ES2710707T3

ES2710707T3 - Anticuerpo que se une específicamente a HER2

Info

Publication number: ES2710707T3
Application number: ES14798440T
Authority: ES
Inventors: Jong-Seo Lee; Kyu-Tae Kim; Young-Ha Lee; Sook-Yeon Lee; In-Sik Hwang; Bong-Kook Ko
Original assignee: AbClon Inc
Current assignee: AbClon Inc
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2034-05-14
Also published as: BR112015027400B1; AU2014266118A1; CN105164160A; RU2628094C2; MX2015015110A; US20160053011A1; JP6234548B2; JP2016518368A; EP2998319A4; EP2998319A1; CA2910407C; EP2998319B1; BR112015027400A2; HK1217500A1; CN105164160B; JP2018008954A; CA2910407A1; US10174116B2; AU2014266118B2; RU2015146664A

Abstract

Un anticuerpo contra el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende una región determinante de complementariedad (CDR)H1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6; (ii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:218; (iii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:239; (iv) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:88; (v) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:76 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6; (vi) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:43 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6; (vii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:84 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6; (viii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:85 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6; (ix) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:76 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:222; (x) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:67 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:156; (xi) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:109; (xii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:76 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:157; (xiii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:67 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:154; (xiv) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:220; (xv) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:64 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:178; (xvi) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:64 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6; (xvii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:71 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:155; (xviii) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:131; (xix) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:71 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6 o (xx) una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:83 y una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpo que se une espedficamente a HER2

Campo de la invencion

La presente invencion se realizo con el apoyo del Korea Institute for the Advancement of Technology bajo la subvencion 1415118385 desde el 1 de noviembre de 2011 hasta el 1 de octubre de 2014 y la gestion del Equipo de Apoyo para la Cooperacion Internacional del KIAT, titulada "International Cooperation Technology Development Works and Innovative Epitope Discovery Platform Technology-Based Global Antibody New Drug Development", realizado por AbClon, Inc.

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente coreana N.° 10-2013-0055912, presentada el 16 de mayo de 2013, en la Oficina de la Propiedad Intelectual de la Republica de Corea.

La presente invencion se refiere a anticuerpos contra HER2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano) para prevenir o tratar enfermedades relacionadas con HER2, particularmente, canceres.

Descripcion de la tecnica relacionada

El gen HER2/neu(ErbB2) codifica una glucoprotema transmembrana de 185 kDa, que es uno de los miembros de la familia de EGFR (receptores del factor de crecimiento epidermico). La protema HER2 consiste en un dominio extracelular con 620 residuos de aminoacidos, un dominio transmembrana con 23 residuos de aminoacidos y un dominio intracelular que tiene actividad tirosina cinasa con 490 residuos de aminoacidos (Akiyama T, et al., Science, 232(4758):1644-1646(1986)).

Ademas, los anticuerpos contra HER2 con diversas caractensticas se describen en una serie de documentos: Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); el documento WO94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Research. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res.

54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); patente de Estados Unidos n.° 5.783.186; Kao et al., publicacion estadounidense n.° 2009/0285837 (2009); Ross et al., The Oncologist 8:307-325 (2003) y Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997).

Entre los anticuerpos contra HER2, trastuzumab como el anticuerpo de mayor exito comercial (comercializado como Herceptin™, patente de Estados Unidos n.° 5.821.337) se ha estudiado intensivamente: Sapino, A., et al., Annals of Oncology (2007) 18: 1963-1968; Bussolati, G, et al., British Journal of Cancer (2005) 92, 1261-1267; y Glazyrin A, et al., J Histology & Cytochemistry (2007) 55(1):25-33.

A pesar de que el trastuzumab ha tenido exito comercial, es probable que este anticuerpo muestre eficacia terapeutica en solo el 15 % de los pacientes con cancer de mama que sobreexpresan HER2. Por lo tanto, se han realizado intentos para mejorar el pronostico de los pacientes con cancer que no responden o que responden mal al trastuzumab mediante una terapia de combinacion, en el contexto de mejorar el alcance o el espectro de eficacias de trastuzumab.

Por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2011-0086004 divulga una terapia combinada contra el cancer con trastuzumab e IL-21. La publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2012-0107270 describe el trastuzumab en combinacion con anticuerpo dirigido a tenascina-C conjugado con IL-2. La publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005-0101618 divulga una terapia contra el cancer con trastuzumab y ligando erbB2. La publicacion de solicitud de patente europea n.° 2134364 divulga la inhibicion de la proliferacion de celulas cancerosas por trastuzumab en combinacion con inhibidores de la telomerasa. El documento WO 2008/031531 describe que el trastuzumab en combinacion con pertuzumab puede suprimir la metastasis del cancer.

El documento WO 2012/143523 divulga anticuerpos biespedficos que comprenden regiones de union a antfgeno a dos epttopos diferentes del receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2) y composiciones y moleculas relacionadas basadas en anticuerpos. Tambien se divulgan composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos y metodos de preparacion y uso de los anticuerpos.

PROBLEMAS TECNOLOGICOS A RESOLVER

Los inventores de la presente invencion han realizado investigaciones intensivas para desarrollar anticuerpos capaces de prevenir o tratar enfermedades relacionadas con HER2, particularmente canceres (mas particularmente cancer de mama y cancer de estomago). En particular, los inventores de la presente invencion han realizado investigaciones intensivas para desarrollar anticuerpos en combinacion con trastuzumab capaces de superar las limitaciones en eficacias antineoplasicas asociadas con el tratamiento con trastuzumab como agente unico. Como resultado, los inventores de la presente invencion han desarrollado anticuerpos novedosos que tienen eficacias antineoplasicas significativas per se, y eficacias mucho mas altas en combinacion con trastuzumab para la prevencion o el tratamiento de canceres (particularmente cancer de mama y cancer de estomago, y mas particularmente cancer de mama y cancer de estomago que expresan HER2).

La presente invencion proporciona anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, composiciones farmaceuticas, anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos para su uso en la prevencion o el tratamiento de un cancer, composiciones farmaceuticas para su uso en la prevencion o el tratamiento de un cancer, composiciones farmaceuticas para su uso en la induccion de apoptosis, y kits para su uso en el diagnostico de un cancer, como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Por consiguiente, Un objetivo de esta invencion es proporcionar un anticuerpo contra el receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2) o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende:

(i) una region variable de cadena pesada que comprende una region determinante de complementariedad (CDR)H1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6;

(ii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:218;

(iii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:239;

(iv) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:88;

(v) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:76 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6;

(vi) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:43 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6;

(vii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:84 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6;

(viii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:85 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6;

(ix) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:76 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:222;

(x) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:67 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:156;

(xi) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:109;

(xii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:76 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:157;

(xiii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:67 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:154;

(xiv) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y Cd Rh3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:220;

(xv) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:64 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:178;

(xvi) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y Cd Rh3 de SEQ ID NO:64 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6;

(xvii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:71 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:155;

(xviii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:131;

(xix) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y Cd Rh3 de SEQ ID NO:71 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6 o

(xx) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 de SEQ ID NO:83 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6.

Se divulga una molecula de acido nucleico que codifica el presente anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antfgeno del mismo.

Se divulga un vector recombinante que porta la molecula de acido nucleico.

Se divulga una celula huesped transfectada con el vector recombinante.

Es otro objetivo de esta invencion proporcionar una composicion farmaceutica para su uso en la prevencion o el tratamiento de un cancer, que comprende: (a) una cantidad farmaceuticamente eficaz del anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antfgeno del mismo de la invencion, y (b) un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

Es otro objetivo mas de esta invencion proporcionar una composicion farmaceutica para su uso en la induccion de apoptosis, que comprende: (a) una cantidad farmaceuticamente eficaz del anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antfgeno del mismo de la invencion; y (b) un vetnculo farmaceuticamente aceptable.

Otros objetivos y ventajas de la presente invencion se haran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada tomada junto con las reivindicaciones y dibujos adjuntos.

Descripcion detallada de esta invencion

Se divulga un anticuerpo contra el receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2) o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende una region determinante de complementariedad (CDR)H1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y CDRH3 representada por la siguiente formula 1; y (b) una region variable de cadena ligera:

Xⁱ-X²-X^a-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-Phe-Asp-Tyr (1)

en la que X ⁱrepresenta His, Asn, Ser o Ala; X²representa Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn, Ile o Ala; X³representa Gly o Cys; X⁴representa Gly o Ser; X⁵representa Thr, Met o Ala; X⁶representa Ala, Ser, Gly o Thr; y X⁷representa Ser, Ala, Cys o Thr.

El anticuerpo de esta invencion tiene una capacidad de union espedfica a HER2. En particular, el presente anticuerpo se une a un epftopo en HER2 diferente de un epttopo al que esta unido el trastuzumab.

El termino usado en el presente documento "trastuzumab" se refiere a un anticuerpo divulgado en la patente de Estados Unidos n.° 5.821.337.

El anticuerpo de la invencion muestra efectos de citotoxicidad o inhibicion de la proliferacion contra diversas celulas cancerosas que expresan HER2. No se pretende establecer una distincion entre los terminos "citotoxicidad" e "inhibicion de la proliferacion" junto con las celulas cancerosas, y estos terminos se usan indistintamente en el presente documento.

El termino usado en el presente documento "anticuerpo" se refiere a anticuerpos espedficos para HER2 que incluyen un anticuerpo completo asf como cualquier fragmento de union a antigeno de anticuerpos.

El anticuerpo completo incluye dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, y cada cadena ligera esta unida a la cadena pesada mediante un enlace disulfuro. La region constante de cadena pesada incluye cinco isotipos diferentes (y, |j, a, 8 y £) que se clasifican en subgrupos de ^y1, ^y2, ^y3, ^y4, a1 y a2. La region constante de cadena ligera incluye dos isotipos diferentes (k y A) (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Capttulo 45, pags. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2a Ed., Capftulo 4, pags. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

Fragmento de union a antfgeno se refiere a cualquier fragmento de anticuerpo capaz de unirse a un antfgeno incluyendo Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv y asf sucesivamente. Fab tiene un sitio de union a antfgeno que esta compuesto por dominios variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo, un dominio constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CHi) de cadena pesada. Fab' es diferente de Fab en el sentido de que hay una region bisagra que contiene uno o mas residuos de cistema en el extremo C del dominio CHi de cadena pesada. El anticuerpo F(ab')2 se produce formando un enlace disulfuro entre los residuos de cistema de la region bisagra de Fab'. Fv es un fragmento de anticuerpo mmimo compuesto por regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, y la tecnica recombinante para preparar un fragmento Fv se divulga en los documentos PCT WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 y WO 88/09344. En el bicatenario, las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera estan unidas por un enlace no covalente, y en el Fv monocatenario, las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera estan generalmente unidas por un enlace covalente a traves de un enlazador peptfdico o unidas directamente entre sf en el extremo C, formando un dfmero como el Fv bicatenario. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando enzimas proteolfticas (por ejemplo, un anticuerpo completo se digiere con papama para producir fragmentos Fab, y el tratamiento con pepsina da como resultado la produccion de fragmentos F(ab')2), y se pueden preparar mediante tecnicas de recombinacion genetica.

De acuerdo con una realizacion, el anticuerpo de esta invencion incluye anticuerpos Fab y anticuerpos completos. Ademas, la region constante de cadena pesada se selecciona de los isotipos que consisten en ^y, j , a, 8 o e. Preferentemente, la region constante de cadena pesada incluye los isotipos ^y1, ^y3 y ^y4, de la forma mas preferente el isotipo y1. La region constante de cadena ligera puede ser el isotipo k y A, preferentemente, el isotipo k. Por lo tanto, una realizacion preferible del presente anticuerpo es un anticuerpo Fab o IgG1 que comprende una cadena ligera k y una cadena pesada y1.

La expresion "cadena pesada" usada en el presente documento se refiere tanto a una cadena pesada de longitud completa como a su parte, que incluye el dominio variable (V^h) que contiene la secuencia de aminoacidos de una secuencia de region variable para unirse espedficamente al antfgeno y tres dominios constantes (Cm, C^h2 y C^h3). La expresion "cadena ligera" usada en el presente documento se refiere tanto a una cadena ligera de longitud completa como a su parte, que incluye el dominio variable (Vl) que contiene la secuencia de aminoacidos de una secuencia de region variable para unirse espedficamente al antfgeno y un dominio constante (C^l).

La expresion usada en el presente documento "CDR (region determinante de complementariedad)" se refiere a una secuencia de aminoacidos de regiones hipervariables de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a edicion, Departamento de salud y servicios humanos de Estados Unidos, Institutos Nacionales de Salud (1987)). Cada una de las cadenas pesada y ligera comprende tres CDR (cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRh3) y cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRl3)). La CDR proporciona residuos de contacto que desempenan un papel crucial en la union del anticuerpo a un antfgeno o epftopo.

En el anticuerpo divulgado, CDRH3 esta representada por la formula 1.

En la formula 1, X1 representa His, Asn, Ser o Ala; espedficamente His, Asn o Ser; mas espedficamente His o Asn; aun mas espedficamente His.

En la formula 1, X2 representa Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn, Ile o Ala; espedficamente Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn o Ile; mas espedficamente Leu, Phe o Tyr; aun mas espedficamente Leu.

En la formula 1, X3 representa Gly o Cys; espedficamente Gly.

En la formula 1, X4 representa Gly o Ser; espedficamente Gly.

En la formula 1, X5 representa Thr, Met o Ala; espedficamente Thr.

En la formula 1, X6 representa Ala, Ser, Gly o Thr; espedficamente Ala.

En la formula 1, X7 representa Ser, Ala, Cys o Thr; espedficamente Ser.

De acuerdo con una divulgacion, Xi representa His, Asn o Ser; X2 representa Leu, Phe o Tyr; X3 representa Gly; X4 representa Gly; X5 representa Thr, Met o Ala; X6 representa Ala, Ser, Gly o Thr; y X7 representa Ser, Ala, Cys o Thr. Mas espedficamente, Xi representa His, Asn o Ser; X2 representa Leu, Phe o Tyr; X3 representa Gly; X4 representa Gly; X5 representa Thr; X6 representa Ala; y X7 representa Ser.

Aun mas espedficamente, CDRH3 comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de las SEQ ID NO:3, 27-28, 32 y 39-86; aun mucho mas espedficamente, CDRH3 comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO:3, 43, 64, 67, 71, 76, 83, 84 u 85; de la forma mas espedfica, la SEQ ID NO:3.

De acuerdo con una divulgacion, la region variable de cadena ligera comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 representada por la siguiente formula 2:

Y1 -Y 2-Y 3-Y 4-Y 5-Y 6-Pro-Trp-Thr (2)

en la que Yi representa Gln, Asp o Ala; Y2 representa Gln, Asn, Glu o Ala; Y3 representa Leu, Met, Asn, Ile, Ser, Thr, Ala o Lys; Y4 representa Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gli, Met o Phe; Y5 representa Ser, Phe, Tyr, Arg, Ile, Gli, Lys, Asn, Val o Ala; y Y6 representa Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gli, Asn, Glu, Phe o Leu.

En la formula 2, Yi representa Gln, Asp o Ala; espedficamente Gln o Asp; mas espedficamente Gln.

En la formula 2, Y2 representa Gln, Asn, Glu o Ala; espedficamente Gln, Asn o Glu; mas espedficamente Gln. En la formula 2, Y3 representa Leu, Met, Asn, Ile, Ser, Thr, Ala o Lys; espedficamente Leu, Met, Asn, Ile, Ser o Thr; mas espedficamente Leu, Met, Asn o Ile; aun mas espedficamente Leu o Met; de la forma mas espedfica, Leu. En la formula 2, Y4 representa Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gli, Met o Phe; espedficamente Tyr o Ala.

En la formula 2, Y5 representa Ser, Phe, Tyr, Arg, Ile, Gli, Lys, Asn, Val o Ala; espedficamente Ser, Phe, Tyr, Arg o Ile; mas espedficamente Ser, Phe o Tyr.

En la formula 2, Y6 representa Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gli, Asn, Glu, Phe o Leu; espedficamente Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly o Asn; mas espedficamente Thr, Ser o Ala.

De acuerdo con una divulgacion, Yi representa Gln o Asp; Y2 representa Gln; Y3 representa Leu, Met, Asn, Ile, Ser o Thr; Y4 representa Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gli, Met o Phe; Y5 representa Ser, Phe, Tyr, Arg o Ile; y Y6 representa Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly o Asn.

Mas espedficamente, CDRL3 comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO:6, 33-38 u 87-245; aun mas espedficamente, CDRL3 comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO:6, 88, i09, 13 i, i55, i56, i57, 178, 2i8, 220, 222 o 239; de la forma mas espedfica, las SEQ ID NO:6, 88 (hziE ii-3), 2 i8 (h z iE ii- i33 ) o 239 (hz1E11-154).

De acuerdo con una divulgacion, la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO:8 (1E11) o 24 (hz iE ii).

De acuerdo con una divulgacion, la region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO:10 (1E11), 26 (h z iE ii), 247 (hz1E11-3), 249 (hz1E11-133) o 251 (hz1E11-154).

Como se demuestra en los ejemplos, mientras que el anticuerpo de la presente invencion esta unido espedficamente al subdominio 4 entre los dominios extracelulares de HER2, el presente anticuerpo esta unido a un epftopo en el subdominio 4 que es diferente de un epttopo de trastuzumab.

El anticuerpo contra HER2 divulgado o su fragmento de union a antfgeno incluye variantes de las secuencias de aminoacidos expuestas en la lista de secuencias adjunta, siempre que sean capaces de reconocer espedficamente HER2. Por ejemplo, las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos pueden alterarse para mejorar la afinidad de union y/o las otras caractensticas biologicas de los anticuerpos. Por ejemplo, dichas alteraciones incluyen delecion, insercion y/o sustitucion de residuos de aminoacidos de anticuerpos.

Dichas variaciones de aminoacidos pueden proporcionarse basandose en una similitud relativa de cadenas laterales de aminoacidos, por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilidad, carga y tamano. Mediante el analisis de tamano, forma y tipo de las cadenas laterales de aminoacidos, podna quedar claro que todos los residuos de arginina, lisina e histidina son aquellos que tienen carga positiva; alanina, glicina y serina tienen un tamano similar; fenilalanina, triptofano y tirosina tienen una forma similar. Por consiguiente, basandose en estos factores considerables, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptofano y tirosina pueden considerarse biologicamente equivalentes funcionales.

Para introducir variaciones, se puede considerar un mdice hidropatico de aminoacidos. Basandose en la hidrofobicidad y la carga, se adjudica el mdice hidropatico a cada aminoacido: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Para proporcionar una funcion biologica interactiva de las protemas, el mdice hidropatico del aminoacido es muy importante. Es bien conocido por un experto en la materia que las variantes pueden poseer una actividad biologica similar solo cuando las protemas se reemplazan con aminoacidos que tienen un mdice hidropatico similar. Cuando se introducen variaciones basadas en el mdice hidropatico, la sustitucion se realiza preferentemente entre residuos de aminoacidos que tienen no mas de ±2 de diferencia en los valores del mdice hidropatico, mas preferentemente dentro de ±1, mucho mas preferentemente dentro de ±0,5.

Tambien sena obvio para los expertos en la materia que las sustituciones de aminoacidos con otros aminoacidos que tienen valores de hidrofilidad similares pueden dar como resultado la generacion de variantes que tienen actividades biologicamente equivalentes. Como se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 4.554.101, a cada residuo de aminoacido se le asignan los siguientes valores de hidrofilidad: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina ( 0,5±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cistema (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

Cuando se pretende que las variaciones se introduzcan en funcion del valor de hidrofilidad, la sustitucion se realiza preferentemente entre residuos de aminoacidos que tienen no mas de ±2 de diferencia en los valores de hidrofilidad, mas preferentemente dentro de ±1, mucho mas preferentemente dentro de ±0,5.

La alteracion de residuos de aminoacidos sin alterar sustancialmente la actividad de la protema es bien conocida por un experto en la materia (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nueva York, 1979). Dicha alteracion de aminoacidos incluye sustituciones de Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, pero sin limitarse a las mismas. Considerando las variaciones mencionadas anteriormente que tienen actividades biologicamente equivalentes, podna entenderse que el anticuerpo o el acido nucleico que lo codifica incluye secuencias sustancialmente identicas a las secuencias expuestas en la lista de secuencias adjunta. Las secuencias sustancialmente identicas se refieren a aquellas que muestran preferentemente al menos el 61 %, mas preferentemente al menos del 70 %, aun mas preferentemente al menos el 80 %, de la forma mas preferente al menos el 90 % de similitud de nucleotidos con las secuencias de la lista de secuencias adjunta, segun se mide usando uno de los algoritmos de comparacion de secuencias usados convencionalmente. Los metodos de alineacion de secuencias para comparacion son bien conocidos en la tecnica. Se describen diversos programas y algoritmos de alineacion en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman y Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson y Lipman, Methods in Mol. Biol.

24: 307-31(1988); Higgins y Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992); y Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994)). La Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol.

215:403-10 (1990)) esta disponible a partir de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional de Informacion Biologica (NBCI, Bethesda, Md.) y en Internet, para su uso en relacion con los programas de analisis de secuencias para blastp, blasm, blastx, blastn y tblastx. Se puede acceder en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Una descripcion de como determinar la identidad de secuencia usando este programa esta disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BI-AST/blast help.html.

El anticuerpo de la presente invencion incluye, pero sin limitacion, anticuerpo monoclonal, anticuerpo multiespedfico, anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimerico, Fv monocatenarios (scFV), anticuerpo monocatenario, fragmento Fab, fragmento F(ab'), anticuerpo Fv unido a disulfuro (sdFV) y anti-idiotipo (anti-Id), y un fragmento de union a epftopo del mismo.

Las secuencias de CDR de los presentes anticuerpos exhiben una baja similitud con las secuencias de CDR de anticuerpos conocidos publicamente, lo que refiere que las secuencias de CDR son unicas. Por ejemplo, los anticuerpos divulgados en las patentes de Estados Unidos n.°. 7.329.737 y 7.993.646 que tienen la mayor similitud con los anticuerpos presentes en la busqueda de BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) muestran una similitud de menos del 50 % con las secuencias de CDR del anticuerpo 1E11, un anticuerpo originales, y ademas estan unidos a hK-1 que es diferente de la diana de los presentes anticuerpos.

Por consiguiente, las secuencias de aminoacidos de los presentes anticuerpos pueden considerarse novedosas y unicas.

Se divulga una molecula de acido nucleico que codifica el presente anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo.

La expresion usada en el presente documento "molecula de acido nucleico" se refiere de manera exhaustiva a una molecula de ADN (ADNg y ADNc) o ARN, y los nucleotidos basicos de la molecula de acido nucleico tambien incluyen analogos con azucar o base modificada, as ^como nucleotidos naturales (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York (1980); Uhlman y Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)). La secuencia de la molecula de acido nucleico divulgada que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera podna modificarse. Dicha modificacion incluye adicion, delecion o sustitucion no conservativa o conservativa del nucleotido.

De acuerdo con una divulgacion, la molecula de acido nucleico que codifica la region variable de cadena pesada comprende una secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO:7 o 23.

De acuerdo con una divulgacion, la molecula de acido nucleico que codifica la region variable de cadena ligera comprende una secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO:9, 25, 246, 248 o 250.

La molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo contra HER2 divulgado tambien incluye una secuencia de nucleotidos que comparte una homologfa sustancial con la secuencia de nucleotidos anterior. La homologfa sustancial significa la secuencia de nucleotidos que comparte una homologfa de al menos el 80 %, mas preferentemente el 90 % y de la forma mas preferente el 95 % mediante el analisis de alineacion de secuencias usando la alineacion maxima entre la secuencia de nucleotidos divulgada y otras secuencias aleatorias y algoritmos conocidos habitualmente por los expertos en la materia.

Se divulga un vector recombinante que comprende la molecula de acido nucleico descrita anteriormente.

El termino usado en el presente documento "vector" es una herramienta para expresar un gen diana en una celula huesped, incluyendo un vector plasmfdico; un vector cosmfdico; y un vector viral tal como un vector de bacteriofago, un vector de adenovirus, un vector de retrovirus y un vector de virus adenoasociado.

De acuerdo con una divulgacion, las moleculas de acido nucleico que codifican las regiones variables de cadenas ligera y pesada estan unidas operativamente a un promotor.

La expresion usada en el presente documento "unido operativamente" se refiere al enlace funcional entre una secuencia de control de la expresion de acido nucleico (por ejemplo, un promotor, secuencia senal o conjunto de sitios de union al factor de transcripcion) y una segunda secuencia de acido nucleico, en la que la secuencia de control de la expresion afecta a la transcripcion y/o traduccion del acido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Los vectores recombinantes divulgados pueden construirse mediante diversos metodos conocidos por los expertos en la materia y sus metodos practicos se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).

Tfpicamente, el vector divulgado puede construirse como vector de clonacion o de expresion. Ademas, el vector puede construirse usando una celula procariota o eucariota como celula huesped.

Por ejemplo, cuando el vector de expresion se construye para la celula huesped eucariota, puede usarse un promotor derivado del genoma de celulas de mairnfero (por ejemplo, promotor de metalotionema, promotor de pactina, promotor de hemoglobina humana y promotor de creatina de musculo humano) o virus de m ai^ero (por ejemplo, promotor tardm de adenovirus; promotor 7.5K del virus vaccinia, promotor de SV40, promotor de citomegalovirus, promotor tk del VHS, promotor del virus del tumor mamario de raton (VTMR), promotor LTR de VIH, promotor del virus Moloney, promotor del virus Epstein-Barr (VEB) y promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR)). El vector generalmente contiene una secuencia de poliadenilacion como terminador de la transcripcion.

El vector divulgado puede fusionarse con otras secuencias para purificar un anticuerpo expresado. Por ejemplo, una secuencia a fusionar incluye glutation-S-transferasa (Pharmacia, EE. UU.), protema de union a maltosa (NEB, EE. UU.), FLAG (IBI, EE. UU.) y 6x His (hexahistidina; Quiagen, EE. UU.) y asf sucesivamente.

Dado que la protema expresada por el vector divulgado es un anticuerpo, el anticuerpo expresado tambien podna purificarse en toda la columna de protema A de una manera facil sin secuencias aditivas para la purificacion.

El vector de expresion divulgado incluye un gen de resistencia a antibioticos conocido por los expertos en la materia como un marcador de seleccion, por ejemplo genes resistentes contra ampicilina, gentamicina, carbenicilina, cloranfenicol, estreptomicina, kanamicina, geneticina, neomicina y tetraciclina.

Se divulga una celula huesped transformada con el vector recombinante descrito anteriormente.

Las celulas huesped en las que el vector divulgado se clona y se expresa de forma estable y sucesiva, tambien utilizan cualquiera conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, celula huesped eucariota adecuada que incluye celulas COS7 (celulas de rinon de mono), celula NSO, SP2/0, celula CHO (ovario de hamster chino), W138, celula BHK (rinon de cna de hamster), MDCK, lmea celular de mieloma, celula HuT 78 y celula HEK-293, pero sin limitarse a las mismas.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica para prevenir o tratar un cancer, que comprende: (a) una cantidad farmaceuticamente eficaz del anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antigeno del mismo de la invencion; y (b) un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

Dado que la presente composicion farmaceutica comprende el anticuerpo contra HER2 de la presente invencion o su fragmento de union a antigeno como principio activo, las descripciones comunes entre ellos se omiten para evitar redundancias indebidas que conducen a la complejidad de esta memoria descriptiva.

Como se aborda en los ejemplos, el anticuerpo contra HER2 de la presente invencion en combinacion con trastuzumab destruye las celulas cancerosas (particularmente, celulas de cancer de mama, mas particularmente, celulas de cancer de mama que expresan HER2) con una citotoxicidad significativamente mejorada y, por lo tanto, muy eficaz en la terapia del cancer (particularmente, cancer de mama y cancer de estomago, mas particularmente, cancer de mama y cancer de estomago que expresan HER2). De acuerdo con una realizacion, la composicion farmaceutica comprende ademas trastuzumab.

El cancer que a prevenir o tratar mediante la presente composicion incluye diversos canceres conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de pulmon, cancer de hngado, cancer de bronquios, cancer nasofarmgeo, cancer de laringe, cancer pancreatico, cancer de vejiga, cancer colorrectal, cancer de colon, cancer de cuello uterino, cancer de cerebro, cancer de prostata, cancer de hueso, cancer de cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de tiroides, cancer de paratiroides o cancer ureteral. Espedficamente, el cancer a prevenir o tratar mediante la composicion es cancer que expresa HER2, mas espedficamente cancer de mama o cancer de estomago que expresa HER2.

En otro aspecto mas de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica para inducir apoptosis, que comprende: (a) una cantidad farmaceuticamente eficaz del anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antfgeno del mismo de la invencion; y (b) un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

De acuerdo con una realizacion, la composicion farmaceutica induce apoptosis para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa; en la que la enfermedad hiperproliferativa es cancer, hiperplasia, queloide, smdrome de Cushing, aldosteronismo primario, eritroplasia, policitemia vera, leucoplasia, cicatriz hiperplasica, liquen plano, lentiginosis, arteriosclerosis, ateroesclerosis, reestenosis o estenosis.

El vehnculo farmaceuticamente aceptable puede ser uno convencional para formulacion, incluyendo lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidon, caucho cultivable, fosfato de potasio, arginato, gelatina, silicato de potasio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabes, metilcelulosa, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceites minerales, pero sin limitarse a los mismos. La composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion puede incluir ademas un lubricante, un humectante, un edulcorante, un agente aromatizante, un emulsionante, un agente de suspension y un conservante. Los detalles de los vehnculos y formulaciones farmaceuticamente aceptables adecuados se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a edicion, 1995).

La composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion se puede administrar por via parenteral, por ejemplo, mediante por administracion intravenosa, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, local, nasal, pulmonar o rectal.

Una dosis adecuada de la composicion farmaceutica de la presente invencion puede variar dependiendo de los metodos de formulacion farmaceutica, los metodos de administracion, la edad del paciente, el peso corporal, el sexo, la gravedad de las enfermedades, la dieta, el momento de administracion, la via de administracion, la tasa de excrecion y la sensibilidad a la composicion farmaceutica. Preferentemente, la composicion farmaceutica de la presente invencion se administra con una dosis diaria de 0,0001-100 mg/kg (peso corporal). La expresion "cantidad farmaceuticamente eficaz" se refiere a una cantidad adecuada para prevenir o tratar el cancer.

De acuerdo con las tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, la composicion farmaceutica puede formularse con un vehnculo y/o excipiente farmaceuticamente aceptable, proporcionando finalmente varias formas que incluyen una forma de dosis unitaria y una forma de dosis multiples. La formulacion puede ser aceite o medio acuoso, resuspension o emulsion, extracto, polvo, supositorio, granulos, comprimido o capsula y comprender ademas dispersante o estabilizante.

El anticuerpo de la presente invencion puede usarse para diagnosticar trastornos, enfermedades o afecciones relacionados con la expresion de HER2.

En un aspecto adicional de esta invencion, se proporciona un kit para su uso en el diagnostico de un trastorno, enfermedad o afeccion relacionado con la expresion de HER2, que comprende el anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antigeno del mismo, de la invencion.

El trastorno, enfermedad o afeccion relacionado con la expresion de HER2 es particularmente cancer, por ejemplo, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de pulmon, cancer de dgado, cancer de bronquios, cancer nasofarmgeo, cancer de laringe, cancer pancreatico, cancer de vejiga, cancer colorrectal, cancer de colon, cancer de cuello uterino, cancer de cerebro, cancer de prostata, cancer de hueso, cancer de cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de tiroides, cancer de paratiroides o cancer ureteral. Espedficamente, El kit de diagnostico para el uso de la presente invencion se usa para diagnosticar cancer que expresa HER2, mas espedficamente cancer de mama o cancer de estomago que expresa HER2.

El anticuerpo de la presente invencion se puede usar para analizar la sensibilidad a un farmaco del presente anticuerpo en un paciente.

Se divulga un kit para analizar la sensibilidad a un farmaco que comprende el presente anticuerpo.

El kit de analisis divulgado se usa para evaluar la sensibilidad a un farmaco del presente anticuerpo en un paciente. Por ejemplo, cuando las celulas cancerosas obtenidas de un paciente se incuban con el anticuerpo de esta invencion y se dilucida que el anticuerpo esta unido a las celulas, se determina que el paciente posee una sensibilidad al farmaco del presente anticuerpo.

Dado que el kit divulgado comprende anticuerpos, puede fabricarse para inmunoensayo o inmunotincion. El formato de inmunoensayo o inmunotincion incluye, pero sin limitacion, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitacion, ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA), ELISA de captura, ensayo de inhibicion o de competicion, ensayo en sandwich, citometna de flujo, tincion por inmunofluorescencia y purificacion por inmunoafinidad, pero sin limitarse a los mismos. El inmunoensayo o los procedimientos de inmunotincion se pueden encontrar en Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), en Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; y Ed Harlow y David Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Por ejemplo, de acuerdo con el metodo de radioinmunoensayo, el anticuerpo etiquetado con radioisotopo (por ejemplo, C¹⁴, I¹²⁵, P³²y S³⁵) se puede usar para identificar h ER2 en la superficie de las celulas cancerosas. De acuerdo con el metodo ELISA, el metodo de ejemplo espedfico puede comprender las etapas de: (i) recubrir una superficie de un sustrato solido con una muestra biologica a analizar; (ii) incubar la muestra biologica con el anticuerpo contra HER2 de esta invencion como un anticuerpo primario; (iii) incubar el resultante de la etapa (ii) con un anticuerpo secundario conjugado con una enzima; y (iv) medir la actividad de la enzima.

El sustrato solido puede ser polfmeros de hidrocarburo (por ejemplo, poliestireno y polipropileno), vidrio, metales o geles. De la forma mas preferente, el sustrato solido es una placa de microtitulacion.

La enzima conjugada con el anticuerpo secundario incluye una enzima que cataliza reacciones colorimetricas, fluorometricas, de luminiscencia o infrarrojas, por ejemplo fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rabano picante, luciferasa y citocromo P⁴⁵⁰. Cuando se usa fosfatasa alcalina, bromocloroindolfosfato (BCIP), nitroazul de tetrazolio (NBT), naftol-AS-Bl-fosfato y ECF (quimifluorescencia mejorada) se pueden usar como sustrato; en el caso de usar peroxidasa de rabano picante, cloronaftol, aminoetilcarbazol, diaminobencidina, D-luciferina, lucigenina (nitrato de bis-W-metilacridinio), eter bendlico de resorufina, luminol, reactivo Amplex Red (10-acetil-3,7-dihidrofenoxazina, Pierce), HYR (p-fenilendiamina-HCl y pirocatecol), TMB (3,3,5,5-tetrametilbencidina), ABTS (2,2-azino-di[sulfonato de 3-etilbenzotiazolina]), o-fenilendiamina (OPD) y naftol/pironina, glucosa oxidasa y f-NBT (nitroazul de tetrazolio) y m-PMS (metosulfato de fenazina) se pueden usar como un sustrato.

De acuerdo con el metodo ELISA de captura, el metodo espedfico puede comprender las etapas de: (i) recubrir una superficie de un sustrato solido con el anticuerpo contra HER2 como un anticuerpo de captura; (ii) incubar el anticuerpo de captura con una muestra biologica a analizar; (iii) incubar el resultante de la etapa (ii) con el anticuerpo contra HER2 conjugado con una etiqueta que genera una serial detectable como un anticuerpo de deteccion; y (iv) medir la serial generada a partir de la etiqueta.

El anticuerpo de deteccion tiene una etiqueta que genera una serial detectable. La etiqueta incluye, pero sin limitacion, una etiqueta qmmica (por ejemplo, biotina), una enzimatica (por ejemplo, fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, peroxidasa de rabano picante y citocromo P⁴⁵⁰), una radiactiva (por ejemplo, C¹⁴, I¹²⁵, P³²y S³⁵), una fluorescente (por ejemplo, fluorescema), una luminiscente, una quimioluminiscente y una FRET (transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia). Se pueden encontrar diversas etiquetas y metodos para etiquetar anticuerpos en Ed Harlow y David Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

La medicion de la actividad o senal de la enzima en ELISA y ELISA de captura se puede llevar a cabo mediante diversos procesos bien conocidos en la tecnica. Cuando se usa biotina como etiquetas, la deteccion se puede realizar usando estreptavidina. Cuando se usa luciferasa, la deteccion se puede realizar usando luciferina.

La muestra biologica aplicable al presente kit incluye, pero sin limitacion, celulas, tejidos, extractos derivados de tejidos, lisado o producto purificado, sangre, plasma, suero, linfa y lfquido ascftico.

El anticuerpo de la presente invencion se puede usar para formar imagenes in vivo o in vitro. Se divulga una composicion de formacion de imagenes que comprende el anticuerpo de la presente invencion y una etiqueta generadora de senales conjugada al anticuerpo.

La etiqueta que genera senales incluye, pero sin limitacion, agente de contraste T1 (por ejemplo, compuesto de quelato de Gd), agente de contraste T2 (por ejemplo, materiales superparamagneticos (por ejemplo, magnetita, Fe3O4, Y-Fe2O3, ferrita de manganeso, ferrita de cobalto y ferrita de mquel)), radioisotopo (por ejemplo, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi y 206Bi), materiales fluorescentes (por ejemplo, fluorescema, ficoeritrina, rodamina, lisamina, Cy3 y Cy5), materiales quimioluminiscentes, partfculas magneticas, etiquetas de masa y partfculas densas a electrones.

Aunque el anticuerpo de la presente invencion solo es util en terapia del cancer, puede proporcionarse en forma de ADC (conjugado de anticuerpo y farmaco) mediante la conjugacion con otro farmaco porque el anticuerpo es capaz de dirigirse a las celulas que expresan HER2.

Se divulga un ADC (conjugado de anticuerpo y farmaco) que comprende el anticuerpo de la presente invencion y un farmaco conjugado con el anticuerpo.

El farmaco conjugado con el anticuerpo incluye, pero sin limitacion, sustancias qmmicas, radionuclidos, agentes inmunoterapeuticos, citocinas, quimiocinas, toxinas, agentes biologicos e inhibidores de enzimas, espedficamente los siguientes medicamentos antineoplasicos: acivicina, aclarubicina, acodazol, acronicina, adozelesina, alanosina, aldesleucina, alopurinol sodico, altretamina, aminoglutetimida, amonafida, ampligen, amsacrina, androgenos, anguidina, glicinato de afidicolina, asaley, asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bacilo de Calmette-Guerin (BCG), Antifol de Baker, beta-2'-desoxitioguanosina, bisantreno HCl, sulfato de bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina, BWA773U82, BW 502U83/HCl, mesilato de BW 7U85, ceracemida, carbetimero, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cloroquinoxalina-sulfonamida, clorozotocina, cromomicina A3, cisplatino, cladribina, corticoesteroides, Corynebacterium parvum, CPT-11, crisnatol, ciclocitidina, ciclofosfamida, citarabina, citembena, maleato de DABIS, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina HCl, desazauridina, dexrazoxano, dianhidrogalactitol, diazicuona, dibromodulcitol, didemnina B, dietilditiocarbamato, diglucoaldeddo, dihidro-5-azacitidina, doxorrubicina, equinomicina, dedatrexato, edelfosina, eflornitina, solucion de Elliott, elsamitrucina, epirubicina, esorrubicina, fosfato de estramustina, estrogenos, etanidazol, etiofos, etoposido, fadrazol, fazarabina, fenretinida, filgrastim, finasterida, acido flavona-acetico, floxuridina, fosfato de fludarabina, 5-fluorouracilo, Fluosol™, flutamida, nitrato de galio, gemcitabina, acetato de goserelina, hepsulfam, hexametilenbisacetamida, homoharringtonina, sulfato de hidrazina, 4-hidroxiandrostenodiona, hidroxiurea, idarubicina HCl, ifosfamida, 4-ipomeanol, iproplatino, isotretinoma, leucovorina calcica, acetato de leuprolido, levamisol, daunorrubicina liposomica, doxorrubicina encapsulada en liposoma, lomustina, lonidamina, maitansina, clorhidrato de mecloretamina, melfalan, menogaril, merbarona, 6-mercaptopurina, mesna, residuo de extraccion con metanol de bacilo de Calmette-Guerin, metotrexato, N-metilformamida, mifepristona, mitoguazona, mitomicina-C, mitotano, mitoxantrona clorhidrato, factor estimulante de colonias de monocitos/macrofagos, nabilona, nafoxidina, neocarzinostatina, acetato de octreotida, ormaplatino, oxaliplatino, paclitaxel, pala, pentostatina, piperazindiona, pipobromano, pirarrubicina, piritrexim, clorhidrato de piroxantrona, PIXY-321, plicamicina, porffmero sodico, prednimustina, procarbazina, progestinas, pirazofurina, razoxano, sargramostim, semustina, espirogermanio, espiromustina, estreptonigrina, estreptozocina, sulofenur, suramin sodio, tamoxifeno, taxotere, tegafur, teniposido, tereftalamidina, teroxirona, tioguanina, tiotepa, inyeccion de timidina, tiazofurina, topotecan, toremifeno, tretinoma, clorhidrato de trifluoperazina, trifluridina, trimetrexato, TNF (factor de necrosis tumoral), mostaza de uracilo, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, vinorelbina, vinzolidina, Yoshi 864, zorubicina, arabinosido de citosina, etoposido, melfalan, taxotere y taxol.

Efectos de esta invencion

Las caractensticas y ventajas de la presente invencion se resumiran de la siguiente manera:

(a) El anticuerpo de la invencion se une espedficamente a HER2 sobreexpresado en celulas cancerosas (particularmente, celulas de cancer de mama y de cancer de estomago), espedficamente a un epttopo en HER2 que es diferente del epttopo para trastuzumab.

(b) Las secuencias de c Dr de los presentes anticuerpos exhiben una baja similitud con las secuencias de CDR de los anticuerpos contra HER2 conocidos publicamente, lo que refiere que las secuencias de CDR son unicas. (c) Los anticuerpos de la presente invencion en combinacion con trastuzumab destruyen las celulas cancerosas con una citotoxicidad significativamente mejorada y, por lo tanto, son muy eficaces en el tratamiento del cancer (en particular, el cancer de mama y el cancer de estomago).

(d) Sin pretender quedar ligados a ninguna teona, las eficacias mejoradas de la terapia combinada abordanan el hecho de que los anticuerpos de la presente invencion se unen al epftopo en HER2 que es diferente del epftopo para trastuzumab, e inhiben HER2 de manera cooperativa con trastuzumab.

(e) Los anticuerpos de la presente invencion capaces de inducir apoptosis pueden usarse para la prevencion o el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas.

(f) La presente invencion tambien puede ser util en el diagnostico del cancer, el analisis de la sensibilidad al farmaco, la formacion de imagenes y el ADC (conjugado anticuerpo y farmaco), asf como en la terapia del cancer.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra mapas geneticos del vector pcDNA3.3-IgG Heavy y del vector pOptiVEC-IgG Kappa.

Las figuras 2A y 2B son graficos que muestran, respectivamente, los efectos inhibidores de la proliferacion de un tratamiento unico con el anticuerpo 1E11 y un tratamiento combinado de anticuerpo 1E11 y trastuzumab contra la lmea celular cancerosa NCI-N87 y la lmea celular cancerosa BT-474. TRA, PER y hIgG indican respectivamente trastuzumab, pertuzumab e IgG humana (control negativo).

Las figuras 3A y 3B muestran que el anticuerpo 1E11 se une a un dominio del subdominio de HER2 que es diferente del dominio de union de trastuzumab'. Las figuras 3A y 3B muestran, respectivamente, los resultados del analisis SPR y el analisis ELISA.

La figura 4A muestra el resultado del analisis ELISA para examinar si el anticuerpo 1E11 se une especfticamente a HER2 entre las protemas de la familia ErbB a las que pertenece HER2. Cetuximab (CET) se uso como un anticuerpo de control contra la protema EGFR.

La figura 4B muestra el resultado del analisis ELISA para examinar si el anticuerpo 1E11 se une a HER2 diferente del de seres humanos.

La figura 5A muestra el resultado del analisis del porcentaje de celulas cancerosas en las que se produjo apoptosis cuando las celulas NCI-N87 se trataron con anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos.

La figura 5B muestra el resultado del analisis del porcentaje de celulas cancerosas en las que se produjo apoptosis cuando las celulas BT-474 se trataron con anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos.

La figura 5C muestra el resultado de los analisis de viabilidad celular 24 horas y 48 horas despues de tratar las celulas NCI-N87 con anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos. El grupo de control muestra la viabilidad de las celulas tratadas solo con PBS, el disolvente para los anticuerpos.

La figura 5D muestra el resultado del analisis de la actividad de caspasa-3/7, 24 horas despues de tratar las celulas NCI-N87 con anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos. El grupo de control muestra la viabilidad de las celulas tratadas solo con PBS, el disolvente para los anticuerpos.

La figura 6A muestra el resultado del analisis de transferencia de Western que ilustra la disminucion en la senalizacion de HER2 cadena abajo mediante el tratamiento con el anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos.

La figura 6B es un grafico que muestra el efecto inhibidor de la proliferacion celular inducido por la heterodimerizacion mediante el tratamiento con el anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos. Un control negativo (Ctrl negativo) muestra la viabilidad de las celulas no tratadas con ligandos ni anticuerpos, y un control positivo (Ctrl positivo) muestra la viabilidad de las celulas tratadas con solo ligandos sin tratamiento con anticuerpos.

Las figuras 7A a 7C muestran los efectos inhibidores del crecimiento de celulas tumorales en un modelo animal de xenoinjerto de NCI-N87 mediante el tratamiento con anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos. La figura 7A muestra un grafico que ilustra el cambio en el volumen del tumor, la figura 7B muestra un grafico que ilustra el cambio en el peso del tumor y la figura 7C muestra una imagen que ilustra el resultado de la tincion de los tejidos tumorales. El Ab de control es palivizumab.

Las figuras 8A y 8B son graficos que muestran, respectivamente, los efectos inhibidores de la proliferacion de la lmea celular cancerosa NCI-N87 y la lmea celular cancerosa OE-19, mediante un tratamiento individual con el anticuerpo hz1E11, que es un anticuerpo humanizado, y un tratamiento combinado del anticuerpo hz1E11 y trastuzumab.

La figura 9 muestra el efecto inhibidor del crecimiento de celulas tumorales en un modelo animal de xenoinjerto de NCI-N87 mediante el tratamiento con anticuerpo hz1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos. El Ab de control es palivizumab.

Las figuras 10A y 10B, respectivamente, muestran los resultados de barrido de alanina de CDRH3 y CDRL3 del anticuerpo hz1 E ll. Las figuras 11A a 11F son graficos que muestran los efectos inhibidores de la proliferacion de las imeas celulares cancerosas NCI-N87, OE-19 y BT-474 mediante un tratamiento individual con los anticuerpos hz1E11-3, hz1E11-133 y hz1E11-154, que son anticuerpos humanizados de afinidad mejorada, y un tratamiento combinado de trastuzumab con ellos.

La presente invencion se describira a continuacion con mas detalle mediante ejemplos. Sena obvio para los expertos en la materia que se pretende que estos ejemplos sean mas concretamente ilustrativos y que el alcance de la presente invencion como se expone en las reivindicaciones adjuntas no este limitado a o por los ejemplos.

Ejemplos

EJEMPLO 1: DESARROLLO DE ANTICUERPOS CONTRA HER2

Para preparar anticuerpos, el dominio extracelular (ECD) de la protema HER2 se produjo usando celulas animales y a continuacion se uso como un antigeno. El ADN, donde una region bisagra de IgG1 humana y la parte Fc (CH2-CH3) se unieron al extremo C de ECD, se clono usando las enzimas de restriccion HindIII y BamHl. Despues, el vector clonado se transfecto transitoriamente en la celula FreeStyleTM 293F (Invitrogen, No. de cat. R790-07) usando polietilenimina (Polyscience Inc., No. de cat. 23966) y se purifico la protema de fusion HER2-ECD Fc a partir del cultivo celular usando la resina Protein-A Ceramic HyperD F (PALL, no. de cat. 20078-028). La protema purificada se cuantifico usando un colorante de ensayo de protemas (Bio-Rad, No. de cat. 500-0006), se sometio a SDS-PAGE y su concentracion y pureza se confirmaron mediante tincion de Coomassie. Se mezclaron 100 |jg del antigeno proteico purificado con adyuvante de Freund (Sigma, No. de Cat. F5506) y a continuacion se inyectaron por via intraperitoneal en ratones BALB/c (DBL Co., Ltd., Corea). En dos semanas, se diluyeron 100 jg del antigeno en PBS y se inyectaron nuevamente, y tres dfas despues, se extrajo el bazo del raton y se aislaron linfocitos a partir del mismo. Los linfocitos aislados se mezclaron con la lmea celular de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC, No. de cat. CRL-1581) en una proporcion de 5:1 y se fusionaron con PEG-1500 (Roche, No. de cat. 783641). Las celulas fusionadas se cultivaron en un medio que contema el suplemento de HAT (Sigma, No. de cat. H0262), y las celulas fusionadas (hibridoma) se seleccionaron y cultivaron selectivamente.

Las celulas de hibridoma obtenidas de este modo se examinaron mediante un ensayo ELISA para determinar si eran las celulas productoras de anticuerpos que se unen a antfgenos. HER2-ECD-Fc o IgG humana ChromPure (hlgG, Jackson Immunoresearch Lab. Inc., No. de cat. 009-000-003) se inmovilizo a temperatura ambiente en una placa Costar de 96 pocillos (Corning, No. de cat. 3590) a una concentracion de 1 jg/ml durante 1 hora. El resultante se lavo 3 veces con TBS-T (Triton X-100 al 0,05 %) y a continuacion se bloqueo a temperatura ambiente con 300 j l de TBS-T/SM (leche desnatada al 2 %) durante 30 minutos. La placa bloqueada se lavo 3 veces y se le anadio un caldo de cultivo de hibridoma, y se dejo unir a anticuerpos a 37 °C durante 1 hora. Despues de lavar el resultante 3 veces, se diluyo IgG-HRP anti-raton (Pierce, No. de cat. 31439) como un anticuerpo secundario en TBS-T/SM en una proporcion de 1:5.000 y se dejo que se uniera al mismo a 37 °C durante 1 hora. Despues de lavar el resultante 3 veces, se añ TaMdiBó (SurModics, No. de cat. TMBC-1000-01) y se dejo desarrollar un color a temperatura ambiente durante 5 minutos y se le acido sulfurico 1 N añ (aDduiókSan, No. de cat. 254) para detener el desarrollo del color. La absorbancia se midio a 450 nm usando Victor X3 (PerkinElmer, No. de cat. 2030-0030), y se seleccionaron los anticuerpos que se unen espedficamente a HER2-ECD-Fc.

Dado que HER2 es una protema expresada en la superficie celular, se examino si los anticuerpos desarrollados estaban unidos a celulas que sobreexpresaban HER2 mediante un ensayo ELISA basado en celulas. La lmea celular de cancer de ovario que sobreexpresa HER2, SKOV-3 (Korean Cell Line Bank (KCLB), No. de cat. 30077) se dividio en partes almuotas en la placa Costar de cultivo celular de 96 pocillos (Corning, No. de cat. 3595) a una concentracion De 10.000 celulas/pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Al dfa siguiente, despues de retirar el sobrenadante del cultivo celular, el resultante se lavo con PBS 3 veces, se le anadio con caldo de cultivo de hibridoma y se cultivo adicionalmente a 37 °C durante 2 horas. Despues de lavar el resultante 3 veces con TBS-T, IgG-HRP anti-raton de cabra como anticuerpo secundario que se diluyo en PBS/FBS (FBS al 3 %) en una proporcion de 1:5.000, se le y se tr aañtoad aió temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar el resultante 3 veces con TBS-T, se dejo desarrollar un color usando TMB. Se seleccionaron 61 clones que muestran una absorbancia mas alta que la del cultivo celular SP2/0 como control negativo.

EJEMPLO 2: COMPARACION DE LOS EFECTOS INHIBIDORES DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS CONTRA EL CRECIMIENTO DE CELULAS DE CANCER DE MAMA

Con el fin realizar un ensayo de viabilidad celular para confirmar el efecto inhibidor contra la proliferacion de celulas de cancer de mama, se purificaron los anticuerpos a partir del caldo de cultivo de hibridoma. El hibridoma se cultivo en un medio de cultivo que contema FBS al 3 %, y los anticuerpos en forma de IgG se purificaron usando resina Protein-A. Los anticuerpos purificados se cuantificaron mediante un ensayo de BCA (Pierce, No. de cat. 23227), se sometieron a SDS-PAGE, y su concentracion y pureza se confirmaron mediante tincion con Coomassie.

El ensayo de viabilidad celular se realizo mediante un tratamiento individual o un tratamiento combinado junto con trastuzumab con respecto a BT-474, la lmea celular representativa de cancer de mama, y la lmea celular NCI-N87, la lmea celular representativa de cancer de estomago, donde se sobreexpresa HER2. Para el tratamiento combinado, se uso una mezcla de los anticuerpos desarrollados y trastuzumab mezclados en una proporcion 1:1 (proporcion en peso). Para la placa de 96 pocillos se dividieron en almuotas BT-474 (ATCC, No. de cat. ^hT^b-20, 10.000 celulas/pocillo) y NCI-N87 (A^tC^c, No. de cat. CRL-5822, 10.000 celulas/pocillo), y se cultivaron durante 24 horas. Los anticuerpos purificados se trataron, respectivamente, para tener una concentracion de 5 jg/ml, y las lmeas celulares BT-474 y NCI-N87 se cultivaron adicionalmente durante 4 dfas. Para el ensayo de viabilidad celular, se anadio CCK-8 (Dojindo, No. de cat. CK-04-13) a una concentracion final del 10 %, se trato a 37 °C durante 3 horas y se midio su absorbancia. La viabilidad relativa se calculo con respecto a la absorbancia del pocillo no tratado con el anticuerpo, que se establecio en el 100 % de la viabilidad. Basandose en lo anterior, se selecciono el anticuerpo 1E11.

EJEMPLO 3: ANALISIS DE LA SECUENCIA DE ANTICUERPOS

Para el ensayo de la secuencia de anticuerpos, se construyo una biblioteca de anticuerpos Fab de fago usando el ARN de hibridoma respectivo, y se procedio a una seleccion por adsorcion de tres etapas para obtener un fago que se une al HER2-ECD-Fc (Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Despues de cultivar el hibridoma, se aislo el ARN usando el sistema SV Total RNA Isolation System (Promega, No. de cat. Z3100) y se sintetizo un ADNc a partir del mismo. Usando un conjunto de cebadores conocido (vease: Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press), la region variable del anticuerpo se amplifico y se clono en el vector pComb3X (Barbas laboratory, The Scripps Research Institute) usando la enzima de restriccion SfiI despues de ligar a Ck y CH1 humanas, y a continuacion se transformo en bacterias ER2537 (New England Biolabs, No. de cat. 801-N). Las bacterias transformadas se transfectaron con el fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, No. de cat. 200251) para obtener un fago, y se adquirio un clon que se une a HER2-ECD-Fc usando un inmunotubo, al que se inmovilizo HER2-ECD-Fc.

Entre las colonias para cada uno de los anticuerpos, los anticuerpos que se unen a HER2-ECD-Fc se confirmaron mediante un ensayo ELISA. Las colonias de las bacterias transformadas se cultivaron a 37 °C hasta que su absorbancia a 600 nm alcanzo 0,5, y se trataron con IPTG a una concentracion final de 1 mM, se dejaron y expresaron anticuerpos en forma de Fab mientras se cultivaban durante una noche a 30 °C. Despues de cultivar 5 ml, las celulas se recogieron por centrifugacion, se suspendieron en 0,4 ml de 1X TES (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, sacarosa al 20 % (v/v), pH 8,0) y se trataron a 4 °C durante 10 minutos. Despues de anadirle 0,6 ml de 0,2X TES, el resultante se trato a 4 °C durante 30 minutos, se centrifugo y se recupero el sobrenadante. Despues de lavar la placa Costar de media area de 96 pocillos (Corning Inc., No. de cat. 3690), que se recubrio con HER2-ECD-Fc a una concentracion de 1 pg/ml, 3 veces con TBS-T, se bloqueo con TBS-T/SM (leche desnatada sin grasa al 3 %, Triton X-100 al 0,05 %) a temperatura ambiente durante 1 hora. El caldo de cultivo o el extracto periplasmico (periplasma) para cada colonia se trato diluyendolo a una proporcion de 1:3 usando TBS-T/SM, y se dejo que se uniera a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar 3 veces, el anticuerpo anti-HA-HRP (Roche, No. de cat.

120-138-190-01) como anticuerpo secundario se diluyo a una proporcion de 1:5000, se le dejo unir a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavo 3 veces, y se le permitio desarrollar un color usando TMB.

La mayona de las colonias en el caldo de cultivo celular o el extracto periplasmico teman una absorbancia de 0.2 o superior, y las secuencias de los anticuerpos se analizaron con respecto a estos clones. El analisis de secuencia revelo que las colonias derivadas de un solo hibridoma mostraron tener las mismas secuencias. Las secuencias de aminoacidos de la region determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo 1E11 se resumen en la tabla 1 a continuacion.

TABLA 1

EJEMPLO 4: CONSTRUCCION Y PRODUCCION DE ANTICUERPOS QUIMERICOS

Los anticuerpos quimericos se construyeron para preparar los anticuerpos de la presente invencion en una forma mas farmacologicamente modulable.

La region variable de los anticuerpos de raton, para la cual se completo el analisis de la secuencia de nucleotidos, se amplifico y se unio a las regiones constantes humanas Ck y CH, y la parte de la cadena pesada se sometio a clonacion TA mediante vector pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen, No. de cat., K8300-01), mientras que la parte de la cadena ligera se sometio a clonacion TA mediante el vector pOptiVEC-TOPO (Invitrogen, No. de cat., 12744-017). Los cebadores usados para la amplificacion se muestran en las tablas 2 y 3 a continuacion. Los cebadores directos se insertaron con un sitio de restriccion de ClaI, mientras que los cebadores inversos se anadieron con el sitio de restriccion de NheI para la cadena pesada y el sitio de restriccion de BsiWI para la cadena ligera, respectivamente. Adicionalmente, los cebadores directos en la region variable se anadieron con una secuencia senal para que los anticuerpos quimericos pudieran secretarse en el caldo de cultivo celular. Las secuencias de nucleotidos y las secuencias de aminoacidos de Ck y CH usadas en la presente invencion se describen en las SEQ ID NO: 11 a 14.

Se realizo repetidamente una reaccion de PCR (30 segundos a 95 °C; 30 segundos a 58 °C y 30 segundos a 72 °C) durante 35 ciclos usando los cebadores y la ADN polimerasa GoTaq (Promega, No. de cat. M3005) descritos anteriormente. Cada uno de los productos de PCR amplificados de las regiones variables y las regiones constantes, despues de someterse a una electroforesis en gel de agarosa al 1 %, se purifico usando un kit de extraccion en gel Qiaquick (QIAGEN, No. de cat. 28706). Con el fin de conectar las regiones variables y las regiones constantes, los productos de PCR de las regiones variables y las regiones constantes se mezclaron en una cantidad igual, y se realizo una PCR de extension por solapamiento usando los cebadores directos para las regiones variables y los cebadores inversos para las regiones constantes para obtener productos genicos, y los productos se purificaron de la misma manera que se ha descrito anteriormente. La PCR de extension por solapamiento (30 segundos a 95 °C; 30 segundos a 58 °C; y 45 segundos a 72 °C) se realizo repetidamente durante 35 ciclos usando los cebadores y se realizo usando la ADN polimerasa GoTaq (Promega, No. de cat. M3005). Los productos genicos amplificados se sometieron a clonacion TA en el vector pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen, No. de cat., K8300-01) para la parte de la cadena pesada, y se sometieron a clonacion TA en el vector pOptiVEC-TOPO (Invitrogen, No. de cat., 12744-017) para la parte de la cadena ligera, de acuerdo con el manual del fabricante.

TABLA 2

TABLA 3

En las tablas anteriores, las letras en negrita indican los sitios de restriccion para las enzimas de restriccion, mientras que las partes subrayadas indican secuencias senal.

Los mapas del vector pcDNA3.3-IgG Heavy finalmente construido y del vector pOptiVEC-IgG Kappa se ilustran en la figura 1.

Despues, los vectores clonados se transfectaron transitoriamente en celulas animales FreeStyleTM 293F (Invitrogen, No. de cat. R790-07) usando polietilenimina (Polyscience Inc., No. de cat. 23966) y se purificaron anticuerpos quimericos a partir del caldo de cultivo celular usando la resina Protein-A Ceramic HyperD F (PALL, No. de cat.

20078-028). Los anticuerpos quimericos purificados se cuantificaron mediante un ensayo de BCA (Pierce, No. de cat. 23227), se sometieron a SDS-PAGe , y su concentracion y pureza se confirmaron mediante tincion con Coomassie.

EJEMPLO 5: COMPARACION DE LOS EFECTOS INHIBIDORES DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS CONTRA EL CRECIMIENTO DE CELULAS DE CANCER DE MAMA Y CANCER DE ESTOMAGO

Con el fin de confirmar los efectos antineoplasicos de los anticuerpos desarrollados de acuerdo con su concentracion, se realizo un ensayo de viabilidad celular con respecto a las lmeas celulares cancerosas que sobreexpresan HER2, tales como, BT-474 (una lmea celular de cancer de mama) y NCI-N87 (una lmea celular de cancer de estomago). BT-474 (10.000 celulas/pocillo) y NCI-N87 (10.000 celulas/pocillo) a un volumen de 70 pl se dividieron en partes almuotas en una placa de 96 pocillos y se inmovilizaron mientras se cultivaban durante 24 horas. Al dfa siguiente, se anadieron 30 pl de los anticuerpos a las celulas en cultivo. La concentracion final de los anticuerpos tratados fue de un maximo de 20 pg/ml por cada anticuerpo y se diluyo secuencialmente en una proporcion de 1:4, y el ensayo se realizo a 5 concentraciones diferentes. Cuando se trato en combinacion de trastuzumab, la proporcion entre los anticuerpos desarrollados y el trastuzumab se establecio a una proporcion de 1:1 (por ejemplo, en las figuras 2A y 2B, cuando la cantidad de administracion fue de 1 pg/ml, se administraron 1 pg/ml TRA y 1 pg/ml de 1E11). Despues del tratamiento con los anticuerpos, las celulas BT-474 y NCI-N87 se cultivaron durante 4 dfas adicionales, se les CCK-8 a una concentracion f ainñaald dióel 10 % y se trataron a 37 °C durante 3 horas. Despues, se midio la absorbancia de las celulas tratadas a 450 nm usando Victor X-3. La absorbancia de las celulas no tratadas con los anticuerpos se fijo al 100 % y se calculo su viabilidad relativa (figuras 2A y 2B).

El anticuerpo 1E11 desarrollado mostro un efecto inhibidor contra la proliferacion de las lmeas celulares NCI-N87 (figura 2A) y BT-474 (figura 2B), que eran sensibles al trastuzumab. Ademas, el tratamiento combinado del anticuerpo 1E11 y trastuzumab mostro una mayor actividad inhibidora contra la proliferacion de celulas cancerosas que el tratamiento con trastuzumab solo, en relacion con las lmeas celulares NCI-N87 y BT-474. De forma interesante, el tratamiento combinado del anticuerpo 1E11 y trastuzumab mostro una mayor actividad inhibidora contra la proliferacion de celulas cancerosas que el tratamiento combinado de trastuzumab y pertuzumab, con respecto a la lmea celular NCI-N87 (figura 2A).

EJEMPLO 6: CONFIRMACION DEL EFECTO SINERGICO DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS EN EL TRATAMIENTO DE COMBINACION CON TRASTUZUMAB

Con el fin de confirmar si el efecto antineoplasico del tratamiento combinado del anticuerpo 1E11 desarrollado y trastuzumab en el cancer de estomago fue sinergico, las celulas NCI-N87 se trataron con el anticuerpo 1E11 o trastuzumab solos o en combinacion de los mismos, se analizaron los efectos antineoplasicos (figura 2A). El efecto antineoplasico de acuerdo con la concentracion se analizo a traves del programa CalcuSyn (Biosoft) usando el metodo de Chou y Talalay (Chou et al., Adv. Enzyme. Regul. 22:27-55(1984)) que analiza el efecto de la administracion combinada de al menos dos farmacos (tabla 4). Cuando se administran dos farmacos en combinacion, se vuelven agonistas, aditivos o sinergicos. Las interacciones mutuas de los farmacos se pueden analizar usando el metodo de Chou y Talalay en terminos de mdice de combinacion (IC). El valor de IC de 1 o mayor indica un efecto agonista, mientras que los valores de IC de 1 y 1 o menos indican un efecto aditivo y un efecto sinergico, respectivamente.

TABLA 4

En la tabla anterior, DE50, DE75 y DE90 indican las dosis efectivas, que muestran efectos en poblaciones del 50 %, 75 % y 90 %, respectivamente. 'r' indica un coeficiente de correlacion lineal de un grafico de mediana-efecto.

Como puede verse en la figura 2A y en la tabla 4, el valor de IC de los dos farmacos de trastuzumab y clones de 1E11 en el momento de su tratamiento combinado fue inferior a 0,1, y se confirmo que los dos anticuerpos tienen un efecto sinergico cuando se administran en combinacion.

EJEMPLO 7: COMPARACION DE EPfTOPOS ENTRE LOS ANTICUERPOS DESARROLLADOS Y TRASTUZUMAB

Se sabe que trastuzumab, el anticuerpo contra HER2, se une al dominio 4 entre los cuatro dominios del ECD de HER2. Con el fin de confirmar si los epftopos en HER2 de los anticuerpos desarrollados se superponen con los de trastuzumab, se realizo una pre-clasificacion de epftopos mediante resonancia del plasmon superficial (SPR) usando Biacore 3000 (GE Healthcare). Aproximadamente 1.000 UR (unidad de respuesta) de trastuzumab se inmovilizaron en un chip sensor CM5 (GE Healthcare, No. de cat. BR-1000-12) a traves de un metodo de acoplamiento de amina usando ECD/NHS. Se permitio que la protema HER2-ECD-His a una concentracion de 320 nM se uniera al chip sensor, al que se inmovilizo el trastuzumab, usando un tampon HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,005 %, pH 7,4) durante 4 minutos, y solo el tampon se dejo fluir durante 5 minutos para estabilizar la union entre trastuzumab y HER2-ECD. Despues, se dejo que los anticuerpos secundarios a una concentracion de 1 pg/ml se les unieran durante 4 minutos, y se dejo que el tampon fluyera sobre ellos. En todos los experimentos, el caudal se establecio a 50 pl/min. Si los anticuerpos unidos de manera secundaria se unen adicionalmente a la protema HER2-ECD, a la que se unio el trastuzumab, son anticuerpos que no comparten el epftopo comun con trastuzumab.

Como puede verse en la figura 3A, hIgG, que se uso como un anticuerpo secundario, no se une a HER2 y, por lo tanto, no hubo una union adicional, y dado que trastuzumab tiene el mismo epftopo, no se unio adicionalmente. Por el contrario, el anticuerpo 1E11 estaba unido adicionalmente a HER2-ECD, que estaba unido a trastuzumab, y por lo tanto se confirmo que tema un epftopo que es diferente del de trastuzumab.

Con el fin de confirmar la region de dominio a la que se unen los clones 1E11, los cuatro subdominios (dominios 1-4) que constituyen el dominio extracelular de la protema HER2 se produjeron individualmente usando celulas animales, a las que la region bisagra y la region Fc de Las IgG1 humanas estaban unidas, y se purificaron usando Protein-A. La union de los clones de 1E11, trastuzumab, pertuzumab se confirmo mediante un ensayo ELISA con respecto a la protema recombinante producida de este modo. Como puede verse en la figura 3B, los clones de 1E11 mostraron unirse al subdominio 4, como en el caso de trastuzumab.

A partir de los resultados anteriores, se confirmo que los clones de 1E11 se unen al subdominio 4 del ECD de la protema HER2, pero se unen a un epftopo que es diferente del de trastuzumab (figura 3).

EJEMPLO 8: ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERDO DESARROLLADO PARA HER 2

Si los anticuerpos 1E11 desarrollados se unen espedficamente a HER2 entre las protemas de la familia de ErbB, a la que pertenece HER2, y si se unen a HER2 de especies distintas a los seres humanos se confirmo mediante el ensayo ELISA. Para confirmar si los anticuerpos 1E11 desarrollados se unen espedficamente a HER2 entre las protemas de la familia ErbB, los dominios extracelulares de EGFR, HER2, HER3 y HER4, que pertenecen a la familia de ErbB, se examinaron mediante un ensayo ELISA. Los dominios extracelulares de EGFR (EGFR-ECD-Fc) se produjeron de la misma manera que en HER2-ECD-Fc, y HER3 (R&D Systems, n.° 348-RB-050) y HER4 (R&D Systems, n.° 1131-ER-050) fueron comprados. Con el fin de confirmar si los anticuerpos desarrollados presentan reacciones cruzadas interespedficas a las protemas HER2 de diferentes especies, se usaron los dominios extracelulares de HER2 de seres humanos, un macaco de la India, un macaco cangrejero, un raton y una rata, y se confirmaron mediante un ensayo ELISA. El dominio extracelular de un macaco cangrejero se produjo de la misma manera que en HER2-ECD-Fc humano, y el dominio extracelular de HER2 de un macaco de la India (Sino Biological Inc., n.° 90020-K08H), el dominio extracelular de HER2 de un raton (Sino Biological Inc., n.° 50714-M08H), y el dominio extracelular de HER2 de una rata (Sino Biological Inc., n.° 80079-R08H) fueron comprados.

Como puede verse en las figuras 4A y 4B, se confirmo que los anticuerpos 1E11 desarrollados se unen espedficamente a HER2 entre las protemas de la familia de ErbB humanos, y tienen reacciones cruzadas interespedficas a las protemas HER2 de un macaco de la India y un macaco cangrejero.

EJEMPLO 9: ANALISIS DE APOPTOSIS DE ANTICUERPOS CONTRA HER2

Se analizo la capacidad de induccion de la apoptosis de los anticuerpos contra HER2 para dilucidar un mecanismo molecular subyacente de los efectos antineoplasicos del anticuerpo 1E11 coadministrado con trastuzumab. Para investigar la capacidad de induccion de la apoptosis, las celulas NCI-N87 y BT-474 se trataron con 10 pg/ml de anticuerpo 1E11, trastuzumab o su combinacion durante 48 horas (10 pg/ml de 1E11 y 10 pg/ml de trastuzumab para administracion combinada). Despues del tratamiento con anticuerpos, las celulas se desprendieron con tripsina y se analizaron 500.000 celulas usando el kit de apoptosis ApoScreen Annexin V(SouthernBiotech, n.° 10010-02) mediante un analisis de citometna de flujo (Cytomics FC500, Beckman Coulter Inc.). (Figuras 5a y 5b).

Para medir las actividades de caspasa-3 y caspasa-7 que desempenan un papel crucial en la apoptosis, se analizaron las eficacias antineoplasicas del anticuerpo 1E11, trastuzumab o una combinacion de los mismos durante el tiempo de tratamiento. Las celulas NCI-N87 se trataron con 10 pg/ml de anticuerpos. Despues de 24 horas y 48 horas de tratamiento, se realizo el ensayo de viabilidad celular usando Caspase-Glo (Promega, n.° G7571) (figura 5c). Se demostro que la viabilidad celular disminuyo bruscamente despues de 24 horas de tratamiento. Basandose en dichos resultados, las actividades de caspasa-3/7 se midieron despues de 24 horas de tratamiento. Las celulas NCI-N87 se trataron con 10 pg/ml de anticuerpos durante 24 horas. Se uso el ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega, n.° G809) para medir la actividad de caspasa-3/7 (figura 5d).

Como se representa en las figuras 5a y 5b, se demostro que el anticuerpo 1E11 solo ejerce actividad apoptotica contra el cancer de estomago (celulas NCI-N87) y el cancer de mama (celulas BT-474) que sobreexpresan ^hER2, a diferencia del trastuzumab. La actividad apoptotica del anticuerpo 1E11 se incremento aun mas con el tratamiento combinado con trastuzumab. El aumento de la actividad apoptotica del tratamiento combinado con 1E11 y trastuzumab se analizo debido al aumento de la actividad de caspasa-3/7 que desempena un papel crucial en la apoptosis (figura 5d).

EJEMPLO 10: INHIBICION DE SENALIZACION CELULAR DE HER2 POR ANTICUERPOS

Para dilucidar el mecanismo antineoplasico de 1E11 en combinacion con trastuzumab contra cancer de estomago y cancer de mama que sobreexpresan HER2, se analizaron las actividades de senalizacion de HER2 en las celulas. Las celulas NCI-N87 se trataron con 10 pg/ml de anticuerpos durante 24 horas. Despues, las celulas se lisaron con una solucion de lisis celular [Tris 50 mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, NP-40 al 1 %, dodecilsulfato sodico al 0,1 %, NaF 1 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM y coctel inhibidor de proteasa (Sigma)] para obtener un lisado celular. El lisado celular se sometio al analisis de transferencia Western. Los anticuerpos contra HER2 (n.° 4290), pHER2 (n.° 2243), pHER3 (n.° 4791), EGFR (n.° 4267), pEGFR (n.° 3777), AKT (n.° 4691), pAKT (n.° 4060), ERK (n.° 4695) y pERK (n.° 4370) se compraron de Cell Signaling Technology. El anticuerpo contra HER3 (sc-285) se compro de Santa Cruz Biotechnology y el anticuerpo contra GAPDH (AbC-1001) como un control de carga se compro de AbClon. Los anticuerpos anti-raton (AbC-5001) y anti-rata (AbC-5003) conjugados con peroxidasa de rabano picante tambien se compraron de AbClon. Las bandas se visualizaron usando AbSignal (AbClon, AbC-3001).

Se examino, ademas, si el tratamiento combinado de 1E11 y trastuzumab inhibe la heterodimerizacion entre HER2 y EGFR o HER3 como otras protemas de la familia de ErbB. Las celulas NCI-N87 se trataron con EGF para la induccion de la heterodimerizacion entre HER2 y EGFR, y se trataron con HRG para la induccion de la heterodimerizacion entre HER2 y HER3. Las celulas NCI-N87 se dividieron en partes almuotas en un medio celular suplementado con FBR al 0,1% y se cultivaron durante 24 h. Despues, las celulas se trataron con 10 pg/ml de anticuerpos durante 1 hora, y despues con 200 ng/ml de EGF (R&D Systems, n.° 236-EG-200) o HRG (R&D Systems, n.° 377-HB/CF). Tres dfas mas tarde, se ensayo la viabilidad celular.

Como se muestra en la figura 6a, el tratamiento combinado de 1E11 y trastuzumab contribuye a disminuir el nivel de la protema HER2. Al disminuir el nivel de la protema HER2, la protema HER2 fosforilada tambien disminuyo. Se observaron niveles reducidos de HER3 y EGFR fosforiladas sin un cambio en el nivel de protema total. Dichos resultados demuestran que el tratamiento combinado de 1E11 y trastuzumab es capaz de controlar las actividades de HER2, HER3 y EGFR. Mediante dichos controles de actividad, las actividades de AKT y ERK, factores cadena abajo de HER2 bien conocidos, tambien se alteraron sin un cambio en el nivel de protema total.

Se demostro que el tratamiento combinado de 1E11 y trastuzumab dio como resultado una reduccion de la proliferacion celular por heterodimerizacion entre HER2 y EGFR (o HER3) (figura 6b). La proliferacion de celulas NCI-N87 mediante EGF capaz de inducir heterodimerizacion entre HER2 y EGFR, y HRG capaz de inducir heterodimerizacion entre HER2 y HER3, se redujo mediante el tratamiento combinado de 1E11 y trastuzumab a un nivel similar a pertuzumab que se sabe que inhibe la union de HER2 a otros receptores.

Estos resultados refieren que la senalizacion celular mediante la heterodimerizacion entre HER2 y EGFR (o HER3) se suprimio mediante el tratamiento combinado de 1E11 y trastuzumab.

EJEMPLO 11: EFICACIAS ANTINEOPLASICAS DE ANTICUERPOS EN MODELOS ANIMALES

Las eficacias antineoplasicas de 1E11 se evaluaron usando modelos animales. Se inyectaron por via subcutanea ratones hembra lampinos atfmicos (Daehan Biolink, Corea) con 5 x 106 celulas NCI-N87 para preparar un modelo de xenoinjerto. Se permitio que los tumores crecieran en un tamano de aproximadamente 200 mm3, y los ratones se aleatorizaron a cuatro grupos. Los animales de los cuatro grupos recibieron dos veces por semana administracion intraperitoneal de 10 mg/kg de palivizumab (como control de isotipo de trastuzumab (Medlmmune LLC)), 1E11, trastuzumab y combinacion de 1E11 y trastuzumab, respectivamente. Para la administracion combinada, cada anticuerpo se administro a una dosis de 10 mg/kg. Los volumenes tumorales se midieron a lo largo del tiempo. En el dfa 22, los animales fueron sacrificados y los tumores se aislaron. Los volumenes del tumor se calcularon usando la formula (L*W*W)/2, donde "L" representa el diametro del tumor mas grande y "W" representa el diametro del tumor mas pequeno. Los tumores aislados se pesaron y se prepararon para analisis inmunohistoqmmicos. Los tejidos del xenoinjerto tumoral se procesaron como cortes de muestras fijados con formalina e incluidos en parafina. Estos se examinaron mediante tincion con hematoxilina (DAKO, n.° CS700) y eosina (DAKO, n.° CS701) (H&E) y tincion de la protema HER2 utilizando el anticuerpo contra HER2 (Cell Signaling Technology, n.° 4290).

1E11 solo inhibio el crecimiento tumoral en una medida similar a trastuzumab (figura 7a). 1E11 mostro una actividad antitumoral drasticamente incrementada en combinacion con trastuzumab en comparacion con el tratamiento con cada anticuerpo individual. La actividad antitumoral tambien se confirmo analizando la masa tumoral despues de los experimentos (figura 7b). La reduccion de las celulas que expresan HER2 mediante la combinacion de 1E11 y trastuzumab se observo en la tincion inmunohistoqmmica (figura 7c), que es compatible con los resultados de la transferencia Western (figura 6a). Estos resultados indican que 1E11 en combinacion con trastuzumab inhibe drasticamente el crecimiento tumoral en comparacion con el tratamiento con un anticuerpo individual, lo que se debe a la supresion de la expresion de la protema HER2.

EJEMPLO 12: DESARROLLO DE ANTICUERPOS HUMANIZADOS Y CONFIRMACION DE SUS EFECTOS Los anticuerpos humanizados de los anticuerpos quimericos 1E11 desarrollados en el ejemplo 4 se desarrollaron usando un metodo de injerto de CDR. Con respecto a los anticuerpos humanos para recibir la CDR de los anticuerpos desarrollados, los genes V y J de los genes de anticuerpos de la lmea germinal humana con una alta homologfa basada en la secuencia de nucleotidos se seleccionaron usando IMGT/V-QUEST (Brochet, X. et al., Nucl Acids Res. 36:503-508(2008)). Como un gen V y un gen J de una cadena pesada, se seleccionaron el gen IGHV3-48*03 y el gen IGHJ4*01, respectivamente, y su homologfa de secuencia fue del 85,07 % y el 87,23 %, respectivamente. Adicionalmente, como un gen V y un gen J de una cadena ligera, se seleccionaron el gen IGKV1-39*01 y el gen IGKJ1*01, respectivamente, y su homologfa de secuencia fue del 81,36 % y el 81,08 %, respectivamente. Teniendo en cuenta un informe de que el injerto de CDR sola disminuye la afinidad, el H49 basado en la numeracion de Kabat de la cadena pesada correspondiente a la zona de Vernier que puede afectar a toda la estructura de un anticuerpo se reemplazo con alanina en lugar de serina, que esta en el gen de la lmea germinal humana. El anticuerpo humanizado desarrollado hz1E11 se produjo en forma de IgG usando la lmea celular FreeStyleTM 293F. Las secuencias de aminoacidos de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera del hz1E11 desarrollado se describen en las SEQ ID NO: 24 y 26, respectivamente.

La afinidad de hz1E11, el anticuerpo humanizado desarrollado de 1E11, por HER2 se midio mediante un ensayo de resonancia del plasmon superficial (SPR). Todos los experimentos se realizaron usando Biacore 3000. En primer lugar, los anticuerpos de cabra contra IgG humana se inmovilizaron a una concentracion de 1000 UR en un chip sensor CM5 a traves de un metodo de acoplamiento de amina. Trastuzumab, pertuzumab y hz1E11 se diluyeron respectivamente a 2,84 pM, 5,68 pM y 7,1 pM usando un tampon HBS-P. Antes de unirse a la protema HER2-ECD-His, cada anticuerpo se unio a una velocidad de 50 pl/min durante 180 segundos, y se permitio que el tampon fluyera sobre el para fines de estabilizacion. Despues, se permitio que la protema HER2-ECD-His se uniera a concentraciones de 640 nM, 320 nM, 160 nM, 80 nM, 40 nM, 20 nM y 0 nM durante 4 minutos, y se permitio que el tampon fluyera durante 15 minutos. El chip sensor se reciclo permitiendo que el tampon de glicina-HCl (pH 1,5) 10 mM fluyera sobre el. Todos los datos de sensorgrama se analizaron mediante un modelo de interaccion 1:1 usando el software BIAevaluation. Las afinidades de los anticuerpos se resumen en la tabla 5 a continuacion. Las afinidades de trastuzumab y pertuzumab fueron de 1,94 nM y 1,89 nM, respectivamente, mientras que la afinidad del anticuerpo desarrollado 1E11 fue de 16,0 nM. La afinidad del anticuerpo humanizado de 1E11 fue de 10,4 nM, sin mostrar casi ninguna diferencia con el anticuerpo 1E11 existente.

TABLA 5

El efecto antineoplasico de hz1E11, el anticuerpo humanizado desarrollado de 1E11, se confirmo en las lmeas celulares de cancer de estomago humano NCI-N87 y OE-19, que sobreexpresan HER2 (figura 8). El tratamiento individual de hz1E11 en celulas NCI-N87 mostro una disminucion en la tasa de supervivencia del cancer similar a la del tratamiento con trastuzumab, mientras que el tratamiento combinado de hz1E11 y trastuzumab mostro una disminucion significativamente mayor en la tasa de supervivencia del cancer en comparacion con el tratamiento individual con cualquiera de los anticuerpos (figura 8A). Adicionalmente, el tratamiento combinado de hz1E11 y trastuzumab en OE-19, una lmea celular de cancer de estomago humano diferente, mostro una mayor disminucion en la tasa de supervivencia del cancer en comparacion con el tratamiento individual con cualquiera de los anticuerpos (figura 8B). Adicionalmente, el tratamiento combinado de hz1E11 y trastuzumab mostro un efecto inhibidor ligeramente mayor que el tratamiento combinado de 1E11 y trastuzumab (figura 2A) contra la proliferacion de celulas cancerosas (figura 8A). El tratamiento combinado de hz1E11 y trastuzumab mostro un mayor efecto inhibidor en las lmeas celulares NCI-N87 OE-19 que el tratamiento combinado de trastuzumab y pertuzumab contra la proliferacion de celulas cancerosas.

Los resultados anteriores indican que el hz1E11, el anticuerpo humanizado desarrollado de 1E11, tiene una capacidad de union igual y un efecto antineoplasico mejorado ligeramente en comparacion con el 1E11 convencional.

El efecto antineoplasico del tratamiento combinado de hz1E11, el anticuerpo humanizado desarrollado de 1E11, junto con trastuzumab se confirmo en un modelo de xenoinjerto usando NCI-N87. A los ratones que teman un cancer formado mediante el trasplante de NCI-N87 se les inyecto por via intraperitoneal dos veces por semana el anticuerpo desarrollado y un grupo de control de isotipo de trastuzumab, hz1E11, trastuzumab y una combinacion de hz1E11 y trastuzumab, respectivamente. El grupo de control de isotipo y trastuzumab se administraron a una dosis de 10 mg/kg. En el caso de un tratamiento combinado, se mezclaron hz1E11 y trastuzumab en una proporcion de 1:1, y se administraron a una dosis de 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg y 10 mg/kg basandose en cada anticuerpo. El tratamiento combinado de hz1E11 y trastuzumab mostro una disminucion del crecimiento del cancer de una manera dependiente de la dosis (figura 9). El efecto antineoplasico observado con la administracion de 10 mg/kg de trastuzumab tambien se observo con la administracion de 1 mg/kg de hz1E11 o trastuzumab. Se demostro que la administracion de hz1E11 y trastuzumab en una dosis superior a 5 mg/kg no solo inhibe el crecimiento del cancer sino que tambien disminuye el cancer ya formado.

Ejemplo 13: CONFIRMACION DE LA REGION DE UNION DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS

Con el fin de confirmar la importante region de los anticuerpos desarrollados para union a antigenos, se realizo un ensayo de barrido de alanina que examina la capacidad de union cambiando los aminoacidos correspondientes a CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera a alanina. Histidina (H), leucina (L), glicina (G), glicina (G), treonina (T) y serina (S) entre las regiones CDR3 de cadena pesada que corresponden a 95, 96, 97, 98, 99 y 100a de acuerdo con la numeracion de Kabat, y glutamina (Q), glutamina (Q), leucina (L), tirosina (Y), serina (S) y treonina (T) entre las regiones CDR3 de cadena ligera que corresponden a 89, 90, 91, 92, 93 y 94 de acuerdo con la numeracion de Kabat, se cambiaron a alanina usado el kit de mutagenesis dirigida QuikChange (Stratagene, n.° 200518). Entre las CDR3 de cadena pesada, A100 se excluyo del ensayo porque el anticuerpo desarrollado tiene alanina. Despues de expresar cada anticuerpo modificado en bacterias, se confirmo su expresion mediante una transferencia por puntos (dot-blot) despues de obtener un extracto periplasmico del mismo, y se analizo la capacidad de union con respecto al HER2-ECD a traves de un ensayo ELISA (vease: figura 10).

TABLA6

Como puede verse en la tabla 6 y en las figuras 10A y 10B, los anticuerpos modificados se expresaron en un nivel similar, mientras que G98A de la cadena pesada mostro una perdida completa de su capacidad de union, y G97A de la cadena pesada mostro una disminucion marcada en su capacidad de union. El cambio en otras regiones no mostro ningun efecto notable sobre la union antigeno-anticuerpo.

Ejemplo 14: MEJORA DE LAS AFINIDADES DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS

Con el fin de mejorar las afinidades de los anticuerpos desarrollados, se desarrollo una biblioteca con CDR3 aleatorizadas de cadena ligera y cadena pesada. F, D e Y entre las CDR3 de la cadena pesada que corresponden a F100b, D101 y Y102, los numeros de aminoacidos de acuerdo con la numeracion de Kabat y P, W y T entre las CDR3 de la cadena ligera que corresponden a P95, W96 y T97 de acuerdo con la numeracion de Kabat se excluyeron de la aleatorizacion porque son aminoacidos comunmente descubiertos en anticuerpos humanos. Se desarrollo una biblioteca de anticuerpos de fagos con 20 aminoacidos aleatorizados de aminoacidos CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera excluyente de los aminoacidos descritos en la tecnologfa anterior (Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). En particular, los cebadores usados anteriormente se relacionan con la region correspondiente a CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera, y se sintetizaron de tal manera que se mezclaron adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T) en una proporcion igual para ser insertados aleatoriamente en la primera y segunda posicion del codon correspondiente al aminoacido a aleatorizar, y la guanina (G) o la citosina (C) se mezclaron en una proporcion igual para ser insertados en la tercera posicion.

Con el fin de seleccionar los clones con afinidades mejoradas a partir de la biblioteca desarrollada, la protema HER2-ECD-His se biotinilo usando el kit de EZ-Link de Sulfo-NHS-LC-Biotinilacion (Thermo Scientific, n.° 21435), y se uso como antfgenos para seleccionar anticuerpos. La biblioteca de anticuerpos de fagos desarrollada y la protema biotina-HER2-ECD-His se dejaron unir a temperatura ambiente durante 2 horas, y los fagos unidos a los antfgenos se separaron usando 50 pl de Dynabeads M-270 Estreptavidina (Invitrogen, n.° 653.06). El proceso de seleccion anterior se realizo 4 veces, y las colonias que expresaron anticuerpos que se unen a HER2-ECD entre las colonias seleccionadas de este modo se seleccionaron mediante un ensayo ELISA usando extractos periplasmicos, y las secuencias de los anticuerpos expresados en las colonias seleccionadas se confirmaron mediante analisis de nucleotidos. Las secuencias de aminoacidos de CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos que se unen a HER2-ECD se resumen en las tablas 7 y 8 a continuacion. El numero 1 en cada tabla representa la secuencia de aminoacidos de CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera de hz1E11.

TABLA7

TABLA8

Con el fin de seleccionar clones con Koff mejorada entre los clones seleccionados, los clones se analizaron a traves de Biacore 3000 (GE Healthcare). La protema HER2-ECD-His se inmovilizo en un chip sensor CM5 a traves de un metodo de acoplamiento de amina usando ECD/NHS. Despues de expresar el anticuerpo de cada clon usando IPTG, se obtuvo un extracto periplasmico del mismo, y se dejo que se uniera a HER2-ECD-His. El valor de Koff para cada anticuerpo se analizo mediante el software de evaluacion BIAevaluation. Basandose en lo anterior, se seleccionaron los anticuerpos con valor de Koff mejorado (vease: tabla 9a). La tabla 9a divulga los ejemplos representativos de los clones que muestran valores de Koff similares o mejorados en comparacion con el anticuerpo original hz1E11, entre los clones desarrollados por los inventores de la presente invencion.

TABLA 9a

Como puede verse en la tabla 9a, diversas CDRH3 representadas por la formula general 1 y CDRL3 representadas por la formula general 2 muestran valores de Koff similares o mejorados en comparacion con CDRH3 y CDRL3 del anticuerpo original, hz1E11.

Entre las secuencias de CDR3 aleatorizadas de la cadena ligera, los experimentos se realizaron usando hz1E11-3, hz1E11-133 y hz1E11-154.

Las regiones variables de cadena pesada de hz1E11-3, hz1E11-133 y hz1E11-154 fueron las mismas que las de hz1E11, y la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena ligera se describen en las s Eq ID NO: 247, 249 y 251, respectivamente.

Con el fin de confirmar el aumento de las afinidades de los 3 tipos de anticuerpos seleccionados, los anticuerpos se produjeron en forma de IgG. La IgG antihumana de cabra (Invitrogen, n.° H10500) a una concentracion de 2000 UR se inmovilizo en un chip sensor CM5 a traves del metodo ECD/NHS. Despues, se dejo que los anticuerpos se unieran a una velocidad de 50 pl/min durante 5 minutos, y se dejo que el tampon fluyera durante 5 minutos para fines de estabilizacion. Las concentraciones de los anticuerpos usados para la union de los anticuerpos fueron 0,4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo contra el receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2) o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende:

(iii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:239;

(iv) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:88;

(vi) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:43 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:6;

(ix) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:76 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:222;

(x) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y ^cD^rH3 de SEQ ID NO:67 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:156;

(xvii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:71 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:155;

(xviii) una region variable de cadena pesada que comprende CDRH1 de SEQ ID NO:1, CDRH2 de SEQ ID NO:2 y c Dr H3 de SEQ ID NO:3 y una region variable de cadena ligera que comprende CDRL1 de SEQ ID NO:4, CDRL2 de SEQ ID NO:5 y CDRL3 de SEQ ID NO:131;

2. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para su uso en la prevencion o el tratamiento de un cancer.

3. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo para el uso de la reivindicacion 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo esta en combinacion con trastuzumab.

4. Una composicion farmaceutica para su uso en la prevencion o el tratamiento de un cancer, que comprende: (a) una cantidad farmaceuticamente eficaz del anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1; y (b) un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

5. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que la composicion comprende ademas trastuzumab.

6. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo o composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en los que el cancer es cancer de mama, cancer de ovario, cancer de estomago, cancer de pulmon, cancer de hngado, cancer de bronquios, cancer nasofarmgeo, cancer de laringe, cancer pancreatico, cancer de vejiga, cancer colorrectal, cancer de colon, cancer de cuello uterino, cancer de cerebro, cancer de prostata, cancer de hueso, cancer de cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de tiroides, cancer de paratiroides o cancer ureteral, preferentemente cancer de mama o cancer de estomago.

7. Una composicion farmaceutica para su uso en la induccion de apoptosis, que comprende: (a) una cantidad farmaceuticamente eficaz del anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1; y (b) un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

8. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que la composicion farmaceutica induce apoptosis para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa; en la que la enfermedad hiperproliferativa es cancer, hiperplasia, queloide, smdrome de Cushing, aldosteronismo primario, eritroplasia, policitemia vera, leucoplasia, cicatriz hiperplasica, liquen plano, lentiginosis, arteriosclerosis, ateroesclerosis, reestenosis o estenosis.

9. Un kit para su uso en el diagnostico de un cancer que comprende el anticuerpo contra HER2 o fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1.

10. Una composicion farmaceutica que comprende: (a) el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1; y (b) un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

11. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 10, que comprende ademas trastuzumab.