KR20160104160A - 클라우딘 3 및 4에 대한 단일클론항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 클라우딘(Caludin) 3 및 4에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 난소암 세포)에서 과발현되는 클라우딘 3 및 4에 특이적으로 결합하는 항체로서, 기존의 클라우딘 3 또는 4 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 본 발명의 항체는 암세포를 살상시켜 암(특히, 난소암)의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

Description

클라우딘 3 및 4에 대한 단일클론항체 및 그의 용도{Monoclonal Antibodies Specific to Claudin 3 and 4, and The Use Thereof}

본 발명은 인간 클라우딘 3 또는 4에 대해 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.

클라우딘(claudin)은 세포 간 밀착연접(tight junction)의 주요 필수 막단백질로서 포유류의 경우 24개의 패밀리가 있으며, 사람의 경우 포유류에서 클라우딘 13을 제외한 클라우딘 패밀리를 가지고 있다. 클라우딘 패밀리는 세포벽을 투과하여 박혀 있는 형태의 유사한 구조를 가지며, 대부분 두 개의 세포 외 루프(extracellular loop)를 가지고 있는 구조를 가지고 있다.

클라우딘은 세포 간 분자들의 흐름을 제어하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 최근 다양한 연구들을 통하여 결장암, 위암, 유방암, 식도암 및 난소암 등 암의 발생과도 밀접한 관련성이 있다는 연구가 보고되고 있다. 특히, 뚜렷한 증상이 없고 수술과 화학적 요법 이외에는 적절한 치료 방법이 없어 예후가 나쁜 것으로 알려져 있는 난소암에서 클라우딘 패밀리 중 클라우딘 3와 클라우딘 4가 과발현된다는 것이 보고되었다(Claudin Proteins in Human Cancer: Promising New Targets for Diagnosis and Therapy, P.J. Morin, Cancer Res. 65: 9604-9006 (2005)).

또한 84명의 난소 장액성 선암(ovarian serous adenocarcinoma) 환자의 생존율과 클라우딘 3의 발현율을 Kaplan-Meier 기법의 생존커브로 확인한 결과, 클라우딘 3의 발현율이 환자의 수명 단축과 밀접한 관계가 있다는 연구가 보고되었다(Expression profile of tight junction protein claudin 3 and claudin 4 in ovarian serous adenocarcinoma with prognostic, Choi et al., Histol. Histopathol. 22:1185~1195(2005)).

이와 같이 암 조직에서 특이성이 높은 클라우딘 발현의 증감여부는 암 생성에 대한 예측지시인자로 사용될 수 있으며, 또한 암의 진단과 치료에 있어 클라우딘이 유용한 바이오마커가 되어 다양한 그룹에서 클라우딘을 타겟으로 하는 치료제 개발을 시도 중에 있다. 특히, 미국, 일본 등에서 난소암에서 과발현하는 것으로 알려져 있는 클라우딘 3 및 4를 타겟으로 하는 치료용 항체에 대한 개발을 진행하고 있으며, 클라우딘 3과 4를 동시에 타겟으로 하는 단일클론 항체가 보고되기도 하였다 (Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4. Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)). 이에 본 발명자들은 기존에 본 발명자들이 개발한 클라우딘 3와 4의 항원을 기반으로 클라우딘 3과 4를 동시에 타켓팅하여 난소암 등의 암 치료에 효과를 나타낼 수 있는 치료용 항체를 개발하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 대한 우수한 결합 능력을 나타내면서도, 암(특히, 난소암)을 현저하게 개선된 효능으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 다음 일반식 1로 표시되는 CDR(complementarity determining region)L1, 다음 일반식 2로 표시되는 CDRL2 및 다음 일반식 3으로 표시되는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (b) 다음 일반식 4로 표시되는 CDRH1, 다음 일반식 5로 표시되는 CDRH2 및 서열목록 제85서열 내지 제96서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편:

일반식 1

X₁-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Ile-Gly-X₂-Asn-X₃-Val-X₄

상기 일반식에서, X₁은 Ser 또는 Thr이고, X₂는 Ser 또는 Asn이고, X₃는 Ala, Tyr, Ser, Asn 또는 Asp이며, 그리고 X₄는 Thr, Ser, Tyr 또는 Asn임.

일반식 2

Y₁-Y₂-Y₃-Y₄-Y₅-Pro-Ser

상기 일반식에서, Y₁은 Ala, Ser 또는 His이고, Y₂는 Asp 또는 Asn이고, Y₃는 Ser 또는 Asn이며, Y₄는 His, Gln, Lys 또는 Asn이며, 그리고 Y₅는 Arg 또는 Pro임.

일반식 3

Z₁-Z₂-Trp-Asp-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇

상기 일반식에서, Z₁은 Gly 또는 Ala이고, Z₂는 Ala, Thr 또는 Ser이고, Z₃는 Asp, Tyr, Ala 또는 Ser이고, Z₄는 Ser, Val 또는 Asn이고, Z₅는 Leu 또는 Pro이고, Z₆는 Ser, Asp, Gly 또는 Asn이며, 그리고 Z₇는 Ala, Phe 또는 Gly임.

일반식 4

B₁-Tyr-B₂-Met-Ser

상기 일반식에서, B₁은 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이며, B₂는 Tyr, Asp, Ala 또는 Ser임.

일반식 5

J₁-Ile-J₂-J₃-J₄-J₅-J₆-J₇-J₈-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly

상기 일반식에서, J₁은 Val, Gly, Ala 또는 Ser이고, J₂는 Ser 또는 Tyr이고, J₃는 Ser, Tyr, His 또는 Pro이고, J₄는 Asp, Ser 또는 Gly이고, J₅는 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이고, J₆는 Ser 또는 Gly이고, J₇는 Ser 또는 Asn이며, 그리고 J₈은 Thr, Ile 또는 Lys임.

본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 대한 우수한 결합 능력을 나타내면서도, 암(특히, 난소암)을 현저하게 개선된 효능으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발하였다.

본 발명의 항체는 클라우딘 3 및 4에 대하여 특이적 결합능력을 갖는다. 특히, 본 발명의 항체는 클라우딘 3 및 4에 있는 에피토프 중에서, CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)가 결합하는 에피토프에 경쟁적으로 결합한다. 기존에 보고된 클라우딘 3와 4를 동시에 타겟팅하는 항체의 경우, 항원과 결합하는 부위에 있어 CPE와 경쟁하지 않는다는 점에서(Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4. Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)) 본 발명의 항체는 기존의 항체와는 에피토프가 다른 항체이다.

본 발명의 항체는 다양한 클라우딘 3 및 4 발현의 암 세포에 대하여 우수한 살상능력 또는 증식 억제능력을 갖는다. 본 명세서에서, 암 세포를 언급하면서 사용되는 용어 “살상” 또는 “증식 억제”는 동일한 의미로 혼용된다.

본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 클라우딘 3 및 4에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 scFv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. F(ab')는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 F(ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. scFv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 scFv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. scFv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인(papain)으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신(pepsin)으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(γ1), 감마 3(γ3) 및 감마 4(γ4)이고, 가장 바람직하게는 감마 1(γ1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgG1 형태이다.

본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄 및 경쇄에는 각각 3개의 CDR ((중쇄 (CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3))이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 발명의 항체에서, CDRL1은 일반식 1로 표시된다.

일반식 1에서 X₁은 Ser 또는 Thr이고, 보다 더 구체적으로 X₁은 Thr이다.

일반식 1에서 X₂는 Ser 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 X₂는 Ser이다.

일반식 1에서 X₃는 Ala, Tyr, Ser, Asn 또는 Asp이고, 구체적으로 Ala 또는 Tyr이고, 보다 더 구체적으로 Ala이다.

일반식 1에서 X₄는 Thr, Ser, Tyr 또는 Asn이고, 구체적으로 X₄는 Thr 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 X₄는 Thr이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRL1는 서열목록 제3서열 내지 제20서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRL1는 서열목록 제3서열 내지 제9서열의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로, 상기 CDRL1는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 항체에서, CDRL2는 일반식 2로 표시된다.

일반식 2에서 Y₁은 Ala, Ser 또는 His이고, 보다 더 구체적으로 Y₁은 Ala이다.

일반식 2에서 Y₂는 Asp 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Y₂는 Asp이다.

일반식 2에서 Y₃는 Ser 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Y₃는 Ser이다.

일반식 2에서 Y₄는 His, Gln, Lys 또는 Asn이고, 구체적으로 Y₄는 His, Gln, Lys이고, 보다 더 구체적으로 Y₄는 His이다.

일반식 2에서 Y₅는 Arg 또는 Pro이고, 보다 더 구체적으로 Y₅는 Arg이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRL2는 서열목록 제21서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRL2는 서열목록 제21서열 내지 제27서열의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로, 상기 CDRL2는 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 항체에서, CDRL3는 일반식 3로 표시된다.

일반식 3에서 Z₁은 Gly 또는 Ala이고, 보다 더 구체적으로 Z₁은 Gly이다.

일반식 3에서 Z₂는 Ala, Thr 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 Z₂는 Ala이다.

일반식 3에서 Z₃는 Asp, Tyr, Ala 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 Asp이다.

일반식 3에서 Z₄는 Ser, Val 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Ser이다.

일반식 3에서 Z₅는 Leu 또는 Pro이고, 보다 더 구체적으로 Leu이다.

일반식 3에서 Z₆는 Ser, Asp, Gly 또는 Asn이고, 구체적으로 Asp, Gly 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Asn이다.

일반식 3에서 Z₇는 Ala, Phe 또는 Gly이고, 구체적으로 Ala 또는 Phe이고, 보다 더 구체적으로 Ala이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRL3는 서열목록 제39서열 내지 제60서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRL1는 서열목록 제39서열 내지 제49서열의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로, 상기 CDRL3는 서열목록 제39서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 항체에서, CDRH1는 일반식 4로 표시된다.

일반식 4에서 B₁은 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이고, 보다 더 구체적으로 Gly이다.

일반식 4에서 B₂는 Tyr, Asp, Ala 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 Tyr이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRH1는 서열목록 제61서열 내지 제72서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRH1는 서열목록 제61서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 항체에서, CDRH2는 일반식 5로 표시된다.

일반식 5에서 J₁은 Val, Gly, Ala 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 J₁은 Val이다.

일반식 5에서 J₂는 Ser 또는 Tyr이고, 보다 더 구체적으로 J₂는 Ser이다.

일반식 5에서 J₃는 Ser, Tyr, His 또는 Pro이고, 보다 더 구체적으로 J₃는 His이다.

일반식 5에서 J₄는 Asp, Ser 또는 Gly이고, 보다 더 구체적으로 J₄는 Asp이다.

일반식 5에서 J₅는 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이고, 보다 더 구체적으로 J₅는 Gly이다.

일반식 5에서 J₆는 Ser 또는 Gly이고, 보다 더 구체적으로 J₆는 Ser이다.

일반식 5에서 J₇는 Ser 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 J₇는 Ser이다.

일반식 5에서 J₈은 Thr, Ile 또는 Lys이고, 보다 더 구체적으로 J₈은 Thr이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRH2는 서열목록 제73서열 내지 제84서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRH2는 서열목록 제73서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 항체에서, CDRH3는 서열목록 제85서열 내지 제96서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되며, 구체적으로 서열목록 제85서열의 아미노산 서열로 표시된다.

본 발명의 클라우딘 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 클라우딘 3 및 4를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 F(ab')₂ , 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 항체 CDR 서열은 종래 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성(similarity)이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 아미노산 서열은 그 서열의 신규성 및 독특함이 인정된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의해 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체는 기존의 항암제와 병용투여하는 경우, 암 세포(특히, 난소암 세포)를 크게 개선된 세포 살상능력으로 살상시킬 수 있어, 암(특히, 난소암, 보다 구체적으로 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 난소암)의 치료에 매우 유효하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기존의 항암제인 카르보플라틴(carboplatin)과 본 발명의 항체를 병용투여하는 경우 효과적으로 난소암 세포의 증식을 억제하였다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 당업계에 공지된 다양한 암을 포함하며, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 암이고, 보다 구체적으로 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 난소암이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 암의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 진단, 예컨대 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 관련된 질환(disorders), 질병(diseases) 또는 상태(conditions)를 진단하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 관련 질환, 질병 또는 상태의 진단키트를 제공한다.

클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 관련 질환, 질병 또는 상태는 구체적으로 암이고, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 진단키트는 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 암, 보다 구체적으로 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 난소암의 진단에 이용된다.

또한, 본 발명의 항체는, 본 발명의 항체 치료제가 환자에게 의약 반응성(drug responsiveness)이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 의약 반응성(drug responsiveness) 분석 키트를 제공한다.

본 발명의 분석 키트는, 특정의 환자가 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 환자의 암 세포에 본 발명의 항체를 처리한 경우, 본 발명의 항체가 결합하는 것으로 결과가 나오면, 이 환자는 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는 것으로 판정할 수 있다. 상술한 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

본 발명의 항체는 그 단독으로도 암을 치료하는 데 이용될 수 있지만, 클라우딘(Claudin) 3 및 4 발현 세포를 타겟팅 할 수 있기 때문에 다른 약물을 결합시켜 ADC(antibody drug conjugate) 형태로 제공될 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 약물을 포함하는 항체 의약 컨쥬게이트(ADC)를 제공한다.

본 발명의 항체에 결합되는 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토카인, 케모카인, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질을 포함하며, 보다 구체적으로 다음과 같은 항암제이다: 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5’-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴,파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁소텔 및 탁솔.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 인간 클라우딘 3 및 4에 대하여 특이적인 활성을 갖는 인간 항체로서 표적 항원인 인간 클라우딘 3 및 4의 특정 부위를 에피토프로 하여 이에 대해 친화력을 가지는 인간 항체를 제공한다.

(b) 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 난소암 세포)에서 과발현되는 클라우딘 3 또는 4에 특이적으로 결합하는 항체이다.

(c) 본 발명의 항체는 종래의 클라우딘 3 또는 4 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다.

(d) 본 발명의 항체는 암 세포를 살상시켜 암(특히, 난소암)의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

(e) 본 발명의 항체는 암 치료제로서 뿐만 아니라, 암의 진단, 의약 반응성 분석, 이미징 및 ADC(antibody drug conjugate)로도 이용될 수 있다.

도 1은 결합력이 우수한 scFv를 선별하기 위하여 각각 클라우딘 3 및 클라우딘 4 항원에 대하여 ELISA 분석을 수행한 사진이다.
도 2a 및 b는 선별된 scFv와 클라우딘 3 및 4를 과발현하는 세포와의 결합능력을 확인하기 위하여 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석한 도면이다.
도 3은 B12 항체 발현 세포주를 만드는 과정에서 발현량이 높은 클론을 선별하기 위하여 닷 블랏(dot blot)을 수행한 사진이다.
도 4는 정제된 항체에서 HCP (Host Cell Protein) 분석을 한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 정제된 항체에서 잔여 Protein A 분석을 한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 1차 정제(a), 2차 정제(b), 3차 정제(c) 후 B12 항체에 대하여 HPLC 분석을 한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7은 B12 항체의 결합 친화성을 확인하기 위하여 OVCAR-3 세포 및 TOV-112D 세포와 클라우딘 항체 및 B12 항체를 이용하여 유세포분석을 수행하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8은 B12 항체의 결합 친화성을 확인하기 위하여 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)을 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 9는 B12 항체의 결합 친화성을 확인하기 위하여 면역침강법(Immunoprecipitation)을 수행한 결과를 보여주는 도면이다.
도 10은 B12 항체에 대해 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)를 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 11은 B12 항체에 대해 Complement dependent cytotoxicity (CDC)를 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 12은 마우스 모델에서 난소암 세포주를 이형이식 시킨 것을 보여주는 사진이다.
도 13는 종양(난소암 세포주)을 유발한 마우스 모델에 B12 항체를 투여한 효과를 보여주는 도면이다.
도 14는 종양(난소암 세포주)을 유발한 마우스 모델에 B12 항체와 카르보플라틴을 병용 투여한 효과를 보여주는 도면이다.
도 15는 B12 항체와 CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)가 결합부위에 있어 경쟁하는지를 확인하기 위하여 유세포 분석방법(Flow cytometry)을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 16은 B12 항체의 친화도를 증진시키기 위해 사용한 2 슬라이드 방법의 개요를 보여주는 도면이다.
도 17은 B12 항체의 친화도를 증진시킨 항체들의 결합능력을 비교하기 위하여 유세포 분석방법(Flow cytometry)을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체 개발

항체 개발을 위해 클라우딘 3 및 4 단백질의 루프 2 부위를 대장균을 이용하여 생산한 후 항원으로 사용하였다. 클라우딘 3 항원의 아미노산 서열은 SANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGA(서열목록 제1서열)이며, 클라우딘 4 항원의 아미노산 서열은 TAHNIIQDFYNPLASGQKREMGAS(서열목록 제2서열)이다. 구체적인 항원의 제작방법은 대한민국 등록특허 10-1334207호에 개시되어 있다.

정제된 클라우딘 3 및 4의 항원과 특이적 결합을 하는 항체를 스크리닝하기 위하여 파지 라이브러리 디스플레이법(phage library display)을 이용하였다. 라이브러리는 합성한 인간 scFv 라이브러리를 이용하였으며, 라이브러리에 대한 구체적인 정보는 Construction of a Large Synthetic Human scFv Library with Six Diversified CDRs and High Functional Diversity (H. Y. Yang et al., Mol. Cells., 27:225-235 (2009))에 개시되어 있다. 요약하면, 상기 논문의 표 1에 기재된 오버랩핑 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 PCR을 수행하여 V_H 및 J_H-링커-V_L 서열을 어셈블링 함으로써, V 유전자 레퍼토리(repertoires)를 어셈블링 하였다. 먼저 V_H-CDR-H3를 PCR하여 얻어낸 다음, 다시 PCR을 이용하여 J_H-링커-V_L에 연결시켜서 scFv PCR 생성물(-750bp)을 얻어내었다. 이렇게 얻어진 scFv 단편을 pComb3X vector(Scott, J.K. and C.F. Barbas, III, Phage Display Vectors. In phage display: A Laboratory Manual, C.F. Barbas, III, D.R. Burton, J.K. Scott, and G.J. Silverman, eds. (Cold Spring Harbor, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 2.1-2.19. (2001))에 클로닝하였고, 시퀀싱을 통해 정확한 프레임워크( framework)를 가진 클론들을 선별하였다. 선별된 클론들을 템플레이트(template)로 하여 PCR을 수행하였고, 결과적으로 상기 논문의 표 2에 기재된 scFv 레퍼토리(repertoires)를 만들었다.

상기 scFv 라이브러리를 사용하여 파지 라이브러리 디스플레이법을 이용한 스크리닝을 위해 다음과 같이 바이오패닝(Biopanning)을 진행하였다.

상기 scFv 라이브러리 스톡과 고체 비드에 연결된 항원(solid bead conjugated antigen)을 각각 5% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간 동안 블로킹을 진행하였다. 블로킹이 끝난 항원에서 탈지유를 제거하고 scFv 라이브러리 스톡과 혼합하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 멤브래인 필터(Corning costar Spin-X 0.45um, Cat. No. CLS8126)를 이용하여 scFv-항원 컨쥬게이트(conjugate) 형태로 100 mM TEA 버퍼에 준비하였다. 준비된 scFv-항원 컨쥬게이트(conjugate)를 E.coli TG1 세포에 첨가한 다음, LB/앰피실린(ampicillin)/글루코스(glucose) 아가 배지에서 37℃로 하룻밤 배양하였다. 상기 E.coli TG1 세포를 LB/앰피실린 배지로 옮겨 OD 600 값이 0.5가 될 때까지 배양한 다음, 1 X 10¹¹ - 1 X 10¹²의 헬퍼 파지(helper phage)를 첨가하고 다시 1시간 동안 37℃에서 배양한 후, 카나마이신(kanamycin)을 첨가하여 다시 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양한 배양액을 원심분리한 다음, 상층액을 PEG 용액과 4℃에서 반응시킨 후 다시 원심분리하여 펠렛을 분리하였다. 펠렛을 PBS에 녹인 다음, 원심분리하여 상층액을 scFv 라이브러리 용액으로 확보하였다. 이와 같은 과정을 4차례 반복하여 클라우딘 3 및 4의 항원과 특이적 결합을 하는 scFv 후보군을 확보하였다.

확보된 scFv 후보군에서 결합력이 우수한 scFv를 선별하기 위하여 각각 클라우딘 3 및 클라우딘 4 항원에 대하여 ELISA 분석을 수행하였다. 4차 패닝이 끝난 라이브러리 스톡을 LB/앰피실린(ampicillin)/글루코스(glucose) 아가 배지에서 하룻밤 배양한 다음, 각각의 단일 콜로니(single colony)를 LB/앰피실린 배지 200 ㎕에 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음, IPTG 농도가 1 mM이 되도록 섞어준 후 다시 30℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양이 진행되는 동안 클라우딘 3 또는 클라우딘 4 항원을 플레이트에 25 - 250 ng/well이 되도록 코팅하였다. 배양이 완료되면 배양액을 원심분리하여 세포만을 분리한 다음, TES 버퍼를 이용하여 세포를 용해시켜서 scFv를 확보하였다. 확보한 scFv를 항원이 코팅된 플레이트에 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 이차 항체(anti-HA HRP, santacruz, Cat. No.sc-7392)를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이차 항체반응이 완료되면 TMB를 첨가하여 발색반응을 시키고 ELISA 리더기(450 nm)를 이용하여 분석하였다(도 1). ELISA 분석값을 상대적으로 비교하여 상위 12개의 우수한 scFv를 1차적으로 선별하였다. 선별한 scFv들의 아미노산 서열을 분석한 결과, 다음과 같았다(표 1).

	경쇄 가변영역			중쇄 가변영역
	CDRL1	CDRL2	CDRL3	CDRH1	CDRH2	CDRH3
B12	TGSSSNIGSNAVT	ADSHRPS	GAWDDSLNA	GYYMS	VISHDGSSTYYADSVKG	DARVCTPKRCYSYDAMDV
B9	SGSSSNIGSNAVS	ADSQRPS	GTWDYSLSG	SYDMS	GISYSGGSTYYADSVKG	APLICSNLICYSYNAMDV
C10	TGSSSNIGSNSVS	ANSNRPS	GTWDASLSA	NYAMS	VISSSSGNTYYADSVKG	ALGHTHKKHFYSAYGMDV
D12	TGSSSNIGSNYVY	SDSKRPS	ASWDDSLSA	GYAMS	AISPGSGSIYYADSVKG	GVHDGDRRPFDY
E6	TGSSSNIGSNAVT	ADSHRPS	GAWDDSLNA	NYAMS	GISSDNGSTYYADSVKG	DAPAITVTRFDY
H12	SGSSSNIGSNNVT	SNSKRPS	GTWDSSLSG	NYDMS	SIYYGNSNTYYADSVKG	GTSTCRHSQCYYDDAMDV
BC4A9	SGSSSNIGNNSVN	ADSNRPS	GSWDDSLNG	NYSMS	AISSDGGSTYYADSVKG	VRSNCYSSHCSSSDAMDV
BC4D1	SGSSSNIGNNSVY	SDSQRPS	GTWDYSLNG	DYSMS	VIYSGDGSTYYADSVKG	QLPWFDY
BC4D4	SGSSSNIGNNDVY	SDSKRPS	ASWDDSLNG	DYDMS	AISSSDGSIYYADSVKG	FTPFDY
RC3F9	TGSSSNIGNYYVY	ANSHRPS	GAWDSSLSG	GYAMS	AISHGGSSKYYADSVKG	TRPGFDY
BC4H3	TGSSSNIGNNYVN	HDSHPPS	GAWDYSLSA	DYYMS	AISHGGSSKYYADSVKG	DPTQERARLFDY
BC4H12	SGSSSNIGNNYVS	SDNNRPS	GTWDSSLSG	SYDMS	AISHSSGNTYYADSVKG	GRVGTPSRPSYYDAMDV

ELISA를 통하여 선별한 scFv 후보들에 대하여 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 scFv 후보들과 클라우딘 3 및 4를 과발현하는 세포와의 결합여부를 확인하였다(도 2). 우선, 선별한 scFv에 HA tag을 태깅(tagging)하여 anti-HA FITC 항체(Genscript, A01621)에 의해 검출이 될 수 있도록 하였다. 세포는 인간 난소암 세포주인 OVCAR-3(구입처?), CAOV-3 및 SNU8을 사용하였다. 계대배양 중인 3가지 세포를 세포 분리용 버퍼(cell dissociation buffer, Gibco, 13151-014)를 이용하여 단일 세포단위로 분리하여 PBS에 준비하였다. 세포를 대조군과 실험군으로 나누어 각 그룹마다 각각 3 × 10⁵ 세포가 들어가도록 PBS에 준비한 다음, 대조군에는 PBS, 실험군에는 선별한 scFv를 1 - 5 ug/100 ㎕(항체에 따라 다양한 농도로 사용)로 4℃에서 1시간 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척 후 대조군에는 PBS 100 ㎕, 실험군에는 anti-HA taq FITC 항체 1 ug/100 ㎕를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 세척을 하고 BD FACSCalibur로 분석하였다. 대조군에 비하여 선별한 scFv 후보군에서 피크의 이동이 일어나는 것을 확인하였으며, 분석 결과 결합력이 가장 우수한 B12 scFv를 선별하게 되었다.

실시예 2: 전체 IgG 발현벡터 제작

B12 scFv의 CDR 부위를 기반으로 전체 IgG 형태를 발현할 수 있는 발현벡터를 제작하였다. B12 scFv의 경쇄 가변영역(light chain variable region)과 중쇄 가변영역(heavy chain variable region)을 각각 PCR을 통해 얻어낸 다음, 각각을 하나의 벡터에서 경쇄와 중쇄를 동시에 발현할 수 있도록 만들어진 발현벡터인 pYAB(에이비온, 대한민국)에 클로닝하였다.

B12 scFv의 경쇄와 중쇄의 가변영역을 얻기 위해 사용한 프라이머는 다음과 같다:

경쇄F 5`-gatatcatggaaacc-3`

경쇄R 5`-ttaattaatcaggag-3`

중쇄F 5`-cctaggatggaaacc-3`

중쇄R 5`-gtatactcatttgcc-3`

발현벡터에는 경쇄 일정영역(light chain constant region, 서열목록 제97서열)과 중쇄 일정영역(heavy chain constant region, 서열목록 제98서열)이 포함되어 있다. 따라서 발현 벡터로부터 클로닝한 B12 scFv의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역과 함께 경쇄 및 중쇄 일정영역이 발현되어, 결과적으로 B12 scFv의 CDR 영역을 포함하는 전체 IgG, 즉 B12 항체가 만들어지게 된다.

실시예 3: 항체 발현 세포주 제작

CHO 세포주(ATCC)를 이용하여 IgG 발현 세포주를 제작하였다. 트랜스펙션 시약(freestyle MAX; Life Technologies Inc. )을 이용하여 IgG 발현 벡터를 CHO 세포주에 트랜스펙션한 다음, 발현량이 높은 세포주를 선별하기 위하여 퓨로마이신(puromycin)과 MTX(methotrexate)를 이용하여 선별 과정을 진행하였다. 1차 과정에서는 퓨로마이신 10 ug/㎖ 및 MTX 100 nM 또는 퓨로마이신 20 ug/㎖ 및 MTX 200 nM 조건에서 선별 과정을 진행하였다. 2차 과정에서는 퓨로마이신 30 ug/㎖ 및 MTX 500 nM 또는 퓨로마이신 50 ug/㎖ 및 MTX 1000 nM 조건에서 선별 과정을 진행하였다. 2차 선별이 종료된 후, SFB(Simple Fed Batch)를 진행하여 그 중 발현양이 높은 것을 선택하였다. 선택된 배치에 대해 96 well 플레이트에서 Single cell limited dilution을 진행하였고 dot blot 방법으로 각각의 개별 세포의 발현양을 확인 하였다(도 3). 이 가운데 5개의 클론(12, 14, 16, 17, 53번)을 선별하였고, 각각에 대해 125 ㎖ 플라스크까지 scale up을 진행하면서 IgG 발현양이 가장 높은 클론(16번)을 선택하였다.

실시예 4: 항체의 생산 및 정제

항체 생산 세포주를 20 L culture bag(Zacros, Cat. CBC20-1)을 이용하여 CO₂ 8%, 37℃, 35-40 rpm 조건으로 배양하였으며, 최종적으로 1g/L 이상 수준의 항체를 생산하였다.

대량 생산한 항체를 세포주와 분리하기 위하여 8000 rpm으로 원심분리하여 항체가 포함되어 있는 상층액만을 얻은 다음, ultra-filtration (LAPTOP)을 이용하여 농축을 하면서 동시에 PBS 버퍼로 변경시켜주었고, 이후 항체를 정제하기 위해 다음의 공정을 진행하였다.

(1) Protein A 정제

Protein A 정제를 위해 레진(Mabselect SuRe), 결합/세척버퍼(Sodium phosphate, pH 7.0 및 pH 5.0) 및 용출버퍼(Sodium citrate, pH 3.6)를 사용하였다. 결합/세척버퍼는 패킹(packing)된 컬럼 부피의 5배, 용출버퍼는 10 ㎖씩 100% step gradient로 15 ㎖ 코니칼 튜브에 흘려주었다. 이 때, 15 ㎖ 튜브에 중화 반응을 위해 pH 8.0 Tris-HCl 용액을 1/10 부피만큼 미리 넣어 두었다.

(2) 이온교환 크로마토그래피(Ion exchange chromatography)

이온 교환 크로마토그래피의 진행을 위해 B12의 pI값인 8.1 을 기반으로 하여 버퍼를 선택하고 정제를 수행하였다. Cation exchange resin인 SP sepharose(GE healthcare)를 이용하였으며, 결합버퍼(Sodium citrate, pH 5.2), 용출버퍼(Sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.0)를 사용하였다. 결합버퍼는 패킹된 컬럼 부피의 5배, 용출버퍼는 10 ㎖씩 linear gradient로 15 ㎖ 코니칼 튜브에 흘려주었다.

(3) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography)

레진(Butyl HP sepharose, GE healthcare), 결합버퍼(Sodium phosphate, 1.5 M NaCl, pH 7.0) 및 용출버퍼(Sodium phosphate, pH 7.0)을 이용하였다. 결합버퍼는 패킹된 컬럼 부피의 5배, 용출버퍼는 10 ㎖씩 linear gradient로 15 ㎖ 코니칼 튜브에 흘려주었다.

(4) 사이즈 배제 크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography)

세 번의 정제공정을 거친 항체를 크기별로 분리하기 위해 사이즈 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 우선 70-80 cm 길이의 컬럼에 레진(Sephacryl S-300 HR)을 패킹하고, PBS 용액으로 equilibration을 진행한 다음, 컬럼 부피 2배의 양을 로딩하여 분리를 진행하였다.

실시예 5: 정제된 항체의 순도 확인

정제된 항체의 순도를 확인하기 위하여 HCP 분석, HCD 분석 및 Protein A 분석을 수행하였다.

(1) HCP (Host Cell Protein) 분석

HCP 분석은 정제된 항체에 생산세포의 단백질이 어느 정도 남아있는지를 검출하는 방법으로서 분석을 위해 CHO HCP 분석 키트(CHO HCP assay kit, F015, Cygnus Tech.)를 제작자의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 분석결과, 정제된 B12 항체에서의 흡광도가 0.0012이하로 나왔으며 이는 정제된 항체에 HCP의 혼입이 없다는 것을 보여주는 것이다(도 4).

(2) HCD (Host Cell DNA) 분석

HCD 분석은 정제된 항체에 생산세포의 DNA가 어느 정도 남아있는지를 검출하는 방법으로서 분석을 위해 CHO HCD 분석 키트(CHO HCD assay kit, Cygnus Tech.)를 제작자의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 분석결과, 정제된 B12 항체에서의 형광값이 2.69이하로 나왔는데, 이는 스탠다드의 0 ng/㎖ 의 값에 근접한 수치로서 HCD의 혼입이 없다는 것을 보여주는 것이다.

(3) Protein A 분석

정제된 항체에 정제될 때 사용되었던 Protein A가 얼마나 있는지를 검출하기 위하여 Protein A 분석키트(Protein A assay kit, F400Z, Cygnus Tech.)를 제작자의 메뉴얼에 따라 사용하였다. 분석결과 흡광도가 0.121이하로 나왔으며 이는 정제된 항체에 Protein A의 혼입이 없다는 것을 보여주는 것이다(도 5).

실시예 6: 개발된 항체의 결합 친화성( binding affinity ) 확인

B12 항체의 클라우딘 3 및 클라우딘 4에 대한 결합 친화성을 확인하기 위하여 유세포계수법(Flow cytometry), 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 분석 및 면역침강법(Immunoprecipitation)을 수행하였다.

(1) 유세포계수법(Flow cytometry)

양성 대조군 항체(positive antibody)로 상업적으로 구입이 가능한 인간 클라우딘 3 항체(human claudin-3 flourescein Mab, FAB4620F, R&D)와 인간 클라우딘 4 항체(human claudin-4 flourescein Mab, FAB4219F, R&D)를 사용하였다. 이차 항체로 goat anti-human IgG-FITC(SantaCruz biotechnology, sc-2456)를 사용하였다. 세포는 양성 대조군으로 클라우딘 3와 4를 과발현하는 것으로 알려져 있는 인간 난소암 세포인 OVCAR-3(ATCC), 음성대조군으로 클라우딘 3와 4의 발현이 매우 낮은 것으로 알려져 있는 TOV-112D(ATCC)를 사용하였다. 각각의 세포를 세포 분리 버퍼(cell dissociation buffer, Gibco, 13151-014)를 이용하여 단일 세포 단위로 준비한 다음, 각각 3 × 10⁵ 세포에 대조군에는 PBS를, 실험군에는 B12 항체(1 ug/100 ㎕ 또는 2 ug/100 ㎕)를 처리한 후 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척한 후 대조군에는 구입한 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체를 1 ug/100 ㎕ 처리하거나 PBS만을 100 ㎕ 처리하였고, 실험군에는 이차 항체인 goat anti-human IgG-FITC를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 PBS로 세척한 다음, BD FACSCalibur를 이용하여 분석하였다. 분석결과, B12 항체는 대조군 항체 중 인간 클라우딘 3 또는 4 항체와 유사하게 양성대조군 세포인 OVCAR-3에서는 피크의 이동(peak shift)을 나타내었으며, 음성대조군 세포인 TOV-112D에서는 피크의 이동(peak shift)을 나타내지 않았다(도 7). 이러한 결과는 B12 항체가 상업적으로 구입 가능한 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체와 유사하게 난소암 세포에 대해 결합 친화성이 있다는 것을 보여주는 것이다.

(2) 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 분석

SPR kinetics 분석은 항원만 존재할 때와 항원-항체 복합체가 존재할 때의 공명각이 다른 것을 이용하여 항원-항체 복합체가 얼마나 형성되었는지를 알아볼 수 있는 방법이다. 리간드로 B12 항체 제작에 사용한 항원인 클라우딘 3 또는 4 펩타이드를, analyte로 B12 항체를 사용하였으며 SR7000 Gold sensor slide (Reichert Inc, 13206061)를 이용하여 SPR 분석을 진행하였다. SPR system(Reichert Inc, SR7500DC)에 gold sensor slide를 장착한 다음, PBS(sonication)로 센서안정화를 진행하였다. 센서가 안정화된 그래프를 형성하면 0.2 M EDC와 0.05 M NHS를 1:1 비율로 혼합한 시약으로 센서를 활성화 시킨 다음, 준비한 리간드를 고정용 버퍼(Immobilization buffer)에 용해시켜 센서의 검출 채널(detection chanel) 에 흘리면서 붙여주었다. 리간드가 충분히 센서에 붙으면 1 M ethanolamine으로 블록킹을 해준 다음, B12 항체를 흘려 보내면서 kinetic를 분석하였다(도 8). 분석결과, B12 항체의 kinetic value는 1.92(2) nM로 나타났으며, 이는 B12 항체가 클라우딘 3 및 4에 대해 높은 결합 친화성을 지고 있다는 것을 보여주는 것이다.

(3) 면역침강법(Immunoprecipitation)

대조군 항체(positive antibody)로 상업적으로 구입이 가능한 인간 클라우딘 3 항체(human claudin-3 flourescein Mab, FAB4620F, R&D)를 사용하였다. 세포는 양성 대조군으로 클라우딘 3와 4를 과발현하는 것으로 알려져 있는 인간 난소암 세포인 OVCAR-3(ATCC)를 사용하였다. OVCAR-3 세포를 배양하여 수집한 다음 원심분리하여 세포만을 분리하고 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS에 풀어주었다. 1 ㎖ 주사기를 활용하여 세포를 10번 정도 펌핑하여 세포를 파쇄시켰다. 4℃ 5000 rpm에서 5분동안 원심분리한 다음, 상층액만을 새로운 튜브에 수거하여 다시 한 번 4℃ 10000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액만을 분리하였다. 상층액에서 단백질을 일반적인 방법에 따라 정량한 다음, 각 샘플당 1 mg의 단백질이 들어가도록 튜브에 분주하고, 각 튜브에 항체(인간 전체 IgG, 클라우딘 3항체, B12 항체)를 넣어준 후 4℃에서 30분에서 1시간 동안 회전시키면서 항체와 단백질간 결합반응이 일어나도록 하였다. 항체가 결합반응을 하는 동안, Protein A bead (Roche)를 준비하였다. 비드를 튜브로 옮겨 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS에 3번 세척하여 평형화(equilibration) 시켜주었다. 비드를 샘플 당 50 ㎕씩 들어가도록 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS에 풀어주었다. 항체 결합반응이 끝난 샘플에 각각 50 ㎕씩 비드를 첨가한 다음, 다시 4℃에서 1시간 동안 회전시키면서 비드 결합반응을 진행하였다. 비드 결합반응이 완료되면, 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS로 3번 세척한 다음, 2x 샘플 버퍼 30 ㎕씩을 넣어주고 볼텍싱을 하였다. 100℃에서 5분 동안 끓여준 다음, 스핀 다운(spin down) 하여 통해 비드를 침강시켰다. 상층액만을 분리하여 12% SDS gel에서 전기영동을 수행한 다음, 일반적인 방법에 따라 웨스턴 블랏팅을 수행하였다(도 9). 분석결과, B12항체에 의해 항체 농도 의존적으로 클라우딘 3가 면역침강되는 것을 확인하였다.

실시예 7: 개발된 항체의 세포독성 확인

B12 항체의 세포독성을 확인하기 위하여 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)와 Complement dependent cytotoxicity(CDC)를 수행하였다.

(1) Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)

ADCC를 확인하기 위해 ADCC Reporter Bioassay Kit(Promega, G7014)를 사용하였다. 분석키트에 포함되어 있는 RPMI 1640 배지 33.6 ㎖에 IgG 혈청 1.4 ㎖을 넣어 ADCC 분석용 버퍼를 만들어 37 ℃에 놓아두었다. 키트에 포함되어 있는 대조군 항체인 anti-CD20 및 B12 항체의 연속적 희석(serial dilution)을 수행하였으며, 항체의 희석은 v-bottom 96-well 플레이트에 전체 부피가 150 ㎕가 되도록 하였다. 키트에 들어 있는 타겟 세포인 WIL2-S를 녹인 다음, 플레이트에 분주하였다. 타겟 세포의 분주는 75 ㎕ ADCC 분석용 버퍼(assay buffer) 당 약 10,000개의 세포가 분주될 수 있도록 하였다. 세포를 분주한 다음, 미리 희석하여 준비해 두었던 항체를 25 ㎕씩 처리하였다. 키트에 포함되어 있는 이펙터(effector) 세포 630 ㎕를 3.6 ㎖의 분석용 버퍼에 녹인 다음, 각 well 당 25 ㎕씩 넣어주고 37 ℃ CO₂ 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 플레이트를 15분 동안 상온에 보관한 뒤, Bio-Glo 루시퍼라제(luciferase) 분석용 버퍼와 기질(substrate)을 섞어 미리 준비한 루시퍼라제 분석용 시약을 75 ㎕씩 넣어주었다. 5-30분 후, 루미네선스(luminescence)를 측정하였다(도 10). 분석 결과, 대조군인 IgG의 EC₅₀ 값과 상응하는 B12의 EC₅₀ 값이 16.0 ng/㎖ 라는 것을 확인하였다.

(2) Complement dependent cytotoxicity (CDC)

CDC 분석을 위해 CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay Kit(Promega)를 사용하였다. 키트에 들어있는 타겟 세포를 각 well 25 ㎕ 당 5,000개 세포가 들어가도록 분주하여 배양하였다. 배양한 타겟세포를 각 well 당 25 ㎕씩 넣어준 다음 항체(25 ㎕/well)를 처리하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 각 well 당 인간 혈청(Sigma)을 50 ㎕씩 첨가한 후, 37 ℃에서 6시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 각 well 당 Cytotox-Glo mixture를 50 ㎕씩 넣어준 후, 상온에서 15분 동안 배양하였다. 플레이트 리더기를 이용하여 RLU 값을 측정하였다. 다시 용해 버퍼(Lysis buffer)를 50 ㎕씩 첨가한 후, 상온에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트 리더기를 이용하여 RLU 값을 측정하였다. 세포의 용해 전후의 RLU 값을 비교하여 세포 독성(cytotoxicity)을 분석하였다(도 11).

실시예 8: 개발된 항체의 난소암 성장 억제 효능

개발된 B12 항체의 농도에 따른 항암 효과를 확인하기 위하여 마우스 모델을 이용하였다. 우선 난소암이 유발된 마우스 모델을 확립하기 위해 6-8주령이 된 흉선이 없는 누드 마우스(athymic nude mouse, AthymicNude - Foxn1nu, Harlan Laboratories, Italy)를 사용하였으며, 이종 이식 모델(xenograft model)을 만들 세포주로 난소암 세포주인 OVCAR-3(ATCC)를 사용하였다. OVCAR-3 세포주를 2 × 10⁶ cells/㎖ 되도록 PBS에 준비한 다음, matrigel(Corning, Cat.No 354248)를 세포와 100 ㎕: 100 ㎕로 섞어서 얼음에 보관하였다. 마우스를 마취한 다음, 준비한 matrigel과 섞여있는 세포를 주사기를 이용하여 피하로 투여하였다. 일정기간 동안 종양 덩어리(tumor mass)의 생성 여부를 관찰하였으며(도 12), 종양이 약 65 - 100 mm³의 크기로 성장한 시점에 마우스들을 각각의 실험그룹으로 나누어 약물처리를 시작하였다.

그룹은 다섯 개로 나누어 실험을 진행하였다. 첫 번째 그룹은 대조군으로 hIgG만을 투여하였으며, 두 번째 그룹은 다른 대조군으로 난소암의 주요 항암제인 카르보플라틴(carboplatin, 8 mg/kg)을 투여하였다. 세 번째 그룹은 저용량의 B12 항체(20 mg/kg)를 투여하였으며, 네 번째 그룹은 고용량의 B12 항체(50 mg/kg)를 투여하였다. 다섯 번째 그룹은 카르보플라틴과 B12 항체의 시너지 효과를 확인하기위하여 B12 항체(20 mg/kg)와 카르보플라틴 (8 mg/kg)를 병용투여하였다. B12 항체와 카르보플라틴 투여는 복강내 주사방법으로 3일 간격으로 일주일에 2회씩 총 4주간 투여하였다.

실험결과, 고용량의 B12 항체(1 mg)를 투여한 경우, 대조군과 비교하여 종양의 부피가 40 % 정도 줄어든 것을 확인하였다(도 13, p value < 0.05). 또한 B12 항체와 카르보플라틴을 병용 투여하는 경우, 카르보플라틴 단독 투여와 비교하여 종양의 부피가 30 % 정도 줄어든 것을 확인하였다(도 14, p value < 0.01).

이러한 결과는 B12 항체가 난소암 치료에 효과적이며, 또한 기존의 난소암 치료제인 carboplatin과 병용 투여시 시너지 효과를 나타낼 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 9: 개발된 항체와 기존 항체의 에피토프 비교

CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)는 클라우딘 3 또는 4의 두 번째 루프에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 기존에 보고된 클라우딘 항체의 경우 클라우딘과의 결합부위에 있어 CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)와는 경쟁하지 않는 것으로 알려져 있다(Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4. Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)).

본 발명에서 개발한 B12 항체의 경우 클라우딘과의 결합부위에 있어 CPE와 경쟁하는지를 확인하기 위하여 유세포 분석방법(Flow cytometry)을 이용하여 분석하였다. 항체는 goat anti-human IgG-FITC(SantaCruz biotechnology, sc-2456)와 strepavidin-FITC(eBioscience, 11-4317-87)를 사용하였으며, CPE는 바이오티닐래이션 컨쥬게이션(biotinylation conjugation)으로 제작하여 DMSO에 준비하였다. 세포는 양성 대조군으로 클라우딘 3/4를 과발현하는 것으로 알려진 OVCAR-3(ATCC) 세포를 사용하였고, 음성 대조군으로 클라우딘 3/4를 거의 발현하지 않는 것으로 알려져 있는 TOV-112D(ATCC) 세포와 HT-1080(ATCC) 세포를 사용하였다.

세포를 세포 분리 버퍼(cell dissociation buffer, Gibco, 13151-014)를 이용하여 단일 세포 단위로 준비한 후, 3 × 10⁵ 개의 세포가 들어가도록 분주하였다. 대조군에는 PBS를 처리하였고, 실험군에는 CPE를 농도별(20,40, 80 ug)로 처리한 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척한 후 대조군에는 PBS, 실험군에는 B12 항체를 1ug/100ul로 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척한 후 대조군에는 PBS, 실험군은 goat anti-human IgG-FITC 1 ug/100 ㎕를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 PBS로 세척한 후 BD FACSCalibur로 분석하였다. 분석 결과, CPE의 농도를 높일수록 B12 항체의 결합 피크의 이동(binding peak shift)이 감소하는 것을 확인하였다(도 15). 이와 같은 결과는 B12항체가 CPE와 경쟁적으로 클라우딘 3 또는 4의 두 번째 루프에 결합하는 것을 보여주는 것이며, 본 발명의 개발된 항체가 기존에 보고된 항체와는 결합부위가 다르다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 10: 개발된 항체의 친화도 증진

개발된 B12 항체의 친화도를 증진시키기 위하여 경쇄 셔플링(Light chain shuffling)과 2 슬라이드 방식을 병행하여 이용하였다.

경쇄 셔플링을 위해 B12 항체의 중쇄 가변영역을 유지하면서, 경쇄 가변영역의 CDR 부분이 무작위로 서로 다른 PCR 생성물을 만들었다. 이를 위해 상기 실시예 1에서 사용한 라이브러리에서 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 상기 실시예 2의 전체 IgG 발현 벡터의 제작과 동일한 방식으로 발현 벡터에 클로닝하였다.

Primer	5` -> 3`
Lsh -F	CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCC
Lsh -R	GGGTGGCTGAGTCAGCACAGACTG

2 슬라이드 방식은 B12 항체의 중쇄서열을 유지하면서, 경쇄 가변영역 중 CDR3 부분만을 변경하기 위한 방법으로서, CDR3 전제 서열 중 일부분을 NNKNNK sequence(N : A + C + G + T, K : T + G)가 포함된 프라이머로 PCR을 수행하여 CDR3 부분만을 무작위로 변경하는 방법이다. 이를 위해 상기 실시예 1에서 사용한 라이브러리에서 1차적으로 경쇄부분의 CDR3를 제외한 부분(프라이머: pC3X-F, H-R)과 CDR3 부분(프라이머: 2SLIDE-F, pC3X-B)만이 생성되도록 PCR을 수행하고 다시 2차적으로 변경된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역 전체가 생성되도록(프라이머: pC3X-F, pC3X-B) PCR을 수행하였다(표 3, 도 16). 이렇게 얻어진 PCR 생성물을 실시예 2의 전체 IgG 발현 벡터의 제작과 동일한 방식으로 발현벡터에 클로닝하였다.

Primer	5` -> 3`
pC3X -F	GCACGACAGGTTTCCCGAC
H-R	ACAGTAATAATCAGCCTCATCCTC(GAGGATGAGGCTGATTATTACTGT)
2 SLIDE - 1	GAGGCTGATTATTACTGTNNKNNKTGGGATGATAGCCTGAAT
2 SLIDE - 2	GAGGCTGATTATTACTGTGGTNNKNNKGATGATAGCCTGAATGCT
2 SLIDE - 3	GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTNNKNNKGATAGCCTGAATGCTTAT
2 SLIDE - 4	GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGNNKNNKAGCCTGAATGCTTATGTC
2 SLIDE - 5	GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATNNKNNKCTGAATGCTTATGTCTTC
2 SLIDE - 6	GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATNNKNNKAATGCTTATGTCTTCGGC
2 SLIDE - 7	GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATAGCNNKNNKGCTTATGTCTTCGGCGGA
2 SLIDE - 8	GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATAGCCTGNNKNNKTATGTCTTCGGCGGAGGC
pC3X -B	AACCATCGATAGCAGCACCG

상기 두 가지 방법을 통하여 친화도가 증진된 항체 10개를 선별하였다. 선별된 항체들의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 분석한 결과, 다음과 같았다(표 4).

	경쇄 가변영역
	CDRL1	CDRL2	CDRL3
B12	TGSSSNIGSNAVT	ADSHRPS	GAWDDSLNA
B1	TGSSSNIGSNAVT	ADSHRPS	GAWDDVPNA
B2	TGSSSNIGSNAVT	ADSHRPS	GAWDDNPNA
D7	TGSSSNIGSNAVT	ADSHRPS	GAWDDSPDA
D9	TGSSSNIGSNAVT	ADSHRPS	GAWDDSLGF
D10	TGSSSNIGSNYVS	ANSQRPS	AAWDDSLSG
D11	TGSSSNIGNNYVS	ADSQRPS	ATWDDSLNG
G2	TGSSFNIGSNYVS	ADSQRPS	ATWDDSLNG
G7	TGSSSNIGSNYVT	ADNHRPS	GAWDDSLNG
G8	SGSSSNIGSNYVT	ANSKRPS	GSWDDSLNG
H5	TGSSSNIGSNYVS	ADSQRPS	ATWDDSLNG

친화도를 증진시킨 항체들의 결합 친화성을 확인하기 위하여 상기 서술한 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하는 방법을 사용하여 OVCAR-3 세포에서 항체들의 결합 친화성을 분석하였다. 분석결과, 상업적으로 구입한 클라우딘 3/4 항체의 결합 피크의 이동(binding peak shift)과 비교하였을때 친화도를 증진시킨 항체들이 B12 항체보다 더 많은 피크 이동(peak shift)을 나타내었다(도 17). 이와 같은 결과는 선별된 항체들이 B12 항체에 비해 결합 친화도가 증진되었다는 것을 보여주는 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Abion <120> Monoclonal Antibodies Specific to Claudin 3 and 4, and The Use Thereof <130> PN130728 <160> 98 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Human Claudin 3 <400> 1 Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu 1 5 10 15 Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala 20 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Human Claudin 4 <400> 2 Thr Ala His Asn Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Ala Ser Gly 1 5 10 15 Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala Ser 20 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_B12 <400> 3 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_D10 <400> 4 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_D11 <400> 5 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_G2 <400> 6 Thr Gly Ser Ser Phe Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_G7 <400> 7 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_G8 <400> 8 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_H5 <400> 9 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_B9 <400> 10 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_C10 <400> 11 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_D12 <400> 12 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_E6 <400> 13 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_H12 <400> 14 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Val Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4A9 <400> 15 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Asn 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4D1 <400> 16 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4D4 <400> 17 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp Val Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_RC4F9 <400> 18 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Tyr Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4H3 <400> 19 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4H12 <400> 20 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_B12 <400> 21 Ala Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_D10 <400> 22 Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_D11 <400> 23 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_G2 <400> 24 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_G7 <400> 25 Ala Asp Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_G8 <400> 26 Ala Asn Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_H5 <400> 27 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_B9 <400> 28 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_C10 <400> 29 Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_D12 <400> 30 Ser Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_E6 <400> 31 Ala Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_H12 <400> 32 Ser Asn Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4A9 <400> 33 Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4D1 <400> 34 Ser Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4D4 <400> 35 Ser Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_RC4F9 <400> 36 Ala Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4H3 <400> 37 His Asp Ser His Pro Pro Ser 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4H12 <400> 38 Ser Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B12 <400> 39 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B1 <400> 40 Gly Ala Trp Asp Asp Val Pro Asn Ala 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B2 <400> 41 Gly Ala Trp Asp Asp Asn Pro Asn Ala 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D7 <400> 42 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Pro Asp Ala 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D9 <400> 43 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Phe 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D10 <400> 44 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D11 <400> 45 Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_G2 <400> 46 Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_G7 <400> 47 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_G8 <400> 48 Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_H5 <400> 49 Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B9 <400> 50 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_C10 <400> 51 Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D12 <400> 52 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_E6 <400> 53 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_H12 <400> 54 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4A9 <400> 55 Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4D1 <400> 56 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4D4 <400> 57 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_RC4F9 <400> 58 Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4H3 <400> 59 Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4H12 <400> 60 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_B12 <400> 61 Gly Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_B9 <400> 62 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_C10 <400> 63 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_D12 <400> 64 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_E6 <400> 65 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_H12 <400> 66 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4A9 <400> 67 Asn Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4D1 <400> 68 Asp Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4D4 <400> 69 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_RC4F9 <400> 70 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4H3 <400> 71 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4H12 <400> 72 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_B12 <400> 73 Val Ile Ser His Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_B9 <400> 74 Gly Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_C10 <400> 75 Val Ile Ser Ser Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_D12 <400> 76 Ala Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_E6 <400> 77 Gly Ile Ser Ser Asp Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_H12 <400> 78 Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4A9 <400> 79 Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4D1 <400> 80 Val Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4D4 <400> 81 Ala Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_RC4F9 <400> 82 Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4H3 <400> 83 Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4H12 <400> 84 Ala Ile Ser His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_B12 <400> 85 Asp Ala Arg Val Cys Thr Pro Lys Arg Cys Tyr Ser Tyr Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_B9 <400> 86 Ala Pro Leu Ile Cys Ser Asn Leu Ile Cys Tyr Ser Tyr Asn Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_C10 <400> 87 Ala Leu Gly His Thr His Lys Lys His Phe Tyr Ser Ala Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> CDRH3_D12 <400> 88 Gly Val His Asp Gly Asp Arg Arg Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> CDRH3_E6 <400> 89 Asp Ala Pro Ala Ile Thr Val Thr Arg Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_H12 <400> 90 Gly Thr Ser Thr Cys Arg His Ser Gln Cys Tyr Tyr Asp Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_BC4A9 <400> 91 Val Arg Ser Asn Cys Tyr Ser Ser His Cys Ser Ser Ser Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> CDRH3_BC4D1 <400> 92 Gln Leu Pro Trp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> CDRH3_BC4D4 <400> 93 Phe Thr Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> CDRH3_RC4F9 <400> 94 Thr Arg Pro Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> CDRH3_BC4H3 <400> 95 Asp Pro Thr Gln Glu Arg Ala Arg Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH3_BC4H12 <400> 96 Gly Arg Val Gly Thr Pro Ser Arg Pro Ser Tyr Tyr Asp Ala Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 97 <211> 105 <212> PRT <213> Light chain constant region <400> 97 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 98 <211> 330 <212> PRT <213> Heavy chain constant regioin <400> 98 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (11)

1. (a) 다음 일반식 1로 표시되는 CDR(complementarity determining region)L1, 다음 일반식 2로 표시되는 CDRL2 및 다음 일반식 3으로 표시되는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (b) 다음 일반식 4로 표시되는 CDRH1, 다음 일반식 5로 표시되는 CDRH2 및 서열목록 제85서열 내지 제96서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
   일반식 1
   X₁-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Ile-Gly-X₂-Asn-X₃-Val-X₄
   상기 일반식에서, X₁은 Ser 또는 Thr이고, X₂는 Ser 또는 Asn이고, X₃는 Ala, Tyr, Ser, Asn 또는 Asp이며, 그리고 X₄는 Thr, Ser, Tyr 또는 Asn임.
   일반식 2
   Y₁-Y₂-Y₃-Y₄-Y₅-Pro-Ser
   상기 일반식에서, Y₁은 Ala, Ser 또는 His이고, Y₂는 Asp 또는 Asn이고, Y₃는 Ser 또는 Asn이며, Y₄는 His, Gln, Lys 또는 Asn이며, 그리고 Y₅는 Arg 또는 Pro임.
   일반식 3
   Z₁-Z₂-Trp-Asp-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇
   상기 일반식에서, Z₁은 Gly 또는 Ala이고, Z₂는 Ala, Thr 또는 Ser이고, Z₃는 Asp, Tyr, Ala 또는 Ser이고, Z₄는 Ser, Val 또는 Asn이고, Z₅는 Leu 또는 Pro이고, Z₆는 Ser, Asp, Gly 또는 Asn이며, 그리고 Z₇는 Ala, Phe 또는 Gly임.
   일반식 4
   B₁-Tyr-B₂-Met-Ser
   상기 일반식에서, B₁은 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이며, B₂는 Tyr, Asp, Ala 또는 Ser임.
   일반식 5
   J₁-Ile-J₂-J₃-J₄-J₅-J₆-J₇-J₈-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly
   상기 일반식에서, J₁은 Val, Gly, Ala 또는 Ser이고, J₂는 Ser 또는 Tyr이고, J₃는 Ser, Tyr, His 또는 Pro이고, J₄는 Asp, Ser 또는 Gly이고, J₅는 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이고, J₆는 Ser 또는 Gly이고, J₇는 Ser 또는 Asn이며, 그리고 J₈은 Thr, Ile 또는 Lys임.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 B₁은 Gly, B₂는 Tyr, J₁은 Val, J₂는 Ser, J₃는 His, J₄는 Asp, J₅는 Gly, J₆는 Ser, J₇는 Ser, J₈은 Thr이며, CDRH3는 서열목록 제85서열로 표시되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 X₁은 Thr, X₂는 Ser, X₃는 Ala, X₄는 Thr, Y₁는 Ala, Y₂는 Asp, Y₃는 Ser, Y₄는 His, 그리고 Y₅는 Arg인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 Z₁은 Gly, Z₂는 Ala, Z₃는 Asp, Z₄는 Ser, Val 또는 Asn, Z₅는 Leu 또는 Phe, Z₆는 Asn, Asp 또는 Gly, 그리고 Z₇는 Ala 또는 Phe인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 Z₁은 Gly, Z₂는 Ala, Z₃는 Asp, Z₄는 Ser, Z₅는 Leu, Z₆는 Asn, 그리고 Z₇는 Ala인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
6. 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 암은 난소암인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 6 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 다른 항암제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 다른 항암제는 카르보플라틴(carboplatin)인 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트.

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