CN104341529B - 带有DARPin的双特异性嵌合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性嵌合蛋白，其包括经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，以及与所述DARPin相连的IgG抗体，scFv‑Fc抗体片段，或其组合；用其治疗或预防癌症的方法，以及相关的方法和组合物。

Description

带有DARPin的双特异性嵌合蛋白
发明背景
1.发明领域
本文涉及含有经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)的双特异性嵌合蛋白，以及相关的方法和组合物。
2.相关技术的描述
在活细胞中，各种蛋白彼此相互作用，参与各种致病机制。如果有至少两种这样的致病蛋白被同时抑制，相比于仅有单一蛋白被抑制的情况而言，就有更大的可能性来治疗和预防疾病。为此，研发了多种能抑制至少两种蛋白的抗体。
尽管研发出数种双特异性抗体，其中大多数不能在商业上用作抗体药物，因为它们的疗效未经临床验证或者观察到了多种副作用。此外，所研发的双特异性抗体在稳定性和产量方面有不足，这对于商业应用而言也是障碍。早期研发的具有IgG形式的双特异性抗体难以分离和纯化，因为在生产过程中轻链和重链随机组合，导致大规模生产中的诸多问题。而且，在非IgG的双特异性抗体的情形中，与蛋白折叠、药效学等无关的作为药物的稳定性也没有得到验证。
因此，需要研发在活体内稳定性增强、且作为药物有改进特性的双特异性抗体。
发明内容
本申请提供了双特异性嵌合蛋白(双特异性抗体偶联物)，其包括抗体(例如IgG抗体)和/或抗体片段(例如ScFv-Fc抗体片段)、以及与其相连的经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，本发明还提供了包含所述抗体和可药用载体的药物组合物。所述的双特异性嵌合蛋白或双特异性抗体偶联物可以用作双特异性抗体。
本申请还提供了制备所述双特异性嵌合蛋白的方法，其通过将DARPin与抗体(例如IgG抗体)和/或抗体片段(例如ScFv-Fc抗体片段)相连来实现， 或通过在细胞中表达编码所述双特异性嵌合蛋白的核酸来实现。
本申请还提供了用于治疗或预防癌症的所述双特异性嵌合蛋白，或者所述双特异性嵌合蛋白在治疗或预防癌症方面的用途。
此外，本申请还提供了用于增强双特异性嵌合蛋白的抗癌效力的DARPin，或者DARPin用于增强双特异性嵌合蛋白的抗癌效力的用途，是与未连接DARPin的抗体或抗体片段相比。
本申请还提供了相关的组合物和方法，可以从下文的详述中更清楚地了解。
附图说明
图1图示了根据一个实施方案用抗EGFR DARPin制备多种双特异性抗体偶联物的过程。
图2图示了根据一个实施方案用抗EGFR DARPin制备多种双特异性抗体偶联物的过程。
图3图示了根据一个实施方案制备抗c-Met/抗EGFR双特异性嵌合蛋白的过程。
图4图示了根据一个实施方案的抗c-Met/抗EGFR双特异性嵌合蛋白在溶液中展示的稳定性特性。
图5图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白与EGF在竞争性ELISA试验中的竞争。
图6图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白在A431细胞中抑制EGFR磷酸化的程度。
图7图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对SNU5细胞增殖的抑制程度。
图8图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对MKN45细胞增殖的抑制程度。
图9图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对H1993细胞增殖的抑制程度。
图10图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对A431细胞增殖的抑制程度。
图11的荧光图像显示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异 性嵌合蛋白对c-Met和EGFR的内在化。
图12图示了根据一个实施方案的抗-c-Met/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白的c-Met(上图)和EGFR(下图)表达量。
图13图示了根据一个实施方案制备抗HER2/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白的过程。
图14图示了根据一个实施方案的抗HER2/抗EGFR双特异性嵌合蛋白展示的稳定性特性。
图15图示了根据一个实施方案的抗HER2/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对MKN45细胞增殖的抑制程度。
图16的荧光图像显示了根据一个实施方案的抗HER2/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白对HER2和EGFR的内在化。
图17图示了根据一个实施方案制备抗HER3/抗-EGFR双特异性嵌合蛋白的过程。
图18图示了根据一个实施方案的抗HER3/抗EGFR双特异性嵌合蛋白展示的稳定性特性
图19图示了根据一个实施方案制备抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin双特异性嵌合蛋白的过程。
图20图示了根据一个实施方案的抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin双特异性嵌合蛋白展示的稳定性特性。
图21A至21G展示了各种DARPin的核苷酸序列。
具体实施方式
已研发出多种类型和形式的双特异性抗体，且由于这些抗体结合至少两种抗原的能力，可预期其与早已存在的单克隆抗体相比具有出色的治疗效果。本文通过将DARPin与IgG抗体或其片段结合提供了双特异性嵌合蛋白。
DARPin(经设计的锚蛋白重复蛋白；见第5章“Designed Ankyrin RepeatProteins(DARPins):From Research to Therapy”,Methods in Enzymology,vol503:101～134(2012)；和“Efficient Selection of DARPins with Sub-nanomolar Affinitiesusing SRP Phage Display”,J.Mol.Biol.(2008)382,1211-1227，其全部公开内容引入本文作为参考)是指具有对靶蛋白的高特异性和高结合亲和力的抗体模拟蛋白，其通过基因工程制备。DARPin起源于天然的锚蛋白， 且具有包含至少2个锚蛋白重复基元(例如，包含至少3、4或5个锚蛋白重复基元)的结构。根据重复基元的数量，DARPin可具有任何适宜的分子量。例如，包含3、4、或5个锚蛋白重复基元的DARPin可分别具有约10kDa、约14kDa、或约18kDa的分子量。
DARPin包括提供结构的核心部分和位于该核心外且结合靶标的靶结合部分。该结构性核心包括保守的氨基酸序列而该靶结合部分包括根据靶标而相区别的氨基酸序列。
下表中总结了DARPin的实例且图21A-21G图释了其核苷酸序列：
靶蛋白 DARPin
人IgG1-Fc I_01/02/07/11/13/19
TNF-alpha T_01/02/07/08/09/16/25/27/37/40
ErbB1(EGFR) E_01/67/68/69
ErbB2(1-509) 9_16/26/29
ErbB2(1-631) H_14
ErbB4 B4_01/02/07/33/45/50/58
CitS cp34_15/16
DARPin具有与抗体相似的靶特异性。因此，通过将DARPin与抗体或抗体片段，如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体，或scFv-Fc抗体片段等连接，提供了一种新形式的双特异性嵌合蛋白。
一项实施方案提供了包括(a)DARPin和(b)抗体(例如，IgG抗体)、抗体片段(例如，scFv-Fc抗体片段)或其组合的双特异性嵌合蛋白。另一项实施方案提供了通过以下方法制备双特异性嵌合蛋白的方法：将(a)DARPin与(b)抗体(例如，IgG抗体)、抗体片段(例如，scFv-Fc抗体片段)或其组合结合，或在细胞中表达编码该双特异性抗体的核酸。该结合步骤可在体外(ex vivo)进行。
在该双特异性嵌合蛋白中，DARPin和抗体或抗体片段的靶标(抗原)可以相同(在该情况中，识别位点是不同的)或彼此不同。因此，该双特异性嵌合蛋白可用作靶向不同抗原或相同抗原中不同识别位点(表位)的双特异性抗体。
抗体可以是任一亚型的免疫球蛋白(例如,IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)。
该IgG抗体可以是哺乳动物的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，例如IgG1或IgG2亚型。该IgG抗体可包含两条重链和两条轻链，且所述重链和轻链经由二硫键彼此连接，形成两个重链-轻链结构。所述重链-轻链结构在重链的Fc区经由二硫键彼此连接。所述IgG形式的抗体可以是靶向单一抗原的单特异性抗体(单靶向抗体)，其在两个重链-轻链结构中包含针对相同抗原的抗原结合区；或者能够靶向两种抗原的抗体(双重靶向抗体)，其在所述两个重链-轻链结构的每一个中包含针对不同抗原的的抗原结合区。
scFv-Fc形式的抗体可以是靶向单一抗原的单特异性抗体，其包含一个scFv-Fc片段，所述scFv-Fc片段针对一个抗原的抗原结合区；靶向单一抗原的二聚体形式的单特异性抗体，其包含两个scFv-Fc片段，所述scFv-Fc片段包含针对相同抗原的抗原结合区，其中所述两个scFv-Fc片段在Fc区彼此连接；或能够靶向两种抗原的二聚体形式的抗体，其包含两个scFv-Fc片段，所述scFv-Fc片段包含针对彼此不同的抗原的抗原结合区，其中所述两个scFv-Fc片段在Fc区彼此连接。Fc区可衍生自哺乳动物的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，例如IgG1或IgG2，具体地，人IgG1或人IgG2。
当具有IgG形式或scFv-Fc形式的抗体能够靶向两个抗原时，所靶向的两个抗原中的一个可与DARPin的靶标相同。
术语“抗原结合区”(例如，互补位)可指包含与抗原特异性结合的片段的多肽，且，例如，指的是重链CDR(互补决定区)、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或其组合(例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2)。
此外，DARPin可与C-端、N-端、两个末端，或IgG形式或scFv-Fc形式的抗体的任何其它可连接位点连接。例如，但不限于，为了保持所述IgG形式或scFv-Fc形式的抗体的抗原结合能力，所述DARPin可与IgG形式或scFv-Fc形式的抗体的Fc区的C-端连接。
如果所述双特异性嵌合蛋白包含DARPin以及IgG形式的抗体与scFv-Fc形式的抗体的组合，则所述DARPin、IgG形式的抗体和scFv-Fc形式的抗体可以任意顺序连接。尽管在一些情况中，所述双特异性嵌合蛋白的有效率或表达率可能取决于连接顺序，但在通常情况中，连接顺序对所述双特异性嵌合蛋白所需的有效性并无影响。例如，但不限于，所述双特异性嵌合蛋白可包含IgG形式的抗体、与所述IgG形式的抗体的C-端连接的DARPin和与所述DARPin的C-端连接的scFv-Fc形式的抗体。
所述双特异性嵌合蛋白可包含至少一个DARPin，例如，约1个至约10个、约1个至约5个或约1个至约3个包含相同氨基酸序列的DARPin，或者包含至少两种DARPin，例如约2种至约10种，约2种至约5种或约2种至约3种包含不同氨基酸序列并靶向相同或不同抗原的DARPin。当包含至少两个DARPin或至少两种DARPin时，所述至少两个DARPin或至少两种DARPin可彼此连接(例如，以提供重复形式的DARPin)并且然后与所述抗体(具有IgG形式或scFv-Fc形式)连接。所述DARPin可与具有IgG形式或scFv-Fc形式的抗体的各链的C-端、N-端和其它可连接位点中的至少一个连接。
所述双特异性嵌合蛋白可进一步包含至少一种抗原结合片段，例如，1种至5种或1种至3种与DARPin和IgG抗体或scFv-Fc抗体片段靶向的相同或不同的抗原的抗原结合片段。这些额外的抗原结合片段可以是重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或其组合(例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2)，并且与所述双特异性嵌合蛋白的任意可连接位点(例如，重链的C-端(例如，Fc区)或所述具有IgG形式和/或scFv-Fc形式的抗体的轻链的C-端，或所述DARPin的C-端)连接。
DARPin和IgG形式和/或scFv-Fc形式的抗体；scFv-Fc中的重链可变区和轻链可变区；scFv-Fc和scFv-Fc(在形成二聚体的情况中)；和抗原结合片段、DARPin和IgG形式和/或scFv-Fc形式的抗体可在有或无接头的情况下彼此连接。所述接头可以是肽接头，且如果使用两个或多个接头，则所述接头可以相同或彼此不同。所述肽接头可包括1至100或2至50(例如，5至25、1至10或2至5)个氨基酸，且所述肽接头中包含的氨基酸的种类可不具有任何限制。例如，所述肽接头可包含Gly、Asn和/或Ser残基，或可包含中性氨基酸，如Thr和/或Ala。适于肽接头的氨基酸序列可以是相关领域公知的。所述肽接头的长度可适当地确定从而对所述双特异性嵌合蛋白的功能没有负面影响。例如，所述肽接头可包括至少一种选自Gly、Asn、Ser、Thr和Ala的氨基酸，其中所述接头中的氨基酸的总数可以为1至100、2至50或5至50。在一项实施方案中，所述肽接头可表示为(GGGGS)n，其中“n”为选自1至10的整数(例如，选自2至5的整数)。
由于DARPin对抗原(靶标)具有高亲和力，且较很多类型的抗体片段(例如，scFv、Fab等)具有更高的稳定性和更小的分子量，因此DARPin在活体中具有有利的性质(如活体中的药代动力学(PK)性质)和稳定性。此外，DARPin 可容易地与其它蛋白融合。因此，DARPin可用于制备在体内具有出色性质和稳定性的双特异性嵌合蛋白。
“EGFR(表皮生长因子受体)”是HER家族受体酪氨酸激酶(RTK)中的一员。EGFR的过表达、基因扩增、突变或重排在数种人恶性肿瘤中经常被观察到且与癌症治疗的不良预后和较差的临床结果相关。基于这些原因，EGFR称为抗癌治疗中的重要靶标。
在一项实施方案中，DARPin可以是抗-EGFR DARPin(或EGFR-结合型DARPin)，其靶向EGFR，即特异性地结合EGFR。在该情况中，所述双特异性嵌合蛋白包含(a)抗-EGFRDARPin和(b)抗体(例如，IgG抗体)、抗体片段(例如，scFv-Fc抗体片段)，或其组合。在另一项实施方案中，提供了一种制备包含(a)抗-EGFR DARPin和(b)抗体(例如，IgG抗体)、抗体片段(例如，scFv-Fc抗体片段)，或其组合的双特异性嵌合蛋白的方法。所述包含抗-EGFRDARPin和抗体和/或抗体片段的双特异性嵌合蛋白可用作靶向两个或多个包括EGFR的抗原或两个或多个识别位点的双特异性抗体。
所述抗-EGFR DARPin可以是任何具有DARPin所拥有的独特结构且特异性结合EGFR的DARPin。例如，所述抗-EGFR DARPin可以是选自以下4个抗-EGFR DARPin中的至少一个：
抗-EGFR DARPin-01(SEQ ID NO:109):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnaddtwgwtplhlaayqghleivevllkngadvnaydyigwtplhlaadghleivevllkngadvnasdyigdtplhlaahnghleivevllkhgadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
抗-EGFR DARPin-67(SEQ ID NO:110):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnatdndgntplhlsawighleivevllkhgadvnaddllgmtplhlaadtghleivevllkygadvnardtrgktplhlaardghleivevllkhdadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
抗-EGFR DARPin-68(SEQ ID NO:111):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnafdywgmtplhlaadnghleivevllkhgadvnasdnfgftplhlaafyghleivevllkhgadvnafdmwgntplhlaaqnghleivevllkngadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
抗-EGFR DARPin-69(SEQ ID NO:112):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnaddnagrtplhlaanfghleivevllkngadvnakghhcntplhlaawaghleivevllkygadvnadddegytplhlaadigdleivevllkygadvnawdmygrtplhlaasaghleivevllkygadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
在所述双特异性嵌合蛋白中，IgG形式的抗体和/或scFv-Fc形式的抗体可靶向EGFR，或可与抗-EGFR DARPin靶向不同的抗原。当所述IgG形式的抗体和/或scFv-Fc形式的抗体与所述抗-EGFR DARPin靶向相同的抗原时，所述抗体和所述抗-EGFR DARPin所识别和结合的表位可以相同或彼此不同。
如上所述，EGFR是癌症治疗中的主要靶标。如果靶向至少一种其它肿瘤相关蛋白(HER1、ErbB-1)，如细胞信号转导相关蛋白(包括信号转导分子(例如，受体如受体酪氨酸激酶蛋白等))等，则可获得提高的抗癌作用。当所述IgG形式的抗体和/或scFv-Fc形式的抗体靶向(识别)的抗原与所述抗-EGFR DARPin所靶向的抗原不同时，所述抗体或抗体片段所识别的抗原可独立地选自肿瘤相关蛋白，例如，除EGFR外的多种生长因子和多种受体酪氨酸激酶蛋白。所述生长因子可包括，例如，EGF(表皮生长因子)、PDGF(血小板衍生的生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)等。所述受体酪氨酸激酶蛋白可包括所述生长因子的受体，且尤其包括ErbB家族，如HER2、HER3等，胰岛素受体、PDGF受体(血小板衍生的生长因子受体；PDGFR)、FGF受体(成纤维细胞生长因子受体；FGFR)、VEGF受体(血管内皮生长因子受体；VEGFR)、HGF受体(肝细胞生长因子受体；HGFR)如c-Met等、Trk受体(原肌球蛋白受体激酶受体)、Eph受体(Ephrin受体)、AXL受体、LTK受体(白细胞受体酪氨酸激酶)、TIE受体、ROR受体(受体酪氨酸激酶样孤儿受体)、DDR受体(盘状结构域受体)、RET受体、KLG受体、RYK受体(与受体酪氨酸激酶受体相关)、MuSK受体(肌肉特异性激酶受体)等。在一项具体的实施方案中，所述IgG形式的抗体和/或scFv-Fc形式的抗体可独立地识别选自c-Met、HER2、HER3、VEGF等作为抗原的至少一个(见，例如图1)。
IgG形式的抗体可具有IgG1或IgG2亚型形式。所述IgG形式的抗体的结构如上所述。所述IgG形式的抗体可以是靶向单一抗原(单一靶向的抗体)的单特异性抗体，所述抗体在两个重链-轻链结构处均包含针对相同抗原的抗原结合区；或者能够靶向两个抗原的抗体(双重靶向抗体)，所述抗体在两个重链-轻链结构的每一个处分别包含针对不同抗原的抗原结合区。所述scFv-Fc形式的抗体可以是靶向单一抗原的单体形式的单特异性抗体，其包含一个scFv-Fc 片段，所述scFv-Fc片段包含针对一个抗原的抗原结合区；靶向单一抗原的二聚体形式的单特异性抗体，所述抗体包含两个scFv-Fc片段，所述scFv-Fc片段包含针对相同抗原的抗原结合区，其中所述两个scFv-Fc片段在Fc区彼此连接；或能够靶向两个抗原的二聚体形式的抗体，所述抗体包含两个scFv-Fc片段，所述scFv-Fc片段包含针对彼此不同的抗原的抗原结合区，其中所述两个scFv-Fc片段在Fc区彼此连接。当所述IgG形式或scFv-Fc形式的抗体能够靶向两个抗原时，所靶向的两个抗原中的一个可以是EGFR，且在该情况中，所述抗体可与所述抗-EGFR DARPin识别和/或结合EGFR的相同区域或不同区域。
在所述IgG形式或scFv-Fc形式的抗体中，术语“抗原结合区”如上所述，且可以是包含特异性结合抗原的片段的多肽，例如，重链CDR(互补决定区)、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或其组合(例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2)，其中所述抗原为选自肿瘤相关蛋白，例如生长因子和受体酪氨酸激酶蛋白的至少一种。
所述抗-EGFR DARPin可与所述抗体(例如，IgG抗体)或抗体片段(例如，scFv-Fc抗体片段)的C-端、N-端或任何可连接位点连接。例如，但不限于，为了保持所述抗体或抗体片段的抗原结合能力，所述抗-EGFR DARPin可与所述抗体(例如，IgG抗体)或抗体片段(例如，scFv-Fc抗体片段)的C-端连接。
如果所述双特异性嵌合蛋白包含抗-EGFR DARPin以及IgG形式的抗体与scFv-Fc形式的抗体的组合，则所述抗-EGFR DARPin、IgG形式的抗体和scFv-Fc形式的抗体可以任意顺序连接。尽管在一些情况中，所述双特异性嵌合蛋白的有效率或表达率可能取决于连接顺序，但在通常情况中，连接顺序对所述双特异性嵌合蛋白所需的有效性并无影响。例如，但不限于，所述双特异性嵌合蛋白可包含IgG形式的抗体、与所述IgG形式的抗体的C-端连接的抗-EGFR DARPin和与所述抗-EGFR DARPin的C-端连接的scFv-Fc形式的抗体。
所述双特异性嵌合蛋白可包含至少一个抗-EGFR DARPin，例如，约1个至约10个、约1个至约5个或约1个至约3个包含相同氨基酸序列的抗-EGFR DARPin，或者包含至少两种抗-EGFR DARPin，例如约2种至约10种，约2种至约5种或约2种至约3种包含不同氨基酸序列的抗-EGFR DARPin。当所述抗-EGFR DARPin包含不同氨基酸序列时，所述抗-EGFR DARPin所识别和/或 结合的EGFR的表位可以相同或彼此不同。除所述抗-EGFR DARPin外，所述双特异性嵌合蛋白可进一步包含一个或多个DARPin，例如约1种至约10种、约1种至约5种或约1种至约3种DARPin，所述DARPin靶向除EGFR外的其它蛋白。当包含至少两个DARPin或至少两种DARPin时，所述至少两个DARPin或至少两种DARPin可彼此连接(例如，以提供重复形式的DARPin)并且然后通过具有IgG形式或scFv-Fc形式的抗体的各链的C-端、N-端和其它可连接位点中的至少一个与所述抗体(具有IgG形式或scFv-Fc形式)连接。例如，所述抗-EGFRDARPin可以是重复形式，其中一个或多个选自包含SEQ ID NO:109、110、111和112的氨基酸序列的抗-EGFR DARPin的抗-EGFR DARPin重复1至10次，约1至约5次，或约1至约3次，并且在该情况中，抗-EGFR DARPin的重复形式可以与具有IgG形式和/或scFv-Fc形式的抗体的C-端、N-端和其它可连接位点(例如重链的C-端(即Fc区)或轻链的C-端)连接。例如，所述抗-EGFR DARPin可包含至少一个选自以下的抗-EGFR DARPin：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112的抗-EGFR DARPin，或其中至少一个抗-EGFR DARPin重复2至10次、2至5次，或2至3次的重复形式。
所述双特异性嵌合蛋白可进一步包含至少一种，例如1至5或1至3种与所述抗-EGFR DARPin、所述IgG形式的抗体和所述scFv-Fc形式的抗体靶向相同或不同的抗原的抗原结合片段。所述额外的抗原结合片段可以是靶向选自生长因子和受体酪氨酸激酶中的至少一种的抗体的重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或其组合(例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2)，并且与所述双特异性嵌合蛋白的任意可连接位点(例如，重链的C-端(例如，Fc区)或所述具有IgG形式和/或scFv-Fc形式的抗体的轻链的C-端，或所述抗-EGFR DARPin的C-端)连接(见，例如图2)。例如，所述抗原结合片段可以是选自以下的至少一种：针对c-Met的抗原结合片段(抗-c-Met抗体的抗原结合区)、针对HER2的抗原结合片段、针对HER3的抗原结合片段、针对EGFR的抗原结合片段、针对VEGF的抗原结合片段等。
抗-EGFR DARPin和IgG形式和/或scFv-Fc形式的抗体；scFv-Fc中的重链可变区和轻链可变区；scFv-Fc和scFv-Fc(在形成二聚体的情况中)；以及抗原结合片段、抗-EGFRDARPin和IgG形式和/或scFv-Fc形式的抗体可在有或无接头的情况下彼此连接。所述接头如上所述。
由于所述抗-EGFR DARPin对抗原(EGFR)具有高亲和力，且较通用抗体片段(例如，scFv、Fab等)具有更高的稳定性和更小的分子量，因此所述抗-EGFR DARPin在活体中具有有利的性质(如活体中的药代动力学(PK)性质)和稳定性。此外，DARPin可容易地与其它蛋白融合。因此，DARPin可用于制备在体内具有出色性质和稳定性的双特异性嵌合蛋白。
在一个实施方案中，IgG形式的抗体和/或scFv-Fc形式的抗体片段可以是靶向c-Met的抗c-Met抗体。在此情况中，包含抗EGFR DARPin和抗c-Met抗体或其片段的双特异性嵌合蛋白可以用作靶向EGFR和c-Met的双特异性抗体。
c-Met是一种代表性的受体酪氨酸激酶蛋白，其与EGFR相互作用，并且参与多种肿瘤相关机制。这些蛋白质诱导癌细胞的增殖和穿透，血管发生，等等。另外，这些蛋白质彼此相互作用，并且参与彼此的信号转导途径，由此诱导对每种治疗的抗性。另外，通过施用EGFR靶向性治疗(Erbitux(爱必妥)
Figure BDA0000544752490000111
、Tarceva(特罗凯)
Figure BDA0000544752490000112
、Iressa(易瑞沙)TM，等等)获得的抗性与c-Met的过表达和突变相关。因此，与抑制单一靶物的情况相比，对EGFR和c-Met的同时抑制可以实现克服先前存在的抗癌治疗的许多问题(诸如副作用，抗性等)的可能性增加及升高的治疗效果。因此，预期的是对癌症的治疗效果可以通过同时抑制EGFR和c-Met获得。
另外，靶向c-Met的抗体仅对有限的癌症种类展现出癌细胞增殖抑制效果。如果c-Met是过表达的，那么经常观察到EGFR的过表达。因此，同时抑制c-Met和EGFR以克服对c-Met靶向治疗的抗性是有利的。
因此，一个实施方案提供了双特异性嵌合蛋白，其包含(a)抗EGFR DARPin，和(b)IgG形式的抗体、scFv-Fc形式的抗体、或其组合。另一个实施方案提供了制备双特异性嵌合蛋白的方法，其包括结合(a)抗EGFR DARPin与(b)IgG形式的抗体、scFv-Fc形式的抗体、或其组合。当抗EGFR DARPin是包含至少两种抗EGFR DARPin的抗EGFR DARPin时，所述方法可以进一步包括在结合抗EGFR DARPin与IgG形式的抗体、scFv-Fc形式的抗体、或其组合的步骤之前或之后将至少2种，例如约2至约10种，约2至约5种，或约2至约3种抗EGFR DARPin彼此连接(例如串联连接)的步骤。
抗c-Met抗体能够诱导c-Met的胞内内在化和降解。基于c-Met的此类能力，包含抗EGFR DARPin和抗c-Met抗体的双特异性嵌合蛋白可以诱导EGFR 降解及c-Met降解，由此在无激动的情况下导致升高的抗癌活性。在应用双特异性嵌合蛋白时，观察到EGFR聚簇。EGFR聚簇导致相关蛋白酪氨酸激酶(PTK)聚簇以形成信号转导复合物，其与c-Met一起被胞内内在化和降解，由此可以获得双特异性嵌合蛋白的升高的治疗效果。双特异性嵌合蛋白的升高的治疗效果在存在c-Met配体HGF(肝细胞生长因子)时可以是更加升高的，并且此类效果在c-Met过表达细胞(例如癌细胞)中可以更加清楚地看到。另外，双特异性嵌合蛋白可以克服对c-Met靶向治疗，诸如抗c-Met抗体和/或EGFR靶向治疗，诸如抗EGFR抗体的抗性，由此甚至对具有对此类治疗的抗性的癌细胞展现出治疗效果。包含抗EGFR DARPin和抗c-Met抗体的双特异性嵌合蛋白由于与先前存在的抗体的治疗机制区别的治疗机制而可以展现出更加升高的效果，如上文描述的。
抗c-Met抗体可以是对c-Met起作用以诱导c-Met的胞内内在化和降解的任何抗体或抗原结合片段。抗c-Met抗体可以是识别c-Met的特定区域，例如SEMA域中的特定区域，如表位的任何抗体。
“c-Met蛋白”指与肝细胞生长因子结合的受体酪氨酸激酶。c-Met蛋白可以源自任何物种，例如那些源自灵长类的，诸如人c-Met(例如NP_000236)和猴c-Met(例如猕猴(Macaca mulatta)，NP_001162100)，或那些源自啮齿类的，诸如小鼠c-Met(例如NP_032617.2)和大鼠c-Met(例如NP_113705.1)。蛋白质包括例如由在GenBank登录号NM_000245下存放的核苷酸序列编码的多肽，或由在GenBank登录号NM_000236下存放的多肽序列编码的蛋白质，或其胞外域。受体酪氨酸激酶c-Met牵涉几种机制，包括癌症发生率、癌症转移、癌细胞迁移、癌细胞穿透、血管发生，等等。
c-Met(一种肝细胞生长因子(HGF)受体)可以分成三个部分：胞外、跨膜和胞内。胞外部分由通过二硫键彼此连接的α-亚基和β-亚基组成，并且含有负责结合HGF的SEMA域、PSI域(丛蛋白-脑信号蛋白-整联蛋白同源性域)和IPT域(由丛蛋白和转录因子域共享的免疫球蛋白样折叠)。c-Met蛋白的SEMA域可以具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列，并且是功能为结合HGF的胞外域。SEMA域的特定区域，即具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列(其对应于c-Met蛋白的SEMA域的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)的氨基酸残基106至124的范围)的区域是SEMA域的表位内的第二和第三推进物之间的环区域。该区域作用为本发明的特异性抗c-Met抗体的表位。
如本文中使用的术语“表位”指抗原性决定簇，即由抗体识别的抗原部分。在一个实施方案中，表位可以是包含c-Met蛋白的SEMA域(SEQ ID NO:79)内的5个或更多个邻近的(连续的或非连续的)氨基酸残基，例如SEQ ID NO:71的氨基酸序列内的5至19个邻近氨基酸残基的区域。表位可以是具有选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的部分组合的5至19个邻近氨基酸的多肽，其中该多肽基本上包含充当表位的实质性元件的SEQ ID NO:73的氨基酸序列(EEPSQ)。例如，表位可以是多肽，该多肽包含SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、或SEQ IDNO:73的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成。
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的表位对应于c-Met蛋白的SEMA域内第二和第三推进物之间的最外面的环部分。具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位是依照一个实施方案的抗体或抗原结合片段最特异性结合的位点。
因此，抗c-Met抗体可以特异性结合具有选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的部分组合的5至19个邻近氨基酸(包括SEQ ID NO:73)作为实质性元件的表位。例如，抗c-Met抗体可以特异性结合包含SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体或其抗原结合片段可以包含：
至少一个选自下组的重链互补决定区(CDR)：(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:2、或具有SEQ ID NO:2内的8-19个邻近氨基酸的氨基酸序列，其中该8-19个邻近氨基酸包含SEQ ID NO:2的第3位至第10位氨基酸残基；和(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:85、或具有SEQ ID NO:85内的6-13个邻近氨基酸的氨基酸序列，其中该6-13个邻近氨基酸包含SEQID NO:85的第1位至第6位氨基酸残基，或者包含至少一个重链互补性决定区的重链可变区；
至少一个选自下组的轻链互补决定区(CDR)：(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1；(b)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:86、或具有SEQ ID NO:89内的9-17个邻近氨基酸的氨基酸序列，其中该9-17个邻近氨基酸包含 SEQ ID NO:89的第1位至第9位氨基酸残基，或者包含至少一个轻链互补性决定区的轻链可变区；
至少一个重链互补决定区和至少一个轻链互补决定区的组合；或
重链可变区和轻链可变区的组合。
在本文中，SEQ ID NO:4至9的氨基酸序列分别以下文的式I至VI表示：
式I
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser(SEQ ID NO:4)，
其中Xaa1是缺乏的或Pro或Ser，且Xaa2是Glu或Asp，
式II
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr(SEQ ID NO:5)，
其中Xaa3是Asn或Lys，Xaa4是Ala或Val，且Xaa5是Asn或Thr，
式III
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr(SEQ ID NO:6)，
其中Xaa6是Ser或Thr，
式IV
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)
其中Xaa7是His、Arg、Gln、或Lys，Xaa8是Ser或Trp，Xaa9是His或Gln，且Xaa10是Lys或Asn，
式V
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(SEQ ID NO:8)
其中Xaa11是Ala或Gly，Xaa12是Thr或Lys，且Xaa13是Ser或Pro，且
式VI
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr(SEQ ID NO:9)
其中Xaa14是Gly、Ala、或Gln，Xaa15是Arg、His、Ser、Ala、Gly、或Lys，且Xaa16是Leu、Tyr、Phe、或Met。
在一个实施方案中，CDR-H1可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、22、23、和24。CDR-H2可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、25、和26。CDR-H3可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、27、28、和85。
CDR-L1可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、29、30、 31、32、33、和106。CDR-L2可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:11、34、35、和36。CDR-L3可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、13、14、15、16、37、86、和89。
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段可以包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括包含选自SEQ ID NO:1、22、23、和24的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)、包含选自SEQ ID NO:2、25、和26的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)、和包含选自SEQ ID NO:3、27、28、和85的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)；所述轻链可变区包含含有选自SEQ ID NO:10、29、30、31、32、33和106的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)、包含选自SEQ ID NO:11、34、35、和36的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)、和包含选自SEQ ID NO:12、13、14、15、16、37、86、和89的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
在抗c-Met抗体或抗原结合片段的一个实施方案中，重链的可变区包含SEQ IDNO:17、74、87、90、91、92、93、或94的氨基酸序列，且轻链的可变区包含SEQ ID NO:18、19、20、21、75、88、95、96、97、98、99、或107的氨基酸序列。
用所需抗原对未经免疫的动物进行免疫所产生的动物来源的抗体当注射于人用于医学治疗目的时，通常会引起免疫原性，因此已研发嵌合抗体以抑制此类免疫原性。嵌合抗体的制备是，通过遗传工程，将引起抗同种型应答的动物来源的抗体的恒定区替换为人抗体的恒定区。与动物来源的抗体相比，嵌合抗体极大地改善了抗同种型应答，但是动物来源的氨基酸仍具有可变区，从而嵌合抗体在潜在的抗独特型应答方面有副作用。已研发人源化抗体以减少此类副作用。人源化抗体通过将在嵌合抗体的可变区的抗原结合中起重要作用的互补决定区(CDR)移植至人抗体框架中而产生。
在CDR移植产生人源化抗体中最重要的事情是，选择经过优化的人抗体以便接受动物来源的抗体的CDR。使用了抗体数据库、晶体结构分析和分子模型技术。然而，即使当所述动物来源的抗体的CDR被移植至最优化的人抗体框架时，在动物来源的CDR的框架中仍然存在影响抗原结合的氨基酸。因此，在很多情况中，抗原结合亲和力不能被维持，因而需要恢复所述抗原亲和力的其它抗体工程技术的应用。
所述抗c-Met抗体可以是小鼠来源的抗体、小鼠-人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。所述抗体或其抗原结合片段可以自活体分离或是非天然存在 的。抗体或其抗原结合片段可以是重组的或合成的。
完整的抗体包括两个全长轻链和两个全长重链，其中每个轻链通过二硫键连接至重链。所述抗体具有重链恒定区和轻链恒定区。所述重链恒定区为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)型，其可进一步分为gamma 1(γ1)、gamma 2(γ2)、gamma 3(γ3)、gamma 4(γ4)、alpha 1(α1)或alpha 2(α2)。所述轻链恒定区为kappa(κ)或lambda(λ)型。
如本文所用，术语“重链”指的是全长重链和其片段，其包括包含足以提供对抗原特异性的氨基酸序列的可变区VH和三个恒定区CH1、CH2和CH3以及铰链。术语“轻链”指的是全长轻链和其片段，其包括包含足以提供对抗原特异性的氨基酸序列的可变区VL和恒定区CL。
术语“互补决定区(CDR)”指的是存在于免疫球蛋白的重链或轻链的高变区中的氨基酸序列。所述重链和轻链可分别包含三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3；和CDRL1、CDRL2和CDRL3)。所述CDR可提供在抗体与抗原或表位的结合中起重要作用的接触残基。术语“特异性结合”和“特异性识别”是本领域普通技术人员所公知的，且表示抗体和抗原彼此特异性接触以产生免疫活性。
术语“抗原结合片段”用于本文指完整免疫球蛋白的片段，其包括包含具有特异性结合抗原的抗原结合区的多肽的部分。在一个具体的实施方案中，抗原结合片段可以是scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、或F(ab’)2，但不限于此。
在众多抗原结合片段中，Fab包含轻链可变区和重链可变区、轻链恒定区、和第一重链恒定区CH1，具有一个抗原结合位点。
Fab’片段与Fab片段不同之处在于Fab’包含铰链区，在CH1的C末端具有至少一个半胱氨酸残基。
F(ab’)2抗体经由Fab’片段铰链区中的半胱氨酸残基进行二硫键桥联而形成。
Fv是最小的抗体片段，仅具有重链可变区和轻链可变区。生成Fv片段的重组技术是本领域中公知的。
双链Fv包含通过非共价键连接的重链可变区和轻链区。单链Fv一般包含重链可变区和轻链可变区，它们通过共价键经由肽接头连接，或在C末端连接以具有类似双链Fv的二聚体结构。肽接头可以与上文中的描述相同，例如那些包含约1至约100，约2至约50，特别是约5至约25个的氨基酸长度的，并 且可以不作任何限制地包含任何种类的氨基酸。
抗原结合片段可使用蛋白酶得到(例如，Fab片段可通过用木瓜蛋白酶对整个抗体的限制性切割获得，而F(ab’)2片段可通过用胃蛋白酶切割获得)，或者可通过使用遗传重组技术来制备。
如本文中使用的，术语“铰链区”指抗体的重链内CH1和CH2域之间功能为对抗原结合位点提供柔性的区域。
在动物抗体经受嵌合化过程时，用人IgG1铰链或IgG2铰链替换动物起源的IgG1铰链，同时两个重链间的二硫化物桥在数目上从3个减少到2个。另外，动物来源的IgG1铰链比人IgG1铰链短。因而，铰链的刚性被改变。因此，铰链区的修饰可以引起人源化抗体的抗原结合效力的改善。通过氨基酸删除、添加或取代修饰铰链区是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，可以通过在铰链区的氨基酸序列上删除、插入、添加或取代至少一个氨基酸残基修饰抗c-Met抗体或其抗原结合片段，使得其展现出增强的抗原结合效力。例如，抗体可以包括包含SEQ ID NO：100(U7-HC6)、101(U6-HC7)、102(U3-HC9)、103(U6-HC8)、或104(U8-HC5)的氨基酸序列的铰链区，或包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的铰链区(非修饰的人铰链)。具体地，铰链区具有SEQ ID NO:100或101的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以由以保藏号KCLRF-BP-00220保藏的杂交瘤细胞生成，其特异性结合c-Met蛋白的胞外区(参考韩国专利公开文本No.2011-0047698，其公开内容通过提及完整并入本文)。抗c-Met抗体可以包含韩国专利公开文本No.2011-0047698(其公开内容在此通过提及并入)中限定的任何抗体。
在抗c-Met抗体中，排除如上文定义的CDR、轻链可变区、和重链可变区的轻链和重链部分的剩余部分，即轻链恒定区和重链恒定区可以是那些来自任何免疫球蛋白亚类(例如IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM，等等)的。
进一步举例而言，抗c-Met抗体或抗体片段可以包含：
包含选自下组的氨基酸序列的重链：SEQ ID NO:62的氨基酸序列(其中第1位至第17位氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，或SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列，SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其中第1位至第17位氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，SEQ ID NO:64的第18位至第461位的 氨基酸序列，SEQ ID NO:66的氨基酸序列(其中第1位至第17位氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，和SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列；和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO:68的氨基酸序列(其中第1位至第20位氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，或SEQ ID NO:68的第21位至第240位的氨基酸序列，SEQ ID NO:70的氨基酸序列(其中第1位至第20位氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨基酸序列，和SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
例如，抗c-Met抗体可以选自下组：
包括包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68的第21位至第240位的氨基酸序列的轻链的抗体；
包括包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18位至第461位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68的第21位至第240位的氨基酸序列的轻链的抗体；
包括包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ ID NO:68的第21位至第240位的氨基酸序列的轻链的抗体；
包括包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨基酸序列的轻链的抗体；
包括包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18位至第461位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨基酸序列的轻链的抗体；
包括包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨基酸序列的轻链的抗体；
包括包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链的抗体；
包括包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18位至第 461位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链的抗体；和
包括包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链的抗体。
依照一个实施方案，抗c-Met抗体可以包括包含SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:68的第21位至第240位的氨基酸序列的轻链，或包含SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:108的序列的轻链。
多肽SEQ ID NO:70是包含人kappa(κ)恒定区的轻链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:68的多肽是通过用酪氨酸替换具有氨基酸序列SEQ ID NO:70的多肽的第62位(对应于依照kabat编号方式的SEQ ID NO:68第36位)组氨酸获得的多肽。抗体的生成产率可以因所述替换而增加。具有氨基酸序列SEQ ID NO:108的多肽是通过用色氨酸替换具有氨基酸序列SEQID NO:108的多肽的第32位(对应于SEQ ID NO:68的第52位，也即SEQ ID NO:68中从氨基酸残基21至240的氨基酸序列依照kabat编号方式的第27e位；位于CDR-L1内)丝氨酸获得的多肽。通过此类替换，包含此类序列的抗体和抗体片段展现出诸如c-Met结合亲和力、c-Met降解活性、Akt磷酸化抑制等等活性增强。
在另一个实施方案中，抗c-Met抗体可以包括包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的轻链互补决定区、包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区、或包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，所述抗-c-Met抗体可呈IgG的形式，例如，呈IgG1或IgG2亚型的形式。IgG形式的抗体的结构如上所述。
IgG形式的抗-c-Met抗体可为单一特异性的抗体(单一靶向的抗体)，其在两个重链-轻链结构上都包含c-Met抗原结合区(例如，重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或它们的组合)。或者，IgG形式的抗-c-Met抗体可以是能靶向两种抗原的抗体(双重靶抗体)，其在两个重链-轻链结构的一个中包含c-Met抗原结合区(例如，重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或它们的组合)，并在另一个重链-轻链结构中包含针对除了c-Met抗原之外的其它抗原的抗原结合区。在这种情况下，所述除了c-Met之外的抗原可以是EGFR。
在另一个实施方案中，IgG形式的抗-c-Met抗体可以是能结合多重表位且顶部和底部不对称的抗体，其可包含呈IgG形式、且在两个重链-轻链结构中都含c-Met抗原结合区的单一特异性抗体，以及与该IgG形式的单一特异性抗体的C端经由或不经接头相连的针对除了c-Met之外的另一种抗原的抗原结合区(例如，重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或它们的组合(例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2))。在这种情况下，所述除了c-Met之外的抗原可以是EGFR。接头如上所述。
在另一个实施方案中，scFv-Fc形式的抗体可以是，靶向c-Met的呈单体形式的单一特异性抗体，其包含一个含c-Met抗原结合区(例如，重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或它们的组合)的scFv-Fc片段；靶向单个抗原的呈二聚体形式的单一特异性抗体，其包含两个含c-Met抗原结合区的scFv-Fc片段，其中所述两个scFv-Fc片段在Fc区域彼此相连接；或能靶向c-Met和另一种抗原的呈二聚体形式的抗体，其包含含有c-Met抗原结合区的scFv-Fc片段和含有针对除了c-Met之外的抗原的抗原结合区的scFv-Fc片段，其中所述两种scFv-Fc片段在Fc区域彼此相连接。所述除了c-Met之外的抗原可以是EGFR。
在另一个实施方案中，双特异性嵌合蛋白可包含抗-EGFR DARPin以及IgG形式或scFv-Fc形式的针对除了c-Met之外的肿瘤相关蛋白(如选自受体、信号转导分子等)的抗体。信号转导分子可选自生长因子，例如EGF、PDGF、FGF、VEGF等。受体可为特异性结合信号转导分子的受体，且可选自除了c-Met之外的ErbBs(例如，EGFR、HER2、HER3等)、PDGFR、FGFR、VEGFR、HGFR等。
例如，IgG形式或scFv-Fc形式的抗体可包含选自以下的抗原结合区：
(1)HER2的抗原结合区：选自曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗-emtansine偶联物(T-DM1)等的抗-HER2抗体的抗原结合区(例如，重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区或它们的组合(例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2))；或包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链可变区、包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的轻链可变区或它们的组合(其中，重链可变区和轻链可变区可用或不用肽接头彼此相连接)。
其中抗-HER2抗体的重链可变区的氨基酸序列包含(SEQ ID NO:113)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
和，抗-HER2抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含(SEQ ID NO:114)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR
(2)HER3的抗原结合区：包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链可变区、包含SEQID NO:116的氨基酸序列的轻链可变区或它们的组合(其中，重链可变区和轻链可变区可用或不用肽接头彼此相连接)。
其中抗-HER3抗体的重链可变区的氨基酸序列包含(SEQ ID NO:115)
QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSAST
和抗-HER3抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含(SEQ ID NO:116)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLG
(3)抗-EGGFR/抗-HER3双特异性嵌合蛋白：包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链可变区、包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的轻链可变区或它们的组合(其中，重链可变区和轻链可变区可用或不用肽接头彼此相连接)。
其中抗-EGFR/抗-HER3抗体的重链可变区的氨基酸序列包含(SEQ ID NO:117)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSGDWIHWVRQAPGKGLEWVGEISAAGGYTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRVSFEAAMDYWGQGTLVTVSS
和抗-EGFR/抗-HER3抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含(SEQ ID NO:118)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIATDVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSEPEPYTFGQGTKVEIK
包含抗-EGFR DARPin和抗肿瘤相关蛋白的抗体的双特异性嵌合蛋白不仅可抑制EGFR活性还可抑制肿瘤相关蛋白活性，由此导致增强的治疗效果。具体地，包含抗-EGFRDARPin和抗-c-Met抗体的双特异性嵌合蛋白可通过抑制c-Met和EGFR的活性并经由抗体的内在化和降解降低c-Met和EGFR的总量来根本性地抑制c-Met和EGFR。因此，包含抗-EGFRDARPin和抗-c-Met抗体的双特异性嵌合蛋白可具有治疗效果，甚至当将其应用于对现有抗-EGFR拮抗剂(抗体)有抗性的受试者时也是如此。
另一个实施方案提供了包含作为活性成分的双特异性嵌合蛋白的药物组合物。另一个实施方案提供了用于预防和/或治疗癌症的包含作为活性成分的双特异性嵌合蛋白的药物组合物。另一个实施方案提供了预防和/或治疗癌症的方法，其包括对有预防和/或治疗癌症需要的受试者给予药学有效量的双特异性嵌合蛋白。所述方法还包括在给药步骤之前鉴定有预防和/或治疗癌症需要的受试者的步骤。另一个实施方案提供了双特异性嵌合蛋白用于预防和/或治疗癌症的用途。双特异性嵌合蛋白可为包含以下抗体的双特异性嵌合体抗体：(a)抗-EGFR DARPin和(b)呈IgG形式的抗体、呈scFv-Fc形式的抗体或它们的组合；或(a)抗-EGFR DARPin和(b)呈IgG形式的抗-c-Met抗体、呈scFv-Fc形式的抗-c-Met抗体或它们的组合。
所述癌症可与EGFR和/或c-Met的过表达(超量产生)和/或异常活化相关联。所述癌症可为实体癌或血液学癌(hematological cancer)，且例如可为，但不限于，一种或多种选自以下的癌症：鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、小细胞肺癌(small-cell lungcancer)、非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer)、肺腺癌(adenocarcinoma of thelung)、肺鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the lung)、腹膜癌(peritonealcarcinoma)、皮肤癌(skin cancer)、皮肤或眼球中的黑色素瘤(melanoma in the skin oreyeball)、直肠癌(rectal cancer)、肛周癌(cancer near the anus)、食道癌(esophaguscancer)、小肠肿瘤(small intestinal tumor)、内分泌腺癌(endocrine gland cancer)、甲状旁腺癌(parathyroid cancer)、肾上腺癌(adrenal cancer)、软组织肉瘤(soft-tissue sarcoma)、尿道癌(urethral cancer)、慢性或急性白血病(chronic or acuteleukemia)、淋巴细胞性淋巴瘤(lymphocytic lymphoma)、肝癌(hepatoma)、胃癌(gastriccancer)、胃肠癌(gastrointestinal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、子宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(livercancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝细胞腺瘤(hepatocellular adenoma)、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌(colon cancer)、大肠癌(large intestine cancer)、子宫内膜癌或子宫癌(endometrial carcinoma or uterine carcinoma)、唾液腺肿瘤(salivarygland tumor)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、外阴癌(vulvarcancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、头癌或颈癌(head or neck cancer)、脑癌(braincancer)、骨肉瘤(osteosarcoma)等。具体地，所述癌症可为具有对现有抗癌药物，例如针对EGFR的拮抗剂，具有抗性的癌症。癌症的预防和/或治疗效果不仅可包括抑制癌细胞的生长还包括抑制由其迁移、侵袭和转移引起的癌症的恶化。因此，可医治的癌症既可包括原发性癌症又可包括转移性癌症。
可将双特异性嵌合蛋白与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起给药或配制。
组合物中所要包含的可药用载体可为抗体制剂中常用的载体，所述载体可为一种或多种选自以下的物质，但不限于：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxy benzoate)、羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁和矿物油。药物组合物还包含一种或多种选自以下的物质：润滑剂、润湿剂、增甜剂、香味增强剂、乳化剂、助悬剂(suspension agent)和防腐剂。
可口服或肠胃外给予药物组合物或双特异性嵌合蛋白。肠胃外给药可包括静脉内注射(intravenous injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉注射(muscular injection)、腹膜内注射(intraperitoneal injection)、内皮给药(endothelial administration)、局部给药(local administration)、鼻内给药(intranasal administration)、肺内给药(intrapulmonary administration)和直肠给药(rectal administration)。由于口服给药导致蛋白质或肽的消化(digestion)，必须将组合物中用于口服给药的活性成分包衣或配制，从而防止在胃内的消化。此外，可使用任选的能够将活性物质递送到靶细胞的装置来给予组合物。
药物组合物与双特异性嵌合蛋白的适合剂量可以多种方式来建议(prescribed)，其取决于多种因素，例如配制方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、病理学情况(pathologic conditions)、饮食(diets)、给药时间、给药途径、排泄速率(excretionspeed)和反应敏感性(reaction sensitivity)。对于成 人而言，药物组合物或双特异性嵌合蛋白的期望剂量可为每天约0.001至100mg/kg或0.02至10mg/kg。本申请中所使用的术语“药学有效量”是指在预防或治疗癌症中展现效果的量。
通过相关领域技术人员容易实现的方法，可将药物组合物或双特异性嵌合蛋白与可药用载体和/或赋形剂配制成单位剂型或复合剂型(multiple dosage)。所述剂型可为在油性或含水介质中的溶液剂、混悬剂(suspension)、糖浆剂、乳化剂、提取物(extract)、粉剂(powder)、颗粒剂、片剂或胶囊剂，且还可包含分散剂或稳定剂。
此外，药物组合物或双特异性嵌合蛋白可作为单个的药物或与其它药物一起给药，且可与现有药物以任一次序先后给药或同时给药。
由于双特异性嵌合蛋白或药物组合物包含抗体或其抗原结合片段，可将其配制成免疫脂质体(immunoliposome)。可使用相关领域中公知的方法制备含抗体的脂质体。所述免疫脂质体为包含磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，且可通过反相蒸发法制备。例如，通过二硫键交换反应可将抗体的Fab'片段与脂质体轭合。化学药物例如多柔比星(doxorubicin)也可包含在脂质体中。
被给予药物组合物或双特异性嵌合蛋白的受试者或被施用预防和/或治疗方法的患者可为哺乳动物，例如，但不限于，灵长类如人和猴，或啮齿类如大鼠和小鼠。所述受试者或患者可为对现有抗癌药物具有抗性的癌症患者，所述抗癌药物例如EGFR拮抗剂(例如，抗-EGFR抗体等)和/或抗-c-Met抗体。
如上所述，DARPin在体内具有优良的性质(例如，药物动力学(PK)性质)和稳定性，并且因此，当其与现有抗体(例如，呈IgG形式的抗体)融合来制备双特异性嵌合蛋白时，不仅能同时靶向至少两种抗原(包括DARPin的靶标)而且还能增强呈IgG形式的抗体的性质和/或稳定性。即，通过使DARPin和现有呈IgG形式的抗体融合，可解决稳定性方面的缺陷(这是现有双特异性嵌合蛋白的主要问题)，且可达到更加增强的效果。
相应地，另一个实施方案提供了增强抗体效力的方法，所述方法包括使(a)DARPin与(b)IgG形式的抗体、scFv-Fc形式的抗体或它们的组合结合。另一个实施方案提供了增强抗体效力的方法，所述方法包括使(a)抗-EGFR DARPin与(b)IgG形式的抗体、scFv-Fc形式的抗体或它们的组合结合。另一 个实施方案提供了增强抗-c-Met抗体效力的方法，所述方法包括使(a)抗-EGFR DARPin与(b)具有IgG形式的抗-c-Met抗体、scFv-Fc形式的抗-c-Met抗体或它们的组合结合。
抗体(例如，抗-c-Met抗体)的效力的增强包括选自以下的至少一种：通过靶向至少两种抗原得到的协同效应(synergistic effects)、改善作为药物的性质如药物动力学(PK)特性、增强的体内或活体外稳定性、克服对抗体(例如，抗-c-Met抗体)的抗性、降低的抗体(例如，抗-c-Met抗体)副作用(例如，激动作用(agonism))等。
在增强抗体效力的方法中，DARPin、抗-EGFR DARPin、IgG形式的抗体、具有来自IgG的scFv-Fc的抗体和它们的连接形式如上所述。
另一个实施方案提供了编码如上所述双特异性嵌合蛋白的核酸。所述核酸可提供在适当的载体中。因此，另一个实施方案提供了包含(携带)所述核酸的重组载体。术语“载体”可指用于表达宿主细胞中靶基因的工具，例如质粒载体、粘粒载体和病毒载体如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺联病毒载体。在重组载体中，核酸可有效地连接至启动子。术语“有效地连接(operatively linked)”是指感兴趣的核苷酸序列和表达调节元件(例如，启动子序列)之间的功能性连接，从而使得感兴趣的核苷酸序列的表达受控于调节元件。例如，当其“有效地连接至”调节元件时，能在调节元件的控制下转录和/或翻译感兴趣的核苷酸序列。通常可将重组载体构建为克隆载体或表达载体。对于重组表达载体，通常可使用用于表达植物、动物或微生物细胞中外来蛋白的载体。本领域中公知的各种方法可用于重组载体的构建。
另一个实施方案提供了包含(转染有)所述核酸的(重组的)细胞或包含所述核酸的重组载体。为了在宿主如原核细胞或真核细胞中使用，可适当构建重组载体。使用本领域中公知的方法，可将所述核酸或携带所述核酸的重组载体引入(掺入)宿主细胞中。当宿主细胞为原核细胞时，通过CaCl2或电穿孔法(electroporation)实现该转化。对于真核宿主细胞，可使用但不限于以下方法完成遗传引入(genetic introduction)：显微注射法(microinjection)、磷酸钙沉淀(precipitation)、电穿孔法、脂质体介导的转染或粒子轰击(particle bombardment)。为了选择转化的宿主细胞，根据本领域已知的方法，可采用归于选择标志物的表型。例如，当选择标志物为抗某一抗生素的基因时， 宿主细胞可在培养基中抗生素的存在下生长，从而选择感兴趣的转化体。
如上所述的双特异性嵌合蛋白可通过如下方法制备：在细胞中表达编码双特异性嵌合蛋白的核酸(例如，在允许核酸表达的条件下培养细胞)和任选地通过一般方法分离和/或纯化表达的双特异性嵌合蛋白。因此，另一个实施方案提供了制备如上所述双特异性嵌合蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达编码双特异性嵌合蛋白的核酸。
双特异性嵌合蛋白，例如包含抗-EGFR DARPin和抗-c-Met抗体的双特异性嵌合蛋白，与现有抗体，例如现有抗-c-Met抗体相比，可具有如下改善的效果：
1.建立IgG-DARPin形式的双特异性嵌合蛋白的平台，
2.一般性使用抗-EGFR DARPin，
3.通过新的MOA(作用机制)抑制EGFR活性
4.与现有抗-c-Met抗体、抗-HER2抗体或抗-EGFR拮抗剂相比的协同抗癌效果。
5.在对现有抗-c-Met抗体、抗-HER2抗体或抗-EGFR拮抗剂具有抗性的癌细胞上的抗癌效果。
6.IgG-DARPin形式的双特异性嵌合蛋白的呈递，与使用EGFR/MET或EGFR/HER2的抑制剂的组合疗法相比，其展现出优良的效果。
在下文中，将会通过实施例详细描述本发明。
下列实施例仅意在举例说明本发明而非意在限制本发明。
实施例
参照例1:抗c-Met抗体的构建
1.1.生产“AbF46”，一种针对c-Met的小鼠抗体
1.1.1.小鼠的免疫
为获得生成杂交瘤细胞系所需的免疫小鼠，5只4-6周龄的BALB/c小鼠(JapanSLC,Inc.)各自经腹膜内注射100μg人c-Met/Fc融合蛋白(R&D Systems)和1倍体积的完全弗氏佐剂的混合物。注射的两周后，对相同小鼠第二次腹膜内注射50μg人c-Met/Fc蛋白和1倍体积不完全弗氏佐剂的混合物。在第二次免疫的一周后，免疫应答被末次加强。三天后，从小鼠尾部 取血并将血清以1/1000稀释于PBS中并用于通过ELISA检查抗体对c-Met的效价。选择有足够抗体效价的小鼠用于细胞融合过程。
1.1.2.细胞融合和杂交瘤的生成
在细胞融合的三天前，BALB/c小鼠(Japan SLC,Inc.)经腹膜内注射50μg人c-Met/Fc融合蛋白和1倍体积PBS的混合物而免疫。将免疫小鼠麻醉，然后将脾脏从左侧身体切除。将脾脏过筛以分离脾细胞，然后将脾细胞悬浮于培养基(DMEM,GIBCO,Invitrogen)中。离心该细胞悬浮液以回收细胞层。将所获得的脾细胞(1x108细胞)与骨髓瘤细胞(Sp2/0)(1x108细胞)混合，然后自旋以得到细胞沉淀(pellet)。将该细胞沉淀缓慢地悬浮，用含45％聚乙二醇(PEG)(1mL)的DMEM在37℃处理1分钟，补加1mL DMEM。在10分钟内向这些细胞中添加10mL DMEM，然后在37℃水浴中温育5分钟。将细胞体积调整至50mL，然后离心。将所形成的细胞沉淀以密度为1～2×105细胞/mL再悬浮于选择培养基(HAT培养基)中，给96孔板的每个孔分配0.1mL细胞悬浮液，随后在37℃在CO2培养箱中温育，以建立杂交瘤细胞群。
1.1.3.选择产生针对c-Met蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞
用人c-Met/Fc融合蛋白和人Fc蛋白作为抗原，通过ELISA，从参照例1.1.2所建立的杂交瘤细胞群中筛选对c-Met显示特异性应答的杂交瘤细胞。
将人c-Met/Fc融合蛋白以50μL(2μg/mL)/孔的量接种于微量滴定板，使其附着于每个孔的表面。通过洗涤除去仍未结合的抗体。为了用于选择不结合c-Met但识别Fc的抗体，以相同的方式将人Fc蛋白附着于微滴板表面。
将参照例1.1.2所获得的杂交瘤细胞培养物以50μL的量添加至所述板的各孔中并培养1小时。使用足量的Tris缓冲盐水和吐温20(TBST)洗出仍未反应的细胞。将山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)添加至所述板并在室温培养1小时。使用足量的TBST洗涤所述板，随后将过氧化物酶与底物(OPD)反应。在ELISA读数器上测量450nm处的吸光度。
重复地选择出分泌特异性地并强烈地结合人c-Met但不结合人Fc的抗体的杂交瘤细胞系。在经重复选择获得的杂交瘤细胞系中，通过有限稀释最终分离出产生单克隆抗体的单个克隆。根据布达佩斯条约，所述产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单个克隆SAIT-MET-AbF46于2009年10月6日 保藏于韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line ResearchFoundation)，一家位于Yungun-Dong,Jongno-Gu,Seoul,Korea的国际保藏单位，保藏号为KCLRF-BP-00220(参考韩国专利公开(Laid-Open Publication)2011-0047698)。
1.1.4.单克隆抗体的产生和纯化
将参照例1.1.3中获得的杂交瘤细胞系培养于无血清培养基中，并从该细胞培养物中产生和纯化单克隆抗体(AbF46)。
首先，将于补充有10％(v/v)FBS的50ml培养基(DMEM)中培养的杂交瘤细胞离心，细胞沉淀用20ml PBS洗涤两次或更多次以从中除去FBS。然后将细胞再悬浮于50mL DMEM中，37℃在CO2培养箱中培养3天。
通过离心除去细胞后，上清液在4℃保存备用或者立即用于抗体的分离和纯化。使用配备有亲和柱(G蛋白琼脂糖柱；Pharmacia，USA)的AKTA system(GE Healthcare)从50-300mL上清液中纯化抗体，然后使用过滤器(Amicon)浓缩。将抗体的PBS溶液贮存好，以备下述实施例所用。
1.2.构建chAbF46，一种针对c-Met的嵌合抗体
小鼠抗体易于在人中激发免疫原性。为了解决该问题，用人IgG1抗体的氨基酸序列替换恒定区而不是对抗体特异性负责的可变区，从而从参照例1.1.4所产生的小鼠抗体AbF46构建嵌合抗体chAbF46。
为此，将基因设计成包括重链核苷酸序列“EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-TGA-XhoI”(SEQ ID NO:38)和轻链核苷酸序列“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI”(SEQID NO:39)，并合成。然后，具有重链核苷酸序列(SEQ ID NO:38)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:39)的DNA片段被EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，然后被分别克隆至OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，和克隆至pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中。
所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达系统(invitrogen)进行瞬时表达。293 F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106 细胞/ml时，进行瞬时表达。通过脂质体试剂法使用FreestyleTM MAX试剂(invitrogen)进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTM SFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTM SFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在结束转染后，将细胞在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下在130rpm培养箱中培养5天。
然后将细胞在37℃在5％CO2条件下在补充有10％(v/v)FBS的DMEM中培养5小时，然后在37℃在5％CO2条件下在无FBS的DMEM中培养48小时。
离心后，将上清液应用于AKTA prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样至配备有蛋白A柱的AKTA Prime(GE healthcare,17-0405-03)，随后用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)进行洗脱。将所述缓冲液与PBS交换，以纯化嵌合抗体AbF46(以下称为“chAbF46”)。
1.3.从嵌合抗体chAbF46构建人源化抗体huAbF46
1.3.1.重链的人源化
为设计两个域H1-重链和H3-重链，分析了与参照例1.2中纯化的小鼠抗体AbF46的VH基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。一项Ig BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/ igblast/)结果显示，VH3-71在氨基酸水平具有83％的同一性/同源性。小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Kabat编号法定义。设计将小鼠抗体AbF46的CDR引入VH3-71的框架中。于是，在位置30(S→T)、48(V→L)、73(D→N)和78(T→L)处进行了小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。然后，H1进一步在位置83(R→K)和84(A→T)处突变，以最终建立H1-重链(SEQ ID NO:40)和H3-重链(SEQ ID NO:41)。
为了设计H4-重链，通过BLAST搜索分析多个人抗体框架。结果显示，已知的最稳定的VH3亚型在框架和序列方面与小鼠抗体AbF45非常相似。小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Kabat编号法定义并被引入至VH3亚型以构建H4-重链(SEQ ID NO:42)。
1.3.2.轻链的人源化
为了设计两个域H1-轻链(SEQ ID NO:43)和H2-轻链(SEQ ID NO:44)，分析了与小鼠抗体AbF46的VH基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。Ig BLAST搜索结果显示，VK4-1在氨基酸水平具有75％的同一性/同源性。小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义。设计将小鼠抗体AbF46的CDR引入VK4-1的框架中。于是，在位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行了小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。仅在H2-轻链的位置49(Y→I)处进行一个回复突变。
为了设计H3-轻(SEQ ID NO:45)，通过BLAST搜索分析了多个与小鼠抗体AbF46的VL基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。结果，选择了VK2-40。发现小鼠抗体AbF46的VL与VK2-40在氨基酸水平具有61％的同一性/同源性。所述小鼠抗体的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义并被引入至VK2-40的框架中。在H3-轻的位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行回复突变。
为了用于设计H4-轻链(SEQ ID NO:46)，分析了多个人抗体框架。BLAST搜索显示，已知的最稳定的Vk1亚型在框架和序列方面与小鼠抗体AbF46非常相似。小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义并被引入至Vk1亚型中。于是，在H4-轻链的位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行回复突变。
此后，具有重链核苷酸序列(H1-重链:SEQ ID NO:47，H3-重链:SEQ ID NO:48，H4-重链:SEQ ID NO:49)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(H1-light:SEQ ID NO:50,H2-light:SEQ ID NO:51,H3-light:SEQ ID NO:52,H4-light:SEQ ID NO:53)的DNA片段经EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，然后被分别克隆至OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，和克隆至pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中，从而构建多个重组载体以表达人源化抗体。
所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达系统(invitrogen)进行瞬时表达。293 F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106 细胞/ml时，进行瞬时表达。通过脂质体试剂法使用FreestyleTM MAX试剂(invitrogen)进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTM SFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTM SFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在结束转染后，将细胞在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下在130rpm培养箱中培养5天。
离心后，将上清液应用于AKTA prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样至配备有蛋白A柱的AKTA Prime(GE healthcare,17-0405-03)，随后用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)进行洗脱。将所述缓冲液与PBS交换，以纯化人源化抗体AbF46(以下称为“huAbF46”)。以下实施例中所用的人源化抗体huAbF46包括H4-重链(SEQ ID NO:42)和H4-轻链(SEQ ID NO:46)的组合。
1.4.构建huAbF46抗体的scFV文库
为了用于从huAbF46抗体的重链和轻链可变区构建huAbF46抗体的scFV，将一个基因设计成对于每个重链和轻链可变区具有“VH-接头-VL”的结构，该接头具有氨基酸序列“GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS”(SEQ ID NO:54)。在Bioneer中合成编码所设计的huAbF46的scFV的多核苷酸序列(SEQ ID NO:55)并且该多核苷酸的表达载体具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列。
在表达后，发现产物对c-Met展现出特异性。
1.5.用于亲和力成熟的文库基因的构建
1.5.1.靶CDR的选择和引物的合成
在以下步骤中实现huAbF46的亲和力成熟。首先，6个互补决定区(CDR)根据Kabat编号法定义。在下表1中给出所述CDR。
表1
CDR 氨基酸序列
CDR-H1 DYYMS(SEQ ID NO:1)
CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:2)
CDR-H3 DNWFAY(SEQ ID NO:3)
CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:10)
CDR-L2 WASTRVS(SEQ ID NO:11)
CDR-L3 QQSYSAPLT(SEQ ID NO:12)
为了将随机序列引入抗体的CDR中，如下设计引物。常规地，使用N密码子以相同的比例(25％A,25％G,25％C,25％T)将碱基引入所需的突变位点。在本实验中，以如下方式将随机碱基引入至huAbF46的CDR中：在编码每个CDR的野生型多核苷酸中，对于每个密码子的三个核苷酸而言，第一和第二核苷酸在整个序列的85％中是保守的，而另外三个核苷酸以相同的百分数(各为5％)引入，并且向该第三个核苷酸赋予了相同的可能性(33％G、33％C、33％T)。
1.5.2.huAbF46抗体文库的构建和对c-Met的亲和力
使用以与参照例1.5.1相同的方式合成的引物通过引入随机序列进行抗体基因文库的构建。使用覆盖huAbF46 scFV的多核苷酸作为模板，获得两种PCR产物，对它们实施重叠延伸PCR，以得到huAbF46抗体(其中仅所需的CDR是突变的)的多个scFV文库基因。对于从所述scFV文库基因制备的6个CDR，构建靶向它们中的每一个的文库。
每个文库对c-Met的亲和力与野生型的亲和力相比较。与野生型相比，大多数文库对c-Met的亲和力较低。在一些突变体中对c-Met的亲和力得到保留。
1.6.从文库选择具有改善的亲和力的抗体
在对构建的文库进行了c-Met亲和力成熟后，分析来自每个克隆的scFv的核苷酸序列。如此获得的核苷酸序列汇总于表2，并且将其转化成IgG形式。在随后的实验中使用分别从克隆L3-1、L3-2、L3-3、和L3-5生成的4种抗体。
表2
克隆 构建的文库 CDR序列
H11-4 CDR-H1 PEYYMS(SEQ ID NO:22)
YC151 CDR-H1 PDYYMS(SEQ ID NO:23)
YC193 CDR-H1 SDYYMS(SEQ ID NO:24)
YC244 CDR-H2 RNNANGNT(SEQ ID NO:25)
YC321 CDR-H2 RNKVNGYT(SEQ ID NO:26)
YC354 CDR-H3 DNWLSY(SEQ ID NO:27)
YC374 CDR-H3 DNWLTY(SEQ ID NO:28)
L1-1 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:29)
L1-3 CDR-L1 KSSRSLLSSGNHKNYLA(SEQ ID NO:30)
L1-4 CDR-L1 KSSKSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:31)
L1-12 CDR-L1 KSSRSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:32)
L1-22 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:33)
L2-9 CDR-L2 WASKRVS(SEQ ID NO:34)
L2-12 CDR-L2 WGSTRVS(SEQ ID NO:35)
L2-16 CDR-L2 WGSTRVP(SEQ ID NO:36)
L3-1 CDR-L3 QQSYSRPYT(SEQ ID NO:13)
L3-2 CDR-L3 GQSYSRPLT(SEQ ID NO:14)
L3-3 CDR-L3 AQSYSHPFS(SEQ ID NO:15)
L3-5 CDR-L3 QQSYSRPFT(SEQ ID NO:16)
L3-32 CDR-L3 QQSYSKPFT(SEQ ID NO:37)
1.7.将选择的抗体转化成IgG
编码4种选择的抗体的重链的相应多核苷酸设计为具有“EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-XhoI”(SEQ ID NO:38)的结构。这些huAbF46抗体的重链照原样使用，因为它们的氨基酸在亲和力成熟期间没有变化。然而，在铰链区的情况中，采用U6-HC7铰链(SEQ IDNO:57)代替人IgG1的铰链。轻链基因设计为具有“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-XhoI”的结构。编码经过亲和力成熟而选出的4种抗体的轻链可变区多肽在Bioneer中合成。然而，将具有重链核苷酸序列的DNA片段(SEQ ID NO:38)和一组具有轻链核苷酸序列的DNA片段(包含L3-1衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:58的DNA片段，包含L3-2衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:59的DNA片段，包含L3-3衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:60的DNA片段，和包含L3-5衍生的CDR-L3：SEQID NO:61的DNA片段)用EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，之后分别克隆到OptiCHOTM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPOTA克隆试剂盒中，和克隆到pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中，从而构建用于表达亲和力成熟的抗体的重 组载体。
所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达系统(invitrogen)进行瞬时表达。293 F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106细胞/ml时，进行瞬时表达。使用FreestyleTM MAX试剂(invitrogen)通过脂质体试剂法进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTM SFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTM SFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下温育5天。
离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTAPrime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。用PBS更换缓冲液以纯化4种亲和力成熟的抗体(下文分别称为“huAbF46-H4-A1(L3-1起源)、huAbF46-H4-A2(L3-2起源)、huAbF46-H4-A3(L3-3起源)、和huAbF46-H4-A5(L3-5起源)”)。
1.8.构建取代了恒定区和/或取代了铰链区的huAbF46-H4-A1
在参照例1.7中选出的4种抗体中，发现huAbF46-H4-A1对c-Met的亲和力最高而Akt磷酸化和c-Met降解程度最低。在该抗体中，替换铰链区，或替换恒定区加铰链区。
抗体huAbF46-H4-A1(U6-HC7)由重链和轻链组成，所述重链包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链、和人IgG1恒定区的恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)由重链和轻链组成，所述重链包含重链可变区、人IgG2铰链区、和人IgG1恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)由huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG2恒定区及轻链组成，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻可变区和人kappa恒定区。因此，在所有三种抗体中将轻 链的人kappa恒定区上第36位的组氨酸残基改变成酪氨酸，以增加抗体生成。
为了用于构建三种抗体，在Bioneer合成多核苷酸(SEQ ID NO:63)、多核苷酸(SEQID NO:65)、多核苷酸(SEQ ID NO:67)、以及多核苷酸(SEQ ID NO:69)，其中，多核苷酸(SEQID NO:63)编码多肽(SEQ ID NO:62，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:65)编码多肽(SEQ ID NO:64，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:67)编码多肽(SEQID NO:66，其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG2恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:69)编码多肽(SEQ ID NO:68，其包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区(其中位置36处的组氨酸被酪氨酸替换)和人kappa恒定区)。然后，将具有重链核苷酸序列的那些DNA片段插入OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPOTA克隆试剂盒中，而将具有轻链核苷酸序列的那些DNA片段插入pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中，从而构建表达这些抗体的载体。
所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达系统(invitrogen)进行瞬时表达。293 F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106细胞/ml时，进行瞬时表达。使用FreestyleTM MAX试剂(invitrogen)通过脂质体试剂法进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTM SFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTM SFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下温育5天。
离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTAPrime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。用PBS更换缓冲液以最终纯化3种抗体(huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)、和huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))。在三种抗体中， 代表性选择huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)用于下列实施例，并且将其称为L3-1Y-IgG2。
实施例1：抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白1的制备
将4种抗EGFR DARPin的每一种(SEQ ID NO:109、110、111和112)融合至在参照例1中制备的L3-1Y-IgG2的C端，制得4种抗c-Met抗体/抗EGFR DARPin融合复合物(即抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体)(图3)。将L3-1Y-IgG2抗体的重链和抗EGFR DARPin经由具有10个氨基酸的肽接头(GGGGSGGGGS；(G4S)2)彼此连接，以产生“L3-1Y-IgG2重链-(G4S)2-抗EGFRDARPins”形式。
通过Biacore检查4种抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体对EGFR的结合亲和力(见下文实施例2)，以选出对EGFR具有最高亲和力的抗体(R&D systems)。所选的双特异性嵌合蛋白称为ME-19(包含E01 DARPin(SEQ ID NO:109))。
实施例2：检查抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的特性和EGFR亲和力
为了检查在实施例1中制备的双特异性嵌合蛋白ME-19(抗c-Met/抗EGFR双特异性嵌合蛋白)的特性，将20ug的所述双特异性嵌合蛋白以0.5ml/min的速度注射到装备有TSKG3000SWXL柱(Tosho)的HPLC系统(WATERS 2695)中，以进行大小排阻层析。
获得的结果显示于图4。在图4中，“1”指可溶性二聚体的峰的量化值，而“2”指单体峰的量化值。如图4中显示的，所选的双特异性嵌合蛋白ME-19形成少量的可溶性二聚体(<10％)，这证明该双特异性嵌合蛋白是非常稳定的分子。
使用Biacore T100(GE)检查双特异性嵌合蛋白ME-19对两种抗原c-Met和EGFR的每一种的结合亲和力。将人Fab结合剂(GE Healthcare)依照制造商手册固定于CM5芯片(#BR-1005-30,GE)的表面上。捕获约90～120 RU双特异性嵌合蛋白ME-19，给捕获的双特异性嵌合蛋白添加多种浓度的EGFR-Fc(#344-ER,R&D Systems)。向其添加10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)溶液以使表面再生。为了测定亲和力，将获得的数据用BIAevaluation软件(GEHealthcare，Biacore T100评估软件)拟合。
获得的结果显示于表3。
【表3】
抗体 抗原 K<sub>D</sub>(nM) K<sub>a</sub>(1/Ms) K<sub>d</sub>(1/s)
ME19 EGFR 0.35 1.8×10<sup>5</sup> 6.4×10<sup>-5</sup>
如表3中显示的，实施例1中制备的双特异性嵌合蛋白ME-19展现出对EGFR的非常高的亲和力，经Biacore测量为KD＝0.35nM。
实施例3：抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的EGF竞争测试
为了确认实施例1中制备的双特异性嵌合蛋白ME-19是否与EGF竞争，使用ELISA进行竞争测定法。将96孔免疫板(Nunc)用0.25μg/孔的EGFR(#344-ER,R&D Systems)包被。然后，将20 ng/ml生物素化的EGF(invitrogen)和系列稀释的ME-19混合，并将混合物接种于板上，在室温反应2小时。将所得反应产物用含有0.05％(w/v)Tween 20的PBS清洗。向每个孔添加偶联了HRP(辣根过氧化物酶)的抗链霉亲合素抗体(#21140,Thermo scientific)并在室温反应1小时。在如上文清洗后，向每个孔添加TMB底物(eBioscience)以诱导显色反应，然后测量在405nm的吸光度。为了比较，用Erbitux(爱必妥，Merck)而非双特异性嵌合蛋白ME-19进行与上文相同的检查。
获得的结果显示于图5。如图5中显示的，双特异性嵌合蛋白ME-19与EGF竞争。相比于已存在的抗EGFR抗体Erbitux(爱必妥)，ME-19相对较弱地阻止EGF与EGFR结合。
实施例4：检查抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的EGFR磷酸化抑制
为了检查实施例1中制备的双特异性嵌合蛋白ME-19的EGFR磷酸化抑制效果，使用低水平表达c-Met的人表皮状癌A431细胞系进行磷酸-EGFR测试。将A431细胞(ATCC)以2x104细胞/孔的量接种于96孔细胞培养板上，并在补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素的RPMI1640培养基(#11875-093,Gibco)中在5％CO2和37℃的条件下温育24小时。在从获得的细胞培养物除去培养基后，向细胞培养物添加无血清培养基(#30-2002,ATCC)，将细胞培养物再培养18小时。将培养的细胞用5μg/ml双特异性嵌合蛋白 ME-19处理并再培养30分钟，然后用200ng/ml EGF(R&D systems)处理并再培养30分钟。在将培养的细胞裂解后，通过使用磷酸-EGFR检测试剂盒(Cell signaling)测量在405nm的吸光度来测定EGFR磷酸化的程度。为了比较，用Erbitux(爱必妥，#ET509081213,Merck)(阳性对照)而非双特异性嵌合蛋白ME-19进行与上文相同的检查。
获得的结果显示于图6。在图6中，“培养基”指没有用抗体处理的情况。如图6中显示的，在低水平表达c-Met的A431细胞中，ME-19甚至比仅用天然EGF处理的情况(培养基)更多地增加EGFR磷酸化。这些结果表明，EGFR信号途径在A431细胞中被ME-19引起的EGFR超磷酸化(hyper phosphorylation)所扰动(pertubed)。
实施例5：检查抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的细胞增殖抑制
为了检查实施例1中制备的双特异性嵌合蛋白ME-19的癌细胞增殖抑制效果，在SNU5细胞系(KCLB No.00005)、MKN45细胞系(KCLB No.80103)、H1993细胞系(ATCC CRL-5909)和A431细胞系(ATCC)中测试细胞增殖程度。
将所有细胞在补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素的RPMI1640培养基(#11875-093,Gibco)中在5％CO2和37℃的条件下培养。为了进行细胞增殖测定法，每种细胞系在96孔板中以1×104细胞/孔的浓度进行再培养，用5ug(微克)/ml量的实施例1中制备的抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白ME-19处理，并再培养72小时。将未用抗体处理的组用作阴性对照。将用商业可获的EGFR抑制剂Erlotinib(厄洛替尼，表示为“Er”；#S1023,Selleckchem；2uM(微摩尔))、Erbitux(爱必妥，表示为“Ebt”；#ET509081213,Merck；5μg/ml)、5μg/ml参照例1中制备的L3-1Y-IgG2抗体、或参照例1中制备的L3-1Y-IgG2抗体与Erbitux(爱必妥)的组合处理的组用作阳性对照。
培养后，通过Cell Counting Kit-8测定(Dojindo Molecular Technologies,Gaithersburg,MD)依照制造商手册测量细胞增殖。简言之，在培养72小时后，将10ul(微升)CCK8溶液添加到每个孔，并再培养2.5小时。然后，使用微板读数器测量在450 nm的吸光度。
获得的结果分别显示于图7(SNU5)、图8(MKN45)、图9(H1993)和图10(A431)。在图7和10中，“对照”指未用抗体处理的培养基，在图8和9中，Y 轴上的“细胞增殖指数”指通过CCK8测量的细胞增殖的值。如图7-9中显示的，在过表达c-Met的胃癌细胞系如SNU5和MKN45中，以及在过表达c-Met和EGFR两者的H1993细胞系中，ME-19相比于L3-1Y-IgG2、Erbitux(爱必妥)及其组合而言，显示出很好的抗癌效果(癌细胞增殖抑制效果)。另外，如图10中显示的，ME-19甚至在低水平表达c-Met的A431上也展现出相比于L3-1Y-IgG2而言很好的抗癌效果。
实施例6：抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白对c-Met和EGFR的内在化
以4X104细胞/孔的量提供胃癌细胞系MKN45(KCLB No.80103)。这些细胞用参照例1中制备的L3-1Y-IgG2、cetuximab(西妥昔单抗，#ET509081213,Merck)和实施例1中制备的ME-19单独或组合地以1μg/ml每孔的量处理(在组合处理时，每种处理量是1μg/ml)，并在37℃温育2小时。将温育的细胞用4％(v/v)甲醛处理15分钟以固定化于板上，然后用PBS清洗3次。然后，将所得细胞用封闭缓冲液(0.5％(v/v)triton x-100和5％(v/v)驴血清)处理1小时，之后在4℃用分别针对c-Met和EGFR的一抗(针对c-Met的一抗；#FAB3582A,R&Dsystems，针对EGFR的一抗；#5616,Cell signaling)以100ul(微升)(1:100稀释)的量处理15小时。将所得物用PBS清洗3次，用二抗(#A21433,Invitrogen)以100ul(1:2000稀释)的量在室温处理1小时，并用PBS再清洗3次，从而制备有封固介质(#H-1200,Vector)的板。通过共聚焦显微镜(Zeiss,LSM710)观察制得的板中的细胞。
获得的结果显示于图11。如图11中显示的，当仅用L3-1Y-IgG2处理时，仅c-Met移动到细胞中(内在化)且EGFR仍然保留在细胞膜上，而当用ME-19处理时，c-Met和EGFR两者均移动到细胞中。
结论是，具有抗EGFR DARPin的抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白通过来自先前已有的抗EGFR或抗c-Met抗体的不同机制来抑制EGFR和c-Met功能。
实施例7：抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的靶受体表达降低
为了确认通过抗c-Met/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的降低的靶 受体c-Met和EGFR的表达，以2x103细胞/孔的量在96孔板中分别再培养人胃癌细胞系MKN45(KCLBNo.80103)和SNU638(ATCC)，分别用5μg/ml L3-1Y-IgG2、5μg/ml Erbitux(爱必妥)和5μg/ml ME19处理并温育24小时。将未用抗体处理的培养基用作阴性对照。温育后，将细胞用Complete Lysis-M(#04719956001,Roche)裂解，并收集细胞裂解物。用总cMet检测ELISA试剂盒(DYC358E,R&D systems)依照制造商手册测量c-Met的表达水平，且用总EGF受体ELISA试剂盒(#7297,Cell Signaling)测量EGFR的表达水平。
获得的结果显示于图12。L3-1Y-IgG2和ME19相比于阴性对照均降低c-Met的表达水平(见图12上部)。Erbitux对于EGFR的表达没有影响，而ME19大大降低EGFR的表达水平(见图12下部)以及c-Met的表达水平(见图12上部)。
实施例8：抗HER2/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的制备
将抗EGFR DARPins(SEQ ID NO:109)融合于Herceptin(赫塞汀，Roche)的C端来制备抗HER2抗体/抗EGFR DARPin融合复合物(即抗HER2/抗EGFR双特异性嵌合蛋白)(图13)。Herceptin(赫塞汀)抗体的重链和抗EGFR DARPin经由具有10个氨基酸的肽接头(GGGGSGGGGS；(G4S)2)彼此连接以产生'Herceptin重链-(G4S)2-抗EGFR DARPins'形式。
制得的抗HER2/抗EGFR双特异性嵌合蛋白称为“H2E-01”。
实施例9：检查抗HER2/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白的特性和EGFR亲和力
为了检查实施例8中制备的双特异性嵌合蛋白H2E-01(抗HER2/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白)的特性，将20ug所述双特异性嵌合蛋白以0.5ml/min的速度注射到装备有TSKG3000SWXL柱(Tosho)的HPLC系统(WATERS 2695)中，进行大小排阻层析。
获得的结果显示于图14。在图14中，“1”指可溶性二聚体的峰的量化值，而“2”指单体峰的量化值。如图14中显示的，与实施例1中制备的ME-19类似，抗HER2/抗EGFR DARPin双特异性抗体H2E-01形成非常少量的可溶性二聚体(<10％)，这证明该双特异性嵌合蛋白是非常稳定的分子。
使用Biacore T100(GE)检查双特异性嵌合蛋白H2E-01对两种抗原HER2和EGFR的每一种的结合亲和力。将人Fab结合剂(GE Healthcare)依照制造商 手册固定化于CM5芯片(#BR-1005-30,GE)的表面上。捕获约90～120 RU双特异性嵌合蛋白H2E-01，给捕获的双特异性嵌合蛋白添加多种浓度的EGFR-Fc(#344-ER,R&D Systems)。向其添加10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)溶液以使表面再生。为了测定亲和力，将获得的数据用BIAevaluation软件(GEHealthcare，Biacore T100评估软件)拟合。
获得的结果显示于表4。
【表4】
Figure BDA0000544752490000411
如表4中显示的，实施例8中制备的双特异性嵌合蛋白H2E-01展现出对EGFR和HER2的非常高的亲和力，经Biacore测量分别为KD＝0.03nM和<0.01nM。
实施例10：检查抗HER2/抗EGFR双特异性嵌合蛋白的细胞增殖抑制
为了检查实施例8中制备的双特异性嵌合蛋白H2E-01的癌细胞增殖抑制效果，在MKN45细胞系(KCLB No.80103)中测试细胞增殖程度。
将MKN45细胞在补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素的RPMI1640培养基(#11875-093,Gibco)中在5％CO2和37℃的条件下培养。为了进行细胞增殖测定，将细胞在96孔板中以1×104细胞/孔的浓度进行再培养，用5ug/ml量的实施例8中制备的抗HER2/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白H2E-01处理，并再培养72小时。将未用抗体处理的组用作阴性对照。将用商业可获的EGFR抑制剂Erbitux(爱必妥，#ET509081213,Merck；5μg/ml)、HER2抑制剂Herceptin(赫塞汀)(Trastuzumab(曲妥珠单抗),Roche；5μg/ml)、或其组合处理的组用作阳性对照。
培养后，通过Cell Counting Kit-8测定(Dojindo Molecular Technologies,Gaithersburg,MD)依照制造商手册测量细胞增殖。简言之，在培养72小时后，将10ul CCK8溶液添加到每个孔，并再培养2.5小时。然后，使用微板读数器测量在450nm的吸光度。
获得的结果显示于图15。如图15中显示的，抗HER2/抗EGFR DARPin双 特异性嵌合蛋白H2E-01相比于Herceptin(赫塞汀)、Erbitux(爱必妥)及其组合在胃癌细胞如MKN45上展现出很好的抗癌效果。
实施例11：抗HER2/抗EGFR双特异性嵌合蛋白对HER2和EGFR的内在化
以4X104细胞/孔的量提供胃癌细胞系MKN45(KCLB No.80103)。对于细胞，用Trastuzumab(曲妥珠单抗)(Herceptin(赫塞汀),Roche)、Cetuximab(西妥昔单抗)(Erbitux(爱必妥),#ET509081213,Merck)、和实施例8中制备的H2E-01，单独或组合地，以1μg/ml每孔的量处理(在组合处理时，每种处理量是1μg/ml)，并在37℃温育2小时。将温育的细胞用4％(v/v)甲醛处理15分钟以固定化于板上，然后用PBS清洗3次。然后，将所得细胞用封闭缓冲液(0.5％(v/v)triton x-100和5％(v/v)驴血清)在室温处理1小时，之后在4℃用分别针对HER2和EGFR的一抗(针对HER2的一抗；#280003Z,Invitrogen，针对EGFR的一抗；#5616,Cell signaling)以100ul(1:100稀释)的量处理15小时。将所得物用PBS清洗3次，用二抗(#A21433,Invitrogen)以100ul(1:2000稀释)的量在室温处理1小时，并用PBS再清洗3次，从而制备有封固介质(#H-1200,Vector)的板。通过共聚焦显微镜(Zeiss,LSM710)观察制备的板中的细胞。
获得的结果显示于图16。如图16中显示的，当用Herceptin和Erbitux组合处理时，EGFR和HER2仍然保留在细胞膜上，而当用H2E-01处理时，HER2和EGFR两者均移动到细胞中。
结论是，具有抗EGFR DARPin的抗HER2/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白通过来自先前已有的抗EGFR或抗HER2抗体的不同机制来抑制EGFR和HER2功能。
实施例12：抗EGFR/HER3抗体/抗EGFR DARPin融合复合物的制备
将抗EGFR DARPins(SEQ ID NO:109)融合于抗HER3抗体RG-7597的C端来制备抗HER3抗体/抗EGFR DARPin融合复合物(即抗HER3/抗EGFR双特异性嵌合蛋白)(图17)。RG-7597抗体的重链和抗EGFR DARPin经由具有10个氨基酸的肽接头(GGGGSGGGGS；(G4S)2)彼此连接以产生'RG-7597重链-(G4S)2-抗EGFR DARPins'形式。抗HER3抗体RG-7597使用SEQ IDNO:117的重链可变区、SEQ ID NO:118的轻链可变区和IgG1 Fc区制备。
<抗EGFR/HER3抗体RG-7597的重链可变区的氨基酸序列>(SEQ ID NO:117)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSGDWIHWVRQAPGKGLEWVGEISAAGGYTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRVSFEAAMDYWGQGTLVTVSS
<抗EGFR/HER3抗体RG-7597的轻链可变区的氨基酸序列>(SEQ ID NO:118)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIATDVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSEPEPYTFGQGTKVEIK
制备的抗EGFR/HER3抗体/抗EGFR DARPin融合复合物称为“EH3E-01”。
为了检查如上文制备的双特异性嵌合蛋白EH3E-01(抗HER3/抗EGFR DARPin双特异性嵌合蛋白)的特性，将20ug的所述双特异性嵌合蛋白以0.5ml/min的速度注射到装备有TSKG3000SWXL柱(Tosho)的HPLC系统(WATERS 2695)中，以进行大小排阻层析。
获得的结果显示于图18。在图18中，“1”指可溶性二聚体的峰的量化值，而“2”指单体峰的量化值。如图18中显示的，与实施例1中制备的ME-19类似，抗HER3/抗EGFR DARPin双特异性抗体EH3E-01形成非常少量的可溶性二聚体(<10％)，这证明该双特异性嵌合蛋白是非常稳定的分子。
实施例13：抗c-Met/抗EGFR DARPins双特异性嵌合蛋白2的制备
将两个抗EGFR DARPin(DARPin-01(SEQ ID NO:109)和DARPin-69(SEQ ID NO:112))融合于参照例1中制备的L3-1Y-IgG2的C端来制备抗c-Met抗体/抗EGFR DARPin融合复合物(即抗c-Met/抗EGFR双特异性抗体)，其中两个抗-EGFR DARPin串联连接至IgG形式的二聚体抗c-Met抗体的每个C端(图19)。L3-1Y-IgG2抗体的重链和抗EGFR DARPin-01经由具有10个氨基酸的肽接头(GGGGSGGGGS；(G4S)2)彼此连接，且抗EGFR DARPin-01和抗EGFRDARPin-69也经由具有10个氨基酸的肽接头(GGGGSGGGGS；(G4S)2)彼此连接，以产生'L3-1Y-IgG2重链-(G4S)2-抗EGFR DARPin-01-(G4S)2-抗EGFR DARPin-69’形式。
制得的抗c-Met/抗EGFR双特异性嵌合蛋白称为“ME-28”。
为了检查制备的抗c-Met/抗EGFR双特异性嵌合蛋白ME-28的特性，将20ug的所述双特异性嵌合蛋白以0.5ml/min的速度注射到装备有TSKG3000SWXL柱(Tosho)的HPLC系统(WATERS 2695)中，以进行大小排阻层析。
获得的结果显示于图20。在图20中，“1”指可溶性二聚体的峰的量化值，而“2”指单体峰的量化值(“3”和“4”推测为指各种降解的双特异性抗体片段)。如图20中显示的，相比于ME-19，双特异性嵌合蛋白ME-28形成相对增加量的可溶性二聚体或聚合物(>5)。
使用Biacore T100(GE)检查双特异性嵌合蛋白ME-28对EGFR的结合亲和力。将人Fab结合剂(GE Healthcare)依照制造商手册固定于CM5芯片(#BR-1005-30,GE)的表面上。捕获约90～120 RU的双特异性嵌合蛋白ME-28，并将多种浓度的EGFR-Fc(#344-ER,R&DSystems)添加到捕获的双特异性嵌合蛋白。向其添加10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)溶液以使表面再生。为了测定亲和力，将获得的数据用BIAevaluation软件(GE Healthcare，BiacoreT100评估软件)拟合。
获得的结果显示于表5。
【表5】
样品 抗原 K<sub>D</sub>(nM) K<sub>a</sub>(1/Ms) K<sub>d</sub>(1/s)
ME28 EGFR <0.01 1.1×10<sup>5</sup> &lt;3.4×10<sup>-5</sup>
如表5中显示的，双特异性嵌合蛋白ME-28展现出对EGFR的非常高的亲和力，经Biacore测量为KD<0.01nM。
本文中引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利均通过提述并入本文，其程度如同每个参考文献均分别且特定地指示为通过提述纳入且在本文中完整列出的。
除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，术语“一个/一种”和“该”和“至少一个/一种”及类似指代物在描述本发明的背景中(尤其在所附权利要求的背景中)的使用应理解为涵盖单数和复数。除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，术语“至少一个/一种”后接一项或多项的列的使用(例 如“至少一个/一种的A和B”或“A和B的至少一个/一种”)应理解为意指选自所列项的一项(A或B)，或两项或更多所列项的任意组合(A和B)。除非另外记载，术语“包含/包括”、“具有”和“含有”应理解为开放端术语(即意指“包括但不限于”)。除非另外指示，本文中值的范围的记载仅意图作为分别提述落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独的值均纳入说明书中，如其在本文中分别记载的。除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，本文中描述的所有方法可以任何适宜的次序进行。除非另外主张，本文中提供的任何和所有例子或例示性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地说明本发明，而不对本发明的范围施加限制。说明书的任何语言均不应理解为指示任何未主张的要素为对本发明实践必要的。
在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明最佳的模式。在阅读前述说明后，那些优选实施方案的变体对于本领域普通技术人员可能是明显的。发明人预期熟练的技术人员如适宜地采用这类变体，且发明人意图本发明以本文中具体描述的以外的方式实践。因此，本发明包括所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物，如适用法律所允许的。而且，除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，上述要素在其所有可能变体中的任意组合均涵盖在本发明中。
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Claims (9)

1.一种双特异性嵌合蛋白，包含：
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，和
与DARPin连接的IgG抗体、scFv-Fc抗体片段、或其组合，其中所述DARPin是抗EGFRDARPin，所述与DARPin连接的IgG抗体、scFv-Fc抗体片段、或其组合是与DARPin连接的抗c-Met IgG抗体、抗c-Met scFv-Fc抗体片段、或其组合，
并且其中所述抗c-Met抗体或抗体片段包含：
由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成的CDR-H1；
由SEQ ID NO:2的氨基酸序列构成的CDR-H2；
由SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成的CDR-H3；以及
由SEQ ID NO:10的氨基酸序列构成的CDR-L1；
由SEQ ID NO:11的氨基酸序列构成的CDR-L2；以及
由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16的氨基酸序列构成的CDR-L3；
并且其中所述抗EGFR DARPin包含SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、或SEQ ID NO:112的一种或多种。
2.依照权利要求1的双特异性嵌合蛋白，其中所述抗c-Met抗体或抗体片段包含：
重链，包含以下：SEQ ID NO:62的氨基酸序列，从SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列，SEQ ID NO:64的氨基酸序列，从SEQ ID NO:64的第18位至第461位的氨基酸序列，SEQ ID NO:66的氨基酸序列，或从SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列；和
轻链，包含以下：SEQ ID NO:68的氨基酸序列，从SEQ ID NO:68的第21位至第240位的氨基酸序列，SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或从SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨基酸序列。
3.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1或2中的双特异性嵌合蛋白。
4.一种制备权利要求1或2的双特异性嵌合蛋白的方法，包括：
将i)所述抗EGFR DARPin和ii)所述抗c-Met IgG抗体、抗c-Met scFv-Fc抗体片段、或其组合连接；或
在细胞中表达编码所述双特异性嵌合蛋白的核酸。
5.权利要求4的方法，其中所述双特异性嵌合蛋白的抗癌功效相比于没有所述抗EGFRDARPin与其连接的所述抗c-Met抗体或抗体片段增强。
6.编码权利要求1或2的双特异性嵌合蛋白的核酸。
7.包含权利要求6的核酸的细胞。
8.权利要求1的双特异性嵌合蛋白，其中所述抗EGFR DARPin包含SEQ ID NO:109、SEQID NO:110、SEQ ID NO:111、或SEQ ID NO:112的一种或多种，其中任意一种重复2至10次。
9.在载体中编码权利要求1或2的双特异性嵌合蛋白的核酸。
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