ_ILｆ（ｒ_IL）
ｆ（ｒ_IL）はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ（ｒ_IL）＝１（ｒ_IL＜＝Ｒ１ｆ（ｒ_IL）＝（ｒ_IL−Ｒ１）／（Ｒ２−Ｒ１）でＲ２＜ｒ_IL＞Ｒ１の場合、
ｆ（ｒ_IL）＝０（ｒ_IL＞＝Ｒ２の場合）。
【００６５】
ここで、Ｒ１はｒ１^vdw＋ｒ_L ^vdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１^vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒ_L ^vdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【００６６】
Ｎ_rotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ³−ｓｐ³結合およびｓｐ³−ｓｐ²結合の数である。末端ＣＨ₃またはＮＨ₃の回転は考慮に入れない。
【００６７】
最後の項Ｅ_vdwは方程式６によって計算される：
Ｅ_vdw＝ε₁ε₂（（ｒ₁ ^vdw＋ｒ₂ ^vdw）¹²／ｒ¹²−（ｒ₁ ^vdw＋ｒ₂ ^vdw）⁶／ｒ⁶）
ここでε₁とε₂は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ₁ ^vdw＋ｒ₂ ^vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【００６８】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε₁とε₂はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：０．２４５、Ｎ：０．２８３、Ｏ：０．３１６、Ｓ：０．３１６（つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について）。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：１．８５、Ｎ：１．７５、Ｏ：１．６０、Ｓ：２．００Å。
【００６９】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである（特に本願で試みられている計算のタイプについて）。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【００７０】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【００７１】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【００７２】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造（すなわち、アミノ酸配列）に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【００７３】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６１：２６９−２８８（１９８２））、ＬＵＤＩ（Ｂｏｅｈｍ，Ｈ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８：６２３−６３２（１９９４））およびＦＬＥＸＸ（Ｒａｒｅｙ Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、ＩＳＭＢ、３：３００−３０８（１９９５））。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ（Ｔｒｉｐｏｓ）およびＣＨＡＲｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、４：１８７−２１７（１９８３）。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Ｄａｕｂｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．、ｐｒｏｔｅｉｎｓ４（１）：３１−４７（１９８８）。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．、ｅｄ．、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ：０−３０６ ４３１３−９。

Claims (29)

1. ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子。
2. 本来の非修飾分子に由来する１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、前記免疫原性の喪失が達成される請求項１に記載の分子。
3. 前記分子に由来するペプチドを結合し得る多数のＭＨＣアロタイプの低減により、前記免疫原性の喪失が達成される請求項１または２に記載の分子。
4. １つのＴ細胞エピトープが除去されている請求項２または３に記載の分子。
5. 前記本来存在するＴ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である請求項２から４のいずれかに記載の分子。
6. 前記ペプチド配列が、表１に記載される群から選択される請求項５に記載の分子。
7. 本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基が変更された請求項２から６のいずれかに記載の分子。
8. １個のアミノ酸残基が変更された請求項７に記載の分子。
9. アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換したものである請求項７または８に記載の分子。
10. １個または複数のアミノ酸残基の置換が表２に示すようにして行われる請求項９に記載の分子。
11. さらに１個または複数のアミノ酸残基の置換が表３に示すようにして行われ、前記分子に由来するペプチドを結合することができるＭＨＣアロタイプの数が低減している請求項１０に記載の分子。
12. １個または複数のアミノ酸の置換が表３に示されるようにして行われる請求項９に記載の分子。
13. アミノ酸残基の変更が、本来存在するアミノ酸残基の特定の位置における欠失によるものである請求項７または８に記載の分子。
14. アミノ酸残基の変更が、本来存在するアミノ酸への特定の位置におけるアミノ酸の付加によるものである請求項７または８に記載の分子。
15. さらに追加の変更が、前記分子の生物活性を回復するように行われる請求項７から１４のいずれかに記載の分子。
16. 前記さらに追加の変更が、特定のアミノ酸の置換、付加または欠失である請求項１５に記載の分子。
17. アミノ酸の変更が、同種のタンパク質配列を参考にして行われる請求項７から１６のいずれかに記載の分子。
18. アミノ酸の変更が、インシリコのモデリング技術を参考にして行われる請求項７から１６のいずれかに記載の分子。
19. 請求項１から１８のいずれかに記載の修飾されたケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）をコードするＤＮＡ配列。
20. 前記請求項のいずれかに定義されるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の生物活性を有する修飾された分子を、場合により薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物。
21. 以下のステップを含む、前記請求項のいずれかに定義されるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の生物活性を有する修飾された分子の製造方法：
    （ｉ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を決定すること；
    （ｉｉ）インビトロもしくはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
    （ｉｉｉ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合によって、あるいはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合によって、測定したＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減または除去するように、識別した潜在的なＴ細胞エピトープ内に１つまたは複数のアミノ酸を修飾した新規な配列変異体を設計すること；
    （ｉｖ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、かつ前記変異体を試験することによって、所望の特性を備えた１つまたは複数の変種を識別すること；および
    （ｖ）場合によってはステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと。
22. ステップ（ｉｉｉ）を、本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失により行う請求項２１に記載の方法。
23. 前記変更を、同種のタンパク質配列および／またはインシリコモデリング技術を参考にして行う請求項２２に記載の方法。
24. ステップ（ｉｉ）を以下のステップ：
    （ａ）既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；（ｂ）所定の均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを前記選択領域から連続的にサンプリングすること；（ｃ）サンプリングした前記アミノ酸残基セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対する割当て値を合計することにより、サンプリングした前記各セグメントについてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および（ｄ）実質的にペプチドの治療上の有用性を低減せずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算したＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別する
    により実行する請求項２１から２３のいずれかに記載の方法。
25. ステップ（ｃ）を、好ましくは、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド対立エネルギー項を含むように修飾したベーム（Ｂｏｈｍ）スコアリング関数を用い、（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；（５）サンプリングした各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；（６）サンプリングした各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する請求項２４に記載の方法。
26. 潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、免疫原性的に非修飾のケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）から作製され、表１に示した群から選択される１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチド。
27. 請求項２６に記載の１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチド中の連続する少なくとも９個のアミノ酸残基からなるペプチド配列。
28. インビボで使用した時に、同一の生物活性を有する非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を製造するための、請求項２６に記載の１３ｍｅｒのＴ細胞エピトープペプチドの使用。
29. インビボで使用した時に、同一の生物活性を有する非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を製造するための、請求項２７に記載のペプチド配列の使用。