JP6017763B2 - ヒト化免疫グロブリン遺伝子座 - Google Patents
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Description
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物からヒト化抗体を生産させるための方法および手段に関する。本発明は、具体的には、新規の免疫グロブリン重鎖および軽鎖構築物、ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物を作成することにおいて有用である組み換えのトランスジェニックベクター、トランスジェニック動物、ならびにヒト化免疫グロブリン調製物に関する。トランスジェニックベクターには、ヒト化された免疫グロブリン遺伝子座が含まれる。これには、非ヒト動物内因性の調節機構および抗体生産機構を本質的には完全なまま残し、多様化させられたヒト化抗体を生じるように、非ヒトトランスジェニック動物中で、遺伝子再構成、遺伝子変換、および超変異を受けさせることができる。得られるヒト化抗体は、ヒトに対する最少の免疫原性を有しており、ヒト患者の治療的処置における使用に適している。
抗体は、薬学的産物の1つの重要なクラスである。これは、ガン、アレルギー性疾患のような種々のヒトの疾患および症状の処置、移植による拒絶反応、宿主対移植片反応の予防において良好に使用されている。
1つの局面においては、本発明は、複数のヌクレオチド配列が隣接するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子に関する。ここで、隣接配列は、同じである場合も、異なる場合もあり、これには、遺伝子変換および/または超変異によって主に抗体多様性を生じる動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子に由来するスペーサー配列の、あるいは、2つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドが含まれる。
(a)少なくとも1つの遺伝子セグメントが、スペーサー配列に由来するか、または2つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも20個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が隣接しているヒトIg遺伝子セグメントであり;
(b)複数の遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており;そして
(c)非ヒト動物が遺伝子を変換する動物であり、非ヒト動物中でヒト化された免疫グロブリンのレパートリーを生産する場合には、ヒト化Ig遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、必要に応じて、さらに遺伝子変換および/または超変異を受けることができる。
(a)少なくとも1つのV遺伝子セグメントと、少なくとも1つのJ遺伝子セグメントと、少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントを含む、非ヒト動物に由来するIg遺伝子座またはその一部を含むDNAフラグメントを得る工程;ならびに、
(b)ヒト化Ig遺伝子座を生産するように、工程(a)のDNAフラグメント中に少なくとも1つのヒトIg遺伝子セグメントを組み込む工程であって;ここで、ヒトIg遺伝子セグメントには、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子中のコード領域の間隔を隔てるスペーサー配列に由来するスペーサー配列か、あるいは、2つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が隣接しており;ここで、(i)複数の遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており;そして(ii)ヒト化Ig遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、そして、必要に応じて、非ヒト動物中でヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生産することができる、工程
が含まれる。
(A.定義)
「抗体」(Ab)と「免疫グロブリン」(Ig)は、同じ構造特性を有している糖タンパク質である。抗体は特異的な抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンには、抗体と、抗原特異性を有していない他の抗体様分子の両方が含まれる。後者のポリペプチドは、例えば、リンパ系によっては低レベルで、そして骨髄腫によっては高レベルで生産される。
免疫グロブリン遺伝子中の調節エレメントは、Bradley et al.(1999),Transcriptional enhancers and the evolution of the IgH locus;Lauster,R.et al.,Embo J 12:4615−23(1993);Volgina et al.,J Immunol 165:6400(2000);Hole et al.,J Immunol 146:4377(1991)によって記載されている。
Dev 44:56−62(1996)によって記載されている。免疫グロブリンの発現を欠損させたウサギは、McCartney−Francis et al.,Mol
Immunol 24:357−64(1987);Allegrucci,et al.,Eur J Immunol 21:411−7(1991)によって記載されている。
acid into an avian genome,useful for transfecting avian blastodermal cells for producing transgenic avian animals with the desired genes,by directly introducing the nucleic acid into the germinal disc of the egg.”によって記載されている。
105(1):1−6(1970);Benedict et al.,Adv Exp Med Biol 1977;88(2):197−205によって記載されている。
al.,Nature Biotechnology 1998;16:642−646;A.E.Schnieke et al.,Science 278:2130−2133(1997);K.H.Campbell et al.,Nature 380:64−66(1996);Kuroiwa et al.,Nature Genetics 2004年6月6日によって記載されている。ウサギの核導入クローニングは、Stice et al.,Biology of Reproduction 39:657−664(1988)、およびChallah−Jacques et al.,Cloning and Stem Cells 8(4):295−299(2003)によって記載されている。
of a single VH family,”J Immunol 156:2163に記載されている。
免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子には、個々の遺伝子によってコードされ、イントロン配列によって間隔を隔てられているいくつかのセグメントが含まれる。したがって、ヒト免疫グロブリン重鎖についての複数の遺伝子が、14番染色体上で見られる。重鎖(VH)の可変領域には3つの遺伝子セグメント:V、D、およびJセグメントが含まれ、その後ろに、C領域をコードする複数の遺伝子が続く。V領域は、大きなスペーサーによってC領域から隔てられおり、V、D、およびJセグメントをコードする個々の遺伝子もまた、スペーサーによって隔てられている。
0 491 057 B1(“Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G”)を参照のこと。これらの開示は、引用により本明細書中に組み入れられる。クローニングされたcDNA分子からのモノクローナル抗体の生体外での生産は、Andris−Widhopf et al.,“Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display”、J Immunol Methods 242:159(2000)によって、そして、Burton,D.R.,“Phage display”Immunotechnology 1:87(1995)によって記載されている。それらの開示は、引用により本明細書中に組み入れられる。
(ウサギ免疫グロブリン遺伝子座を含むBACクローンの単離および配列決定)
高分子量のDNAをa2b5雄ウサギから単離した。ウサギを安楽死させ、脾臓と腎臓を取り出し、氷冷したPBS中でリンスした。脂肪と結合組織を除去し、別々に処理した。臓器をフラグメントになるように切り、予め冷却しておいたDounceホモジナイザーにおいてホモジナイズした。上清を冷却した50mlのファルコンチューブに移し、冷却したPBSと混合し、大きな組織の破片を2分間の間、底に沈ませた。上清中の細胞を、200gで4℃で10分間かけてペレット状にし、PBSで1回洗浄し、1mlのPBS中に再度懸濁させ、数えた。5×106、5×107、および5×108個の細胞のセットを、CHEF哺乳動物ゲノムDNAプラグキット(CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit)(BIORAD)を使用してアガロースプラグに包埋した。HindIIIでの部分的消化の条件を最適化するために、プラグを5個の同じフラグメントに切断し、1から10単位のHindIIIで種々の時間の間、種々の温度で消化した。最良の結果は、4℃で3時間、または37℃で25分間の、2単位のHindIIIを用いた場合に得られた。消化したDNAを、以下のパラメーターを使用してパルスフィールドゲル電気泳動(Pulse Field Gel Electrophoresis)(PFGE)装置上でダブルサイズ分画した:6時間の逆行、15秒間のスイッチ時間;6時間前方へ進める、15秒間のスイッチ時間;20時間前方へ進める、90秒間のスイッチ時間;200V、14℃。所望される大きさの部分的に消化されたDNAを有しているゲルの領域を切り取り、DNAをゲレース(gelase)を使用して単離した。11ngの挿入フラグメントを、1ngのHindIIIで消化したpBELOBAC11と連結し、DH10B細胞中にエレクトロポレーションした。得られたコロニーの1%についてNotIを使用して大きさを測定し、平均の挿入フラグメントの大きさが124kbであることを明らかにした。1×105個のクローンをナイロンフィルター(Nylon filter)上にスポットし、特異的プローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
(ヒト化ウサギ免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築)
ウサギの免疫グロブリン重鎖遺伝子座の配列を含むBACおよびフォスミドクローンを、定常領域、可変領域、および結合遺伝子セグメント、あるいは、3’エンハンサー領域に特異的なプローブを使用してゲノムDNAライブラリーから単離した。単離したBAC(図1)27N5(GenBank Acc.No.AY386696)、219D23(GenBank Acc.No.AY386695)、225P18(GenBank
Acc.No.AY386697)、38A2(GenBank Acc.No.AY386694)、フォスミドFos15B(GenBank Acc.No.AY3866968)を配列決定した(Ros et al.,Gene 330,49−59)。
Yu et al.,PNAS 97,5978−5983(2000);Muyrers et al.,Nucleic Acids Research 27,1555−1557(1999);Zhang et al.,Nature Biotechnology 18,1314−1317(2000))。
(合成のフラグメントを用いたヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築)
ヒトV配列とウサギのスペーサーを有している、ユニット1、ユニット2、ユニット3、およびユニット4と示される4個のフラグメント(図13、配列番号189〜192)を化学的に合成した。それぞれのフラグメントには、5’に、AscI制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、3’にはlox71 Creリコンビナーゼ認識配列と、その後ろにFseIとMluI制限酵素認識配列が隣接している。ユニット1は、ウサギのスペーサーI29−30、I3−4、I2−3、およびIl−2の3’側半分(I1−2B)によって間隔を隔てられているヒトVH3−49、VH3−11、VH3−7、およびVH3−15可変遺伝子から構成されている。ユニット2は、ウサギのスペーサーI1−2A、(I1−2の5’側半分)、I7−8、I6−7、およびI4−5の3’側半分(I4−5B)によって間隔を隔てられているヒトVH3−48、VH3−43、およびVH3−64から構成されている。ユニット3は、ウサギのスペーサー配列I4−5B、I26−27、I11−12、およびI17−18によって間隔を隔てられているヒトVH3−74、VH3−30、およびVH3−9から構成されている。
(PCR増幅したフラグメントを用いるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築)
ヒトVHエレメントを、ゲノムDNA(ClonTech)とプライマー配列番号227〜248(表2)を使用して増幅した。PCR産物を、ゲル電気泳動によって分析し、GENECLEANキット(Q−Biogen)を使用してゲル精製した。その後、増幅産物を、Zero−Blunt TOPO(登録商標)(Invitrogen)に、製造業者の説明書にしたがってサブクローニングした。全ての増幅したVエレメントの配列を確認した。ヒト化V領域の構築のために、Vエレメントを、鋳型としてのプラスミドDNAと、プライマー配列番号249〜270(表2)を使用して増幅した。正方向プライマーには、AscI部位、その後ろに、ウサギスプライシング部位を含めた。逆方向プライマーには、ウサギの組み換えシグナル配列(RSS)と、MluI制限部位を含めた。PCR産物を、GENECLEANキットを使用してゲル精製した。
(ヒト化Cκとヒト化再構成VJを含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築)
ウサギのゲノムBACライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ1遺伝子セグメントを含む3個のBAC(215M22、179L1、および196O2;それぞれ、Gene Bank Acc.No.AY495826、AY495827、およびAY495828)が得られた。ウサギのCκ1を、記載されている(E−Chiang
Lee et al.,Genomics 73,56−65(2001);Daiguan Yu et al.,PNAS 97,5978−5983(2000);Muyrers et al.,Nucleic Acids Research 27,1555−1557(1999);Zhang et al.,Nature Biotechnology 18,1314−1317(2000))ようなETクローニングによって、ヒトCκアロタイプKm3と交換した。ヒトCκ(アロタイプKm3)を、標的配列に相同である50bpの配列を含むプライマー(配列番号301および302、表2)を用いてPCRによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κ(b5;GenBank Accession No.K01363)の公開されている配列に基づいて設計し、Cκのイントロン−エキソン境界と適合させた。BAC 179L1中でのウサギのCκのヒトCκへの交換を、配列決定によって確認した。
(複数のヒトVκエレメント、ニワトリのスペーサーエレメント、および再構成されたヒトVJを含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築)
ウサギのゲノムBACライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ1遺伝子セグメントを含む3個のBAC(215M22、179L1、および196O2;それぞれ、Gene Bank Acc.No.AY495826、AY495827、およびAY495828)が得られた。ウサギのCκ1を、記載されている(E−Chiang
Lee et al.,Genomics 73,56−65(2001);Daiguan Yu et al.,PNAS 97,5978−5983(2000);Muyrers et al.,Nucleic Acids Research 27,1555−1557(1999);Zhang et al.,Nature Biotechnology 18,1314−1317(2000))ようなETクローニングによって、ヒトCκアロタイプKm3と交換した。ヒトCκ(アロタイプKm3)を、標的配列に相同である50bpの配列を含むプライマー(配列番号301および302、表2)を用いてPCRによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κ(b5;GenBank Accession No.K01363)の公開されている配列に基づいて設計し、Cκのイントロン−エキソン境界と適合させた。BAC 179L1中でのウサギのCκのヒトCκへの交換を、配列決定によって確認した。
(複数のヒトVκエレメント、ニワトリのスペーサー、および再構成されていないヒトJκ遺伝子座を含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築)
実施例6に記載した構築物を、以下のようなETクローニングによって修飾した。再構成された機能的なVJ配列を、機能的な組み換えシグナル配列(RSS)が隣接している機能的なV1と交換した。RSSを、pBELOBAC11 Unit1/2のV1に相同である50bpの配列を含む正方向プライマー(配列番号325、表2)、および、AscI制限酵素部位を含み、ゲンタマイシン耐性遺伝子に対する相同性を有している逆方向プライマー(配列番号326、表2)を用いて、BAC 179L1からPCR増幅した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、RSSの増幅に使用した逆方向プライマーに相同である配列を含む正方向プライマー(配列番号327、表2)、およびpBELOBAC11
Unit1/2に相同である50bpの配列と、BsiWI制限酵素部位を含む逆方向プライマー(配列番号328、表2)を用いて増幅した。
(複数のヒトVκエレメントを含むヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築)
ウサギのゲノムBACライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ1遺伝子セグメントを含む3個のBAC(215M22、179L1、および196O2;それぞれ、Gene Bank Acc.No.AY495826、AY495827、およびAY495828)が得られた。ウサギのCκ1を、記載されている(E−Chiang
Lee et al.,Genomics 73,56−65(2001);Daiguan Yu et al.,PNAS 97,5978−5983(2000);Muyrers et al.,Nucleic Acids Research 27,1555−1557(1999);Zhang et al.,Nature Biotechnology 18,1314−1317(2000))ようなETクローニングによって、ヒトCκアロタイプKm3と交換した。ヒトCκ(アロタイプKm3)を、標的配列に相同である50bpの配列を含むプライマー(配列番号301および302、表2)を用いてPCRによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κ(b5;GenBank Accession No.K01363)の公開されている配列に基づいて設計し、Cκのイントロン−エキソン境界と適合させた。BAC 179L1中でのウサギのCκのヒトCκへの交換を、配列決定によって確認した。
(ニワトリ重鎖遺伝子座スペーサー配列を有するヒト化重鎖遺伝子座の構築)
ニワトリのスペーサー配列によって隔てられている、ウサギD領域、ヒトJ領域、ヒトCμ、ヒトCγ、ウサギCα4、ウサギ3’αエンハンサー、およびヒトVHエレメント(プロモーター、および7マー/9マーの配列を含む)を含む、合成のヒト化重鎖遺伝子座を構築する。
27N5Fosを形成させた。
al.,J Immunol 145(11),3601−3609(1990)、Reynaud et al.,Cell 59(1),171−183(1989))に特異的なプライマー(配列番号459および460、表2)を使用して、PCRによってニワトリのゲノムDNAから増幅した。あるいは、スペーサー配列を化学合成した。
(ヒトVエレメントおよび非ヒトスペーサー配列を含む(プロモーター領域とRSSは含まない)ヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築)
非ヒトゲノムDNAを用いて作成したBACライブラリーを、免疫グロブリンに特異的なプローブを用いてスクリーニングし、重鎖および軽鎖免疫グロブリンC、J、およびD領域を含むBACクローンを同定した。BACクローンを修飾して、制限酵素部位を含ませた。ヒト重鎖および軽鎖可変エレメントを、GenBank(例えば、Acc.No.NG_001019)に公開されている配列にしたがって設計したプライマーを使用してPCRによって増幅した。配列は、ゲノムDNAから増幅したか、または化学合成した。ヒトVエレメントには、ヒトのプロモーター領域、ヒトのリーダー配列、リーダーとVをコードする領域との間のヒトのイントロン、ヒトVをコードする領域、およびヒトの組み換えシグナル配列(RSS)が含まれている。増幅したか、または合成したフラグメントは、末端に特異的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有している。非ヒトスペーサー配列は、PCR増幅したか、または化学合成した。非ヒトスペーサー配列とヒトのVエレメントを、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む1つまたはいくつかの大きなDNAフラグメントとなるように結合させた。構築物を、トランスジェニック動物を作成するために使用した。ニワトリのスペーサー配列を用いたヒト化V領域の構築の例を、図10に示す。
(ヒトVエレメントおよび非ヒトスペーサー配列を含むヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築)
非ヒトゲノムDNAを用いて作成したBACライブラリーを、免疫グロブリンに特異的なプローブを用いてスクリーニングし、重鎖および軽鎖免疫グロブリンC、J、およびD領域を含むBACクローンを同定した。BACクローンを修飾して、制限酵素部位を含ませた。ヒト重鎖および軽鎖可変エレメントを、GenBank(例えば、Acc.No.NG_001019)に公開されている配列にしたがって設計したプライマーを使用してPCRによって増幅した。配列は、ゲノムDNAから増幅したか、または化学合成した。ヒトVエレメントには、ヒトVをコードする領域が含まれている。非ヒトスペーサー配列は、PCRによって増幅したか、または化学合成した。これには、組み換えシグナル配列、スペーサー配列、プロモーター領域、リーダー配列、およびリーダーとVをコードする領域との間のイントロンが含まれている。このような非ヒトスペーサー配列を、ヒトのVエレメントと、1つまたはいくつかの大きなDNAフラグメントとなるように結合させ、トランスジェニック動物を作成するために使用した。マウスまたはウサギのスペーサー配列を用いたヒト化V領域の構築の例を、図11に示す。
(ヒト化免疫グロブリンを発現するトランスジェニックウサギ)
トランスジェニックウサギを、Fan et al.(Pathol.Int.49:583−594,1999)に記載されているように作成した。簡単に説明すると、雌のウサギを標準的な方法を使用して過剰排卵させ、雄のウサギと交配させた。前核段階の受精卵を卵管から回収し、20%のウシ胎児血清を補充したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水のような適切な培養液に入れた。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むBACを、1対のマニピュレーターの力を借りて雄の前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している受精卵を、偽妊娠させたウサギの卵管に移した。偽妊娠は、ヒトの絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)の注射によって誘導した。ヒト化軽鎖構築物を受精卵の4645個の前核に注入した後、4043個の卵母細胞を132匹のレシピエントに移した。全部で253匹の生存性の子孫が産まれ、そのうちの11匹がトランスジェニックであった。ヒトκ軽鎖の発現を、ヒトκ軽鎖特異的試薬(例えば、マウスの抗ヒトκ、Southern Biotech,9220−01;ヤギの抗ヒトκ、Southern Biotech 2063−08)を使用してELISAによって検出した。
(ヒト化免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス)
トランスジェニックマウスを、Nagy et al.,(Manipulating
the Mouse Embryo:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2003)に記載されているように作成した。簡単に説明すると、雌のマウスを標準的な方法を使用して過剰排卵させ、雄のマウスと交配させた。前核段階の受精卵を卵管から回収し、M2培地のような適切な培養液に入れた。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むBACを、1対のマニピュレーターの力を借りて雄の前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している受精卵を、偽妊娠させた雌のマウスの卵管に移した。偽妊娠は無精子症の雄との交配によって誘導した。ヒト化軽鎖構築物を受精卵の1325個の受精卵の前核への注入の後、787個の卵母細胞を29匹のレシピエントに移した。全部で55匹の生存性の子孫が産まれ、そのうちの11匹がトランスジェニックであった。
Claims (8)
- ヒト化Ig遺伝子座を含むトランスジェニックベクターであって、該ヒト化Ig遺伝子座が、ウサギのIg遺伝子座またはIg遺伝子座の一部に由来し、該ヒト化Ig遺伝子座は、複数のIg遺伝子セグメントを含み、ここで:
(a)該遺伝子セグメントが、配列番号189、配列番号190、配列番号191及び配列番号192のものであり;
(b)該遺伝子セグメントが、再構成されていない配置、部分的に再構成された配置、または完全に再構成された配置において並列しており;そして
(c)該ヒト化Ig遺伝子座が、遺伝子再構成を受けることができ、かつ遺伝子変換および/または超変異を受けることができ、そして前記ウサギにおいて、ヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生じることができる、
トランスジェニックベクター。 - ウサギ中でヒト化抗体の機能的なレパートリーを生じることができるヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを作製するための方法であって、該方法は、以下:
(a)少なくとも1つのV遺伝子セグメント、少なくとも1つのJ遺伝子セグメント、および少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントを含む該動物に由来するIg遺伝子座またはその一部を含むDNAフラグメントを得る工程;ならびに
(b)ヒト化Ig遺伝子座を生じるように、工程(a)のDNAフラグメント中に配列番号189、配列番号190、配列番号191及び配列番号192の遺伝子セグメントを組み込む工程であって、ここで、(i)該遺伝子セグメントが、再構成されていない配置、部分的に再構成された配置、または完全に再構成された配置において並列しており;そして(ii)ヒト化Ig遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、遺伝子変換および/または超変異を受けることができ、そして該ウサギ中でヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生じることができる、工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載のトランスジェニックベクター中に存在するヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、トランスジェニックウサギであって、完全な内因性の調節機構および抗体産生機構を保存している、トランスジェニックウサギ。
- 請求項3に記載のトランスジェニックウサギに由来するB細胞であって、請求項1に記載のトランスジェニックベクター中に存在するヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、B細胞。
- 請求項3に記載のトランスジェニックウサギを用いてヒト化免疫グロブリンを産生するための方法。
- 前記ヒト化免疫グロブリンが抗体であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記ヒト化免疫グロブリンがポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記ヒト化免疫グロブリンがモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
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