WO2003012091A2 - Fettsäure-desaturase-gene aus granatapfel und verfahren zur herstellung von ungesättigten fettsäuren - Google Patents

Fettsäure-desaturase-gene aus granatapfel und verfahren zur herstellung von ungesättigten fettsäuren Download PDF

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WO2003012091A2
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acid sequence
seq
fatty acids
organism
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Ivo Feussner
Ellen Hornung
Christian Pernstich
Andreas Renz
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Basf Plant Science Gmbh
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
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    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of unsaturated or saturated fatty acids and a process for the production of oils and / or triglycerides with an increased content of unsaturated or saturated fatty acids.
  • the invention further relates to nucleic acid sequences; Nucleic acid constructs, vectors and organisms containing the nucleic acid sequences, nucleic acid constructs and / or vectors.
  • the invention relates to fatty acid mixtures and triglycerides with an increased unsaturated fatty acid content and their use.
  • Fatty acids and triglycerides have a multitude of applications in the food industry, animal nutrition, cosmetics and pharmaceuticals. Depending on whether it is free saturated or unsaturated fatty acids or triglycerides with an increased content of saturated or unsaturated fatty acids, they are suitable for a wide variety of applications, for example polyunsaturated fatty acids are added to baby food to increase the nutritional value.
  • the various fatty acids and triglycerides are derived from microorganisms such as Mortierella and Schizochytrium or from oil-producing plants such as soybean, oilseed rape, sunflower and others, where they occur in 'usually in the form of their triacylglycerides. But they are also advantageously obtained from animals such as fish.
  • the free fatty acids are advantageously produced by saponification.
  • oils with saturated or unsaturated fatty acids are preferred, e.g. In human nutrition, lipids with unsaturated fatty acids, especially polyunsaturated fatty acids, are preferred because they have a positive influence on the cholesterol level in the blood and thus on the possibility of heart disease. They are used in various dietary foods or medications.
  • conjugated unsaturated fatty acids such as conjugated linoleic acid.
  • conjugated fatty acids for example the administration of conjugated linoleic acid reduces body fat in Humans and animals or increase the feed conversion in body weight in animals (WO 94/16690, WO 96/06605, WO 97/46230, WO 97/46118).
  • conjugated linoleic acid By administering conjugated linoleic acid, allergies (WO 97/32008) or cancer (Banni et al., Carcinogenesis, Vol. 20, 1999: 1019-1024, Thompson et al., Cancer, Res., Vol. 57, 1997: 5067-5072).
  • Punicic acid occurs naturally in Punica granatum (El-Shaarawy and Nahapetian, Fette Seifen Anstrichstoff, 85, 1983: 123-126; Melgarejo et al., Sei. Food Agric., 69, 1995, 253-256; Melgarejo and Artes, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80, 1452-1454).
  • conjugated linoleic acid is found in beef (Chin et al., Journal of Food Composition and Analysis, 5, 1992: 185-197), in milk (Dhiman et al., Journal of Dairy Science, 1999, 82, 2146-56) and dairy products.
  • conjugated fatty acids such as calendulic acid, electostearic acid or punicic acid takes place via the desaturation of oleic acid to linoleic acid by means of a ⁇ -12-desaturase and a further desaturation, combined with a rearrangement of the double bond to the conjugate fatty acid by a specific conjutrient-forming desaturase.
  • conjugated calendulic acid Qiu et al. , (Plant Physiology, 125, 2001, 847-855) also describes the production of conjugated linoleic acid by the enzymatic activity of desaturase.
  • the disadvantage of this side activity is, however, • that the unwanted 8,10-isomer of the conjugated linoleic acid is produced by the enzymatic action.
  • ⁇ -15 desaturase in WO 94/11516 claims a ⁇ -12 desaturase.
  • ⁇ -6 desaturases are described in WO 93/06712 and WO 96/21022 described. Further desaturases are described, for example, in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al. , J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al. , Nature 347, 1990: 200-203 5 or Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659.
  • nucleic acid sequences which are derived by back-translation into a nucleic acid sequence from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 8 on the basis of the degenerate genetic code, or
  • a further embodiment of the invention is a process for the production of oils or triglycerides with an increased unsaturated fatty acid content, characterized in that it comprises the following process steps:
  • the fatty acids contained in the oil or in the triglycerides can subsequently be released by acidic or alkaline hydrolysis according to methods known to the person skilled in the art.
  • nucleic acid codes for a polypeptide with desaturase activity, selected from the group:
  • nucleic acid sequences which are derived by back-translation into a nucleic acid sequence from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 on the basis of the degenerate genetic code, or d) Derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, which code for polypeptides with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 6 and have at least 90% identity at the amino acid level, without the enzymatic action of the polypeptides having changed significantly.
  • oils and / or triglycerides with an increased content of unsaturated fatty acids for example unsaturated conjugated fatty acids such as punicic acid, for example from oleic acid
  • unsaturated conjugated fatty acids such as punicic acid
  • punicic acid desaturase for example from oleic acid
  • a further ⁇ -12-desaturase such as the ⁇ -12-desaturase with SEQ ID NO: 5 is advantageous.
  • conjutien fatty acids for example from oleic acid
  • oilseeds such as rapeseed would allow inexpensive and easy access to conjutrien due to their high oleic acid content.
  • rapeseed would allow inexpensive and easy access to conjutrien due to their high oleic acid content.
  • linoleic acid Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678-81
  • the use of the ⁇ -12-desaturases mentioned is advantageous for the production of the linoleic acid.
  • Derivatives include, for example, functional homologs of the enzyme encoded by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 or its enzymatic activity, that is to say enzymes which have the same enzymatic reactions as that of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 catalyze encoded enzyme.
  • These genes also enable advantageous production of unsaturated conjugated fatty acids.
  • unsaturated fatty acids are to be understood as mono- and polyunsaturated fatty acids, the double bonds of which can be conjugated or non-conjugated.
  • the sequences mentioned in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 code for new, unknown desaturases which are involved in the synthesis of punicic acid in Punica granatum.
  • the enzymes preferably convert (9Z, 12Z) octadecadiene / linoleic acid to (9Z, 11E, 13Z) octadecaconjutrien / punicic acid. In the following, they are referred to as punicic acid desaturase (s).
  • Further substrates of these enzymes are, for example, ⁇ -linolenic acid, which is converted into various 18: 4 conjutetrenic acid isomers (FIG. 3B).
  • the enzymes also convert oleic acid. 9 c i s ll trans conjugated linoleic acid is advantageously formed
  • the nucleic acid sequences according to the invention or fragments thereof can advantageously be used to isolate further genomic sequences via homology screening.
  • the derivatives mentioned can be isolated, for example, from other organisms in eukaryotic organisms such as plants such as Calendula stellata, Osteospermum spinescens or Osteospermum hyoseroides, algae, dinoflagellates or fungi.
  • derivatives or functional derivatives of the sequence mentioned in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 are to be understood as allelic variants, for example, which in the case of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 have at least 75% homology at the derived amino acid level, preferably at least 80% homology, 5 particularly preferably at least 85% homology, very particularly preferably 90% homology.
  • the derivatives have a homology of 90%, preferably 95%, particularly 98%. The homology was calculated over the entire amino acid range.
  • the PileUp program was used 0 (J. Mol.
  • the acid sequences derived from the ⁇ Ami said nucleic acids are sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 can be seen: 6 or SEQ ID NO. 5
  • Allelic variants include in particular functional variants which can be obtained by deleting, inserting or substituting nucleotides from the sequence shown in SEQ ID No. 1, the enzymatic activity of the derived synthesized proteins being retained. 0
  • DNA sequences can be derived from the DNA sequence described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 or parts of these sequences, for example using conventional hybridization methods or the PCR technique from other Euka- 5 Isolate ryontes as mentioned above. These DNA sequences hybridize to the sequences mentioned under standard conditions. Short oligonucleotides, for example of the conserved regions, which can be determined by comparison with other desaturase genes known to the person skilled in the art, are advantageously used for hybridization. However, longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can also be used for the hybridization.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA: RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C.
  • derivatives include homologs of the sequences SEQ ID No: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, for example eukaryotic homologs, shortened sequences, single-stranded DNA of the coding and non-coding DNA sequence or RNA of the coding and non-coding DNA Sequence to understand.
  • homologs of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 are to be understood as derivatives such as promoter variants.
  • These variants can be changed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or effectiveness of the promoters being impaired.
  • the effectiveness of the promoters can be increased by changing their sequence, or they can be completely replaced by more effective promoters, including organisms of other species.
  • Derivatives are also advantageously to be understood as variants whose nucleotide sequence in the range -1 to -2000 before the start codon has been changed such that the gene expression and / or the protein expression is changed, preferably increased.
  • Derivatives are also to be understood as variants that were changed at the 3 'end.
  • the punicic acid desaturas ' gene can advantageously be combined with other genes of fatty acid biosynthesis in the process according to the invention.
  • the combination with the ⁇ -12-desaturase listed under SEQ ID NO: 5 and 6 is advantageous.
  • Further advantageous sequences are desaturase sequences such as ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase or ⁇ -8-desaturase sequences, acetyltransferase sequences or elongase sequences.
  • amino acid sequences according to the invention are to be understood as proteins which have an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, or one obtainable therefrom by substitution, inversion, insertion or deletion of one or more amino acid residues Contain sequence, wherein the enzymatic activity of the protein shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 is retained or is not changed significantly.
  • These not significantly modified proteins are therefore still enzymatically active, that is to say functionally.
  • Not significantly changed means all enzymes which still have at least 10%, preferably 20%, particularly preferably 30% of the enzymatic activity of the starting enzyme.
  • amino acids can be replaced by those with similar physicochemical properties (space filling, basicity, hydrophobicity, etc.).
  • arginine residues are exchanged for lysine residues, valine residues for isoleucine residues or aspartic acid residues for glutamic acid residues.
  • one or more amino acids can also be interchanged, added or removed in their order, or several of these measures can be combined with one another.
  • nucleic acid constructs or fragments according to the invention are the sequences mentioned in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, sequences which result from the genetic code and / or their functional or non-functional derivatives to understand that have been functionally linked to one or more regulatory signals advantageously to increase gene expression.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified, so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes has been increased.
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences" functionally linked to the promoter, which increase one
  • the advantageous expression of the nucleic acid sequence can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lad ⁇ 3- ⁇ T7, T5, Contain T3, gal, tre, ara, SP6, ⁇ -P R - or in the ⁇ -P ⁇ , promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lad ⁇ 3- ⁇ T7, T5, Contain T3, gal, tre, ara, SP6, ⁇ -P R - or in the ⁇ -P ⁇ , promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MF ⁇ , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH or in the plant promoters such as CaMV / 35S [Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294], PRPl [Ward et al., Plant Mol. Biol .22 (1993)], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos or in the ubiquitin promoter.
  • plant promoters are, for example, one that can be induced by benzenesulfonamide (EP 388186), one that can be induced by tetracycline (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), one that can be induced by abscisic acid (EP335528) or a promoter inducible by ethanol or cyclohexanone (W09321334).
  • Further plant promoters are, for example, the promoter of the cytosolic FBPase from potato, the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al., EMBO J.
  • the promoter of the phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Glycine max (see Genbank Accession number U87999) or a node-specific promoter as in EP 249676 can also be used advantageously. Plant promoters which ensure expression in tissues or parts of plants in which fat biosynthesis or its precursors take place are particularly advantageous. Promoters which ensure seed-specific expression, such as the usp promoter, the LEB4 promoter, the phaseolin promoter or the napin promoter, should be mentioned in particular. 5
  • the desaturase genes are advantageously used in the same nucleic acid construct, preferably the ⁇ -12 desaturase gene, as shown in Seq ID NO: 5 and 6.
  • nucleic acid constructs according to the invention are advantageously inserted into a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables the genes to be optimally expressed in the host.
  • a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables the genes to be optimally expressed in the host.
  • Suitable plasmids are, for example, in E.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018 ) can be removed. Suitable plant vectors are described in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chap. 6/7, p.71-119.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally. Chromosomal replication is preferred.
  • the vector advantageously contains at least one copy of the nucleic acid sequences according to the invention and / or the nucleic acid fragments according to the invention.
  • nucleic acid sequences or homologous genes are incorporated, for example, in a nucleic acid fragment or into a vector that preferably contains the genes associated with the respective regulatory gene sequences or similarly acting promoter activity. In particular, those regulatory sequences are used which increase gene expression.
  • nucleic acid fragments for the expression of the further genes contained additionally contain 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the host organism selected and gene or genes for optimal expression.
  • regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed and / or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably influence the gene expression of the introduced genes positively and thereby increase.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers" are used.
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the gene construct according to the invention (the singulate is also to include the plural below) can also advantageously be introduced into the organisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid fragment as a vector or the nucleic acid sequence according to the invention.
  • the nucleic acid sequence according to the invention (the singulate is also intended to include the plural below) is advantageously cloned together with at least one reporter gene into a nucleic acid construct which is introduced into the genome.
  • This reporter gene should enable easy detection via a growth, fluorescence, chemo-, bioluminescence or resistance assay or via a photometric measurement.
  • reporter genes are antibiotic or herbicide resistance genes, hydrolase genes, fluorescence protein genes, bioluminescence genes, ZucJer-- or nucleotide t ⁇ f, 'fe' ⁇ er , Jaselgi?
  • These genes enable the transcription activity and thus the expression of the genes to be measured and quantified easily. This enables genome sites to be identified that show different levels of productivity.
  • nucleic acid sequence according to the invention can also be introduced into an organism on its own.
  • nucleic acid sequence according to the invention can all be introduced into the organism together with a reporter gene in a single vector or each individual gene with a reporter gene in each vector, the different vectors being introduced simultaneously or successively can.
  • the host organism advantageously contains at least one copy of the nucleic acid and / or the nucleic acid construct according to the invention.
  • nucleic acid according to the invention introduction of the nucleic acid according to the invention, the nucleic acid construct or the vector into organisms, for example plants, can in principle be carried out by all methods known to the person skilled in the art.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the construct to be expressed is preferably converted into a vector
  • Agrobacterium tumefaciens 35 cloned, which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • the transformation of plants with Agrobacterium tumefaciens is described, for example, by Höfgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877.
  • Agrobacteria transformed with an expression vector according to the invention can also be used in a known manner to transform plants such as test plants such as Arabidopsis or crop plants, in particular oil-containing crop plants such as
  • soybean, peanut, castor bean, sunflower, corn, cotton, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinctorius) or cocoa bean are used, e.g. by using wounded leaves, Leaf pieces, hypocotyl pieces or roots are bathed in an agrobacterial solution and then cultivated in suitable media.
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by S.D. Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer can be found.
  • nucleic acid constructs or the vectors are in principle all organisms which are able to synthesize fatty acids, especially unsaturated fatty acids or are suitable for the expression of recombinant genes.
  • Examples include plants such as Arabidopsis, Asteraceae such as Calendula, Punicaceae such as Punica granatum or crop plants such as soybean, peanut, castor bean, sunflower, corn, cotton, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower dye (Carthamus tinctorius) or cocoa bean, microorganisms such as fungi, for example Genus Mortierella, Saprolegnia or Pythium, bacteria like the genus Escherichia, yeasts like the genus Saccharomyces, algae or protozoa like dinoflagellates like Crypthecodinium.
  • fungi for example Genus Mortierella, Saprolegnia or Pythium
  • bacteria like the genus Escherichia
  • yeasts like the genus Saccharomyces
  • transgenic plants which contain a functional or nonfunctional nucleic acid or a functional or nonfunctional nucleic acid construct.
  • These transgenic plants can also contain a vector which contains a functional or non-functional nucleic acid according to the invention or a functional or non-functional nucleic acid constructs.
  • non-functional means that no enzymatically active protein is synthesized anymore.
  • non-functional nucleic acids or nucleic acid constructs are also to be understood as so-called antisense DNA, which leads to transgenic plants which have a reduction in the enzymatic activity or no enzymatic activity.
  • the enzymatic activity is reduced by 5 to 100%, preferably from 10 to 90%, particularly preferably from 20 to 80%, very particularly preferably from 30 to 70%.
  • the antisense technique especially if the nucleic acid sequence according to the invention is combined with other fatty acid synthesis genes in the antisense DNA, it is possible to synthesize oils and / or triglycerides with an increased content of saturated fatty acids or saturated fatty acids.
  • Transgenic plants are understood to mean individual plant cells and their cultures on solid media or in liquid culture, plant parts and whole plants.
  • Transgenic in the sense of the invention means that the nucleic acids used in the method or the nucleic acid constructs according to the invention are not in their natural position in the genome of an organism, and the nucleic acids can be expressed homologously or heterologously.
  • transgene also means that the nucleic acids or expression cassettes are in their natural place in the genome of an organism, but that the sequence has been changed compared to the natural sequence and / or that the regulatory sequences, the natural sequences, have been changed.
  • Transgenic is preferably to be understood as meaning the expression of the nucleic acids according to the invention at a non-natural location in the genome, that is to say a homologous or, preferably, heterologous expression of the small enzyme is present.
  • Preferred transgenic organisms are the abovementioned transgenic plants, preferably oil fruit plants.
  • nucleic acid sequence according to the invention or the nucleic acid construct according to the invention in its functional or non-functional forms for the production of transgenic plants is therefore also part of the subject matter of the invention.
  • Another subject of the invention is therefore a process for the production of oils or triglycerides with an increased content of saturated fatty acids, characterized in that it comprises the following process steps:
  • the saturated fatty acids can be released from the oils and / or triglycerides thus obtained by methods known to those skilled in the art. The release takes place via a so-called acidic or alkaline hydrolysis of the ester bonds. Alkaline hydrolysis with NaOH or KOH, for example, is preferred. If the alkyl esters, such as the methyl or ethyl esters of the saturated or, as described above, the unsaturated fatty acids are to be prepared, the hydrolysis can advantageously be carried out with the corresponding alcoholates.
  • plants particularly preferably oil-fruit plants or microorganisms, are used as organisms.
  • the invention further relates to nucleic acids which code for a protein which comprises a fatty acid of the general structure I,
  • R 1 hydrogen, substituted or unsubstituted, unsaturated or saturated, branched or branched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl
  • R 2 substituted or unsubstituted, unsaturated or saturated Ci-Cg-alkyl-
  • R 3 and R 4 independently of one another are hydrogen, substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated, branched or unbranched C 1 -C 2 -alkylcarbonyl- or phospho-,
  • n 1 to 14, preferably 1 to 8, particularly preferably 4 to 7, very particularly preferably 7.
  • R 1 in the compounds of the formulas I and II denotes hydrogen, substituted or unsubstituted, unsaturated or saturated, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl, or
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted branched or unbranched -CC-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n-pentyl , 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl , 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, -2,3-dimethylbutyl-, ⁇ .-3-, 3-dimethyl -butyl, l -
  • Preferred radicals for R 1 are hydrogen and
  • R 2 in the compounds of the formulas I and II denotes substituted or unsubstituted, unsaturated or saturated Ci-Cg-alkyl-,
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted branched or unbranched Ci-Cg-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n-pentyl , 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2, 2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl , 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1, -dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 2, 3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethy
  • R 3 and R 4 independently denote hydrogen, substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated, branched or unbranched C 1 -C 4 -alkylcarbonyl- or phospho-.
  • R 3 and R 4 are saturated or unsaturated C 1 -C 2 -alkylcarbonyl.
  • Halogen such as fluorine or chlorine, alkyl or hydroxyl may be mentioned as a substituent of the radicals mentioned.
  • a double bond is introduced into the fatty acid and a double bond is shifted so that the three double bonds involved in the reaction are in conjugation. Furthermore, a double bond is isomerized (from ice to trans).
  • the enzyme introduces a cis double bond at position C ⁇ 3 and causes the specific shift of a cis double bond in position C ⁇ 2 to a trans double bond in position Cn, the isomerization taking place in a region-specific manner. The reaction is likely to take place via a 1.4 elimination and a subsequent 11.14 desaturation.
  • ⁇ -Linolenic acid (18: 3, 6Z, 9Z, 12Z) is also suitable as a substrate, which is then converted to the corresponding conjutetraene (18: 4, 6Z, 9Z, 11E, 13Z).
  • oleic acid (18: 1, 9Z) and vaccenic acid (18: 1, HZ) as a substrate, which is then converted into conjugated linoleic acid.
  • the 9 cs , llt ns isomer is preferably formed during the reaction.
  • a further subject of the invention is a process for the production of fatty acid mixtures with an increased unsaturated fatty acid content, characterized in that at least one nucleic acid sequence according to the invention described above or at least one nucleic acid construct according to the invention is brought into a preferably oil-producing organism, this organism is attracted and isolates the oil and / or triglyceride contained in the organism and releases the fatty acids contained in the oil and / or triglyceride.
  • a process for the production of oils and / or triglycerides with an increased content of unsaturated fatty acids characterized in that at least one nucleic acid sequence according to the invention described above or at least one nucleic acid construct according to the invention is brought into an oil-producing organism, attracts this organism and the oil contained in the organism is one of the objects of the invention.
  • Another objects according to the invention are a process for the production of saturated fatty acids, characterized in that at least one non-functional nucleic acid sequence according to the invention mentioned above or at least one non-functional nucleic acid construct according to the invention is brought into an oil-producing organism, this organism attracts that oil contained in the organism is isolated and releases the fatty acids contained in the oil and a process for the production of triglycerides with an increased content of saturated fatty acids, characterized in that at least. a non-functional aforementioned 'nucleic acid sequence of the invention or at least one nonfunctional nucleic acid construct according to the invention into an oil-producing organism brings, attracts this organism and isolates the oil contained in the organism.
  • antisense technology is used for these two processes (see above).
  • organisms for the processes mentioned are plants such as arabidopsis, soybean, peanut, castor bean, sunflower, maize, cotton, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinctorius) or cocoa bean, microorganisms such as fungi Mortierella, Saprolegnia or Pythium, bacteria like the genus Escherichia, yeasts like the genus Saccharomyce ' s, algae or
  • Organisms that can naturally synthesize oils in large quantities such as fungi such as Mortierella alpina, Pythium insidiosum or plants such as soybean, rapeseed, coconut, oil palm, safflower, castor bean, calendula, punica, are preferred .
  • fungi such as Mortierella alpina, Pythium insidiosum or plants such as soybean, rapeseed, coconut, oil palm, safflower, castor bean, calendula, punica
  • Peanut, cocoa bean or sunflower or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, soya, rape, sunflower, calendula, punica or Saccharomyces cerevisiae are particularly preferred.
  • Microorganisms are usually in a liquid medium, which is a carbon source, mostly in the form of sugar, a source of nitrogen, mostly in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate Contains iron, manganese, magnesium salts and possibly vitamins, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C with oxygen.
  • the pH of the nutrient liquid can be kept at a fixed value, that is to say it can be regulated during cultivation or not.
  • the cultivation can be batch-wise, semi-batch wise or continuous. Nutrients can be introduced at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • plants are first regenerated as described above and then grown or grown as usual.
  • the lipids are usually obtained from the organisms.
  • the organisms can first be digested after harvesting or used directly.
  • the lipids are advantageously mixed with suitable solvents such as apolar solvents such as hexane or ethanol, isopropanol or mixtures such as hexane / isopropanol, phenol / chloroform / isoamyl alcohol
  • Extracted temperatures between 0 ° C to 80 ° C, preferably between 20 ° C to 50 ° C.
  • the biomass is usually A shot of solvent, for example, extracts an excess of solvent to biomass of 1: 4.
  • the solvent is then removed, for example by distillation.
  • the extraction can also be done with supercritical CO 2 .
  • the remaining biomass can be removed, for example, by filtration.
  • the crude oil obtained in this way can then be further purified, for example by removing turbidity by adding polar solvents such as acetone or chloroform and then filtering or centrifuging. Further cleaning via columns is also possible.
  • polar solvents such as acetone or chloroform
  • the invention therefore furthermore relates to fatty acid mixtures with an increased unsaturated fatty acid content, and oils and / or trigylcerides with an increased unsaturated fatty acid content, which have been prepared by the abovementioned processes, and to their use in the production of foods, animal feed, cosmetics or pharmaceuticals , For this purpose, they are added to the food -, - the tior food, - ⁇ the cosmetics or pharmaceuticals in the usual amounts.
  • a cDNA was cloned from Punica granatum mRNA using RT-PCR and RACE techniques. When this cDNA is expressed in yeast, linoleic acid is converted into the octadecaconjutrien punicic acid (9Z, 11E, 13Z). To our knowledge, this is the first time description of a punicic acid desaturase. The enzyme causes a region-specific shift of a cis double bond in position C ⁇ 2 to a trans double bond in position Cn and introduces a new cis double bond in position C ⁇ 3 . A cDNA was also cloned, which codes for a functional ⁇ -12-desaturase.
  • RNA isolation from Punica granatum seeds have punicic acid in their lipids.
  • the synthesis of punicic acid can be increased by additional expression of a ⁇ -12 desaturase, which leads to an increase in the content of linoleic acid, which in turn is the substrate for punicic acid desaturase.
  • Example 1 RNA isolation from Punica granatum seeds
  • Punica granatum seeds were used according to the method described in Fritsche et al. (FEBS Letters, 462, 1999, 249-253) described RNA isolated. The following steps were modified: After centrifuging for 18 hours and washing the pellet with 70% ethanol, the subsequent extraction was carried out instead of 15 min for 1 h at 65 ° C. in a water bath, with vortexing every 10 min.
  • the mRNA was isolated from 3 mg of total RNA using the Promega Poly Attract kit, according to the manufacturer.
  • the preparation of ss-cDNA was carried out with Oligo (dT) primer, Superscript II from Gibco-BRL according to the manufacturer's instructions from 1 ⁇ g mRNA. This ss cDNA was used as a template in a polymerase chain reaction (PCR).
  • Example 2 Isolation and cloning of the punicic acid desaturase and the ⁇ -12 desaturase from Punica granatum.
  • Primer A 5 "- TGG GTI AWH GCH GAY GAR 'GB GG - 3' forward primer, derived from the amino acid sequence W V I A H E C
  • Primer B 5 - GGC ATI GTI GAR AAS ARR TGR TGV AGY MAC - 3 ⁇ reverse primer, derived from the amino acid sequence VT / AHHLFSTI
  • Primer C 5 x - CCD TAY TTC TCI TGG AAR WWH AGY CAY CG - 3 ⁇ forward primer, derived from the amino acid sequence PYFSWKY / ISHR
  • Primer D 5 '- CCA RTY CCA YTC IGW BGA RTC RTA RTG - 3 ' Reverse primer, derived from the amino acid sequence HYDSS / TEWD / NW
  • the letters in primers A, B, C and D have the following meaning:
  • the PCR reaction approach was composed as follows:
  • PCR fragments were obtained with the primer combinations A / B and A / D. These were excised from a preparative agarose gel, eluted with GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit from Amersham Pharmacia Biotech and cloned in a pGEM-T vector system (Promega) according to the manufacturer's instructions. Clones different from one another were sequenced with M13 primers. The sequences of these approximately 570 bp long PCR products can be found in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4.
  • the fragments SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 were extended by means of 5 X and 3 ⁇ RACE (rapid amplification of cDNA ends).
  • RACE rapid amplification of cDNA ends.
  • a "Marathon cDNA Amplification Kit” from CLONTECH (Heidelberg) was used to create a "Marathon cDNA bank” according to the manufacturer's instructions.
  • the 5 'and S' RACE PCR was carried out using the Advantage cDNA PCR kit from Clontech according to the manufacturer's instructions with the following gene-specific RACE primers:
  • Primer E 5 r - ACG GAA CGA GGA GCG CTG AGT G - 3 ⁇ Specific primer for 5 'RACE of punicic acid desaturase
  • Primer F 5 ⁇ - CTG ATC GTG AAC GCA TTC CTG G - 3 V
  • rrimer G - £ - GGG-A-GG-AGG-AGC GAT GTG TGG AG - 3 Specific primer for S'-RACE of ⁇ -12-desaturase
  • Primer H 5 - AGT CCT CAT ATT AAA TGC ATT CGT GG - 3 Specific primer for 3 ⁇ - RACE of ⁇ -12-desaturase
  • the PCR reaction approach was composed as follows:
  • the DNA fragments obtained were cut out from a preparative agarose gel as described in Example 2, eluted with GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit from Amersham Pharmacia Biotech and cloned and sequenced in a pGEM-T vector system (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • the 5 v -RACE products reached via the start codon into the 5 'non-translated area (5 X -UTR), the 3 ⁇ - RACE products via the stop codon into the 3 ⁇ - UTR.
  • SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 show the composite DNA sequences of the punicic acid desaturases and the ⁇ -12 desaturase.
  • the sequences include the coding region - as well as a section, the ⁇ 5 * -UT-R - and 3 '- ⁇ JTPv.
  • SEQ ID NO: 2 Punicic acid desaturase, PuFADX
  • SEQ ID NO: 5 ⁇ -12 desaturase
  • SEQ ID NO: 7 Punicic acid desaturase, PuFADX2
  • the coding regions of the punicic acid desaturases and the ⁇ -12 desaturase were amplified and cloned. This was done with the Expand High Fidelity PCR system (Röche Diagnostics) and the primers I and J for punicic acid desaturases or the primers K and L for delta-12 desaturase as well as with Punica cDNA as a template.
  • Primer 1 5 '- AAG CTT ATG GGA GCT GAT GGA ACA ATG TCT C - 3 v Forward Primer (with Hindlll sections)
  • Primer 5 ⁇ - GGA TCC ATT CAG AAC TTG CTC TTG AAC CAT AG - 3 reverse primers (with BamHI interface)
  • Primer K 5 - GTC GAC ATG GGA GCC GGT GGA AGA ATG AC - 3 ⁇ - Forward Primer (with Sall interface)
  • Primer L 5 - AAG CTT TGA TCA GAG GTT CTT CTT GTA CCA G - 3 'Reverse Primer (with Hindlll cut parts)
  • PCR approaches are composed as follows:
  • dNTP mix (10 mM) 1 0 ⁇ l forward primer (10 ⁇ M) 4.0 ⁇ l reverse primer (10 ⁇ M) 4.0 ⁇ l template 3.0 ⁇ l (1:50 diluted marathon cDNA bank)
  • the PCR was carried out according to the following program:
  • the PCR products with a length of 1.2 kb were cloned into the vector pGEM-T (Promega, Mannheim) and transformed into E. coli XLl blue cells.
  • the insert DNA was sequenced in a double-stranded manner using a 373 DNA sequencer (Applied Biosystems) and was in each case identical to the coding regions of the punicic acid desaturases (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 7) and the ⁇ -12 desaturase (SEQ ID NO: 5).
  • 1A shows a comparison of the amino acid sequences of PuFADX with ⁇ -12 desaturases from Gossypium hirsutum, Solanum commersonii, Helianthus annuus, Arabidopsis thaliana, Glycine max and Corylus avellana.
  • 1B shows a comparison of the amino acid sequences of PuFADl2 with ⁇ -12 desaturases from Gossypium hirsutum, Solanum commersonii, Helianthus annus, Arabidopsis thaliana, Glycine max and Corylus avellana.
  • the coding region of the cDNA was cloned in a yeast expression vector and expressed in S. cerevisiae.
  • the punicic acid desaturase produced in the yeast should convert added linoleic acid into punicic acid. This in turn should be detected in hydrolysed and transmethylated lipid extracts using GC and GC / MS as methyl esters.
  • PuFADX in addition to PuFADX, the ⁇ -12 desaturase PuFAD12 was expressed in yeast so that the yeast cells endogenously produce linoleic acid, which in turn can then be converted into punicic acid by the activity of PuFADX.
  • the latter should in turn be verified using GC and GC / MS.
  • the PuFADX cDNA was cut out from the vector pGEM-T by restriction digestion with HindIII / BamHI, cloned into the HindIII / BamHI cut shuttle vector pYES2 (Invitrogen, Carlsbad, USA) and the resulting vector pYES2-PuFADX in E. coli XLl blue transformed.
  • pYES2-PuFADX was transformed using the LiAc method into S. cerevisiae INCScl (Invitrogen, Carlsbad, USA), where the expression of the PuFADX cDNA was under the control of the GALl promoter.
  • the PuFADl2 cDNA was first cut out of the vector pGEM-T by restriction digestion with Sall / HindHI, and the shuttle vector pESC-Leu (Stratagene) cut in the Sall / HindHI. cloned and the resulting vector pEST-Leu-PuFADX transformed into E. coli XLl blue. pYES2-PuFADl2 was transformed using the LiAc method in S. cerevisiae INCScl (Invitrogen, Carlsbad, USA), where the expression of the PuFADl2 cDNA was under the control of the GALl promoter.
  • a main culture was inoculated with the washed cells to an ODgoo of 0.1 to 0.3.
  • the main culture was grown in 25 ml of SD medium with 2% (w / v) galactose, amino acid solution without histidine, 0.02% linoleic acid (2% stock solution in 5% Tergitol NP40), 10% Tergitol NP40 for 72 hours 30 ° C.
  • the main culture was harvested by centrifugation. The cell pellet was frozen at -20 ° C. and then lyophilized for approx. 18 h.
  • PuFADl2 was expressed analogously, with the following differences: it was not selected for histidine but for leucine prototrophy, the volume of the main culture was 50 ml, the culture conditions of the main culture were 240 h at 16 ° C.
  • linoleic acid e.g. Oleic acid, cis-vaccenic acid, trans-vaccenic acid, gamma-linolenic acid, alpha-linolenic acid.
  • PuFADX2 was expressed in yeast.
  • Example 5 Lipid extraction of the fatty acids from transgenic yeast and GC or GC / MS analysis
  • the lyophilized yeast cells were extracted into 1.35 ml of methanol / toluene 5 (2: 1) and 0.5 ml of sodium methoxide solution.
  • the injection temperature was 220 ° C.
  • the following temperature gradient was applied: 1 min 150 ° C, 150 ° C to 200 ° C (15 ° C / min), 200 ° C to 250 ° C (2 ° C / min), 5 min 250 ° C.
  • the FAME was detected using a flame ionization detector (FID) at 275 ° C.
  • the retention times of Octadecakonjutrien FAME are 16.6
  • FIG. 2 shows the production of punicic acid in yeast cells which have been transformed with the punicic acid desaturase from Punica granatum.
  • 2A shows the gas chromatogram of the lipid extracts from yeast cells which were transformed with the empty vector pYES2. The cells were described as in Example 4
  • Example 4 shows the gas chromatogram of the lipid extracts from yeast cells transformed with pYES2-PuFADX. The cells were again as in Example 4
  • 2D shows the mass spectrum of the compound which, according to GC with an HP-5 column, has a retention time of 16.4 min.
  • the mass spectrum clearly identified the compound as the methyl ester of an octadecakonjutriene.
  • FIG. 3 shows the formation of octadecakonjutetraen fatty acids in yeast cells, which were transformed with the punicic acid desaturase from Punica granatum and grown with ⁇ -linolenic acid as described in Example 4.
  • FIG. 3A shows the gas chromatogram of the lipid extracts from control cells which were transformed with the empty vector pYES2. The cells were Tightened with 0.02% ⁇ -linolenic acid at 72 ° C for 72 hours. The gas chromatogram shows no FAME with a retention time of octodeconjutetraen fatty acids (17.0 - 17.4 min).
  • 3B shows the gas chromatogram of the lipid extracts from yeast cells transformed with pYES2-PuFADX. The cells were again grown as described in Example 4 for 72 hours at 30 ° C. with 0.02% ⁇ -linolenic acid. The gas chromatogram has clear peaks with retention times of 17.0 min and 17.4 min, which do not occur in the control batch (see FIG. 3A) and the same retention time as 18: 4 (6Z, 9Z, 11E, 13Z) having.
  • results shown in FIG. 3 show that punicic acid desaturase in yeast converts ⁇ -linolenic acid to octadecakonjutetraen fatty acids.
  • ⁇ -linolenic acid did not lead to the formation of octadecaconjutetraenes (not shown).
  • the octa-decakonj-utetraenes mentioned are incorporated in lipids in yeast, mainly in phospholipids.
  • 4 shows the formation of linoleic acid in yeast cells which have been transformed with the ⁇ -12-desaturase from Punica granatum.
  • 4B shows the gas chromatogram of the lipid extracts from yeast cells transformed with pESC-PuFADl2. The cells were again grown as described in Example 4 for 240 hours at 16 ° C.
  • the gas chromatogram has a clear peak with a retention time of 10.75 min, which does not occur in the control batch (cf. FIG. 4A) and has the same retention time as linoleic acid (cf. FIG. 4C).
  • the oleic acid content is 85%, which is 15% lower than in control yeast cells.
  • the expression of the punicic acid desaturase from Punica granatum in transgenic plants is advantageous in order to increase the punicic acid content in these plants.
  • the PuFADX or PuFADX2 cDNA were cloned into binary vectors and transferred via Agrobacterium-mediated DNA transfer into Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Brassica napus and Linum usitatissimum.
  • the expression of the CalDes cDNA was under the control of the constitutive CaMV 35 S promoter or the seed-specific USP promoter.
  • Arabidopsis is particularly suitable as a model plant because it has a short generation time and sufficient amounts of linoleic acid, the substrate of PuFADX or PuFADX2 for the production of punicic acid, and also ' sufficient amounts of oleic acid, the
  • PuFADX substrate for conjugated fatty acids such as CLA.
  • Tobacco and high linoleic acid varieties of linseed are particularly suitable as oilseeds with a high content of linoleic acid for the heterologous expression of PuFADX or PuFADX2, since linoleic acid is the substrate of PuFADX or PuFADX2 to form punicic acid E ⁇ - dars e-llt.
  • Rapeseed is particularly suitable as an oilseed with a high content of oleic acid in order to convert and accumulate fatty acids such as CLA by conjugating expression of PuFADX or PuFADX2 oleic acid. Furthermore, an increase in the linoleic acid content can be achieved by expression of PuFADl2 in rapeseed and the accumulation of punicic acid can be achieved by coexpression of PuFADl2 and PuFADX or PuFADX2.
  • the expression vectors were the vector pBinAR (Höfgen and Will itzer, Plant Science, 66, 1990: 221-230) and the pBinAR derivative pBinAR-USP, in which the CaMV 35 S promoter was exchanged for the USP promoter from V. faba was used.
  • the vectors pGPTV and pGPTV-USP were also used.
  • the CalDes cDNA had to be cut out of the vector pGEM-T and cloned into pBinAR or pBinAR-USP.
  • Leaf fragments with transformed A. tumefaciens cells from linseed and rapeseed by coculturing hypocotyl pieces with transformed A. tumefaciens cells.
  • the napin promoter can also be used to achieve seed-specific expression of PuFADX, PuFADX2 and PuFADl2.
  • the full-length cDNAs of PuFADX and PuFADX2 were amplified with the primers M and N for expression in plants under the control of the USP promoter and the OCS terminator. This was done using the Expand High Fidelity PCR system (Röche Diagnostics).
  • Primer M 5 '- GGA TCC ATG GGA GCT GAT GGA ACA ATG TCT C - 3' Forward Primer (with BamHI interface) '
  • PCR approaches are composed as follows:
  • the PCR was carried out according to the following program:
  • the PCR products were cloned into the vector pUC19-USP-OCS2 via the built-in interfaces and transformed into E. coli XLI blue cells.
  • the insert DNA was double-stranded sequenced with a 373 DNA sequencer (Applied Biosystems).
  • the expression cassette USP-PuFADX-OCS or USP-PuFADX2-0CS
  • the expression cassette was cut out with the restriction enzymes Sacl.
  • T4 polymerase Treatment with T4 polymerase to produce blunt ends and ligation in pPTV-bar (HindII cut, also with blunt ends by T4 polymerase), the construct pPTV-bar-USP-PuFADX-OCS-DNA was generated.
  • PuFADX2 The construct for PuFADX2 was created analogously. This plasmid was transformed into competent Agrobacterium cells (Agrobacterium tumefaciens EHA105) and tobacco plants ⁇ Nicotiana tabacum SRI) were transformed according to a standard method (Horsch et al. (1985) Science, 269, 1985: 1229-1231) and transgenic tobacco plants were regenerated.
  • the seeds of transgenic plants were harvested and 10 mg of seeds were homogenized in 405 ⁇ l methanol: toluene (2: 1) and treated with 150 ⁇ -1 0.5 M Na Metfeoxid-ex-fer ⁇ -h-iert Bas Seed material was ground as finely as possible and then incubated for 20 min at room temperature with shaking. Then 0.5 ml IM NaCl solution and 0.5 ml n-heptane were added and incubated for 5 minutes at room temperature for extraction. After separation of the fibers by centrifugation (10 min, 4000 rp, 4 ° C.), the heptane supernatant was transferred to a reaction vessel and evaporated under nitrogen. The residue was taken up in 3 times 300 ⁇ l of hexane and again evaporated under nitrogen. The residue was taken up in 40 ⁇ l MeCN and the sample was analyzed by GC or GC / MS.
  • FIG. 5 shows the production of punicic acid in tobacco seeds which have been transformed with the punicic acid desaturase (PuFADX) from Punica granatum.
  • the experiments with PuFADX2 gave the same results.
  • FIG. 5 show that punicic acid desaturase leads to the formation of punicic acid in tobacco plants. Since the fatty acids in tobacco seeds are largely bound in triacylglycerides, it must be assumed that the majority of the detected punicic acid was bound in the triacylglycerides in the tobacco seeds.
  • Figure 5.A shows the control without the PuFADX desaturase.
  • Figure 5. B represents the synthesis of punicic acid using PuFADX desaturase.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Fettsäure-Desaturasen aus Granatapfel (Punica granata), zugehörige Aminosäuresequenzen und diese kodierende Polynucleotidsequenzen, ihre Verwendung bei der Herstellung von Vektoren und transgenen Organismen sowie Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren.

Description

Fettsäure-Desaturase-Gene aus Granatapfel und Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsauresequenzen; Nukleinsaurekonstrukte, Vektoren und Organismen enthaltend die Nukleinsauresequenzen, Nukleinsaurekonstrukte und/oder Vektoren. Außer- dem betrifft die Erfindung Fettsäuregemische sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Verwendung.
Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem ob es sich um freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt . Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Sonnenblume und weiteren gewonnen, wobei sie in' der Regel in Form ihrer Triacylglyceride anfallen. Sie werden aber auch vorteilhaft aus Tieren wie Fischen gewonnen. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung hergestellt.
Je nach Anwendungszweck sind Öle mit gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bevorzugt, so sind z.B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren speziell mehrfach ungesättigten Fettsäuren bevorzugt, da sie einen positiven Ein- fluss auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Mög- lichkeit einer Herzerkrankung haben. Sie finden in verschiedenen diätetischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.
Besonderes wertvolle und gesuchte ungesättigte Fettsäuren sind die sogenannten konjugierten ungesättigten Fettsäuren wie die konjugierte Linolsäure. Für konjugierte Fettsäuren sind eine Reihe positiver Effekte nachgewiesen worden, so reduziert die Verabreichung von konjugierter Linolsäure das Körperfett in Mensch und Tier bzw. erhöht den Futterumsatz in Körpergewicht bei Tieren (WO 94/16690, WO 96/06605, WO 97/46230, WO 97/46118) . Durch Gabe von konjugierter Linolsäure lassen sich auch beispielsweise Allergien (WO 97/32008) oder Krebs (Banni et al . , Carcinogenesis, Vol. 20, 1999: 1019-1024, Thompson et al., Cancer, Res . , Vol. 57, 1997: 5067-5072) positiv beeinflussen.
Die chemische Herstellung konjugierter Fettsäuren beispielsweise Punicinsäure oder konjugierter Linolsäure wird in US 3,356,699 und US 4,164,505 beschrieben. Punicinsäure kommt natürlich in Punica granatum vor (El-Shaarawy und Nahapetian, Fette Seifen Anstrichmittel, 85, 1983: 123-126; Melgarejo et al . , Sei. Food Agric . , 69, 1995, 253-256; Melgarejo und Artes, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80, 1452-1454). Konjugierte Linolsäure findet sich beispielsweise in Rindfleisch (Chin et al., Journal of Food Cbmposition and Analysis, 5, 1992: 185-197), in Milch (Dhiman et al., Journal of Dairy Science, 1999, 82, 2146-56) und Milchprodukten.
Biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Punicinsäure liegen nicht vor, wohl aber zur Biosynthese von Calendulasäure (Crombie et al . , J. Che . Soc. Chem. Commun. , 15, 1984: 953-955 und J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1985: 2425-2434; Fritsche et al., FEBS Letters, 462, 1999, 249-253; Cahoon et al . , J. Biol . Chem., 276, 2001, 2637-2643; Qiu et al . , Plant Physiology, 125, 2001, 847-855). Demnach erfolgt die Biosynthese von konjugierten Fettsäuren wie Calendulasäure, Eleostearinsäure oder Punicinsäure über die Desaturierung von Ölsäure zu Linolsäure durch eine Δ-12-Desaturase und einer weiteren Desaturierung, verbunden mit einer Umlagerung der Doppelbindung zur Konjutrien Fettsäure durch -eine spezifische Konjutrien-bildende Desaturase. Neben der Herstellung konjugierter Calendulasäure wird von Qiu et al . , (Plant Physiology, 125, 2001, 847-855) auch die Herstellung von konjugierte Linolsäure durch die enzymatische Aktivität der Desaturase beschrieben. Von Nachteil ist bei dieser Nebenaktivität jedoch, • dass durch die enzymatische Wirkung das unerwünschte 8,10-Isomer der konjugierten Linolsäure entsteht.
Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften hat e's in der Ver- gangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der
Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase beschrieben. In WO 93/11245 wird eine
Δ-15-Desaturase in WO 94/11516 wird eine Δ-12-Desaturase beansprucht. Δ-6-Desaturasen werden in WO 93/06712 und WO 96/21022 beschrieben. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al . , J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al . , Nature 347, 1990: 200-203 5 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und charakterisieren sind (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 10 1981: 12141-12147, Wang et al . , Plant Physiol. Biochem. , 26, 1988: 777-792) .
In Hefen konnte sowohl eine Verschiebung des Fettsäurespektrums zu ungesättigten Fettsäuren hin als auch eine Steigerung der
15 Produktivität nachgewiesen werden (siehe Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659, Napier et al., Biochem. J. , Vol. 330, 1998: 611-614) . Die Expression der verschiedenen Desaturasen in trans- genen Pflanzen zeigte allerdings nicht den gewünschten Erfolg. Eine Verschiebung des Fettsäurespektrum zu ungesättigten Fett- 0 säuren hin konnte gezeigt werden, gleichzeitig zeigte sich aber, dass die Syntheseleistung der transgenen Pflanzen stark nachließ, das heißt gegenüber den Ausgangspflanzen konnten nur geringere Mengen an Ölen isoliert werden.
5 Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen Genen, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese ungesättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese und speziell konjugierte ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren und in einem technischen Maßstab herzustellen. 0
Es bestand daher die Aufgabe weitere Desaturasen für die Synthese ungesättigter konjugierter, Fettsäuren zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäuresequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit einer Desaturaseaktivität 5 codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, oder
0 b) Nukleinsauresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder
5 c) Derivate der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ . ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 75 % Identität auf Aminosäureebene auf- weisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:
a) Einbringen mindestens einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors (beides wird weiter unten beschriebenen) in. einen Öl produzierenden Organismus;
b) Anzucht dieses Organismus und
c) Isolierung des im Organismus enthaltenen Öls bzw. der im Organismus enthaltenen Triglyceride.
Die im Öl oder in den Triglyceriden enthaltenden Fettsäuren können nach dem Isolieren anschließend nach dem Fachmann bekannten Methoden saure oder alkalische Hydrolyse freigesetzt werden.
Für das erfindungsgemäße beschriebene Verfahren ist es vorteil- haft in den Organismus in Verfahrensschritt (a) zusätzlich mindestens eine weitere Nukleinsäure einzubringen, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Δ-5-Desaturase, einer Δ-6-Desaturase, einer Δ-8-Desaturase oder Δ-12-Desaturase, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, oder
c) Nukleinsauresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder d) Derivate der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist .
Für das beschriebene Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fett- säuren beispielsweise ungesättigten konjugierten Fettsäuren wie Punicinsäure beispielsweise aus Ölsäure ist neben der erwähnten Punicinsäure-Desaturase (= SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7, der Singular soll für die vorliegende Erfindung auch den Plural umfassen) eine weitere Δ-12-Desaturase wie die Δ-12-De- saturase mit SEQ ID NO: 5 vorteilhaft.
Die Bildung von Konjutrien Fettsäuren beispielsweise aus Ölsäure ist besonders vorteilhaft, da Ölsaaten wie Raps einen kostengünstigen und einfachen Zugang zu Konjutrien durch ihren hohen Gehalt an Ölsäure ermöglichen würden. Da sie aber nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen (Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678-81) ist die Verwendung der genannten Δ-12-Desaturasen zur Herstellung der Linolsäure vorteilhaft .
Unter Derivate (n) sind beispielsweise funktionelle Homologe des von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 kodierten Enzyms oder dessen enzymatischer Aktivität, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie das von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 kodierte Enzym katalysieren, zu verstehen. Diese Gene ermöglichen ebenfalls eine vorteilhafte Herstellung ungesättigter konjugierter Fettsäuren. Unter ungesättigten Fettsäuren sind im folgenden einfach und mehrfach ungesättigte Fettsäuren zu verstehen, deren Doppelbindungen konjugiert oder nicht konjugiert sein können. Die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 genannten Sequenzen kodieren für neue unbekannte Desaturasen, die an der Synthese von Punicinsäure in Punica granatum beteiligt sind. Die- Enzyme setzen bevorzugt (9Z,12Z) Octadeca- dien/Linolsäure zu (9Z,11E,13Z) Octadecakonjutrien/Punicinsäure um. Im folgenden werden sie als Punicinsäure-Desaturase (n) bezeichnet. Weitere Substrate dieser Enzyme sind beispielsweise γ-Linolensäure, die zu verschiedenen 18:4 Konjutetrensäure-Isome- ren umgesetzt wird (Fig. 3B) . Auch Ölsäure wird von den Enzymen umgesetzt. Es entsteht vorteilhaft 9cislltrans konjugierte Linol- säure Die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologiescreening verwendet werden.
5 Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen eukaryontischen Organismen wie Pflanzen wie Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Algen, Dinoflagellaten oder Pilze isolieren.
0 Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 genannten Sequenz beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die im Falle von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 mindestens 75 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, 5 besonders bevorzugt mindestens 85 % Homologie, ganz besonders bevorzugt 90 % Homologie aufweisen. Im Falle von SEQ ID NO: 5 weisen die Derivate eine Homologie von 90 %, bevorzugt 95 % besonders von 98 % auf. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet . Es wurde das Programm PileUp verwendet 0 (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Unter Homologie ist für die vorliegende Erfindung Identität zu verstehen. Beide Begriffe sind synonym. Die von den ~ genannten Nukleinsäuren abgeleiteten Ami nosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 6 oder SEQ ID NO: 8 zu entnehmen. 5 Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID No.l dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleib . 0
Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 beschriebenen DNA- Sequenz oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Euka- 5 ryonten wie oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen Desaturasegenen in dem Fachmann bekannterweise ermittelt 0 werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure : Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart 5 DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelz- te peraturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein- säure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von _ <=>r\ Länge, Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G +_C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al.
(eds) , 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Univer- sity Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Bio- logy: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenzen SEQ ID No: 2, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 beispielsweise euka- ryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Dele- tion(en) verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren kön- nen die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden. Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -2000 vor dem Startkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3 '-Ende verändert wurden.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsauresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Vorteilhaft kann das Punicinsäure-Desaturas'e-Gen im erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert werden. Insbesondere die Kombination mit der unter SEQ ID NO: 5 und 6 aufgeführten Δ-12-Desaturase ist vorteilhaft. Weitere vorteilhafte Sequenzen sind Desaturasesequenzen wie Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase- oder Δ-8-Desaturasesequenzen, Acetyltransferasesequenzen oder Elongasesequenzen.
Unter den erfindungsgemäßen Arninosäur.esequenzen sind Proteine zu verstehen, die eine in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die enzymatische Aktivität des in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht we- sentlich verändert wird. Diese nicht wesentlich veränderten Proteine sind daher noch enzymatisch aktiv, das heißt funktioneil. Unter nicht wesentlich verändert sind alle Enzyme zu verstehen, die noch mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 30 % der enzymatischen Aktivität des Ausgangsenzyms aufweisen. Oder deren enzymatische Aktivität im Vergleich zum Ausgangsenzym bzw. der Ausgangsaminosäuresequenz um mindestens 10 %, bevorzugt um 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 100 % gesteigert ist. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Ba- sizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucin- reste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Unter den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten oder -fragmenten sind die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 genannten Sequenzen, Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funk- tionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nuklein- säure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt) kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natür- liehe Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor das natürliche Gen zur Stei- er.υj3(j. der—ΛJtivität—gfibracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Das Calendulasäure- Desaturase-Gen kann in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lad<3-< T7-, T5-, T3-, gal-, tre-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-Pι,-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRPl [Ward et al., Plant.Mol. Biol .22 (1993 ) ] , SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Weitere vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispiels- weise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186) , ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al . , (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (W09321334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 5 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amido- transferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben 0 oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Fettbiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der usp-Promotor, der LEB4-Promotor, der Phaseolin-Promotor oder der Napin-Promotor. 5
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. 0
Im Nukleinsäurefragment (en) [= Genkonstrukt (en) , Nukleinsäure- konstrukt (en) ] können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in dis Organismen eingsbxÄ bJ"_w .en . aoJ.lsn, en a] ten..sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die erfindungsgemäßen Desaturase- Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese, die eine gesteigerte Synthese ermöglichen. Beispielsweise seien die Gene für die Δ-15-, Δ-12-, Δ-9-, Δ-6-, Δ-5-Desaturase, die verschiedenen Hydroxylasen, die Acetylenase, die Acyl-ACP-Thio- esterasen, ß-Ketoacyl-ACP-Synthasen oder ß-Ketoacyl-ACP-Reductasen genannt. Vorteilhaft werden die Desaturasegene im gleichen Nukleinsäurekonstrukt verwendet bevorzugt das Δ-12-Desaturase- gen, wie in Seq ID NO: 5 und 6 dargestellt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsaurekonstrukte werden zur Expression in einem WirtsOrganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUCl9, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, λgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBHO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBBllδ, in Hefen 2<=cM, pAG-1, YEpδ, YEpl3 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al . Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente.
Zur Erhöhuιαg^di?c.-Genkpienzah.l_>.önnen_ die Nukleinsauresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält . Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken .
Vorteilhafterweise enthalten die Nukleinsäurefragmente zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3 ' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptions- signale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt (der Singulat soll im folgenden auch den Plural umfassen) auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts- Organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz bestehen.
Vorteilhafterweise wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure- sequenz (der Singulat soll im folgenden auch den Plural umfassen) zusammen mit mindestens einem Reportergen in ei Nukleinsäure- konstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenz- assay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolu- mineszenzgene, ZucJer-- oder Nukleotids-tΛf,'fe«ιer,Jaselgi?.n-e oder Jlio- synthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das ß-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6- phosphat-Phosphatasegen, das ß-Glucuronidase-Gen, ß-Lactamase- gen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphospho- transferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz) -Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können. Der Wirtsorganismus enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts .
5 Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des Nukleinsäurekonstrukts oder des Vektors in Organismen beispielsweise Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
10 Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al . (1989) Molecular cloning: A laboratory anual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1,
15 (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al . (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzy ology, 1994, Academic Press entnehmen.
20 Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus - • Pflanzengeweben-©ds,'c_P-£la zjanzellen^-z- . transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten-
25 transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro- injektioή und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al.,
30 Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor
35 kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res . 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.
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Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen, insbesondere von Öl-haltigen Kulturpflanzen, wie
45 Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter, Blattstücke, Hypocotylstücke oder Wurzeln in einer Agrobakterien- lösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die Nukleinsaurekonstrukte oder die Vektoren eignen sich prinzipiell alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula, Punicaceae wie Punica granatum oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt . Bevorzugt werden Organismen, die -natürÜrsfe2-rττeise~Ö-le in gr-sßeren- Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Färbersaflor, Flachs, Calendula oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als WirtsOrganismen auch transgene Tiere beispielsweise C. elegans verwendbar.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung sind wie oben beschriebenen transgene Pflanzen, die eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäure oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt enthalten. Diese transgenen Pflanzen können auch einen Vektor, der eine erfindungsgemäße funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäure oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nuklein- säurekonstrukte enthält. Unter nicht funktionell ist im Gegensatz zu funktionell zu verstehen, dass kein enzymatisch aktives Protein mehr synthetisiert wird. Außerdem ist unter nicht funktionellen Nukleinsäuren oder Nukleinsäurekonstrukten auch eine sogenannte Antisense-DNA zu verstehen, die zu transgenen Pflanzen führt, die eine Reduktion der enzymatischen Aktivität oder keine enzymatischen Aktivität aufweisen. Dabei wird in der Regel eine Reduktion der enzymatischen Aktivität von 5 bis 100 %, bevorzugt von 10 bis 90 %, besonders bevorzugt von 20 bis 80 %, ganz besonders bevorzugt von 30 bis 70 % erreicht. Mit Hilfe der Antisense-Technik, speziell wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz mit anderen Fettsäuresynthesegene in der Antisense- DNA kombiniert wird, ist es möglich Öle und/oder Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren bzw. gesättigte Fettsäuren zu synthetisieren. Unter transgenen Pflanzen sind einzelne Pflanzenzellen und deren Kulturen auf Festmedien oder in Flüssigkultur, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu verstehen.
Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder die erfindungsgemäßen Nukleinsaurekonstrukte nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch, dass die Nukleinsäuren oder Expressionskassetten an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterolog-e Ex^es-sion de -SE kleinsäJir.en liegt vor. Bevorzugte transgene Organismen sind die oben genannten transgenen Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt in ihren funktioneilen oder nicht funktionellen Formen zur Herstellung von transgenen Pflanzen gehört deshalb auch zu den Erfindungsgegenständen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:
a) Einbringen mindestens einer nicht funktionellen Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens eines nicht funktionellen Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 4 oder eines Vektors, der derartige nicht funktionelle Nukleinsäuren oder Nukleinsaurekonstrukte enthält, in einen Öl produzierenden Organismus ;
b) Anzucht dieses Organismus und
c) Isolierung des im Organismus enthaltenen Öls bzw. der im Organismus enthaltenen Triglyceride. Aus den so erhaltenen Ölen und/oder Triglyceriden können die gesättigten Fettsäuren über dem Fachmann bekannte Verfahren freigesetzt werden. Die Freisetzung erfolgt dabei über eine sogenannte saure oder alkalische Hydrolyse der Esterbindungen. Die alkalische Hydrolyse beispielsweise mit NaOH oder KOH ist bevorzugt. Sollen die Alkylester wie die Methyl- oder Ethyl- ester der gesättigten oder wie weiter oben geschrieben der ungesättigten Fettsäuren hergestellt werden, so kann die Hydrolyse vorteilhaft mit den entsprechenden Alkoholaten durchgeführt werden .
Für die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Ölen und/ oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten oder gesättigten Fettsäuren und ggf. deren anschließender Frei- setzung über Hydrolyse werden als Organismen bevorzugt Pflanzen besonders bevorzugt Ölfruchtpflanzen oder Mikroorganismen verwendet .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuren, die für ein Protein codieren, das eine Fettsäure der allgemeinen Struktur I,
Figure imgf000017_0001
die zwei durch eine Methylengruppe voneinander getrennte Doppelbindungen aufweist, zu einer dreifach ungesättigten Fettsäure der allgemeinen Struktur II
Figure imgf000017_0002
umsetzt, wobei die drei Doppelbindungen der Fettsäure in Konjugation sind und wobei die Substituenten und Variablen in den Verbindungen der allgemeinen Struktur I und II folgende Bedeutung haben:
R1 = Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigte oder gesättigtes, verzweigtes oder uήverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-,
Figure imgf000017_0003
R2 = substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigtes oder gesättigtes Ci-Cg-Alkyl-
R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-C 2-Alkylcarbonyl- oder Phospho-,
n = 1 bis 14, bevorzugt 1 bis 8, besonders bevorzugt 4 bis 7, ganz besonders bevorzugt 7.
R1 bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigte oder gesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, oder
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl , 2-Methylbutyl , 3-Methylbutyl , 2,2-Dimethylpropyl , 1-Ethylpropyl , n-Hexyl, 1 , 1-Dimethylpropyl , 1, 2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl, 1, 2-Dimethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl, -2,3-Dirnethylbutyl-, ■.-3-, 3-D-i-methyl-butyl , l--=Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl , 1, 1, 2-Trimethylpropyl, 1,2, 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt .
' Bevorzugte Reste für R1 sind Wasserstoff und
-CHir2 I I
0 o R3
R2 bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II substi- tuiertes oder unsubstituiertes, ungesättigtes oder gesättigtes Ci-Cg-Alkyl-,
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Ci-Cg-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2 , 2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl , n-Hexyl , 1 , 1-Dimethylpropyl , 1 , 2-Dimethylpropyl , 1-Methylpentyl , 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl , 4-Methylpentyl, 1, 1-Dimethyl- butyl, 1, 2-Dimethylbutyl, 1 , -Dimethylbutyl , 2, 2-Dimethylbutyl, 2 , 3-Dirnethylbutyl , 3,3-Dirnethylbutyl , 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl , 1,1, 2-Trimethylpropyl , 1,2, 2-Trimethylpropyl , 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl oder n-Nonyl genannt. Bevorzugt ist Ci-Cs-Alkyl, besonders bevorzugt ist C4- und Cs-Alkyl, ganz besonders bevorzugt ist der Butyl-Rest.
R3 und R4 bezeichnen unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι~C -Alkylcarbonyl- oder Phospho- .
Wobei unter Cι-C -Alkylcarbonyl Reste wie Methylcarbonyl ,
Ethylcarbonyl , n Propylcarbonyl, 1 Methylethyl carbonyl, n Butyl- carbonyl, 1 Methylpropylcarbonyl, 2 Methylpropylcarbonyl, 1,1 Di- methylethylcarbonyl , n Pentylcarbonyl, 1 Methylbutylcarbonyl, 2-Methylbutylcarbonyl, 3 Methylbutylcarbonyl, 1,1 Dimethylpropyl- carbonyl, 1,2 Dimethylpropylcarbonyl, 2,2 Dimethylpropylcarbonyl,
1 Ethylpropylcarbonyl, n Hexylcarbonyl , 1 Methylpentylcarbonyl,
2 Methylpentylcarbonyl, 3 Methylpentylcarbonyl, 4 Methylpentylcarbonyl, 1,1 Dimethylbutylcarbonyl , 1,2 Dirnethylbutylcarbonyl, 1,3 Dimethylbutylcarbonyl, 2,2 Dimethylbutylcarbonyl, 2,3 Di- methylbutylcarbonyl, 3,3 Dimethylbutylcarbonyl, 1 Ethylbutyl- carbonyl, 2 Ethylbutylcarbonyl, 1,1,2 Trimethylpropylcarbonyl, 1,2,2 Trimethylpropylcarbonyl, 1 Ethyl 1 methylpropylcarbonyl und -1 Ethyl 2 methylpropylca-r-bonyl, Heptylcarbony-l_,^-.Norιylcarbonyl, Decylcarbonyl , Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl , n-Tridecyl- carbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexa- decylcarbonyl , n-Heptadecylcarbonyl , n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl oder n-Eicosylcarbonyl zu verstehen sind.
Bevorzugte Substituenten für R3 und R4 sind gesättigtes oder ungesättigtes Cιs-C2 -Alkylcarbonyl.
Als Substituenten der genannten Reste seien beispielsweise Halogen wie Fluor oder Chlor, Alkyl oder Hydroxyl genannt.
Bei der Umsetzung mit dem erfindungsgemäßen Protein bzw. Enzym wird eine Doppelbindung in die Fettsäure eingeführt und eine Doppelbindung verschoben, so dass die an der Reaktion beteiligten drei Doppelbindungen in Konjugation liegen. Weiterhin wird ein Doppelbindung isomerisiert (von eis zu trans) .
Das Enzym (= Punicinsäure-Desaturase) katalysiert vorteilhaft die Umsetzung von Linolsäure (18:2, 9Z,12Z) zu Punicinsäure (18:3, 9Z,11E,13Z). Das Enzym führt eine cis-Doppelbindung an Position Cχ3 ein und bewirkt die spezifische Verschiebung einer cis-Doppel- bindung in Position Cχ2 zu einer trans-Doppelbindung in Position Cn, wobei die Isomerisierung regiospezifisch erfolgt. Die Reaktion erfolgt wahrscheinlich zunächst über eine 1,4 Eliminierung und eine nachfolgende 11,14 Desaturierung. Als Substrat kommt auch γ-Linolensäure (18:3, 6Z,9Z,12Z) in Frage, diese wird dann zum entsprechenden Konjutetraen (18:4, 6Z, 9Z, 11E, 13Z) umge- setzt.
Weiterhin kommen auch Ölsäure (18:1, 9Z) und Vaccensäure (18:1, HZ) als Substrat in Frage, die dann zu konjugierter Linolsäure umgesetzt wird. Es entsteht bei der Umsetzung vorteilhaft bevor- zugt das 9c s, llt ns-Isomer .
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuregemischen mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass man min- destens eine oben beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure- konstrukt in einen bevorzugt Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und das in dem Organismus enthaltene Öl und/oder Triglycerid isoliert und die im Öl und/oder Triglycerid enthaltenden Fettsäuren freisetzt.
Auch ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden -mit einem -erhöhten- Gehaite- an ungesättigten Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine oben beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert, gehört zu den Erfindungsgegenständen.
Beide Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Synthese von Fettsäuregemischen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an Punicinsäure .
Weitere erfindungsgemäße Gegenstände sind ein Verfahren zur Herstellung von gesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine nicht funktionelle oben genannte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein nicht funktionelles erfindungsgemäßes 'Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht, dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert und die im Öl enthaltenden Fettsäuren freisetzt und ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens . eine nicht funktionelle oben genannte 'erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein nicht funktionelles erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert. Für diese beiden Verfahren wird die sogenannte Antisense-Technologie verwendet (siehe oben) .
Als Organismen für die genannten Verfahren seien beispielhaft Pflanzen wie Arabidopsis, Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyce's , Algen oder
Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Öl- palme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Punica, . Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Calendula, Punica oder Saccharomyces cerevisiae.
Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach
Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen -Medium-, das eine Kohlenstof-f-quelle -meist in Form-v-en—Zuckern- eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoff- quellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, 'Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert werden.
Pflanzen werden nach Transformation zunächst wie oben beschrieben regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. angebaut.
Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei
Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Über- schuss an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Über- schuss von Lösungsmittel zu Biomasse von 1:4. Das Lösungsmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem C02 erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.
Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über Säulen ist möglich.
Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicherweise verseift.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Fettsäuregemische mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren sowie Öle und/oder Trigylceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, die nach den oben genannten Verfahren hergestellt wurden sowie deren Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika. Hierzu werden diese den Nahrungsmitteln-,—dem Tiorfutter,-~den Kosmetika oder Pharmazeutika in üblichen Mengen zugesetzt.
Die Erfindung wird im Folgenden an Beispielen erläutert:
Beispiele
Über RT-PCR und RACE-Techniken wurde aus mRNA von Punica granatum eine cDNA kloniert. Bei Expression dieser cDNA in Hefe wird Linolsäure in das Octadecakonjutrien Punicinsäure (9Z,11E,13Z) umgesetzt. Es handelt sich hierbei unseres Wissens nach um die erstmalige Beschreibung einer Punicinsäure-Desaturase. Das Enzym bewirkt eine regiospezifische Verschiebung einer cis-Doppel- bindung in Position Cχ2 zu einer trans-Doppelbindung in .Position Cn und führt eine neue cis-Doppelbindung an Position Cχ3 ein. Weiterhin wurde eine cDNA kloniert, die für eine funktionale Δ-12-Desaturase codiert.
Transgene Hefen und Pflanzen mit erhöhter Expression der Punicin- säure-Desaturase-cDNA weisen Punicinsäure in ihren Lipiden auf. Die Synthese von Punicinsäure kann erhöht werden durch zusätzliche Expression einer Δ-12-Desaturase, die zu einer Erhöhung des Gehaltes an Linolsäure führt, die wiederum das Substrat für Punicinsäure-Desaturase darstellt . Beispiel 1: RNA-Isolierung aus Samen von Punica granatum
Aus Punica granatum-Samen wurde nach der in Fritsche et al . (FEBS Letters, 462, 1999, 249-253) beschriebenen Methode RNA isoliert. Folgende Schritte wurden dabei modifiziert: Nach der 18stündigen Zentrifugation und Waschen des Pellets mit 70%igen Ethanol, erfolgte die anschließende Extraktion anstelle von 15 min für 1 h bei 65°C im Wasserbad, mit Vortexen alle 10 min. Die mRNA wurde mit dem Poly-Attract-Kit von Promega nach Hersteller-Angaben aus 3 mg Gesamt-RNA isoliert . Die Herstellung von ss-cDNA erfolgte mit Oligo (dT) -Primer, Superscript II von Gibco-BRL nach Herstellerangaben aus 1 μg mRNA. Diese ss-cDNA wurde als Template in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt.
Beispiel 2 : Isolierung und Klonierung der Punicinsäure-Desaturase und der Δ-12-Desaturase aus Punica granatum •
Um DNA-Sequenzen aus Punica granatum zu isolieren, die für eine Punicinsäure-Desaturase und für eine Δ-12-Desaturase kodieren, wurden verschiedene degenerierte Oligonukleotidprimer von Aminosäure-Sequenzen der konservierten Histidin-Boxen verschiedener Δ-12-Desaturasen abgeleitet.
Primer A: 5 " - TGG GTI AWH GCH GAY GAR' GB GG - 3 ' Forward primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz W V I A H E C
Primer B: 5 - GGC ATI GTI GAR AAS ARR TGR TGV AGY MAC - 3 λ Reverse primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz V T/A H H L F S T I
Primer C : 5 x - CCD TAY TTC TCI TGG AAR WWH AGY CAY CG - 3 λ Forward primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz P Y F S W K Y/I S H R
Primer D: 5' - CCA RTY CCA YTC IGW BGA RTC RTA RTG - 3' Reverse primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz H Y D S S/T E W D/N W Die Buchstaben in Primer A, B, C und D haben folgende Bedeutung:
R = A/G Y = C/T W = A/T H = A/C/T B = C/G/T D = A/G/T I = Inositol
In einer PCR mit Punica-Einzelstrang-cDNA (hergestellt nach Beispiel 1) als Template wurden mit den Primerkombinationen A/B und A/D ein DNA-Fragmente amplifiziert . Für die Amplifikation wurde die Tfl-Polymerase von Biozym eingesetzt.
Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:
dNTP-Mix (10 mM) 0,5 μl
Forward Primer (10 μM) 2,5 μl
Reverse Primer (10 μM) 2,5 μl
Template (ss-DNA) 1,0 μl
20 x Tfl-Puffer 1,25 μl
MgC12.-C.25 mM) 2_5 μl
Tfl-Polymerase (1 U/μl) 0,25 μl
Wasser 14,5 μl
Gesamtvolumen 25,0 μl
Es wurde folgendes PCR-Programm verwendet :
1. 2 min 94°C
2. 30 sec ■ 94°C
3. 45 sec 50°C (Bindungstemperatur)
4. 1 min 72°C
5. 10 x 2. bis 4. 6. 0 sec 94°C
7. 45 sec 50°C
8. 1 min 72°C, Zeitincrement 5 sec pro Zyklus
9. 20 x 5. Bis 7.
10. 2 min 72°C
Bei den Primerkombinationen A/B und A/D wurden PCR-Fragmente erhalten. Diese wurden aus einem präparativem Agarosegel ausgeschnitten, mit GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Pharmacia Biotech eluiert und in pGEM-T-Vector- System (Promega) nach Herstellerangaben kloniert. Voneinander verschiedene Klone wurden mit M13-Primern sequenziert. Die Sequenzen dieser ca. 570 bp langen PCR-Produkte sind SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 4 zu entnehmen.
Beispiel 3 : Gewinnung und Sequenzierung vollständiger cDNA-Klone
Um Vollängen-Klone zu erhalten, wurde die Fragmente SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 4 mittels 5X- und 3λ- RACE (rapid amplification of cDNA ends) verlängert. Ausgehend von 1 μg mRNA (isoliert nach Beispiel 1) wurde mit dem "Marathon cDNA Amplification Kit" von CLONTECH (Heidelberg) eine "Marathon cDNA-Bank" nach Herstellerangaben erstellt.
Die 5'- und S'-RACE-PCR wurde mit dem Advantage cDNA PCR-Kit von Clontech nach Herstellerangaben mit folgenden genspezifischen RACE-Primern durchgeführt:
Primer E : 5 r - ACG GAA CGA GGA GCG CTG AGT G - 3 λ Spezifische Primer für 5' -RACE von Punicinsäure-Desaturase
Primer F: 5λ - CTG ATC GTG AAC GCA TTC CTG G - 3V
Spezifischer Primer für 3' -RACE von Punicinsäure-Desaturase
rrimer G:-£ -— GGG-A-GG-AGG- AGC GAT GTG TGG AG - 3 Spezifischer Primer für S'-RACE von Δ-12-Desaturase
Primer H: 5 - AGT CCT CAT ATT AAA TGC ATT CGT GG - 3 Spezifischer Primer für 3λ-RACE von Δ-12-Desaturase
Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:
dNTP-Mix (10 mM) 1,0 μl
RACE-Primer (10 μM) 1,0 μl
Adaptor-Primer (10 μM) 1,0 μl
Template 1,0 μl (1:50 verdünnte Marathon-cDNA-Bank)
10 x Puffer 5,0 μl
Polymerase (1 U/μl) 1,0 μl Wasser 38,5 μl
Gesamtvolumen 50,0 μl Die RACE-PCR erfolgte nach folgendem Programm:
1. 1 min 94°C
2. 30 sec 94°C
3. 3 min 68°C
4. 10 x 2. - 3.
5. 30 sec 94°C
6. 30 sec 65°C
7. 3 min 68°C
8. 25 x 4. - 6.
9. 5 min 68°C
Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden wie in Beispiel 2 beschrieben aus einem präparativem Agarosegel ausgeschnitten, mit GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Pharmacia Biotech eluiert und in pGEM-T-Vector-System (Promega) nach Herstellerangaben kloniert und sequenziert. Die 5 v-RACE-Produkte reichten über das Startkodon in den 5 '-nicht-translatierten-Bereich (5X-UTR), die 3 λ -RACE-Produkte über das Stopkodon in den 3λ-UTR hinein. In SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 sind die zusammengesetzten DNA-Sequenzen der Punicinsäure-Desaturasen und der Δ-12-Desaturase dargestellt. Die Sequenzen umfassen den kodierenden Bereich—sowie einen Abschnitt, des—^5 * -UT-R—und 3'--τJTPv.
Der kodierende Bereich von SEQ ID NO: 2 (Punicinsäure- Desaturase, PuFADX) reicht von Nukleotid 131 bis 1252, der von SEQ ID NO: 5 (Δ-12-Desaturase) von Nukleotid 94 bis 1254 und der von SEQ ID NO: 7 (Punicinsäure-Desaturase, PuFADX2 ) von Nukleotid 1 bis 1188.
Um durchgängige Volllängen-Klone zu erhalten, wurden die kodierenden Bereiche der Punicinsäure-Desaturasen und der Δ-12-Desaturase amplifiziert und kloniert. Dies erfolgte mit dem Expand High Fidelity-PCR-System (Röche Diagnostics) und den Primern I und J für Punicinsäure-Desaturasen bzw. den Primern K und L für delta-12-Desaturase sowie mit Punica-cDNA als Template.
Primer 1: 5' - AAG CTT ATG GGA GCT GAT GGA ACA ATG TCT C - 3 v Forward Primer (mit Hindlll-Schnittsteile)
Primer : 5 λ - GGA TCC ATT CAG AAC TTG CTC TTG AAC CAT AG - 3 Reverse Primer (mit BamHI-Schnittstelle)
Primer K: 5 - GTC GAC ATG GGA GCC GGT GGA AGA ATG AC - 3 λ - Forward Primer (mit Sall-Schnittstelle) Primer L : 5 - AAG CTT TGA TCA GAG GTT CTT CTT GTA CCA G - 3 ' Reverse Primer (mit Hindlll-Schnittsteile)
Die PCR-Ansätze setzten sich wie folgt zusammen:
dNTP-Mix (10 mM) 1 0 μl Forward-Primer (10 μM) 4, 0 μl Reverse-Primer (10 μM) 4, 0 μl Template 3, 0 μl (1:50 verdünnte Marathon-cDNA-Bank)
10 x Puffer 2 5,0 μl
Polymerase (3,5 U/μl) 0,5 μl Wasser 32,5 μl
Gesamtvolumen 50,0 μl
Die PCR erfolgte nach folgendem Programm:
1. 2 min 94°C
2. 30 sec 94°C
3. 30 sec 58°C
4. 1 min 72°C
5. 10 x 2. - 4.
.6- 3-0 sec . 94°0
7. 30 sec 58°C
8. 1 min 72°C, Zeitinkrement 5 sec pro Zyklus
9. 15 x 5. - 7.
10. 5 min 72°C
Die PCR-Produkte mit einer Länge von 1,2 kb wurden in den Vektor pGEM-T (Promega, Mannheim) kloniert und in E. coli XLl blue Zellen transformiert. Die Insert-DNA wurde mit einem 373 DNA- Sequencer (Applied Biosystems) doppeisträngig sequenziert und war jeweils identisch mit den kodierenden Bereichen von den Punicinsäure-Desaturasen (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7) und der Δ-12-Desaturase (SEQ ID NO: 5) .
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von PuFADX (SEQ ID NO: 2) mit annotierten Proteinsequenzen der SWISS-PROT und SP-TREMBL-Datenbanken ergab die höchste Homologie zu einer Δ-12-Desaturase aus Solanum commersonii (60. % identische Aminosäuren) , einer Δ-12-Desaturase aus Corylus avellana (60 % identische Aminosäuren) und einer Ω-6 Fettsäure Desaturase aus Baumwolle (58 % identische Aminosäuren) über den gesamten kodierenden Bereich. Fig. 1A zeigt einen Vergleich der Aminosäure-Sequenzen von PuFADX mit Δ-12-Desaturasen aus Gossypium hirsutum, Solanum commersonii, Helianthus annuus, Arabidopsis thaliana, Glycine max und Corylus avellana.
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von PuFADl2 (SEQ ID NO: 5) mit annotierten Proteinsequenzen aus SWISS-PROT und SP-TREMBL-Datenbanken ergab die höchsten Homologien zu Δ-12-Desaturasen aus Sesamum indicum (78 % identische Aminosäuren) , aus Corylus avellana (78 % identische Aminosäuren) und aus Solanum commersonii (77 % identische Aminosäuren) . Fig. 1B zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von PuFADl2 mit Δ-12-Desaturasen aus Gossypium hirsutum, Solanum commersonii, Helianthus annus, Arabidopsis thaliana, Glycine max und Corylus avellana.
Ein Vergleich der- abgeleiteten Aminosäuresequenz von PuFADX2 (SEQ ID NO: 7) mit annotierten Proteinsequenzen aus SWISS-PROT und SP-TREMBL-Datenbanken ergab die höchsten Homologien zu Δ-12-Desaturasen aus Gossypium hirsutum (59 % identische Aminosäuren) , aus Corylus avellana (58 % identische Aminosäuren) und aus Solanum commersonii (58 % identische Aminosäuren) . Fig. IC zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von PuFADX2 (= SEQ ID NO: 7) mit Δ-12-Desaturasen aus Gossypium hirsutum, Solanum commersonii und Corylus avellana- und mit—PuFADX (= SEQ ID NO : 2 ) .
Beispiel 4: Expression der Punicinsäure-Desaturase und der Δ-12-Desaturase in Hefe
Um die Funktionalität von PuFADX nachzuweisen, wurde in einem ersten Ansatz der kodierende Bereich der cDNA in einem Hefe- Expressionsvektor kloniert und in S. cerevisiae exprimiert. Die in der Hefe produzierte Punicinsäure-Desaturase sollte zugesetzte Linolsäure in Punicinsäure umsetzen. Diese wiederum sollte in hydrolisierten und transmethylierten Lipidextrakten über GC und GC/MS als Methylester nachgewiesen werden.
In einem zweiten Ansatz wurde zusätzlich zu PuFADX die Δ-12-Desaturase PuFAD12 in Hefe exprimiert, so dass die Hefezellen endogen Linolsäure produzieren, die dann wiederum durch die Aktivititat von PuFADX in Punicinsäure umgesetzt werden kann. Letztere sollte wiederum über GC und GC/MS nachgewiesen werden.
Sämtliche Fest- und Flüssigmedien für Hefe wurden nach Protokollen von Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Bio- logy, John Wiley & Sons, New York, 1995) hergestellt. Die PuFADX-cDNA wurde über Restriktionsverdau mit Hindlll/BamHI aus dem Vektor pGEM-T ausgeschnitten, in den Hindlll/BamHI geschnittenen shuttle-Vektor pYES2 (Invitrogen, Carlsbad, USA) kloniert und der so entstandene Vektor pYES2-PuFADX in E. coli XLl blue transformiert. pYES2-PuFADX wurde mit Hilfe der LiAc- Methode in S. cerevisiae INCScl (Invitrogen, Carlsbad, USA) transformiert, wo die Expression- der PuFADX-cDNA unter der Kontrolle des GALl-Promotors stand.
Um im zweiten Ansatz zusätzlich zu PuFADX auch PuFADl2 in Hefe exprimieren zu können, wurde zunächst die PuFADl2-cDNA über Restriktionsverdau mit Sall/HindHI aus dem Vektor pGEM-T ausgeschnitten, in den Sall/HindHI geschnittenen shuttle-Vektor pESC-Leu (Stratagene) kloniert und der so entstandene Vektor pEST-Leu-PuFADX in E. coli XLl blue transformiert. pYES2-PuFADl2 wurde mit Hilfe der LiAc-Methode in S. cerevisiae INCScl (Invitrogen, Carlsbad, USA) transformiert, wo die Expression der PuFADl2-cDNA unter der Kontrolle des GALl-Promotors stand.
Die Expression von PuFADX in S. cerevisiae INVScl erfolgte modifiziert nach Avery et al . (Appl. Environ. Microbiol . , 62, 1996: 3960-3966) und Girke et al . (The Plant Journal, 5, 1998: 39-48). Um eine --St-a-r-terku-1-te-ur herzustellen, wurden 20 ml SD-Medium mit Glucose und Aminosäurelösung ohne Histidin mit einer Hefe-Einzel- kolonie angeimpft und über Nacht bei 30°C bei 140 rpm inkubiert. Die Zellkultur wurde zwei mal gewaschen durch Abzentrifugieren und Resuspendieren in SD-Medium ohne Supplemente und ohne Zucker. Mit den gewaschenen Zellen wurde eine Hauptkultur auf eine ODgoo von 0 , 1 bis 0 , 3 angeimpft . Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte in 25 ml SD-Medium mit 2 % (w/v) Galaktose, Aminosäurelösung ohne Histidin, 0,02 % Linolsäure (2%ige Stammlösung in 5 % Tergitol NP40), 10 % Tergitol NP40 72 h lang bei 30°C. Die Ernte der Hauptkultur erfolgte über Zentrifugation. Das Zellpellet wurde bei -20°C eingefroren und anschließend für ca. 18 h lyophilisiert .
Die Expression von PuFADl2 erfolgte analog, mit folgenden Unterschieden: es wurde nicht auf Histidin- sondern auf Leucinproto- trophie selektioniert, das Volumen der Hauptkultur betrug 50 ml, die Anzuchtbedingungen der Hauptkultur waren 240 h bei 16°C.
Für Untersuchungen zur Substratspezifität der Punicinsäure- Desaturase wurden der Hefekultur anstelle von Linolsäure andere Fettsäuren zugesetzt, wie z.B. Ölsäure, cis-Vaccensäure, trans- Vaccensäure, gamma-Linolensäure, alpha-Linolensäure .
Analog zu dem vorher beschriebenen- Beispiel wurde PuFADX2 in Hefen exprimiert. Beispiel 5 : Lipidextraktion der Fettsäuren aus transgener Hefe und GC bzw. GC/MS Analyse
Die lyophilisierten Hefezellen wurden in 1,35 ml Methanol/Toluol 5 (2:1) und 0,5 ml Natrium-Methoxid-Lösung extrahiert. Das Zellmaterial wurde mit einem Glasstab möglichst fein zermörsert und dann 1 h lang bei Raumtemperatur (Raumtemperatur = RT bedeutet in dieser Anmeldung ca. 23°C) unter Schütteln inkubiert.
10 Anschließend wurden 1,8 ml 1 M NaCl-Lösung und 3 ml n-Heptan zugegeben und 10 min lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach Phasentrennung durch Zentrifugation (10 min, 400 rpm, 4°C) wurde der Heptan-Überstand in ein Reagenzglas überführt und unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in
15 3 mal 0,3 ml Hexan aufgenommen, in ein Eppendorf-Gefäß überführt und wiederum unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 μl MeCN aufgenommen und die Probe per GC bzw. GC/MS analysiert.
20 Zur GC-Analyse der Fettsäure-Methylester (FAME) wurden 7 μl der Probe (in MeCN) in ein Probenröhrchen überführt und 1 μl injiziert. Die GC-Analyse erfolgte über eine HP-INNOWax-Säule (Cro-ss-linked PEG; 30 m x 0,32 m -x 0,5 μm Beschichtungε'di-cke) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min. Als Trägergas diente Helium.
25 Die Injektionstemperatur betrug 220°C. Folgender Temperaturgradient wurde angelegt: 1 min 150°C, 150°C bis 200°C (15°C/min) , 200°C bis 250°C (2°C/min) , 5 min 250°C. Die Detektion der FAME erfolgte über einen Flammen-Ionisations-Detektor (FID) bei 275°C. Die Retensionszeiten von Octadecakonjutrien FAME betragen 16,6
30 min für Punicinsäure, 17,0 min für Eleosterarinsäure und 17,4 min für Calendulasäure (Fig. 2C) . Die Retensionszeiten von Octadeca- konjutetraen FAME betragen 17,0 min für 18:4 (6Z, 9Z, 11E, 13Z) und 17,4 min für 18:4 (6Z, 9Z, 11E, 13Z) (nicht gezeigt).
35 In Fig. 2 ist die Produktion von Punicinsäure in Hefezellen dargestellt, die mit der Punicinsäure-Desaturase aus Punica granatum transformiert wurden. Fig. 2A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen, die mit dem Leervektor pYES2 transformiert wurden. Die Zellen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben
40 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas- Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retensionszeit von Punicinsäure auf. In Fig. 2B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pYES2-PuFADX dargestellt. Die Zellen wurden wiederum wie in Beispiel 4
45 beschrieben 72 h lang bei 30 °C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogram weist einen deutlichen Peak mit einer Retensionszeit von 16,6 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. Fig. 2A) und die gleiche Retensionszeit wie Punicinsäure aufweist (vgl. Fig. 2C) . Analog wurde Hefen analysiert, die mit SEQ ID NO: 7 (PuFADX2) transformiert wurden.
Zur GC/MS-Analyse der FAME wurden 20 μl der Probe (in MeCN) in ein Probenröhrchen überführt und 4 μl injiziert. Bei der GC-Analyse wurde eine HP-5 Säule (5 % Diphenyl-95 % Polydimethyl Siloxan, 30 m x 0,25 mm, 0,25 μm Beschichtungsdicke, Agilent, Waldbronn) benutzt. Als Trägergas diente Helium (40 cm/s). Die Proben wurden im EI-Modus gemessen, die Injektionstemperatur betrug 250°C. Das benutzte Temperaturprogramm lautete: 60°C bis 110°C (25°C/min), 1 min 110°C, 110°C bis 270°C (10°C/min) , 10 min 270°C.
Verschiedene Cis-Fettsäuren haben bei Verwendung der HP-5 Säule unter den beschriebenen Bedingungen folgende Retensionszeiten:
18 0 = 15,7 min
18 1 9Z = 15,6 min 18 2 9Z,12Z = 15,2 min
18 3 9Z,11E,13Z = 16,4 min 18 4 6Z,9Z,11E,13Z = 16,25 min
In Fig. 2D ist das Massenspektrum der Verbindung dargestellt, die nach GC mit einer HP-5 Säule eine Retensionszeit von 16,4 min aufweist. Analysiert wurde ein Lipidextrakt von Hefezellen, die mit pYES2-PuFADX transformiert wurden, also Punicinsäure- Desaturase exprimieren. Durch das Massenspektrum ließ sich die Verbindung eindeutig als Methylester eines Octadecakonjutriens identifizieren.
Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Punicinsäure- Desaturase in Hefe zur Bildung von Punicinsäure durch Umsetzung von Linolsäure führt. Der Nachweis von Punicinsäure aus trans- formierten Hefezellen gelang nur nach Hydrolyse der Lipide. In den freien Fettsäuren dieser Zellen konnte keine Punicinsäure nachgewiesen werden, das heißt Punicinsäure wird in Hefe in Lipide eingebaut. Da Hefe kaum Triacylglyceride enthält, muss man davon ausgehen, dass der Großteil der nachgewiesenen Punicinäure in den Phospholipiden der Hefe gebunden war.
In Fig. 3 ist die Bildung von Octadecakonjutetraen Fettsäuren in Hefezellen dargestellt, die mit der Punicinsäure-Desaturase aus Punica granatum transformiert und mit γ-Linolensäure wie in Beispiel 4 beschrieben angezogen wurden. Fig. 3A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Kontrollzellen, die mit dem Leervektor pYES2 transformiert wurden. Die Zellen wurden 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % γ-Linolensäure angezogen. Das Gas- Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retensionzeit von Octo- decakonjutetraen Fettsäuren auf (17,0 - 17,4 min).
In Fig. 3B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pYES2-PuFADX dargestellt. Die Zellen wurden wiederum wie in Beispiel 4 beschrieben 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % γ-Linolensäure angezogen. Das Gas-Chromatogram weist deutliche Peaks mit Retensionszeiten von 17,0 min und 17,4 min auf, die im Kontrollansatz nicht auftreten (vgl. Fig. 3A) und die gleiche Retensionszeit wie 18:4 (6Z, 9Z, 11E, 13Z) aufweist.
Eine GC/MS-Analyse dieser Verbindung, extrahiert aus transgenen Hefezellen mit pYES2-PuFADX, die mit γ-Linolensäure angezogen wurden, ist in Fig. 3C dargestellt. Anhand des Massenspektrums lässt sich die Verbindung eindeutig als Methylester eines Octa- decakonjutetraens identifizieren.
Die in Fig. 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Punicinsäure- Desaturase in Hefe γ-Linolensäure zu Octadecakonjutetraen Fettsäuren umsetzt. α-Linolensäure hingegen führte nicht zur Bildung von Octadecakonjutetraenen (nicht gezeigt) . Die genannten Octa- decakonj-utetraene werden bei Hefe in Lipide eingebaut, hauptsächlich in Phospholipide .
In Fig. 4 ist die Bildung von Linolsäure in Hefezellen dargestellt, die mit der Δ-12-Desaturase aus Punica granatum transformiert wurden. Fig. 4A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen, die mit dem Leervektor pESC-Leu trans- formiert wurden. Die Zellen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben 240 h lang bei 16°C angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retensionszeit von Linolsäure auf. Der Gehalt an Ölsäure (Retensionszeit = 10,0 min) beträgt xxx % der Gesamtfettsäuren. In Fig. 4B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pESC-PuFADl2 dargestellt. Die Zellen wurden wiederum wie in Beispiel 4 beschrieben 240 h lang bei 16°C angezogen. Das Gas-Chromatogram weist einen deutlichen Peak mit einer Retensionszeit von 10,75 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. Fig. 4A) und die gleiche Retensions- zeit wie Linolsäure aufweist (vgl. Fig. 4C) . Der Gehalt an Ölsäure beträgt 85 %, ist also um 15 % niedriger als in Kontroll- Hefezellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression von PuFAD12 in Hefe zur Umsetzung von Ölsäure zu Linolsäure führt. Eine Coexpression von PuFADl2 und PuFADX in Hefe führt daher zur Bildung von Punicinsäure, auch ohne Zugabe von Linolsäure. Beispiel 6 : Expression der Punicinsäure-Desaturase in Pflanzen
Die Expression der Punicinsäure-Desaturase aus Punica granatum in transgenen Pflanzen ist vorteilhaft, um den Punicasäure-Gehalt in diesen Pflanzen zu erhöhen. Dazu wurden die PuFADX oder PuFADX2 cDNA in binäre Vektoren kloniert und über Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer in Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Brassica napus und Linum usitatissimum übertragen. Die Expression der CalDes cDNA stand dabei unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV 35 S-Promotors bzw. des samenspezifischen USP-Promotors .
Arabidopsis ist als Modellpflanze besonders geeignet, da sie eine kurze Generationszeit und ausreichende Mengen an Linolsäure, dem Substrat von PuFADX oder PuFADX2 zur Herstellung von Punicin- säure, als auch ' ausreichende Mengen an Ölsäure aufweist, dem
Substrat von PuFADX zur Herstellung von Konjudien Fettsäuren wie CLA.
Tabak -und Hoch-Linolsäure-Sorten von Lein, wie die Varietät Linola, sind als Ölsaaten mit einem hohen Gehalt an Linolsäure besonders geeignet zur heterologen Expression von PuFADX oder PuFADX2, da Linolsäure das Substrat von PuFADX oder PuFADX2 zur Bildung von Punicinsäu-Eβ-dars e-llt .
Raps ist als Ölsaat mit einem hohen Gehalt an Ölsäure besonders geeignet, um durch Expression von PuFADX oder PuFADX2 Ölsäure zu Konjudien Fettsäuren wie CLA umzusetzen und zu akkumulieren. Weiterhin kann durch Expression von PuFADl2 in Raps eine Erhöhung des Linolsäuregehalts erreicht werden und durch Coexpression von PuFADl2 und PuFADX oder PuFADX2 die Akkumulation von Punicinsäure erreicht werden.
Als Expressionsvektoren wurden der Vektor pBinAR (Höfgen und Will itzer, Plant Science, 66, 1990: 221-230) bzw. das pBinAR Derivat pBinAR-USP, bei dem der CaMV 35 S-Promotor gegen den USP- Promotor aus V. faba ausgetauscht war, verwendet. Ebenfalls verwendet wurden die Vektoren pGPTV und pGPTV-USP. Zur Umklonierung musste die CalDes-cDNA aus dem Vektor pGEM-T ausgeschnitten und in pBinAR bzw. pBinAR-USP kloniert werden.
Die entstandenen Plasmide pBinAR-PuFADX, pBinAR-USP-PuFADX, pGPTV-PuFADX, pGPTV-USP-PuFADX, pBinAR-PuFADl2 , pBinAR-ÜSP- PUFAD12, pGPTV-PuFAD12 , pGPTV-USP-PuFADl2 wurden in Agrobacterium tumefaciens transformiert (Höfgen und Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16, 1988: 9877). Die Transformation von A. thaliana erfolgte mittels "floral dip" (Clough und Bent, Plant. Journal, 16, 1998: 735-743), die von N. tabacum über Cokultivierung von Tabak- blattStückchen mit transformierten A. tumefaciens Zellen, die von Lein und Raps durch Cokultivierung von Hypokotylstücken mit transformierten A. tumefaciens Zellen.
i Die Expression der PuFADX und PuFAD12-Gene in transgenen Arabidopsis-, Tabak-, Raps- und Leinpflanzen wurde über Northern- Blot Analyse untersucht. Ausgewählte Pflanzen wurden auf ihren Gehalt an Punicinsäure bzw. anderen konjugierten Fettsäuren wie CLA im Samenöl untersucht .
Analog zum USP-Promotor kann auch der Napin-Promotor verwendet werden, um eine samenspezifische Expression von PuFADX, PuFADX2 nd PuFADl2 zu erreichen.
Die volllängen-cDNAs der PuFADX und PuFADX2 wurden zur Expression in Pflanzen unter Kontrolle des USP-Promotors und des OCS-Termi- nators mit den Primern M und N amplifiziert . Dies erfolgte mittels dem Expand High Fidelity-PCR-System (Röche Diagnostics) .
Primer M : 5' - GGA TCC ATG GGA GCT GAT GGA ACA ATG TCT C - 3' Forward Primer (mit BamHI Schnittstelle)'
-Primer N : 5' - GGG CCC ATT-CAG AAC TTG CTC TTG-AA-P-TAT AG~-_ 3 ' Reverse Primer (mit Apal Schnittstelle)
Die PCR-Ansätze setzten sich wie folgt zusammen:
dNTP-Mix : 1 μl ( 10 mM)
5 ' Primer : 4 μl ( 10 μM) 3 ' Primer : 4 μl ( 10 μM)
Template : 3 μl ( 1 : 50 verdünnte cDNA-Marathon-Bank
Polymerase : 0 , 5 μl ( 3 , 5 U/μl )
10 x Puffer 2 : 5 μl
Wasser 32 , 5 μl Gesamtvolumen: 50 μl
Die PCR erfolgte nach folgendem Programm:
1 2 min 94°C
2 30 sec 94°C
3 30 sec 50°C
4 2 min 72°C
5 10 x 2 . - 4 .
6 30 sec 94°C
7 30 sec 50°C
8 2 min 72°C , Zeitinkrement 5 sec pro Zyclus 9. 15 x 5. bis 7.
10. 5 min 72°C
Die PCR-Produkte wurden über die eingebaute Schnittstellen in den Vektor pUC19-USP-OCS2 kloniert und in E. coli-XLI-Blue-Zellen transformiert. Die Insert-DNA wurde mit einem 373 DNA-Sequencer (Applied Biosystems) dopplesträngig sequenciert. Nach einer Amplifikation der Plasmid-DNA wurde die Expressionskassette (USP-PuFADX-OCS bzw. USP-PuFADX2-0CS) mit den Restriktionsenzymen Sacl herausgeschnitten. Nach einer Behandlung mit T4-Polymerase zur Erzeugung glatter Enden und Ligation in pPTV-bar (HindiII geschnitten, ebenfalls mit glatten Enden durch T4-Polymerase) wurde das Konstrukt pPTV-bar-USP-PuFADX-OCS-DNA generiert. Analog wurde das Konstrukt für PuFADX2 erstellt. Dieses Plasmid wurde in kompetente Agrobacteriumzellen (Agrobacterium tumefaciens EHA105) transformiert und Tabakpflanzen {Nicotiana tabacum SRI) nach einer Standardmethode transformiert (Horsch et al. (1985) Science, 269, 1985: 1229-1231) und transgene Tabakpflanzen regeneriert .
Die Samen transgener Pflanzen wurde geerntet und 10 mg Samen wurden in 405 μl Methanol :Toluol (2:1) homogenisiert und mit 150 μ-1 0,5 M-Na-Metfeoxid-e-x-ferα-h-iert-.--Bas Samenmateri-al wurde möglichst fein gemörsert und anschließend für 20 min bei Raum- temperatur unter Schüttlen inkubiert. Anschließend wurden 0,5 ml IM NaCl - Lösung und 0, 5 ml n-Heptan zugegeben und 5 min lang bei Raumtemperatur zur Extraktion inkubiert. Nach Fasentrennung durch Zentrifugation (10 min, 4000 rp , 4 °C) wurde der Heptan- Überstand in ein Reaktionsgefäß überführt und unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in 3 mal 300 μl Hexan aufgenommen und wiederum unter Stickstoff eingedampft . Der Rückstand wurde in 40 μl MeCN aufgenommen und die Probe per GC bzw. GC/MS analysiert.
Zur GC-Analyse der Fettsäure-Methylester (FAME) wurden 7 μl der Probe (in MeCN) in ein Probenrörchen überführt und 1 μl injiziert. Die GC-Analyse erfolgte über eine HP-DB23 (Cross-Linked PEG; 30 m x 0,32 mm x 0,5 μm Beschichtungsdicke) bei einer Flussrate von 1,5 ml / min. Als Trägergas diente Helium. Die Injek- tionstemperatur betrug 220°C. Folgender Temperaturgradient wurde angelegt: 1 min 150°C, 150°C auf 200°C (15°C / min), 200°C bis 250°C (2°C / min), 5 min 250°C. Die Detektion der FAME erfolgte über einen Fdlammen-Ionisations-Detektor (FID) bei 275°C. In Fig. 5 ist die Produktion von Punicinsäure in Tabaksamen dargestellt, die mit der Punicinsäure-Desaturase (PuFADX) aus Punica granatum transformiert wurden. Die Versuche mit PuFADX2 ergaben die gleichen Ergebnisse.
Die in Fig. 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Punicinsäure-Desaturase in Tabakpflanzen zur Bildung von Punicinsäure führt . Da in Tabaksamen die Fettsäuren zum größten Teil in Triacylglyceride gebunden sind, muss man davon ausgehen, dass der Großteil der nachgewiesenen Punicinsäure in den Triacylglyceride der Tabaksamen gebunden war. Figur 5.A zeigt die Kontrolle ohne die PuFADX-Desaturase. Figur 5. B gibt die Synthese von Punicinsäure mit Hilfe der PuFADX-Desaturase wieder.
Entsprechende Ergebnisse lassen sich mit dem PuFADX2-Gen in Tabak erzielen.
Tabelle I. Fettsäurezusammensetzung der analysierten transgene Tabaksamen (F71-Klone Nr. 1 bis 50) welche die Punicinsäure-Desaturase expremieren in Vergleich zu Wildtyptabakpflanzen (SNNWT/1 und SNNWT/2)
Figure imgf000036_0001
Tabelle I zeigt deutlich, dass alle Desaturase-Klone (F71-Klone) Pucinsäure synthetisieren.

Claims

Patentansprüche
1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, oder
b) Nukleinsauresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 3 öder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder
c) Derivate der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 75 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.
2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Ansp.r-u.ch 1.
3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 8 dargestellte Sequenz.
4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.
6. Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 5.
7. Organismus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.
8. Transgene Pflanze enthaltend eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4. 5
9. Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:
10 a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz gemäß
Anspruch 1, mindestens eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4 oder mindestens eines Vektors gemäß Anspruch 5 in einen Öl produzierenden Organismus;
15 b) Anzucht dieses Organismus und
c) Isolierung des im Organismus enthaltenen Öls bzw. der im Organismus enthaltenen Triglyceride.
20 10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die im Öl oder in den
Triglyceriden enthaltenden Fettsäuren freigesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder ]0, dadur_c crekennzeLchnet, dass in den Organismus in Verfahrensschritt (a) zusätzlich 25 mindestens eine weitere Nukleinsäure eingebracht wird, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Δ-5-Desaturase, einer Δ-6-Desaturase, einer 30 Δ-8-Desaturase oder Δ-12-Desaturase, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, oder 5
Nukleinsauresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableiten, oder 0 d) Derivate der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass 5 die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die ungesättigten Fettsäuren einen erhöhten Gehalt an Punicinsäure aufweisen.
5 13. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die ungesättigte Fettsäuren einen erhöhten Gehalt an Octadecakonjutetraen Fettsäuren aufweisen.
14. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeich- 10 net, dass die ungesättigten Fettsäuren einen erhöhten Gehalt an Octadecakonjudien Fettsäuren aufweisen.
15. Verfahren zur Herstellung von ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren dadurch
15 gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:
a) Einbringen mindestens einer nicht funktionellen Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens eines nicht funktionellen Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 4
20 in einen Öl produzierenden Organismus;
b) Anzucht dieses Organismus und
c) Isolierung des im Organismus enthaltenen Öls bzw. der 25 im Organismus enthaltenen Triglyceride.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die im Öl oder in den Triglyceriden enthaltenden Fettsäuren freigesetzt werden.
30 17. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Organismus um eine Pflanze oder einen Mikroorganismus handelt .
18. Öle oder Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an unge- 35 sättigten Fettsäuren hergestellt nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen Anspruch 9 bis 14.
19. Fettsäuregemisch mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren hergestellt nach einem Verfahren
40 gemäß Anspruch 10.
20. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4 zur Herstellung von transgenen Pflanzen. 5
21. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, Anspruch 24 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening.
5 22. Verwendung von Triglyceriden oder Fettsäuregemisσhen gemäß Anspruch 17 oder 18 mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika.
10 23. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert, das eine Fettsäure der allgemeinen Struktur I,
Figure imgf000041_0001
die zwei durch eine Methylengruppe voneinander getrennte Doppelbindungen aufweist, zu einer dreifach ungesättigten 0 Fettsäure der allgemeinen Struktur II
Figure imgf000041_0002
5
umsetzt, wobei die drei Doppelbindungen der Fettsäure in Konjugation sind und wobei die Substituenten und Variablen in den Verbindungen der allgemeinen Struktur I und II folgende 0 Bedeutung haben:
R1 = Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigte oder gesättigtes , verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, 5 -CH
Figure imgf000041_0003
R2 = substituiertes oder unsubstituiertes, ungesättigtes oder 0 gesättigtes Ci-Cg-Alkyl-
R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-C -Alkylcarbonyl- oder 5 Phospho-,
n = 1 bis 14
24. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsauresequenzen, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten
10 genetischen Codes ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 6 dar- 15 gestellten AminosäureSequenzen codieren und mindestens
90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist.
20 25. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24.
26. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem
25 oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
27. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 26.
30 2'8. Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 2'4, mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 26 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 27.
29. Transgene Pflanze enthaltend eine funktionelle oder nicht 35 funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 24 oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 26.
0
5
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