CN103205436A - 人源化免疫球蛋白基因座 - Google Patents

人源化免疫球蛋白基因座 Download PDF

Info

Publication number
CN103205436A
CN103205436A CN2012103902342A CN201210390234A CN103205436A CN 103205436 A CN103205436 A CN 103205436A CN 2012103902342 A CN2012103902342 A CN 2012103902342A CN 201210390234 A CN201210390234 A CN 201210390234A CN 103205436 A CN103205436 A CN 103205436A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
gene
sections
nucleic acid
acid molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012103902342A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103205436B (zh
Inventor
R.比罗
W.范肖滕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Therapeutic Human Polyclonals Inc
Original Assignee
Therapeutic Human Polyclonals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Therapeutic Human Polyclonals Inc filed Critical Therapeutic Human Polyclonals Inc
Publication of CN103205436A publication Critical patent/CN103205436A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103205436B publication Critical patent/CN103205436B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Active legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/107—Rabbit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及从转基因非人动物生产人源化抗体的方法和手段。本发明具体涉及用于制备表达人源化抗体的转基因非人动物的新型免疫球蛋白重链和轻链构建物、重组和转基因载体，转基因动物和人源化免疫球蛋白制剂。

Description

人源化免疫球蛋白基因座
本申请是国际申请日为2004年7月15日的国际申请PCT/US2004/023226进入中国、申请号为200480026192.8的题为“人源化免疫球蛋白基因座”的发明专利申请的分案申请。 
依据专利合作条约和PCT条例5.2下的行政指示801(a)(i)款，本申请伴随含有序列表的光盘，该序列表另存为文档39691-0007PCT，创建于2004年7月15日、大小为1.489KB，以及副本拷贝以代替序列表纸件，它们的全部内容通过引用整体结合到本文中。 
技术领域
本发明涉及从转基因非人动物中生产人源化抗体的方法和手段。本发明具体涉及新型免疫球蛋白重链和轻链构建物、重组体和转基因载体，其用于制备表达人源化抗体的转基因非人动物，以及转基因动物和人源化免疫球蛋白制剂。该转基因载体包含人源化免疫球蛋白基因座，其能在转基因非人动物中经历基因重排、基因转变和超突变以产生各种人源化抗体，而保留非人动物基本完整的内源调控和抗体产生机制。获得人源化抗体对人具有最小的免疫原性，适合用于人类患者的治疗处理。 
背景技术
抗体是一类重要的药物产品，已成功用于治疗各种人类疾病和病症，如癌症、变应性疾病、移植排斥和宿主抗移植物反应的预防。 
从动物获得的抗体制剂的主要问题在于在人类患者中非人免疫球蛋白的内在免疫原性。为了降低非人抗体的免疫原性，现已表明通过将动物可变区(V)外显子与人恒定区(C)外显子融合，可获得嵌合的抗体基因。 
已经发展并在临床中使用了人源化单克隆抗体。人源化单克隆 抗体是典型地人抗体，其中某些CDR残基和可能某些FR残基被非人动物例如啮齿动物的抗体中相似位点的残基取代。人源化基本上可按照Winter和其同事的方法进行(Jones等，Nature，321：522(1986)；Riechmann等，Nature，332：323(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534(1988))，通过用非人动物如啮齿动物的CDR或CDR序列代替人类单克隆抗体的相应序列。 
现已描述嵌合体和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失，导致完全抑制了内源性抗体的产生。将人类种系免疫球蛋白球基因座转入这种种系突变的小鼠中，导致在抗原攻击时产生了人抗体。参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255(1993)；Bruggemann等，Year in Immunol.，7：33(1993)。虽然这种遗传工程方法导致了人免疫球蛋白多肽在遗传工程小鼠中的表达，但人免疫球蛋白表达的水平限低。这可能由于免疫球蛋白基因座中种特异性的调控元件，其对于有效表达免疫球蛋白是必需的。如转染细胞系中所证明的，存在于人类免疫球蛋白基因中的调控元件在非人动物中可能没有适当的发挥功能。 
的确，已描述了免疫球蛋白基因中的某些调控元件。特别重要的是重链恒定区下游(3’)的增强子和轻链基因中的内含增强子。此外，虽然仍有待鉴定，免疫球蛋白基因中可存在其它的控制元件。小鼠研究表明免疫球蛋白分子膜形式的膜和胞质尾区，在人类C-γl基因纯合的小鼠血清中对人-鼠嵌合抗体的表达水平起着重要作用。因此，对于在动物中表达异源免疫球蛋白基因，希望使用在动物中相似位置处正常发现的序列取代含有增强子元件、编码跨膜(M1外显子)和胞质尾区(M2外显子)的外显子的序列。 
除了非人类抗体潜在的免疫原性引起的问题外，一般而言抗克隆抗体，无论是嵌合的、人源化或是人类的，其使用进一步受限于以下事实：破坏性疾病，如癌症和毒性病原体感染，由于它们的复 杂性、多因素病因和适应性，很难通过攻击一个靶点进行治疗。当单一确定的靶点变化、进化和突变时，抗这些靶点的单克隆抗体就不能发挥作用。因此，恶性肿瘤可对标准单克隆抗体治疗获得抵抗力。这个问题的解决方法是使用多克隆抗体，其有能力靶向和攻击多种与复杂疾病相连的进化靶点。多克隆抗体也能中和细菌和病毒的毒素，指导免疫应答杀死和消除病原体。 
相应地，对于适合大规模生产高效价、高亲和力、人源化多克隆或单克隆抗体的新方法有巨大的临床需求。 
将人类免疫球蛋白基因引入小鼠的基因组，导致了在遗传工程小鼠中表达各种人抗体库。在人和小鼠中，初级抗体多样性由都基因重排产生。这个过程导致产生了许多不同的重组V(D)J节段，其编码大量具有不同抗原结合位点的抗体分子。然而，在其它动物中，如兔、猪、牛和鸟类，初级抗体多样性由实质上不同的机制所产生，即模板突变(templated mutations)或基因转变和非模板突变或超突变。例如，已确定在兔和鸡中，VDJ重排非常有限(几乎90％的免疫球蛋白产生有3’邻近的VH1元件)，并且抗体多样性由基因转变和超突变产生。相反，小鼠和人类基因转变很少发生，如果有的话。因此，预期在通过基因转变和超突变多样化初级抗体库的动物中，基于基因重排的遗传工程方法将导致动物具有低抗体效价和有限的抗体多样性。因此，用于生产非致免疫抗体制剂以用于人类治疗的大动物的遗传工程，要求替代性的遗传工程策略。 
在转基因非人动物中生产人源化抗体描述于PCT公开号WO 02/12437，公开于2002年2月14日，其公开内容通过引用清楚的整体结合到本文中。WO 02/12437描述了含有一个或多个人源化免疫球蛋白基因座的遗传工程非人动物，所述基因座能在转基因非人动物中经历基因重排和基因转变，包括在主要通过基因转变产生抗体多样性的动物中，以生产各种人源化抗体。获得的人源化抗体对人具有最小的免疫原性，适合用于人患者的治疗处理。它还进一步描述 了新型的核苷酸序列，其来自各种非人哺乳动物如鸡、牛、绵羊和兔的免疫球蛋白重链恒定区节段区的5’至3’侧翼区。其中人类免疫球蛋白重链基因节段的两侧为与这种5’和3’序列同源的序列的重组载体，显示出可用于使用相应的人免疫球蛋白重链基因节段代替非人动物的免疫球蛋白重链基因节段。 
发明内容
一方面，本方面涉及分离的核苷酸分子，其包含两侧为核苷酸序列的人免疫球蛋白基因节段，其中该侧翼序列相同或不同，并且包含间隔区序列的至少约20个连续核苷酸，该间隔区序列来源于主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物的免疫球蛋白重链或轻链基因，或者来源于两种或更多间隔区序列的共有序列。 
另一方面，本发明涉及分离的核苷酸分子，其包含两侧为核苷酸序列的人免疫球蛋白重链或轻链恒定区(C)基因节段，其中该侧翼序列相同或不同，并且包含间隔区序列的至少约20个连续核苷酸，该间隔区序列来源于非灵长类动物的免疫球蛋白重链或轻链基因，或者来源于两种或更多间隔区序列的共有序列。 
又一方面，本发明涉及分离的核苷酸分子，其包含两侧为核苷酸序列的人免疫球蛋白重链或基因节段，其中该侧翼序列相同或不同，并且包含间隔区序列的至少约20个连续核苷酸，该间隔区序列选自SEQ ID NO：1-185(表1)，或者来源于两种或更多间隔区序列的共有序列。 
在一个实施方案中，该侧翼序列包含间隔区序列的至少约50个连续核苷酸。 
在另外一个实施方案中，人免疫球蛋白基因节段是重链V、D或J节段，其中该V节段可以是例如VH3、VH1、VH5或VH4家族的成员。 
在又一个实施方案中，人免疫球蛋白基因节段是轻链V或J节 段，其中该V节段可以是例如κ轻链基因节段，如Vκ1、Vκ3或Vκ4，或是λ轻链节段，如Vλ1、Vλ2或Vλ3。 
在又一个实施方案中，主要通过基因转变和/或体细胞超突变产生抗体多样性的非灵长类动物为，例如，兔、猪、鸟如鸡、火鸡、鸭或鹅、绵羊、山羊、牛、马或驴，然而其它的非灵长类动物如啮齿动物也明确包括在本发明的范围内。 
另一方面，本发明涉及包含任何上述核苷酸分子的重组载体。 
还是另一方面，本发明涉及包含人源化免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因载体，其中该人源化Ig基因座来源于非人动物的Ig基因座或Ig基因座的部分，其包含多种Ig节段，其中 
(a)至少一个该基因节段为侧接有核苷酸序列的人Ig基因节段，该核苷酸序列包含来源于间隔区序列或来源于两种或更多这种间隔区序列共有序列的至少约20个连续核苷酸； 
(b)该基因节段以未重排、部分重排或全部重排的构型并列； 
(c)该人源化Ig基因座能经历基因重排，假如需要，以及基因转变和/或超突变(假如该非人动物是基因转变的动物)，并在非人动物中产生人源化免疫球蛋白库。 
在又一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig重链基因座包含约5-100个V基因节段和至少一个人V基因节段。在一个具体的实施方案中，该人源化Ig重链基因座包含不止一个人V基因节段。 
在另一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig重链基因座包含约5-25个D基因节段。在一个具体的实施方案中，该人源化Ig重链基因座包含一个或数个人D基因节段。 
还是在另一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig重链基因座包含约1-10个J基因节段和至少一个人J基因节段。在一个具体的实施方案中，该人源化Ig重链基因座包含不止一个人J基因节段。 
在另一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig重链基因座包含约1-25个恒定区节段和至少一个人恒定区节段。在一个具体的实施方案中，该存在于转基因载体中的人源化Ig重链基因座包含不止一个人恒定区节段。 
在仍又一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig基因座为非人动物的轻链基因座，它包含至少一个V基因节段、至少一个J基因节段和至少一个恒定(C)区基因节段，其中至少一个基因节段选自人轻链V和J节段和人轻链恒定区节段。在一个具体的实施方案中，该恒定区基因节段为人轻链恒定区基因节段，其可以，例如，是Cλ或Cκ基因节段。在另一个实施方案中，人源化Ig轻链基因座包含两个或更多选自人V和J节段和人恒定区节段的节段。在又一个实施方案中，人源化Ig轻链基因座包含至少一个人V节段、至少一个人J节段和至少一个人恒定区节段。 
在又一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig轻链基因座包含约5-100个V基因节段和至少一个人V基因节段，其中该人V基因节段位于5-100个非人动物V基因节段的下游。在一个具体的实施方案中，该人V基因节段以重排形式直接位于J基因节段的5’。在另一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig轻链基因座包含不止一个人V基因节段。 
在仍又一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig轻链基因座包含约1-10个J基因节段和至少一个人J基因节段。在一个具体的实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig轻链基因座包含不止一个人J基因节段。 
在另一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig轻链基因座包含约1-25个恒定区节段和至少一个人恒定区节段。在一个具体的实施方案中，存在于转基因载体中的人源化Ig轻链基因座包含不止一个人C基因节段。 
在仍又一个实施方案中，存在于转基因载体中的人源化1g基因 座为非人动物的轻链基因座，它包含至少一个V基因节段、至少一个J基因节段和至少一个恒定区(C)基因节段，其中至少一个基因节段选自人轻链V和J节段和人轻链恒定区节段。在一个具体的实施方案中，该恒定区基因节段为人轻链恒定区基因节段，其可以，例如，是Cλ或Cκ基因节段。在另一个实施方案中，人源化Ig轻链基因座包含两个或更多选自人V和J节段和人恒定区节段的节段。在又一个实施方案中，该人源化Ig轻链基因座包含至少一个人V节段、至少一个人J节段和至少一个人恒定区节段。 
在不同方面，本发明涉及包含两个或更多单位的核苷酸分子，该单位从5’至3’方向由5’核苷酸序列、人免疫球蛋白序列和3’核苷酸序列组成，其中5’和3’核苷酸序列相同或不同，包含至少约20个连续核苷酸，该核苷酸来源于在非灵长类动物免疫球蛋白重链或轻链基因中分离编码区的间隔区序列或来源于两种或更多该间隔区序列的共有序列。在具体的实施方案中，该间隔区序列选自SEQ ID NO：1-185(表1)。在另一个具体的实施方案中，5’和/或3’核苷酸序列在所有核酸分子重复单位中都是相同的。在另外一个具体的实施方案中，核酸分子的重复单位包含至少两种不同的5’和/或3’序列。在又一个实施方案中，5’和3’核苷酸序列彼此不同，但是所有的5’核苷酸序列和所有的3’核苷酸序列都相同。 
又一方面，本发明涉及制备包含人源化免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因载体的方法，该人源化免疫球蛋白(Ig)基因座能在非人动物中产生人源化抗体的功能库，包括 
(a)从非人动物中获得包含Ig基因座或其部分的DNA片段，其包含了至少一个V基因节段、至少一个J基因节段和至少一个恒定区基因节段； 
(b)将至少一个人Ig基因节段整合入步骤(a)的DNA片段中以产生人源化Ig基因座，其中该人Ig基因节段两侧为包含至少约20个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸来源于非灵长 类动物免疫球蛋白重链或轻链基因中分离编码区的间隔区序列，或来源于两种或更多这种间隔区序列的共有序列；其中(i)该基因节段以未重排、部分重排或全部重排形式并置，(ii)人源化Ig基因座能经历基因重排，假如需要，在非人动物中产生人源化免疫球蛋白库。 
该人源化Ig基因座可以是人源化Ig重链或轻链基因座。在人源化Ig重链基因座的情况中，步骤(a)中获得的DNA片段另外包含至少一个D基因节段。 
另一方面，本方面涉及包含上述人源化免疫球蛋白基因座的转基因动物和制备这些转基因动物的方法。在一个实施方案中，转基因动物既包含人源化免疫球蛋白重链基因座又包含人源化免疫球蛋白轻链基因座。在另一个实施方案中，存在于转基因动物中的重链和轻链基因座只有一种是人源化的。在另一个实施方案中，至少一种动物免疫球蛋白基因座的所有V、D、J和C区是人源化的。在仍另一实施方案中，转基因动物的内源性免疫球蛋白基因座的所有V、D、J和C区是人源化的。 
又一方面，本发明涉及从依据本发明生产的转基因动物中获得的B细胞。 
仍然又一方面，本发明涉及使用本发明的转基因动物生产的人源化免疫球蛋白、包含人源化免疫球蛋白的抗体制剂或药物组合物。 
附图说明
图1为兔免疫球蛋白基因重链基因座的图示。 
图2-4显示了兔重链间隔区序列的对比。 
图5为兔免疫球蛋白轻链基因座的图示。 
图6说明了使用人VH和兔间隔元件构建免疫球蛋白基因V基因座。 
图7：使用redεβγ系统通过同源重组插入两个盒。上盒含有两 个限制性酶切位点(FseI和AscI)，其侧接在庆大霉素盒上。下盒含有倒置的(i)和突变的(71)loxP位点、FRT位点和MluI限制性位点。在修饰后使用FseI和AscI消化BAC。 
图8显示基于兔K1轻链基因座的人源化兔轻链基因座(rLC3-B)。使用人Cκ取代兔Cκ1。插入人重排的人VκJκ。该合成的人VκJκ与兔Vκ元件有超过80％的序列同源性。 
图9a显示包含鸡轻链基因组基因座的BAC克隆的序列，鸡轻链基因座的核苷酸序列显示于图9b中(SEQ ID NO：186)。 
图10：概述了使用鸡免疫球蛋白间隔区序列和人V元件构建人源化免疫球蛋白基因座。 
图11：概述了使用小鼠或兔免疫球蛋白间隔区序列和人V元件构建人源化免疫球蛋白基因座。 
图12a至12c显示人源化轻链基因座。(a)中显示了含有17个人V假基因和18个鸡间隔区序列的合成序列(图12a，单位1，12235bp，SEQ ID NO：187)。(b)中显示了第二种含有功能重排的人VkJκ基因片段、11个人V假基因、12个鸡间隔区序列和2个内含子的合成序列(图12b，单位2，13283bp，SEQ ID NO：188)。使用来源于BAC 179L1的片段组合单位1和2，该BAC 179L1片段含有人Cκ和兔内含子和间隔区序列(图12c)。 
图13a-e显示了人源化重链基因座。使用部分BAC219D23、27N5和Fos15B组合由人VH3基因片段和兔间隔区和内含子序列组成的四种合成DNA片段(图13a，单位1，6607bp，SEQIDNO:189;图13b，单位2，15699bp，SEQIDNO:190;图13c，单位3，13971bp，SEQIDNO:191;图13d，单位4，15445bp，SEQIDNO:192)，如(图13e)中显示。 
具体实施方式
A.定义
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体展现出对特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体 和其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一类多肽，例如，由淋巴系统低水平产生和由骨髓瘤高水平产生。 
“天然的抗体和免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过共价二硫键与重链相连，而在不同免疫球蛋白同种型的重链间二硫键的数目有所不同。每条重链和轻链也有规律分布的链内二硫键。每条重链在一端有可变域(VH)，随后是多个恒定域。每条轻链在一端具有可变域(VL)和，在另外一段具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一个恒定域对齐，轻链的可变域与重链的可变域对齐。认为具体的氨基酸残基在轻链可变域和重链可变域之间形成了界面(Clothia等，J Mol.Biol.186：651(1985)；Novotny和Haber，Proc.Natl. Acad. Sci.U.S.A.82：4592(1985))。 
术语“可变”是指以下事实：抗体之间可变域的某些部分的序列完全不同，用于各个具体抗体结合和特异性针对它的具体抗原。然而，可变性并非在整个抗体的可变域中平等地分配。在轻链和重链可变域中都集中在被称为互补决定区(CDR)或超变区的三个节段中。可变域较高度保守的部分被称为骨架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，由三个CDR连接。每一条链中的CDR由FR区紧密连接，与其它链的CDR结合，促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第四版，美国国立卫生研究所，Bethesda，MD(1991))。恒定域不直接涉及抗体与抗原结合，但是展现各种效应子作用，例如抗体参与抗体依赖的细胞毒。 
术语“单克隆抗体”用于指由B细胞单克隆合成的抗体分子。 
术语“多克隆抗体”用于指由B细胞多个克隆合成的抗体分子群。在一个具体的实施方案中，多克隆抗体识别数个表位。 
如本文使用的术语“人源化抗体”和“人源化免疫球蛋白”，是指包含部分人免疫球蛋白多肽序列(或由人免疫球蛋白基因阶段编 码的多肽序列)的免疫球蛋白分子。本发明的人源化免疫球蛋白分子可从转基因非人动物中分离到，该非人动物经工程改造以产生人源化免疫球蛋白分子。相对于从动物中制备的或从动物衍生细胞中制备的非人源化免疫球蛋白分子，这种免疫球蛋白分子对灵长类动物尤其对人具有较少的免疫原性。 
本文使用的术语“非人动物”包括但不限于哺乳动物，包括，例如，非人类灵长类动物、兔、猪、鸟(如鸡、火鸡、鸭、鹅等)、绵羊、山羊、牛、马和啮齿动物(如小鼠和大鼠)。优选的非人动物是基本通过基因转变和/域体细胞超突变产生抗体多样性的动物，如兔、猪、鸟(如鸡、火鸡、鸭、鹅等)、绵羊、山羊和牛。特别优选的非人动物为兔和鸡。 
本文使用的术语“非灵长类动物”包括但不限于除了灵长类动物外的哺乳动物，包括上述列举的动物。 
短语“基本通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物”用于指其中抗体多样化的主要机制是基因转变和/或超突变，而不是基因重排的动物。 
本文中使用的术语“Ig基因节段”是指编码各种Ig分子部分的DNA节段，这种节段存在于动物和人类种系中，在B细胞中集合形成重排的Ig基因。因此，本文使用的Ig基因节段包括V基因节段、D基因节段、J基因节段和C区基因节段。 
本文使用的术语“人Ig基因节段”包括天然产生的人Ig基因节段序列、天然产生的人Ig基因节段序列的退化形式，以及合成的序列，其编码的多肽序列基本与天然产生的人Ig基因节段编码的多肽相同。“基本”意味着氨基酸序列的一致性程度为至少约85％-95％。在一个具体的实施方案中，人Ig基因节段使得免疫球蛋白分子在人类中无免疫原性。 
本发明具体的人源化免疫球蛋白分子含有至少部分的人重链或轻链可变区多肽序列。另外具体的免疫球蛋白分子含有至少部分的 人重链和轻链可变区多肽序列，和至少部分的人恒定域多肽序列。 
“人源化抗体的制剂”或“人源化抗体制剂”是指从转基因非人动物(如动物的血清、乳或蛋黄)或转基因非人动物的细胞(如B细胞或杂交瘤细胞)中制备的分离抗体产物或纯化的抗体产物。 
人源化抗体制剂可以是多克隆抗体的制剂，其包括了人源化免疫球蛋白分子的库。人源化抗体制剂也可以是单克隆抗体制剂。 
术语“抗体多样性”和“抗体库”互换使用，是指生物能表达的所有抗体特异性的总和。 
本文使用的术语“间隔区序列”是指任何位于免疫球蛋白重链或轻链基因中的非编码核苷酸序列。因此，该术语具体包括免疫球蛋白重链基因中的内含子序列和任何其它在V、D、J节段和C区节段内分隔编码区的非编码序列，包括免疫球蛋白轻链基因中的内含子序列和任何其它在V、J节段和C区节段内分隔编码区的非编码序列，以及包括免疫球蛋白重链或轻链基因中侧接调控元件(如增强子)的非编码序列。此外，在编码跨膜螺旋部分的外显子和重链和轻链的增强子之间的非编码序列也具体地包括在内。 
能经历基因重排和基因转变的Ig基因座在本文中也指“功能性”Ig基因座，由功能性Ig基因座产生的多样性抗体在本文中也指“功能性”抗体或抗体的“功能性”库。 
B.相关文献
免疫球蛋白中的调控元件已由Bradley等(1999)，Transcriptional enhancers and the evolution of the IgH locus；Lauster，R.等，Embo J 12：4615-23(1993)；Volgina等，J Immunol 165：6400(2000)；Hole等，J Immunol 146：4377(1991)描述。 
Bucchini等，Nature 326：409-11(1987)；Knight等，Advances in Immunology 56：179-218(1994)；Langman等，Res Immunol 144：422-46(1993)已描述了鸡和兔中通过基因转变引起的抗体多样性。 Pluschke等，Journal of Immunological Methods 215：27-37(1998)已描述了生产表达人-小鼠嵌合抗体的小鼠。Zou等，Science 262：1271-1274(1993)；Zou等，Curr Biol 4：1099-1103已描述了生产表达具有小鼠来源膜和胞质尾的人-鼠嵌合抗体的小鼠。Bruggemannd等，Curr Opin Biotechnol 8(4)：455-8(1997)；Lonberg等，Int Rev Inimunol 13(1)：65-93(1995)；Neuberger等，Nature 338：350-2(1989)已描述了生产表达人免疫球蛋白多肽的小鼠。Yang等，Nat Biotechnol 15：859-65 (1997)已描述了使用BAC克隆生产转基因小鼠。Kuroiwa等，Nature Biotech 20(9)：889-894(2002)已描述了生产表达人抗体的牛。 
Fan，J.等，Pathol Int 49：583-94(1999)；Brem等，Mol Reprod Dev 44：56-62(1996)已描述了转基因兔的产生。McCartney-Francis等，Mol Immunol 24：357-64(1987)；Allegrucci等，Eur J Immunol 21：411-7(1991)已描述了免疫球蛋白表达受损的兔。 
在Sherman等，Nature Biotech 16：1050-1053(1998)；Etches等，Methods in Molecular Biology 62：433-450；Pain等，Cells Tissues Organs 165(3-4)：2l2-9(1999)；Sang，H.，“Transgenic chickens-methods and potential applications”，Trends Biotechnol 12:415 (1994)；WO2004003157，″Gene regulation in transgenic animals using a transposon based vector″和WO200075300，″Introducing a nucleic acid into an avian genome，useful for transfecting avian blastodermal cells for producing transgenic avian animals with the desired genes，by directly introducing the nucleic acid into the germinal disc of the egg″中，已描述了转基因鸡的产生。 
Frommel等，J Immunol 105(1)：1-6(1970)；Benedict等，Adv Exp Med Biol 1977；88(2)：197-205已描述了γ-球蛋白血(globulinemic)鸡。 
T.Wakayama等，Nature 1998；394：369-374；J.B.Cibelli等，Science 280：1256-1258(1998)；J.B.Cibelli等，Nature Biotechnology 1998；16：642-646；A.E.Schnieke等，Science 278：2130-2133(1997)； K.H.Campbell等，Nature 380：64-66(1996)，Kuroiwa等，Nature Genetics 2004年6月6日已描述了从细胞克隆动物。Stice等，Biology of Reproduction 39：657-664(1988)，和Challah-Jacques等，Cloning and Stem Cells 8(4)：295-299(2003)已描述了核移植克隆兔。 
已在美国专利第5,814,318号、第5,545,807号和第5,570,429号中描述了从转基因动物生产抗体。在美国专利第5,416,260中例证了嵌合哺乳动物宿主的同源重组。在美国专利第5,567,607号中描述了将DNA引入胚胎的方法。在美国专利第5,453,357号中描述了胚胎干细胞的维持和扩张。 
Butler，J.E.(1998)，“Immunoglobulin diversity，B-cell and antibody repertoire development in large farm animals”，Rev Sci Tech 17：43中综述了在猪、绵羊和牛中参与抗体库多样性的机制。Reynaud，C.A.，C.Garcia，W.R.Hein和J.C.Weill(1995)，“Hypermutation generating the sheep immunoglobulin repertoire is an antigen-independent process”，Cell 80：115；和Dufour，V.，S.Malinge和F.Nau.(1996)，“The sheep Ig variable region consists of a single VH family”，J Immunol 156：2163已描述了绵羊中的抗体多样性。 
C.详述
免疫球蛋白重链和轻链基因包含数个由单个基因编码并由内含子序列分隔的节段。因此人免疫球蛋白重链的基因位于第14号染色体。重链可变区(VH)包含三个基因节段：V、D和J节段，随后是编码C区的多基因。V区与C区被大的间隔区序列所分开，编码V、D和J节段的单个基因也被间隔区序列所分开。 
有两类免疫球蛋白轻链：κ和λ。人κ轻链的基因位于第2号染色体，人λ轻链的基因位于第22号染色体。抗体轻链的可变区包括V节段和J节段，由单独的基因节段编码。在κ轻链基因的种系构型中，大约有100-200个线性排列的V区基因，每个基因拥有各自的 前导序列，随后是大约5个J基因节段和C区基因节段。所有的V区都被内含子所分开，内含子也分开V、J和C区基因节段。 
免疫系统防御感染的能力取决于特异性产生各种抗体库的遗传机制。B细胞中编码抗体的基因在可变区(V)中以允许无数结合位点组合的方式装配。据估计超过1012种可能的结合结构源于这种机制。在所有的动物中，包括人类，制备抗体的过程开始于重组免疫球蛋白(Ig)基因座的可变(V)、多样性(D)和连接(J)节段。按照这个步骤，依赖动物种类，两种通用机制用于产生各种抗体结合结构。 
在某些动物中，例如人和小鼠中，在免疫球蛋白重链基因座上存在V、D和J基因节段的多拷贝，在免疫球蛋白轻链基因座上存在V和J基因节段的多拷贝。在这些动物中的抗体多样性主要由基因重排产生，即基因节段的不同组合形成重排的重链可变区和轻链可变区。然而，在其它动物中(如兔、鸟如鸡、鹅和鸭以及绵羊、山羊和牛)，基因重排在产生抗体多样性中起着较小的作用。例如，在兔中，只有非常有限数量的V基因节段，最通常是在V区3’末端的V基因节段，用于基因重排形成连续的VDJ节段。在鸡中，只有一个V基因节段(邻近D区的一个节段，或“3’邻近的V基因节段”)、一个D节段和一个J节段用于重链重排；只有一个V基因节段(3'邻近的V节段)和一个J节段用于轻链重排。因此，在这些动物中，在由结合多样性引起的最初重排可变区序列中只有很少的多样性。重排的Ig基因的其它多样性通过基因转变所完成，在这个过程中，来源于上游V基因节段的短序列取代了重排Ig基因中V基因节段内的短序列。此外，抗体序列的多样性可由超突变产生。 
免疫球蛋白(抗体)分为5类(IgG、IgM、IgA、IgE和IgD)，在免疫防御中各自起着不同的生物学作用。在血液中量最多、在应答感染时最有效的是IgG类。在人IgG类内，有四个亚类(IgG1、IgG2，IgG3和IgG4同种型)，其由包含Fc域的重链恒定区结构所决定。抗体的F(ab)域结合抗原上的特定序列(表位)，而抗体的Fc域募集和激活其 它的免疫系统元件以清除抗原。 
自从19世纪90年代以来，抗体已成功的用作为治疗剂，那个时候发现从动物获取的多克隆抗血清可治疗人类中威胁生命的感染。随着重组产生抗体的方法的发展，随后是用于在非人动物中制备全人单克隆抗体的人源化技术和方法的发展，抗体研究中发生了显著的进步。 
结果是，最近嵌合、人源化和人单克隆抗体作为一类重要的药物产品出现。而当阻断具体的靶点(如受体和配基)时，基于单克隆抗体的药物在治疗疾病中非常有效，某些破坏性的疾病，如癌症和有毒病原体感染，由于它们的复杂性、多因子病因和适应性而可能很难治疗。单克隆抗体寻找单一确定的靶点，而疾病在人群或个体内蔓延期间该靶点发生变化、进化或突变。这种适应进化是单一特异性药物(如单克隆抗体)失效的原因，该药物很快被抗性株所绕开。实例大量存在细菌和病毒对高效抗生素的抗性，恶性癌症对标准抗癌药物如单克隆抗体疗法发展出抵抗力。 
相反，多克隆抗体能结合和消除多种与复杂疾病相连的进化靶标。通过结合多种抗原，甚至在抗原突变的事件中多克隆抗体饱和了靶标并且保持活性。其次，通过信号级联，多克隆抗体诱导了有效的免疫应答，以清除靶抗原、病原体或细胞。这些性质使得多克隆抗体理想地用于治疗感染性疾病和癌症。 
到目前为止，多克隆抗体的用途被供应问题和非人类蛋白的不希望的反应所严格限制。 
本发明提供了新的人源化方法，基于选择性人源化免疫球蛋白(Ig)转基因座的免疫球蛋白编码元件。创造这种人-动物转基因座允许创造高产量表达多样化的、高亲和力人源化(多克隆)抗体的转基因动物。 
第一步，鉴定和测序非人类(包括非灵长类动物)的免疫球蛋白重链和轻链的基因组基因座。例如，作为本发明的一部分，测定了兔 和鸡免疫球蛋白重链和轻链的基因组序列，显示于图1、5和9中。 
兔Ig重链基因组基因座的分析表明，免疫球蛋白重链可变区(Vh)含有许多基因，包括功能基因和非功能假基因。18个Vh基因的比对揭示在兔重链可变区基因序列(Vh1-Vh18)间存在高度的序列一致性(80-90％)。发现兔重链可变区基因与人重链可变区基因的Vh3簇具有最高的同源性。具体而言，兔Vh1-a2基因和人Vh3-23序列的序列比较揭示728％的序列一致性。 
此外，分析了分隔兔重链可变区基因序列的非编码序列(如内含子)。图2-4显示了兔重链内含子序列的对比。发现这种内含子序列分为两组，都是高度保守的。尤其是第1组内含子的成员显示了令人惊讶的高序列一致性(80-90％)。 
分析兔免疫球蛋白轻链可变区基因组序列获得了相似的发现。具体而言，分析兔免疫球蛋白轻链基因座表明轻链可变区(V1)含有许多基因节段，其显示出高度的序列一致性(80-90％)。还进一步发现兔轻链可变区(Vκ)显示出与人轻链可变区基因序列的Vκ1簇高度同源。发现大多数的Vκ序列是有功能的且高度保守的。与在兔重链可变区基因中不同，发现兔轻链可变区基因中的内含子是异种的。 
鸡免疫球蛋白重链和轻链基因组序列的相似研究提供了类似的结果。 
一方面，本发明提供了间隔区序列，其在非灵长类动物重链和轻链基因中分隔编码区。在一个实施方案中，本发明提供了来自动物重链和轻链基因的间隔区序列，该动物基本通过基因转变产生抗体多样性，包括，例如，兔和鸡。然后这种间隔区序列被用于侧接人免疫球蛋白重链或轻链基因节段，用于创造人源化免疫球蛋白基因座的过程。 
间隔区序列典型地包含至少约20个核苷酸，或至少约30个核苷酸，或至少约40个核苷酸，或至少约50个核苷酸，典型地约20至约10000核苷酸长度。间隔区序列可含有适合长度的连续伸展的 核苷酸，其来源于非人类(如非灵长类动物)中天然产生的内含子序列，或者可包括人工序列，该人工序列可以，例如，是两种或更多天然产生的内含子序列的共有序列。 
间隔区序列可包含至少约20个(30、40、50等直至1000，以10个核苷酸增长)连续的核苷酸，其来源于选自SEQ ID NO 1-185(表1)的序列，或来源于两种或更多这种序列的共有序列。可能，但并不必需，通过间隔区序列分隔用于人源化的人重链或轻链序列(如V、D、J和C区序列)，该间隔区序列在其免疫球蛋白待人源化的非人动物(非灵长类动物)基因组序列内分隔了相应区。 
通常，非人动物中免疫球蛋白(Ig)基因座的人源化包括将一个或多个人Ig基因节段整合入动物的基因组，以创造人源化免疫球蛋白基因座。因此，创造人源化Ig重链基因座包括将一个或多个V和/或D和/或J节段和/或C区节段整合入动物基因组。相似地，创造人源化Ig轻链基因座包括将一个或多个V和/或J节段和/或C区节段整合入动物基因组。 
根据使用的方法，可在通常存在动物内源性Ig基因座的染色体区域整合人Ig基因节段，或者整合到动物不同的基因座。不管染色体定位，本发明人源化Ig基因座能在非人动物中经历基因重排和基因转变和超突变，因此产生了人源化Ig分子的多样性库。能经历基因重排和基因转变的Ig基因座也被称为“功能性”Ig基因座，由功能性Ig基因座产生的具有多样性的抗体也被称为“功能性”抗体或抗体分子的“功能性”库。 
又一方面，本发明提供了包含侧接有核苷酸序列的人Ig基因节段的核酸分子，该核苷酸序列包含至少约20个连续核苷酸，来源于间隔区序列或来源于两种或更多这种间隔区序列的共有序列，该间隔区序列在非灵长类动物Ig重链或轻链基因中分隔编码区。正如侧翼序列内间隔区序列的来源部分，侧翼序列可相同或不同。来源于间隔区序列或两种或更多这种间隔区序列共有序列的连续核苷酸， 可被直接融合入人Ig基因节段。或者，在人Ig基因有节段和至少一个间隔区-起始核苷酸序列之间可存在插入序列。因此，例如，人V基因节段5’端的侧翼序列可包括启动子区，其直接与人V基因节段连接，并将人V基因节段与间隔区序列来源核苷酸段分离至少20个核苷酸。 
还是又一方面，本发明涉及人源化Ig重链基因座，其中人重链V、D和/或J基因节段和/或C区节段以与最初的非人动物免疫球蛋白基因相同的构型存在，并且被包括至少约20个连续核苷酸的序列所分隔，这些核苷酸来源于在非灵长类动物Ig重链或轻链基因中分隔编码区的内含子序列。在另一个实施方案中，本发明提供了人源化轻链基因座，其中人轻链C区节段和/或J基因节段和或V区节段被非人动物(如非灵长类动物)的内含子序列所分隔，其构型与在最初的非人动物免疫球蛋白基因中相同。在一个具体的实施方案中，基于非人动物(非灵长类动物)非编码(如内含子)序列设计间隔区序列。在一个实施方案中，间隔区可保留来自非人动物(非灵长类动物)的适当非编码序列。或者，为了简化结构，可基于高度同源的非编码序列(内含子)设计共有序列，并且用作统一的间隔区序列，用于制备多种人重链或轻链基因节段。 
本发明特别提供了分离的核苷酸序列和载体，其用于构建人源化免疫球蛋白基因座。 
在一个实施方案中，从通过基因转变产生抗体多样性的动物(如兔和鸡)中分离含有待人源化Ig基因座的DNA片段。通过筛选质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)或细菌人工染色体(BAC)等文库，可分离这种大的DNA片段，并可从非人动物如非灵长类动物的基因组DNA制备。完整的动物C区可包含在一个质粒或粘粒克隆中，其接着被人源化。YAC克隆可携带最多2兆个碱基的DNA片段，因此完整动物重链基因座或其大部分可在一个YAC克隆中分离得到，或者被重建以使其包含在一个YAC克隆中。BAC克隆能携带小尺寸的 DNA片段(约150-450kb)。然而，可分别人源化含有Ig基因座重叠片段的多重BAC克隆，随后一齐注入接受动物细胞，其中在接受动物细胞中重叠的Ig基因座重组以产生连续的Ig基因座。 
通过各种方法，包括连接DNA片段或通过同源重组插入DNA片段，可将人Ig基因节段整合入载体(如BAC克隆)上的Ig基因座。以这种方式进行人Ig基因节段的整合，以致人Ig基因节段有效连接至转基因中的宿主动物序列，以产生功能型人源化Ig基因座，即能基因重排、基因转变和超突变的Ig基因座，其导致产生人源化抗体的多样性库。 
在一个实施方案中，可通过同源重组可将人Ig基因节段整合入Ig基因座。在细菌、酵母和其它具有高频重组事件的细胞中可进行同源重组。例如，使用含有动物Ig基因座或其大部分的YAC转化酵母细胞。随后，进一步使用上文描述的重组载体转化这种酵母细胞，该重组载体携带人Ig基因节段，其连接5’侧翼序列和3’侧翼序列。重组载体中的5’和3’侧翼序列与YAC上动物Ig基因节段的侧翼序列同源。作为同源重组的结果，YAC上的动物基因节段被人Ig基因节段取代。或者，可使用含有动物Ig基因座或其大部分的BAC转化细菌细胞如大肠杆菌。进一步使用重组载体转化这种细菌细胞，该重组载体携带人Ig基因节段，其连接5’侧翼序列和3’侧翼序列。重组载体中的5’和3’侧翼序列介导了重组载体上人Ig基因节段和BAC上动物Ig基因节段之间的同源重组和交换。可轻易从细胞中分离人源化YAC和BAC，并用于制备转基因动物。 
本发明的又一方面提供了制备能产生人源化免疫球蛋白的转基因动物的方法。 
依照本发明，通过将一种或多种本文上述的携带人源化Ig基因座的转基因载体引入动物的接受细胞，并从遗传修饰的接受细胞中衍生动物，制备能产生人源化免疫球蛋白的转基因动物。 
接受细胞可以，例如，来源于通过基因转变和/或超突变产生抗 体多样性的非人动物，例如鸟(如鸡)、兔、牛等。在这种动物中，优选使用3’邻近V基因节段生产免疫球蛋白。通过取代动物的3’邻近V基因节段，或置于3’邻近V基因节段的附近，人V基因节段整合入转基因载体上的Ig基因座中，导致表达大多数免疫球蛋白中的人V区多肽序列。或者，重排的人V(D)J节段可插入到转基因载体上的免疫球蛋白基因座的J基因座中。 
含有人源化Ig基因座的转基因载体被引入接受细胞，然后通过随机整合或通过定向整合与接受细胞的基因组整合。 
对于随机整合，通过标准转基因技术，可将含有人源化Ig基因座的转基因载体引入动物的接受细胞。例如，可直接将转基因载体引入受精卵母细胞的前核。也可在卵母细胞受精之前，通过共育精子和转基因载体而引入转基因载体。可从受精的卵母细胞发育转基因动物。另外一种引入转基因载体的方法是通过转染胚胎干细胞，随后将遗传修饰的胚胎干细胞注入正在发育的胚胎。或者，可将转基因载体(单独的或与促进剂组合)直接注入正在发育的胚胎。最后，从胚胎产生嵌合的转基因动物，该胚胎含有人源化Ig转基因，其被整合入转基因动物的至少某些体细胞的基因组。 
在一个具体的实施方案中，含有人源化Ig基因座的转基因被随机整合入来源于动物品系的接受细胞的基因组(如受精的卵母细胞和正在发育的胚胎)，所述动物品系的内源性免疫球蛋白基因表达受损。这种动物品系的用途允许从人源化转基因Ig基因座优选表达免疫球蛋白分子。这种动物的实例包括Alicia和Basilea兔品系，Agammaglobinemic鸡品系和敲除免疫球蛋白的小鼠。或者，具有人源化免疫球蛋白转基因或基因座的转基因动物可与内源性免疫球蛋白表达受损的动物品系交配。可获得具有受损内源性Ig基因座和人源化转基因Ig基因座纯合的子代。 
对于定向整合，可将转基因载体引入适当的动物接受细胞，如胚胎干细胞或已经分化的体细胞。然后，可通过标准的方法选择其 中转基因整合入动物基因组，并且通过同源重组取代相应内源Ig基因座的细胞。参见，例如，Kuroiwa等，Nature Genetics 2004，6月6日。然后可将选择的细胞与去核移植单位细胞进行融合，如卵母细胞或胚胎干细胞，细胞为全能的并能形成功能新生儿。依照已很好建立的常规技术进行融合。使用注射吸管通过显微外科，也可进行卵母细胞的去核和核移植。(参见，例如，Wakayama等，Nature(1998)394：369)。然后将所得的卵细胞培养于合适的培养基中，并转入同步接受者用于产生转基因动物。或者，可将选择的遗传修饰细胞注入正在发育的胚胎中，其随后发育成嵌合体动物。 
此外，依据本发明，也可通过引入接受细胞一种或多种本文上述的重组载体，制备能产生人源化免疫球蛋白的转基因动物，所述重组载体携带连接5’和3’侧翼序列的人Ig基因节段，该侧翼序列与内源性Ig基因节段的侧翼序列同源，选择其中通过同源重组内源性Ig基因节段被人源化Ig基因节段取代的细胞，并且从选择的遗传修饰接受细胞中得到动物。 
类似转基因载体的定向插入，在这种方法中适合用作接受细胞的细胞包括胚胎干细胞或已经分化的体细胞。通过任何可行的方法，如转染，可将携带人Ig基因节段的重组载体引入这种接受细胞。之后，可通过标准的方法选择其中通过同源重组将Ig基因节段代取代相应内源性Ig基因节段的细胞。这些遗传修饰细胞可在核移植方法中用作核供体细胞用于克隆转基因动物。或者，选择的遗传修饰的胚胎干细胞可注入正在发育的胚胎，其可随后发育成嵌合体动物。 
通过任何上述方法产生的转基因动物形成了本发明另外的实施方案。该转基因动物在基因组中具有至少一个，即一个或多个，人源化Ig基因座，从中产生了人源化抗体的功能库。 
在具体的实施方案中，本发明提供了基因组中具有一个或多个人源化Ig基因座的转基因兔。本发明的转基因兔能重排和基因转变人源化Ig基因座，并能表达人源化抗体的功能库。 
在另一个具体的实施方案中，本发明提供了基因组中具有一个或多个人源化Ig基因座的转基因鸡。本发明的转基因鸡能重排和基因转变人源化Ig基因座，并能表达人源化抗体的功能库。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了基因组中具有一个或多个人源化V区的转基因小鼠。该人源化V区胞含至少两个人V基因节段，其侧接非人类的间隔区序列。该转基因小鼠能重排人V元件，并能表达抗体的功能库。 
一旦制备了能产生多样化的人源化免疫球蛋白分子的转基因非人动物，通过使用抗原免疫动物，可轻易的获得抗抗原的人源化免疫球蛋白和人源化抗体制剂。可使用各种抗原免疫转基因宿主动物。这种抗原包括但不限于微生物例如活的、减毒的或死亡的病毒和单细胞生物(如细菌和真菌)、微生物的片段、从微生物中分离的抗原性分子。 
用于免疫动物的示例性细菌抗原包括：从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)纯化的抗原如5型和8型荚膜多糖、致病因子的重组体形式如α毒素、粘附结合蛋白、胶原结合蛋白和纤连蛋白结合蛋白。示例性细菌抗原的实例也包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠球菌(enterococcus)、肠杆菌(enterobacter)和肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)的减毒形式，或者来源于这些细菌细胞的培养物上清。其它用于免疫的细菌抗原包括纯化的脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖和/或铜绿假单胞菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌的外膜蛋白、纤连蛋白结合蛋白、内毒素和外毒素的重组体形式。 
用于产生抗真菌抗体的示例性抗原包括，真菌或其外膜蛋白的减毒形式，真菌包括但不限于白色假丝酵母(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)。 
用于免疫以产生抗病毒抗体的示例性抗原包括病毒的包膜蛋白 和减毒形式，所述病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(特别是F蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。 
通过使用分离的肿瘤细胞或细胞系免疫转基因动物，可产生用于治疗癌症的治疗抗体。肿瘤相关抗原包括但不限于Her-2-neu抗原(抗它的抗体用于治疗乳腺癌)；CD19、CD20、CD22和CD53抗原(抗它们的抗体用于治疗B细胞淋巴瘤)，(3)前列腺特异性膜抗原(PMSA)(抗它的抗体用于治疗前列腺癌)，和17-1A分子(抗它的抗体用于治疗结肠癌)。 
可以任何方便的方式给予转基因宿主动物抗原，有或没有佐剂，可以依据预定计划给予。 
在免疫接种之后，分级来自免疫转基因动物的血清或乳，纯化特异性作用于抗原的药物级多克隆抗体。在转基因鸟类的情况中，也可通过分级卵黄制备抗体。通过色谱(亲和、离子交换、凝胶过滤等)，使用盐如硫酸铵、有机溶剂如乙醇或聚合物如聚乙二醇选择性沉淀，可获得浓缩的、纯化的免疫球蛋白级分。 
为制备单克隆抗体，从免疫的转基因动物分离脾细胞，用于与转化细胞系融合以生产杂交瘤，或通过标准分子生物学技术克隆编码抗体的cDNA并在转染细胞中表达。制备单克隆抗体的方法在本领域已很好的建立。参见，例如，欧洲专利申请0 583 980 A1 (“Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits”)、美国专利第4,977,081号(“Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof”)、WO97/16537(“Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof”)和欧洲专利0 491 057 B1(“Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G”)，其公开内容通过引用结合到本文中。从克隆的cDNA分子中体外生产单克隆抗体已由Andris-Widhopf等，“Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display”，J Immunol Methods 242：159(2000)和 Burton，D.R.，“Phage display”，Immunotechnology 1：87(1995)描述，其公开内容通过引用结合到本文中。 
从本发明转基因动物得到的细胞，如从用抗原免疫的转基因动物建立的B细胞或细胞系，也是本发明的一部分。 
本发明的又一方面，提供了通过给予希望治疗疾病的纯化人源化抗体组合物，优选为人源化多克隆抗体组合物，用于治疗灵长类动物疾病的方法，特别是人类患者。 
本发明的另一方面，纯化的单克隆或多克隆抗体与适当的适合给予灵长类动物(特别是人类)的药物载体混和，以提供药物组合物。可用于本发明药物组合物的药物可接受载体可以是任何和所有的溶剂、分散介质、等渗剂等。除了其中包含对接受者或对抗体治疗效果有害的任何常规介质、试剂、稀释剂或载体之外，它在本发明药物组合物中的用途是适当的。载体可以是液体、半固体如糊或固体载体。载体的实例包括油、水、盐水溶液、醇、糖、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔性基质、粘合剂、充填剂、涂层、防腐剂等或其组合。 
用于给药的人源化多克隆抗体组合物通常特征为含有多克隆抗体群，免疫球蛋白的浓度为0.1-100mg/ml，更通常从1-10mg/ml。抗体组合物可含有各种同种型的免疫球蛋白。或者，抗体组合物可只含有一种同种型的抗体，或者含有多种所选同种型的抗体。 
在大多数实例中，抗体组合物由未修饰的免疫球蛋白组成，即从动物制备的人源化抗体没有经过另外修饰，如通过化学或酶修饰。或者，可对免疫球蛋白级分进行处理，如酶消化(例如使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、糖苷酶、核酸酶等)、加热等，和/或进一步的分级。 
通常抗体组合物给到血管系统中，通过注射或通过植入适当静脉的导管输液，方便地静脉内给药。依据患者可接受液体的速率，以适当的速率给予抗体组合物，通常从约10分钟至约24小时，更 通常从约30分钟至约6小时。有效剂量的给药可发生在单次输液或一系列输液中。每天一次、每星期一次、每月一次或每三个月一次可给予重复输液，取决于抗体制剂的半寿期和临床指征。对于上皮表面的应用，给予需要治疗的表面足以提供预期最终结果的量的抗体组合物，可按需要重复给予。此外，抗体可例如作为肌内高浓度注射给予，其可以但并非必需，之后进行连续给药，如通过输液。 
抗体组合物可用于结合和中和人体组织中的抗原实体，该抗原实体引起了疾病或引起了不希望的或异常的免疫应答。“抗原实体”在本文中被定义为包含任何可溶或细胞表面的结合分子，包括蛋白，以及细胞或感染性致病生物或介质，其至少能结合抗体，优选也能刺激免疫应答。 
作为单一疗法或与化学疗法结合，给予抗感染性介质的抗体组合物，导致清除感染性颗粒。单次给予抗体通常减少感染性颗粒的数量10-100倍，更通常超过1000倍。相似地，作为单一疗法或与化学疗法结合，使用抗体治疗患有恶性病的患者，通常减少恶性细胞的数量10-100倍，或超过1000倍。可在延长的时间内重复活疗，以确保完全清除感染性颗粒、恶性细胞等。在某些情况中，在不存在可检测量的感染性颗粒或不希望细胞时，继续在延长的时间内使用抗体制剂治疗。相似地，使用抗体治疗用于调整免疫应答可由单次或多次给予治疗抗体组成。不存在任何疾病症状时可继续延期治疗。 
患者治疗可与化疗联合使用，其量足以抑制感染性疾病或恶性肿瘤。在自身免疫疾病患者或移植受者中，抗体疗法也可与免疫抑制疗法结合使用，其量足以抑制免疫反应。本发明由以下的实施例进一步阐明，但不受以任何方式的限制。 
实施例1
分离和测序含有兔免疫球蛋白基因座的BAC克隆
从a2b5雄兔中分离高分子量DNA。对兔进行安乐死，取出脾 脏和肾脏，并在冰冷的PBS中漂洗。各自去除和处理脂肪和结缔组织。器官切成碎块，在预冷的Dounce匀浆机中匀浆。上清转入冷却的50ml falcon管，与冷PBS混和，沉降2分钟允许大的组织碎片沉降到底部。4℃下200g下沉淀上清中的细胞10分钟，用PBS洗涤一次，重新悬浮于1ml PBS中，并计数。使用CHEF哺乳动物基因组DNA Plug Kit(BIORAD)，5x106、5x107和5X108个细胞植入胶块。为了优化使用HindIII部分消化的条件，浆胶块切成5等分，使用1-10单位HindIII在不同时间和温度下消化。使用2单位HindIII 4℃下消化3小时或37℃下消化25分钟获得了最佳的结果。使用以下参数的脉冲场凝胶电泳(PFGE)装置上消化DNA为两倍大小的级分：6小时背景，15秒切换时间(switch time)；6小时向前，15秒切换时间；20小时向前，90秒切换时间；200伏特、14℃。切下具有希望大小的部分消化DNA的凝胶区域，使用琼脂酶分离DNA。I1ng插入物与lng HindIII消化的pBELOBAC 11连接，电穿孔入DH10B细胞。使用NotI测量1％所得菌落，揭示平均插入物的大小为124kb。在尼龙膜上印迹了1x105个克隆，并通过与特异性探针杂交进行筛选。 
使用来自兔的基因组DNA，经PCR扩增用于筛选的探针，克隆入pBlueScript，并经测序证实。依据公开的序列设计引物对(SEQ ID NO：193-208，表2)。分离并制图了某些代表兔重链和轻链免疫球蛋白基因座的BAC(图1和5)。对BAC 219D23、219D23(GenBank检索号AY386695)、225P18(GenBank检索号AY386697)、27N5(GenBank检索号AY386696)、38A2(GenBank检索号AY386694)、179L1(GenBank检索号AY495827)、215M22(GenBank检索号AY495826)、19(GenBank检索号AY495828)和F粘粒Fos15B(GenBank检索号AY3866968)进行了测序。在PCR-Blunt中构建了用于测序的鸟枪文库，插入物大小为1.5-2kb。对于序列分析，使用了STADEN包(Roger Staden，Cambridge，UK)。软件模块pregap和gap4用于装配和缺口闭合。对于序列的质量剪切(quality clipping)，偶联了PHRED(Washington  University)和STADEN包。 
实施例2
构建人源化兔免疫球蛋白重链基因座
使用对恒定、可变或J基因节段或3’增强子区特异的探针，从基因组DNA库中分离含有兔免疫球蛋白重链基因座的BAC和F粘粒克隆。对分离的BAC(图1)27N5(GenBank检索号AY386696)、219D23(GenBank检索号AY386695)、225P18(GenBank检索号AY386697)、38A2(GenBank检索号AY386694)和F粘粒Fos15B(GenBank检索号AY3866968)进行了测序(Ros等，Gene 330，49-59)。 
在由ET克隆的大肠杆菌中，通过同源重组，选择的免疫球蛋白编码序列与相应人免疫球蛋白编码序列进行了交换(E-Chiang Lee等，Genomics 73，56-65(2001)；Daiguan Yu等，PNAS 97，5978-5983(2000)；Muyrers等，NucleicAcids Research27，1555-1557(1999)；Zhang等，Nature Biotechnology 18，1314-1317(2000))。 
或者，通过体外连接并接着转化大肠杆菌，重组DNA片段。通过体外连接和转化、ET克隆或通过Cre重组酶介导的整合，组合BAC和/或Fos15B或其部分。 
对于ET克隆，将含有靶序列的载体转化入含有可诱导λ噬菌体重组酶Redα、Redβ和γ的链霉素抗性大肠杆菌菌株。从共转染质粒(具有质粒pSC101的DH10B大肠杆菌细胞)或从基因组整合的λ原噬菌体(DY380大肠杆菌菌株)表达这些重组蛋白。ET克隆方法包括两个同源重组步骤。 
在第一步中，靶基因座被选择-反选择盒所代替(例如neo-rpsL，其赋予了新霉素抗性(neo)和链霉素敏感性(rpsL))。分离新霉素抗性菌落之后，通过限制性酶分析和部分测序证实通过同源重组插入的选择盒。 
在第二步中，rpsL-neo选择盒与新序列进行交换。通过限制性 分析和测序分析链霉素抗性克隆。用于ET克隆方法的片段具有20-50bp长度的侧翼序列，该序列与靶序列相同。用于连接的序列在它们的3’和5’端有适当的限制性核酸内切酶位点。这些位点是天然存在的位点，或者使用含有适当位点的引物经PCR引入的。 
或者，序列由合成产生。 
通过ET克隆，使用相应人配对物取代BAC 219D23中的兔JH、Cμ和BAC 27N5中的Cγ，构建了人源化重链。从人基因组DNA中经PCR扩增用于ET克隆方法的人序列。 
使用50bp与兔靶序列同源的引物(SEQ ID NO：209-214，表2)扩增人Cμ、Cγ和JH基因节段。 
在BAC克隆225P18和克隆219D23连接，以及BAC27N5与F粘粒15B连接之后，通过Cre重组酶介导的插入将连接的构建物转化入大肠杆菌并连接。这导致形成了由18个兔可变基因、兔D区、人J区、人Cμ、人Cγ、兔Cε、兔Cα4和3’增强子元件组成的功能基因座。 
为产生转基因动物，作为三个重叠的BAC(25P18和219D23和BAC 27N5)或两个重叠组合的BAC(225P18-219D23和BAC 27N5-F粘粒15B)，或者作为一个BAC(225P18-219D23-27N5-F粘粒15B)，各自共同注射人源化BAC克隆。通过PCR鉴定具有转基因的建立者动物。 
实施例3
使用合成片段构建人源化免疫球蛋白重链基因座
化学合成了四种具有人V序列和兔间隔区的片段，称为单位1、单位2、单位3和单位4(图13，SEQ ID NO：189-192)。每一片段的5'侧接了AscI限制性内切酶识别序列，3’侧接了lox71 Cre重组酶识别序列，接着是FseI和MluI限制性内切酶识别序列。单位1由人VH3-49、VH3-11、VH3-7和VH3-15可变基因组成，被兔间隔区129-30、  I3-4、I2-3和I1-2的3’半部分(I1-2B)所分隔。单位2由人VH3-48、VH3-43和VH3-64所组成，被兔间隔区I1-2A(I1-2的5’半部分)、I7-8、I6-7和I4-5的3’半部分(I4-5B)所分隔。单位3由人VH3-74、VH3-30和VH3-9所组成，被兔间隔区序列I4-5B、I26-27、I11-12和I17-18所分隔。 
单位3除了具有先前提及的上游侧接Flp重组酶识别靶序列(FRT)之外，紧跟着Sglf限制性内切酶识别序列，其在先前提及的Asc I位点之前。 
单位4具有人VH3-23基因，在5’侧接兔间隔区序列I1-2、lox66 Cre重组酶靶序列和AscI限制性核酸内切酶识别序列，并且在3’侧接IV-C(5’半部分)兔间隔区序列，随后紧跟MluI核酸内切酶识别序列。 
使用含有AscI和FseI位点的引物SEQ ID NO 215和216(表2)，PCR扩增了庆大霉素选择盒，连接入含有修饰克隆位点的pGEM载体，修饰克隆位点包括AscI、FseI和MluI核酸内切酶识别位点(使用SEQ ID NO 217和218经PCR修饰的pGEM.Genta，表2)。 
将单位1、2和3克隆入pGEM.Genta(Promega)载体。 
单位4被亚克隆入使用Hind III线性化的专门pBELOBACIl(NEB)载体中，并进行PCR扩增。正向引物(SEQ ID NO：219，表2)有HindIII、PacI和AatII的限制性酶切位点，反向引物(SEQ ID NO：220)有BamHI、MluI和AscI的限制性位点。以删除pBELOBAC11氯霉素选择盒的方式设计引物。而且，使用携带Bam HI和Hind III限制性酶切位点的引物SEQ ID NO 221和222(表2)PCR扩增新霉素选择盒，并连接修饰的pBELOBAC11载体(pBB11.1)。 
如所述(Mejia等，Genomics 70(2)165-70(2000))通过cre介导的重组装配单位1-4。将第一个单位1克隆入专门的pgem.Genta载体，使用Fse I消化，随后通过连接重新环化。将这种无载体的构建物转化入含有pBB11.1单位4和p706-Cre质粒的大肠杆菌中。在单位1和pBB11.1单位4重组后，在含有卡那霉素和庆大霉素的培养基上选择阳性克隆(单位4/1)。使用各种酶经限制性分析鉴别克隆。 
为重组单位2，插入的单位4/1被AscI和PacI双消化所切割，并克隆入具有修饰连接基团的pBELOBAC11(pBB11.2：使用引物SEQ ID NO 223和224经PCR修饰，表2)。 
使用HindIII线性化pBELOBAC11，并使用编码PacII和AatII核酸内切酶识别位点的正向引物、编码MluI和NotI核酸内切酶识别位点以及lox66Cre重组酶靶位的反向引物进行扩增。使用MluI和PacI打开pBB11.2载体，用于连接单位1/4。 
将pGEM.Genta.单位2转化为如pGEM.Genta单位1所描述的环状无载体构建物，并通过体内Cre介导的重组与pBB11.2单位4/1连接。随后，通过ET克隆使用lox66靶位取代野生型loxp位点，制备最终的构建物pBB11.2.单位4/1/2，用于与单位3进行Cre介导的重组(Muyrers等，Nucleic Acids Research 27，1555-1557(1999)；Muyers等，Trends Biochem.Sci.26(5)：325-31(2001))。使用含有与BAC靶序列同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 225和226，表2)，经PCR扩增氯霉素选择盒。反向引物包括lox66位点。将凝胶纯化的PCR产物转化入带有同源重组必需的靶BAC和pSC101质粒的细胞。使用氯霉素选择阳性克隆，并经限制性分析和测序证实。如上述制备单位1和2，体外重组制备pGEM.Genta.单位3，转化入携带接受BAC以及p706-Cre质粒的细胞。使用庆大霉素选择阳性克隆pBB11.2单位4/1/2/3，并经限制性分析证实。通过ET克隆进一步修饰pBB11.2.单位4/1/2/3以产生lox71靶位。随后，使pBB11.2.单位4/1/2/3连接来自BAC 219D23、27N5和Fos15B的片段。 
实施例4
使用PCR扩增的片段构建人源化免疫球蛋白重链基因座
使用基因组DNA(ClonTech)和引物SEQ ID NO 227-248(表2)扩增人VH元件。通过凝胶电泳分析PCR产物，使用GENECLEAN试剂盒(Q-Biogen)凝胶纯化。随后，依据制造商说明书，将扩增产物亚 克隆入Zero-Blunt TOPOTM(Invitrogen)。确认所有扩增的V元件的序列。为构建人源化V区，使用质粒DNA作为模板，引物SEQ ID NO 249-270(表2)，扩增V元件。正向引物含有Ascl位点，随后是兔的剪接位点。反向引物含有兔重组信号序列(RSS)和MluI限制性位点。使用GENECLEAN试剂盒凝胶纯化PCR产物。 
不能通过PCR分离人VH、V3-33、V3-74、V3-49、V3-21、V3-48、V3-73、V3-7和V3-D，它们是化学合成的(BlueHeron，Bothel，WA)。在合成期间添加限制性酶切位点和兔的调控序列。 
使用BAC 38A2和225P18作为模板，使用引物SEQ ID NO 271-288(表2)，扩增兔间隔区序列。使用Nhel双重消化BAC 225P18，凝胶纯化41kp的片段。这个片段作为模板用以扩增间隔区V 1-2、V2-3、V3-4、V4-5和V5-6。 
使用BstBI消化BAC 225P18，凝胶纯化间隔区V6-7和V7-8的模板。使用Pacl和RsrlI双重消化BAC 38A2，允许凝胶纯化间隔区V21-22和V22-23的模板。 
凝胶纯化扩增的间隔区序列，依据制造商说明书亚克隆入XL-PCR-TOPOTM(Invitrogen)。 
将VH元件和兔的间隔区序列亚克隆入修饰的pGEM(Promega)和pBS(Strategene)载体中。该pGEM载体使用NotI和Hind III切割，并与化学合成的含有FseI、AscI和MluI位点的寡核苷酸序列连接(寡核苷酸1：SEQ ID NO：289；寡核苷酸2：SEQ ID NO：290；表2)。载体pBS使用SacI和KpnI切割，并与化学合成的含有Fsel,AscI和MluI限制性酶切位点的寡核苷酸序列连接(寡核苷酸1：SEQ ID NO：291；寡核苷酸2：SEQ ID NO：292；表2)。 
使用具有Fse I和AscI位点的引物(SEQ ID NO：293-296，表2)扩增庆大霉素和新霉素选择盒，连接入修饰的pGEM和pBS载体。 
将最终的构建物构建入修饰的pBeloBAC II载体。使用BamHI和HindIII打开该pBeloBAC II载体，并使用化学合成的寡核苷酸序 列修饰克隆位点，以含有FseI、AscI、MluI位点(寡核苷酸1：SEQ ID NO：297；寡核苷酸2：SEQ ID NO：298，表2)。 
使用ET克隆，通过引入限制性酶切位点修饰BAC 219D23(Muyrers等，Nucleic Acids Research 27，1555-1557(1999)；Muyers等，Trends Biochem.Sci.26(5)：325-31(2001))。使用引物SEQ ID NO：299和SEQ ID NO：300扩增新霉素选择盒(表2)。正向引物含有FseI位点，反向引物含有AscI位点。 
纯化的PCR产物转化入携带同源重组必需的BAC 219D23和质粒pSC 101的大肠杆菌细胞。在BAC中盒和靶位的同源重组之后，通过限制性分析证实引入的限制性位点。随后，使用FseI和MluI消化修饰的BAC 219D23，并通过PFGE分离所得的17kb片段(含有FseI-Neo-AscI盒)，通过电洗脱纯化。这种纯化的片段与使用FseI和MluI打开的修饰pBeloBACII载体连接。 
编码人VH元件的纯化DNA片段与使用AscI和MluI打开的修饰pGEM.neo.载体连接。相似地，间隔区序列亚克隆入修饰的pGEM.genta载体。随后，使用FseI和MluI切割携带间隔区序列的pGEM.genta载体，插入物与使用FseI和AscI打开的pGEM.neo.VH载体连接。重复这个步骤数次，以构建由数个间隔区和VH节段组成的片段。使用FseI和MluI切割这些片段，与使用Fsel和AscI线性化的修饰pBeloBAC II载体连接。重复这个过程以构建大的免疫球蛋白V区(图6)。人源化重链基因座用于产生转基因动物。 
实施例5
构建含有人源化Cκ和人源化重排VJ的人源化兔轻链基因座
筛选兔基因组BAC文库，导致鉴别了3种含有兔轻链K1基因节段的BAC(215M22、179L1和196O2；分别为Gene Bank检索号：AY495826、AY495827和AY495828)。通过所述的ET克隆，使用人Cκ同种异型Km3调换兔Cκ1(E-Chiang Lee等，Genomics 73，56-65 (2001)；Daiguan Yu等，PNAS 97，5978-5983(2000)；Muyrers等，Nucleic Acids Research 27，1555-1557(1999)；Zhang等，Nature Biotechnology 18，1314-1317(2000))。通过PCR使用含有与靶序列同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 301和302，表2)扩增人Cκ(同种异型Km3)。基于兔种系κ的公开序列(b5；GenBank检索号K01363)设计同源臂，并匹配Cκ的内含子-外显子边界。经测序证实BAC 179L1中兔Cκ与人Cκ的交换。 
通过两次ET克隆修饰BAC 179L1-huCk。使用含有与BAC 179L1同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 303和304，表2)扩增新霉素选择盒。正向引物另外具有i-CeuI大范围核酸酶位点。将PCR产物用于ET克隆。使用新霉素选择阳性克隆，并通过限制性酶消化和测序检查正确性。使用含有与BAC 179L1同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 305和306，表2)扩增zeocin选择盒。正向引物另外具有i-SceI大范围核酸酶位点。将PCR产物用于ET克隆。使用zeocin选择阳性克隆，通过限制性酶消化和测序检查正确性。 
通过一次ET克隆修饰BAC 215M22。使用含有与BAC 215M22同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 307和308，表2)扩增庆大霉素抗性基因。正向引物另外具有i-CeuI大范围核酸酶位点，反向引物具有i-SceI大范围核酸酶位点。将PCR产物用于ET克隆。使用庆大霉素选择所得克隆，并经限制性酶消化和测序分析。 
使用i-CeuI和i-SceI切割修饰的BAC179L1和225M22。纯化和连接98kb和132kb的片段。使用卡那霉素和氯霉素选择所得克隆，并通过限制性酶消化、PCR含有i-SceI和i-CeuI限制性位点的区域和测序来检查正确性。所得的BAC称为179-215-huCk。 
通过ET克隆使用合成的人重排VκJκ基因取代BAC 179-215-huCk的兔Jκ1和Jκ2。化学合成具有兔启动子、兔前导序列、兔内含子和人VκJκ基因的DNA片段。优化合成的人VJ的密码子选择，以获得与兔Vκ基因的最高DNA序列同源性。 
使用含有与BAC 179L1同源的50bp序列的正向引物(SEQ ID NO 309，表2)，以及含有庆大霉素抗性基因的同源序列和FRT位点的反向引物(SEQ ID NO 310，表2)，PCR扩增合成的人VJ。使用含有FRT位点的正向引物(SEQ ID NO 311，表2)，以及具有与BAC 179L1同源的50bp和FRT位点的反向引物(SEQ ID NO 312，表2)，扩增庆大霉素抗性基因。使用合成人VJ基因的正向引物和庆大霉素抗性基因的反向引物，通过重叠延伸PCR组合人合成人VJ和庆大霉素抗性基因。所得的片段用于ET克隆。使用庆大霉素选择阳性克隆，并通过限制性酶消化和测序检查正确性。 
通过表达Flp重组酶经位点特异性重组去除庆大霉素抗性基因。经重组之后留下了一个FRT。通过ET克隆删除FRT位点。经PCR扩增来源于合成人VJ的232bp片段(使用引物SEQ ID NO 313和314，表2)，并用于ET克隆。通过PCR筛选缺失FRT位点的所得菌落(使用引物EQ ID NO 315和316，表2)，并经测序证实。 
经ET克隆取代BAC179-215-huCk的新霉素抗性基因。使用含有与BAC 179-215-huCk同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 3l7和318，表2)，经PCR扩增庆大霉素抗性基因(pRep-Genta；Genebridges)。正向引物另外有loxP位点、attB位点和PvuI限制性位点。使用度大霉素选择所得的克隆，并通过限制性酶消化和测序检查正确性。 
所得的BAC(rLC3-B；图8)用于产生转基因动物。 
实施例6
构建含有多种人Vk元件、鸡间隔区元件和重排人VJ的人源化兔轻链基因座
筛选兔基因组BAC文库，导致鉴别了三种含有兔轻链K1基因节段的BAC(215M22、179L1和196O2；分别为Gene Bank检索号：AY495826、AY495827和AY495828)。通过所述的ET克隆，用人Cκ同种异型Km3调换兔Cκ1(E-Chiang Lee等，Genetics 73，56-65 (2001)；Daiguan Yu等，PNAS 97，5978-5983(2000)；Muyrers等，Nucleic Acids Research 27，1555-1557(1999)；Zhang等，Nature Biotechnology 18，1314-1317(2000))。使用含有与靶序列同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 301和302，表2)，经PCR扩增人Cκ(同种异型Km3)。基于兔种系κ的公开序列(b5；GenBank检索号K01363)设计同源臂，并匹配Cκ的内含子-外显子边界。经测序证实BAC 179L1中兔Cκ与人Cκ的交换。 
化学合成了两种DNA片段：含有17个人V假基因和18个鸡间隔区序列的单位1(12,235bp，图12a，SEQ ID NO 187)、含有一个具有前导序列的功能重排的人κVJ基因、11个人V假基因、12个鸡间隔区序列、内含子1和内含子2部分的单位2，并克隆入载体pBR322。 
使用限制性酶NgoMIV和AsiSI或NgoMIV和AscI分别消化单位1和单位2，并通过三个片段的连接用修饰连接基团连接入pBELOBAC11。该修饰的连接基因含有BsiWI限制性位点、FRT5位点、rpsL-Neo-盒、AscI位点和AsiSI位点。使用高保真聚合酶(Roche)、引物CE_1_001_012904(SEQ ID NO 319，表2)和CE_1_on005_013004(SEQ ID NO 320，表2)，以质粒pRpsL-Neo(Genebridges)为模板，扩增连接基团片段。接着，将扩增产物连接入pBELOBAC11的BamHI和HindIII位点。对于单位1和2连接，使用AsiSI和AscI打开pBELOBAC11。通过限制性酶消化检查阳性克隆(pBELOBACll单位1/2)。 
通过ET克隆插入两个修饰的选择盒，修饰BAC 179L1(GenBank检索号AY495827)。盒1为使用引物(SEQ ID NO 321和322，表2)扩增的庆大霉素抗性基因，该引物在反向引物中含有与BAC 179L1同源的50bp序列和AscI位点。盒2为使用引物(SEQ ID NO 323和324，表2)扩增的rpsl-Neo选择盒，该引物在正向引物中含有与BAC179L1同源的50bp序列和attB位点、FRT5位点和BsiWI位点。 
纯化的PCR产物转化入携带同源重组必需的BAC和质粒pSC101的大肠杆菌细胞。同源重组之后，通过限制性消化分析、DNA印迹和测序，证实BAC的成功修饰。 
使用限制性酶AscI和BsiWI切割修饰的BAC 179L1。纯化含有人Cκ的片段，与使用相同限制性酶打开的pBELOBAC11单位1/2连接。通过限制性酶消化检查阳性克隆。将最终的构建物用于转基因动物的产生(图12c)。 
实施例7
构建含有多种人Vk元件、鸡间隔区元件和未重排人Jκ基因座的人源化兔轻链基因座
如下经ET克隆修饰实施例6中描述的构建物。使用侧接了功能性重组信号序列(RSS)的功能V1调换重排的功能VJ序列。使用含有与pBELOBAC11单位1/2的V1同源的50bp序列的正向引物(SEQ ID ZNO 325，表2)，和含有AscI限制性酶位点并与庆大霉素抗性基因同源的反向引物(SEQ ID NO 326，表2)，从BAC179L1中PCR扩增该RSS。使用正向引物(SEQ ID NO 327，表2)和反向引物(SEQ ID NO 328，表2)扩增庆大霉素抗性基因，该正向引物含有与用于RSS扩增的反向引物同源的序列，反向引物含有与pBELOBAC11单位1/2同源的50bp序列和BsiWI限制性酶位点。 
使用用于RSS扩增的正向引物和用于庆大霉素抗性基因扩增的反向引物，经重叠延伸PCR组合RSS和庆大霉素抗性基因。将所得的片段用于经ET克隆修饰pBELOBAC11单位1/2。使用庆大霉素选择阳性克隆，并通过限制性酶消化和测序进行分析。 
进一步经ET克隆修饰具有人Cκ的BAC 179L1。使用含有与BAC179L1同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 329和330，表2)扩增卡那霉素选择盒。反向引物也含有AscI限制性酶位点和FRT位点。将PCR产物用于ET克隆。使用含有与BAC 179L1同源的50bp序列的 引物(SEQ ID NO 331和332，表2)扩增氨苄西林选择盒。正向引物也含有attB位点、AsiSI限制性酶位点和FRT5位点。反向引物含有BsiWI限制性酶位点和FRT位点。将PCR产物用于ET克隆。使用含有与BAC179L1同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 333和334，表2)从人基因组DNA中扩增人J区。将PCR产物用于ET克隆。通过限制性酶消化和测序分析所得的克隆。 
使用AscI和BsiWI切割阳性克隆。纯化所得片段，连接入使用相同酶切割的修饰pBELOBAC11单位1/2。使用氨苄西林选择阳性克隆，并通过限制性酶消化和测序分析。正确的克隆用于生产转基因动物。 
实施例8
构建含有多种人Vk元件的人源化兔轻链基因座
筛选兔基因组BAC文库，导致辨别了三种含有兔轻链K1基因节段的BAC(215M22、179L1和196O2；Gene Bank检索号分别为：AY495826、AY495827和AY495828)。通过所述的ET克隆使用人Cκ同种异型Km3调换兔Cκ1(E-Chiang Lee等，Genomics 73，56-65(2001)；Daiguan Yu等，PNAS 97，5978-5983(2000)；Muyrers等，Nucleic Acids Research 27，1555-1557(1999)；Zhang等，Nature Biotechnology 18，1314-1317(2000))。使用含有与靶序列同源的50bp序列的引物(SEQ ID NO 301和302，表2)经PCR扩增人Cκ(同种异型Km3)。基于兔种系κ的公开序列(b5；GenBank检索号K01363)设计同源臂，并匹配Cκ的内含子-外显子边界。经测序证实BAC 179L1中兔Cκ与人Cκ的交换。 
使用引物(SEQ ID NO 335-382，表2)和作为模板的人基因组DNA，经PCR扩增了Vκ1家族的人Vκ元件(O2、L8、L4、A30、L11、L1、L5、L15、O8、L19、L12、A20、O4、L14、L23、L9、A4、L24、O6、L22、A9、A25、A15、O9)。 
经凝胶电泳分析扩增产物，使用GENECLEAN(Q-Biogen)凝胶纯化产物，亚克隆入Zero-Blunt TOPOTM载体(Invitrogen)，并进行测序。通过PCR扩增产生了重排的人Vκ(O2)Jκ(J4)元件，并亚克隆和测序。为了组合人Vκ元件和兔间隔区序列，使用引物(SEQ ID NO 383-430，表2)，以质粒DNA为模板，经PCR扩增人Vκ元件。引物含有AscI或MluI位点。 
使用引物SEQ ID NO 431-450(表2)经PCR扩增了兔间隔区序列。使用SpeI、NheI、AclI、SfoI、MluI和SalI/XhoI消化BAC 179L1和215M22。凝胶纯化片段，用作扩增模板。 
通过含有FRT和attB位点的上游寡核苷酸扩增位于5’端的间隔区序列。使用GENECLEAN试剂盒凝胶纯化PCR产物，依据制造商的说明书亚克隆入XL-PCR-TOPOTM(Invitrogen)。 
将人Vk元件和兔间隔区序列克隆入如实施例4中描述的修饰的pGem(Promega)。 
使用AscI和MluI消化人Vκ和修饰的pGEM.genta载体，并连接。相似地，将兔间隔区序列克隆入pGEM.neo载体。接着，使用Fsel和AscI切割pGem.neo.Vκ，并与使用FseI和MluI切割的pGem.genta.spacer的纯化插入片段连接。AscI和MluI互补端的连接破坏了限制性酶切位点，允许重复使用AscI和MluI构建包含数个Vκ和间隔区元件的Vκ基因座。最终的构建物由人源化BAC 179L1和215M22片段、以及人源化Vκ区组成，将其构建入pBeloBAC。对BAC 179L1和215M22进行修饰和组合。接着，进一步经ET克隆修饰BAC 179L1-215M22-huCk。如图7所示经ET克隆在载体中插入两个含有限制性酶位点、选择标记和另外功能位点的盒。用于扩增盒的引物(SEQ ID NO 451-454)罗列在表2中。 
为了构建最终的构建物，使用FseI和MluI切割由人V元件、兔间隔区元件和抗性标记组成的单位，将其切除出pGEM，并与使用FseI和AscI消化的BAC 179L1-215M22连接。接着，使用由人V 元件、兔间隔区元件和其它抗性标记组成的新插入片段取代该抗性标记。经过数次重复之后，最终的构建物将由许多被兔间隔区序列分隔的Vk节段组成(L8、L4、A30、L11、L1、L5、L15、O8、L19、L12、A20、O4、L14、L23、L9、A4、L24、O6、L22、A9、A25、A15、O9)。人源化轻链基因座用于产生转基因动物。 
实施例9
构建具有鸡重链基因座间隔区序列的人源化重链基因座
构建合成的人源化重链基因座，其含有兔D区、人J区、人Cμ、人Cγ、兔Cα4、兔3’α增强子和人VH元件(包括启动子和九聚物/七聚物序列)，被鸡间隔区序列所分隔。 
进一步经ET克隆修饰修饰的兔BAC 27N5(参见实施例2)。该构建物含有人源化Cμ和Cγ，以及两个独特的限制性位点，α-4膜外显子下游的BsiWI和AsiSI。使用寡核苷酸SEQ ID NO 455和456(表2)扩增DNA。 
使用NheI消化F粘粒Fosl 5B，将所得的含有3’α增强子的13kb片段亚克隆入载体，其方式使插入片段的两侧连接BsiWI和AsiSI位点。接着，使用BsiWI和AsiSI切割插入片段，并与修饰的BAC 27N5连接形成BAC 27N5Fos。 
在BAC 219D23中，兔的J区与相应的人J区经ET克隆进行交换。使用引物SEQ ID NO 457和458(表2)经PCR扩增人J区。 
在BAC219D23中D区(A)上游和Cμ(B)上游插入独特的限制性酶切位点。在BAC 27N5Fos限制性位点中，A被插入在连接基团区的上游，B被插入在BAC219D23的同源序列中。接着使用酶A和B消化之后，分离含有人J和兔D区的片段，并与BAC 27N5Fos连接以产生BAC 219D23/27N5Fos。 
使用鸡重链V假基因的特异性引物(SEQ ID NO 459和460，表2)，经PCR从鸡基因组DNA中扩增鸡重链间隔区序列(Mansikka等， J Immunol 145(11)，3601-3609(1990)， Reynaud等，Cell59(1)，171-183(1989))。或者，化学合成间隔区序列。 
凝胶纯化PCR产物，克隆入pTOPO(Invitrogen)，并测序。 
使用依据GENBANK中公开序列(如检索号NG 001019)设计的引物或化学合成的引物，经PCR扩增人重链可变元件。人V元件含有人启动子区、人前导序列、在前导序列和V编码区之间的人内含子、人V编码区和人重组信号序列。扩增或合成的片段两侧连接特异性限制性核酸内切酶识别序列。在一个或数个大的包含人源化免疫球蛋白基因座的DNA片段中，组合鸡间隔区序列和人V元件。该构建物用于产生转基因动物。 
实施例10
构建含有人V元件和非人类间隔区序列(无启动子和RSS)的人源化免疫球蛋白基因座
使用对免疫球蛋白特异的探针筛选了使用非人类基因组DNA产生的BAC文库，并鉴定了含有重链和轻链免疫球蛋白C、J和D区的BAC克隆。修饰该BAC克隆以使其含有限制性酶位点。使用依据GenBank中公开序列(如检索号NG_001019)设计的引物，经PCR扩增了人重链和轻链可变元件。从基因组DNA扩增序列或化学合成序列。该人V元件含有人启动子区、人前导序列、在前导序列和V编码区之间的人内含子、人V编码区和人重组信号序列(RSS)。扩增或合成的片段在末端具有特异性限制性核酸内切酶识别位点。PCR扩增或化学合成非人类间隔区序列。在一个或数个大的包含人源化免疫球蛋白基因座的DNA片段中组合非人类间隔区序列和人V元件。将构建物用于产生转基因动物。使用鸡间隔区序列构建人源化V区的实例显示于图10中。 
实施例11
构建含有人V元件和非人类间隔区序列的人源化免疫球蛋白基因座
使用对免疫球蛋白特异的探针筛选使用非人类基因组DNA产生的BAC文库，并鉴定了含有重链和轻链免疫球蛋白C、J和D区的BAC克隆。修饰该BAC克隆以使其含有限制性酶位点。使用依据GenBank中公开序列(如检索号NG_001019)设计的引物，经PCR扩增了人重链和轻链可变元件。从基因组DNA扩增序列或化学合成序列。该人V元件含有人V编码区。经PCR扩增或化学合成非人类间隔区序列，其含有重组信号序列、间隔区序列、启动子区、前导序列、以及前导序列和V编码区之间的内含子。在一个或数个大的DNA片段中组合这种非人类间隔区序列和人V元件，用于产生转基因动物。使用小鼠或兔间隔区序列构建人源化V区的实例显示于图11中。 
实施例12
表达人源化免疫球蛋白的转基因兔
如Fan等的描述生产了转基因兔(Pathol.Int.49：583-594，1999)。简言之，使用标准方法使雌兔超排卵，并与雄兔交配。从输卵管收集前核阶段的受精卵，置于合适的培养基，如补加20％胎牛血清的Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液。在一对操作器的帮助下将含有人源化免疫球蛋白基因座的BAC显微注射入雄前核。生态学存活的受精卵转入假妊娠兔的输卵管。通过注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导假妊娠。接着将人源化轻链构建物注射入4645个受精卵母细胞的前核，将4043个卵母细胞转入132个接受者。总共出生了253个活的后代，其中11个是转基因的。使用人κ轻链特异性试剂(例如小鼠抗人κ，Southern Biotech，9220-01；山羊抗人κ，Southern Biotech2063-08)经ELISA检测人κ轻链的表达。 
将人源化重链构建物注射入4083个受精卵母细胞的前核。3485 个卵母细胞被转入119个接受者，产生了433个后代。PCR和FISH分析揭示这些动物中的20个是转基因的。使用对人IgM/IgG特异的抗体(例如兔抗人IgM，Rockland 609-4131；兔抗人IgM，Rockland 609-4631；兔抗人IgG，Pierce 31142，兔抗人IgG，Southern Biotech 6145-08；兔抗人IgG，Pierce 31784)通过ELISA检测建立动物血液中的人源化重链。 
使用标准程序进行夹心ELISA以检测人源化k、μ和γ链。简言之，使用捕获抗体涂布微量滴定板，并与稀释的血清样品孵育。使用第二种标记的抗体和过氧化物酶-链霉抗生物素-结合物(Sigma，S2438)检测结合的人免疫球蛋白。 
通过育种建立者动物，产生表达人源化免疫球蛋白重链和轻链的双转基因动物。 
实施例13
表达人源化免疫球蛋白的转基因小鼠
如Nagy等的描述生产转基因小鼠(Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2003)。简言之，使用标准方法使雌鼠超排卵，并与雄鼠交配。从输卵管收集前核阶段的受精卵，置于合适的培养基，如M2培养基。在一对操作器的帮助下将含有人源化免疫球蛋白基因座的BAC显微注射入雄前核。生态学存活的受精卵转入假妊娠雌小鼠的输卵管。通过与不育雄鼠交配诱导假妊娠。接着将人源化轻链构建物注射入1325个受精卵母细胞的前核，将787个卵母细胞转入29个接受者。总共出生了55个活的后代，其中11个是转基因的。 
将人源化重链构建物注射入1050个受精卵母细胞的前核。将650个卵母细胞转入25个接受者，得到64个活的后代，经PCR分析揭示这些动物中的19个是转基因的。 
通过育种建立者动物，产生表达人源化免疫球蛋白重链和轻链 的双转基因动物。使用标准程序通过ELISA检测人源化κ、μ和γ链的表达。简言之，使用捕获抗体涂布微量滴定板，并与稀释的血清样品孵育。使用第二种标记的抗体和过氧化物酶-链霉抗生物素-结合物(Sigma，S2438)检测结合的人免疫球蛋白。 
所有在本说明书各处引用的参考文献都通过引用清楚地结合到本文中。尽管通过参考某些实施方案阐明本发明，但该实施方案并非限制。本领域的技术人员将认识到，可能有各种修饰和变化而不背离本发明的精华。所有这种修饰和变化都明确性地包括在本发明的范围内。 
Spacer间隔区    exon外显子 
表1 
Figure BDA00002256804700451
Figure BDA00002256804700461
Figure BDA00002256804700471
*CLC-鸡轻链基因座SEQ ID 184，图9 
**pV-假V基因(无功能) 
备注： 
通过在3′和5′如下缺失载体序列，修饰提交至GenBank的BAC序列： 
  BAC   检索号   从5′端除去   从3′端除去
  38A2   AY386694   1-125   1281285-128225
  219D23   AY386695   1-54   137357-137389
  Fos15B*   AY3866968   1-97   33395-33427
  179L1   AY495827   0   205145-205968
  196O2   AY495828   1-32   178117-178171
*此外GenBank中的重叠群由50nt分隔。与临时申请一起提交的Fos15B序列中重叠群由10nt分隔。 
表2 
Figure BDA00002256804700501
Figure BDA00002256804700511
Figure BDA00002256804700521
Figure BDA00002256804700531
Figure BDA00002256804700541
Figure BDA00002256804700551
Figure BDA00002256804700561
Figure BDA00002256804700571
Figure BDA00002256804700581
Figure IDA00002256805500011
Figure IDA00002256805500021
Figure IDA00002256805500041
Figure IDA00002256805500051
Figure IDA00002256805500061
Figure IDA00002256805500071
Figure IDA00002256805500091
Figure IDA00002256805500101
Figure IDA00002256805500111
Figure IDA00002256805500121
Figure IDA00002256805500131
Figure IDA00002256805500141
Figure IDA00002256805500151
Figure IDA00002256805500161
Figure IDA00002256805500171
Figure IDA00002256805500181
Figure IDA00002256805500191
Figure IDA00002256805500201
Figure IDA00002256805500211
Figure IDA00002256805500231
Figure IDA00002256805500251
Figure IDA00002256805500261
Figure IDA00002256805500281
Figure IDA00002256805500291
Figure IDA00002256805500301
Figure IDA00002256805500311
Figure IDA00002256805500321
Figure IDA00002256805500331
Figure IDA00002256805500351
Figure IDA00002256805500371
Figure IDA00002256805500381
Figure IDA00002256805500401
Figure IDA00002256805500411
Figure IDA00002256805500421
Figure IDA00002256805500431
Figure IDA00002256805500441
Figure IDA00002256805500461
Figure IDA00002256805500481
Figure IDA00002256805500491
Figure IDA00002256805500501
Figure IDA00002256805500511
Figure IDA00002256805500521
Figure IDA00002256805500531
Figure IDA00002256805500541
Figure IDA00002256805500551
Figure IDA00002256805500561
Figure IDA00002256805500571
Figure IDA00002256805500581
Figure IDA00002256805500591
Figure IDA00002256805500631
Figure IDA00002256805500641
Figure IDA00002256805500651
Figure IDA00002256805500661
Figure IDA00002256805500671
Figure IDA00002256805500691
Figure IDA00002256805500711
Figure IDA00002256805500721
Figure IDA00002256805500731
Figure IDA00002256805500741
Figure IDA00002256805500751
Figure IDA00002256805500761
Figure IDA00002256805500771
Figure IDA00002256805500791
Figure IDA00002256805500801
Figure IDA00002256805500811
Figure IDA00002256805500821
Figure IDA00002256805500831
Figure IDA00002256805500851
Figure IDA00002256805500861
Figure IDA00002256805500881
Figure IDA00002256805500891
Figure IDA00002256805500911
Figure IDA00002256805500931
Figure IDA00002256805500941
Figure IDA00002256805500951
Figure IDA00002256805500961
Figure IDA00002256805500971
Figure IDA00002256805500981
Figure IDA00002256805500991
Figure IDA00002256805501001
Figure IDA00002256805501011
Figure IDA00002256805501021
Figure IDA00002256805501031
Figure IDA00002256805501041
Figure IDA00002256805501051
Figure IDA00002256805501061
Figure IDA00002256805501071
Figure IDA00002256805501081
Figure IDA00002256805501091
Figure IDA00002256805501101
Figure IDA00002256805501111
Figure IDA00002256805501121
Figure IDA00002256805501131
Figure IDA00002256805501141
Figure IDA00002256805501151
Figure IDA00002256805501161
Figure IDA00002256805501171
Figure IDA00002256805501181
Figure IDA00002256805501191
Figure IDA00002256805501221
Figure IDA00002256805501231
Figure IDA00002256805501241
Figure IDA00002256805501251
Figure IDA00002256805501271
Figure IDA00002256805501281
Figure IDA00002256805501301
Figure IDA00002256805501311
Figure IDA00002256805501321
Figure IDA00002256805501331
Figure IDA00002256805501341
Figure IDA00002256805501361
Figure IDA00002256805501381
Figure IDA00002256805501391
Figure IDA00002256805501401
Figure IDA00002256805501411
Figure IDA00002256805501421
Figure IDA00002256805501441
Figure IDA00002256805501451
Figure IDA00002256805501461
Figure IDA00002256805501471
Figure IDA00002256805501481
Figure IDA00002256805501491
Figure IDA00002256805501501
Figure IDA00002256805501511
Figure IDA00002256805501521
Figure IDA00002256805501541
Figure IDA00002256805501551
Figure IDA00002256805501561
Figure IDA00002256805501571
Figure IDA00002256805501581
Figure IDA00002256805501591
Figure IDA00002256805501601
Figure IDA00002256805501611
Figure IDA00002256805501621
Figure IDA00002256805501631
Figure IDA00002256805501641
Figure IDA00002256805501651
Figure IDA00002256805501661
Figure IDA00002256805501671
Figure IDA00002256805501681
Figure IDA00002256805501701
Figure IDA00002256805501721
Figure IDA00002256805501731
Figure IDA00002256805501741
Figure IDA00002256805501751
Figure IDA00002256805501761
Figure IDA00002256805501771
Figure IDA00002256805501781
Figure IDA00002256805501791
Figure IDA00002256805501801
Figure IDA00002256805501811
Figure IDA00002256805501821
Figure IDA00002256805501831
Figure IDA00002256805501841
Figure IDA00002256805501851
Figure IDA00002256805501861
Figure IDA00002256805501871
Figure IDA00002256805501881
Figure IDA00002256805501891
Figure IDA00002256805501901
Figure IDA00002256805501921
Figure IDA00002256805501931
Figure IDA00002256805501941
Figure IDA00002256805501951
Figure IDA00002256805501961
Figure IDA00002256805501971
Figure IDA00002256805501981
Figure IDA00002256805502001
Figure IDA00002256805502011
Figure IDA00002256805502031
Figure IDA00002256805502041
Figure IDA00002256805502061
Figure IDA00002256805502071
Figure IDA00002256805502091
Figure IDA00002256805502101
Figure IDA00002256805502111
Figure IDA00002256805502121
Figure IDA00002256805502131
Figure IDA00002256805502141
Figure IDA00002256805502151
Figure IDA00002256805502161
Figure IDA00002256805502171
Figure IDA00002256805502181
Figure IDA00002256805502191
Figure IDA00002256805502201
Figure IDA00002256805502211
Figure IDA00002256805502221
Figure IDA00002256805502231
Figure IDA00002256805502241
Figure IDA00002256805502271
Figure IDA00002256805502281
Figure IDA00002256805502291
Figure IDA00002256805502301
Figure IDA00002256805502331
Figure IDA00002256805502341
Figure IDA00002256805502351
Figure IDA00002256805502361
Figure IDA00002256805502371
Figure IDA00002256805502381
Figure IDA00002256805502391
Figure IDA00002256805502401
Figure IDA00002256805502421
Figure IDA00002256805502431
Figure IDA00002256805502441
Figure IDA00002256805502451
Figure IDA00002256805502461
Figure IDA00002256805502471
Figure IDA00002256805502491
Figure IDA00002256805502511
Figure IDA00002256805502521
Figure IDA00002256805502531
Figure IDA00002256805502541
Figure IDA00002256805502551
Figure IDA00002256805502561
Figure IDA00002256805502571
Figure IDA00002256805502601
Figure IDA00002256805502621
Figure IDA00002256805502631
Figure IDA00002256805502641
Figure IDA00002256805502661
Figure IDA00002256805502671
Figure IDA00002256805502681
Figure IDA00002256805502701
Figure IDA00002256805502711
Figure IDA00002256805502721
Figure IDA00002256805502731
Figure IDA00002256805502741
Figure IDA00002256805502751
Figure IDA00002256805502771
Figure IDA00002256805502781
Figure IDA00002256805502801
Figure IDA00002256805502811
Figure IDA00002256805502821
Figure IDA00002256805502831
Figure IDA00002256805502841
Figure IDA00002256805502851
Figure IDA00002256805502861
Figure IDA00002256805502871
Figure IDA00002256805502891
Figure IDA00002256805502901
Figure IDA00002256805502911
Figure IDA00002256805502921
Figure IDA00002256805502951
Figure IDA00002256805502961
Figure IDA00002256805502981
Figure IDA00002256805502991
Figure IDA00002256805503011
Figure IDA00002256805503021
Figure IDA00002256805503031
Figure IDA00002256805503041
Figure IDA00002256805503051
Figure IDA00002256805503061
Figure IDA00002256805503071
Figure IDA00002256805503081
Figure IDA00002256805503091
Figure IDA00002256805503111
Figure IDA00002256805503121
Figure IDA00002256805503131
Figure IDA00002256805503141
Figure IDA00002256805503151
Figure IDA00002256805503171
Figure IDA00002256805503181
Figure IDA00002256805503191
Figure IDA00002256805503201
Figure IDA00002256805503221
Figure IDA00002256805503231
Figure IDA00002256805503241
Figure IDA00002256805503261
Figure IDA00002256805503271
Figure IDA00002256805503281
Figure IDA00002256805503291
Figure IDA00002256805503301
Figure IDA00002256805503311
Figure IDA00002256805503321
Figure IDA00002256805503331
Figure IDA00002256805503351
Figure IDA00002256805503361
Figure IDA00002256805503371
Figure IDA00002256805503381
Figure IDA00002256805503391
Figure IDA00002256805503411
Figure IDA00002256805503421
Figure IDA00002256805503431
Figure IDA00002256805503451
Figure IDA00002256805503461
Figure IDA00002256805503471
Figure IDA00002256805503481
Figure IDA00002256805503491
Figure IDA00002256805503501
Figure IDA00002256805503521
Figure IDA00002256805503531
Figure IDA00002256805503541
Figure IDA00002256805503551
Figure IDA00002256805503561
Figure IDA00002256805503581
Figure IDA00002256805503591
Figure IDA00002256805503601
Figure IDA00002256805503621
Figure IDA00002256805503631
Figure IDA00002256805503641
Figure IDA00002256805503651
Figure IDA00002256805503661
Figure IDA00002256805503671
Figure IDA00002256805503681
Figure IDA00002256805503691
Figure IDA00002256805503711
Figure IDA00002256805503721
Figure IDA00002256805503751
Figure IDA00002256805503761
Figure IDA00002256805503771
Figure IDA00002256805503781
Figure IDA00002256805503801
Figure IDA00002256805503811
Figure IDA00002256805503821
Figure IDA00002256805503831
Figure IDA00002256805503851
Figure IDA00002256805503861
Figure IDA00002256805503871
Figure IDA00002256805503881
Figure IDA00002256805503891
Figure IDA00002256805503901
Figure IDA00002256805503931
Figure IDA00002256805503941
Figure IDA00002256805503951
Figure IDA00002256805503991
Figure IDA00002256805504001
Figure IDA00002256805504011
Figure IDA00002256805504021
Figure IDA00002256805504051
Figure IDA00002256805504061
Figure IDA00002256805504081
Figure IDA00002256805504091
Figure IDA00002256805504101
Figure IDA00002256805504111
Figure IDA00002256805504121
Figure IDA00002256805504131
Figure IDA00002256805504141
Figure IDA00002256805504151
Figure IDA00002256805504161
Figure IDA00002256805504171
Figure IDA00002256805504181
Figure IDA00002256805504191
Figure IDA00002256805504201
Figure IDA00002256805504221
Figure IDA00002256805504231
Figure IDA00002256805504241
Figure IDA00002256805504251
Figure IDA00002256805504261
Figure IDA00002256805504281
Figure IDA00002256805504291
Figure IDA00002256805504301
Figure IDA00002256805504311
Figure IDA00002256805504321
Figure IDA00002256805504331
Figure IDA00002256805504341
Figure IDA00002256805504361
Figure IDA00002256805504391
Figure IDA00002256805504401
Figure IDA00002256805504411
Figure IDA00002256805504431
Figure IDA00002256805504441
Figure IDA00002256805504461
Figure IDA00002256805504471
Figure IDA00002256805504481
Figure IDA00002256805504491
Figure IDA00002256805504501
Figure IDA00002256805504511
Figure IDA00002256805504521
Figure IDA00002256805504531
Figure IDA00002256805504541
Figure IDA00002256805504551
Figure IDA00002256805504561
Figure IDA00002256805504571
Figure IDA00002256805504581
Figure IDA00002256805504591
Figure IDA00002256805504601
Figure IDA00002256805504621
Figure IDA00002256805504631
Figure IDA00002256805504641
Figure IDA00002256805504651
Figure IDA00002256805504661
Figure IDA00002256805504671
Figure IDA00002256805504681
Figure IDA00002256805504691
Figure IDA00002256805504701
Figure IDA00002256805504711
Figure IDA00002256805504721
Figure IDA00002256805504731
Figure IDA00002256805504741
Figure IDA00002256805504751
Figure IDA00002256805504761
Figure IDA00002256805504771
Figure IDA00002256805504781
Figure IDA00002256805504791
Figure IDA00002256805504801
Figure IDA00002256805504811
Figure IDA00002256805504821
Figure IDA00002256805504831
Figure IDA00002256805504841

Claims (58)

1.一种包含人免疫球蛋白基因节段的分离核酸分子，所述人免疫球蛋白基因节段两侧为核苷酸序列，其中所述侧翼序列相同或不同，包含间隔区序列的至少约20个连续核苷酸，所述间隔区序列来源于主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物的免疫球蛋白重链或轻链基因，或者来源于两种或更多所述间隔区序列的共有序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述侧翼序列基本上由间隔区序列的至少约20个连续核苷酸组成，所述间隔区序列来源于主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物的免疫球蛋白重链或轻链基因，或者来源于两种或更多所述间隔区序列的共有序列。
3.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述侧翼序列包含至少约50个连续核苷酸。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其中侧翼序列相同。
5.权利要求1的分离的核酸分子，其中侧翼序列不同。
6.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为重链V、D或J基因节段。
7.权利要求6的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为重链V节段。
8.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为VH3、VH1、VH5或VH4家族的成员。
9.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为轻链V或J节段。
10.权利要求9的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为轻链V节段。
11.权利要求10的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为κ轻链基因节段。
12.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为Vκ1、Vκ3或Vκ4家族的成员。
13.权利要求10的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为λ轻链基因节段。
14.权利要求13的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为Vλ1、Vλ2或Vλ3家族的成员。
15.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为重链C节段。
16.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为轻链C节段。
17.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物选自兔、鸡、猪、绵羊、山羊和牛。
18.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述侧翼序列选自包含至少约20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸来源于选自SEQ ID NO：1-185的序列或者两种或更多所述序列的共有序列。
19.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为重链V、D或J节段。
20.权利要求19的分离的核酸分子，其中所述侧翼序列包含至少约20个连续核苷酸，所述连续核苷酸来源于选自SEQ ID NO：1-56的序列或者两种或更多所述序列的共有序列。
21.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为轻链V节段。
22.权利要求21的分离的核酸分子，其中所述侧翼序列包含至少约20个连续核苷酸，所述连续核苷酸来源于选自SEQ ID NO：107-184的序列或者两种或更多所述序列的共有序列。
23.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为重链C节段。
24.权利要求23的分离的核酸分子，其中所述侧翼序列包含至少约20个连续核苷酸，所述连续核苷酸来源于选自SEQ ID NO：57-104的序列或者两种或更多所述序列的共有序列。
25.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述人免疫球蛋白基因节段为轻链C节段。
26.权利要求25的分离的核酸分子，其中所述侧翼序列包含至少约20个连续核苷酸，所述连续核苷酸来源于选自SEQ ID NO：105、106、184、185的序列，或者两种或更多所述序列的共有序列。
27.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求1或26的核酸分子。
28.一种包含人源化Ig基因座的转基因载体，其中所述人源化Ig基因座来源于主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物的Ig基因座或Ig基因座的部分，包含多个Ig基因节段，其中：
(a)所述基因节段的至少一个为人Ig基因节段，其两侧为包含至少约20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸来源于主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的所述动物的免疫球蛋白重链或轻链基因的间隔区序列，或者来源于两种或更多所述间隔区序列的共有序列；
(b)所述基因节段以未重排、部分重排或全部重排的构型并列，
(c)所述人源化Ig基因座可经历基因重排，假如需要，可经历基因转变和/或超突变，在所述非灵长类动物中产生人源化免疫球蛋白的库。
29.权利要求28的转基因载体，其中所述间隔区序列选自SEQ IDNO：1-185，或者选自两种或更多所述序列的共有序列。
30.权利要求29的转基因载体，其中主要通过基因转变产生抗体多样性的所述动物选自兔、猪、鸡、绵羊、山羊和牛。
31.权利要求30的转基因载体，其中所述人源化Ig基因座为重链基因座，其包含至少一个V基因节段、至少一个D基因节段、至少一个J基因节段和至少一个恒定区基因节段。
32.权利要求31的转基因载体，其中所述恒定区基因节段为人重链恒定区基因节段。
33.权利要求32的转基因载体，其中所述人重链恒定区节段为Cγ和/或Cμ节段。
34.权利要求31的转基因载体，所述转基因载体包含约5-100个V基因节段和至少一个人V基因节段。
35.权利要求30的转基因载体，其中所述人源化Ig基因座为轻链基因座，包含至少一个V基因节段、至少一个J节段和至少一个恒定区基因节段。
36.权利要求35的转基因载体，其中所述恒定区基因节段为人轻链恒定区基因节段。
37.权利要求36的转基因载体，其中所述人轻链恒定区基因节段为Cλ或Cκ。
38.权利要求36的转基因载体，所述转基因载体包含约5-100V基因节段和至少一个人V基因节段。
39.权利要求36的转基因载体，其中所述人V基因节段以重排构型直接连接于J基因节段5’端。
40.一种核酸分子，所述核酸分子包含两种或更多单位，所述单位由5’至3’方向的5’核苷酸序列、人免疫球蛋白基因节段和3′核苷酸序列组成，其中所述5’核苷酸序列和所述3’核苷酸序列相同或不同，包含间隔区序列的至少约20个连续核苷酸，所述间隔区序列来源于主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物的免疫球蛋白重链或轻链基因，或者来源于两种或更多所述间隔区序列的共有序列。
41.权利要求40的核酸分子，其中所述间隔区序列选自SEQ IDNO：1-185，或者选自两种或更多所述间隔区序列的共有序列。
42.权利要求41的核酸分子，其中所述单位相同。
43.权利要求41的核酸分子，其中所述单位不同。
44.一种制备转基因载体的方法，所述转基因载体包含人源化免疫球蛋白基因座，所述人源化免疫球蛋白基因座能在主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物中产生人源化抗体的功能库，所述方法包括：
(a)从所述动物中获得包含Ig基因座或其部分的DNA片段，其包含至少一个V基因节段、至少一个J基因节段和至少一个恒定区基因节段；
(b)将至少一个人Ig基因节段整合入步骤(a)的DNA片段中以产生人源化Ig基因座，其中人Ig基因节段两侧为包含间隔区序列的至少约20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述间隔区序列来源于主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的动物的免疫球蛋白重链或轻链基因，或者来源于两种或更多所述间隔区序列的共有序列；其中(i)所述基因节段以未重排、部分重排或全部重排的构型并列，(ii)所述人源化Ig基因座可经历基因重排，假如需要，可经历基因转变和/或超突变，在所述动物中产生人源化免疫球蛋白的库。
45.一种主要通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性的转基因动物，所述转基因动物包含权利要求28的转基因载体中存在的人源化免疫球蛋白基因座。
46.权利要求45的转基因动物，所述转基因动物保留基本完整的内源性调控和抗体产生机制。
47.权利要求46的转基因动物，所述转基因动物选自转基因兔、鸡、猪、绵羊、山羊和牛。
48.一种B细胞，所述B细胞来源于权利要求45的转基因动物。
49.一种人源化免疫球蛋白，所述人源化免疫球蛋白使用权利要求45的转基因动物产生。
50.权利要求49的人源化免疫球蛋白，所述人源化免疫球蛋白为抗体。
51.权利要求50的人源化免疫球蛋白，所述人源化免疫球蛋白为多克隆抗体。
52.权利要求50的人源化免疫球蛋白，所述人源化免疫球蛋白为单克隆抗体。
53.一种抗体制剂，所述制剂包含权利要求49的人源化免疫球蛋白。
54.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求49的人源化免疫球蛋白。
55.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含两个或更多人免疫球蛋白重链或轻链可变区(V)基因节段，所述基因节段两侧为核苷酸序列，其中所述侧翼序列相同或不同，包含间隔区序列的至少约20个连续核苷酸，所述间隔区序列来源于非灵长类动物免疫球蛋白重链或轻链基因，或来源于两种或更多所述间隔区序列的共有序列。
56.权利要求55的分离的核酸，其中所述间隔区序列选自SEQ IDNO：1-185。
57.权利要求55的分离的核酸，其中所述间隔区序列选自啮齿动物免疫球蛋白间隔区序列。
58.权利要求57的分离的核酸，其中所述啮齿动物为小鼠或大鼠。一种转基因载体，所述转基因载体包含权利要求55或56的分离的核酸分子。
CN201210390234.2A 2003-07-15 2004-07-15 人源化免疫球蛋白基因座 Active CN103205436B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48773303P 2003-07-15 2003-07-15
US60/487733 2003-07-15
US60/487,733 2003-07-15
CNA2004800261928A CN1852925A (zh) 2003-07-15 2004-07-15 人源化免疫球蛋白基因座

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800261928A Division CN1852925A (zh) 2003-07-15 2004-07-15 人源化免疫球蛋白基因座

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103205436A true CN103205436A (zh) 2013-07-17
CN103205436B CN103205436B (zh) 2016-05-25

Family

ID=34079388

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800261928A Pending CN1852925A (zh) 2003-07-15 2004-07-15 人源化免疫球蛋白基因座
CN201210390234.2A Active CN103205436B (zh) 2003-07-15 2004-07-15 人源化免疫球蛋白基因座

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800261928A Pending CN1852925A (zh) 2003-07-15 2004-07-15 人源化免疫球蛋白基因座

Country Status (10)

Country Link
US (4) US7585668B2 (zh)
EP (1) EP1644417B1 (zh)
JP (2) JP2007537704A (zh)
CN (2) CN1852925A (zh)
AU (1) AU2004257292A1 (zh)
CA (1) CA2532117C (zh)
ES (1) ES2473596T3 (zh)
IL (1) IL172885A0 (zh)
MX (1) MXPA06000562A (zh)
WO (1) WO2005007696A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106715700A (zh) * 2014-01-10 2017-05-24 艾乐美生物科技有限公司 能产生比小鼠IgE量高出许多的人源化IgE的基因转殖动物
CN110662421A (zh) * 2017-01-19 2020-01-07 开放式单克隆技术股份有限公司 来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2005007696A2 (en) * 2003-07-15 2005-01-27 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Humanized immunoglobulin loci
EP2029729A2 (en) * 2006-05-31 2009-03-04 Genzyme Corporation Methods of using anti-thymocyte globulin and related agents
US20090053210A1 (en) * 2006-09-01 2009-02-26 Roland Buelow Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
PE20081216A1 (es) * 2006-09-01 2008-09-04 Therapeutic Human Polyclonals Inc Expresion mejorada de la inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgenicos no humanos
CN101784664B (zh) 2007-06-01 2013-04-10 Omt公司 用于抑制内源性免疫球蛋白基因和生产转基因人独特型抗体的组合物和方法
EP2185692A4 (en) * 2007-08-10 2012-05-02 Medarex Inc HCO32 AND HCO27 AND RELATED EXAMPLES
AU2008286791A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 Symphogen A/S Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus
EP2108696A1 (en) * 2008-04-10 2009-10-14 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH Cis-acting diversification activator and method for selective diversification of nucleic acids
AU2009329365B2 (en) * 2008-12-18 2016-01-14 Roger Kingdon Craig Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use thereof
US20120204278A1 (en) * 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
JP5756802B2 (ja) 2009-08-13 2015-07-29 クリスタル バイオサイエンス インク．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ． 最小ｃｄｒを有する抗体を産生するトランスジェニック動物
US8865462B2 (en) 2010-01-20 2014-10-21 Crystal Bioscience Inc. Sustained culture of avian gonocytes
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
SI3095871T1 (sl) 2010-02-08 2019-06-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš z navadno lahko verigo
LT3248462T (lt) * 2010-03-31 2024-05-27 Ablexis, Llc Pelių genų inžinerija, skirta chimerinių antikūnų gamybai
IL300712A (en) 2010-06-22 2023-04-01 Regeneron Pharma Mice with light chain to human
DK2601298T3 (en) 2010-08-02 2017-02-27 Regeneron Pharma Mice generating binding proteins comprising VL domains
CN102250239B (zh) * 2011-06-13 2013-04-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种与兔出血症病毒vp60蛋白相结合的蛋白及其应用
RS61946B1 (sr) 2011-08-05 2021-07-30 Regeneron Pharma Humanizovani miševi univerzalnog lakog lakca
CA2846319A1 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Kymab Limited Antibodies, variable domains & chains tailored for human use
EP3216871B1 (en) 2011-10-17 2021-12-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Restricted immunoglobulin heavy chain mice
PT2793567T (pt) 2011-12-20 2019-05-27 Regeneron Pharma Murganhos de cadeia leve humanizada
BR112014013035A2 (pt) 2011-12-22 2018-10-09 Hoffmann La Roche métodos de seleção de células, conjuntos de expressão bicistrônica, células eucarióticas, vetores lentivirais, uso de vetor lentiviral, bibliotecas de ventores lentivirais e de células eucarióticas, métodos de seleção de células, fluxos de trabalho e uso de célula
ES2753774T3 (es) * 2012-02-01 2020-04-14 Regeneron Pharma Ratones humanizados que expresan cadenas pesadas que contienen dominios VL
EP2883449B1 (en) 2012-03-16 2018-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
BR112014022855A2 (pt) 2012-03-16 2017-07-18 Regeneron Pharma animal não humano geneticamente modificado, mamífero geneticamente modificado, e, método para fabricar um animal não humano
EP3597037B1 (en) 2012-06-12 2021-04-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci
CN104755493B (zh) 2012-08-03 2020-12-25 Sab有限责任公司 用于在转基因动物中生产人类抗体的复杂的染色体工程
DK2840892T3 (en) 2013-02-20 2018-07-23 Regeneron Pharma Non-human animals with modified heavy chain immunoglobulin sequences
PT2967013T (pt) * 2013-03-13 2019-04-03 Regeneron Pharma Murganhos que expressam um repertório limitado de cadeia leve de imunoglobulina
KR20150126863A (ko) * 2013-03-13 2015-11-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 공통 경쇄 마우스
SG10201808083VA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
US10881085B2 (en) 2014-03-21 2021-01-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
WO2015167011A1 (ja) * 2014-05-02 2015-11-05 株式会社カイオム・バイオサイエンス ヒト抗体を産生する細胞
EP3271403A1 (en) 2015-03-19 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
SG11201802698XA (en) * 2015-10-29 2018-05-30 Hoffmann La Roche Transgenic rabbit with common light chain
DK3766343T3 (da) * 2016-11-04 2022-06-20 Regeneron Pharma Ikke-humane dyr med et manipuleret immunoglobulin-lambda-letkædelocus
EP3549228B1 (en) 2016-12-05 2020-04-15 Koninklijke Philips N.V. Foreign object detection in a wireless power transfer system
CN111511400A (zh) 2017-12-29 2020-08-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗vegf抗体及其使用方法
EP3768079A4 (en) * 2018-03-21 2021-12-08 Crystal Bioscience Inc. TRANSGENIC CHICKEN WHICH PRODUCES HUMAN ANTIBODIES
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
CN110540996B (zh) * 2019-08-29 2022-01-28 华中农业大学 一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因、其编码的gLysi2蛋白及其应用
KR20220116490A (ko) * 2019-12-18 2022-08-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 공통 리더 서열을 갖는 bcr 트랜스제닉 마우스
TW202340248A (zh) 2021-12-20 2023-10-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 促效性ｌｔｂｒ抗體及包含其之雙特異性抗體

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992003918A1 (en) * 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO2002012437A2 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Schooten Wim Van Production of humanized antibodies in transgenic animals

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0491057B1 (en) 1990-07-10 1998-12-30 Nkk Corporation Hybridoma which produces avian specific immunoglobulin g
EP0583980A1 (en) 1992-08-20 1994-02-23 Eli Lilly And Company Method for generating monoclonal antibodies from rabbits
AU7326796A (en) 1995-10-30 1997-05-22 Spectral Diagnostics Inc. Stable chicken b-cell line and method of use thereof
ATE307830T1 (de) 1999-02-05 2005-11-15 Therapeutic Human Polyclonals Aus nicht-menschlichen transgenen tieren gewonnene menschliche polyklonale antikörper
EP1190042A2 (en) 1999-06-04 2002-03-27 Tranxenogen, Inc. Methods for manipulating the avian genome
AU7491800A (en) 1999-09-15 2001-04-17 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Immunotherapy with substantially human polyclonal antibody preparations purifiedfrom genetically engineered birds
ATE430756T1 (de) 2002-06-26 2009-05-15 Transgenrx Inc Genregulation in transgenen tieren unter verwendung eines vektors auf transposonbasis
WO2005007696A2 (en) * 2003-07-15 2005-01-27 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Humanized immunoglobulin loci
EP1782360A4 (en) 2004-08-27 2009-03-18 Medic4All Ag METHOD AND SYSTEM FOR THE USE OF A MOBILE DEVICE AS A PORTABLE PERSONAL TERMINAL FOR MEDICAL INFORMATION
US20110077965A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Cerner Innovation, Inc. Processing event information of various sources
US20120306653A1 (en) 2011-06-02 2012-12-06 Nokia Siemens Networks Oy Medical sensor
US20130021154A1 (en) 2011-07-21 2013-01-24 Solomon Clifford T Medical parameters notification system

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992003918A1 (en) * 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO2002012437A2 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Schooten Wim Van Production of humanized antibodies in transgenic animals

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUEGGEMANN M ET AL.: "STRATEGIES FOR EXPRESSING HUMAN ANTIBODY REPERTOIRES IN TRANSGENIC MICE.", 《IMMUNOLOGY TODAY》 *
BRUGGEMANN M ET AL.: "A REPERTOIRE OF MONOCLONAL ANTIBODIES WITH HUMAN HEAVY CHAINS FROM TRANSGENIC MICE.", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA》 *
HESSE J E ET AL.: "V(D)J RECOMBINATION: A FUNCTIONAL DEFINITION OF THE JOINING SIGNALS.", 《GENES AND DEVELOPMENT》 *
JAKOBOVITS A ET AL.: "ANALYSIS OF HOMOZYGOUS MUTANT CHIMERIC MICE: DELETION OF THE IMMUNOGLOBULIN HEAVY-CHAIN JOINING REGION BLOCKS B-CELL DEVELOPMENTAND ANTIBODY PRODUCTION.", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106715700A (zh) * 2014-01-10 2017-05-24 艾乐美生物科技有限公司 能产生比小鼠IgE量高出许多的人源化IgE的基因转殖动物
CN110662421A (zh) * 2017-01-19 2020-01-07 开放式单克隆技术股份有限公司 来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004257292A1 (en) 2005-01-27
US8652842B2 (en) 2014-02-18
USRE47131E1 (en) 2018-11-20
US20100205682A1 (en) 2010-08-12
ES2473596T3 (es) 2014-07-07
CA2532117A1 (en) 2005-01-27
JP6017763B2 (ja) 2016-11-02
WO2005007696A2 (en) 2005-01-27
JP2011182801A (ja) 2011-09-22
CN103205436B (zh) 2016-05-25
US7585668B2 (en) 2009-09-08
US20130189774A1 (en) 2013-07-25
IL172885A0 (en) 2006-06-11
US8410333B2 (en) 2013-04-02
US20060026696A1 (en) 2006-02-02
CA2532117C (en) 2012-07-10
EP1644417B1 (en) 2014-04-30
CN1852925A (zh) 2006-10-25
EP1644417A2 (en) 2006-04-12
WO2005007696A3 (en) 2005-11-03
JP2007537704A (ja) 2007-12-27
MXPA06000562A (es) 2006-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103205436B (zh) 人源化免疫球蛋白基因座
AU2001284703B2 (en) Production of humanized antibodies in transgenic animals
JP5188969B2 (ja) ヒト化免疫グロブリンを発現するトランスジェニック動物におけるｂ細胞アポトーシスの抑制
US20050153392A1 (en) Transgenesis with humanized immunoglobulin loci
CN101084317A (zh) 对内源免疫球蛋白表达的抑制
AU2001284703A1 (en) Production of humanized antibodies in transgenic animals
ZA200301723B (en) Production of humanized antibodies in transgenic animals.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant