BR112015027400B1 - Anticorpo capaz de se ligar especificamente ao her2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composições farmacêuticas e kit que compreendem os mesmos, bem como uso dos mesmos para prevenir ou tratar um câncer e/ou induzir apoptose - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS CAPAZES DE SE LIGAR ESPECIFICAMENTE AO HER2. A presente invenção se refere a anticorpos ao HER2 (Receptor 2 de Fator de Crescimento Epidérmico Humano) para prevenir ou tratar cânceres. Os anticorpos da presente invenção se ligam especificamente ao HER2 superexpresso em células cancerosas (em particular, células de câncer de mama e câncer de estômago), especificamente a um epítopo sobre HER2 que é diferente do epítopo para o trastuzumabe. As sequências de CDR dos presentes anticorpos exibem baixa similaridade com sequências de CDR de anticorpos HER2 conhecidos publicamente, significando que as sequências de CDR são únicas. Os anticorpos da presente invenção, em combinação com o trastuzumabe, matam as células cancerosas com citotoxicidade significativamente aprimorada e, portanto, são muito eficazes em terapia de câncer (particularmente, câncer de mama e câncer de estômago). Sem pretender ficar limitado pela teoria, as eficácias aprimoradas da terapia combinada significam que os anticorpos da presente invenção se ligam a um epítopo sobre HER2 que é diferente do epítopo para o trastuzumabe e inibem o HER2 de um modo cooperativo com o trastuzumabe.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção foi feita com apoio do Korea Institute for the Ad-vancement of Technology sob a Garantia 1415118385 de 01 de Novembro de 2011 a 1 de Outubro de 2014, com a gestão da International Cooperation Support Team of KIAT, intitulada como International Cooperation Technology Development Works and Innovative Epitope Discovery Platform Technology-Based Global Antibody New Drug Development, realizada pela AbClon, Inc.

[002]O presente Pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Coreana N° 10-2013-0055912, depositado em 16 de Maio de 2013, no Korean Intellectual Property Office, a descrição do qual é aqui incorporada por referência.

[003]A presente invenção se refere a anticorpos ao HER2 (Receptor 2 de Fator de Crescimento Epidérmico Humano) para prevenir ou tratar doenças relacio-nadas ao HER2, em particular, cânceres.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[004]O gene de HER2/neu(ErbB2) codifica uma glicoproteína transmembra- na de 185 kDa a qual é um dos membros da família EGFR (Receptores de Fator de Crescimento Epidérmico). A proteína HER2 consiste em um domínio extracelular com 620 resíduos de aminoácidos, um domínio transmembrana de 23 resíduos de aminoácidos e um domínio intracelular tendo atividade de quinase de tirosina tendo com 490 resíduos de aminoácidos (Akiyama T., et al., Science, 232(4758): 1644-1646(1986)).

[005]Além disso, anticorpos HER2 com várias características são reportados em uma série de trabalhos: Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res. 51: 53615369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52: 25802589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); documento WO94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Research. 51: 4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992); Patente dos Estados Unidos No 5.783.186; Kao et al., Publicação dos Estados Unidos N° 2009/0285837 (2009); Ross et al., The Oncologist 8: 307-325 (2003) e Klapper et al., Oncogene 14: 2099-2109 (1997).

[006]Dentre os anticorpos ao HER2, o trastuzumabe, como o anticorpo de maior sucesso comercial (comercializado como HerceptinTM, Patente dos Estados Unidos No 5.821.337) tem sido intensivamente estudado: Sapino, A. et al., Annals of Oncology (2007) 18: 1963-1968; Bussolati, G. et al., British Journal of Cancer (2005) 92, 1261-1267; Glazyrin, A. et al., J Histology & Cytochemistry (2007) 55(1): 25-33.

[007]Embora o trastuzumabe tenha sido bem sucedido comercialmente, é provável que este anticorpo mostre eficácia terapêutica em apenas 15% dos pacien-tes com câncer de mama que superexpressam o HER2. Portanto, tem havido tenta-tivas de melhorar o prognóstico dos pacientes com câncer que não são responsivos ou pouco responsivos ao trastuzumabe por meio de uma terapia combinada, no con-texto de extensão de reforço ou espectro de eficácias do trastuzumabe.

[008]Por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No 2011-0086004 descreve uma terapia combinada para o câncer com trastuzumabe e IL-21. A Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No 2012-0107270 descreve o trastuzumabe em combinação com um anticorpo que objetiva a tenasci- na-C conjugado com IL-2.

[009]A Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No 20050101618 descreve uma terapia para o câncer com trastuzumabe e ligante erbB2. A Publicação de Pedido de Patente Europeia No 2134364 descreve a inibição de proliferação de células cancerosas pelo trastuzumabe em combinação com inibidores de telomerase. O documento WO 2008/031531 descreve que o trastuzumabe em combinação com pertuzumabe pode suprimir a metástase de câncer.

[010]Ao longo do presente Pedido, várias publicações e patentes são citadas e as citações são fornecidas entre parênteses. A descrição destas patentes e publi-cações são aqui incorporadas por referência na íntegra ao presente Pedido de modo a descrever mais completamente a presente invenção e o estado da técnica à qual a presente invenção pertence.

PROBLEMAS TECNOLÓGICOS A SEREM RESOLVIDOS

[011]Os presentes inventores fizeram pesquisas intensivas para desenvolver anticorpos capazes de prevenir ou tratar doenças relacionadas ao HER2, particular-mente cânceres (mais particularmente câncer de mama e câncer de estômago). Em particular, os presentes inventores fizeram pesquisas intensivas para desenvolver anticorpos em combinação com trastuzumabe capazes de superar as limitações em eficácias anticâncer associadas ao tratamento com o trastuzumabe como um agente único. Como um resultado, os presentes inventores desenvolveram novos anticorpos que têm eficácias anticâncer significativas per se e eficácias muito mais elevadas em associação com o trastuzumabe para a prevenção ou tratamento de cânceres (particularmente câncer de mama e câncer de estômago e, mais particularmente, câncer de mama e câncer de estômago que expressam HER2).

[012]Consequentemente, é um objetivo da presente invenção proporcionar um anticorpo ao receptor 2 de fator de crescimento epidérmico humano (HER2) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[013]É outro objetivo da presente invenção proporcionar uma molécula de ácido nucleico que codifica o presente anticorpo ao HER2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[014]É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar um vetor re- combinante contendo a molécula de ácido nucleico.

[015]É outro objetivo da presente invenção proporcionar uma célula hospe-deira transfectada com o vetor recombinante.

[016]É um outro objetivo da presente invenção proporcionar uma composi-ção farmacêutica para a prevenção ou tratamento de um câncer.

[017]É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar uma compo-sição farmacêutica para indução de apoptose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

[018]Em um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um anticorpo ao receptor 2 de fator de crescimento epidérmico humano (HER2) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo: (a)uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região de-terminante de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR) H1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 representado pela fórmula 1 a seguir; e (b)uma região variável de cadeia leve: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Phe-Asp-Tyr (1) X1 representa His, Asn, Ser ou Ala; X2 representa Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn, Ile ou Ala; X3 representa Gly ou Cys; X4 representa Gly ou Ser; X5 representa Thr, Met ou Ala; X6 representa Ala, Ser, Gly ou Thr; e X7 representa Ser, Ala, Cys ou Thr.

[019]Os presentes inventores fizeram pesquisas intensivas para desenvolver anticorpos capazes de prevenir ou tratar doenças relacionadas ao HER2, particular-mente cânceres (mais particularmente câncer de mama e câncer de estômago). Em particular, os presentes inventores fizeram pesquisas intensivas para desenvolver anticorpos em combinação com o trastuzumabe capazes de superar as limitações nas eficácias anticâncer associadas ao tratamento com trastuzumabe como um agente único. Como um resultado, os presentes inventores desenvolveram novos anticorpos que têm eficácias anticâncer significativas per se e eficácias muito mais elevadas em associação com o trastuzumabe para a prevenção ou tratamento de cânceres (particularmente câncer de mama e câncer de estômago e, mais particu-larmente, câncer de mama e câncer de estômago que expressam HER2).

[020]O anticorpo da presente invenção tem uma capacidade de ligação es-pecífica ao HER2. Em particular, o presente anticorpo se liga a um epítopo sobre HER2 diferente de um epítopo ao qual o trastuzumabe está ligado.

[021]O termo "trastuzumabe" usado aqui se refere a um anticorpo descrito na Patente dos Estados Unidos No 5.821.337.

[022]O anticorpo da presente invenção exibe efeitos de citotoxicidade ou efeitos de inibição de proliferação contra várias células cancerosas que expressam HER2. Não há nenhuma distinção pretendida entre os termos "citotoxicidade" e "inibição de proliferação" em relação a células cancerosas e estes termos são usados alternadamente aqui.

[023]O termo "anticorpo" usado aqui se refere a anticorpos específicos ao HER2, incluindo um anticorpo inteiro, bem como qualquer fragmento de ligação ao antígeno de anticorpos.

[024]O anticorpo inteiro inclui duas cadeias leves de comprimento completo e duas cadeias pesadas de comprimento completo e cada cadeia leve está ligada à cadeia pesada através de uma ligação de dissulfureto. A região constante de cadeia pesada inclui cinco isotipos diferentes (y, μ, α, δ e ε) os quais são classificados em subgrupos de y1, Y2, Y3, Y4, α1 e α2. A região constante de cadeia leve inclui dois isotipos diferentes (K e À) (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Capítulo 45, páginas 41-50, W. B. Saunders Co. Filadélfia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2a Ed., Capítulo 4, páginas 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

[025]Fragmento de ligação ao antígeno se refere a qualquer fragmento de anticorpo capaz de ligação a um antígeno, incluindo Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv e assim por diante. Fab tem um sítio de ligação ao antígeno que é composto de domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo, um domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Fab' é diferente do Fab no sentido de que há uma região de dobradiça que contém um ou mais resí-duos de cisteína na posição C-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada. O anti-corpo F(ab')2 é produzido através da formação de uma ligação de dissulfureto entre os resíduos de cisteína da região de dobradiça do Fab'. Fv é um fragmento de anti-corpo mínimo composto de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve e uma técnica recombinante para preparar um fragmento Fv é descrita nos documentos PCT WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 e WO 88/09344. Em Fvs com duas cadeias, as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve estão ligadas por uma ligação não covalente e, em Fvs com uma única cadeia, as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve são, em geral, ligadas por uma ligação covalente através de um ligante peptídico ou diretamente ligadas uma à ou-tra na posição C-terminal, formando um dímero, tal como Fv com duas cadeias. Tais fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando enzimas proteolíticas (por exemplo, um anticorpo inteiro é digerido com papaína para produzir fragmentos Fab e tratamento com pepsina resulta na produção de fragmentos F(ab')2) e podem ser preparados por meio de técnicas de recombinação genética.

[026]De acordo com uma modalidade, o anticorpo da presente invenção in-clui anticorpos Fab e anticorpos inteiros. Além disso, a região constante de cadeia pesada é selecionada de isotipos que consistem em Y, μ, α, δ ou ε. De preferência, a região constante de cadeia pesada inclui os isotipos y1, Y3 e Y4, mais preferivelmen-te o isotipo Y1. A região constante de cadeia leve pode ser de isotipo K e À, de prefe-rência de isotipo K. Portanto, uma modalidade preferível do presente anticorpo é Fab ou anticorpo de IgG1 compreendendo a cadeia leve k e a cadeia pesada Y1.

[027]O termo "cadeia pesada" usado aqui se refere tanto uma cadeia pesada de comprimento total quanto à sua porção, a qual inclui um domínio variável (VH) que contém a sequência de aminoácidos de uma sequência de região variável para ligação especificamente ao antígeno e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). O termo "cadeia leve" usado aqui se refere tanto a uma cadeia leve de comprimento total quanto à sua porção, a qual inclui um domínio variável (VL) que contém a se-quência de aminoácidos de uma sequência de região variável para ligação especifi-camente ao antígeno e um domínio constante (CL).

[028]O termo "CDR (região determinante de complementaridade)" usado aqui se refere a uma sequência de aminoácidos de regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Na-tional Institutes of Health (1987)). Cada uma das cadeias pesada e leve compreende três CDRs de cadeia pesada ((CDRH1, CDRH2 e CDRH3) e de cadeia leve (CDRL1, CDRL2 e CDRL3)). CDR fornece resíduos de contato com um papel fundamental na ligação do anticorpo a um antígeno ou epítopo.

[029]No presente anticorpo, CDRH3 é representada pela fórmula 1.

[030]Na fórmula 1, X1 representa His, Asn, Ser ou Ala; especificamente His, Asn ou Ser; mais especificamente His ou Asn; still mais especificamente His.

[031]Na fórmula 1, X2 representa Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn, Ile ou Ala; especificamente Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn ou Ile; mais especificamente Leu, Phe ou Tyr; still mais especificamente Leu. Na fórmula 1, X3 representa Gly ou Cys; especificamente Gly. Na fórmula 1, X4 representa Gly ou Ser; especificamente Gly. Na fórmula 1, X5 representa Thr, Met ou Ala; especificamente Thr. Na fórmula 1, X6 representa Ala, Ser, Gly ou Thr; especificamente Ala. Na fórmula 1, X7 representa Ser, Ala, Cys ou Thr; especificamente Ser.

[032]De acordo com uma modalidade, X1 representa His, Asn ou Ser; X2 re-presenta Leu, Phe ou Tyr; X3 representa Gly; X4 representa Gly; X5 representa Thr, Met ou Ala; X6 representa Ala, Ser, Gly ou Thr; e X7 representa Ser, Ala, Cys ou Thr.

[033]Mais especificamente, X1 representa His, Asn ou Ser; X2 representa Leu, Phe ou Tyr; X3 representa Gly; X4 representa Gly; X5 representa Thr; X6 representa Ala; e X7 representa Ser.

[034]Ainda mais especificamente, CDRH3 compreende a sequência de ami- noácidos selecionada do grupo de SEQ ID NOs:3, 27-28, 32 e 39-86; mais especifi-camente, CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs:3, 43, 64, 67, 71, 76, 83, 84 ou 85; ainda mais especificamente, SEQ ID NO: 3.

[035]De acordo com uma modalidade, a região variável de cadeia leve com-preende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 representada pela fórmula 2 a seguir: Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Pro-Trp-Thr (2) em que Y1 representa Gln, Asp ou Ala; Y2 representa Gln, Asn, Glu ou Ala; Y3 representa Leu, Met, Asn, Ile, Ser, Thr, Ala ou Lys; Y4 representa Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gly, Met ou Phe; Y5 representa Ser, Phe, Tyr, Arg, Ile, Gly, Lys, Asn, Val ou Ala; e Y6 representa Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly, Asn, Glu, Phe ou Leu.

[036]Na fórmula 2, Y1 representa Gln, Asp ou Ala; especificamente Gln ou Asp; mais especificamente Gln.

[037]Na fórmula 2, Y2 representa Gln, Asn, Glu ou Ala; especificamente Gln, Asn ou Glu; mais especificamente Gln.

[038]Na fórmula 2, Y3 representa Leu, Met, Asn, Ile, Ser, Thr, Ala ou Lys; es- pecificamente Leu, Met, Asn, Ile, Ser ou Thr; mais especificamente Leu, Met, Asn ou Ile; ainda mais especificamente Leu ou Met; ainda mais especificamente, Leu.

[039]Na fórmula 2, Y4 representa Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gly, Met ou Phe; especificamente Tyr ou Ala.

[040]Na fórmula 2, Y5 representa Ser, Phe, Tyr, Arg, Ile, Gly, Lys, Asn, Val ou Ala; especificamente Ser, Phe, Tyr, Arg ou Ile; mais especificamente Ser, Phe ou Tyr.

[041]Na fórmula 2, Y6 representa Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly, Asn, Glu, Phe ou Leu; especificamente Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly ou Asn; mais especificamente Thr, Ser ou Ala.

[042]De acordo com uma modalidade, Y1 representa Gln ou Asp; Y2 repre-senta Gln; Y3 representa Leu, Met, Asn, Ile, Ser ou Thr; Y4 representa Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gly, Met ou Phe; Y5 representa Ser, Phe, Tyr, Arg ou Ile; e Y6 representa Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly ou Asn.

[043]Mais especificamente, CDRL3 compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 6, 33-38 ou 87-245; mais especificamente, CDRL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs:6, 88, 109, 131, 155, 156, 157, 178, 218, 220, 222 ou 239; ainda mais especificamente, SEQ ID NOs: 6, 88 (hz1E11-3), 218 (hz1E11-133) ou 239 (hz1E11-154).

[044]De acordo com uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (1E11) ou 24 (hz1E11).

[045]De acordo com uma modalidade, a região variável de cadeia leve com-preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (1E11), 26 (hz1E11), 247 (hz1E11-3), 249 (hz1E11-133) ou 251 (hz1E11-154).

[046]Conforme demonstrado nos Exemplos, embora o anticorpo da presente invenção se ligue especificamente ao subdomínio 4 dentre os domínios extracelula- res de HER2, o presente anticorpo se liga a um epítopo sobre o subdomínio 4 que é diferente de um epítopo do trastuzumabe.

[047]O presente anticorpo ao HER2 ou fragmento de ligação ao antígeno in-clui variantes de sequências de aminoácidos apresentadas na Listagem de Sequên-cias anexa, contanto que elas sejam capazes de reconhecer especificamente o HER2. Por exemplo, as sequências de aminoácidos de anticorpos podem ser alteradas para melhorar a afinidade de ligação e/ou as outras características biológicas dos anticorpos. Por exemplo, tais alterações incluem exclusão, inserção e/ou substi-tuição de resíduos de aminoácidos de anticorpos.

[048]Tais variações de aminoácidos podem ser fornecidas com base em uma similaridade relativa das cadeias laterais de aminoácidos, por exemplo, hidrofo- bicidade, hidrofilicidade, carga e tamanho. Por meio de análise quanto ao tamanho, formato e tipo das cadeias laterais de aminoácidos, seria evidente que todos dos resíduos de arginina, lisina e histidina são aqueles que têm carga positiva; alanina, glicina e serina têm um tamanho similar; fenilalanina, triptofano e tirosina têm um formato similar. Consequentemente, com base nestes fatores consideráveis, argini- na, lisina e histidina; alanina, glicina e serina; e fenilalanina, triptofano e tirosina podem ser considerados equivalentes funcionais biologicamente.

[049]Para introdução de variações, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. Com base na hidrofobicidade e carga, um índice hidropático é fornecido a cada um dos aminoácidos: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); tre- onina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (3,9); e arginina (-4,5).

[050]Para conferir uma função biológica interativa de proteínas, o índice hi- dropático do aminoácido é muito importante. É bem sabido por aqueles versados na técnica que as variantes podem possuir uma atividade biológica similar apenas onde as proteínas são substituídas por aminoácidos tendo um índice hidropático similar. Onde variações são introduzidas com base no índice hidropático, a substituição é, de preferência, realizada entre resíduos de aminoácidos tendo não mais do que ± 2 diferença nos valores de índice hidropático, mais preferivelmente dentro de ± 1, ain-da mais preferivelmente dentro de ± 0,5.

[051]Será também óbvio para aqueles versados na técnica que outras subs-tituições de aminoácidos por outros aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade si-milares podem resultar na geração de variantes tendo atividade biológica equivalen-te. Conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No 4.554.101, são atribuídos a cada resíduo de aminoácido os seguintes valores de hidrofilicidade: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+ 3,0 ± 1); glutamato (+ 3,0 ± 1); serina (+0,3); aspa- ragina (0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); iso- leucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

[052]Onde se pretende introduzir variações com base no valor de hidrofilici- dade, a substituição é, de preferência, realizada entre resíduos de aminoácidos que tenham não mais do que ± 2 diferença nos valores de hidrofilicidade, mais preferi-velmente dentro de ± 1, ainda mais preferivelmente dentro de ± 0,5.

[053]A alteração de resíduos de aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade da proteína é bem conhecida por aqueles versados na técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Tal alteração de aminoá- cido inclui substituições de Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, mas não está limitada às mesmas.

[054]Considerando-se as variações anteriormente mencionadas tendo ativi-dades biologicamente equivalentes, poderia ser entendido que qualquer um dos an-ticorpos da presente invenção ou o ácido nucleico que codifica os mesmos inclui se- quências substancialmente idênticas às sequências apresentadas na Listagem de Sequências anexa. Sequências substancialmente idênticas se refere àquelas que mostram, de preferência, pelo menos 61%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% de similaridade de nucleotídeos com as sequências da Listagem de Sequências anexa, conforme medido usando um dos algoritmos de comparação de sequências convencionalmente usados. Métodos de alinhamento de sequências para compara-ção são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman e Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson e Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins e Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins e Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992); e Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) está disponível a partir de diversas fontes, incluindo o National Center for Biological Information (NBCI, Bethesda, Md.) e na Internet, para uso em conjunto com os programas de análise de sequência para blastp, blasm, blastx, tblastn e tblastx. Ele pode ser acessado em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ . Uma descrição sobre como determinar a identidade de sequência usando este pro-grama está disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BI-AST/blast help.html.

[055]O anticorpo da presente invenção inclui, porém sem limitações, anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, Fvs com uma única cadeia (scFv), anticorpos com uma única cadeia, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs ligados por dissulfu- reto (sdFv) e anticorpos anti-idiotipo (anti-Id) e um fragmento de ligação a epítopo dos mesmos.

[056]As sequências de CDR dos presentes anticorpos exibem baixa similari- dade com sequências de CDR de anticorpos conhecidos publicamente, significando que as sequências de CDR são únicas. Por exemplo, os anticorpos descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos 7.329.737 e 7.993.646, os quais têm a maior similaridade com os presentes anticorpos em pesquisa pelo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), mostram similaridade de menos de 50% às sequências de CDR do anticorpo 1E11, um anticorpo parental e, além disso, se ligam ao hK-1, sendo diferente do alvo dos presentes anticorpos.

[057]Consequentemente, as sequências de aminoácidos dos anticorpos da presente invenção podem ser consideradas novas e únicas.

[058]Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico que codifica o presente anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo.

[059]O termo "molécula de ácido nucleico" usado aqui se refere, de forma abrangente, a uma molécula de DNA (gDNA e cDNA) ou RNA e aos nucleotídeos básicos da molécula de ácido nucleico também inclui análogos modificados com açúcar ou base, bem como nucleotídeos naturais (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman e Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)). A sequência da presente molécula de ácido nucleico que codifica as regiões variáveis de cadeia leve e pesada pode ser modificada. Tal modificação inclui adição, exclusão ou substituição não conservativa ou conservativa de nucleotídeos.

[060]De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que co-difica a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 7 ou 23.

[061]De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que co-difica a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9, 25, 246, 248 ou 250.

[062]A molécula de ácido nucleico que codifica o presente anticorpo HER2 também inclui uma sequência de nucleotídeos que compartilha homologia substancial com a sequência de nucleotídeos acima. Homologia substancial significa que a sequência de nucleotídeos compartilha homologia de pelo menos 80%, mais preferivelmente 90% e, ainda mais preferivelmente, 95% através de análise por alinhamento de sequências usando um alinhamento máximo entre a sequência de nucleotí- deos da presente invenção e outras sequências aleatórias e algoritmo comumente conhecido por aqueles versados na técnica.

[063]Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um vetor recombinante que compreende a presente molécula de ácido nucleico descrita acima.

[064]O termo "vetor" usado aqui é uma ferramenta para expressão de um gene alvo em uma célula hospedeira, incluindo um vetor de plasmídeo; um vetor de cosmídeo; e um vetor viral, tal como um vetor de bacteriófago, um vetor adenoviral, um vetor retroviral e um vetor de vírus adeno-associado.

[065]De acordo com uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas estão operativamente ligadas a um promotor.

[066]O termo "operativamente ligada" usado aqui se refere à ligação funcio-nal entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (por exemplo, um promotor, sequência sinalizadora ou arranjo de sítios de ligação a fator de trans-crição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que a sequência de controle de expressão afeta a transcrição e/ou a tradução do ácido nucleico que corresponde à segunda sequência.

[067]Os vetores recombinantes da presente invenção podem ser construídos por meio de vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e seus mé-todos práticos são descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), o qual é aqui incorporado por referência.

[068]Tipicamente, o vetor da presente invenção pode ser construído como um vetor de clonagem ou de expressão. Além disso, o vetor da presente invenção pode ser construído usando uma célula procariota ou eucariota como uma célula hospedeira.

[069]Por exemplo, quando o vetor de expressão é construído para a célula hospedeira eucariota, um promotor derivado do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína, promotor de β-actina, promotor de hemoglobina humana e promotor de creatina muscular humana) ou vírus de mamíferos (por exemplo, promotor tardio de adenovírus; promotor 7.5K do vírus da varíola, promotor de SV40, promotor de citomegalovírus, promotor tk de HSV, promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor LTR de HIV, promotor do vírus Moloney, promotor do vírus de Epstein-Barr (EBV) e promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV)) podem ser usados. O vetor contém, em geral, uma sequência de poliadenilação como um terminador de transcrição.

[070]O vetor da presente invenção pode ser fundido com outras sequências para purificar um anticorpo expresso. Por exemplo, uma sequência a ser fundida inclui glutationa-S-transferase (Pharmacia, EUA), proteína de ligação à maltose (NEB, EUA), FLAG (IBI, EUA) e 6X His (hexa-histidina; Qiagen, EUA) e assim por diante.

[071]Uma vez que a proteína expressa pelo vetor da presente invenção é um anticorpo, o anticorpo expresso também poderia ser purificado através de uma colu-na de proteína A de uma maneira fácil, sem sequências aditivas para purificação.

[072]O vetor de expressão da presente invenção inclui um gene de resistên-cia a antibióticos conhecido por aqueles versados na técnica como um marcador de seleção, por exemplo, genes de resistência contra ampicilina, gentamicina, carbeni- cilina, cloranfenicol, estreptomicina, canamicina, geneticina, neomicina e tetraciclina.

[073]Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante descrito acima.

[074]As células hospedeiras nas quais o presente vetor é estável e sucessi-vamente clonado e expresso também usam qualquer uma conhecida por aqueles versados na técnica, por exemplo, uma célula hospedeira eucariota adequada, inclu-indo células COS7 (células de rim de macaco), células NSO, SP2/0, células CHO (ovário de hâmster chinês), W138, células BHK (rim de hâmster bebê), MDCK, a li-nhagem de células de mieloma, células HuT 78 e células HEK-293, porém sem limi-tação às mesmas.

[075]Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma compo-sição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de um câncer compreendendo: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz do presente anticorpo ao HER2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[076]Uma vez que a presente composição farmacêutica compreende o anti-corpo HER2 da presente invenção ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como um ingrediente ativo, as descrições em comum entre eles são omitidas de forma a evitar redundância indevida que levaria à complexidade do presente relató-rio descritivo.

[077]Conforme abordado nos Exemplos, o anticorpo HER2 da presente in-venção, em combinação com o trastuzumabe, mata as células cancerosas (em parti-cular, células de câncer de mama, mais particularmente células de câncer de mama que expressam HER2) com citotoxicidade significativamente aumentada e, portanto, são muito eficazes na terapia de câncer (particularmente câncer de mama e câncer de estômago, mais particularmente câncer de mama e câncer de estômago que ex-pressam HER2). De acordo com uma modalidade, a composição farmacêutica com-preende ainda o trastuzumabe.

[078]O câncer a ser prevenido ou tratado pela composição da presente in-venção inclui vários cânceres conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de brônquio, câncer de nasofaringe, câncer de laringe, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de colo do útero, câncer cerebral, câncer de próstata, câncer ósseo, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer de tiroide, câncer de paratiroide ou câncer ureteral.

[079]Especificamente, o câncer a ser prevenido ou tratado pela composição é um câncer que expressa HER2, mais especificamente câncer de mama ou câncer de estômago que expressa HER2.

[080]Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica para induzir à apoptose compreendendo: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz do presente anticorpo ao HER2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[081]De acordo com uma modalidade, a composição farmacêutica induz à apoptose para a prevenção ou tratamento de uma doença hiperproliferativa; em que a doença hiperproliferativa é câncer, hiperplasia, queloide, síndrome de Cushing, aldosteronismo primário, eritroplasia, policitemia vera, leucoplasia, cicatriz hiperplás- tica, líquen plano, lentiginose, arteriosclerose, aterosclerose, restenose ou estenose.

[082]O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um convencional para formulação, incluindo lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, borracha, fosfato de potássio, arginato, gelatina, silicato de potássio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xaropes, metil celulose, metil hidróxi benzoato, propil hidróxi benzoato, talco, estearato de magnésio e óleos minerais, porém sem limitação aos mesmos. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ainda incluir um lubrificante, um umectante, um edulcorante, um flavorizan- te, um emulsificante, um agente de suspensão e um conservante. Detalhes de veícu-los farmaceuticamente aceitáveis e formulações adequados podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995), o qual é aqui incorporado por referência.

[083]A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por via parenteral, por exemplo, através de injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, local, nasal, pulmonar ou retal.

[084]Uma dose adequada da composição farmacêutica da presente invenção pode variar dependendo da forma farmacêutica da formulação, dos métodos de administração, da idade do paciente, peso corporal, sexo, gravidade das doenças, dieta, momento de administração, via de administração, taxa de excreção e sensibi-lidade à composição farmacêutica. De preferência, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada com uma dose diária de 0,0001-100 mg/kg (peso corporal). O termo "quantidade farmaceuticamente eficaz" se refere a uma quantida-de adequada para prevenir ou tratar o câncer.

[085]De acordo com métodos convencionais conhecidos por aqueles versa-dos na técnica, a composição farmacêutica pode ser formulada com um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável que, por fim, proporciona várias formas, in-cluindo uma forma de dose unitária e uma forma de múltiplas doses. A formulação pode ser um meio oleoso ou aquoso, ressuspensão ou emulsão, extrato, pó, suposi-tório, grânulo, cápsula ou comprimido e ainda compreender um dispersante ou esta- bilizante.

[086]O anticorpo da presente invenção pode ser usado para diagnosticar dis-túrbios, doenças ou condições relacionados que expressam HER2.

[087]Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um kit para diagnóstico de um distúrbio, doença ou condição relacionada que expressa HER2 compreendendo o presente anticorpo ao HER2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[088]O distúrbio, doença ou condição relacionada que expressa HER2 é par-ticularmente câncer, por exemplo, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de es-tômago, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de brônquio, câncer de nasofa- ringe, câncer de laringe, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de colo do útero, câncer cerebral, câncer de próstata, câncer ósseo, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer de tiroide, câncer de paratiroide ou câncer ureteral. Especificamente, o kit diagnóstico da presente invenção é usado para diagnosticar um câncer que expressa HER2, mais especificamente câncer de mama ou câncer de estômago que expressa HER2.

[089]O anticorpo da presente invenção pode ser usado para analisar uma capacidade de resposta a um fármaco do presente anticorpo em um paciente.

[090]Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um kit para analisar uma capacidade de resposta a um fármaco compreendendo o presente an-ticorpo.

[091]O kit de análise da presente invenção é usado para avaliar a capacidade de resposta a um fármaco do presente anticorpo em um paciente. Por exemplo, onde células cancerosas obtidas de um paciente são incubadas com o anticorpo da presente invenção e o anticorpo é elucidado como estando ligado às células, é de-terminado que o paciente possui uma capacidade de resposta ao fármaco do presente anticorpo.

[092]Uma vez que o presente kit compreende anticorpos, ele pode ser fabri-cado para imunoensaio ou imunocoloração. O formato de imunoensaio ou imunoco- loração inclui, porém sem limitações, radioimunoensaio, radioimunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), ELISA de captura, ensaio de inibi-ção ou competição, ensaio em sanduíche, citometria de fluxo, imunofluorescência e purificação por imunoafinidade, porém sem limitação aos mesmos. Procedimentos de imunoensaio ou imunocoloração podem ser encontrados em Enzyme Immunoas-say, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Flórida, 1980; Gaastra, W., o ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) em Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; e Ed Harlow e David Lane, Using Anti-bodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, os quais são aqui incorporados por referência.

[093]Por exemplo, de acordo com o método de radioimunoensaio, o anticor-po marcado com radioisótopo (por exemplo, C14, I125, P32 e S35) pode ser usado para identificar HER2 sobre a superfície de células cancerosas. De acordo com o método ELISA, o exemplo específico do presente método pode compreender as etapas de: (i) revestimento de uma superfície de um substrato sólido com uma amostra biológica a ser analisada; (ii) incubação da amostra biológica com o anticorpo HER2 da presente invenção como um anticorpo primário; (iii) incubação do produto resultante da etapa (ii) com um anticorpo secundário conjugado com uma enzima; e (iv) medição da atividade enzimática.

[094]O substrato sólido pode ser polímeros de hidrocarbonetos (por exem-plo, poliestireno e polipropileno), vidro, metais ou géis. Mais preferivelmente, o substrato sólido é uma placa de microtitulação.

[095]A enzima conjugada ao anticorpo secundário inclui uma enzima que catalisa reações colorimétricas, fluorimétricas, luminescência ou infravermelho, por exemplo, fosfatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de rábano, luciferase e ci- tocromo P450. Quando se usa fosfatase alcalina, bromocloroindolilfosfato (BCIP), nitro azul de tetrazólio (NBT), naftol-AS-B1-fosfato e ECF (quimiofluorescência intensificada) podem ser usados como um substrato; no caso de uso de peroxidase de rábano, cloronaftol, aminoetilcarbazol, diaminobenzidina, D-luciferina, lucigenina (nitrato de bis-N-metilacridínio), benzil éter de resorufina, luminol, reagente Vermelho Amplex (10-acetil-3,7-di-hidroxifenoxazina, Pierce), HYR (p-fenilenodiamina-HCl e pirocatecol), TMB (3,3,5,5-tetrametilbenzidina), ABTS (2,2-di-azina-di-[3- etilbenztiazolino sulfonato]), o-fenilenodiamina (OPD) e naftol/pironina, glicose oxidase e t-NBT (nitro azul de tetrazólio) e m-PMS (metossulfato de fenazina) podem ser usados como um substrato.

[096]De acordo com o método ELISA de captura, o exemplo específico do presente método pode compreender as etapas de: (i) revestimento de uma superfície de um substrato sólido com o anticorpo HER2 como um anticorpo de captura; (ii) incubação do anticorpo de captura com uma amostra biológica a ser analisada; (iii) incubação do produto resultante da etapa (ii) com o anticorpo HER2 conjugado com um marcador que gera um sinal detectável como um anticorpo de detecção; e (iv) medição do sinal gerado a partir do marcador.

[097]O anticorpo de detecção tem um marcador que gera um sinal detectá- vel. O marcador inclui, porém sem limitações, um produto químico (por exemplo, biotina), um marcador enzimático (por exemplo, fosfatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de rábano e citocromo P450), um marcador radioativo (por exemplo, C14, I125, P32 e S35), um marcador fluorescente (por exemplo, fluoresceína), um marcador luminescente, um marcador quimioluminescente e um marcador para FRET (transferência de energia por ressonância de fluorescência). Vários marcadores e métodos para marcação de anticorpos podem ser encontrados em Ed Harlow e David Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

[098]A medição de atividade enzimática ou sinal em ELISA e ELISA de cap-tura pode ser realizada por meio de vários processos bem conhecidos na técnica. Quando biotina é usada como marcador, a detecção pode ser realizada usando es- treptavidina. Onde luciferase é usada, a detecção pode ser realizada usando lucife- rina.

[099]A amostra biológica aplicável ao presente kit inclui, porém sem limita-ções, células, tecidos, extratos derivados de tecidos, lisados ou produto purificado, sangue, plasma, soro, linfa e fluido ascítico.

[0100]O anticorpo da presente invenção pode ser usado para imagiologia in vivo ou in vitro. Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma com-posição para imagiologia que compreende o anticorpo da presente invenção e um marcador gerador de sinal conjugado com o anticorpo.

[0101]O marcador gerador de sinal inclui, porém sem limitações, agente de contraste T1 (por exemplo, composto de quelato de Gd), agente de contraste T2 (por exemplo, materiais superparamagnéticas (por exemplo, magnetita, Fe3O4, Y-Fe2θ3, ferrita de manganês, ferrita de cobalto e ferrita de níquel)), radioisótopos (por exemplo, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi e 206Bi), materiais fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, ficoeritrina, rodamina, lissamina, Cy3 e Cy5 ), materiais quimioluminescentes, partículas magnéticas, marcadores de massa e partículas densas de elétrons.

[0102]Embora o anticorpo da presente invenção em si seja útil em terapia de câncer, ele pode ser fornecido na forma de ADC (Antibody Drug Conjugate - conjugado de anticorpo-fármaco) através de conjugação com outro fármaco, uma vez que o anticorpo é capaz de objetivar células que expressam HER2.

[0103]Portanto, em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um ADC (conjugado de anticorpo-fármaco) que compreende o anticorpo da presente invenção e um fármaco conjugado com o anticorpo.

[0104]O fármaco conjugado com o anticorpo inclui, porém sem limitações, produtos químicos, radionuclídeos, substâncias imunoterapêuticas, citocinas, quimi- ocinas, toxinas, agentes biológicos e inibidores enzimáticos, especificamente fárma- cos anticâncer como segue: acivicina, aclarubicina, acodazol, acronicina, adozelesi- na, alanosina, aldesleucina, alopurinol sódico, altretamina, aminoglutetimida, amona- fida, ampligen, ansacrina, androgênios, anguidina, glicinato de afidicolina, asaley, asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), Baker's Antifol, beta-2'-deoxitioguanosina, bisantreno HCl, sulfato de bleomicina, bussulfano, butionina sulfoximina, BWA773U82, BW 502U83/HCl, mesilato BW 7U85, ceracemi- da, carbetímero, carboplatina, carmustina, clorambucil, cloroquinoxalina- sulfonamida, clorozotocina, cromomicina A3, cisplatina, cladribina, corticosteroides, Corynebacterium parvum, CPT-11, crisnatol, ciclocitidina, ciclofosfamida, citarabina, citembena, maleato dabis, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina HCl, deazauri- dina, dexrazoxano, dianidrogalactitol, diaziquona, dibromodulcitol, didemnina B, die- tilditiocarbamato, diglicoaldeído, di-hidro-5-azacitidina, doxorrubicina, equinomicina, dedatrexato, edelfosina, eflornitina, solução de Elliott, elsamitrucina, epirubicina, eso- rubicina, fosfato de estramustina, estrogênios, etanidazol, etiofos, etoposídeo, fadra- zol, fazarabina, fenretinida, filgrastim, finasterida, ácido acético de flavona, floxuridi- na, fosfato de fludarabina, 5-fluorouracila, Fluosol™, flutamida, nitrato de gálio, gen- citabina, acetato de goserelina, hepsulfam, hexametileno bisacetamida, homo- harringtonina, sulfato de hidrazina, 4-hidroxiandrostenodiona, hidroziureia, idarrubi- cina HCl, ifosfamida, 4-ipomeanol, iproplatina, isotretinoína, leucovorina de cálcio, acetato de leuprolida, levamisol, daunorrubicina lipossômica, doxorrubicina encapsulada em lipossomas, lomustina, lonidamina, maitansina, cloridrato de mecloretamina, melfalano, menogaril, merbarona, 6-mercaptopurina, mesna, resíduo da extração de metanol de Bacilo de Calmette-Guerin, metotrexato, N-metilformamida, mifepristona, mitoguazona, mitomicina-C, mitotano, cloridrato de mitoxantrona, fator de estimulação de colônias de monócitos/macrófagos, nabilona, nafoxidina, neocarzinostatina, acetato de octreotida, ormaplatina, oxaliplatina, paclitaxel, pala, pentostatina, pipera- zinodiona, pipobromano, pirarubicina, piritrexim, cloridrato de piroxantrona, PIXY- 321, plicamicina, porfímero de sódio, prednimustina, procarbazina, progestinas, pira- zofurina, razoxano, sargramostim, semustina, espirogermânio, espiromustina, es- treptonigrina, estreptozocina, sulofenur, suramina de sódio, tamoxifeno, taxotere, tegafur, teniposídeo, tereftalamidina, teroxirona, tioguanina, tiotepa, injeção de timi- dina, tiazofurina, topotecano, toremifeno, tretinoína, cloridrato de trifluoperazina, tri- fluridina, trimetrexato, TNF (fator de necrose tumoral), mostarda de uracila, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, vinorelbina, vinzolidina, Yoshi 864, zorubicina, citosina arabinosídeo, etoposídeo, melfalan, taxotere e taxol.

EFEITOS DA PRESENTE INVENÇÃO

[0105]As características e vantagens da presente invenção serão resumidas como segue: (a)O anticorpo da invenção se liga especificamente ao HER2 superexpresso em células cancerosas (em particular, células de câncer de mama e câncer de es-tômago), especificamente a um epítopo sobre HER2 que é diferente do epítopo para o trastuzumabe. (b)As sequências de CDR dos presentes anticorpos exibem uma baixa simi-laridade com sequências de CDR de anticorpos ao HER2 conhecidos publicamente, significando que as sequências de CDR são únicas. (c)Os anticorpos da presente invenção, em associação com o trastuzumabe, matam células cancerosas com citotoxicidade significativamente aprimorada e, por-tanto, são muito eficazes em terapia de câncer (particularmente, câncer de mama e câncer de estômago). (d)Sem pretender estar limitado pela teoria, as eficácias aprimoradas da te-rapia combinada se referem ao fato de que os anticorpos da presente invenção se ligam a um epítopo sobre HER2 que é diferente do epítopo para o trastuzumabe e inibem o HER2 de um modo cooperativo com o trastuzumabe. (e)Os anticorpos da presente invenção capaz de induzir à apoptose podem ser usados para a prevenção ou tratamento de doenças hiperproliferativas. (f)A presente invenção também pode ser útil no diagnóstico de câncer, análise de resposta a um fármaco, imagiologia e ADC (conjugado de anticorpo-fármaco), bem como terapia de câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0106]A Figura 1 mostra mapas genéticos do vetor pcDNA3.3-pesada de IgG e do vetor pOptiVEC-Kapa de IgG.

[0107]As Figuras 2A e 2B são gráficos que ilustram, respectivamente, os efeitos inibidores de proliferação de um único tratamento com o anticorpo 1E11 e um tratamento combinado com anticorpo 1E11 e trastuzumabe contra a linhagem de células de câncer NCI-N87 e a linhagem de células de câncer BT-474. TRA, PER e hIgG indicam, respectivamente, trastuzumabe, pertuzumabe e IgG humana (controle negativo).

[0108]As Figuras 3A e 3B mostram que o anticorpo 1E11 se liga a um domí-nio do subdomínio de HER2 que é diferente do domínio de ligação do trastuzumabe. As Figuras 3A e 3B mostram, respectivamente, os resultados de análise SPR e análise ELISA.

[0109]A Figura 4A mostra o resultado de análise ELISA para examinar se o anticorpo 1E11 se liga especificamente ao HER2 dentre proteínas da família ErbB à qual o HER2 pertence. Cetuximabe (CET) foi usado como um anticorpo de controle contra a proteína EGFR.

[0110]A Figura 4B mostra o resultado de análise ELISA para examinar se o anticorpo1E11 se liga a outros HER2 que não humano.

[0111]A Figura 5A mostra o resultado de análise da percentagem de células cancerosas onde apoptose ocorreu quando células NCI-N87 foram tratadas com an-ticorpo 1E11 ou trastuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos.

[0112]A Figura 5B mostra o resultado de análise da percentagem de células cancerosas onde apoptose ocorreu quando células BT-474 foram tratadas com anti-corpo 1E11 ou trastuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos.

[0113]A Figura 5C mostra o resultado de análise de viabilidade celular 24 horas e 48 horas após o tratamento de células NCI-N87 com anticorpo 1E11 ou tras- tuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos. O grupo de controle mostra a viabilidade de células tratadas com PBS apenas, o solvente para os anti-corpos.

[0114]A Figura 5D mostra o resultado de análise de atividade de Caspase- 3/7 24 horas após o tratamento de células NCI-N87 com anticorpo 1E11 ou tras- tuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos. O grupo de controle mostra a viabilidade de células tratadas com PBS apenas, o solvente para os anti-corpos.

[0115]A Figura 6A mostra o resultado de análise Western blot demonstrando a diminuição na sinalização ao HER2 a jusante através de tratamento com anticorpo 1E11 ou trastuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos.

[0116]A Figura 6B é um gráfico que mostra o efeito inibidor de proliferação celular induzido por heterodimerização através de tratamento com o anticorpo 1E11 ou trastuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos. Um controle negativo (Ctrl negativo) mostra a viabilidade de células não tratadas com ligantes nem anticorpos e um controle positivo (Ctrl positivo) mostra a viabilidade de células tratadas com ligantes apenas sem tratamento com anticorpos.

[0117]As Figuras 7A a 7C mostram os efeitos inibidores de crescimento de células tumorais em um modelo animal de xenoenxerto NCI-N87 através de trata-mento com o anticorpo 1E11 ou trastuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos. A Figura 7A mostra um gráfico que ilustra a variação no volume do tumor, a Figura 7B mostra um gráfico que ilustra a variação no peso do tumor e a Figura 7C mostra uma imagem que ilustra o resultado de coloração de tecidos tumo- rais. Ab de controle é o palivizumabe.

[0118]As Figuras 8A e 8B são gráficos que mostram, respectivamente, os efeitos inibidores de proliferação da linhagem de células cancerosas NCI-N87 e da linhagem de células cancerosas OE-19 através de um único tratamento com anticor- po hz1E11, o qual é um anticorpo humanizado, e um tratamento combinado com anticorpo hz1E11 e trastuzumabe.

[0119]A Figura 9 mostra o efeito inibidor de crescimento de células tumorais em um modelo animal de xenoenxerto NCI-N87 através de tratamento com o anticorpo hz1E11 ou trastuzumabe apenas ou em combinação dos mesmos. Ab de controle é o palivizumabe.

[0120]As Figuras 10A e 10B mostram, respectivamente, os resultados de varredura de alanina de CDRH3 e CDRL3 do anticorpo hz1E11.

[0121]As Figuras 11A a 11F são gráficos que mostram os efeitos inibidores da proliferação das linhagens de células cancerosas NCI-N87, OE-19 e BT-474 por um único tratamento com anticorpos hz1E11-3, hz1E11-133 e hz1E11-154, os quais são anticorpos humanizados aprimorados por afinidade, e um tratamento combinado de trastuzumabe com os mesmos.

[0122]A presente invenção será agora descrita em maiores detalhes por meio de exemplos. Será óbvio para aqueles versados na técnica que estes exemplos se destinam a ser mais concretamente ilustrativos e o âmbito da presente invenção, conforme definido nas reivindicações anexas, não está limitado a ou pelos exemplos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS AO HER2

[0123]Para preparo de anticorpos, o domínio extracelular (ExtraCellular Do-main - ECD) da proteína HER2 foi produzido usando células animais e, então, usado como antígeno. O DNA, onde uma região de dobradiça de IgG1 humana e uma porção Fc (CH2-CH3) foram ligadas ao C-término do ECD, foi clonado usando enzimas de restrição HindIII e BamHI. Então, o vetor clonado foi transitoriamente transfectado na célula FreeStyleTM 293F (Invitrogen, Cat. N° R790-07) usando polietilenoimina (Polyscience Inc., Cat. N° 23966) e proteína de fusão HER2-ECD Fc foi purificada a partir da cultura de células usando uma resina Protein-A Ceramic HyperD F (PALL, Cat. N° 20078-028). A proteína purificada foi quantificada usando um corante de en-saio de proteína (Bio-Rad, Cat. N° 500-0006), submetida a SDS-PAGE e sua con-centração e pureza foram confirmadas por meio de coloração com Coomassie. 100 μg do antígeno de proteína purificada foram misturados com adjuvante de Freund (Sigma, Cat. N° F5506) e depois injetados intraperitonealmente em camundongos BALB/c (DBL Co., Ltda., Coreia). Em duas semanas, 100 μg do antígeno foram dilu-ídos em PBS e injetados novamente e, três dias depois, o baço dos camundongos foi removido e os linfócitos foram isolados dos mesmos. Os linfócitos isolados foram misturados com a linhagem de células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC, Cat. N° CRL-1581) em uma proporção de 5:1 e fundidas usando PEG-1500 (Roche, Cat. N° 783641). As células fundidas foram cultivadas em um meio contendo o suplemento HAT (Sigma, Cat. N° H0262) e as células fundidas (hibridomas) foram seletivamente separadas e cultivadas.

[0124]As células de hibridoma assim obtidas foram examinadas por meio de um ensaio ELISA para determinar se elas eram as células produtoras de anticorpos que se ligam aos antígenos. HER2-ECD-Fc ou IgG humana ChromPure (hIgG, Jackson Immunoresearch Lab. Inc., Cat. N° 009-000-003) foi imobilizada em temperatura ambiente a uma placa Costar com 96 cavidades (Corning, Cat. N° 3590) em uma concentração de 1 μg/ml durante 1 hora. O resultante foi lavado 3 vezes com TBS-T (Triton X-100 a 0,05%) e, então, bloqueada em temperatura ambiente com 300 μL de TBS-T/SM (leite desnatado a 2%) durante 30 minutos. A placa bloqueada foi lavada 3 vezes e um caldo de cultura de hibridoma adicionado e deixado se ligar a anticorpos a 37 °C durante 1 hora (Pierce, Cat. N° 31439). Após lavagem do resul-tantes 3 vezes, IgG-HRP anti-camundongo como um anticorpo secundário foi diluído em TBS-T/SM em uma proporção de 1:5000 e deixado se ligar ao mesmo a 37 °C durante 1 hora. Após lavar o resultante 3 vezes, TMB (SurModics, Cat. N° TMBC- 1000-01) foi adicionado ao mesmo e a cor foi deixada desenvolver em temperatura ambiente durante 5 minutos e ácido sulfúrico a 1 N adicionado (DukSan, Cat. N° 254) para interromper o desenvolvimento da cor. A absorbância foi medida a 450 nm usando Victor X3 (Perkin Elmer, Cat. N° 2030-0030) e os anticorpos que se ligam especificamente ao HER2-ECD-Fc foram selecionados.

[0125]Uma vez que HER2 é uma proteína expressa sobre a superfície da cé-lula, foi examinado se os anticorpos desenvolvidos estavam ligados a células que superexpressam HER2 através do ensaio ELISA com base em células. A linhagem de células de câncer de ovário que superexpressa HER2, SKOV-3 (Korean Cell Line Bank (KCLB), Cat. N° 30077) foi dividida em alíquotas na placa de cultura de células Costar com 96 cavidades (Corning, Cat. N° 3595) em uma concentração de 10.000 células/cavidade e cultivadas durante 24 horas. No dia seguinte, após remoção do sobrenadante da cultura de células, o produto resultante foi lavado 3 vezes com PBS, caldo de cultura de hibridoma adicionado e as células adicionalmente cultivadas a 37 °C durante 2 horas. Após lavar o resultante 3 vezes com TBS-T, IgG-HRP de cabra anti-camundongo como um anticorpo secundário que foi diluído em PBS/FBS (FBS a 3%) em uma proporção de 1:5000, foi adicionada ao mesmo e tratado em temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavar o resultante 3 vezes com TBS-T, a cor foi deixada desenvolver usando TMB. Foram selecionados 61 clones que mostram absorbância maior do que aquela a cultura de células SP2/0 como um controle negativo.

EXEMPLO 2: COMPARAÇÃO DO EFEITO INIBIDOR DE ANTICORPOS DESENVOLVIDOS CONTRA O CRESCIMENTO DE CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA

[0126]De modo a realizar um ensaio de viabilidade celular para confirmação do efeito inibidor contra a proliferação de células de câncer de mama, os anticorpos do caldo de cultura de hibridoma foram purificados. O hibridoma foi cultivado em um meio de cultura contendo FBS a 3% e os anticorpos na forma de IgG foram purifica-dos usando resina de Proteína A. Os anticorpos purificados foram quantificados por meio do ensaio BCA (Pierce, Cat. N° 23227), submetidos a SDS-PAGE e sua con-centração e pureza foram confirmadas através de coloração com Coomassie.

[0127]O ensaio de viabilidade celular foi realizado através de um único tra-tamento ou um tratamento combinado juntamente com trastuzumabe em relação à BT-474, uma linhagem de células de câncer de mama representativa, e a linhagem de células NCI-N87, uma linhagem de células de câncer de estômago representativa, onde HER2 é superexpresso. Para o tratamento combinado, uma mistura dos anticorpos desenvolvidos e trastuzumabe misturados na proporção de 1:1 (propor-ção em peso) foi usada. À placa com 96 cavidades foram colocadas em alíquotas células BT-474 (ATCC, Cat. N° CRL-5822, 10.000 células/cavidade) e NCI-N87 (ATCC, Cat. N° HTB-20, 10.000 células/cavidade) e cultivadas durante 24 horas. Os anticorpos purificados foram, respectivamente, tratados para ter uma concentração de 5 μg/mL e as linhagens de células BT-474 e NCI-N87 foram cultivadas adicional-mente durante 4 dias. Para o ensaio de viabilidade celular, CCK-8 foi adicionado (Dojindo, Cat. N° CK-04-13) em uma concentração final de 10%, tratadas a 37 °C durante 3 horas e sua absorbância foi medida. A viabilidade relativa foi calculada em relação à absorbância da cavidade não tratada com o anticorpo, a qual foi fixada em 100% de viabilidade. Com base no exposto acima, o anticorpo 1E11 foi selecionado.

EXEMPLO 3: ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE ANTICORPO

[0128]Para o ensaio de sequência do anticorpo, uma biblioteca de anticorpos Fab em fagos foi construída usando o respectivo RNA de hibridoma e uma filtração de três etapas realizada para obter um fago que se liga a HER2-ECD-Fc (Phage Display: A Laboratory Manual, Carlos Barbas III et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Após cultura do hibridoma, o RNA foi isolado usando o SV Total RNA Isolation System (Promega, Cat. N° Z3100) e um cDNA foi sintetizado a partir da mesma. Usando um conjunto de iniciadores conhecidos (vide: Phage Display: A Laboratory Manual, Carlos Barbas III et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press.), a região va-riável do anticorpo foi amplificada e clonada no vetor pComb3X (Barbas Laboratory, The Scripps Research Institute) usando a enzima de restrição SfiI após ligação ao Ck e CH1 humanos e, então, transformada em bactérias ER2537 (New England Biolabs, Cat. N° 801-N). As bactérias transformadas foram transfectadas com o fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, Cat. N° 200251) para obter um fago e um clone o qual se liga à HER2-ECD-Fc foi adquirido usando um imunotubo, ao qual HER2-ECD-Fc foi imobilizada.

[0129]Dentre as colônias para cada um dos anticorpos, os anticorpos que se ligam à HER2-ECD-Fc foram confirmados por meio de um ensaio ELISA. As colônias de bactérias transformadas foram cultivadas a 37 °C até sua absorbância a 600 nm atingir 0,5 e tratadas com IPTG em uma concentração final de 1 mM, deixadas descansar e anticorpos expressos na forma de Fab enquanto se cultivava durante a noite a 30 °C. Após cultura de 5 mL, as células foram coletadas por meio de centri-fugação, suspensas em 0,4 mL de 1X TES (Tris a 50 mM, EDTA a 1 mM, sacarose a 20% (v/v), pH de 8,0) e tratadas a 4 °C durante 10 minutos. Após a adição de 0,6 mL de 0,2X TES às mesmas, o resultante foi tratado a 4 °C durante 30 minutos, centri-fugado e o sobrenadante foi recuperado. Após lavagem de metade da área de uma placa Costar com 96 cavidades (Corning Inc., Cat. N° 3690), a qual foi revestida com HER2-ECD-Fc em uma concentração de 1 μg/mL, 3 vezes com TBS-T, ela foi blo-queada com TBS-T/SM (leite desnatado a 3%, Triton X-100 a 0,05%) em temperatu-ra ambiente durante 1 hora. O caldo de cultura ou extrato periplasmático (Periplas-ma) para cada colônia foi tratado diluindo-o em uma proporção de 1:3 usando TBS- T/SM e deixado se ligar em temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavar 3 ve-zes, anti-HA-HRP (Roche, Cat. N° 120-138-190-01) como anticorpo secundário foi diluído em uma proporção de 1:5000, deixado se ligar em temperatura ambiente du- rante 1 hora, lavado 3 vezes e a cor deixada desenvolver usando TMB.

[0130]A maioria das colônias no caldo de cultura de células ou extrato peri- plásmico tinha uma absorção de 0,2 ou maior e as sequências dos anticorpos foram analisadas em relação a estes clones. A análise da sequência revelou que as colônias derivadas de um único hibridoma mostraram ter as mesmas sequências. As sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo 1E11 estão resumidas na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 Sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo 1E11

EXEMPLO 4: CONSTRUÇÃO E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS QUIMÉRICOS

[0131]Anticorpos quiméricos foram construídos para preparar os anticorpos da presente invenção em uma forma mais passível de objetivação por um fármaco.

[0132]A região variável dos anticorpos de camundongo, para os quais análi-se da sequência de nucleotídeos foi concluída, foi amplificada e ligada às regiões constantes humanas CK e CH, e a parte da cadeia pesada foi TA clonada pelo vetor pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen, Cat. N° K8300-01), enquanto que a parte da cadeia leve foi TA clonada pelo vetor pOptiVEC-TOPO (Invitrogen, Cat. N°, 12744-017). Os iniciadores usados para amplificação são mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo. Os iniciadores diretos foram inseridos com um sítio de restrição ClaI, enquanto que os iniciadores inversos foram adicionados com sítio de restrição NheI para a cadeia pe-sada e o sítio de restrição BsiWI para a cadeia leve, respectivamente. Adicionalmen-te, os iniciadores diretos na região variável foram adicionados com uma sequência sinalizadora, de modo que os anticorpos quiméricos pudessem ser secretados no meio de cultura de células. As sequências de nucleotídeos e sequências de aminoá- cidos de CK e CH usadas na presente invenção são descritos em SEQ ID NOs: 11 a 14.

[0133]Uma reação de PCR (30 segundos a 95 °C; 30 seg a 58 °C; e 30 seg a 72 °C) foi realizada repetidamente durante 35 ciclos usando os iniciadores e DNA polimerase GoTaq (Promega, Cat. N° M3005 ) descritos acima. Cada um dos produtos de PCR amplificados das regiões variáveis e das regiões constantes, após terem sido submetidos a uma eletroforese em gel de agarose a 1%, foi purificado usando um kit de extração de gel QIAquick (Qiagen, Cat. N° 28706). De modo a ligar as regiões variáveis e as regiões constantes, os produtos de PCR das regiões variáveis e das regiões constantes foram misturados em uma quantidade igual e uma PCR de extensão por sobreposição foi realizada usando os iniciadores diretos para as regiões variáveis e os iniciadores inversos para as regiões constantes para obter produtos gênicos e os produtos foram purificados da mesma maneira conforme descrito acima. A PCR de extensão por sobreposição (30 segundos a 95 °C; 30 seg a 58 °C; e 45 seg a 72 °C) foi realizada repetidamente durante 35 ciclos usando os iniciadores e foi realizada usando DNA polimerase GoTaq (Promega, Cat. N° M3005). Os produtos dos genes amplificados foram TA clonados no vetor pcDNA3.3-TOPO (Invi- trogen, Cat. N° K8300-01) para a parte da pesada cadeia e TA clonados no vetor pOptiVEC-TOPO (Invitrogen, Cat. N° 12744-017 ) para a parte da cadeia leve, de acordo com o manual do fabricante. TABELA 2 Iniciadores para amplificação de regiões variáveis

TABELA 3 Iniciad ores para amplificação de regiões constantes

[0134]Nas Tabelas acima, as letras a negrito indicam os sítios de restrição para as enzimas de restrição, enquanto que as partes sublinhadas indicam sequên-cias sinalizadoras.

[0135]Os mapas do vetor pcDNA3.3-pesada de IgG finalmente construído e do vetor pOptiVEC-Kapa de IgG são ilustrados na Figura 1.

[0136]Então, os vetores clonados foram transitoriamente transfectados em células animais FreeStyleTM 293F (Invitrogen, Cat. N° R790-07) usando polietilenoi- mina (Polyscience Inc., Cat. N° 23966) e anticorpos quiméricos foram purificados a partir do caldo de cultura de células usando resina Protein-A Ceramic HyperD F (PALL, Cat. N° 20078-028). Os anticorpos quiméricos purificados foram quantifica-dos por meio do ensaio BCA (Pierce, Cat. N° 23227), submetidos a SDS-PAGE e sua concentração e pureza foram confirmadas através de coloração com Coomas- sie.

EXEMPLO 5: COMPARAÇÃO DOS EFEITOS INIBIDORES DE ANTICORPOS DESENVOLVIDOS CONTRA O CRESCIMENTO DE CÂNCER DE MAMA E CÂNCER DE ESTÔMAGO

[0137]De modo a confirmar os efeitos anticâncer dos anticorpos desenvolvi-dos de acordo com sua concentração, um ensaio de viabilidade celular foi realizado sobre linhagens de células cancerosas que superexpressam HER2, tais como BT- 474 (uma linhagem de células de câncer da mama) e NCI-N87 (uma linhagem de células de câncer de estômago). BT-474 (10.000 células/cavidade) e NCI-N87 (10.000 células/cavidade) em um volume de 70 μL foram transformadas em alíquo- tas em uma placa com 96 cavidades e imobilizadas à mesma enquanto se cultivava durante 24 horas. No dia seguinte, 30 μL dos anticorpos foram adicionados às células em cultura. A concentração final dos anticorpos tratados foi de no máximo 20 μg/mL por cada anticorpo e sequencialmente diluídos em uma proporção de 1:4 e o ensaio foi realizado em 5 concentrações diferentes. Quando tratados em combinação com trastuzumabe, a proporção entre os anticorpos desenvolvidos e o trastuzu- mabe foi fixada em uma proporção de 1:1 (por exemplo, nas Figuras 2A e 2B, quando a quantidade de administração foi de 1 μg/mL, 1 μg/ml de TRA e 1 μg/mL de 1E11 foram administrados). Após tratamento com os anticorpos, as células BT-474 e NCI-N87 foram cultivadas durante mais 4 dias, CCK-8 adicionado para uma concentração final de 10% e tratadas a 37 °C durante 3 horas. Então, a absorbância das células tratadas foi medida a 450 nm usando Victor X-3. A absorbância das células não tratadas com os anticorpos foi fixada em 100% e sua viabilidade relativa foi cal-culada (Figuras 2A e 2B).

[0138]O anticorpo 1E11 desenvolvido mostrou um efeito inibidor contra a proliferação das linhagens de células NCI-N87 (Figuras 2A) e BT-474 (Figura 2B), as quais foram consideradas responsivas ao trastuzumabe. Além disso, o tratamento combinado com anticorpo 1E11 e trastuzumabe mostrou uma atividade inibidora mais elevada contra a proliferação de células cancerosas do que o tratamento com trastuzumabe apenas em relação às linhagens de células NCI-N87 e BT-474. Curio-samente, o tratamento combinado com anticorpo 1E11 e trastuzumabe mostrou uma atividade inibidora mais elevada contra a proliferação de células cancerosas do que o tratamento combinado com trastuzumabe e pertuzumabe em relação à linhagem de células NCI-N87 (Figura 2A).

EXEMPLO 6: CONFIRMAÇÃO DE EFEITO SINÉRGICO DE ANTICORPOS DESENVOLVIDOS EM TRATAMENTO COMBINADO COM TRASTUZUMABE

[0139]De modo a confirmar se o efeito anticâncer do tratamento combinado com o anticorpo 1E11 desenvolvido e o trastuzumabe sobre o câncer de estômago era um efeito sinérgico, células NCI-N87 foram tratadas com anticorpo 1E11 ou tras- tuzumabe, individualmente ou em combinação dos mesmos. Os efeitos anticâncer foram analisados (Figura 2A). O efeito anticâncer de acordo com a concentração foi analisado através do programa CalcuSyn (Biosoft) usando o método de Chou e Tala- lay (Chou et al., Adv. Enzym. Regul. 22: 27-55 (1984)), o qual analisa o efeito da administração combinada de pelo menos dois fármacos (Tabela 4). Quando dois fármacos são administrados em combinação, eles se tornam agonistas, aditivos ou sinérgicos. As interações mútuas dos fármacos podem ser analisadas usando o mé-todo de Chou e Talalay em termos de índice de combinação (CI). O valor de CI de 1 ou maior indica um efeito agonista, enquanto que valores de CI de 1 e 1 ou menos indicam um efeito aditivo e um efeito sinérgico, respectivamente. TABELA 4

[0140]Na tabela acima, ED50, ED75 e ED90 indicam as doses eficazes as quais mostram efeitos em 50%, 75% e 90% das populações, respectivamente. 'r' indica um coeficiente de correlação linear de uma representação de mediana-efeito.

[0141]Conforme pode ser visto na Figura 2A e na Tabela 4, o valor de CI dos dois fármacos de trastuzumabe e clones de 1E11 no momento de seu tratamento combinado estava abaixo de 0,1 e, portanto, os dois anticorpos foram confirmados como tendo um efeito sinérgico quando administrados em combinação.

EXEMPLO 7: COMPARAÇÃO DE EPÍTOPOS ENTRE OS ANTICORPOS DESENVOLVIDOS E O TRASTUZUMABE

[0142]Trastuzumabe, o anticorpo contra HER2, é conhecido por se ligar ao domínio 4 entre os quatro domínios ECD de HER2. De modo a confirmar se os epí- topos de HER2 dos anticorpos desenvolvidos se sobrepõem àqueles do trastuzuma- be, um "binning" de epítopo foi realizado através de ressonância de plasma em su-perfície (Surface Plasmon Resonance - SPR) usando Biacore 3000 (GE Healthcare). Cerca de 1.000 RU (unidade de resposta) de trastuzumabe foram imobilizadas sobre um chip sensor CM5 (GE Healthcare, Cat. N° BR-1000-1012) através de um método de acoplamento de amina usando ECD/NHS. HER2-ECD-His, em uma concentração de 320 nM, foi deixada se ligar ao chip do sensor, ao qual o trastuzumabe foi imobili-zado usando tampão HBS-P (HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, EDTA a 1 mM, Tween-20 a 0,005%, pH de 7,4) durante 4 minutos e apenas o tampão sobre o mesmo foi posteriormente lavado durante 5 minutos para estabilizar a ligação entre o trastuzumabe e HER2-ECD. Então, os anticorpos secundários, em uma concentração de 1 μg/mL, foram deixados se ligar aos mesmos durante 4 minutos e o tampão sobre os mesmos foi lavado. Em todos os experimentos, a taxa de lavagem foi fixada em 50 μL/min. Se os anticorpos secundariamente ligados ainda se ligam à proteína HER2-ECD, à qual trastuzumabe estava ligado, eles são anticorpos que não compartilham o epítopo em comum com o trastuzumabe.

[0143]Conforme pode ser visto na Figura 3A, hIgG, a qual foi usada como um anticorpo secundário, não se liga ao HER2 e, assim, não houve ligação adicional e, uma vez que o trastuzumabe tem o mesmo epítopo, ele não se ligou mais. Em contraste, o anticorpo 1E11 foi adicionalmente ligado ao HER2-ECD, o qual estava ligado ao trastuzumabe e, assim, foi confirmado ter um epítopo que é diferente da-quele do trastuzumabe.

[0144]De modo a confirmar a região do domínio à qual se liga os clones de 1E11, os quatro subdomínios (domínios 1-4) que constituem o domínio extracelular da proteína HER2 foram produzidos individualmente usando células animais, às quais a região de dobradiça e a região Fc de IgG1 humana foram ligadas e purificadas usando Proteína A. A ligação dos clones de 1E11, trastuzumabe, pertuzumabe foi confirmada através do ensaio ELISA em relação à proteína recombinante assim produzida. Conforme pode ser visto na Figura 3B, os clones de 1E11 se ligam ao subdomínio 4, como no caso com o trastuzumabe.

[0145]A partir dos resultados precedentes, foi confirmado que os clones de 1E11 se ligam ao subdomínio 4 de ECD da proteína HER2, mas eles se ligam a um epítopo que é diferente daquele do trastuzumabe (Figura 3).

EXEMPLO 8: ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOS DESENVOLVIDOS AO HER 2

[0146]Se os anticorpos 1E11 desenvolvidos se ligam especificamente ao HER2 dentre as proteínas da família ErbB, à qual pertence o HER2, e se eles se ligam ao HER2 de outras espécies que não seres humanos, foi confirmado por meio de um ensaio ELISA. De modo a confirmar se os anticorpos 1E11 desenvolvidos se ligam especificamente ao HER2 dentre as proteínas da família ErbB, os domínios extracelulares de EGFR, HER2, HER3 e HER4, os quais pertencem à família ErbB, foram examinados por meio de um ensaio ELISA. Os domínios extracelulares de EGFR (EGFR-ECD-Fc) foram produzidos da mesma maneira conforme HER2-ECD- Fc e HER3 (R&D Systems, #348-RB-050) e HER4 (R&D Systems, #1131-ER-050) foram adquiridos. De modo a confirmar se os anticorpos desenvolvidos apresentam reações cruzadas interespecíficas às proteínas HER2 de espécies diferentes, os domínios extracelulares de HER2 em seres humanos, macaco rhesus, macaco cynomolgus, camundongo e rato foram usados e confirmados através de um ensaio ELISA. O domínio extracelular de macaco cynomolgus foi produzido da mesma ma-neira conforme em HER2-ECD-Fc humana e o domínio extracelular de HER2 de macaco rhesus (Sino Biological Inc., #90020-K08H), o domínio extracelular de HER2 de rato (Sino Biological Inc., #50714-M08H) e o domínio extracelular de HER2 de rato (Sino Biological Inc., #80079-R08H) foram adquiridos.

[0147]Conforme pode ser visto nas Figuras 4A e 4B, foi confirmado que os anticorpos 1E11 desenvolvidos se ligam especificamente ao HER2 dentre as proteí- nas humanas da família ErbB e têm reações cruzadas interespecíficas às proteínas HER2 de macaco rhesus e macaco cynomolgus.

EXEMPLO 9: ANÁLISE DE APOPTOSE DE ANTICORPOS AO HER2

[0148]Nós analisamos as capacidades de indução de apoptose de anticorpos HER2 para elucidar um mecanismo molecular subjacente de efeitos anticâncer do anticorpo 1E11 coadministrado com o trastuzumabe. Para investigar as capacidades de indução de apoptose, células NCI-N87 e BT-474 foram tratadas com 10 μg/mL de anticorpos 1E11, trastuzumabe ou sua combinação durante 48 horas (10 μg/mL de 1E11 e 10 μg/mL de trastuzumabe para administração combinada). Após o tratamento com anticorpos, as células foram soltas com tripsina e 500.000 células foram analisadas usando o kit ApoScreen Annexin V Apoptosis (SouthernBiotech, #10010-02) através de uma análise de citometria de fluxo (Cytomics FC500, Beck-man Coulter, Inc.) (Figuras 5a e 5b).

[0149]Para medir as atividades de caspase-3 e caspase-7 que desempenham um papel crucial em apoptose, as eficácias de anticorpos anticâncer 1E11, trastuzumabe ou combinação dos mesmos foram analisadas ao longo do tempo de tratamento. Células NCI-N87 foram tratadas com 10 μg/ml de anticorpos. Após 24 h e 48 h de tratamento, o ensaio de viabilidade celular foi realizado usando Caspase- Glo (Promega, #G7571) (Figura 5c). foi mostrado que a viabilidade celular foi diminuída acentuadamente após 24 horas de tratamento. Com base em tais resultados, as atividades de caspase-3/7 foram medidas após 24 horas de tratamento. Células NCI- N87 foram tratadas com 10 μg/mL de anticorpos durante 24 horas. O Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, #G809) foi usado para medir a atividade de caspase-3/7 (Figura 5d).

[0150]Conforme representado nas Figuras 5a e 5b, foi mostrado que apenas o anticorpo 1E11 exerce atividade apoptótica em câncer de estômago (células NCI- N87) e câncer de mama (células BT-474) que superexpressam HER2, os quais são diferentes do trastuzumabe. A atividade apoptótica do anticorpo 1E11 foi adicional-mente aumentada com o tratamento combinado com trastuzumabe. O aumento da atividade apoptótica do tratamento combinado com 1E11 e trastuzumabe foi anali-sado como sendo em virtude do aumento na atividade de caspase-3/7, a qual de-sempenha um papel crucial em apoptose (Figura 5d).

EXEMPLO 10: INIBIÇÃO DE SINALIZAÇÃO CELULAR AO HER2 POR ANTICORPOS

[0151]Para elucidar o mecanismo anticâncer do 1E11 em combinação com o trastuzumabe contra o câncer de estômago e câncer de mama que superexpressam HER2, nós analisamoss as atividades de sinalização ao HER2 em células. Células NCI-N87 foram tratadas com 10 μg/mL de anticorpos durante 24 horas. Então, as células foram submetidas à lise com solução de lise celular [Tris a 50 mM, pH de 7,4, NaCl a 150 mM, NP-40 a 1%, dodecil sulfato de sódio a 0,1%, NaF a 1 mM, Na3VO4 a 1 mM, PMSF a 1 mM e coquetel inibidor de protease (Sigma)] para obtenção de um lisato celular. O lisato celular foi submetido à análise Western blot. Anticorpos ao HER2 (#4290), pHER2 (#2243), pHER3 (#4791), EGFR (#4267), pEGFR (#3777), AKT (#4691), pAKT (#4060), ERK (#4695) e pERK (#4370) foram adquiridos da Cell Signaling Technology. O anticorpo ao HER3 (SC-285) foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology e GAPDH (ABC-1001), como um anticorpo de controle de carregamento, foi adquirido da AbClon. Os anticorpos anti-camundongo (ABC-5001) e antirato (ABC-5003) conjugados com peroxidase de rábano também foram adquiridos da AbClon. As bandas foram visualizadas usando AbSignal (AbClon, ABC-3001).

[0152]Nós examinamos ainda se o tratamento combinado com 1E11 e tras- tuzumabe inibe a heterodimerização entre HER2 e EGFR ou HER3 como outras pro-teínas da família ErbB. Células NCI-N87 foram tratadas com EGF para indução de heterodimerização entre HER2 e EGFR e tratadas com HRG para a indução de he- terodimerização entre HER2 e HER3. Células NCI-N87 foram transformadas em alí- quotas em um meio de células suplementado com FBR a 0,1% e cultivadas durante 24 h. Então, as células foram tratadas com 10 μg/mL de anticorpos durante 1 hora e, então, com 200 ng/mL de EGF (R&D Systems, #236-EG-200) ou HRG (R&D Systems, #377-HB/CF) . Três dias depois, a viabilidade celular foi testada.

[0153]Conforme mostrado na Figura 6a, o tratamento combinado com 1E11 e trastuzumabe contribui para a diminuição do nível de proteína HER2. Quando de diminuição do nível de proteína HER2, a proteína HER2 fosforilada foi também diminuída. Observamos um nível reduzido de HER3 e EGFR fosforilados sem alteração no nível total de proteína. Tais resultados demonstram que o tratamento combinado com 1E11 e trastuzumabe é capaz de controlar a atividade de HER2, HER3 e EGFR. Por meio de tais controles de atividade, as atividades de AKT e ERK, fatores a jusante de HER2 conhecidos, também foram alteradas sem variação no nível total de proteína.

[0154]Foi mostrado que o tratamento combinado com 1E11 e trastuzumabe resultou em redução de proliferação celular por meio de heterodimerização entre HER2 e EGFR (ou HER3) (Figura 6b). A proliferação de células NCI-N87 por EGF capaz de indução de heterodimerização entre HER2 e EGFR, e HRG capaz de indução de heterodimerização entre HER2 e HER3, foi reduzida por meio de tratamento combinado com 1E11 e trastuzumabe para um nível similar ao pertuzumabe, conhe-cido por inibir a ligação de HER2 a outros receptores.

[0155]Estes resultados significam que a sinalização celular através hetero- dimerização entre HER2 e EGFR (ou HER3) foi suprimida pelo tratamento combina-do com 1E11 e trastuzumabe.

EXEMPLO 11: EFICÁCIAS DE ANTICORPOS ANTICÂNCER EM MODELOS ANIMAIS

[0156]As eficácias anticâncer de anticorpos 1E11foram avaliadas usando modelos animais. Camundongos fêmeas nus atímicos (Daehan Biolink, Coreia) fo- ram injetados por via subcutânea com 5 x 106 de células NCI-N87 para preparar o modelo de xenotransplante. Os tumores foram deixados crescer para um tamanho de aproximadamente 200 mm3 e os camundongos foram depois divididos aleatoria-mente em quatro grupos. Animais dos quatro grupos receberam uma administração intraperitoneal duas vezes por semana de 10 mg/kg de palivizumabe (como controle de isotipo de trastuzumabe (MedImmune LLC.)), 1E11, trastuzumabe e a combina-ção de 1E11 e trastuzumabe, respectivamente. Para administração combinada, cada anticorpo foi administrado em uma dose de 10 mg/kg. Os volumes dos tumores fo-ram medidos ao longo do tempo. No dia 22, os animais foram sacrificados e os tu-mores foram isolados. Os volumes dos tumores foram calculados usando a fórmula (L*W*W)/2, onde "L" representa o diâmetro maior do tumor e "W" representa o diâ-metro menor do tumor. Os tumores isolados foram pesados e preparados para análi-se imuno-histoquímica. Tecidos de xenoenxerto de tumor foram processados como seções de espécimes incrustadas em parafina e fixadas em formalina. Estas foram examinadas por meio de coloração com hematoxilina (DAKO, #CS700) e eosina (DAKO, #CS701) (H&E) e coloração de proteína HER2 usando anticorpo ao HER2 (Cell Signaling Technology, #4290).

[0157]1E11 apenas inibiu o crescimento do tumor de uma forma similar ao trastuzumabe (Figura 7a). 1E11 mostrou um aumento de atividade antitumor de for-ma dramática em combinação com o trastuzumabe comparado com cada tratamento com um anticorpo individual. A atividade antitumor também foi confirmada através de análise da massa de tumor extraída após os experimentos (Figura 7b). A redução de células que expressam HER2 por meio do tratamento combinado com 1E11 e tras- tuzumabe foi observada em coloração imuno-histoquímica (Figura 7c), o que é compatível com os resultados de Western blot (Figura 6a). Estes resultados indicam que o 1E11, em combinação com o trastuzumabe, inibe dramaticamente o crescimento do tumor comparado com o tratamento com um anticorpo individual, o qual é em vir- tude de supressão da expressão de proteína HER2.

EXEMPLO 12: DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS HUMANIZADOS E CONFIRMAÇÃO DE SEUS EFEITOS

[0158]Os anticorpos humanizados dos anticorpos quiméricos 1E11 desen-volvidos no Exemplo 4 foram desenvolvidos usando um método de enxertia de CDR. Em relação aos anticorpos humanos que recebem a CDR dos anticorpos desenvol-vidos, os genes V e J de genes de anticorpos da linha germinativa humana com ele-vada homologia de sequência com base na sequência de nucleotídeos foram seleci-onados usando IMGT/V-Quest (Brochet, X. et al., Nucl Acids Res. 36: 503-508 (2008)). Como um gene V e um gene J de uma cadeia pesada, o gene IGHV3-48*03 e o gene IGHJ4*01 foram selecionados, respectivamente, e sua homologia de sequência era de 85,07% e 87,23%, respectivamente. Além disso, como um gene V e um gene J de uma cadeia leve, o gene IGKV1-39*01 e o gene IGKJ1*01 foram selecionados, respectivamente, e sua homologia de sequência era de 81,36% e 81,08%, respectivamente. Considerando um relatório de que a enxertia de CDR diminui ape-nas a afinidade, H49 com base na numeração de Kabat da cadeia pesada, que cor-responde à zona de Vernier que pode afetar toda a estrutura de um anticorpo, foi substituído por alanina em vez de serina, o qual é o gene de linha germinativa hu-mana. O anticorpo humanizado hz1E11 desenvolvido foi produzido na forma de IgG usando a linhagem de células FreeStyleTM 293F. As sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve do hz1E11 de-senvolvido são descritas em SEQ ID NOS: 24 e 26, respectivamente.

[0159]A afinidade de hz1E11, o anticorpo humanizado desenvolvido de 1E11, pelo HER2 foi medida através do ensaio de ressonância de plasma em super-fície (SPR). Todos os experimentos foram realizados usando Biacore 3000. Primeiro, os anticorpos de cabra à IgG humana foram imobilizados em uma concentração de 1000 RU a um chip sensor CM5 através de um método de acoplamento de amina. Trastuzumabe, pertuzumabe e hz1E11 foram, respectivamente, diluídos para 2,84 μM, 5,68 μM e 7,1 μM usando um tampão HBS-P. Antes de ligação à HER2-ECD- His, cada anticorpo foi ligado em uma taxa de 50 μL/min durante 180 segundos e tampão deixado fluir sobre os mesmos para fins de estabilização. Então, a proteína HER2-ECD-His foi deixada se ligar em concentrações de 640 nM, 320 nM, 160 nM, 80 nM, 40 nM, 20 nM e 0 nM durante 4 minutos e tampão deixado fluir sobre a mesma durante 15 minutos. O chip sensor foi reciclado ao permitir fluxo de tampão de glicina-HCl a 10 mM (pH de 1,5) sobre o mesmo. Todos os dados do sensorgrama foram analisados via um modelo de interação a 1:1 usando o software BIAevalua- tion. As afinidades dos anticorpos são resumidas na Tabela 5 abaixo. As afinidades do trastuzumabe e pertuzumabe foram de 1,94 nM e 1,89 nM, respectivamente, en-quanto que a afinidade do anticorpo 1E11 desenvolvido foi de 16,0 nM. A afinidade do anticorpo humanizado 1E11 foi de 10,4 nM, não mostrando quase nenhuma dife-rença em relação ao anticorpo 1E11 existente. TABELA 5

[0160]O efeito anticâncer de hz1E11, o anticorpo humanizado desenvolvido de 1E11, foi confirmado nas linhagens de células de câncer de estômago humano NCI-N87 e OE-19, as quais superexpressam HER2 (Figura 8). O tratamento único com hz1E11 em células NCI-N87 revelou uma diminuição na taxa de sobrevida ao câncer, similar àquela do tratamento com trastuzumabe, enquanto que o tratamento combinado com hz1E11 e trastuzumabe mostrou uma diminuição significativamente maior na taxa de sobrevida ao câncer comparado com o tratamento único com qualquer um dos anticorpos (Figura 8A). Adicionalmente, o tratamento combinado com hz1E11 e trastuzumabe em OE-19, uma linhagem de células de câncer de estômago humano diferente, mostrou uma queda maior na taxa de sobrevida ao câncer com-parado com o tratamento único com um ou outro anticorpo (Figura 8B). Além disso, o tratamento combinado com hz1E11 e trastuzumabe mostrou um efeito inibidor um pouco maior do que o tratamento combinado com 1E11 e trastuzumabe (Figura 2A) contra a proliferação de células cancerosas (Figura 8A). O tratamento combinado com hz1E11 e trastuzumabe mostrou um efeito inibidor superior na linhagem de células NCI-N87 OE-19 do que o tratamento combinado com trastuzumabe e pertuzu- mabe contra a proliferação de células cancerosas.

[0161]Os resultados acima indicam que o hz1E11, o anticorpo humanizado desenvolvido de 1E11, tem uma capacidade de ligação igual e um efeito anticâncer um pouco aprimorado comparado com o 1E11 convencional.

[0162]O efeito anticâncer do tratamento combinado com hz1E11, o anticorpo humanizado desenvolvido de 1E11, juntamente com o trastuzumabe foi confirmado em um modelo de xenoenxerto usando NCI-N87. Os camundongos tendo um câncer formado por meio de transplante de NCI-N87 foram injetados intraperitonealmente duas vezes por semana com o anticorpo desenvolvido e um grupo de controle de isotipo de trastuzumabe, hz1E11, trastuzumabe e uma combinação de hz1E11 e trastuzumabe, respectivamente. Ao grupo de controle de isotipo e trastuzumabe foi administrada uma dose de 10 mg/kg. No caso de um tratamento combinado, hz1E11 e trastuzumabe foram misturados em uma proporção de 1:1 e administrados em uma dose de 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg e 10 mg/kg com base em cada um dos anticorpos. O tratamento combinado com hz1E11 e trastuzumabe mostrou uma diminuição no crescimento de câncer de um modo dependente da dose (Figura 9). O efeito anticâncer observado com a administração de 10 mg/kg de trastuzumabe foi também observado com a administração de 1 mg/kg de hz1E11 ou trastuzumabe. Foi demonstrado que a administração de hz1E11 e trastuzumabe em uma dose maior do que 5 mg/kg não apenas inibe o crescimento de câncer, mas também diminui o câncer já formado.

EXEMPLO 13: CONFIRMAÇÃO DA REGIÃO DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS DESENVOLVIDOS

[0163]De modo a confirmar a região importante dos anticorpos desenvolvi-dos para a ligação aos antígenos, um ensaio de varredura de alanina, o qual examina a capacidade de ligação ao trocar os aminoácidos que correspondem à CDR3 de cadeia pesada e cadeia leve por alanina, foi realizado. Histidina (H), leucina (L), gli- cina (G), glicina (G), treonina (T) e serina (S) entre a região CDR3 de cadeia pesada, os quais correspondem a 95, 96, 97, 98, 99 e 100a de acordo com a numeração de Kabat, e glutamina (Q), glutamina (Q), leucina (L), tirosina (Y), serina (S) e treonina (T) entre a região CDR3 de cadeia leve, os quais correspondem a 89, 90, 91, 92, 93 e 94a de acordo com a numeração de Kabat, foram trocados por alanina usando o kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, #200518). Entre a CDR3 de cadeia pesada, A100 foi excluído do ensaio porque o anticorpo desenvolvido tem alanina. Após expressão de cada um dos anticorpos modificados em bactérias, sua expressão foi confirmada através de um dot-blot após obtenção de um extrato peri- plásmico dos mesmos e a capacidade de ligação foi analisada em relação à HER2- ECD por meio do ensaio ELISA (vide Figura 10). TABELA 6

[0164]Conforme pode ser visto na Tabela 6 e Figuras 10A e 10B, os anticor-pos modificados foram expressos em um nível similar, enquanto que G98A da cadeia pesada mostrou uma perda completa de sua capacidade de ligação e G97A de cadeia pesada mostrou uma diminuição acentuada em sua capacidade de ligação. A troca em outras regiões não mostra qualquer efeito perceptível sobre a ligação antí- geno-anticorpo.

EXEMPLO 14: APRIMORAMENTO DE AFINIDADES DOS ANTICORPOS DESENVOLVIDOS

[0165]De modo a melhorar as afinidades dos anticorpos desenvolvidos, uma biblioteca com CDR3 randomizada da cadeia leve e da cadeia pesada foi desenvol-vida. F, D, e Y entre a CDR3 de cadeia pesada, os quais correspondem a F100b, D101 e Y102, os números de aminoácidos de acordo com a numeração de Kabat, e P, W e T entre a CDR3 de cadeia leve, os quais correspondem a P95, W96 e T97 de acordo com a numeração de Kabat, foram excluídos da randomização porque eles são comumente aminoácidos descobertos em anticorpos humanos. Uma biblioteca de fagos de anticorpos com 20 aminoácidos randomizados de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve, excluindo os aminoácidos descritos na tecnologia acima, foi desenvolvida (Phage Display: A Laboratory Manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Em particular, os iniciadores usados acima se referem à região que corresponde à CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve e foram sintetizados de modo que adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T) fossem misturadas em uma proporção igual para serem inseridos aleatoriamente nas primeira e segunda posições do códon que corresponde ao aminoácido a ser randomizado e guanina (G) ou citosina (C) foram misturados em uma proporção igual para serem inseridos na terceira posição.

[0166]De modo a selecionar os clones com afinidades aprimoradas a partir da biblioteca desenvolvida, a HER2-ECD-His foi biotinilada usando o kit EZ- EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation (Thermo Scientific, #21435) e usada como antígeno para a seleção de anticorpos. A biblioteca de fagos de anticorpos desenvolvidos e biotina- HER2-ECD-His foram deixados se ligar em temperatura ambiente durante 2 horas e os fagos ligados aos antígenos foram separados usando 50 μL de Dynabeads M-270 Streptavidin (Invitrogen, #65306). O processo de seleção acima foi realizado 4 vezes e as colônias que expressam anticorpos que se ligam à HER2-ECD entre as colônias assim selecionadas foram escolhidos através de um ensaio ELISA usando extratos periplásmicos e as sequências dos anticorpos expressos nas colônias selecionadas foram confirmadas por meio de análise de nucleotídeos. As sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve dos anticorpos que se ligam à HER2-ECD são resumidos nas Tabelas 7 e 8 abaixo. O número 1 em cada Tabela representa a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve do hz1E11. TABELA 7

[0167]Sequências de CDRH3 de mutantes selecionados a partir do processo de aprimoramento de afinidade

TABELA 8 Sequências de CDRL3 de mutantes selecionados a partir do processo de aprimoramento de afinidade

[0168]De modo a selecionar clones com melhor Koff entre os clones selecio-nados, os clones foram analisados através do Biacore 3000 (GE Healthcare). A HER2-ECD-His foi imobilizada a um chip sensor CM5 através de um método de acoplamento de amina usando ECD/NHS. Após expressão do anticorpo a partir de cada clone usando IPTG, um extrato periplásmico foi obtido a partir do mesmo e dei-xado se ligar à HER2-ECD-His. O valor de Koff para cada anticorpo foi analisado por meio do software BIAevaluation. Com base no exposto, foram selecionados os anti-corpos com valor de Koff aprimorado (vide: Tabela 9a). a Tabela 9a descreve os exemplos representativos dos clones com valores de Koff similares ou aprimorados comparado com o anticorpo parental hz1E11 dentre os clones desenvolvidos pelos presentes inventores. TABELA 9a

[0169]Conforme pode ser visto na Tabela 9a, várias CDRH3s representadas pela fórmula geral 1 e CDRL3s representadas pela fórmula geral 2 da presente in-venção mostram valores de Koff similares ou aprimorados comparado com CDRH3 e CDRL3 do anticorpo parental, hz1E11.

[0170]Dentre a sequência de CDR3 randomizada de cadeia leve, experimen-tos foram realizados usando hz1E11-3, hz1E11-133 e hz1E11-154.

[0171]As regiões variáveis de cadeia pesada de hz1E11-3, hz1E11-133 e hz1E11-154 foram as mesmas conforme aquela do hz1E11 e a sequência de ami- noácidos das regiões variáveis de cadeia leve estão descritas em SEQ ID NOS: 247, 249 e 251, respectivamente.

[0172]De modo a confirmar o aumento de afinidades dos 3 tipos de anticor-pos selecionados, os anticorpos foram produzidos na forma de IgG. A IgG de cabra anti-humana (Invitrogen, #H10500), em uma concentração de 2000 RU, foi imobili-zada a um chip sensor CM5 através de ECD/NHS. Então, os anticorpos foram dei-xados se ligar em uma taxa de 50 μL/min durante 5 minutos e tampão deixado fluir sobre os mesmos durante 5 minutos para fins de estabilização. As concentrações dos anticorpos usados para ligação dos anticorpos foram de 0,4 μg/mL para o Tras- tuzumabe (TRA), 0,8 μg/mL para o pertuzumabe (PER) e 1 μg/mL para hz1E11 e os anticorpos selecionados. Após estabilização dos anticorpos, a proteína HER2-ECD- His em concentrações de 640 nM, 320 nM, 160 nM, 80 nM, 40 nM, 20 nM e 0 nM foi deixada se ligar em uma taxa de 50 μL/min durante 4 minutos e tampão deixado fluir sobre a mesma durante 15 minutos para separar. Após análise de cada uma das concentrações, eles foram recicladas usando glicina a 10 mM (pH de 1,5) e os en-saios subsequentes realizados. As afinidades dos anticorpos foram analisadas pelo software BIAevaluation. Os resultados da análise estão resumidos na Tabela 9b. TABELA 9b

[0173]Na Tabela 9b acima, ka, kd, Rmax e KD indicam, respectivamente, a constante de taxa de associação, a constante de taxa de dissociação, a capacidade máxima de ligação e constante de dissociação em equilíbrio.

[0174]Conforme pode ser visto na Tabela 9b, hz1E11-133 e hz1E11-154 mostraram uma redução de 8,4 vezes no valor de Koff, ou seja, valores de Kd, comparado com aqueles de hz1E11, enquanto que eles mostraram pouco aumento do valor de Kon, ou seja, o valor de Ka. Conclusivamente, em relação à afinidade final, hz1E11-133 mostrou 1,5 nM e hz1E11-154 mostrou 1,1 nM, os quais foram um aprimoramento de 15 vezes e um aprimoramento de 20 vezes comparado com aquele do hz1E11.

EXEMPLO 15: CONFIRMAÇÃO DE EFEITOS ANTICÂNCER DE ANTICORPOS COM AFINIDADES APRIMORADAS

[0175]Os efeitos anticâncer dos anticorpos com afinidades aprimoradas fo-ram confirmados em relação ao câncer de estômago e câncer de mama que supe- rexpressam HER2. As taxas de sobrevivência de células cancerosas quando NCI- N87 e OE-19, linhagens de células de câncer de estômago que superexpressam HER2, BT-474, uma linhagem de células de câncer de mama que superexpressa HER2 tratadas com um tratamento único por cada anticorpo individual ou um tratamento combinado junto com trastuzumabe, de acordo com a concentração, foram analisadas.

[0176]Conforme pode ser visto nas Figuras 11A a 11F, os anticorpos hz1E11-3, hz1E11-133 e hz1E11-154 com afinidades aprimoradas mostraram efeitos aprimorados em tratamento único e tratamento combinado comparado com aqueles do hz1E11.

[0177]Tendo descrito uma modalidade preferida da presente invenção, deverá ser entendido que variantes e modificações da mesma que caem dentro do espírito da invenção podem se tornar evidentes para aqueles versados na técnica e o âmbito da presente invenção deve ser determinado pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

Claims (13)

1. Anticorpo do receptor 2 de fator de crescimento epidérmico humano (HER2) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região deter-minante de complementaridade (CDR) H1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6; (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:218; (iii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:239; (iv) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:88; (v) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6; (vi) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6; (vii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 84 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6; (viii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6; (ix) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:222; (x) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:156; (xi) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:109; (xii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:157; (xiii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 67 e uma região vari- ável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:154; (xiv) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:220; (xv) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:178; (xvi) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6; (xvii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 71 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:155; (xviii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:131; (xix) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 71 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6; ou (xx) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 1, CDRH2 de SEQ ID NO: 2 e CDRH3 de SEQ ID NO: 83 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 e CDRL3 de SEQ ID NO:6.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a CDRH3 compreende a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 43, 64, 67, 71, 76, 83, 84 ou 85.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a CDRH3 compreende a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende CDRL1 de SEQ ID NO: 4 e CDRL2 de SEQ ID NO: 5.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a CDRL3 compreende a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6, 88, 109, 131, 155, 156, 157, 178, 218, 220, 222 ou 239.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a CDRL3 compreende a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6, 88, 218 ou 239.

7. Composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de um câncer CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) uma quantidade farmaceuti- camente eficaz do anticorpo de HER2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende ainda trastuzumabe.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é câncer de mama, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de brônquio, câncer de nasofaringe, câncer de laringe, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer cervical, câncer cerebral, câncer de próstata, câncer ósseo, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer de tiroide, câncer de paratiroide ou câncer ureteral.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é câncer de mama ou câncer de es-tômago.

11. Composição farmacêutica para indução de apoptose CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anti-corpo para HER2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) um veículo farmaceuticamente acei-tável.

12. Kit para o diagnóstico de um câncer CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o anticorpo para HER2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

13. Uso do anticorpo para HER2 ou de um fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e de um veículo farmaceuticamente aceitável, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de um câncer e/ou para indução de apoptose.

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