WO2003031600A1 - Saccharomyces-cerevisiae-hefestamm mit stabiler integration und expression der nukleinsäuresequenz für einen heterologen kaliumionen-kanal - Google Patents

Saccharomyces-cerevisiae-hefestamm mit stabiler integration und expression der nukleinsäuresequenz für einen heterologen kaliumionen-kanal Download PDF

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nucleic acid
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ion channel
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Jost Ludwig
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Jost Ludwig
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    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the invention relates to Saccfraromyces-cerew 's / ae yeast strains with a stable integration and expression of the nucleic acid sequence for a heterologous potassium ion channel as well as the method for this yeast strain construction.
  • the invention relates to a Sacc ⁇ aromyces cerews / ae yeast strain in which all identified potassium ion translocation systems are specifically deleted; such Saccr / aromyces-cerew 's /' ae yeast strain, coded into the addition, a nucleic acid sequence encoding a heterologous potassium ion channel, in particular for a mammalian potassium ion channel as the human ERG potassium ion channel (HERG) is stably integrated into the yeast genome and expressed; a method of stably integrating heterologous potassium ion channel proteins into a Sacctjaromyces cere ' s / ae yeast strain and a method of detecting specific modulators of mammalian potassium ion channels using said yeast strains.
  • a nucleic acid sequence encoding a heterologous potassium ion channel in particular for a mammalian potassium ion channel as the human ERG potassium ion channel (HERG) is stably integrated
  • the yeast strains of the present invention are useful for identifying mammalian modulators, including human potassium ion channel genes or their protein products involved in genetic diseases.
  • the yeast strains are the basis of a pharmacological screening system of natural and / or chemical libraries with high efficiency for industrial use.
  • Modulators of HERG potassium ion channels are valuable pharmacological agents with potential therapeutic anti-arrhythmic and / or anti-fibrillar application.
  • Ion channels are transmembrane proteins that selectively mediate the flow of certain ions through membranes.
  • potassium ion channels are the most numerous and heterogeneous group. In both excitable and non-excitable cells, they are responsible for maintaining the resting potential.
  • the mediated by potassium ion channels Outward currents are the basis of both the shape and frequency as well as the repolarization of action potentials in excitable tissue.
  • Potassium ion channels are ubiquitous membrane proteins with a surprising variety of electrical properties. Thus, there are potassium ion channels that rapidly inactivate (A-type channels) and those that mediate inward currents (K channels). The functional diversity of potassium ion channels is reflected as much in the diversity of their structure.
  • Kv voltage-dependent potassium ion channels of the so-called Kv family consist of four subunits, with six transmembrane regions and one pore-forming domain being postulated for each subunit.
  • S. cerevisiae TOK1 potassium ion channel has been used to find a prototype of a group of potassium ion channels for which a very different topological structure has been proposed by duplicated pore regions (Ketchum, KA et al., Nature 376: 690-695 (1995) )).
  • LQT syndrome is a disease related to ventricular repolarization. Delayed repolarization of ventricular myocytes causes prolongation of the QT interval in the electrocardiogram (ECG).
  • ECG electrocardiogram
  • the LQT syndrome is usually inherited as an autosomal dominant or recessive disease. If the ventricular arrhythmias degenerate to fibrillation (atrial fibrillation), sudden death may result.
  • the role of the human ergo (human eag related gene, HERG) potassium ion channel in the heart is of particular interest.
  • HERG human eag related gene
  • the fast component I Kr is blocked by class III anti-arrhythmic agents such as D-solatol, dofetilide and clofilium.
  • the currents mediated by the HERG potassium ion channel channel correspond to the fast I Kr component of the delayed rectifier measured in isolated myocardial cells (Lees-Miller, JP et al., Circ. Res. 81: 719-723 (1997)).
  • HERG-mediated potassium ion currents contribute to the shortening of the action potentials at a faster heart rate. Mutations in HERG cause a hereditary form of polymorphic ventricular arrhythmia (torsades des pointes), also known as LQT2 syndrome (Sanguinetti, MC et al., Cell 81: 299-307 (1995); Curran, ME et al., Cell 80: 795-803 (1995), Keating, MT, Sanguinetti, M.C., Science 272: 681-685 (1996)).
  • Another syndrome (LQT1) is due to a defect in the Kv-LQT1 gene (Wang, Q. et al., Nat. Genet. 12: 17-23 (1996)).
  • Modulators of potassium ion channels are therefore valuable pharmacological agents with potential therapeutic application.
  • Highly selective blockers in- hibitors
  • potassium channel openers activators
  • Additional substances are for potential therapeutic use in acquired or inherited diseases by mutations in potassium ion channels such.
  • B. in HERG necessary.
  • New substances are commonly tested in mammalian cell lines expressing foreign potassium ion channel genes.
  • this method is complicated by the presence of endogenous channels in the cell lines used, and understandably only limited suitable for biotechnological purposes (homologous and heterologous expression of potassium ion channels).
  • the disadvantages of using animal cell lines are in particular:
  • yeast test systems with G protein-coupled receptors (King, K. Science 250: 121-123 (1990)), cytoplasmic receptors (Metzger, D. et al., Nature 334: 31-36 (1988) Schena, M. and Yamamoto, KR Science 251: 965-967 (1988)), a human ionic channel (VDAC) (Blachly-Dyson, E. et al., J. Bio. Chem. 268: 1835-1841 (1993)), immunosuppressant agents (Foor, F.
  • G protein-coupled receptors King, K. Science 250: 121-123 (1990)
  • cytoplasmic receptors Metzger, D. et al., Nature 334: 31-36 (1988) Schena, M. and Yamamoto, KR Science 251: 965-967 (1988)
  • VDAC human ionic channel
  • immunosuppressant agents Faor, F.
  • Cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae express a double affinity potassium uptake system encoded by the genes TRK1 and TRK2 (Rodriguez-Navarro, A., Ramos, J., J. Bacteriol 159: 940-945 (1984) and Ko, C. and Gaber Biol. 11: 4266-4273 (1991)) and a TOK1 gene-encoded outward rectifying voltage-dependent potassium ion channel for potassium efflux (Ketchum, KA et al., Nature 376: 690-695 (1995)).
  • This protein is the only voltage-dependent potassium ion channel in the plasma membrane of S. cerevisiae. S.
  • an inwardly rectifying potassium ion channel gene from guinea pigs could be functionally expressed in yeasts (Tang, W. et al., Mol. Biol. Cell 6: 1231-1240 (1995)).
  • Saccharomyces cerevisiae strains containing only mutations in the genes TRK1 and TRK2 for potassium transport are not suitable for biotechnological purposes (heterologous expression of potassium ion channel proteins).
  • a variety of potassium transport defective mutants have also been generated by simple mutations in haploid laboratory strains. Saccharomyces cerevisiae wild-type strains are diploid organisms with a double set of chromosomes. The modified alleles in haploid strains are thus genetically unstable.
  • mutant yeast strains are in particular: no defined genetic background, the phenotypic selection for expressed heterologous potassium ion channel genes is uncertain the expression of heterologous potassium ion channel genes only minimally and under certain conditions affects the growth of the mutant yeast strains, and thus the screening of pharmacologically active substances on heterologously expressed potassium ion channels is difficult.
  • the object and the aim of the present invention was to provide the o.
  • a genetically defined (isogenic) Saccharomyces cerevisus / ae strain of yeast in which all yeast-specific genes described for transport and channel proteins are specifically deleted, and a general method for granular, targeted integration of mammalian potassium ions
  • the human potassium ion channel erg HERG is stably integrated into the yeast genome and functionally expressed.
  • yeasts can be used in growth-based assays for screening many different substance libraries on a very small scale and with high efficiency ("screening" methods in microtiter dishes) and as a recombinant system for analyzing and confirming therapeutically active substances on target proteins of human origin. In addition, they can be used as biotherapeutics as well as substrates for targeted drug development.
  • This object is achieved by a genetically modified isogenic Saccharomyces cerevisiae yeast strain with deletions in the TRK1, TRK2 and TOK1 genes necessary for potassium uptake, and subsequent integration of nucleic acid sequences encoding heterologous potassium konn channels, in particular for human encode erg potassium ion channel.
  • This S, -cerew 's / ae-yeast strain is obtainable by the introduction of one or more selective marker (auxotrophy and / or resistance), followed by crossing to obtain isoge- ner strains and selecting those strains which, after transformation and stable integration of the potassium ion channel gene into the yeast genome (ie, the chromosomally encoded genetic information) and grow in culture media with a limited potassium concentration of 10 mg / l or less.
  • the invention thus relates
  • a preferred embodiment of the modified S. cerevisae yeast strain of (1) is a modified yeast strain further comprising one or more nucleic acid sequences encoding a heterologous potassium ion channel or a functional derivative or mutation thereof integrated into the yeast genome and expressed;
  • a preferred embodiment of the modified S. cerewsae yeast strain of (1) is a modified yeast strain in which, further, selectively only one functional heterologous nucleic acid sequence is stably integrated into a single locus in the yeast genome;
  • a process for producing a modified Saccharomyces cerevisiae yeast strain as defined in (2), comprising transforming a parent yeast strain or yeast strain as defined in (1) with an integration vector encoding a nucleic acid sequence encoding the potassium ion channel comprises;
  • a method of detecting specific modulators of the mammalian potassium ion channel comprising: a) treating a Saccharomyces cerevisiae yeast strain as defined in (2) or (3) with test substances, b) determining growth in the presence or after application of a Test substance, c) measurements of the increase or decrease in potassium ion transport of those strains in the presence or after application of a test substance;
  • a method for the directed singular integration of a funktionelllen HE terolgen nucleic acid sequence in a singular locus of Saccharomyces cerew 's /' ae-yeast genome comprising transforming a Popefestammes with an integration vector comprising a nucleic acid construct from the to be integrated functional nucleic acid sequence and a promoter effective in S. cerevisiae flanked by nucleobic acid sequences homologous to the unique gene locus in S. cerevisiae; and
  • Fig. 1 shows a schematic representation of the genomic fragments containing the Saccharomyces cerevisiae wild type TRK1, TRK2 and TOKl loci and the corresponding mutant alleles trkl :: ⁇ 51lox-kanMX, trk2 ⁇ 50 :: lox-kanMX and tokl ⁇ l :: lox-kanMX (cf. Clarification, the kan R gene is not drawn to scale, the size of this gene is 1.0 kb).
  • the TRK1, TRK2 and TOK1 coding regions are indicated by black bars.
  • the mutant alleles were used to replace the corresponding wild-type loci in sacca romyces cerevisiae strains transformed.
  • TRK1-sense SEQ ID NO: 1
  • TRK1-antisense SEQ ID NO: 2
  • TRK2-sense SEQ ID NO: 3
  • TRK2-antisense SEQ ID NO: 4
  • TOK1sense SEQ ID NO: 5
  • TOK1 antisense SEQ ID NO: 6
  • Fig. 2 shows a listing of the primers used; * Position numbers refer to either 5 'upstream (-) of the START codon or 3 downstream to the STOP codon.
  • the underlined sequences correspond to the amino glycoside phosphotransferase sequences in plasmid pUG6 (described in Güldener, U., et al., Nucleic Acid Research 24: 2519-2524 (1996)).
  • Fig. 3 is a list of constructed Saccharomyces cerevisiae strains.
  • Fig. 4 shows a schematic representation of the plasmid construct p679-pmal-HERG which was used to express the human erg potassium ion channel.
  • the pmal (Saccharomyces cerevisiae plasma membrane ATPase) promoter sequence and the nucleic acid sequence for the human erg potassium ion channel (HERG) are shown as filled arrows.
  • the plasmid construct has the following functional regions: Amp (start: 1268, end: 2125 (complement)); HIS3 (Start: 2709; End: 3371); fl (+) (start: 3585; end: 4041 (complement)); lacZ (start: 4043; end: 4231 (complement)); Ieu2 5 '(integration sequence) (start: 4242; end: 4719 (complement)); Leu2 3 '(integration sequence) (start: 4728; end: 5347 (complement)); pmal promoter (start: 5378; end: 6316); HERG (coding region) (start: 6326; finish: 9802); Linearization (Notl) (start: 4720, end: 4727); lacZ promoter (start: 109; end: 231 (complement)); ColEl (start: 325; end: 1205).
  • the nucleic acid sequence of the plasmid is shown in SEQ ID NO: 28.
  • Figure 5B shows the S. cerevisiae chromosomes X gene (5729 bp) comprising TRK1 (ACCESSION No. Z49404 Y13136; Submitted (25-SEP-1995) from the Max Planck Institute of Biochemistry, Am Klopferspitz 18a D-82152 Martinsried; CDS component (1232..4939); SEQ ID NO: 11).
  • the TRK1 protein is shown in Figure 5A (SEQ ID NO: 12).
  • Figure 6B shows the S. cerevisiae TRK2 gene (Accession No. M65215; Mol. Cell Biol. 11, 4266-4273 (1991); CDS 920..3589; SEQ ID NO: 13).
  • the TRK2 protein is shown in Figure 6A (SEQ ID NO: 14).
  • Figure 7B shows the Saccharomyces cerevisiae "outward-rectifier potassium Channel Toklp" (TOK1) gene (Accession No. U28005; Yeast 10 (7), 965-973 (1994); Submitted (30-May-1995) Karen A. Ketchum, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University, 295 Congress Avenue, New Haven, CT 06536-0812, USA, CDS 30..2105, SEQ ID NO: 15).
  • the Tokl protein is shown in Figure 7A (SEQ ID NO: 16).
  • Figure 8A shows the human putative potassium channel subunit (HERG) gene (Accession No. U04270; Proc. Natl. Acad., See, USA (1994); submitted (09-Dec-1993) to Jeffrey W. Warmke, Genetics and Molecular Biology, Merch Search Laboratories, 126 East Lincoln Avenue, PO Box 2000, Rahway, NJ 07065, USA; CDS 184..3663; SEQ ID NO: 17)
  • the HERG protein is shown in Figure 8B (SEQ ID NO: 18 ).
  • Figure 9 shows the results of the "reverse transcription" polymerase chain reaction of Example 4.2 (A: RNA, 2nd clone 5, 3rd clone 6, 4th clone 7, 5th clone 8, 6th clone 10, and B: 1 2. markers; 2. clone 5; 3. clone 6; 4. clone 7; 5. clone 8; 6. clone 10; 7. RNA control; 8. Construct control; 9th water control).
  • Fig. 10 shows the growth of the isolated Trkltrk2tokl Saccharomyces cerevisiae triple mutant with defective potassium ion transport depending on the potassium ion concentration in the culture medium.
  • Figure 11 shows the vector p77-TOK-pmal (7429 bp). The exact DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 27.
  • all potassium ion translocation genes are including TRKl, TRK2 and TOKl deleted or disruptered.
  • the yeast strain is preferably a trkl + trk2 + tokl mutant.
  • TRKl, TRK2 potassium transport proteins
  • TOKl potassium ion channel
  • the selectable biosynthetic marker genes (auxotrophy needs and / or resistances) can be introduced into the loci of the wild-type potassium transporter genes by recombinant DNA techniques. Suitable selectable markers are e.g. the auxotrophic markers URA3 and LEU2 or genes showing resistance e.g. against G418 (aminoglycoside phosphotransferase gene) effect. Such modified alleles can then be transformed into Saccharomyces cerevisiae, where they replace the wild-type loci by homologous recombination. The strains with modified alleles can be determined by selection for the biosynthetic marker (s).
  • the selectable biosynthetic markers introduced into the loci of the potassium translocation systems also provide an easy way to transfer these mutations into genetically different lines (crossing).
  • a strain containing a mutation in one of the potassium translocation genes e.g., TRK1 or TRK2 or TOK1
  • TRK1 or TRK2 or TOK1 can be crossed to diploids with a strain of the opposite mating type carrying a mutation in another potassium translocation gene (e.g., TRK2 or TRK1 or TOK1).
  • TRK2 or TRK1 or TOK1 By subsequent sporulation into haploids (tetrad analysis), the isogenic progeny can then be selected for the presence of the biosynthetic markers.
  • the trkltrk2tokl triple-mutant Saccharomyces cerevisiae phenotype can be determined by growth tests on selective culture media with potassium concentrations of 10 mM or less.
  • a yeast strain according to embodiments (1) to (3) according to the invention can be determined by a test which analyzes whether the expressed potassium ion channel gene to be tested functionally complements the trkltrk2tokl triple mutant Saccharomyces cerevisiae phenotype.
  • the modified yeast strains of the embodiments (2) and (3) are obtained by transforming the Saccharomyces cerevisiae yeast strain of the present invention with a recombinant DNA containing the gene of the potassium ion channel or functional heterologous nucleic acid sequence to be expressed also can code for a heterologous potassium ion channel) contains.
  • "Heterologous potassium ion channels" in the context of the present invention are those potassium ion channels which are not derived from S.
  • the heterologous potassium ion channel be (i) a mammalian potassium ion channel, in particular a human potassium ion channel or a functional derivative or a mutation thereof, and / or (ii) a potassium ion channel containing the Potassium ion uptake, an inbound (K
  • HERG erg ergic potassium ion channel
  • the yeast strain according to embodiment (3) of the invention is obtainable by directed integration by means of an integration vector into a unique gene locus, wherein the integration vector is a nucleic acid construct of the functional nucleic acid sequence and a promoter effective in Saccharomyces cerevisiae flanked in nucleic acid sequences belonging to the singular gene locus S. cerevisiae are homologous.
  • the functional nucleic acid encodes the HERG potassium ion channel, with particular preference being given to integrating HERG at the locus of one of the potassium ion translocation systems, in particular at the TOK1 locus of the yeast genome.
  • a further subject of the invention is the construction and transformation of a Saccharomyces cerevisiae yeast strain with a recombinant DNA, which enables targeted integration into a unique gene locus of the yeast genome.
  • a Recombinant DNA By transformation of such a Recombinant DNA is transformed into a transgenic yeast strain in which the foreign DNA is stably integrated into the yeast genome, with which chromosomal genetic information is propagated and thus continuously transmitted to the progeny.
  • the wild type Saccharomyces cerevisiae phenotype can be determined by selecting those strains that grow in the culture medium after transformation, selection and after cultivation under conditions of 10 mg / l potassium ions. For this purpose, the strain to be tested is incubated by growth tests on selective culture media with potassium ion concentrations of 10 mM or less.
  • the integration vector (8) employable for the method according to embodiment (7) comprises a nucleic acid construct (DNA, RNA, etc.) of the functional nucleic acid sequence to be integrated and a promoter effective in S. cerevisiae flanked by nucleellic acid sequences homologous to the unique gene locus in S. cerevisiae.
  • a nucleic acid construct DNA, RNA, etc.
  • a promoter effective in S. cerevisiae flanked by nucleellic acid sequences homologous to the unique gene locus in S. cerevisiae.
  • integration vectors that mediate integration into specific loci of the yeast system are known, e.g. P679 and derivatives (Doheny, K.F. et al., Cell, 73 (4): 761-774 (1993)).
  • these vectors were mostly constructed when only part of the yeast genome was known (before 1996).
  • Nucleic acid sequence to be integrated in the sense of the present invention are all heterologous, ie not derived from S. cerevisiae, functional nucleic acid sequences that are expressible in S. cerevisiae.
  • the heterologous nucleic acid sequences may be derived from mammals (including from humans), plants, but also from other microorganisms. It is particularly preferred that the functional nucleic acid sequence encode a potassium ion channel (as in embodiment (3) of the invention), but this should not be construed as limiting the invention.
  • a potassium ion channel as in embodiment (3) of the invention
  • the homologous sequences have a length of 40 to 1000 nucleotides, preferably of at least 80 nucleotides and / or
  • the promoter is selected from natural promoters of Saccharomyces cerevisiae and in particular the pmal promoter, and / or (iii) the functional nucleic acid sequence encodes one of the potassium ion channels defined above.
  • promoters in addition to the pmal promoter, all natural promoters of S. cerevisiae can be used, such as PGK, phosphoglycerate kinase, ADH, alcohol dehydrogenase, G-galactose permease, CUP1 copper permease, etc., and heterologous promoters which have a sufficient expression rate in S. cerevisiae such as CMVL (cytomegalovirus), etc.
  • the pmal promoter is particularly preferred.
  • the nucleic acid construct of the integration vector may also contain further functional sequences such as markers, leader sequences, etc.
  • the unique gene locus is the TOK1 locus and the flanking sequences are from the region pretok 3130 to 3599 of SEQ ID NO: 27 (corresponding to positions -1 to -449, based on the coding T ⁇ d-sequence) and posttok 3608 to 4156 (complement) of SEQ ID NO: 27 (corresponding to positions 2075 to 2604, based on the coding TOK1 sequence).
  • the growth defect of the trkltrk2tokl triple mutant Saccharomyces cerevisiae yeast strain can be used to isolate and accumulate potassium ion channel genes from gene libraries (e.g., human cDNA libraries) when the expressed genes complement the mutations in the tri-mutant yeast strain and have a wild-type phenotype the required potassium ion concentration results.
  • gene libraries e.g., human cDNA libraries
  • potassium ion channels can be identified which, while physiologically described but not yet isolated, are predicted to be presumed potassium ion channels from nucleic acid or amino acid sequence databases.
  • several potassium ion channels can be introduced into the triple mutant to test. whether the growth defect is complemented on potassium ion-limited media.
  • yeast strain that stably expresses a foreign potassium ion channel heterologously can be used to screen modulators of the respective potassium ion channel.
  • a yeast strain that heterologously expresses a foreign potassium ion channel can be used in simple procedures to screen various test substance libraries (chemical and natural substance libraries). These simple methods in which growth changes or increased and / or decreased potassium ion uptake can be monitored by agar plate assays and / or in liquid culture can thus detect specific active substances that modulate potassium ion channel function.
  • the screening method may include such changes as metabolic activity, increased growth rate, or increased uptake of potassium ions.
  • the screening method may include such changes as decreased growth rate or decreased potassium ion uptake.
  • test substances which are used in the method for the detection of specific modulators may be e.g. be synthetic or natural products.
  • Natural products include herbal, animal or microbial extracts.
  • the invention also relates to a method for detecting specific modulators of the expressed potassium ion channel including the HERG potassium ion channel, wherein a) a Saccftaromyces cereusae strain containing the nucleic acid sequence for the human erg Potassium ion channel (HERG) but not the yeast's own potassium translocation systems TRK1, TRK2 and TOK1 expressed, treated with test substances, b) the growth in the presence or after application of a test substance is determined and c) the increase or decrease in the potassium ion transport of those strains in the presence or after application of a test substance is measured.
  • a Saccftaromyces cereusae strain containing the nucleic acid sequence for the human erg Potassium ion channel (HERG) but not the yeast's own potassium translocation systems TRK1, TRK2 and TOK1 expressed, treated with test substances
  • b) the growth in the presence or after application of a test substance is determined and c) the increase or decrease in
  • This method is suitable for identifying specific modulators of the HERG ion channel.
  • the method is suitable for the detection of (i) anti-inflammatory substances, (ii) anti-fibrillatory substances or (iii) anti-inflammatory substances.
  • Yeast transformation Saccharomyces cerevisiae strains were transformed according to the lithium acetate method as described by Rothstein, R. (1991) in Methods in Enzymology 194: 281-302.
  • flanking homology PCR Polymerase Chain Reaction
  • a Saccharomyces cerevisiae yeast strain JRY379 (Reid, JD et al., Receptors and Channels 4: 51-61 (1996)) was used in the first step with the plasmid pGAL-HO (Rothstein, R., in Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology , C. Gutie and GR Fink (eds.) Pp. 281-302 Academic Press (1991)) to obtain the opposite mating type in the resulting strain HLY38 (see also Fig. 3).
  • PCR polymerase chain reaction
  • TRKl-sense 5 X GAA GGA GGG TAT TCT ATT GGC TCT CAA GGA AGT CAT TGC TCC TGA GTA AGC TTC CGC TGC 3 ⁇ (SEQ ID NO: l) and
  • TRK2 antisense 5 ⁇ AAT TAC GTT GGC TCT TAT GTA GGT AAA GAG GGG TAA ACT TGC ATA GGC CAC TAG TGG ATC TG 3 ⁇ (SEQ ID NO: 4);
  • TOK1-sense 5 ⁇ GGT TCC GGG ACG AAA GAG TTA GTA TTA TTA ATG CCA GCT GAA GCT TCG TAC GC 3 ⁇ (SEQ ID NO: 5) and
  • TOK1 antisense 5 ⁇ AGC TCT TCG TCT TCT ACT AGA TTA CCA ACT AAG CAT AGG CCA CTA GTG GAT CTG 3 ⁇ (SEQ ID NO: 6).
  • Strain JRY379 (Reid, JD, Receptors and Channels 4: 51-61 (1996)) was transformed separately with each of the deletion cassettes generated from the PCR, and transformed yeast colonies were selected on culture media with the antibiotic G418 (200 ⁇ g / ml, kanamycin sulfate) (Güldener, U., Nucleic Acid Research 24: 2519-2524 (1996)).
  • yeast strains HLY39 and HLY40 have replaced the complete coding regions of the TRK1, TRK2 genes by the lox-kanMX-lox module (aminoglycoside phosphotransferase gene; kan) (see also Figures 5A, 5B for TRK1 and 6A , 6B for TRK1).
  • the TOK1 gene is not completely replaced by the lox-kanMX-lox module (aminoglycoside phosphotransferase gene, kan R ): 223 nucleotides remain from the coding region after disruption the 5 'coding region and 88 nucleotides of the 3' coding sequence (see also Figs. 7A and 7B).
  • lox-kanMX-lox module aminoglycoside phosphotransferase gene, kan R
  • TRK1-START 5 ⁇ CGT TCG GGG CTG ACA ACG CA3 ⁇ (SEQ ID NO: 7), TRK2-START: 5 ⁇ CCC GTC CAT TGA GTG CCC GT 3 ⁇ (SEQ ID NO -8), and
  • TOK1-START 5 ⁇ CGC ATT CGC GTC TCG TTA CC 3 ⁇ (SEQ ID NO: 9) as 5 'sense starting molecules against the 3' antisense starting molecule
  • KAN antisense 5 ⁇ CCT CAG TGG CAA ATC CTA AC T (SEQ ID NO: 10), which lies 358 base pairs within the aminoglycoside phosphotransferase coding region (kan, lox-kanMX-lox module) in plasmid pUG6.
  • the yeast strains HLY39, HLY40 and HLY41 contain the trkl ⁇ lr.
  • HLY39 trkl ⁇ Sl :: lox-kanMX-lox
  • HLY40 trk2 ⁇ 50 :: loxkanMX-lox
  • HLY41 tokl ⁇ O :: lox-kanMX-lox
  • Figure 3 The isolated strains HLY39 (trkl ⁇ Sl :: lox-kanMX-lox), HLY40 (trk2 ⁇ 50 :: loxkanMX-lox) and HLY41 (tokl ⁇ O :: lox-kanMX-lox) ( Figure 3) were separated with the plasmid pSH47, which transforms the nucleic acid sequence for Cre / oxP recombinase under control of the GAL1 promoter (Güldener, U., Nucleic Acid Research 24: 2519-2524 (1996)).
  • Transformed yeast colonies were grown on culture media with galactose to induce the promoter for the Cre / oxP recombinase and isolated from single cell-derived colonies with sensitivity to G418 (kanamycin sulfate).
  • G418 kanamycin sulfate
  • the lox-kanMX-lox cassette was specifically excised by the activity of the pSH47 plasmid-encoded Cre / o P recombinase.
  • the G418 sensitive yeast strains were grown on culture media with 5-fluoro-orotic acid (5FOA) as described in Rothstein, R. (1991). 5FOA-resistant, single-celled colonies were isolated and grown, and the isolated yeast strains (see also Figure 3) HLY42 (trkl ⁇ 51), HLY43 (trk2 ⁇ 50) and HLY44 (tokl ⁇ SO) contain the unlabelled mutations.
  • Figure 5 is the deduced amino acid ⁇ (SEQ ID NO: ll; 5A) and the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 12; 5B) of Saccharomyces cerevisiae potassium ion transport protein TRKl shown.
  • the underscore highlighted regions correspond to the deleted sequence.
  • the START and STOP codons are indicated by boldface and the oligonucleotides used by italics.
  • Figure 6 shows the deduced amino acid (SEQ ID NO: 13; 6A) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 14; 6B) of Saccharomyces cerevisiae potassium ion transport protein TRK2.
  • the underscore highlighted regions correspond to the deleted sequence.
  • the START and STOP codons are indicated by boldface and the oligonucleotides used by italics.
  • Figure 7 shows the deduced amino acid (SEQ ID NO: 15; 7A) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 16; 7B) of the Saccharomyces cerevisiae potassium ion ion channel protein TOK1.
  • the underscore highlighted regions correspond to the deleted sequence.
  • the START and STOP codons are indicated by boldface and the oligonucleotides used by italics.
  • the engineered yeast strains were prepared according to the Sherman, F. et al. (Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1981). Subsequently, the diploid strains were sporulated and Segreganten isolated with the desired potassium ion transport defects by micromanipulation.
  • the strain HLY38 (MATa his3- ⁇ 200 leu2-3,112 trpl- ⁇ 901 ura3-52 suc2- ⁇ 9) and the strain HLY42 (MATa his3- ⁇ 200 leu2-3,112 trpl- ⁇ 901 ura3-52 suc2- ⁇ 9 trkl ⁇ 51) were crossed, the resulting sponges diploid strain and isolates tetrads on culture media with 50 mM KCl. Since the TRK1 gene codes for the high affinity potassium ion transporter in S. cerevisiae, the trkl mutant yeast strain should have a need for growth for potassium ions.
  • the diploid yeast strain, each with an unmutated allele of the potassium ion transporters TRK1 and TRK2 grew on all media tested. This growth was used to examine the recessive mutations. Recessive mutations are necessary for complementation with heterologous genes.
  • the potassium ion uptake-defective phenotype segregated as expected for two unrelated genes. Three phenotypes were expected and observed with respect to potassium ion scores from this crossover corresponding to the four genotypes: wild type with no defect in the TRK1, TRK2 alleles, trklTRK2 mutant with poor growth on 100 ⁇ M potassium ions, trk2TRK1 mutant of the same phenotype and trkltrk2 mutant with very poor Growth on 100 ⁇ M potassium ions. The trkltrk2 phenotype could be suppressed by growth on culture media with 10 mM potassium ions.
  • a trkltrk2 double mutant yeast strain HLY46 (trkl ⁇ 51 trk2 ⁇ 50) with MAT ⁇ mating type was grown from one of the resulting spores and probed with strain HLY44 (MATa his3- ⁇ 200 Ieu2-3,112 trpl- ⁇ 901 ura3-52 suc2- ⁇ 9 tokl ⁇ 50). crossed, the sporulated diploid strain and isolated tetrads on culture media with 50 mM KCl.
  • the diploid yeast strain, each with an unmutated allele of the potassium ion transporters TRK1, TRK2 and TOK1, grew on all media tested. This growth was used to examine the recessive mutations.
  • trkltrk2tokl triply mutant Saccharomyces cerevisiae yeast strain HLY47 (trkl ⁇ 51 trk2 ⁇ 50 tokl ⁇ 50) are all previously described yeast-own transport and channel proteins TRKl, TRK2 and TOKl specifically deleted (see also Fig. 3).
  • the phenotype of this strain is characterized by growth only on culture media containing at least 50 mM potassium ions.
  • Example 2 Construction of a plasmid for targeted, singular integration of foreign genes into the S. cerews / ae genome and for expression of these foreign genes in S. cerevisiae
  • genomic DNA was first isolated from the Saccharomyces cerevisiae wild strain S288C (ATCC, USA) using standard methods. 1 ⁇ g of this chromosomal DNA was used for a polymerase chain reaction (PCR) with Thermophilus aquaticus DNA polymerase and the following oligonucleotide primers for the amplification of the 5 'noncoding region of the S.
  • PCR polymerase chain reaction
  • oligonucleotide pretok_sense 5 ⁇ GG GCGGCC GCCTGCAAAT TTATCGAGAC TCTG 3 '(SEQ ID NO: 21), Position -470 to -449 with respect to the coding TOKl sequence, wherein the nucleotides added for cloning reasons are shown in italics and the nucleotides inserted to obtain a Not I site are underlined.
  • the DNA amplified by the PCR was separated as a 0.47 kb fragment by agarose gel electrophoresis and isolated from the gel matrix. This DNA was cleaved with the restriction endonucleases Not I and Sac I, separated by agarose gel electrophoresis and isolated from the gel matrix.
  • the plasmid vector p774 (Connelly and Heiter (1996) Cell 86, 275-285, 6.59 kb) was also cleaved with the restriction endonucleases Not I and Sac I, the products were separated by agarose gel electrophoresis and the 6.1 kb fragment from the Gel matrix isolated. The DNA fragments thus obtained were ligated. After transformation into bacteria (E.
  • tokl / pmal integration cassette for any desired target genes in the singular TOKl locus of the Saccharomyces cerevisiae yeast genome, 1 ⁇ g isolated, chromosomal DNA in a polymerase chain reaction (PCR) with DNA polymerase from Thermophilus aquaticus and the following oligonucleotide primers used for amplification of the 3 'non-coding region of the S. cerevisiae TOK1 gene: oligonucleotide posttok-antisense: 5 ⁇ GG GCGGCC GCCGGGATCG ATGATGTAGG G 3 '(SEQ ID NO: 23),
  • Position 2624 to 2604 based on the coding TOKl sequence, wherein the nucleotides added for cloning reasons are shown in italics and the nucleotides inserted to obtain a Not I site are underlined.
  • the DNA amplified by the PCR was separated as a 0.56 kb fragment by agarose gel electrophoresis and isolated from the gel matrix. This DNA was cleaved with the restriction endonucleases Not I and Spe I, separated by agarose gel electrophoresis and isolated from the gel matrix.
  • the plasmid vector p77-pretok was also cleaved with the restriction endonucleases Not I and Spe I, the products were separated by agarose gel electrophoresis and the 5.95 kb fragment was isolated from the gel matrix. The resulting fragments were ligated. After transformation into bacteria (E. coli XLI-Blue, Stratagene) and incubation at 37 ° C.
  • the yeast own promoter of the plasma membrane ATPase PMA1 was used for transcription of any desired human gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the pym promoter constitutively active in Saccharomyces cerevisiae was isolated as an Eco RI / Bam HI 0.9 kb fragment from the plasmid pRS408 (obtained from Dr. A. Goffeau, Universite Catholique de Louvain-Ia-Neuve, Belgium) after separation by agarose gel electrophoresis.
  • the 0.9 kb pmal Eco RI / Bam HI was ligated with the Eco RI / Barn HI digested plasmid vector pUC18.
  • the resulting plasmid pUC-pmal was confirmed by restriction mapping and sequencing. From this plasmid, the 0.9 kb pmal promoter fragment was obtained with DNA polymerase from Thermophilus aquaticus and the following oligonucleotide primers for the amplification of the regulatory region: Oligonucleotide pmal_antisense:
  • the DNA amplified by the PCR was separated as a 0.93 kb fragment by agarose gel electrophoresis and isolated from the gel matrix. This DNA was cleaved with the restriction endonucleases Sal I and Apa I, separated by agarose gel electrophoresis, isolated from the gel matrix and ligated with the plasmid vector p77-TOK cleaved by the restriction endonucleases Sal I / Apa I. After transformation into bacteria (E. coli XLI-Blue, Stratagene) and incubation at 37 ° C.
  • Any desired human target genes can be inserted into this constructed integration plasmid. After cleavage with the restriction endonuclease Not I obtain linear DNA fragments which can be used to transform suitable yeast host strains. This results in stable transgenic yeast strains in which the desired target gene is integrated at the unique TOK1 locus in the yeast genome instead of the endogenous TOK1 gene.
  • the yeast's own promoter of the plasma membrane ATPase PMA1 is used for transcription of any desired human gene in the generated transgenic Saccharomyces cerevisiae yeast strain.
  • the gene for the human ergo potassium ion channel was isolated by cleavage with the restriction endonucleases Bam HI and XbaI as a 3.9 kilobase pair (kb) fragment from the plasmid pcDNAHERG (obtained from Dr. G. Robertson, University of Wisonsin, Madison, USA) and separation by agarose gel electrophoresis.
  • yeast's own promoter of the plasma membrane ATPase PMA1 was used for the transcription of a human gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the pym promoter which was constitutively active in Saccharomyces cerevisiae was isolated as an Eco RI / Bam HI 0.9 kb fragment from the plasmid pRS408 (obtained from Dr. A. Goffeau, Universite Catholique de Louvain-Ia-Neuve, Belgium) after separation by agarose gel electrophoresis.
  • Plasmid p679pmal HERG was identified by restriction mapping (see Figure 4).
  • the human erg gene was stably integrated into the gene locus for the biosynthetic marker LEU2 of the Saccharomyces cerevisiae yeast strain.
  • flanking regions of the LEU2 gene are inserted for directional homologous recombination of the cloned insert at the chromosomal locus of the LEU2 gene in Saccharomyces cerevisiae 5 'and 3'.
  • the restriction endonuclease Not I introduced a linearization of the plasmid p679pmalHERG at position 2189 between the flanking LEU2 regions.
  • the obtained linear 10.2 kb Not I fragment was used after separation by agarose gel electrophoresis to transform the trkltrk2tokl triple mutant Saccharomyces cerevisiae yeast strain in which all previously described yeast own transport and channel proteins TRKl, TRK2 and TOKl are specifically deleted.
  • transformants were selected for the biosynthetic marker HIS3 (HIS3 + prototrophy) likewise contained in the plasmid p679. Single-celled colonies were further selected on culture media with potassium ion concentrations less than 10 mM.
  • the expression of the human potassium ion channel erg gene complements the Potassium ion transport defective phenotype of trkltrk2tokl triplicate Saccharomyces cerevisiae mutant on culture media with potassium ion concentrations less than 10 mM.
  • yeast's own potassium ion transport and channel proteins in this Saccharomyces cerevisiae strain (genotype MATa his3- ⁇ 200 leu2-3,112 trpl- ⁇ 901 ura3-52 suc2- ⁇ 9 trkl ⁇ 51trk2 ⁇ 50 tokl ⁇ 50 leu2 :: pmalHERG HIS3) (see also FIG human HERG potassium ion channel expressed.
  • Figure 8 shows the nucleic acid (SEQ ID NO: 17; 8A) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 18; 8B) of the human erg potassium ion channel gene (HERG). The sequence corresponds to that described in the original publication by Trudeau, MC et al., Science 269: 92-95 (1995).
  • oligonucleotides used for RNA analysis H1119 5 l CAG CGG CTT GCT CAA CTC CA 3 (SEQ ID NO: 19) and H1557 5 GAT GAG GTC CAC CAC AGC CA 3 '(SEQ ID NO: 20) are indicated by italics and underline.
  • FIG. 9 shows the results of a "reverse transcription" polymerase chain reaction.
  • RNA was isolated from several positive clones expressing the human potassium ion channel erg gene (clones Nos. 5, 6, 7, and 8) after selective growth in the culture medium with 10 mM potassium ions. The separation of the total RNA for checking the integrity and proportions was carried out in 1% denaturing agarose gel (left part in FIG. 9). This total RNA was transcribed into complementary DNA with reverse transcriptase and amplified in a subsequent PCR analysis using erg specific oligonucleotides (SEQ ID NO: 19) / (SEQ ID NO: 20) a 440 base pair long fragment.
  • SEQ ID NO: 19 erg specific oligonucleotides
  • SEQ ID NO: 20 a 440 base pair long fragment.
  • Non-rewritten RNA from clone # 6 was used to control for possible DNA contamination in the RNA preparation.
  • to Control of the correct amplification product was 20 pg of the plasmid p679pmalHERG used.
  • To control the reaction mixture a reaction without template was carried out (water control). The separation of the fragments took place in a 0.8% agarose gel.
  • RNA analysis by RT-PCR confirmed the expression of the human potassium ion channel erg gene (HERG) introduced by homologous recombination into the trkltrk2tokl triple mutant Saccharomyces cerevisiae yeast strain.
  • HERG human potassium ion channel erg gene
  • the Saccharomyces cerevisiae yeast strain with defects in all potassium ion translocation systems TRK1, TRK2 and TOK1 does not grow at low potassium ion concentrations (10 mM) in the medium at pH 5.0 and pH 5.5.
  • the strain expressing the human potassium ion channel erg gene is able to grow comparably well to 10 mM potassium ions in the medium at pH 5.0 and pH 5.5, the Saccharomyces cerevisiae wild strain.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Saccharomyces-cerevisiae-Hefestämme mit stabiler Integration und Expression der Nukleinsäuresequenz für einen heterologen Kaliumionen-Kanal sowie das Verfahren zur Konstruktion dieser Hefestämme. Im Einzelnen betrifft die Erfindung einen Saccharomyces-cerevisiae-Hefestamm, in dem alle identifizierten Kaliumionentranslokations-systeme spezifisch deletiert sind; einen solchen Saccharomyces-cerevisiae-Hefestamm, in den darüber hinaus eine Nukleinsäuresequenz, die für einen heterologen Kaliumionen-Kanal, insbesondere für einen Säuger-Kaliumionen-Kanal wie den humanen erg-Kaliumionen-Kanal (HERG) kodiert, stabil in das Hefegenom integriert ist und exprimiert wird; ein Verfahren zur stabilen Integration heterologer Kaliumionen-Kanalproteine in einen Saccharomyces-cerevisiae-Hefestamm sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren von Säuger-Kaliumionen-Kanälen unter Verwendung der genannten Hefestämme.

Description

Sacc iarom ces-cere 's/ae-Hefestamm mit stabiler Integration und Ex pression der Nukleinsäuresequenz für einen heterologen Kaliumionen
Kanal
Die Erfindung betrifft Saccfraromyces-cerew's/ae-Hefestämme mit stabiler Integration und Expression der Nukleinsäuresequenz für einen heterologen Kaliumionen-Kanal sowie das Verfahren zur Konstruktion dieser Hefestämme. Im Einzelnen betrifft die Erfindung einen SaccΛaromyces-cerews/ae-Hefestamm, in dem alle identifizierten Kaliumionentranslokations-systeme spezifisch deletiert sind; einen solchen Saccr/aromyces-cerew's/'ae-Hefestamm, in den darüber hinaus eine Nukleinsäuresequenz, die für einen heterologen Kaliumionen-Kanal, insbesondere für einen Säuger-Kaliumionen-Kanal wie den humanen erg-Kaliumionen-Kanal (HERG) kodiert, stabil in das Hefegenom integriert ist und exprimiert wird; ein Verfahren zur stabilen Integration heterologer Kaliumionen-Kanalproteine in einen Sacctjaromyces-cere 's/ae-Hefestamm sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren von Säuger-Kaliumionen-Kanälen unter Verwendung der genannten Hefestämme.
Die erfindungsgemäßen Hefestämme sind geeignet zur Identifizierung von Modulatoren von Säuger einschließlich humanen Kaliumionen-Kanalgenen bzw. deren Proteinprodukten, die in genetisch bedingten Krankheiten involviert sind. Die Hefestämme sind die Basis eines pharmakologischen Durchmusterungssystems natürlicher und/oder chemischer Bibliotheken mit hohem Wirkungsgrad zum industriellen Einsatz. Modulatoren von HERG Kaliumionen-Kanälen sind wertvolle pharmakologische Agentien mit möglicher therapeutischer anti-arrhythmischer und/oder anti-fibrillärer Anwendung.
Hintergrund der Erfindung
Ionenkanäle sind Transmembranproteine, die selektiv den Fluß bestimmter Ionen durch Membranen vermitteln. Unter den bisher bekannten Ionenkanälen stellen Kaliumionen-Kanäle die zahlreichste und heterogenste Gruppe dar. Sowohl in erregbaren als auch in nicht-erregbaren Zellen sind sie für die Aufrechterhaltung des Ruhepotentials verantwortlich. Die durch Kaliumionen-Kanäle vermittelten Auswärtsströme sind die Grundlage sowohl der Form und Frequenz als auch der Repolarisierung von Aktionspotentialen in erregbarem Gewebe. Kaliumionen-Kanäle sind ubiquitare Membranproteine mit einer erstaunlichen Vielfalt elektrischer Eigenschaften. So gibt es Kaliumionen-Kanäle, die schnell inaktivieren (A-Typ Kanäle), und solche, die Einwärtsströme (K Kanäle) vermitteln. Die Funktionsvielfalt der Kaliumionen-Kanäle spiegelt sich ebensosehr in der Unterschiedlichkeit ihrer Struktur wieder. "Klassische" spannungsabhängige Kaliumionen-Kanäle der sogenannten Kv-Familie bestehen aus vier Untereinheiten, wobei für jede Untereinheit sechs Transmembranregionen und eine porenbildende Domäne postuliert werden, KιR Ionenkanaluntereinheiten der einwärts-gleichrichtenden Kaliumionen-Kanäle bestehen aus nur zwei Transmembran- und einer Porenregion. Erst kürzlich wurde mit dem S. cerevisiae TOKl Kaliumionen-Kanal der Prototyp einer Gruppe von Kaliumionen-Kanälen gefunden, für die eine besonders unterschiedliche topologische Struktur durch duplizierte Porenregionen vorgeschlagen wurde (Ketchum, K.A. et al., Nature 376:690-695 (1995)).
Während der letzten Jahre wurde in einer Reihe von Arbeiten eine wachsende Anzahl menschlicher Krankheiten als Resultat von Mutationen in für Kaliumionen- Kanäle kodierenden Genen gezeigt. So verursacht z.B. eine Punktmutation in Kvl.l die Episodische Ataxie (Adelmann, J. P. et al., Neuron 15: 1449-1454 (1995)).
Das LQT Syndrom ist eine Krankheit, die die ventrikuläre Repolarisation betrifft. Eine verzögerte Repolarisation ventrikulärer Myocyten verursacht eine Verlängerung des QT Intervalls im Elektrokardiogramm (EKG). Das LQT Syndrom wird meist als autosomal dominante oder rezessive Krankheit vererbt. Wenn die ventrikulären Arrythmien zur Fibrillation degenerieren (Herzflimmern), kann plötzlicher Tod die Folge sein.
In diesem Zusammenhang ist die Rolle des humanen erg (human eag related gene, HERG) Kaliumionen-Kanals im Herzen von besonderem Interesse. In ventriculären Myocyten sind repolarisierende Kaliumströme, genannt "delayed rectifier", aktiv, die sich aus mehreren Komponenten zusammensetzen. Diese multiplen Komponenten werden anhand der Geschwindigkeit ihrer Aktivierung (schnell = rapid = IKr; langsam = slow = IKs) und ihrer unterschiedlichen Pharmakologie unterschieden. Die schnelle Komponente IKr wird durch Klasse III anti- arrythmische Agentien wie D-Solatol, Dofetilid und Clofilium blockiert. Die durch den HERG Kaliumionenkanal-Kanal vermittelten Ströme entsprechen der in isolierten Herzmuskelzellen gemessenen schnellen IKr Komponente des "delayed rectifier" (Lees-Miller, J. P. et al., Circ. Res. 81:719-723 (1997)).
HERG vermittelte Kaliumionenströme tragen zur Verkürzung der Aktionspotentiale bei schnellerer Herzschlag rate bei. Mutationen in HERG verursachen eine erbliche Form der polymorphen ventrikulären Arrhythmie (torsades des pointes), auch bekannt als LQT2 Syndrom (Sanguinetti, M. C. et al., Cell 81 :299-307 (1995); Curran, M. E. et al., Cell 80:795-803 (1995); Keating, M. T., Sanguinetti, M. C, Science 272:681-685 (1996)). Ein weiteres Syndrom (LQT1) wird durch einen Defekt im Kv-LQTl Gen bedingt (Wang, Q. et al., Nat. Genet. 12: 17-23 (1996)).
Der Verlust funktioneller auswärts-gleichrichtender KAτp Kanäle in den ß-Zellen des Pankreas verursacht eine persistente Hypersekretion von Insulin, die Hy- perglykämie (Kane, C. et al., Nature Medicine 2: 1344-1347 (1996)). Bei diesem Defekt der Glucose-Homeostase wurden erfolgreich 'therapeutische' Kalium-Kanal-Öffner (KCOs), synthetische pharmakologische Moleküle, zur Behandlung eingesetzt (Lawson, K., Clinical Science 91:651-663 (1996); Ashcroft, F. M., Nature Medicine 2: 1301-1302 (996)).
Ströme durch spannungsabhängige Kaliumionen-Kanäle werden durch mehrere Substanzen moduliert und/oder blockiert, die entweder organische Salze oder tierische Toxine (Proteinderivate) sind (Mosczydiowski, E. et al., J. Membrane Biol. 105:95-111 (1988); Rudy, B., Neuroscience 25:729-749 (1988); Pongs, O., Physiological Rev. 72:69-87 (1992); Defarias, F. P. et al., Recept. and Channels 3:273-281 (1995); Gomez-Lagunas, F. et al. J. Membrane Biol. 152:49-56 (1996)).
Modulatoren von Kaliumionen-Kanälen sind daher wertvolle pharmakologische Agentien mit möglicher therapeutischer Anwendung. Hoch-selektive Blocker (In- hibitoren) sind nur für eine relativ begrenzte Anzahl von spannungsabhängigen Kaliumionen-Kanälen bekannt, Kalium-Kanal-Öffner (Aktivatoren) sind für diesen Kanaltyp bisher unbekannt. Zusätzliche Substanzen sind zur möglichen therapeutischen Anwendung bei erworbenen oder vererbten Krankheiten durch Mutationen in Kaliumionen-Kanälen wie z. B. in HERG notwendig. Neue Substanzen werden üblicherweise in Säugerzellinien getestet, die fremde Kaliumionen-Kanal Gene exprimieren. Jedoch ist dieses Verfahren durch das Vorhandensein endogener Kanäle in den verwendeten Zellinien erschwert, und für biotechnologische Zwecke (homologe und heterologe Expression von Kaliumionen-Kanälen) verständlicherweise nur eingeschränkt geeignet. Die Nachteile zur Verwendung tierischer Zellinien sind insbesondere:
- die Kultivierung tierischer Zellinien ist wesentlich komplizierter, finanziell aufwendig sowie kontaminationsanfällig.
- Homolog und/oder heterolog exprimierte Kaliumionen-Kanäle beeinflussen das Wachstum tierischer Zellinien nicht,
- Das Vorhandensein endogener Kaliumionen-Kanäle erschwert die Auswertung der experimentellen Daten.
Ein alternativer Ansatz zur Verwendung tierischer Zellinien ist die Entwicklung von Hefestämmen, die Kaliumionen-Kanäle aus Säugern, insbesondere dem Menschen, funktionell exprimieren.
Traditionell werden die meisten pharmakologisch wirksamen Substanzen durch Massen-Durchmusterung chemischer oder natürlicher Banken entdeckt. Dabei wurden "screening"-Programme in Hinsicht auf die Empfindlichkeit mit der das aktive Material identifiziert werden kann, die Anzahl der Proben, die getestet werden können sowie verschiedene Typen molekularer Ziele und deren erkennbare zelluläre Funktionen optimiert.
Basierend auf der Anwendung von Hefegenetik und Molekularbiologie konnten während des letzten Jahrzehnts verschiedene, diesen Kriterien entsprechende Testsysteme entwickelt werden. So sind z.B. Hefe-Testsysteme mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren (King, K. Science 250: 121-123 (1990)), zytoplasmati- schen Rezeptoren (Metzger, D. et al., Nature 334:31-36 (1988); Schena, M. und Yamamoto, K.R. Science 251:965-967 (1988)), eines humanen Ionen-Kanals (VDAC) (Blachly-Dyson, E. et al., J. Bio. Chem. 268: 1835-1841 (1993)), immun- suppressiven Agentien (Foor, F. et al., Nature 360:682-684 (1992)), Sterol-Bio- synthese Enzymen (Basson, M. E. et al., Mol. Cell. Biol. 8:3797-3808 (1998)), Onkogenen (Broach, J. R. Trends Genet. 7:28-33 (1991)) und Proteine für "multiple drug resistance" (Raymond, M. et al., Science 256:232-234 (1992)) entwickelt worden.
Alle diese Systeme sind dadurch charakterisiert, daß zur Expression des heterologen Gens Plasmidvektoren verwendet werden, die sich episomal, d. h. außerhalb der Hefechromosomen vermehren. Die durch Transformation dieser Plasmide hergestellten Hefestämme haben den Nachteil, daß kontinuierlich auf die Anwesenheit der Plasmide mit Hilfe ebenfalls plasmidkodierter auxotropher Marker selektioniert werden muß.
Die hohe Homologie essentieller zellulärer Vorgänge in Hefe und Zellen höherer Eukaryonten eröffnet weitreichende Möglichkeiten zur Verwendung von Hefe als Expressionssystem zur Untersuchung heterolog exprimierter Kaliumionen-Kanal- Gene. Diese von diesen Genen kodierten rekombinanten Kaliumionen-Kanal- Proteine können für folgende Untersuchungen verwendet werden :
- Entdeckung von auf Säuger-Zellen wirksamen Substanzen (Durchmusterungs- Tests),
- Anwendung als Biotherapeutika und als
- Substrate zur gezielten Medikament Entwicklung.
Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimieren ein durch die Gene TRK1 und TRK2 kodiertes zweifach-affines Kaliumaufnahmesystem (Rodriguez- Navarro, A., Ramos, J., J. Bacteriol. 159:940-945 (1984) und Ko, C. und Gaber, R. F., Mol. Cell.. Biol. 11:4266-4273 (1991)) und einen durch das TOKl Gen kodierten auswärts-gleichrichtenden spannungsabhängigen Kaliumionen-Kanal für Kalium Efflux (Ketchum, K. A. et al., Nature 376:690-695 (1995)). Dieses Protein ist der einzige spannungsabhängige Kaliumionen-Kanal in der Plasmamembran von S. cerevisiae. S. cerevisiae Hefestämme, die Mutationen in den Kaliumtransportproteinen TRK1 und TRK2 beinhalten, zeigen Wachstumsdefekte auf Medien mit niedrigen Kaliumionenkonzentrationen. Im Vergleich zum S. cerevisiae Wildstamm bedürfen diese mutanten Hefestämme eines Zusatzes von 10 mM Kalium im Medium (Liang, H. et al., Mol. Cell. Biol., 926-935 (1998)). Die Komplementation dieses Kaliumaufnahmedefektes durch die Anwendung von Expressionsklonierungs Strategien führte zur Isolierung und Klonierung verschiedener Kaliumtransport- Proteine aus Pflanzen (Anderson, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Science USA 89:3736-3740 (1992); Sentenac, H. et al., Science 256: 663-665 (1992); Schachtman, D. P. und Schroeder, J. I. Nature 370: 655-658 (1994)). Außerdem konnte ein einwärts-gleichrichtendes Kaliumionen-Kanalgen (gpIRK) aus Meerschweinchen in Hefen funktionell exprimiert werden (Tang, W. et al., Mol. Biol. Cell 6: 1231-1240 (1995)).
Saccharomyces cerevisiae Hefestämme, die Mutationen in den Kaliumtransportproteinen TRK1 und TRK2 beinhalten, verfügen jedoch noch über zusätzliche effektive Mechanismen zur Kaliumaufnahme, vermittelt durch den Kaliumionen- Kanal TOKl (Fairman, C. et al., J. Membr Biol. 168: 149-57 (1999)). Ahmed, A. et al., Cell 99, 283-291 (1999) beschreibt weiterhin, dass das TOKl-Gen als Ziel von viralen Killertoxinen dienen kann.
Damit sind Saccharomyces cerevisiae Stämme, die nur Mutationen in den Genen TRK1 und TRK2 für Kaliumtransport beinhalten, für biotechnologische Zwecke (heterologe Expression von Kaliumionen-Kanal Proteinen) nicht geeignet. Eine Vielzahl der Kaliumtransport defekten Mutanten sind außerdem durch einfache Mutationen in haploiden Laborstämmen erzeugt worden. Saccharomyces cerevisiae Wildtyp Stämme sind diploide Organismen mit zweifachem Chromosomensatz. Die modifizierten Allele in haploiden Stämmen sind somit genetisch nicht stabil. Die Nachteile zur Verwendung solcher mutanten Hefestämme sind insbesondere: kein definierter genetischer Hintergrund, die phänotypische Selektion auf exprimierte heterologe Kaliumionen- Kanalgene ist unsicher, da die Expression heterologer Kaliumionen-Kanalgene das Wachstum der mutanten Hefestämme nur minimal und unter bestimmten Bedingungen beinflusst, und somit die Durchmusterung pharmakologisch wirksamer Substanzen auf heterolog exprimierte Kaliumionen-Kanäle erschwert ist.
In der DE 199 41 768 werden Schizosaccharomyces-pombe-Hefestä mme mit Defekten in den Kaliumtransportproteinen TKHp und Trk2 beschrieben. Andere hier beschriebenen Hefestämme exprimieren darüber hinaus noch die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg-Kaliumionen-Kanal. Diese Hefestämme sind jedoch nicht zum Durchmustern von Testsubstanzen geeignet, da, wie kürzlich gefunden wurde, sich in diesen Schizosaccharomyces-pombe-Stämmen noch ein zusätzliches Gen für Kaliumtransport befindet. Dieses Gen wurde nie identifiziert oder beschrieben, entsprechend in den angemeldeten Stämmen auch nicht eliminiert. Damit besteht bei dem S.-pomtJe-Herg-Stamm prinzipiell die Möglichkeit, dass das zu beobachtende Wachstum nicht aufgrund des heterolog exprimierten Herg-Gens, sondern aufgrund des obengenannten nicht eliminierten Transporters erfolgt. Darüber hinaus besitzt S. pombe im Vergleich zu S. cerevisiae einen weniger eindeutigen genetischen Hintergrund.
Die Aufgabe und das Ziel der vorliegenden Erfindung war es, die o. g. Nachteile zu vermeiden und einen genetisch definierten (isogenen) Saccharomyces-cerevi- s/ae-Hefestamm, in dem alle beschriebenen hefeeigenen Gene für Transport- und Kanalproteine spezifisch deletiert sind, sowie ein allgemeines Verfahren zur sin- gulären, gezielten Integration von Säuger-Kaliumionen-Kanälen in das Genom des Hefestammes zu entwickeln, wobei spezifisch der humane Kaliumionen-Ka- nal-erg (HERG) stabil in das Hefegenom integriert und funktionell exprimiert ist.
In der Biotechnologie besteht ein Bedarf an gut wachsenden, genetisch definierten Hefestämmen für die heterologe Expression von in menschlichen Krankheiten involvierten, Kaliumionen transportierenden Kaliumionen-Kanal Genen für pharmakologische Zwecke. Die biotechnologische Verwendbarkeit stabil Kaliumionen- Kanal Gene exprimierender, gut wachsender Hefestämme besteht in der funktio- nellen und pharmakologischen Analyse der heterologen Kaliumionen-Kanal Ziel- proteine: Hefen können in auf Wachstum basierenden Testreihen für Durchmusterungen vieler verschiedener Substanzbibliotheken in sehr kleinem Maßstab und mit hohem Wirkungsgrad ("screening" Verfahren in Mikrotiterschalen) und als rekombinantes System zur Analyse und Bestätigung therapeutisch wirksamer Substanzen auf Zielproteine humanen Ursprungs verwendet werden. Darüber hinaus können sie als Biotherapeutika sowie als Substrate zur gezielten Medikamententwicklung verwendet werden.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Diese Aufgabe wird gelöst durch einen genetisch modifizierten isogenen Saccha- romyces-cerevisiae-Hefestamm mit Deletionen in den TRK1, TRK2 und TOKl Genen, die zur Kaliumaufnahme notwendig sind, und nachfolgende Integration von Nukleinsäuresequenzen, die für heterologe Kaliumkonen-Kanäle, insbesondere für den humanen erg-Kaliumionen-Kanal kodieren. Dieser S,-cerew's/ae-Hefe- stamm ist erhältlich durch die Einführung eines oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophie und/oder Resistenzen), nachfolgender Kreuzung zum Erhalt isoge- ner Stämme und Auswahl derjenigen Stämme, welche nach Transformation und stabiler Integration des Kaliumionen-Kanal Gens in das Hefegenom (d. h. in die chromosomal kodierte Erbinformation) und Anzucht in Kulturmedien mit limitierter Kaliumkonzentration von 10 mg/1 oder weniger wachsen. Die Erfindung betrifft somit
(1) einen modifizierten Saccharomyces-cerevisiae-Hefestamm, dessen eigene spezifische Kaliumionentranslokations-Systeme selektiv deletiert oder disruptiert sind;
(2) eine bevorzugte Ausführungsform des modifizierten S.-cerevisae- Hefestammes von (1) ist ein modifizierter Hefestamm, in den weiterhin eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die für einen heterologen Kaliumionen-Kanal oder für ein funktionelles Derivat oder eine Mutation desselben kodieren, stabil in das Hefegenom integriert sind und exprimiert werden;
(3) eine bevorzugte Ausführungsform des modifizierten S.-cerewsae-Hefestam- mes von (1) ist ein modifizierter Hefestamm, in dem weiterhin selektiv nur eine funktionelle heterologe Nukleinsäuresequenz an einen singulären Locus stabil in das Hefegenom integriert ist; (4) ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Saccharomyces cerevisiae Hefestamms, wie in (2) definiert, umfassend Transformation eines Ausgangshefestammes oder eines Hefestammes, wie in (1) definiert, mit einem Integrationsvektor, der eine Nukleinsäuresequenz, die für den Kaliumionen-Kanal kodiert, umfasst;
(5) ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des Säuger-Kaliumionen-Kanals, umfassend: a) die Behandlung eines Saccharomyces cerevisiae Hefestamms, wie in (2) oder (3) definiert, mit Testsubstanzen, b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz, c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumionentransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz;
(6) die Verwendung eines SaccΛaromyces-cerew's/ae-Hefestamms, wie in (1) bis (3) definiert, als Wirtsorganismus zur homologen oder heterologen Expression von Kaliumionen-Kanälen;
(7) ein Verfahren zur gerichteten singulären Integration einer funktionelllen he- terolgen Nukleinsäuresequenz in einen singulären Genlocus des Saccharomyces- cerew's/'ae-Hefegenoms, umfassend die Transformation eines Ausgangshefestammes mit einem Integrationsvektor, der ein Nukleinsäurekonstrukt aus der zu integrierenden funktionellen Nukleinsäuresequenz und einem in S. cerevisiae wirksamen Promotor, das von Nukelinsäuresequenzen flankiert ist, die zu dem singulären Genlocus in S. cerevisiae homolog sind, umfasst; und
(8) einen Integrationsvektor, wie in (7) definiert.
Figurenbeschreibung
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der genomischen Fragmente, die die Saccharomyces cerevisiae Wildtyp TRK1, TRK2 und TOKl Loci enthalten sowie die entsprechenden mutierten Allele trkl::Δ51lox-kanMX, trk2Δ50: :lox-kanMX und toklΔl::lox-kanMX (zur Verdeutlichung ist das kanR Gen nicht maßstabsgerecht dargestellt, die Größe diese Gens beträgt 1.0 kb). Die TRK1, TRK2 und TOKl kodierenden Regionen sind durch schwarze Balken gekennzeichnet. Die mutanten Allele wurden zum Ersatz der entsprechenden Wildtyp Loci in Saccha- romyces cerevisiae Stämme transformiert. Die zur Konstruktion der mutierten Allele verwendeten Oligonukleotide TRKl-sense (SEQ ID NO: l), TRKl-antisense (SEQ ID NO:2), TRK2-sense (SEQ ID NO:3), TRK2-antisense (SEQ ID NO:4), TOKl-sense (SEQ ID NO:5) und TOKl-antisense (SEQ ID NO:6) sind als gefüllte Pfeile dargestellt.
Fig. 2 zeigt eine Auflistung der verwendeten Primer; * Positionsnummern beziehen sich auf entweder 5' stromaufwärts (-) vom START Codon oder 3 stromabwärts zum STOP Codon. Die unterstrichenen Sequenzen entsprechen den Amino- glycosid Phosphotransferase Sequenzen in Plasmid pUG6 (beschrieben in Güldener, U., et al., Nucleic Acid Research 24:2519-2524 (1996)).
Fig. 3 ist eine Liste der konstruierten Saccharomyces cerevisiae Stämme.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmidkonstruktes p679-pmal- HERG, welches zur Expression des humanen erg Kaliumionen-Kanals verwendet wurde. Die pmal (Saccharomyces cerevisiae Plasmamembran ATPase) Promotorsequenz und die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) sind als gefüllte Pfeile dargestellt. Das Plasmidkonstrukt weist die folgenden funktionellen Bereiche auf: Amp (Start: 1268; Ende: 2125 (Komplement)); HIS3 (Start: 2709; Ende: 3371); fl (+) (Start: 3585; Ende: 4041 (Komplement)); lacZ (Start: 4043; Ende: 4231 (Komplement)); Ieu2 5' (Integrationssequenz) (Start: 4242; Ende: 4719 (Komplement)); Leu2 3' (Integrationssequenz) (Start: 4728; Ende: 5347 (Komplement)); pmal- Promotor (Start: 5378; Ende: 6316); HERG (codierender Bereich) (Start: 6326; Ende: 9802); Linearisierung (Notl) (Start: 4720 ; Ende: 4727); lacZ Promotor (Start: 109; Ende: 231 (Komplement)); ColEl (Start: 325; Ende: 1205). Die Nukleinsäuresequenz des Plasmids ist in SEQ ID NO:28 gezeigt.
Fig. 5B zeigt das S. cerevisiae chromosome X Gen (5729 bp), das TRK1 umfasst (ACCESSION-Nr. Z49404 Y13136; Submitted (25-SEP-1995) vom Max-Planck- Institut für Biochemie, Am Klopferspitz 18a D-82152 Martinsried; CDS comple- ment (1232..4939); SEQ ID NO: 11). Das TRKl-Protein ist in Fig. 5A gezeigt (SEQ ID NO: 12). Fig. 6B zeigt das S. cerevisiae TRK2 Gen (Accession-No. M65215; Mol. Cell. Biol. 11, 4266-4273 (1991); CDS 920..3589; SEQ ID NO: 13). Das TRK2- Protein ist in Fig. 6A gezeigt (SEQ ID NO: 14).
Fig. 7B zeigt das Saccharomyces cerevisiae "outward-rectifier potassium Channel Toklp" (TOKl) gene (Accession-No. U28005; Yeast 10 (7), 965-973 (1994); Submitted (30-May-1995) Karen A. Ketchum, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University, 295 Congress Avenue, New Haven, CT 06536-0812, USA; CDS 30..2105; SEQ ID NO: 15). Das Tokl-Protein ist in Fig. 7A gezeigt (SEQ ID NO: 16).
Fig 8A zeigt das humane "putative potassium Channel subunit" (HERG) Gen (Accession-No. U04270; Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994); submitted (09-Dec- 1993) Jeffrey W. Warmke, Genetics and Molecular Biology, Merch Search Laboratories, 126 East Lincoln Avenue, P.O. Box 2000, Rahway, NJ 07065, USA; CDS 184..3663; SEQ ID NO: 17) Das HERG-Protein ist in Fig 8B gezeigt (SEQ ID NO: 18).
Fig. 9 zeigt die Ergebnisse der "Reverse-Transcription"-Polymerasekettenreaktion von Beispiel 4.2 (A: RNA; 2. Klon 5, 3. Klon 6, 4. Klon 7; 5. Klon 8; 6. Klon 10 und B: 1. Marker; 2. Kon 5; 3. Klon 6; 4. Klon 7; 5. Klon 8; 6. Klon 10; 7. RNA- Kontrolle, 8. Konstruktkontrolle, 9. Wasserkontrolle).
Fig. 10 zeigt das Wachstum der isolierten trkltrk2tokl Saccharomyces cerevisiae Dreifach-Mutante mit defektem Kaliumionentransport in Abhängigkeit von der Kaliumionenkonzentration im Kulturmedium.
Fig. 11 zeigt den Vektor p77-TOK-pmal(7429 bp). Die exakte DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO:27 gezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In dem modifizierten Saccharomyces-cerevisiae- Hefestamm nach Ausführungsform (1) der Erfindung sind vorzugsweise alle Kaliumionentranslokationsgene einschließlich TRKl, TRK2 und TOKl deletiert oder disrupiert. Der Hefestamm ist vorzugsweise ein trkl+trk2+tokl -Mutant. Zum Erhalt des trkltrk2tokl dreifach- mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestammes werden die Gene für beide Kaliumtransportproteine (TRKl, TRK2) und das Gen für den Kaliumionen-Kanal (TOKl) durch Einführung eines oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophie und/oder Resistenzen) deletiert und/oder disruptiert.
Die selektierbaren biosynthetischen Markergene (Auxotrophiebedürfnisse und/oder Resistenzen) können durch rekombinante DNS-Techniken in die Loci der Wildtyp Kaliumtransportergene eingeführt werden. Geeignete selektierbare Marker sind z.B. die Auxotrophiemarker URA3 und LEU2 oder Gene, die eine Resistenz z.B. gegen G418 (Aminoglycosid Phosphotransferase Gen) bewirken. Solche modifizierten Allele können dann in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden, wo sie durch homologe Rekombination die Wildtyp Loci ersetzen. Die Stämme mit modifizierten Allele können durch Selektion auf den oder die biosynthetischen Marker ermittelt werden.
Die in die Loci der Kaliumtranslokations-Systeme eingeführten selektierbaren biosynthetischen Marker stellen außerdem einen einfachen Weg zum Transfer dieser Mutationen in genetisch andere Linien dar (Kreuzung). Ein Stamm, der eine Mutation in einem der Kaliumtranslokationsgene (z.B. TRKl oder TRK2 oder TOKl) beinhaltet, kann mit einem Stamm des entgegengesetzten Paarungstyps, der eine Mutation in einem anderen Kaliumtranslokationsgen (z.B. TRK2 oder TRKl oder TOKl) trägt, zu Diploiden gekreuzt werden. Durch anschließende Sporulation zu Haploiden (Tetradenanalyse) kann die isogene Nachkommenschaft dann auf die Anwesenheit der biosynthetischen Marker hin selektiert werden. Der trkltrk2tokl dreifach-mutante Saccharomyces cerevisiae Phänotyp kann durch Wachstumstests auf selektiven Kulturmedien mit Kaliumkonzentrationen von 10 mM oder weniger ermittelt werden.
Ein erfindungsgemäßer Hefestamm gemäß Ausführungsformen (1) bis (3) kann durch einen Test ermittelt werden, bei dem analysiert wird, ob das zu prüfende exprimierte Kaliumionen-Kanal-Gen den trkltrk2tokl dreifach-mutanten Saccharomyces cerevisiae Phänotyp funktioneil komplementiert. Die modifizierten Hefestämme der Ausführungsform (2) und (3) werden dadurch erhalten, daß der erfindungsgemäße Saccharomyces cerevisiae Hefestamm mit einer rekombinanten DNS transformiert wird, welche das Gen des zu exprimie- renden Kaliumionen-Kanals bzw. der zu exprimierenden funktionellen heterologen Nukleinsäuresequenz (die ebenfalls für einen heterologen Kaliumionen-Kanal kodieren kann) enthält. "Heterologe Kaliumionen-Kanäle" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind solche Kaliumionen-Kanäle, die nicht von S. cerevisiae stammen. Bevorzugt dabei ist, dass der heterologe Kaliumionen-Kanal (i) ein Säuger-Kaliumionen-Kanal, insbesondere ein humaner Kaliumionen-Kanal oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutation desselben ist, und/oder (ii) ein Kaliumionen-Kanal ist, der die Kaliumionenaufnahme vermittelt, ein einwärtsgerichteter (K|r) oder spannungsabhängiger (Kv) Kaliumionen-Kanal ist, oder ein Doppelporenkanal ist oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutation derselben, wobei der humane erg-Kaliumionen-Kanal (HERG) oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutation desselben besonders bevorzugt ist.
Der Hefestamm gemäß Ausführungsform (3) der Erfindung wird durch gerichtete Integration mittels eines Integrationsvektors in einen singulären Genlocus erhältlich ist, wobei der Integrationsvektor ein Nukleinsäurekonstrukt aus der funktionellen Nukleinsäuresequenz und einem in Saccharomyces cerevisiae wirksamen Promotor, das von in Nukleinsäuresequenzen flankiert ist, die zu dem singulären Genlocus S. cerevisiae homolog sind, umfasst.
In einer bevorzten Ausführungsform kodiert die funktionelle Nukleinsäure für den HERG-Kaliumionen-Kanal, wobei besonders bevorzugt ist, wenn HERG am Lokus einer der Kaliumionentranslokationssysteme, insbesondere am TOKl-Lokus des Hefegenoms integriert ist.
Gemäß Ausführungsform (7) der Erfindung ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Konstruktion und Transformation eines Saccharomyces-cerevisiae-Hefe- stammes mit einer rekombinanten DNS, die die gezielte Integration in einen singulären Genlocus des Hefegenoms ermöglicht. Durch Transformation einer sol- chen rekombinanten DNS wird ein transgener Hefestamm erhalten, in dem die Fremd-DNS stabil in das Hefegenom integriert ist, mit der chromosomalen Erbinformation vermehrt und dadurch kontinuierlich an die Nachkommenschaft weitergegeben wird. Der Saccharomyces cerevisiae Wildtypphänotyp kann durch Auswahl derjenigen Stämme, welche nach Transformation, Selektion und nach Anzucht unter Bedingungen von 10 mg/1 Kaliumionen im Kulturmedium wachsen, ermittelt werden. Dazu wird der zu prüfende Stamm durch Wachstumstests auf selektiven Kulturmedien mit Kaliumionenkonzentrationen von 10 mM oder weniger inkubiert.
Der Integrationsvektor (8), der für das Verfahren gemäß Ausführungsform (7) einsetzbar ist, umfasst ein Nukleinsäurekonstrukt (DNA, RNA usw.) aus der zu integrierenden funktionelle Nukleinsäuresequenz und einem in S. cerevisiae wirksamen Promotor, das von Nukelinsäuresequenzen flankiert ist, die zu dem singulären Genlocus in S. cerevisiae homolog sind. Zwar sind Integrationsvektoren, die die Integration in spezifischen Loci des Hefesystems vermitteln, bekannt, z. B. p679 und Derivate (Doheny, K. F. et al., Cell, 73(4) :761-774 (1993)). Diese Vektoren wurden jedoch zumeist konstruiert, als nur ein Teil des Hefegenoms bekannt war (vor 1996). So existieren viele Bereiche, die den flankierenden Regionen des LEU2-Gens sehr ähnlich sind (sogenannte repetitive, also sich wiederholende Sequenzen), die als "targeting", also als Zielregion, beispielsweise von p679 (Doheny, K. F. et al., ibidem) genutzt werden. Der in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Vektor zeichnet sich dadurch aus, dass die Integration in einen genau definierten Bereich des Genoms erfolgt, der kaum Homologien zu anderen Loci aufweist.
"Zu integrierende Nukleinsäuresequenz" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle heterologen, d. h. nicht aus S. cerevisiae stammenden, funktionellen Nukleinsäuresequenzen, die in S. cerevisiae exprimierbar sind. Die heterologen Nukleinsäuresequenzen können dabei von Säugern (einschließlich vom Menschen), Pflanzen, aber auch von anderen Mikroorganismen stammen. Besonders bevorzugt ist, dass die funktionelle Nukleinsäuresequenz einen Kaliumionen-Kanal kodiert (wie in Ausführungsform (3) der Erfindung), dies soll jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung verstanden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
(i) haben die homologen Sequenzen eine Länge von 40 bis 1000 Nukleotiden, vorzugsweise von wenigstens 80 Nukleotiden und/oder
(ii) der Promotor ist ausgewählt aus natürlichen Promotoren von Saccharomyces cerevisiae und insbesondere der pmal-Promotor, und/oder (iii) die funktionelle Nukleinsäuresequenz kodiert für einen der vorstehend definierten Kaliumionen-Kanäle.
Als Promotoren sind neben dem pmal-Promotor alle natürlichen Promotoren von S. cerevisiae einsetzbar wie PGK, Phophoglyceratkinase, ADH, Alkoholdehydro- genase, G t-J-Galaktosepermease, CUP1 -Kupferpermease usw. und heterologe Promotoren, die eine hinreichende Expressionsrate in S. cerevisiae aufweisen wie CMVL (Cytomegalovirus) usw. Besonders bevorzugt ist jedoch der pmal-Promotor. Neben der zu ingegrierenden funiktionellen Nukleinsäuresequenz und dem Promotor kann das Nukleinsäurekonstrukt des Integrationsvektors noch weitere funktionelle Sequenzen wie Marker, Leadersequenzen usw. enthalten. In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens (7) ist der singuläre Genlocus der TOKl-Locus und die flankierenden Sequenzen sind aus der Region pretok 3130 bis 3599 von SEQ ID NO:27 (entsprechend der Position -1 bis -449, bezogen auf die kodierende TÖ d-Sequenze) und posttok 3608 bis 4156 (complement) von SEQ ID NO: 27 (entsprechend de Position 2075 bis 2604, bezogen auf die kodierende TOKl -Sequenz) ausgewählt sind.
Der Wachstumsdefekt des trkltrk2tokl dreifach-mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestamms kann zur Isolierung und Anreicherung von Kaliumionen-Kanalgenen aus Genbibliotheken (z. B. humane cDNS Bibliotheken) verwendet werden, wenn die exprimierten Gene die Mutationen in dem dreifach-mutanten Hefestamm komplementieren und ein Wildtypphänotyp hinsichtlich der benötigten Kaliumionenkonzentration resultiert. Damit können Kaliumionen-Kanäle identifiziert werden, die zwar physiologisch beschrieben, aber bisher noch nicht isoliert wurden oder die als vermutete Kaliumionen-Kanäle aus Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzdatenbanken vorhergesagt werden. Alternativ können verschiedene Kaliumionen-Kanäle in die Dreifach-Mutante eingeführt werden, um zu tes- ten, ob der Wachstumsdefekt auf Kaliumionen limitierten Medien komplementiert wird.
Jede dieser Anwendungen resultiert in einem Hefestamm, der heterolog einen fremden Kaliumionen-Kanal stabil exprimiert und zur Durchmusterung von Modulatoren des betreffenden Kaliumionen-Kanals verwendet werden kann. Ein Hefestamm, der heterolog einen fremden Kaliumionen-Kanal exprimiert, kann in einfachen Verfahren zur Durchmusterung verschiedener Testsubstanz-Bibliotheken (chemische und natürliche Substanz Bibliotheken) verwendet werden. Diese einfachen Verfahren, in denen Wachstumsveränderungen oder gesteigerte und/oder verminderte Kaliumionenaufnahme durch Agarplattentests und/oder in Flüssigkultur beobachtet werden kann, können somit spezifisch wirksame Substanzen detektieren, die die Kaliumionen-Kanal Funktion modulieren.
Zur Durchmusterung auf Aktivatoren einer Kaliumionen-Kanal Funktion kann das Durchmusterungsverfahren solche Veränderungen wie metabolische Aktivität, gesteigerte Wachstumsrate oder gesteigerte Aufnahme von Kaliumionen beinhalten.
Zur Durchmusterung auf Inhibitoren einer Kaliumionen-Kanal Funktion kann das Durchmusterungsverfahren solche Veränderungen wie verminderte Wachstumsrate oder verminderte Kaliumionen Aufnahme beinhalten.
Die Testsubstanzen, die verfahrensmäßig zur Detektion spezifischer Modulatoren eingesetzt werden, können z.B. synthetische oder natürliche Produkte sein. Natürliche Produkte beinhalten pflanzliche, tierische oder mikrobielle Extrakte.
Gemäß Ausführungsform (5) der Erfindung betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des exprimierten Kaliumionen-Kanals einschließlich des HERG-Kaliumionen-Kanals, wobei a) ein Saccftaromyces-cere s/ae-Hefestamm, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG), aber nicht die der Hefe eigenen Kaliumtranslokations-Systeme TRKl, TRK2 und TOKl exprimiert, mit Testsub stanzen behandelt wird, b) das Wachstum in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz bestimmt wird und c) der Anstieg oder die Abnahme des Kaliumionentransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz gemessen wird.
Dieses Verfahren ist zur Identifizierung spezifischer Modulatoren des HERG Ionenkanals geeignet. Insbesondere ist das Verfahren zur Detektion von (i) anti-arrythmischen Substanzen, (ii) anti-fibrillatorischen Substanzen oder (iii) anti-entzündlichen Substanzen geeignet ist.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, schränken sie jedoch nicht ein.
Beispiele
Allgemeine Methoden
Rekombinante DNA Technik: Zur Anreicherung und Manipulation von DNS wurden Standardmethoden benutzt, wie sie bei Sambrook, J. et al., Cold Spring Har- bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben sind. Die verwendeten molekularbiologischen Reagenzien wurden nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.
Hefetransformation : Saccharomyces cerevisiae Stämme wurden entsprechend der Lithium-Acetat Methode, wie sie von Rothstein, R. (1991) in Methods in En- zymology 194: 281-302, beschrieben sind, transformiert.
Hefegenetische Methoden: Saccharomyces cerevisiae Stämme wurden entsprechend der bei Sherman, F. et al., Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981) beschriebenen Methode gekreuzt und diploide Stämme durch Mikromanipulation isoliert. Beispiel 1: Isolierung des isoqenen Saccharomyces cerevisiae Hefestammes mit defektem Kaliumionentransport
1.1 Einführung der biosynthetischen Marker
Prinzip: Zum Erhalt der spezifischen Gendisruptionen wurde die Technik der flankierenden Homologien-PCR ("Polymerase Chain Reaction") angewendet, in der die kodierende Region (offener Leserahmen) eines Gens durch die Nukleinsäuresequenz für die Aminoglycosid Phosphotransferase (lox-kanMX-lox; kanR Resistenzmarker) ersetzt wird, die eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Geneticin (G418, Kanamycinsulfat) vermittelt (Güldener, U. et al., Nucleic Acid Research 24:2519-2524 (1996)).
Ein Saccharomyces cerevisiae Hefestamm JRY379 (Reid, J. D. et al., Receptors and Channels 4:51-61 (1996)), wurde im ersten Schritt mit dem Plasmid pGAL- HO (Rothstein, R., in Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, C. Gutie und G. R. Fink (eds.) pp. 281 - 302 Academic Press (1991)), zum Erhalt des entgegengesetzten Paarungstyps im resultierenden Stamm HLY38 (siehe auch Fig. 3) transformiert.
Durch "polymerase chain reaction" (PCR)-Technik wurde das Strukturgen der Aminoglycosid Phosphotransferase im Plasmid pUG6, (kanR, Güldener, U.et al., Nucleic Acid Research 24:2519-2524 (1996)) mit Oligonukleotid-Primern, die jeweils 20-22 homologe Basen zur Sequenz des Aminoglycosid Phosphotransferase Gens (kanR) im Plasmid pUG6, und anschließende 40 flankierende Basen zu den 5' stromaufwärts des START Codons und 3' stromabwärts des STOP Codons gelegenen Regionen der zu disruptierenden Gene TRKl, TRK2 und TOKl beinhalten, amplifϊziert. Unter Verwendung der Oligonukleotidpaare (siehe auch Fig. 2), TRKl-sense: 5X GAA GGA GGG TAT TCT ATT GGC TCT CAA GGA AGT CAT TCC TGC TGA AGC TTC GTA CGC TGC 3Λ (SEQ ID NO: l) und
TRKl-antisense 5 ACG TAG GCA AAT GTA TAT CAC AAT GTT ACT AAT CAA GGT TGC ATA GGC CAC TAG TGG ATC TG X (SEQ ID NO: 2); TRK2-sense: 5λ CCC CTC GGC CGT GCG GCT GAA AAA GAG AAA TGA TAT TGG AGC TGA AGC TTC GTA CGC TGC 3λ (SEQ ID N0:3) und
TRK2-antisense: 5λ AAT TAC GTT GGC TCT TAT GTA GGT AAA GAG GGG TAA ACT TGC ATA GGC CAC TAG TGG ATC TG 3Λ (SEQ ID NO: 4); und
TOKl-sense: 5λ GGT TCC GGG ACG AAA GAG TTA GTA TTA TTA ATG CCA GCT GAA GCT TCG TAC GC 3Λ (SEQ ID NO: 5) und
TOKl-antisense: 5λ AGC TCT TCG TCT TCT ACT AGA TTA CCA ACT AAG CAT AGG CCA CTA GTG GAT CTG 3Λ (SEQ ID NO: 6).
und dem Plasmid pUG6 als Matrizen-DNS wurden die entsprechenden Disrup- tionskonstrukte trklΔ51 ::lox-kanMX-lox, trk2Δ50;: lox-kanMX-lox und toklΔ50: :lox-kanMX-lox generiert (siehe Figur 1). Diese drei Deletionskassetten enthalten das Aminoglycosid Phosphotransferase Strukturgen, beidseitig flankiert von den 34 Basenpaare langen loxP "direct repeats" und flankiert von ca. 40 homologen Basenpaaren zu den 5' stromaufwärts des START Codons und 3' stromabwärts des STOP Codons gelegenen Regionen der zu disruptierenden Gene TRKl, TRK2 und TOKl (Fig. 1).
1.2 Selektion von Mutanten auf G418 Resistenz
Der Stamm JRY379 (Reid, J. D., Receptors and Channels 4: 51-61 (1996)) wurde separat mit jeder der PCR generierten Deletionskassetten transformiert und transformierte Hefekolonien auf Kulturmedien mit dem Antibiotikum G418 (200 μg/ml, Kanamycinsulfat) selektioniert (Güldener, U., Nucleic Acid Research 24:2519-2524 (1996)).
Die Hefestämme HLY39 und HLY40 (siehe auch Fig. 3) haben die vollständigen kodierenden Regionen der Gene TRKl, TRK2 durch das lox-kanMX-lox Modul (Aminoglycosid Phosphotransferase Gen; kan ) ersetzt (siehe auch Fig. 5A, 5B für TRKl und 6A, 6B für TRKl).
In dem Hefestamm HLY41 (siehe auch Fig. 3) ist das TOKl Gen nicht vollständig durch das lox-kanMX-lox Modul (Aminoglycosid Phosphotransferase Gen; kanR) ersetzt: von der kodierenden Region verbleiben nach Disruption 223 Nukleotide der 5' kodierenden Region und 88 Nukleotide der 3' kodierenden Sequenz (siehe auch Fig. 7A und 7B).
Aus G418 resistenten Kolonien wurde genomische DNS nach Standardmethoden (Rothstein, 1991) isoliert.
1.3 Charakterisierung der positiven Stämme durch PCR
Die korrekte Integration der trklΔ51 :: lox-kanMX-lox, trk2Δ50: : lox-kanMX-lox und toklΔΞO: : lox-kanMX-lox Deletionskassetten am jeweiligen chromosomalen TRKl , TRK2 und TOKl Locus der Hefestämme HLY39, HLY40 und HLY41 wurde mit PCR Reaktionen nachgewiesen. Als Matrize wurde die jeweils aus den Hefestämmen HLY39, HLY40 und HLY41 isolierte genomische DNS eingesetzt sowie die Oligonukleotide (siehe auch Fig. 2)
TRK1-START: 5λ CGT TCG GGG CTG ACA ACG CA3λ (SEQ ID NO: 7), TRK2-START: 5Λ CCC GTC CAT TGA GTG CCC GT 3λ (SEQ ID NO. -8), und
TOK1-START: 5λ CGC ATT CGC GTC TCG TTA CC 3λ (SEQ ID NO: 9) als 5' sense Startmoleküle gegen das 3' antisense Startmolekül KAN-antisense: 5λ CCT CAG TGG CAA ATC CTA AC T (SEQ ID NO: 10), welches 358 Basenpaare innerhalb der für die Aminoglycosid Phosphotransferase kodierenden Region (kan , lox-kanMX-lox Modul) in Plasmid pUG6 liegt. Ergebnis: Die Hefestämme HLY39, HLY40 und HLY41 enthalten die trklΔδlr. lox- kanMX-lox, trk2Δ50: : lox-kanMX-lox und toklΔSO: : lox-kanMX-lox Module am korrekten chromosomalen Locus der entsprechenden Gene TRKl, TRK2 und TOKl .
1.4 Excision des biosynthetischen Marker Gens für G418 Resistenz
Die isolierten Stämme HLY39 (trklΔSl:: lox-kanMX-lox), HLY40 (trk2Δ50:: lox- kanMX-lox) und HLY41 (toklΔΞO: : lox-kanMX-lox) (Fig. 3) wurden separat mit dem Plasmid pSH47, welches die Nukleinsäuresequenz für die Cre-/oxP Rekombi- nase unter Kontrolle des GAL1 Promotors enthält (Güldener, U., Nucleic Acid Research 24:2519-2524 (1996)), transformiert. Transformierte Hefekolonien wurden auf Kulturmedien mit Galaktose zur Induktion des Promotors für die Cre-/oxP Rekombinase angezogen und aus Einzelzellen stammende Kolonien mit Sensiti- vität gegenüber G418 (Kanamycinsulfat) isoliert. In diesen Hefestämmen war die lox-kanMX-lox Kassette durch die Aktivität der pSH47 Plasmid kodierten Cre-/o P Rekombinase jeweils spezifisch ausgeschnitten.
1.5 Isolierung von nicht-plasmid haltiqen Mutanten
Um das Plasmid pSH47 aus diesen Hefestämmen zu entfernen, wurden die G418 sensitiven Hefestämme auf Kulturmedien mit 5-Fluoro-Orotinsäure (5FOA), wie beschrieben in Rothstein, R. (1991), angezogen. 5FOA resistente, aus Einzellen stammende Kolonien wurden isoliert und angezogen, die isolierten Hefestämme (siehe auch Fig. 3) HLY42 (trklΔ51), HLY43 (trk2Δ50) und HLY44 (toklΔSO) beinhalten die unmarkierten Mutationen. In Figur 5 ist die abgeleitete Amino¬ säure- (SEQ ID NO: ll; 5A) und die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 12; 5B) des Saccharomyces cerevisiae Kaliumionentransportproteins TRKl dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobenen Regionen entsprechen der deletierten Sequenz. In der Nukleinsäuresequenz sind die START und STOP Codons durch Fettdruck und die verwendeten Oligonukleotide durch Kursivdruck angezeigt. In Figur 6 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ ID NO: 13; 6A) und die Nukleinsäu- re- sequenz (SEQ ID NO: 14; 6B) des Saccharomyces cerevisiae Kaliumionentransportproteins TRK2 dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobenen Regionen entsprechen der deletierten Sequenz. In der Nukleinsäuresequenz sind die START und STOP Codons durch Fettdruck und die verwendeten Oligonukleotide durch Kursivdruck angezeigt. In Figur 7 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ ID NO: 15; 7A) und die Nukleinsäure- sequenz (SEQ ID NO: 16; 7B) des Saccharomyces cerevisiae Kaliumionenionen-Kanalproteins TOKl dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobenen Regionen entsprechen der deletierten Sequenz. In der Nukleinsäuresequenz sind die START und STOP Codons durch Fettdruck und die verwendeten Oligonukleotide durch Kursivdruck angezeigt.
1.6 Isolierung der Kaliumionentransport defekten Dreifach-Mutante
Zur Isolierung des trkltrk2tokl dreifach-mutanten Saccharomyces cerevisiae Stammes und parallelem Erhalt der durch Transformation komplementierbaren Auxotrophien wurden die konstruierten Hefestämme entsprechend der bei Sher- man, F. et al. (Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1981) beschriebenen Methode gekreuzt. Anschließend wurden die diploiden Stämme sporuliert und Segreganten mit den gewünschten Kaliumionentransportdefekten durch Mikromanipulation isoliert.
Dazu wurde der Stamm HLY38 (MATa his3-Δ200 Ieu2-3,112 trpl-Δ901 ura3-52 suc2-Δ9) und der Stamm HLY42 (MATa his3-Δ200 Ieu2-3,112 trpl-Δ901 ura3-52 suc2-Δ9 trklΔ51) gekreuzt, der resultierende diploide Stamm sporuliert und Tetraden auf Kulturmedien mit 50 mM KCI vereinzelt. Da das TRKl Gen für den hoch-affinen Kaliumionentransporter in S. cerevisiae kodiert, sollte der trkl mut- ante Hefestamm ein Wachstumsbedürfnis für Kaliumionen haben. Das eingekreuzte mutante trklΔSl Allel segregierte wie erwartet 2+:2-, wobei trkl mut- ante Hefestämme aufgrund des schlechten Wachstums auf Kulturmedien mit nur 100 μM Kaliumionen überprüft wurden.
Ein aus den resultierenden trklΔ51 Sporen angezogener Hefestamm (HLY45) mit MATα Paarungstyp wurde mit dem Stamm HLY43 (MATa his3-Δ200 Ieu2-3,112 trpl-Δ901 ura3-52 suc2-Δ9 trk2Δ50) gekreuzt, der diploide Stamm sporuliert und Tetraden auf Kulturmedien mit 50 mM KCI vereinzelt. Der diploide Hefestamm mit jeweils einem nicht mutiertem Allel der Kaliumionentransporter TRKl und TRK2 wuchs auf allen getesteten Medien. Dieses Wachstum wurde zur Überprüfung der rezessiven Mutationen eingesetzt. Rezessive Mutationen sind für die Komplementation mit heterologen Genen notwendig. Nach Sporulation und Tetradenanalyse zum Erhalt der Haploiden segregierte der für Kaliumionenaufnahme defekte Phänotyp wie erwartet für zwei nicht verbundene Gene. Drei Phä- notypen wurden in Bezug auf Kaliumionenbedüfnisse aus dieser Kreuzung entsprechend der vier Genotypen erwartet und beobachtet: Wildtyp ohne Defekt in den TRKl, TRK2 Allelen, trklTRK2 Mutante mit schlechtem Wachstum auf lOOμM Kaliumionen, trk2TRKl Mutante mit gleichem Phänotyp und trkltrk2 Mutante mit sehr schlechtem Wachstum auf lOOμM Kaliumionen. Der trkltrk2 Phänotyp konnte durch Wachstum auf Kulturmedien mit lOmM Kaliumionen unterdückt werden.
Ein trkltrk2 doppelt mutanter Hefestamm HLY46 (trklΔ51 trk2Δ50) mit MATα Paarungstyp wurde aus einer der resultierenden Sporen angezogen und mit dem Stamm HLY44 (MATa his3-Δ200 Ieu2-3,112 trpl-Δ901 ura3-52 suc2-Δ9 toklΔ50) gekreuzt, der diploide Stamm sporuliert und Tetraden auf Kulturmedien mit 50 mM KCI vereinzelt. Der diploide Hefestamm mit jeweils einem nicht mutiertem Allel der Kaliumionentransporter TRKl, TRK2 und TOKl wuchs auf allen getesteten Medien. Dieses Wachstum wurde zur Überprüfung der rezessiven Mutationen eingesetzt. Rezessive Mutationen sind für die Komplementation mit heterologen Genen notwendig. Nach Sporulation und Tetradenanalyse zum Erhalt der Haploiden segregierten die drei Deletions-Allele 2+ :2-. Wie erwartet wurde ein Verbund von trklΔ51 und toklΔSO beobachtet: diese Gene liegen ca. 26 cM voneinander entfernt auf Chromosom X (46 parentaler Dityp, 1 nicht parentaler Dityp und 48 Tetratypen). In dem trkltrk2tokl dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestamm HLY47 (trklΔ51 trk2Δ50 toklΔ50) sind alle bisher beschriebenen hefeeigenen Transport- und Kanalproteine TRKl, TRK2 und TOKl spezifisch deletiert (siehe auch Fig. 3). Der Phänotyp dieses Stammes ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Wachstum nur auf Kulturmedien mit mindestens 50mM Kaliumionen erfolgt.
Beispiel 2: Konstruktion eines Plasmids zur gezielten, singulären Integration von Fremdqenen in das S.-cerews/ae-Genom und zur Expression dieser Fremdgene in S. cerevisiae
2.1 Konstruktion des p77-tok-pmal Plasmids
Zur Konstruktion der tokl/pmal Integrationskassette für beliebige, gewünschte humane Zielgene in den singulären TOKl Locus des Saccharomyces cerevisiae Hefegenoms wurde zunächst aus dem Saccharomyces cerevisiae Wildstamm S288C (ATCC, USA) genomische DNA mit Standardmethoden isoliert. 1 μg dieser chromosomalen DNA wurden für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit DNA- Polymerase aus Thermophilus aquaticus und den folgenden Oligonukleotidpri- mern zur Amplifikation der 5' nicht-kodierenden Region des S. cerevisiae TOKl Gens (cDNA Genbank Accession U28005, 2233 bp, deponiert 30.05.1995; Chromosom X, komplette chromosomale Sequenz NC_001142, 745444 bp, DNA, Ge- neID:YJL093C, Leserahmen YJL093C complement 254433..256508) eingesetzt: Oligonukleotid pretok_sense: 5λ G G GCGGCC GCCTGCAAAT TTATCGAGAC TCTG 3' (SEQ ID NO: 21), Position -470 bis -449 bezogen auf die kodierende TOKl Sequenz, wobei die aus klonierungstechnischen Gründen angefügten Nukleotide kursiv dargestellt sind und die zum Erhalt einer Not I Schnittstelle eingefügten Nukleotide unterstrichen sind.
Oligonukleotid pretok_antisense:
5λ G G GAGCTC ATATATAGAA ATCGGTAAAA TAAATAC 3' (SEQ ID NO:22),
Position -1 bis -27 bezogen auf die kodierende TOKl Sequenz, wobei die aus klonierungstechnischen Gründen angefügten Nukleotide kursiv dargestellt sind und die zum Erhalt einer Sac I Schnittstelle eingefügten Nukleotide unterstrichen sind.
Die durch die PCR amplifizierte DNA wurde als 0,47 kb Fragment durch Agarose- gelektrophorese aufgetrennt und aus der Gelmatrix isoliert. Diese DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen Not I und Sac I gespalten, durch Agarosegelek- trophorese aufgetrennt und aus der Gelmatrix isoliert. Der Plasmidvektor p774 (Connelly and Heiter (1996) Cell 86, 275-285; 6,59 kb) wurde ebenfalls mit den Restriktionsendonukleasen Not I und Sac I gespalten, die Produkte durch Agaro- segelektrophorese aufgetrennt und das 6,1 kb Fragment aus der Gelmatrix isoliert. Die so erhaltenen DNA Fragmente wurden ligiert. Nach Transformation in Bakterien (E. coli XLl-Blue, Stratagene) und Inkubation bei 37° C auf LB-Amp Agarplatten (Luria-Bertani-Medium, lOOμg/ml Ampicillin, [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). In: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) wurden die erhaltenen Kolonien analysiert. Durch eine Restriktionskartierung isolierter Plasmid DNA und Auftrennung im Agarosegel wurde das 0,47 kb p77-pretok Fragment in p774 (6,58 kb) bestätigt.
Zur weiteren Konstruktion der tokl/pmal Integrationskassette für beliebige, gewünschte Zielgene in den singulären TOKl Locus des Saccharomyces cerevisiae Hefegenoms wurden 1 μg isolierte, chromosomale DNA in einer Polymerase-Ket- tenreaktion (PCR) mit DNA-Polymerase aus Thermophilus aquaticus und den folgenden Oligonukleotidprimern zur Amplifikation der 3' nicht-kodierenden Region des S. cerevisiae TOKl Gens eingesetzt: Oligonukleotid posttok-antisense: 5λ G G GCGGCC GCCGGGATCG ATGATGTAGG G 3' (SEQ ID NO: 23),
Position 2624 bis 2604 bezogen auf die kodierende TOKl Sequenz, wobei die aus klonierungstechnischen Gründen angefügten Nukleotide kursiv dargestellt sind und die zum Erhalt einer Not I Schnittstelle eingefügten Nukleotide unterstrichen sind.
Oligonukleotid posttok-sense:
5λ G G ACTAGT GCTAGCTGAT ATACAAACAC CCGAAGC 3' (SEQ ID NO: 24), Position 2075 bis 2094 bezogen auf die kodierende TOKl Sequenz, wobei die aus klonierungstechnischen Gründen angefügten Nukleotide kursiv dargestellt sind und die zum Erhalt der Spe I (ACTAGT) und Nhe I (GCTAGC) Schnittstellen eingefügten Nukleotide unterstrichen sind.
Die durch die PCR amplifizierte DNA wurde als 0,56 kb Fragment durch Agarose- gelektrophorese aufgetrennt und aus der Gelmatrix isoliert. Diese DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen Not I und Spe I gespalten, durch Agarosegelek- trophorese aufgetrennt und aus der Gelmatrix isoliert. Der Plasmidvektor p77- pretok wurde ebenfalls mit den Restriktionsendonukleasen Not I und Spe I gespalten, die Produkte durch Agarosegelektrophorese aufgetrennt und das 5,95 kb Fragment aus der Gelmatrix isoliert. Die so erhaltenen Fragmente wurden ligiert. Nach Transformation in Bakterien (E. coli XLl-Blue, Stratagene) und Inkubation bei 37° C auf LB-Amp Agarplatten (Luria-Bertani-Medium, lOOμg/ml Ampicillin, [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). In: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) wurden die erhaltenen Kolonien analysiert. Durch eine Restriktions- kartierung isolierter Plasmid DNA und Auftrennung im Agarosegel wurde das 1,02 kb p77-tok-int Verbundfragment im so erhaltenen Plasmid p77-TOK (6,51 kb) bestätigt.
Zur Transkription eines beliebigen gewünschten humanen Gens in der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde der hefeeigene Promotor der Plasmamembran AT- Pase PMA1 verwendet. Der in Saccharomyces cerevisiae konstitutiv aktive pmal Promotor wurde als Eco Rl/Bam HI 0.9 kb Fragment aus dem Plasmid pRS408 (erhalten von Dr. A. Goffeau, Universite Catholique de Louvain-Ia-Neuve, Belgien) nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese isoliert. In einer Ligation wurde das 0.9 kb pmal Eco RI/Bam HI mit dem Eco RI/ Barn HI gespaltenem Plasmidvektor pUC18 ligiert. Das erhaltene Plasmid pUC-pmal wurde durch Restriktionskartierung und Sequenzierung bestätigt. Aus diesem Plasmid wurde das 0.9 kb pmal Promotorfragment mit DNA-Polymerase aus Thermophilus aquaticus und den folgenden Oligonukleotidprimern zur Amplifikation der regulierenden Region erhalten: Oligonukleotid pmal_antisense:
5λ G G GTCGAC GATATTGTTT GATAATTAAA TCTTTC 3' (SEQ ID NO:25), wobei die aus klonierungstechnischen Gründen angefügten Nukleotide kursiv dargestellt sind und die zum Erhalt der Sal I Schnittstelle eingefügten Nukleotide unterstrichen sind. Oligonukleotid pmal_sense:
5' G G GGGCCC TGAAACGGAG AAACATAAAC AGGC 3' (SEQ ID NO:26), wobei die aus klonierungstechnischen Gründen angefügten Nukleotide kursiv dargestellt sind und die zum Erhalt der Apa I Schnittstelle eingefügten Nukleotide unterstrichen sind.
Die durch die PCR amplifizierte DNA wurde als 0.93 kb Fragment durch Agarose- gelektrophorese aufgetrennt und aus der Gelmatrix isoliert. Diese DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sal I und Apa I gespalten, durch Agarosegelek- trophorese aufgetrennt, aus der Gelmatrix isoliert und mit dem durch die Restriktionsendonukleasen Sal l/Apa I gespaltenen Plasmidvektor p77-TOK ligiert. Nach Transformation in Bakterien (E. coli XLl-Blue, Stratagene) und Inkubation bei 37° C auf LB-Amp Agarplatten (Luria-Bertani-Medium, lOOμg/ml Am- picillin, [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). In: Molecular clon- ing: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) wurden die erhaltenen Kolonien analysiert. Durch eine Restriktionskartierung isolierter Plasmid DNA und Auftrennung im Agarosegel wurde das p77 -tok-int-pmal Verbundfragment im so erhaltenen Plasmid p77-TOK-pmal (7,44 kb) bestätigt (Fig. 11; SEQ ID NO:27).
In dieses konstruierte Integrationsplasmid können beliebige, gewünschte humane Zielgene inseriert werden. Nach Spaltung mit der Restriktionsendouklease Not I werden lineare DNA Fragmente erhalten, die zur Transformation geeigneter Hefewirtstämme verwendet werden können. Erhalten werden dadurch stabile transgene Hefestämme, in denen das gewünschte Zielgen am singulären TOKl Locus im Hefegenom anstatt des endogenen TOKl Gens integriert ist. Zur Transkription eines beliebigen gewünschten humanen Gens im erzeugten trans- genen Saccharomyces cerevisiae Hefestamm wird der hefe-eigene Promotor der Plasmamembran ATPase PMA1 verwendet.
Beispiel 3: Konstruktion des HERG Integrationsplasmids p679/HERG
Das Gen für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) wurde durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI und Xbal als 3.9 Kilobasenpaar (kb) Fragment aus dem Plasmid pcDNAHERG (erhalten von Dr. G. Robertson, Univer- sity of Wisonsin, Madison, USA) und Auftrennung durch Agarosegelelektrophore- se erhalten.
Zur Transkription eines humanen Gens in der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde der hefe-eigene Promotor der Plasmamembran ATPase PMA1 verwendet. Der in Saccharomyces cerevisiae konstitutiv aktive pmal Promotor wurde als Eco Rl/Bam HI 0.9 kb Fragment aus dem Plasmid pRS408 (erhalten von Dr. A. Gof- feau, Universite Catholique de Louvain-Ia-Neuve, Belgien) nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese isoliert.
In einer Dreifach-Ligation wurden die 0.9 kb pmal Eco Rl/Bam HI und 3.9 kb HERG Bam HI Xbal Fragmente mit dem Eco RI/ Xbal gespaltenem Plasmidvektor pUC18 ligiert. Das erhaltene Plasmid pmalHerg wurde durch Restriktionskartie- rung und Sequenzierung bestätigt. Aus diesem Plasmid wurde das 4.8 kb pmalHerg Verbundfragment durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Eco Rl/Sal I und nach Auftrennung durch Agarose-gelelektrophorese erhalten.
In der folgenden Plasmidkonstruktion wurde das Plasmid p679 (erhalten von Dr. P. Ljungdahl, Ludwig Institute of Cancer Research, Stockholm, Schweden) mit den Restriktionsendonukleasen Eco Rl/Sal I gespalten. Dieser lineare Vektor wurde mit dem 4.9 kb pmalHerg Verbundfragment ligiert. Das gewünschte Plasmid p679pmalHERG wurde durch Restriktionskartierung identifiziert (siehe Figur 4). Mit Hilfe dieses Plasmids wurde das humane erg Gen stabil in den Genlocus für den biosynthetischen Marker LEU2 des Saccharomyces cerevisiae Hefestamms integriert.
Beispiel 4: Konstruktion des HERG integrierten Hefestammes
4.1 Konstruktion des HERG exprimierenden Saccharomyces cerevisiae Stammes In dem Plasmid p679-pmal-HERG (siehe Fig. 4) sind zur gerichteten homologen Rekombination des klonierten Inserts am chromosomalen Locus des LEU2 Gens in Saccharomyces cerevisiae 5' und 3 flankierende Regionen des LEU2 Gens inseriert. Zur gerichteten Integration des Gesamtplasmids einschließlich des 4.9 kb pmalHerg Verbundfragments am chromosomalen Locus des LEU2 Gens wurde mit der Restriktionsendonuklease Not I eine Linearisierung des Plasmids p679pmalHERG an Position 2189, zwischen den flankierenden LEU2 Regionen eingeführt.
Das erhaltene lineare 10,2 kb Not I Fragment wurde nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese zur Transformation des trkltrk2tokl dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestammes, in dem alle bisher beschriebenen hefe-eigenen Transport- und Kanalproteinen TRKl, TRK2 und TOKl spezifisch deletiert sind, verwendet. Dazu wurden Transformanten auf den in dem Plasmid p679 ebenfalls enthaltenen biosynthetischen Marker HIS3 (HIS3+ Prototrophie) selektioniert. Aus Einzellen stammende Kolonien wurden weiterhin auf Kulturmedien mit Kaliumionenkonzentrationen kleiner als 10 mM selektioniert.
Die Transformation des trkltrk2tokl dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestamms mit dem humanen Kaliumionen-Kanal erg Gen unter Kontrolle des pmal Promotors führte zur Isolierung eines Saccharomyces cerevisiae Hefestamms, in dem alle bisher beschriebenen hefe-eigenen Transport- und Kanalproteinen TRKl, TRK2 und TOKl spezifisch deletiert sind, und das humane erg Gen (HERG) am chromosomalen Locus des biosynthetischen LEU2 Gens stabil integriert und unter Kontrolle des hefe-eigenen pmal Promotors exprimiert ist. Die Expression des humanen Kaliumionen-Kanal erg Gens komplementiert den Kaliumionentransport defekten Phänotyp der trkltrk2tokl dreifach Saccharomyces cerevisiae Mutante auf Kulturmedien mit Kaliumionenkonzentrationen kleiner 10 mM.
Anstelle der hefe-eigenen Kaliumionentransport- und Kanalproteine wird in diesem Saccharomyces cerevisiae Stamm (Genotyp MATa his3-Δ200 leu2-3,112 trpl-Δ901 ura3-52 suc2-Δ9 trklΔ51trk2Δ50 toklΔ50 leu2::pmalHERG HIS3) (siehe auch Fig. 3) ausschließlich der humane HERG Kaliumionen-Kanal exprimiert.
4.2 Charakterisierung des HERG exprimierenden Saccharomyces cerevisiae Stammes durch RNS Analyse
Die Bestätigung der Expression des durch homologe Rekombination eingeführten humanen Kaliumionen-Kanal erg Gens (HERG) an den Saccharomyces cerevisiae LEU2 Locus erfolgte durch RNS Analyse (Fig. 9). In Figur 8 ist die Nukleinsäure- (SEQ ID NO: 17; 8A) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 18; 8B) des humanen erg Kaliumionen-Kanals Gens (HERG) dargestellt. Die Sequenz entspricht der in der Originalpublikation von Trudeau, M. C. et al., Science 269:92- 95 (1995) beschriebenen. Die zur RNS Analyse verwendeten Oligonukleotide H1119 5l CAG CGG CTT GCT CAA CTC CA 3 (SEQ ID NO: 19) und H1557 5 GAT GAG GTC CAC CAC AGC CA 3' (SEQ ID NO:20) sind durch Kursivdruck und Unterstrich angezeigt.
In Figur 9 sind die Ergebnisse einer "Reverse-Transcription" Polymerase Ketten Reaktion dargestellt. Dazu wurde RNS von verschiedenen, das humane Kaliumionen-Kanal erg Gen exprimierenden positiven Klonen (Klone Nr. 5, 6, 7, und 8) nach selektivem Wachstum im Kulturmedium mit 10 mM Kaliumionen isoliert. Die Auftrennung der Gesamt-RNS zur Überprüfung der Integrität und Mengenverhältnisse erfolgte im l%igen denaturierenden Agarosegel (linker Teil in Fig. 9). Diese Gesamt-RNS wurde mit Reverser Transkriptase in komplementäre DNS umgeschrieben und in einer nachfolgenden PCR Analyse mithilfe erg spezifischer Oligonukleotide (SEQ ID NO: 19)/(SEQ ID NO:20) ein 440 Basenpaare langes Fragment amplifiziert. Zur Kontrolle auf mögliche DNS Kontamination in der RNS Präparation wurde nicht-umgeschriebene RNS aus Klon Nr. 6 eingesetzt. Zur Kontrolle des korrekten Amplifikationsproduktes wurde 20 pg des Plasmids p679pmalHERG eingesetzt. Zur Kontrolle des Reaktionsgemisches wurde eine Reaktion ohne Matrize durchgeführt (Wasserkontrolle). Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in einem 0.8%igem Agarosegel.
Ergebnis: Durch RNS Analyse mit der RT-PCR erfolgte die Bestätigung der Expression des durch homologe Rekombination eingeführten humanen Kaliumionen-Kanal erg Gens (HERG) in den trkltrk2tokl dreifach-mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestamm.
4.3 Charakterisierung des HERG exprimierenden Saccharomyces cerevisiae Stammes durch Wachstumstests auf Kaliumionen limitierten Medien
Kulturen von Saccharomyces cerevisiae Wildstamm, des trkltrk2tokl dreifach- mutanten Hefestammes eines HERG exprimierenden Stammes wurden im Vollmedium YPD (2% yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 5.0 bei 30° C über Nacht unter Schütteln angezogen. 1 x 105 Zellen wurden auf Vollmedium- Agarplatten ausgestrichen, bei 30° C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten (0.67% yeast nitrogen base with amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D- glucose) mit 100 oder 10 mM KCI bei pH 5.5 und pH 5.0 plattiert. Diese Platten wurden für 48 Stunden bei 30° C inkubiert, wie in Figur 10 gezeigt, wächst der Saccharomyces cerevisiae Hefestamm mit Defekten in allen Kaliumionentranslo- kations-Systemen TRKl, TRK2 und TOKl (trkltrk2tokl, Dreifach-Mutante) nicht mit niedrigen Kaliumionenkonzentrationen (10 mM) im Medium bei pH 5.0 und pH 5.5. Im Gegensatz zur Saccharomyces cerevisiae Dreifach-Mutante ist der das humane Kaliumionen-Kanal erg Gen (HERG) exprimierende Stamm in der Lage, auf 10 mM Kaliumionen im Medium bei pH 5.0 und pH 5.5 dem Saccharomyces cerevisiae Wildstamm vergleichbar gut zu wachsen.
4.4 Charakterisierung des HERG exprimierenden Saccharomyces cerevisiae Stammes durch Wachstumstests in Gegenwart von Inhibitoren
Kulturen von Saccharomyces cerevisiae Wildstamm, des trkltrk2tokl dreifach- mutanten Hefestamms und dem HERG exprimierenden Stamm wurden im Vollmedium YPD (2% yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 5.0 bei 30° C über Nacht unter Schütteln angezogen. 1 x 105 Zellen wurden auf Vollmedium- Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten (0.67% yeast nitrogen base with amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D- glucose, pH 5.5) mit 10 mM KCI und 1 mM Barium, 1 mM Cäsium, 40 μM Lanthan und 20 nM Astemisol plattiert. Diese Platten wurden für 48 Stunden bei 30°C inkubiert.
Ergebnis
Die Restaurierung des Kaliumionenaufnahme Wildtyp Phänotyps ist abhängig von der heterologen Expression des HERG Kaliumionen-Kanals, wie anhand der Inhibierung des exprimierten HERG auf 10 mM Kaliumionen enthaltenden Agarplatten in der Gegenwart von 1 mM Barium, 1 mM Cäsium, 40 μM Lanthan und 20 nM Astemisol bestätigt wurde (siehe nachfolgende Tabelle 1). Durch die Inhibierung des heterolog exprimierten HERG Kaliumionen-Kanals kann der trkltrk2tokl dreifach-mutante Saccharomyces cerevisiae Stamm mit Defekten in allen Kali- umionentranslokations-Systemen auf 10 mM Kaliumionenkonzentration nicht mehr wachsen.
Tabelle 1
Wachstumsbedingungen
10 mM K+ 10 mM K+ 10 mM K+ lO mM KJ pH 5.5 pH 5.5 pH 5.5 pH 5.5
Stamm 1 mM Ba 1 mM Cs 40 μM Lanthan 20 nM Astemisol
S cerevisiae +++ +++ -H- +++ S. cerevisiae trkltrkltokf S. cerevisiae trkltrk2toklΗERG +/-

Claims

Patentansprüche
1. Modifizierter Sacc/iaromyces-cere s/ae-Hefestamm, dessen eigene spezifische Kaliumionentranslokations-Systeme selektiv deletiert oder disruptiert sind.
2. Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 1, wobei die Kaliumionen-Transloka- tionssysteme TRKl, TRK2 und TOKl spezifisch deletiert sind, insbesondere der Hefestamm ein trkltrk2tokl- Mutant ist.
3. Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kaliumionen- Translokationssysteme durch Einführung von selektiven Markern, insbesondere Auxotrophie- und/oder Resistenzmarker, in die Loci der Kaliumionen-Transportsysteme deletiert sind.
4. Modifizierter Hefestamm nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, in den weiterhin eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die für einen heterologen Kaliumionen-Kanal oder für ein funktionelles Derivat oder eine Mutation desselben kodieren, stabil in das Hefegenom integriert sind und exprimiert werden.
5. Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 4, wobei der heterologe Kaliumionen- Kanal
(i) ein Säuger-Kaliumionen-Kanal, insbesondere ein humaner Kaliumionen-Kanal oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutation desselben ist, und/oder (ii) ein Kaliumionen-Kanal ist, der die Kaliumionenaufnahme vermittelt, ein einwärtsgerichteter (K,r) oder spannungsabhängiger (Kv) Kaliumionen-Kanal ist, oder ein Doppelporenkanal ist oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutation derselben, wobei der humane erσ-Kaliumionen-Kanal (HERG) oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutation desselben besonders bevorzugt ist.
6. Modifizierter Hefestamm nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, in dem weiterhin selektiv nur eine funktionelle heterologe Nukleinsäuresequenz an einen singulären Locus stabil in das Hefegenom integriert ist.
7. Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 6, der durch gerichtete Integration mittels eines Integrationsvektors in einen singulären Genlocus erhältlich ist, wobei der Integrationsvektor ein Nukleinsäurekonstrukt aus der funktioneilen Nukleinsäuresequenz und einem in Saccharomyces cerevisiae wirksamen Promotor, das von in Nukleinsäuresequenzen flankiert ist, die zu dem singulären Genlocus S. cerevisiae homolog sind, umfasst.
8. Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 6 oder 7, wobei die funktionelle heterologe Nukleinsäuresequenz für einen wie in Anspruch 4 oder 5 definierten heterologen Kaliumionen-Kanal kodiert und insbesondere für den HERG-Kaliumionen- Kanal kodiert.
9. Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäuresequenz für HERG am Lokus einer der Kaliumionentranslokationssysteme, insbesondere am TOKl-Lokus des Hefegenoms integriert ist.
10. Modifizierter Hefestamm nach Anspruch 9, der durch Integration des Vektors p77-TOK-pmal (SEQ ID NO:27) erhältlich ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Saccharomyces cerevisiae Hefestamms nach Anspruch 4, umfassend Transformation eines Ausgangshefestammes oder eines Hefestammes nach Anspruch 1 mit einem Integrationsvektor, der eine Nukleinsäuresequenz, die für den Kaliumionen-Kanal kodiert, umfasst.
12. Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des Säuger-Kaliumionen- Kanals, umfassend: a) die Behandlung eines Saccharomyces cerevisiae Hefestamms, wie in Anspruch 4, 5 oder 8 bis 10 definiert, mit Testsubstanzen, b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz, c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumionentransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.
13. Verfahren nach Anspruch 12, das zur Detektion von (i) anti-arrythmischen Substanzen,
(ii) anti-fibrillatorischen Substanzen oder (iii) anti-entzündlichen Substanzen geeignet ist.
14. Verwendung eines SaccΛaromyces-cere 's/'ae-Hefestamms nach Anspruch 1 bis 10 als Wirtsorganismus zur homologen oder heterologen Expression von Kaliumionen-Kanälen.
15. Verfahren zur gerichteten singulären Integration einer funktionelllen heterol- gen Nukleinsäuresequenz in einen singulären Genlocus des Saccharomyces-cere- 's/ae-Hefegenoms, umfassend die Transformation eines Ausgangshefestammes mit einem Integrationsvektor, der ein Nukleinsäurekonstrukt aus der zu integrierenden funktionelle Nukleinsäuresequenz und einem in S. cerevisiae wirksamen Promotor, das von Nukelinsäuresequenzen flankiert ist, die zu dem singulären Genlocus in S. cerevisiae homolog sind, umfasst.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei
(i) die homologen Sequenzen eine Länge von 40 bis 1000 Nukleotiden, vorzugsweise von wenigstens 80 Nukleotiden, aufweisen, und/oder (ii) der Promotor ausgewählt ist aus natürlichen Promotoren von Saccharomyces cerevisiae und insbesondere der pmal-Promotor ist, und/oder (iii) die funktionelle Nukleinsäuresequenz für einen wie in den Ansprüchen 4 und 5 definierten Kaliumionen-Kanal kodiert.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der singuläre Genlocus der TOKl-Locus ist und die flankierenden Sequenzen aus der Region pretok 3130 bis 3599 von SEQ ID NO:27 und posttok 3608 bis 4156 (complement) von SEQ ID NO:27 ausgewählt sind.
18. Integrationsvektor, wie in Ansprüchen 15 bis 17 definiert.
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