DE10308850A1

DE10308850A1 - Verfahren zur Herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens drei Doppelbindungen in Pflanzen

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Publication number: DE10308850A1
Application number: DE10308850A
Authority: DE
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-09-09

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen in Eukaryonten speziell in Pflanzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten und/oder unkonjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen. DOLLAR A Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsäure in Eurkaryonten speziell in Pflanzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierter Linolsäure. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Organismen, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren. Außerdem betrifft die Erfindung Fettsäuregemische sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten und/oder unkonjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speziell an konjugierter Linolsäure und deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen in Eukaryonten speziell in Pflanzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten und/oder unkonjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsäure in Eurkaryonten speziell in Pflanzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierter Linolsäure.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuresequenzen; Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Organismen enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren. Außerdem betrifft die Erfindung Fettsäuregemische sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten und/oder unkonjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speziell an konjugierter Linolsäure und deren Verwendung.
Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem ob es sich um freie Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Sonnenblume und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride anfallen. Sie werden aber auch vorteilhaft aus Tieren wie Fischen gewonnen. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung hergestellt.
Je nach Anwendungszweck sind Öle mit gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bevorzugt, so sind z.B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren speziell mehrfach ungesättigten Fettsäuren bevorzugt, da sie einen positiven Einfluss auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Möglichkeit einer Herzerkrankung haben. Sie finden in verschiedenen diätetischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.
Besonders wertvolle und gesuchte ungesättigte Fettsäuren sind die sogenannten konjugierten ungesättigten Fettsäuren. Konjugierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren kommen im Vergleich zu anderen mehrfach ungesättigte Fettsäuren in der Natur eher selten vor. In Pflanzen kommen diese konjugierten Fettsäuren nur in einzelnen Arten vor wie beispielsweise in den Euphorbiacease wie Aleurites fordii oder in Calendula officinalis. Für die konjugierte Linolsäure (= conjugated linoleic acid = CLA) gibt es keine natürliche pflanzliche Quelle.

Die chemische Herstellung konjugierter Fettsäuren beispielsweise Punicinsäure oder konjugierter Linolsäure wird in US 3,356,699 und US 4,164,505 beschrieben. CLA oder andere konjugierte Fettsäuren können chemisch leicht über eine alkalische Isomerisation aus Linolsäure oder Linolensäure oder Ölen, die Linolsäure oder Linolensäure enthalten gewonnen werden. Zwei Reaktionen werden durch die alkalische Isomerisierung bei Temperaturen von beispielsweise bei 180°C katalysiert, zum einen die Hydrolyse der Fettsäureesterbindung in den Triglyceriden und zum anderen die Isomerisierung der Doppelbindungen (WO 99/32604). In diesem Verfahren werden je nach verwendetem Öl ca. 20 bis 35 % cis-9, trans-11 CLA und in etwa gleichen Mengen traps-10, cis-12 CLA hergestellt. Neben diesen Hauptisomeren entstehen weitere Isomere. Eine weitere Anreicherung der verschiedenen Isomere ist über eine aufwendige, teure Reinigung beispielsweise über eine fraktionierte Kristallisation möglich. Auf diesem Wege lassen sich jedoch keine reinen Isomere der CLA gewinnen.

Die Herstellung von konjugierter Linolsäure durch die enzymatische Aktivität einer Desaturase wird von Qiu et al., (Plant Physiology, 125, 2001, 847-855) beschrieben. Von Nachteil ist bei dieser Aktivität jedoch, dass durch die enzymatische Wirkung das unerwünschte 8,10-Isomer der konjugierten Linolsäure entsteht.

Weiterhin wurden eine Reihe von prokaryontischen Mikroorganismen beschrieben, die in Starterkulturen oder im Pansen von Wiederkäuern vorkommen und die natürlicherweise CLA produzieren. Vermutlich ist CLA dabei ein Abbauprodukt der Linolsäure auf dem Weg zur Stearidonsäure. In WO 99/29886 werden Bakterien zur Anreicherung von CLA in Lebens- und Futtermittel offenbart.

In WO 99/32604 wird eine Linoleat-Isomerase aus Lactobacillus reuteri beschrieben. Die Enzymaktivität führt zur Umsetzung von Linolsäure in sechs verschiedene Isomere der CLA [(cis,trans)-9,11-CLA, (trans,cis)-10,12-CLA, (cis,cis)-9,11-CLA, (cis,cis)-10,12-CLA, (trans,trans)-9,11-CLA and (trans,trans)-10,12-CLA]. Von Nachteil bei dieser Isomerase ist, dass die Ausbeute in der Reaktion gering ist und die Reinheit der CLA zu wünschen lässt. Dies führt zu einem wirtschaftlich wenig attraktiven Prozess.

Von Kepler et al. wurde eine Isomerase aus Butyrivibrio fibrisolvens (Kegler and Tovee, J. Biol. Chem., 1966, 241: 1350) und von Deng et al. wurde eine aus Propionibacterium acnes (Deng et al., 1 st International Conference on CLA, 2001, Alesund, Norway) beschrieben. In WO 99/29886 wird eine Isomerase aus Bifidobacterium offenbart und beansprucht. Die bisher beschriebenen CLA Isomerasen verwenden freie Fettsäuren als Substrat. Das Gen codierend für CLA Isomerase aus Lactobacillus reuteri und Propionibacterium acnes wurde kloniert und konnte in prokaryontischen Mikroorganismen funktional exprimiert werden. Eine Expression in Eukaryonten gelang bisher nicht. Die biologische Umsetzung von Linolsäure zu CLA durch Mikroorganismen hat zwar qualitative Vorteile gegenüber der chemischen Umsetzung, sie ist aber aufgrund der Fermentationskosten ökonomisch nachteilig und liefert lediglich freie Fettsäuren, aber keine Triglyceride.

Konjugierte Linolsäure ist ein Zwischenprodukt des Linolsäurestoffwechsels in Wiederkäuern. CLA ist ein Sammelbegriff für positionelle und strukturelle Isomere der Linolsäure, die sich durch ein konjugiertes Doppelbindungssystem am Kohlenstoffatom 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 auszeichnen. Geometrische Isomere existieren für jedes dieser positionellen Isomere, also cis-cis, trans-cis, cis-trans, trans-trans. Vor allem C18:2 cis-9, trans-11 und C18:2 traps-10, cis-12 CLAs, die die biologisch aktivsten Isomere darstellen, sind von besonderem Interesse, da sie sich im Tierexperiment als krebsvorbeugend erwiesen haben, anti-arteriosklerotisch wirken und in Mensch und Tier den Körperfettanteil reduzieren. Kommerziell werden CLAs heute hauptsächlich als freie Fettsäure vertrieben.

Für den Menschen sind die wichtigsten natürlichen Quellen für CLA vor allem tierische Fette. Wie oben erwähnt gibt es keine pflanzlichen Quellen. So besitzen Fette von wiederkäuenden Tieren, wie Rindern (Chip, Journal of Food Composition and Analysis, 5, 1992: 185 – 197) und Schafen, sowie Molkereiprodukte sehr hohe CLA-Konzentrationen. Bei Rindern findet man 2,9 bis 8,9 mg/g Fett. Dagegen besitzen Pflanzenöle, Margarinen und Fette von nicht-wiederkäuenden Tieren CLA-Konzentrationen von nur 0,6 bis 0,9 mg/g Fett.

Für CLA sind eine Reihe positiver Effekte nachgewiesen worden. So reduziert die Verabreichung von konjugierter Linolsäure das Körperfett in Mensch und Tier bzw. erhöht den Futterumsatz pro Körpergewicht bei Tieren (WO 94/16690, WO 96/06605, WO 97/46230, WO 97/46118). Durch Gabe von konjugierter Linolsäure lassen sich auch beispielsweise Allergien (WO 97/32008), Diabetes (WO 99/29317) oder Krebs positiv (Banni, Carcinogenesis, Vol. 20, 1999: 1019-1024, Thompson, Cancer, Res., Vol. 57, 1997: 5067-5072) beeinflussen. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren werden auch Baby nahrung zur "Erhöhung des Nährwertes" und als essentielle Bausteine, die Wachstum und Gehirnentwicklung gewährleisten, zugesetzt.

Nur wenige Daten sind über die tägliche CLA-Aufnahme des Menschen erhältlich. In Deutschland beträgt die tägliche CLA-Aufnahme ungefähr 0,36 g/Tag für Frauen und 0,44 g/Tag für Männer [Fritsche et al., Zeitschrift Lebensmittel. Untersuchung Forschung A-Food Research & Technology 205:415-418 (1997)].

CLA hat wie oben beschrieben sehr weitreichende positive ernährungsphysiologische Wirkungen. CLA kommt jedoch natürlicherweise in signifikanten Mengen nur bei Wiederkäuern und deren Produkten, wie Milch, Käse etc. vor. Es besteht daher ein großer Bedarf an Alternativen des aus diesen tierischen Quellen stammenden CLA, insbesondere um eine ausgeglichene und gesunde Ernährung in weniger entwickelten Regionen zu gewährleisten, in denen die Versorgung mit diesen tierischen Fetten unzureichend oder eine synthetische Herstellung zu teuer ist. Aber auch in entwickelten Regionen hat der Verzehr an Fleisch- und Milchprodukten abgenommen, um den Anteil an als ungesund geltenden gesättigten Fettsäuren zu verringern. Dies bedeutet aber gleichzeitig auch eine Verringerung der Aufnahme an "gesunder" CLA.

Im Gegensatz zu CLA kommen konjugierte Polyensäuren nicht in signifikanten Mengen in tierischen Lipiden vor, während sie in einigen pflanzlichen Ölen hauptsächlich als C₁₈-triene oder Tetraene vorkommen. Beispiele für derartige konjugierte Octadecatriensäuren sind die Eleostearinsäure (= Eleostearic acid, 9c,11t,13t) aus Aleurites fordii (Euphorbiaceae) oder Prunus maheleb (= Felsenkirsche), die Punicasäure (9c,11t,13c) aus Punica granatum, die Calendulasäure (8t,10t,12c) aus Calendula officinalis (= Ringelblume), die Parinarsäure (9c,11t,13t,15c) aus Parinarium sp. (Rosaceae) oder Impatiens balsamina. Auch aus marinen Algen wie der Grünalge Anadyomena stellata lassen sich konjugierte Octadecatriensäuren isolieren. Diese konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren haben ein großes Anwendungspotential in Nahrungsmitteln, Kosmetika und/oder Pharmazeutika. Zur Anwendung kommt beispielsweise heute schon Calendulasäure als Bestandteil in vielen Kosmetika.

Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit diesen konjugierten Polyensäuren speziell CLA zu ermöglichen, besteht daher ein großer Bedarf an einem einfachen, kostengünstigen Verfahren zur Herstellung dieser konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren bzw. zur Herstellung von konjugierter Linolsäure.

Es bestand daher die Aufgabe ein entsprechendes Verfahren zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch die im folgenden beschriebenen Verfahren speziell durch ein Verfahren zur Herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in transgenen eurkaryontischen Organismen gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 in einen ungesättigte Fettsäuren produzierenden Organismus; oder
b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder
c) Einbringen mindestens eines Derivates der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist, und
d) Expression der Nukleinsäure im nach (a), (b) oder (c) hergestellten Organismus, und
e) Anzucht und Ernte des nach (a), (b) oder (c) hergestellten Organismus.

Vorteilhaft enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens drei Doppelbindungen. Besonders vorteilhaft enthalten die Fettsäuren zwei oder drei Doppelbindungen. Neben den konjugierten Doppelbindungen können noch weitere nicht-konjugierte Doppelbindungen im Fettsäuremolekül enthalten sein. Es können vorteilhaft zwei (= Diene) oder drei (= Triene) Doppelbindungen in Konjugation sein. Die hergestellten Fettsäuren können bis zu 6 Doppelbindungen im Molekül enthalten. Im Verfahren hergestellte bzw. umgesetzte Fettsäuren haben vorteilhaft 18 bis 22 C-Atome in der Fettsäurekette. Tabelle 1 gibt die Substrate sowie der Umsetzungsprodukte wieder. Vorteilhaft werden C18-Fettsäuren umgesetzt. Ein bevorzugtes Reaktionsprodukt ist die Trien-Fettsäure 18:3(11E,13E,15Z), die durch Umsetzung der Fettsäure 18:3(9Z,12Z,15Z) entstanden ist. Die Konfiguration der Doppelbindungen wurde, wenn nicht anders beschrieben über NMR-Analyse bestimmt. Die Fettsäuren enthalten nach Umsetzung im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft zwei (= Dien) oder drei (= Trien) Doppelbindungen in Konjugation. Diese können im Reaktionsgemisch als einziges Produkt enthalten sein oder aber in einer Mischung aus konjugierten Doppelbindungen, das heißt im Reaktionsgemisch sind gleichzeitig konjugierte dreifach und zweifach Doppelbindungen enthalten. Daneben können weitere Doppelbindungen im Fettsäuremolekül enthalten sein, die nicht in Konjugation zu den anderen Doppelbindungen sind. Es können vorteilhaft zwei oder drei Doppelbindungen in Konjugation liegen.

Eine vorteilhafte Ausführungsform des vorgenannten Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsäure in transgenen eurkaryontischen Organismen gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 in einen ungesättigte Fettsäuren vorteilhaft Linolsäure produzierenden Organismus; oder
b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder
c) Einbringen mindestens eines Derivates der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist, oder
d) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokaryontischen codon-usage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 %, vorteilhaft mindestens 1, 2, 3 oder 5 % bevorzugt mindestens 6, 7, 8, 9 oder 10 %, besonders bevorzugt mindestens 20, 30, 40 oder 50 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90 eines eukaryontischen codon-usage unterscheidet, oder
e) Einbringen eines Derivate der unter (d) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein, vorteilhaft mindestens 2, bevorzugt mindestens 3, besonders bevorzugt mindestens 4, ganz besonders bevorzugt mindestens 5-Codontripletts vorteilhaft am 5' Ende der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäure codieren, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist, und
f) Expression der Nukleinsäure im nach (a), (b), (c), (d) oder (e) hergestellten Organismus, und ggf.
g) ggf. Anzucht und Ernte des nach (a), (b), (c), (d) oder (e) hergestellten Organismus.

Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren die vorgenannten Nukleinsäuren verwendet, nachdem ihr sogenannter codon-usage zur Expression in Eukaryonten bevorzugt zur Expression in Hefen verändert wurde. Entsprechende Modifikationen wurden vorgenommen und sind den Beispielen zu entnehmen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Ölen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speziell mit einem erhöhten Gehalt an konjugierter Linolsäure (= CLA) dadurch gekennzeichnet, dass die im Organismus enthaltenen Öle bzw. die im Organismus enthaltenen Triglyceride aus dem Organismus isoliert werden. Dies kann nach üblichen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, die speziell in der Fettchemie Anwendung finden. Beispielsweise lassen sich die Öle und Triglyceride durch Ernten der transgenen Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld gewinnen. Die weitere Aufarbei tung kann beispielsweise im Falle von Pflanzen durch Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie kaltem oder vorteilhaft warmen Hexan oder Cyclohexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst die Pflanzenschleime und Trübstoffe. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natron- und/oder Kalilauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert.

Die im Öl oder in den Glyceriden enthaltenden Fettsäuren können nach dem Isolieren anschließend nach dem Fachmann bekannten Methoden durch saure oder alkalische Hydrolyse freigesetzt werden.

Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten verestertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das – Gylceridgemisch kann weitere Zusätze, z.B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten.

Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.

Eine erfindungsgemäße Ausführungsform sind deshalb Öle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt worden sind, besonders bevorzugt sind Öle, Lipide oder Fettsäurezusammensetzungen, die einen erhöhten Gehalt an konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speziell an konjugierter Linolsäure umfassen und von transgenen Pflanzen herrühren. Die Lipide bestehen vorteilhaft im wesentlichen aus Glyceriden, wobei diese wiederum im wesentlichen aus Triglyceriden bestehen. Unter erhöhtem Gehalt an konjugierten und/oder nicht konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen ist ein Gehalt an konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen in den Ölen, Lipiden oder Fettsäurezusammensetzungen (= Fettsäuregemische) zu verstehen, der mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20 %, bevorzugt mindestens 30 %, besonders bevorzugt von mindestens 40 % und ganz besonders bevorzugt von mindestens 50 % über dem Gehalt des eurkaryontischen Ausgangsorganismus liegt, der die im erfinderischen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht enthält. Im Falle von transgenen Pflanzen bedeutet ein erhöhter Gehalt an konjugierten und/oder nicht konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen vorteilhaft ein Gehalt an konjugierten und/oder nicht konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen wie Calendulasäure, Punicasäure, Eleostearinsäure oder CLA in den Ölen, Lipiden oder Fettsäurezusammensetzungen (= Fettsäuregemische), der mindestens 100 %, vorteilhaft mindestens 200 %, bevorzugt mindestens 250 %, besonders bevorzugt von mindestens 300 % und ganz besonders bevorzugt von mindestens 500 % über dem Gehalt der Ausgangspflanze liegt, die die im erfinderischen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht enthält. Die vorgenannten % Angaben beziehen sich auf die Gesamtmenge des Öls, der Lipide oder Fettsäuregemische in den Ausgangsorganismen nicht auf weitere Bestandteile in den Organismen.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich damit konjugierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speziell CLA in eukaryontischen Organismen wie Hefen, Pilzen oder vorteilhaft Pflanzen herstellen. Auch eine Herstellung in nicht-humanen Tieren ist prinzipiell möglich. Neben diesen in den Verfahren hergestellten konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuen können noch weitere ungesättigte oder gesättigte Fettsäuren in den Ölen. Lipiden oder Fettsäuregemischen enthalten sein.

Vorteilhaft werden im Verfahren Gehalte an den vorgenannten konjugierte mehrfach ungesättigten Fettsäuren bzw. an CLA in den Organismen von mindestens 1 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 3 Gew.-%, bevorzugt mindestens von 5 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 20 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtfettsäuren des Organismus, erreicht. Die vorgenannten Gew-% Angaben beziehen sich auf die Gesamtmenge des Öls, der Lipide oder Fettsäuregemische nicht auf weitere Bestandteile.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung des Verfahrens zur Herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen mit oder in transgenen eurkaryontischen Organismen ist das Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 in einen ungesättigte Fettsäuren produzierenden Organismus; oder
b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokaryontischen codon-usage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 % eines eukaryontischen codonusage unterscheidet, oder
c) Einbringen mindestens eines Derivate der unter (b) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein Codontriplett der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäure codieren, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist.
d) Expression der Nukleinsäure im nach (a), (b) oder (c) hergestellten Organismus.

Vorteilhaft handelt es sich bei der im vorgenannten Verfahren hergestellten konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen um konjugierte Linolsäure.

Eine weitere erfindungsgemäßen Ausgestaltung betrifft ein Verfahrens zur Herstellung von konjugierter Linolsäure mit oder in transgenen eurkaryontischen Organismen, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 in einen Linolsäure produzierenden Organismus; oder
b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokaryontischen codon-usage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 % eines eukanontischen codonusage unterscheidet, oder
c) Einbringen mindestens eines Derivate der unter (b) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein Codontriplett der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäure codieren, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist,
d) Expression der Nukleinsäure im nach (a), (b) oder (c) hergestellten Organismus.

Vorteilhaft weisen die jeweils in den zwei vorgenannten Verfahren unter dem Punkt (b) genannten Nukleinsäuresequenzen eine möglichst geringe Abänderung des codonusage auf, da diese wenigen Änderungen schon den erfinderischen Effekt aufweisen, das heißt die Expression der Nukleinsäuresequenzen in den eurkaryontischen Organismen ermöglichen und da je weniger Änderungen des codon-usage in die Sequenzen eingefügt werden müssen, desto einfacher lassen sich diese Sequenzen in vitro erzeugen. Vorteilhaft sollten die Änderungen in einem Bereich von 0,5 bis 99 %, vorteilhaft zwischen 0,5 bis 90 %, bevorzugt zwischen 1 bis 50 %, besonders bevorzugt zwischen 1 bis 40 %, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 bis 20 % der gesamten Sequenz liegen. Bevorzugt werden diese Änderungen am aminoterminalen Ende bzw. 5'-Ende der Sequenzen eingefügt. Es ist aber auch eine Änderung an anderer Stelle möglich, beispielsweise am C-Terminus oder innerhalb der Sequenz oder an mehreren Stellen innerhalb der Sequenz.

Der mRNA-instruierte Vorgang der Translation in ein Protein wird durch den codonusage eines jeden speziellen Organismus beeinflusst. Wobei die Funktion f(x) -> y, mit x aus der Menge der Codonen, des genetischen Codes, y aus der Menge der Aminosäuren notiert werden, hierbei ist feine Funktion, die jedes Codon genau auf eine Aminosäure abbildet. Diese Abbildung erfolgt im Sinne der Mathematik nicht eineindeutig, das heißt mehrere Codonen codieren für dieselbe Aminosäure. Der genetische Code wird deshalb als degeneriert bezeichnet, da einige Aminosäuren durch mehrere (synonyme) Codonen codiert werden. Nicht für jedes Codon existiert eine spezifische tRNA, an Position eins des Anticodons können modifizierte Basen eingebaut sein und im Codon/Anticodon-Komplex sind an der dritten Position des Codons Fehlpaarungen erlaubt (Cricksche Wobble-Regel). Die Informationsgehalt der drei Basenpositionen im Codon ist nicht gleich, es gilt der höchste Informationsgehalt ist in Position 2, danach folgt Position 1 gefolgt von Position 3. Deshalb verändert eine Mutation der dritten Base im Codon die Aminosäurenkomposition häufig nicht, eine Mutation in der ersten Basenposition führt häufig zum Einbau einer Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, eine Mutation der mittleren Base verursacht häufig den Einbau einer Aminosäure mit anderen Eigenschaften. Die geringsten Auswirkungen auf die Aminosäurenkomposition der Proteine haben somit Veränderungen der Basenkomposition in Position drei des Codons, gefolgt von Veränderungen der Basenkomposition an Position eins. Trotzdem ist der genetische Code quasi universell, abweichende Codonzuordnungen finden sich jedoch z.B. bei Mitochondrien, Mycoplasma und einigen Protozoen. Die Häufigkeit, mit der Codonen in Genen vorkommen, schwankt zwischen den taxonomischen Gruppen beträchtlich. Die Codonpräferenzen von E. coli und Salmonella typhimurium sind sich relativ ähnlich, die der von ihnen taxonomisch entfernte Gattung Bacillus speziell die Spezies B. subtilis weichen von beiden stark ab. Innerhalb des genetischen Codes gibt es synonyme Codonen, die für dieselbe Aminosäure codieren. Die Verwendung dieser synonymen Codonen in den verschiedenen Organismen erfolgt nicht mit vergleichbarer Häufigkeit, das heißt einige werden bevorzugt eingebaut. Zusätzlich variiert die Codon-Häufigkeiten noch innerhalb einer Species zwischen verschiedenen Genen, je nachdem wie stark diese Gene exprimiert werden sollen. In bestimmten Genen tritt speziesspezifisch eine Teilmenge der Codonen bevorzugt auf. Diese Verzerrung der Codon-Häufigkeiten ist, wie gesagt, positiv korreliert mit der Genexpression. Mögliche Ursachen für diese Verzerrung der Codon-Häufigkeiten sind die unterschiedlichen Konzentrationen der tRNAs, die Aufrechterhaltung der maximalen Elongationsrate, die Kosten für das Korrekturlesen sowie unterschiedliche Translationsraten der Codonen etc.. Diese Verzerrung der Codon-Häufigkeiten wird als "Strategie" interpretiert, die Wachstumsraten zu optimieren. Da in den verschiedenen Organismen ein unterschiedlicher Codongebrauch für dieselbe Aminosäure verwendet wird, das heißt die Codonen anderes abgebildet werden, gibt es bei der Expression einer definierten aus einem Orga nismus stammenden Sequenz in einem anderen Organismus immer wieder unvorhersehbare Überraschungen, das heißt eine Sequenz kann plötzlich deutlich stärker oder schwächer oder gar nicht mehr exprimiert werden. Häufig erfolgt auch trotz Anpassung des genetischen Codes der Sequenzen auf den Wirtsorganismus keine Expression der Sequenzen. Um so unerwarteter war es, dass die erfindungsgemäßen Sequenzen schon nach einer Änderung von ca. 0,5 % der Codonen exprimiert wurden. Da der genetische Code dem Fachmann geläufig ist ebenso wie der Codongebrauch unterschiedlicher Gattungen und Arten und da für die Codonanpassung Algorithmen zur Verfügung stehen, kann er eine Anpassung der erfindungsgemäßen Sequenz an das condon-usage des Wirtsorganismus vornehmen. Beispiele für eine derartige Übersetzung sind den verwendeten Primern I und II zu entnehmen.

Vorteilhaft wird zur Verbesserung der Expression der im Verfahren verwendeten vorteilhaften Nukleinsäuren SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11 in einem transgenen (Wirts)ogganismus die Sequenz in der Weise verändert, dass der codonusage nach dem Startkodon so verändert wird, dass er optimal an den codon-usage des zur Expression verwendeten eurkaryontischen nicht-humanen Organismus angepasst ist und dadurch optimal exprimiert wird. Diese Veränderung kann vorteilhaft mit Hilfe der folgenden Primer erfolgen, wobei die Primer I vorteilhaft für die Veränderung der Bifidobakteriumsequenz (SEQ ID NO: 9) und die Primer II vorteilhaft für die Veränderung der Lactobacillussequenz (SEQ ID NO: 11) verwendet werden: Primer I:

Der zur Veränderung von SEQ ID NO: 7 (Propionibakteriumsequenz) verwendete Primen ist den Beispielen zu entnehmen. Die korrespondierenden ursprünglichen Aminosäuresequenzen der Sequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11 sind den Sequenzen SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 12 zu entnehmen.

Mit einem entsprechenden Vorgehen lassen sich auch die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 weiter verändern.

Durch diese Veränderung des codon-usage wird eine zusätzliche Aminosäure in die Aminosäuresequenzen eingefügt (siehe SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6), wobei jedoch die sonstige Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Weiterhin wird eine Schnittstelle in die Nukleinsäure(n) für ein Restriktionsenzym eingefügt. Die Veränderung führt zu folgenden geänderten Nukleinsäuresequenzen: BBI (Bifidobacteriumssequenz):

Für eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist es vorteilhaft für eine optimale Expression heterologer Gene in einem Organismus die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" vollständig zu verändern. Dies führt vorteilhaft zu einer weiteren Steigerung der Expression. neben der Sequenzveränderung über den vorgenannten Primer.

Die unter Punkt (c) beschriebenen Nukleinsäuresequenzen weisen vorteilhaft nur ein weiteres Codontriplett auf. Dies führt zu einer um eine Aminosäure verlängerte Aminosäuresequenz der Isomerase. Prinzipiell ist auch eine Veränderung der Sequenz ohne eine Verlängerung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz möglich. Im vorliegenden Fall wurde durch die Verlängerung das Codon GGT nach dem Startcodon ATG eingeführt. Die sich dadurch bildende Basensequenz ATGG gilt als consensus-Sequenz, die sich vorteilhaft auf die Translation also vorteilhaft auf die Proteinsynthese auswirkt.

Der so hergestellte Organismus kann dann vorteilhaft angezogen und nach Anzucht wie oben beschrieben geerntet werden. Anschließend können die im Organismus enthaltenen Öle, Lipide und/oder Fettsäuregemische isoliert werden und wie beschrieben weiter behandelt werden.

Vor der Anzucht und Ernte oder während der Anzucht kann jedoch vorteilhaft noch Linolsäure und/oder Linolensäure und/oder weitere mehrfach ungesättigte C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren gefüttert werden, so dass dadurch der Gehalt an konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen vorteilhaft an CLA im Organismus oder im Anzuchtmedium des Organismus gesteigert werden kann. Anschließend kann der nach (a), (b) oder (c) hergestellte Organismus angezogen und geerntet werden.

Es ist jedoch in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung auch möglich den nach (a), (b) oder (c) hergestellten Organismus direkt oder nach Anzucht zu ernten und mit diesem entweder nach Aufschluss des Organismus oder ohne Aufschluss eine Umsetzung von Linolsäure und/oder Linolensäure und/oder weitere mehrfach ungesättigte C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren zu konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen vorteilhaft eine Umsetzung von Linolsäure zu CLA in vitro durchzuführen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren bzw. in den erfindungsgemäßen Verfahren (der Singular soll hier den Plural mit umfassen) werden bevorzugt SEQ ID NO: 1 und ihre Derivate verwendet.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des vorgenannten Öls, Lipids oder der Fettsäurezusammensetzung in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform deshalb ein Verfahren zur Herstellung einer Lebensmittel-, Nahrungsergänzungsmittel-, Tierfuttermittel- oder Arzneimittelzubereitung, umfassend die Zugabe einer konjugierten und/oder nicht-konjugierten trans/cis Octadecadiensäure, Octadecatriensäure, Octadecatetraensäure, Eicosatriensäure, Eicosatetraensäure, Eicosapentaensäure, Docosatriensäure, Docosatetraensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure zur Zubereitung. Vorzugsweise hat die genannte trans/cis Octadecatriensäure eine c9,t11-, t10,c12- oder 11 E,13E,15Z- -Konfiguration.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einzelner biologisch aktiver Isomere der vorgenannten Fettsäuren in vorteilhaften Pflanzen. Bevorzugt lassen sich einzelne biologisch aktive CLA Isomere herstellen. Vorteilhaft wird das Isomerase-Gen entweder in unveränderter Form oder in Fusion mit anderen Genfragmenten so exprimiert, dass das Protein entweder im Cytosol, im Chloroplasten bzw. mit Membranen assoziiert vorliegt oder an Oleosomen gebunden ist.

Die Expression der verwendeten Isomerasen kann vorteilhaft in allen Teilen der Pflanze wie Wurzel, Stiel, Blatt, Blüte, Knospe oder Samen erfolgen, vorteilhaft im Samen dieser Pflanzen.

Durch die enzymatische Aktivität der heterolog exprimierten im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Isomerasen werden die als Substrat (= Edukt) verwendeten Fettsäuren in die entsprechenden konjugierten Fettsäuren umgesetzt, dabei können zwei oder mehrere der Doppelbindungen in den Fettsäuremolekülen durch die enzymatische Reaktion in Konjugation gebracht werden, vorteilhaft werden zwei oder drei Doppelbindungen zueinander in Konjugation gebracht. Vorteilhaft wird Linolsäure in das c9,t11- oder t10,c12-CLA Isomer umgesetzt. Neben diesen konjugierten Doppelbindungen können noch weitere Doppelbindungen im Fettsäuremolekül enthalten sein, die nicht in Konjugation liegen. Im Prinzip können aber auch alle Doppelbindungen eines umgesetzten Fettsäuremoleküls in Konjugation sein. Die so hergestellten konjugierten und/oder nicht-konjugierten Fettsäuren können in die Membranen der Pflan zenzellen und/oder in verschiedene Lipide z.B. in die Triglyceride eingebaut werden und im Samenöl gelagert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine Lebensmittel-, Nahrungsergänzungsmittel-, Tierfuttermittel- oder Arzneimittelzubereitung, enthaltend konjugierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speziell enthaltend konjugierte Linolsäure.

Erfindungsgemäße Zubereitungen eignen sich hervorragend als Nahrungsmittel- oder Futterzusatz, z.B. in Diäten oder bei der Tiermast. So können diese in Kombination oder auch alleine mit einer reduzierten Kalorienaufnahme zur Unterstützung einer Diät, z.B. zur Reduzierung des Körpergewichts beim Menschen, eingesetzt werden, die vorteilhaft auch die Essgewohnheiten beeinflusst. Die verbesserte Verwertung der zugenommenen Nahrung führt zu einer Reduktion des Nahrungsmittelsverbrauchs, was besonders in wenig entwickelten Regionen mit Nahrungsmittelknappheit oder in Extremsituationen (Krankheiten, Leistungssport) vorteilhaft sein kann.

Erfindungsgemäße Zubereitungen können auch ökonomisch und ökologisch vorteilhaft in der Tierernährung, insbesondere für eine Reduzierung der Futtermenge eingesetzt werden.

Neben den konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speziell der konjugierten Linolsäure können verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren z.B. Linolsäure, Linolensäure, PAImitinsäure enthalten sein. Insbesondere kann je nach Herstellungsverfahren der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in den Ölen, Lipiden oder Fettsäuregemischen schwanken. Jedes Fettsäuremuster, ist von der erfindungsgemäßen Zubereitung umfasst, insbesondere Fettsäuremuster, die bei der Herstellung von Öl aus pflanzlichem Material entstehen. Bevorzugt ist, dass die Öle, Lipide oder Fettsäuregemische eine möglichst geringe Streuung an unterschiedlichen Fettsäuren enthalten bzw. dass die Anzahl an verschiedenen Fettsäuren gering ist.

In einer weiteren Ausführungsform enthält die genannte Zubereitung weitere Additive.

Unter dem Begriff "Additive" werden weitere für die Ernährung oder Gesundheit vorteilhafte Zusätze verstanden, z.B. "Nährstofte" oder "Wirkstoffe". Die Zubereitung kann ein oder mehr Additive für die tierische oder menschliche Ernährung oder Behandlung enthalten und damit verdünnt oder gemischt werden. Additive können zusammen mit oder getrennt von dem Futtermittel, Nahrungsmittel, Nahrungsergänzungsmittel oder Arzneimittel verabreicht werden. Eine Lebensmittel-, Nahrungsergänzungsmittel-, Tierfutter- oder Arzneimittelzubereitung beinhaltet keine Additive oder keine Mengen von Additiven, die für die tierische oder menschliche Ernährung als schädlich angesehen werden können.

Unter "Nährstoffe" werden solche Zusätze verstanden, die für die Ernährung von Menschen oder Tieren vorteilhaft sind. Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Zube reitung daher auch Vitamine, z.B. die Vitamine A, B1, B2, B6, B12, C, D3, und/oder E, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothensäure, Taurin, Carboxylsäuren, z.B. Tricarbonsäuren, Citrat, Isocitrat, trans/cis Aconitat, und/oder homo-Citrat, Enzyme, z.B. Phytasen, Carotinoide, Mineralien, z.B. P, Ca, Mg, Mn und/oder Fe, Proteine, Kohlenhydrate, Fette, Aminosäuren und/oder Spurenelemente Sn. Die Zubereitung kann auch Brenztraubensäure, L-Carnitin, Liponsäure, Coenzyme Q10, Aminocarbonsäuren, wie z.B. Kreativ, enthalten.

Unter "Wirkstoffe" werden solche Stoffe verstanden, die die Anwendung der erfinderischen Zubereitung als Arzneimittel unterstützen oder deren Wirkung der Behandlung von Krankheiten, insbesondere der Behandlung von Krebs, Diabetes, AIDS, Allergien und kardiovaskuläre Erkrankungen, dient (s. auch unten).

Folglich kann die erfindungsgemäße Zubereitung auch Konservierungsstoffe, Antibiotika, antimikrobielle Zusätze, Antioxidantien, Chelatbildner, inerte Gase, physiologisch unbedenkliche Salze usw. umfassen. Der Fachmann weiß die für die jeweilige Verwendung als Arzneimittel, Tiertutter, Nahrungsergänzungsmittel oder Lebensmittel-Zusatz geeigneten Additive der Zubereitung hinzuzufügen oder durch einfache, im Stand der Technik bekannte Tests zu ermitteln.

Unter "Additiven" werden auch Antioxidationsmittel verstanden. Antioxidationsmittel sind z.B. vorteilhaft, um die Doppelbindungen der Fettsäuren vor Oxidation zu schützen. Jedoch ist auch die allgemeine gesundheitsfördernde Wirkung von Antioxidationsmitteln bekannt. So wird in der Tierernährung als Antioxidationsmittel Ethoxyquin verwendet, ansonsten werden auch gamma- und alpha-Tocopherole, Tocotrienol, Rosmarinextrakt, natürlich vorkommende Polyphenole, z.B. Flavonoide, Isoflavone und Carotinoide eingesetzt.

In einer weiteren Ausführungsform enthält die genannte Zubereitung weitere vielfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs). Unter dem Begriff "Fettsäure" wird eine unverzweigte Carbonsäure mit geradzahliger Kohlenstoffzahl und 12 bis 22 vorteilhaft 16 bis 22 Kohlenstoffatomen verstanden. Unter "ungesättigter Fettsäure" wird erfindungsgemäß eine Fettsäure mit mindestens zwei Doppelbindungen verstanden. Unter "konjugierter, ungesättigter Fettsäure" wird hierin eine ungesättigte Fettsäure mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen, die in Konjugation zu einander stehen, verstanden. Vorzugsweise enthält die Zubereitung Omega-3-Fettsäuren, z.B. Alphalinolensäure, Docosatrieensäure, Docosatetraensäure, Docosahexaensäure, Docosapentaensäure, und/oder Eicosatriensäure, Eicosatetraensäure, Eicosapentaeinsäure, Dimorphencolsäure, Parinarsäure, und/oder bevorzugt konjugierte Linolensäure.

Den genannten Zubereitungen können auch Geschmacksstoffe zugesetzt sein.

In Lebensmitteln kann die Zubereitung mit üblichen Nahrungskomponenten kombiniert werden. Diese umfassen pflanzliche aber auch tierische Produkte, insbesondere Zucker gegebenenfalls in Form von Sirups, Fruchtzubereitungen, wie Fruchtsäfte, Nektar, Fruchtpulpen, Pürees oder getrocknete Früchte; Getreideprodukte sowie Stärken der genannten Getreide; Milchprodukte, wie Milcheiweiß, Molke, Joghurt, Lecitin und Milchzucker.

In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zubereitung für Verwendung in der Tierernährung geeignet und enthält z.B. Zuschlagstoffe.

Unter "Zuschlagstoffen" werden Stoffe verstanden, die der Verbesserung der Produkteigenschaften, wie Staubverhalten, Fließeigenschaften, Wasseraufnahmefähigkeit und Lagerstabilität dienen. Beispiele für solche Zuschlagstoffe und/oder Mischungen davon können auf der Basis von Zuckern z.B. Lactose oder Maltodextrin, auf der Basis von Getreide- oder Hülsenfruchtprodukten z.B. Maisspindelmehl, Weizenkleie und Sojaschrot, auf der Basis von Mineralsalzen u.a. Calcium-, Magnesium-, Natrium-, Kaliumsalze oder auf der Basis von Kieselsäuren wie Kieselgel sein.

Unter dem Begriff "Öl" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl oder Fett einen hohen Anteil an ungesättigter, konjugierter und/oder nichtkonjugierter veresterter Fettsäure(n), insbesondere konjugierter Linolsäure aber auch anderen ungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten konjugierten und/oder nicht-konjugierten mehrfach ungesättigten veresterten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen ungefähr 30 Gew.-%, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 Gew.-%, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60 Gew.-%, 70 Gew.-%, 80 Gew.-% oder mehr. Zur Bestimmung kann z.B. der Anteil an Fettsäure nach Überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl oder Fett kann weiterhin verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B. CLA, PAImitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangsorganismus speziell nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.

Die im Verfahren hergestellten konjugierten und/oder nicht konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen können in den eurkaryontischen transgenen Organismen in Form ihrer Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester oder in Form der freien Fettsäure vorliegen.

Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen lassen sich die enthaltenden konjugierten und/oder nicht konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen und/oder weitere Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wässrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische AbsPAItung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H₂SO₄. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.

Werden die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten konjugierten und/oder nicht konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen in Futtermitteln verabreicht, so können sie einzeln oder in Kombination mit anderen Stoffen im Futtermittel verabreicht werden, die aktiven Verbindungen z.B. die vorgenannten Fettsäuren können als Reinsubstanz oder Stoffgemische oder flüssige oder feste Extrakte zusammen mit üblichen weiteren Futtermittelbestandteilen oder anderen aktiven Verbindungen wie Vitamine, Carotinoide etc. verabreicht werden. Beispiele üblicher Futtermittelbestandteile sind: Mais, Gerste, Weizen, Hafer, Roggen, Tritikale, Sorghum, Reis und Kleien, Grieskleien sowie Mehle dieser Getreidearten, Sojabohnen, Sojaprodukte wie Sojaextraktionsschrot, Raps, Rapsextraktionsschrot, Baumwollsaat und Extraktionsschrot, Sonnenblumen, Sonnenblumenextraktionsschrot, Leinsaat, Leinextraktionsschrot, Expeller von Ölsaaten, Ackerbohnen, Erbsen, Gluten, Gelatine, Tapioka, Hefen, Single Cell Protein, Fischmehl, Salze, Mineralstoffe, Spurenelemente, Vitamine, Aminosäuren, Öle/Fette und dergleichen. Vorteilhafte Zusammensetzungen werden z.B. in Jeroch, H. et al. Ernährung landwirtschaftlicher Nutztiere, UTB beschrieben.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann als Pulver, Granulat, Pellet, Extrudate mit einem Überzug versehen ("coated") und/oder als Kombinationen davon vorliegen. Die Zubereitung des erfindungsgemäßen Tierfutters, beispielsweise durch umhüllende Verbindungen, dient z.B. zur Verbesserung der Produkteigenschaften, wie Staubverhalten, Fließeigenschaften, Wasseraufnahmefähigkeit und Lagerstabilität. Solche Zubereitungen sind im Stand der Technik weitreichend bekannt. So werden in der Tierernährung z.B. Blöcke aus einer festen, kohesiven, die Form behaltenden Masse von mehreren Kilos verwendet.

Tierernährungen werden so zusammengesetzt, dass der entsprechende Bedarf an Nährstoffen für die jeweilige Tierart optimal gedeckt wird. Im allgemeinen werden pflanzliche Futtermittelkomponenten wie Mais-, Weizen- oder Gerstenschrot, Sojavollbohnenschrot, Sojaextraktionsschrot, Leinextraktionsschrot, Rapsextraktionsschrot, Grünmehl oder Erbsenschrot als Rohproteinquellen gewählt. Um einen entsprechenden Energiegehalt des Futtermittels zu gewährleisten, werden Sojaöl oder andere tierische oder pflanzliche Fette zugegeben. Da die pflanzlichen Proteinquellen einige essentielle Aminosäuren nur in unzureichender Menge beinhalten, werden Futtermittel häufig mit Aminosäuren angereichert. Hierbei handelt es sich vor allem um Lysin, Methionin und/oder Threonin. Um die Mineralstoff- und Vitaminversorgung der Nutztiere zu gewährleisten, werden außerdem Mineralstoffe und Vitamine zugesetzt. Die Art und Menge der zugesetzten Mineralstoffe und Vitamine hängt von der Tierspezies ab und ist dem Fachmann bekannt (s. z.B. Jerosch et al., Ernährung landwirtschaftlicher Nutztiere, Ulmer, UTB). Zur Deckung des Nährstoff- und Energiebedarfs können alleinfutter verwendet werden, die alle Nährstoffe im bedarfsdeckenden Verhältnis zueinander enthalten. Es bildet das einzige Futter der Tiere. Alternativ kann zu einem Körnerfutter aus Getreide ein Ergänzungsfutter gegeben werden. Hierbei handelt es sich um eiweiß-, mineralstoff- und vitaminreiche Futtermischungen, die das Körnerfutter sinnvoll ergänzen.

Weiter betrifft die Erfindung eine erfindungsgemäße Zubereitung, die ein Arzneimittel ist.

Eine verbesserte Nahrungsumsetzung wie sie beispielsweise für CLA beobachtet wurde und für konjugierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Calendulasäure ebenfalls anzunehmen ist, kann bei durch eine Krankheit geschwächten Personen oder Tieren beispielsweise zu einer schnelleren Genesung führen.

Das unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zubereitung hergestellte Arzneimittel kann daher auch zur Behandlung von Krebs, kardiovaskulären Erkrankungen, z.B. Artheriosklerose (MacDonald, J.J. American College of Nutrition, (2000) 19, 111 S-118S), Diabetes (WO99/29317), Allergien und für Krankheiten begleitende Diäten eingesetzt werden.

Vorteilhaft ist somit z.B. der Einsatz der genannten Zubereitung zum beschleunigten Körperaufbau, z.B. nach einer längeren Krankheit, die mit Gewichtsverlust einhergeht, z.B. einer Chemotherapie, und zur Unterstützung oder Beschleunigung des Genesungsprozesses.

Das Arzneimittel kann weiterhin andere Wirkstoffe, z.B. die oben genannten oder anderen, enthalten. Die Wirkstoffe können zur Behandlung von Krebs, kardiovaskuläre Erkrankungen, z.B. Arteriosklerose, Diabetes, Allergien und der Unterstützung von Diäten dienen oder die Wirkung der erfindungsgemäßen Zubereitung verbessern. Ein Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes kann z.B. Insulin, Sulfonylharnstofte, Sulfonamide, Liponsäure, γ-Glucosidase-Hemmer, Thiazolidindione, Metformin und/oder Acetylsalicylsäure enthalten. Krebserkrankungen werden z.B. durch die Zugabe von Zytostatika wie Vinca-Alkaloide, Alkylantien, wie z.B. Chlorambucil, Melphalan, Thio-TEPA, Cyclophospamid, etc., durch Folsäureanaloga, wie Aminopterin oder Methotrexat, oder durch die Zugabe von Immunsuppressiva, wie z.B. Cyclophophosphamid und Azathioprin, Glucocorticoide, wie Prednisolon, oder Cyclosporin behandelt. HIV-Infektionen oder AIDS kann z.B. durch die Gabe von Reverse Transkriptase-Inhibitoren und/oder Protease-Inhibitoren behandelt werden. Allergien werden z.B. behandelt in dem die Mastzellen stabilisiert werden, z.B. durch Cromoglyxat, durch Blockade der Histamin-Rezeptoren, z.B. durch H1-Anithistaminika, oder durch funktionelle Antagonisten der Allergiemediatoren, z.B. durch alpha-Sympathomimetika, Adrenalin, beta2-Sympathomimetika, Theophyllin, Ipratropium oder Glucocorticoide. Kardiovaskuläre Erkrankungen werden mit Hilfe von Gerinnungshemmern, ACE-Inhibitoren, Cholesterolsenker wie Steatine und Fibrate, Niacin, Cholestyramin behandelt.

Das Arzneimittel kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind im Stand der Technik bekannt und schließen physiologisch unbedenkliche Salze, z.B. Phosphat gepufferte Salzlö sungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasseremulsionen, sterile Lösungen etc. Sterile Lösungen können z.B. wässrige oder nicht-wässrige Lösungen sein. Wässrige Lösungen sind z.B. Wasser, Alkohol/Wasser-Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen und schließen Natriumchloridlösungen, Ringers Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid etc. ein. Beispiele für nicht-wässrige Lösungen sind Proylene, Glykol, Polyethylenglykol, pflanzliche öle, organische Ester, z.B. Ethyloleat. Weiterhin kann das Arzneimittel eins der oben genannten, geeigneten Additive umfassen.

Arzneimittel können in üblicher Weise oral oder parenteral (subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperotoneal) verabreicht werden. Die Applikation kann auch mit Dämpfen oder Sprays durch den Nasen-Rachenraum erfolgen.

Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand und Gewicht des Patienten sowie von der Applikationsart ab. In der Regel beträgt die tägliche Wirkstoffdosis zwischen etwa 0,05 und 100 mg/kg Körpergewicht bei oraler Gabe und zwischen etwa 0,01 und 20 mg/kg Körpergewicht bei parenteraler Gabe. Besonders bevorzugt sind 0,5 bis 50 mg/kg.

Die neuen Zubereitungen können in den gebräuchlichen galenischen Applikationsformen fest oder flüssig angewendet werden, z.B. als Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Dragees, Suppositorien, Lösungen, Salben, Cremes oder Sprays. Diese werden in üblicher Weise hergestellt. Die Wirkstoffe können dabei mit den üblichen galenischen Hilfsmitteln wie Tablettenbindern, Füllstoffen, Konservierungsmitteln, Tablettensprengmitteln, Fließreguliermitteln, Weichmachern, Netzmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Retardierungsmitteln, Antioxidantien und/oder Treibgasen verarbeitet werden (vgl. H. Sucker et al.: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1991). Die so erhaltenen Applikationsformen enthalten Wirkstoffe, einschließlich CLA oder -Öl, normalerweise in einer Menge von 0,1 bis 90 Gew.-%.

Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel kann z.B. hergestellt werden, indem Rohextrakte von Pflanzen, die konjugierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie CLA enthalten, gewonnen und formuliert werden. Standardherstellungsverfahren für Arzneimittel sind dem Fachmann hinreichend bekannt.

Je nach Zweck muss die Menge der eingesetzten konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen wie trans/cis konjugierte Linolsäure angepasst werden. Die Menge der eingesetzten vorgenannten Fettsäuren kann z.B. 0,01 % oder 0,1 % der bei der Ernährung zugesetzten Fettmenge darstellen. Ebenfalls bevorzugt sind 0,5 %, 1 %, 2 % oder 3 %, 5 % oder 10 % der konjugierten und/oder nicht-konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen. Diese Mengenangaben können auch noch weitere andere Fettsäuren mit umfassen.

Als transgener Organismus für das erfindungsgemäße Verfahren kommen prinzipiell alle eukaryontischen nicht-humane Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Organismus Mikroorganismen wie Pilze oder Hefen oder Pflanzen wie Algen, Moo se, Monokotyledonen oder Dikotyledonen verwendet, vorteilhaft handelt es sich dabei um Öl-produzierende Organismen. Im Falle der Verwendung von Pflanzen im Verfahren handelt es sich vorteilhaft um sogenannte Ölfruchtpflanzen, Fruchtpflanzen, Nutzpflanzen oder sonstige Pflanzen.

Das Einbringen der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure(n) [der Plural soll für die hier beschriebene Erfindung den Singular mit umfassen und vice versa], der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des Nukleinsäurekonstrukts oder des Vektors in einen eukaryontischen transgenen Organismen beispielsweise einer Pflanze kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboraton Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embnonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt bzw. die zu exprimierende Nukleinsäure in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.

Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis und Tabak oder Kulturpflanzen, insbesondere von Öl-haltigen Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius), Canola, Mohn, Senf, Hanf, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Pistazien, Borretsch, Walnuss, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Tee oder Kakaobohne verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure, das Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor eignen sich prinzipiell alle eukaryontischen Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Lein, Sonnenblume, Calendula oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene nicht-humane Tiere beispielsweise C. elegans geeignet.

Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren können nach Einbringung in eine Pflanzenzelle bzw. Pflanze entweder auf einem separaten Plasmid liegen oder in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen oder ein anderes natives Gen, das im Nukleinsäurekonstrukt (siehe unten) enthalten ist, durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren über Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression von Genen in die transgenen Organismen wie Pflanzen eingebracht. Im Falle von Pflanzen ist eine samenspezifische Expression vorteilhaft.

Unter der Verwendung von Klonierungsvektoren in Pflanzen und bei der Pflanzentransformation, wie denjenigen, die in den folgenden Schriften veröffentlicht sind bzw. dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)), lassen sich die Nukleinsäuren zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese ein besserer oder effizienterer Produzent eines oder mehrerer von Lipiden hergeleiteter Produkte wird, wie PUFAs speziell konjugierte und/oder nicht-konjugierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion eines von Lipiden hergeleiteten Produktes, wie die vorgenannten PUFAs, kann durch direkte Wirkung der Manipulation oder eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden.

Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung eines Isomerase-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einer Ölfruchtpflanze oder einem Mikroorganismus aufgrund eines veränderten Proteins direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder Aktivität des Isomerase-Proteins oder -Gens sowie von Genkombinationen von verschiedenen Isomerasen kann erhöht sein, so dass größere Mengen dieser Verbindungen de novo hergestellt werden, weil den Organismen diese Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese vor dem Einbringen des entsprechenden Gens fehlte. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Enzymen aus dem Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA-Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden Gewebes ermöglicht.

Für das erfindungsgemäße beschriebene Verfahren ist es vorteilhaft, in den Organismus in Verfahrensschritt (a) zusätzlich mindestens eine weitere Nukleinsäure einzubringen, die für ein Polypeptid mit Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe einer Δ-5-Desaturase, einer Δ-6-Desaturase, einer Δ-8-Desaturase oder Δ-12-Desaturase.

Für das beschriebene Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen beispielsweise aus Linolsäure oder Linolensäure ist neben den erwähnten Isomerasen (= SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6) eine weitere Δ-12-Desaturase vorteilhaft, durch die die Menge an Ausgangsprodukt der Isomerisierungsreaktion erhöht werden kann. Um eine breite PAIette an mehrfach ungesättigten Fettsäuen zugänglich zu machen können vorteilhaft weitere Gene für Enzyme wie Desaturase wie für eine Δ-4-Desaturase, eine Δ-5-Desaturase, eine Δ-6-Desaturase und/oder eine Δ-8-Desaturase oder Elongase wie eine Δ-5-Elongase, eine Δ-6-Elongase und/oder Δ-9-Elongase in die Wirtsorganismen eingebracht werden.

Die Bildung von Konjudien und/oder Konjutrienen Fettsäuren beispielsweise aus Linolsäure, Linolensäure und/oder Dihomo-γ-Linolensäure ist besonders vorteilhaft aus Ölsaaten wie Soja, Sonnenblume, Safflower oder vorteilhaft Lein möglich, die einen kostengünstigen und einfachen Zugang zu Konjudien und/oder Konutrienen durch ihren hohen Gehalt an Linolsäure und/oder Linolensäure ermöglichen. Um Raps, der einen hohen Ölsäuregehalt hat, für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft verwenden zu können, muss zusätzlich zur Isomerase noch eine weitere enzymatische Aktivität (Δ-12-Desaturase) in die Pflanze eingebracht werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Isomeraseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

h) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, oder
i) einer Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder
j) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, oder
k) einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokanontischen codonusage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 %, vorteilhaft mindestens 1, 2, 3 oder 5 bevorzugt mindestens 6, 7, 8, 9 oder 10 %, besonders bevorzugt mindestens 20, 30, 40 oder 50 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90 % eines eukanontischen codon-usage unterscheidet, oder
l) Derivate der unter (d) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein, vorteilhaft mindestens 2, bevorzugt mindestens 3, besonders bevorzugt mindestens 4, ganz besonders bevorzugt mindestens 5 – Codontripletts vorteilhaft am 5' Ende der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäure codieren, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist.

Unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 genannten Sequenz sind wie oben beschrieben beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 90 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 95 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 96, 97 oder 98 % Homologie, ganz besonders bevorzugt 99; 99,5; 99,6; 99,7; 99,8; 99,9 oder 99,95 % Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Für Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], die im GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte wurden mit dem Programm BestFit über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 8, Length Weight: 2. Unter Homologie ist für die vorliegende Erfindung Identität zu verstehen. Beide Begriffe sind synonym. Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine sowie das eukaryontische Codon-usage erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Organismen wie oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen Isomerasegenen in dem Fachmann bekannterweise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standdardbedingungen sind Bedingungen zu verstehen, wie sie in dieser Beschreibung weiter oben offenbart wurden.

Vorteilhaft weisen die unter Punkt (b) genannten Nukleinsäuresequenzen eine möglichst geringe Abänderung des codon-usage auf, da diese wenigen Änderungen schon den erfinderischen Effekt aufweisen, das heißt die Expression der Nukleinsäuresequenzen in den eurkaryontischen Organismen ermöglichen und da je weniger Änderungen des codon-usage in die Sequenzen eingefügt werden müssen, desto einfacher lassen sich diese Sequenzen in vitro erzeugen. Vorteilhaft sollten die Änderungen in einem Bereich von 0,5 bis 99 %, vorteilhaft zwischen 0,5 bis 90 %, bevorzugt zwischen 1 bis 50 %, besonders bevorzugt zwischen 1 bis 40 %, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 bis 20 % der gesamten Sequenz liegen. Bevorzugt werden diese Änderungen am Aminoterminalen Ende bzw. 5'-Ende der Sequenzen eingefügt. Es ist aber auch eine Änderung an anderer Stelle möglich, beispielsweise am C-Terminus oder innerhalb der Sequenz oder an mehreren Stellen innerhalb der Sequenz.

Der mRNA-instruierte Vorgang der Translation in ein Protein wird durch den codonusage eines jeden speziellen Organismus beeinflusst. Wobei die Funktion f(x) -> y, mit x aus der Menge der Codonen, des genetischen Codes, y aus der Menge der Aminosäuren notiert werden, hierbei ist feine Funktion, die jedes Codon genau auf eine Aminosäure abbildet. Diese Abbildung erfolgt im Sinne der Mathematik nicht eineindeutig, das heißt mehrere Codonen codieren für dieselbe Aminosäure. Der genetische Code wird deshalb als degeneriert bezeichnet, da einige Aminosäuren durch mehrere (synonyme) Codonen codiert werden. Nicht für jedes Codon existiert eine spezifische tRNA, an Position eins des Anticodons können modifizierte Basen eingebaut sein und im Codon/Anticodon-Komplex sind an der dritten Position des Codons Fehlpaarungen erlaubt (Cricksche Wobble-Regel). Der Informationsgehalt der drei Basenpositionen im Codon ist nicht gleich, es gilt der höchste Informationsgehalt ist in Position 2, danach folgt Position 1 gefolgt von Position 3. Deshalb verändert eine Mutation der dritten Base im Codon die Aminosäurenkomposition häufig nicht, eine Mutation in der ersten Basenposition führt häufig zum Einbau einer Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, eine Mutation der mittleren Base verursacht häufig den Einbau einer Aminosäure mit anderen Eigenschaften. Die geringsten Auswirkungen auf die Aminosäurenkomposition der Proteine haben somit Veränderungen der Basenkomposition in Position drei des Codons, gefolgt von Veränderungen der Basenkomposition an Position eins. Trotzdem ist der genetische Code quasi universell, abweichende Codonzuordnungen finden sich jedoch z.B. bei Mitochondrien, Mycoplasma und einigen Protozoen. Die Häufigkeit, mit der Codonen in Genen vorkommen, schwankt zwischen den taxonomischen Gruppen beträchtlich. Die Codonpräferenzen von E. coli und Salmonella typhimurium sind sich relativ ähnlich, die der von ihnen taxonomisch entfernte Gattung Bacillus speziell die Spezies B. subtilis weichen von beiden stark ab. Innerhalb des genetischen Codes gibt es synonyme Codonen, die für dieselbe Aminosäure codieren. Die Verwendung dieser synonymen Codonen in den verschiedenen Organismen erfolgt nicht mit vergleichbarer Häufigkeit, das heißt einige werden bevorzugt eingebaut. Zusätzlich variiert die Codon-Häufigkeiten noch innerhalb einer Species zwischen verschiedenen Genen, je nachdem wie stark diese Gene exprimiert werden sollen. In bestimmten Genen tritt speziesspezifisch eine Teilmenge der Codonen bevorzugt auf. Diese Verzerrung der Codon-Häufigkeiten ist, wie gesagt, positiv korreliert mit der Genexpression. Mögliche Ursachen für diese Verzerrung der Codon-Häufigkeiten sind die unterschiedlichen Konzentrationen der tRNAs, die Aufrechterhaltung der maximalen Elongationsrate, die Kosten für das Korrekturlesen sowie unterschiedliche Translationsraten der Codonen etc.. Diese Verzerrung der Codon-Häufigkeiten wird als "Strategie" interpretiert, die Wachstumsraten zu optimieren. Da in den verschiedenen Organismen ein unterschiedlicher Codongebrauch für dieselbe Aminosäure verwendet wird, das heißt die Codonen anderes abgebildet werden, gibt es bei der Expression einer definierten aus einem Organismus stammenden Sequenz in einem anderen Organismus immer wieder unvorhersehbare Überraschungen, das heißt eine Sequenz kann plötzlich deutlich stärker oder schwächer oder gar nicht mehr exprimiert werden. Häufig erfolgt auch trotz Anpassung des genetischen Codes der Sequenzen auf den Wirtsorganismus keine Expression der Sequenzen. Um so unerwarteter war es, dass die erfindungsgemäßen Sequenzen schon nach einer Änderung von ca. 0,5 % der Codonen exprimiert wurden. Da der genetische Code dem Fachmann geläufig ist ebenso wie der Codongebrauch unterschiedlicher Gattungen und Arten und da für die Codonanpassung Algorithmen zur Verfügung stehen, kann er eine Anpassung der erfindungsgemäßen Sequenz an das condon-usage des Wirtsorganismus vornehmen. Beispiele für eine derartige Übersetzung sind den verwendeten Primern I und II zu entnehmen.

Vorteilhaft wird zur Verbesserung der Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11 in einem transgenen (Wirts)organismus die Sequenz in der Weise verändert, dass der codon-usage nach dem Startcodon so verändert wird, dass er optimal an den codon-usage des zur Expression verwendeten eurkaryontischen nicht-humanen Organismus angepasst ist und dadurch optimal exprimiert wird. Diese Veränderung kann vorteilhaft mit Hilfe der folgenden Primer erfolgen, wobei die Primer I vorteilhaft für die Veränderung der Bifidobakteriumsequenz (SEQ ID NO: 9) und die Primer II vorteilhaft für die Veränderung der Lactobacillussequenz (SEQ ID NO: 11) verwendet werden: Primer I:

Der zur Veränderung von SEQ ID NO: 7 (Propionibakteriumsequenz) verwendete Primen ist den Beispielen zu entnehmen. Die korrespondierenden Aminosäuresequenzen der Sequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11 sind den Sequenzen SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 12 zu entnehmen.

Durch diese Veränderung des codon-usage wird eine zusätzliche Aminosäure in die Aminosäuresequenzen eingefügt (siehe SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6), wobei jedoch die sonstige Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Weiterhin wird eine Schnittstelle in die Nukleinsäure(n) für ein Restriktionsenzym eingefügt. Die Veränderung führt zu folgenden geänderten Nukleinsäuresequenzen:
BBI (Bifidobacteriumssequenz):

Die unter Punkt (c) beschriebenen Nukleinsäuresequenzen weisen vorteilhaft nur ein weiteres Codontriplett auf. Dies führt zu einer um eine Aminosäure verlängerte Aminosäuresequenz der Isomerase. Prinzipiell ist auch eine Veränderung der Sequenz ohne eine Verlängerung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz möglich. Im vorliegenden Fall wurde durch die Verlängerung eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym in die Sequenz eingeführt. Diese Schnittstelle kann aber auch außerhalb der codierenden Sequenz eingefügt werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Aminosäuresequenz codiert durch die vorgenannten Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, oder SEQ ID NO: 5 bzw. deren vorgenannte Derivate. Diese Aminosäuresequenzen sind SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder zu entnehmen.

Unter Derivate(n) im erfindungsgemäßen Verfahren bzw. zur erfindungsgemäßen Nukleinsäure sind beispielsweise funktionelle Homologe der von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 codierten Enzyme oder deren enzymatischer Aktivität, d.h. Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie das von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 codierte Enzym katalysieren, zu verstehen. Diese Gene ermöglichen ebenfalls eine vorteilhafte Herstellung ungesättigter konjugierter Fettsäuren.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologiescreening verwendet werden.

Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen wie Mikroorganismen des Pansens von Wiederkäuern, dem Darm anderen Tiere oder aus Starterkulturen von Molkereiprodukten oder Silagen isolieren. Vorteilhafte Derivate bzw. Homologe lassen sich Mikroorganismen wie Pilzen, Hefen, Protozoen oder Bakterien wie gram-negativen oder gram-positiven Bakterien, bevorzugt aus gram-positiven Bakterien wie beispielsweise aus den Gattungen Propionibakterium, Lactococcus, Bifidobacterium oder Lactobacillus, besonders bevorzugt aus den Gattungen Lactobacillus oder Bifidobacterium isolieren.

Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 genannten Sequenz beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 90 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 95 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 96, 97 oder 98 Homologie, ganz besonders bevorzugt 99; 99,5; 99,6; 99,7; 99,8; 99,9 oder 99,95 Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Für Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], die im GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte wurden mit dem Programm BestFit über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 8, Length Weight: 2. Der Homologievergleich wurde mit dem Programm Unter Homolgie ist für die vorliegende Erfindung Identität zu verstehen. Beide Begriffe sind synonym. Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine sowie das eukaryontische Codon-usage erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Organismen wie oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen Isomerasegenen in dem Fachmann bekannterweise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50 Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30 bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs bedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45 bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G+C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G+C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 beispielsweise vorteilhaft prokaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich –1 bis –2000 vor dem Startcodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verändert wurden.

Vorteilhaft kann das Isomerase-Gen im erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert werden. Insbesondere die Kombination mit einer Δ-12-Desaturase ist vorteilhaft.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen sind Proteine zu verstehen, die eine in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die enzymatische Aktivität der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Proteine erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich verändert wird. Diese nicht wesentlich veränderten Proteine sind daher noch enzymatisch aktiv, das heißt funktio nell. Unter nicht wesentlich verändert sind alle Enzyme zu verstehen, die noch mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 30 % der enzymatischen Aktivität des Ausgangsenzyms aufweisen. Oder deren enzymatische Aktivität im Vergleich zum Ausgangsenzym bzw. der Ausgangsaminosäuresequenz um mindestens 10 %, bevorzugt um 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 100 % gesteigert ist. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.

Unter den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukten oder fragmenten sind Sequenzen zu verstehen, die mindestens eine der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 enthalten oder die sich als Ergebnis des genetischen Codes durch Rückübersetzung aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 ableiten lassen oder Derivate der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 enthalten und die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt) kann aber auch einfacher aufgebaut sein, d.h., es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Das Isomerase-Gen bzw. die Isomerase-Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacl^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ -P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden und vorteilhaft für die Vermehrung der Nukleinsäure in diesen Organismen verwendet werden können. Weitere vor teilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Weitere vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer ( EP 388186 ), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Latz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer ( EP335528 ) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (VWO9321334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Fettbiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der usp-Promotor, der LEB4-Promotor, der Phaseolin-Promotor oder der Napin-Promotor.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Im Nukleinsäurefragment(en) [= Genkonstrukt(en), Nukleinsäurekonstrukt(en)] können neben SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, und/oder SEQ ID NO: 5 wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Isomerase-Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese. Vorteilhafte Fettsäurebiosynthesegene sind ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Acyl-CoA-Dehydrogenase, eine Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase, eine Acyl-ACP-Thioesterase, eine Fettsäure-Acyl-Transferase, eine Fettsäure-Synthase, eine Fettsäure-Hydroxylase, eine Acetyl-Coenzym A-Carboxylase, eine Acyl-Coenzym A-Oxidase, eine Fettsäure-Desaturase, eine Fettsäure-Acetylenase, eine Lipoxygenase, eine Triacylglycerol-Lipase, eine Allenoxid-Synthase, eine Hydroperoxid-Lyase, einen Fettsäuretransporter oder eine Fettsäure-Elongase codieren. Vorteilhaft werden die Isomerasegene im gleichen Nukleinsäurekonstrukt verwendet wie die weiteren Gene bevorzugt wird als weiteres Gen ein Δ-12-Desaturasegen verwendet.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte werden zur Expression in einem Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSi, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Connebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen PAIS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2☐M, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.

Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, z.B. rekombinante Expressionsvektoren, die mindestens eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendetes Nukleinsäuremolekül enthalten, und Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind, insbesondere eukaryontische Mikroorganismen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe, -organe oder ganze Pflanzen. Bei einer Ausführungsform kann eine solche Wirtszelle die hergestellten konjugierten und nicht-konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen speichern; zur Isolation der gewünschten Verbindung werden die Zellen geerntet. Die Verbindung (Öle, Lipide, Triacylglyceride, Fettsäuren) kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden, die die vorgenannten rnehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten oder speichern, am stärksten bevorzugt Zellen sind Zellen von Speichergeweben wie bei Pflanzen Zellen von Samenhüllen, Knollen, Epidermis- und Samenzellen.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine genetisch veränderte Pflanze, bevorzugt ein Ölfruchtpflanze, wie vorstehend erwähnt, besonders bevorzugt eine Lein-, Sonnenblumen-, Baumwoll- oder Safflorpflanze, in die ein Isomerase-Gen eingebracht worden ist. Bei einer Ausführungsform ist das Genom von Lein, Raps, Soja, Sonnenblume, Baumwolle oder Safflor durch Einbringen eines Isomerase-Gens, das für eine Wildtyp- oder mutierte Isomerase-Sequenz codiert, als Transgen verändert worden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Lein, Sonnenblume, Soja oder Safflor auch zur Produktion einer gewünschten Verbindung, wie Lipiden und Fettsäuren, wobei Triene und/oder Diene besonders bevorzugt sind ganz besonders bevorzugt ist CLA, verwendet.

Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologen Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Vorteilhafterweise enthalten die Nukleinsäurefragmente zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus (= transgener Organismus) bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt; der Singular soll für die vorliegende Beschreibung auch den Plural umfassen) auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor oder der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz bestehen.

Vorteilhafterweise wird die Nukleinsäuresequenz (der Singular soll für die vorliegende Beschreibung auch den Plural umfassen) zusammen mit mindestens einem Reportergen in ein Nukleinsäurekonstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das IIv2-Gen, das Luciferasegen, das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatasegen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen. Weiterhin können erfolgreiche Transformationen vorteilhaft mit diesen Reportergenen identifiziert werden.

Ein Nukleinsäurekonstrukt für Pflanzen enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.

Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

Die Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.

Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.

Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.

Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierbare Alphaamylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinll-Promotor ( EP-A-0 375 091 ).

Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps ( US 5,608,152 ), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Onzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen).

Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten Isomeren allein oder in Kombination mit Desaturasen wie der Δ-12-Desaturase gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden.

Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können in die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.

Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.

Der Wirtsorganismus enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz und/oder des Nukleinsäurekonstrukts.

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, des Nukleinsäurekonstrukts oder des Vektors in Organismen beispielsweise Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Gold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Gold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu.

Rev. Plant Physiol. Plant. Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.

Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen, insbesondere von Öl-haltigen Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter, Blattstücke, Hypocotylstücke oder Wurzeln in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Unter Verwendung des GATE-WAY-Systems von Invitrogen zur Klonierung sind keine geeigneten Schnittstellen im Vektor mehr notwendig.

Um eine stabile Integration der Isomerasegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Isomerase und/oder die vorteilhafte Δ-12-Desaturase codieren, unter der Kontrolle eines eigenen bevorzugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zu Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen früheren können. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt vorteilhaft in einem Polylinker anschließend gegebenenfalls ein Terminator hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu zwei- oder dreimal. Die Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator. Es ist aber auch möglich mehrere Nukleinsäuresequenzen hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, d.h. eine Nukleinsäuresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4-, DC3- oder der Ubiquitin-Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden. Dies kann jedoch zu unerwünschten Rekombinationsereignissen führen.

Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatoren am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stoppcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann z.B. der OCS1 Terminator. Wie auch für die Promotoren, so sollten hier für jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.

Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren eignen sich prinzipiell alle eukaryontischen Organismen, wie sie schon genannt wurden, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Aste raceae wie Calendula, Punicaceae wie Punica granatum oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersaflor, Rizinus, Flachs, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Färbersaflor, Flachs, Calendula oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere beispielsweise C. elegans verwendbar.

Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder Nukleinsäurekonstrukte nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch, dass die Nukleinsäuren oder Expressionskassetten an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, d.h. eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Organismen sind die oben genannten transgenen Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Nachtkerze, Hanf, Diestel, Erdnuss, Canola, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpaame, Kokosnuss) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Hanf, Nachtkerze, Sonnenblume, Safflor, Bäume (ÖlPAIme, Kokosnuss).

Die Verwendung der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen oder des Nukleinsäurekonstrukt zur Herstellung von transgenen eukaryontischen Organismen bzw. transgenen Pflanzen gehört deshalb auch zu den Erfindungsgegenständen.

Vorteilhaft wird zur Herstellung von transgenen eukaryontischen Organismen bzw. transgenen Pflanzen eine Nukleinsäuresequenz verwendet ausgewählt aus der Gruppe:

a) Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, oder
b) Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist, oder
d) einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokaryontischen codon-usage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 %, vorteilhaft mindestens 1, 2, 3 oder 5 % bevorzugt mindestens 6, 7, 8, 9 oder 10 %, besonders bevorzugt mindestens 20, 30, 40 oder 50 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90 % eines eukaryontischen codon-usage unterscheidet, oder
e) Derivate der unter (d) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein, vorteilhaft mindestens 2, bevorzugt mindestens 3, besonders bevorzugt mindestens 4, ganz besonders bevorzugt mindestens 5 Codontripletts vorteilhaft am 5' Ende der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäure codieren, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist wie oben beschrieben ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuregemischen mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine oben beschriebene Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt oder einen Vektor in einen bevorzugt Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und das in dem Organismus enthaltene Öl und/oder Triglycerid isoliert und die im Öl und/oder Triglycerid enthaltenden Fettsäuren freisetzt.

Auch ein Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten und/oder nicht-konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine oben beschriebene Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt oder einen Vektor in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert, gehört zu den Erfindungsgegenständen.

Beide Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Synthese von Fettsäuregemischen oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten und/oder nicht-konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft drei Doppelbindungen. Da diese speziell in Pflanzen natürlicherweise nicht vorkommt, sind die aus den Pflanzen resultierenden Öle, Lipide und/oder Fettsäuregemische neu. Gleiches gilt auch für andere eukanontische Organismen.

Als Organismen für die genannten Verfahren seien beispielhaft Pflanzen wie Arabidopsis, Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersavflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, ÖlPAIme, Färbersavflor, Rizinus, Calendula, Punica, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Calendula, Punica oder Saccharomyces cerevisiae.

Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und 100°C, bevorzugt zwischen 10 bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, d.h. während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert werden.

Pflanzen werden nach Transformation zunächst wie oben beschrieben regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. angebaut.

Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0 bis 80°C, bevorzugt zwischen 20 bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Überschuss an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuss von Lösungsmittel zu Biomasse von 1:4. Das Lösungmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem CO₂ erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.

Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmitteln wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über Säulen ist möglich.

Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicherweise verseift.

Die Erfindung wird im Folgenden an Beispielen erläutert:
Beispiel 1: Klonierung und Expression der CLA-Isomerase aus Propionibacteium acnes in Bakterien
Die cDNA der CLA-Isomerase aus Propionibacterium acnes, welche Linolsäure in das t10,c12-CLA-Isomer umsetzt, war bekannt von WO 01/00846 und wurde unter – Verwendung von folgenden Primern über eine PCR mit Pfu-Polymerase (Roche – Diagnostics) amplifiziert und in den pSE380 Vektor (Invitrogen) kloniert:
Primer A: 5' – ATC TGC AGA TGT CCA TCT CGA AGG AT – 3' Forward Primer (mit Pstl Schnittstelle)
Primer B: 5' – GCG AGC TCA CAC GAA GAA CCG CGT C – 3' Reverse Primer (mit Sacl Schnittstelle)

Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

dNTP-Mix (10 mM)	1,0 μl
Forward Primer (10 μM)	2,0 μl
Reverse Primer (10 μM)	2,0 μl
Temolate (1/100 verdünnte genomische DNA von Propionibacterium acnes)	1,0 μl
10-Fach Puffer	5,0 μl
Polymerase (3,5 U/μl)	0,5 μl
Wasser	38,5 μl
Gesamtvolumen	50,0 μl

Es wurde folgendes PCR-Programm verwendet:
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus einem präparativen Agarosegel geschnitten und mit dem QiaQuick Gel Elution Kit (Qiagen) eluiert. Sowohl das PCR-Fragment als auch der pSE380 wurden mit Pstl und Sacl geschnitten und der offene Vektor wurde zusätzlich mit einer alkalischen Phosphatase dephosphoryliert. Beide DNA-Fragmente wurden mit der T4-Ligase zueinander ligiert. Das so hergestellte pSE-PAI-Konstrukt wurde in E. coli amplifiziert und zur Kontrolle doppelsträngig sequenziert.
Beispiel 2: Expression einer codon-optimierten CLA-Isomerase aus Propionibacterium acnes in Hefe
In einem ersten Ansatz wurde der N-Terminus der Isomerase so verändert, dass die ersten 60 Basenpaare der codierenden Sequenz der optimalen Codonzusammensetzung der Hefe entsprechen. Anschließend wurde die modifizierte cDNA in einen Hefeexpressionsvektor kloniert und die Funktionalität der modifizierte Isomerase in Hefe überprüft.
Ein Forward Primer mit codon-optimierter Sequenz wurde verwendet, um mittels PCR eine codon-optimierte Propionibacterium Isomerase zu generieren. Die PCR erfolgte mit dem Expand High Fidelity-PCR-System (Roche Diagnostics) unter Verwendung von folgenden Primern:

Forward Primer (mit EcoRI Schnittstelle)

Reverse Primer (mit Notl Schnittstelle)
Durch die Verwendung der Primer wird die folgende Originalsequenz:
zur folgenden modifizierten Sequenz verändert:
SEQ ID NO: 1 gibt die optimierte, modifizierte Gesamtsequenz der Propionibacterium acnes Nukleinsäuresequenz wieder. SEQ ID NO: 7 ist die Originalsequenz zu entnehmen.

Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

dNTP-Mix (10 mM)	1,0 μl
Forward Primer (10 μM)	4,0 μl
Reverse Primer (10 μM)	4,0 μl
Template (1/50 verdünnte pSE-PAI Plasmid-DNA)	1,0 μl
10-Fach Puffer	5,0 μl
Polymerase (3,5 U /μl)	0,5 μl
Wasser	34,5 μl
Gesamtvolumen	50,0 μl

Es wurde folgendes PCR-Programm verwendet:
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus einem präparativen Agarosegel geschnitten, mit GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience) eluiert und in den pGEM-T-Vector (Promega) nach Herstellerangaben kloniert. Nach einer Amplifikation der Plasmid-DNA in E. coli, wurde die codon-optimierte Isomerase-cDNA über die EcoRl und Notl Schnittstellen in den gleichfalls geschnittenen Vektor pYES2 ligiert. Das so hergestellte pY2-coPAI-Konstrukt wurde in E. coli amplifiziert und zur Hefe-Expression in den Hefestamm INVSc1 (Invitrogen) mit der LiAc-Methode-(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995) transformiert.

a) Expression in Hefezellen Sämtliche Fest- und Flüssigmedien für Hefe wurden nach Protokolle von Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995) hergestellt. Die Expression von coPAI in S. cerevisiae INVSc1 erfolgte modifiziert nach Avery et al. (Appl. Environ. Microbiol., 62, 1996: 3960-3966) und Girke et al. (The Plant Journal, 5, 1998: 39-48). Um eine Starterkultur herzustellen, wurden 20 ml SD-Medium mit Glucose und Aminosäure-/Baselösung ohne Uracil für die Selektion mit einer Hefe-Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 30°C und 140 rpm inkubiert. Die Zellkultur wurde zweimal gewaschen durch Abzentrifugieren und Resuspendieren in SD-Medium ohne Supplemente und ohne Zucker. Mit den gewaschenen Zellen wurde eine Hauptkultur auf eine OD600 von 0,1 bis 0,3 angeimpft. Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte in 25 ml SD-Medium mit 2 % (w/v) Galaktose,Aminosäure-/Baselösung ohne Uracil für die Selektion, 0,02 % Linolsäure (2%ige Stammlösung in 5 % Tergitol NP40), 10 Tergitol NP40 72 Stunden lang bei 30°C. Die Ernte der Hauptkultur erfolgte über Zentrifugation (10 min, 4000 rpm, 4°C). Das Zellpellet wurde bei –20°C eingefroren und anschließend für mindestens 18 Stunden lyophilisiert.
b) Lipidextraktion der Fettsäuren aus transgener Hefe Die lyophilisierten Hefepellets wurden in 1,35 ml Methanol/Toluol (2:1) und 0,5 ml Natrium-Methoxid-Lösung extrahiert. Das Zellmaterial wurde mit einem Glasstab möglichst fein zermörsert und dann 1 h lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden 1,8 ml 1 M NaCl-Lösung und 3 ml n-Heptan zugegeben und 10 min lang bei RT unter Schütteln inkubiert. Nach Phasentrennung durch Zentrifugation (10 min, 4000 rpm, 4°C) wurde der Heptan-Überstand in ein Reagenzglas überführt und unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in 3 mal 0,3 ml Hexan aufgenommen, in ein Eppendorf-Gefäß überfährt und wiederum unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 μl Acetonitril aufgenommen und die Probe per GC bzw. GC/MS analysiert.
c) Extraktion der freien Fettsäuren aus transgene Hefe Die Isomerase aus P. acnes nimmt freie Linolsäure als Substrat. Um nachzuweisen, ob nach Expression der coPAI in Hefezellen das t10,c12-CLA-Isomer im Pool der freien Fettsäuren vorkommt, wurden die freien Fettsäuren mit der HIP-Methode extrahiert, mit Methanol methyliert und anschließend mittels GC oder GC/MS nachgewiesen. Für die HIP-Extraktion wurde das Hefepeleet in 15 ml HIP-Puffer (Hexan/Isopropanol 3:2 (v/v) mit 0,0025 % BHT (2,6-Di-tert.-butyl-4-methyl-phenol)) aufgenommen und mit einem Glasstab möglichst fein homogenisiert. Nach Zugabe von 75 μl 1 M HCl wurde das Gemisch für 5 min bei RT unter Schütteln inkubiert. Nach einer Phasentrennung durch Zentrifugation (10 min, 4000 rpm, 4°C) wurde der Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt, aufgefüllt auf 22,5 ml mit einer K₂SO₄-Lösung (66,6 g K₂SO₄/I H₂O) und wiederum für 5 min bei RT unter Schütteln inkubiert. Nach einer erneuten Phasentrennung durch Zentrifugation (5 min, 4000 rpm, 4°C) wurde der Überstand in ein neues Reagenzglas überführt und unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde mit 2 mal 1 ml Hexan in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und wiederum unter Stickstoff eingedampft. Letztendlich wurde der Rückstand in 400 μl Methanol aufgenommen. Zur Methylierung der extrahierten freien Fettsäuren wurde die extrahierte Probe in 400 μl Methanol mit 10 μl EDAC-Lösung (N-(3-Dimethylaminoproyl)-N'-ethylcarbodümide hydrochloride, 1 mg in 10 ml Methanol) versetzt und 2 h bei RT unter Schütteln inkubiert. Nach Zugabe von 200 μl 0,1 M Tris/HCl-Lösung, pH 7,5, als auch 1 ml Hexan wurde das Gemisch gründlich vermischt durch Vortexen und zentrifugiert (5 min, 12000 rpm, RT). Nach der Phasentrennung wurde die obere Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Das Gemisch wurde nochmals mit 1 ml Hexan extrahiert, beide Hexanphasen vereinigt und unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde in 40 μl Acetonitril aufgenommen.
d) GC-Analyse Zur GC-Analyse der Fettsäure-Methylester (FAME) wurden 7 μl der Probe (in Acetonitril) in ein Probenröhrchen überführt und 1 μl injiziert. Die GC-Analyse erfolgte über eine HP-DB23 (Cross-linked PEG; 30 m × 0,32 mm × 0,5 μm Beschichtungsdicke) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min. Als Trägergas diente Helium. Die Injektionstemperatur betrug 220°C. Folgender Temperaturgradient wurde angelegt: 1 min 150°C, 150°C bis 200°C (mit 15°C/min), 200°C bis 250°C (mit 2°C/min), 5 min 250°C. Die Detektion der FAME erfolgte über einen Flammen-lonisations-Detektor (FID) bei 275°C. Die Retentionszeiten betrugen für konjugierte Linolsäure 10c,12-CLA 14,3 min. Die Retentionszeiten für Linolsäure betrug 12,68 min und für Ölsäure 11,86 min.

Resultate
In 1 ist die Produktion von t10,c12-CLA in Hefezellen dargestellt (Hefeexpression PAI – transmethyliert), die mit der codon-optimierten CLA-Isomerase aus Propionibacterium acnes (= PAl-Isomerase oder kurz PAI) transformiert wurden. 1A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen, die mit dem Leervektor pYES2 transformiert wurden. Die Zellen wurden 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retentionszeit von t10,c12-CLA auf. In 1B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pY2-coPAI dargestellt. Die Zellen wurden wiederum 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist einen deutlichen Peak mit einer Retentionszeit von 14,37 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. 1A ) und die gleiche Retentionszeit wie t10,c12-CLA aufweist (vgl. 1C). Die Expression erfolgte im Stamm INVSc1, der 3 Tage bei 30°C auf Linolsäure angezogen wurde, anschließend erfolgte eine Transmethylierung der Fettsäuren.
In 2 wird das Vorkommen des t10,c12-CLA-Isomer in dem Pool der freien Fettsäuren dargestellt. 2A zeigt das Gas-Chromatogramm der methylierten Fettsäuren aus Hefezellen, die mit dem Leervektor pYES2 transformiert wurden. Die Zellen wurden 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retentionszeit von t10,c12-CLA auf. In 2B ist das Gas-Chromatogramm der methylierte Fettsäuren aus Hefezellen transformiert mit pY2-coPAI dargestellt. Die Zellen wurden wiederum 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist einen deutlichen Peak mit einer Retentionszeit von 14,29 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. 2A) und die gleiche Retentionszeit wie das t10,c12-CLA-Isomer aufweist (vgl. 2C). Die Expression erfolgte im Stamm INVSc1, der 3 Tage bei 30°C auf Linolsäure angezogen wurde, anschließend erfolgte eine Methylierung der Fettsäuren.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der GC-Analysen dargestellt. Die Leerkontrolle zeigt die Fettsäurezusammensetzung von transgenen Hefezellen, die mit dem leeren pYES Vektor transformiert wurden. PAI 4.3.1, PAI 4.3.2, PAI 6.1.1 und PAI 6.1.2 entsprechen unabhängigen Wiederholungen der coPAI-Expression in transgenen Hefezellen. Experiment A stellt die FAME-Analysen der Lipide nach Inkubation für 72 h bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure dar. Experiment B stellt die FAME-Analysen der freien Fettsäuren nach Inkubation für 72 h bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure dar. Experiment C stellt die FAME-Analysen der Lipide nach Inkubation für 10 Tage bei 16°C mit 0,02 % Linolsäure dar.
Die in 1, 2 und Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die codonoptimierte Isomerase aus P. acnes in Hefe zur Bildung von t10,c12-CLA durch Umsetzung von Linolsäure führt. Der Nachweis von t10,c12-CLA aus transformierten Hefezellen gelang nach Hydrolyse der Lipide. Da Hefe kaum Triacylglyceride enthält, muss man davon ausgehen, dass der Großteil der so nachgewiesenen t10,c12-CLA in den Phopholipiden der Hefe gebunden war. Der Nachweis von t10,c12-CLA aus transformierten Hefezellen gelang auch nach Extraktion und Methylierung der freien Fettsäuren. Das deutet darauf hin, dass die coPAI in transgene Hefezellen auch die freien Fettsäuren als präferentielles Substrat benutzen.
Beispiel 3: Expression der Isomerase aus Propionibacterium acnes in Hefe
Um die Funktionalität der Propionibacterium acnes Isomerase (PAI) cDNA aus der WO 01/00846 Anmeldung in einem eukaryontischen Organismus nachzuweisen, wurde in einem ersten Ansatz der codierende Bereich der cDNA von PAI in einen Hefeexpressionvektor kloniert und in S. cerevisiae exprimiert. Die in der Hefe produzierte Isomerase sollte zugesetzte Linolsäure in das t10,c12-CLA-Isomer umsetzen. Dies wiederum sollte in transmethylierten Lipidextrakten als auch in methylierten Hefeextrakten über GC und GC/MS als Methylester nachgewiesen werden.
Die PAI-cDNA wurde über eine PCR mit dem Expand High Fidelity-PCR-System (Roche Diagnostics) unter Verwendung von folgenden Primern amplifiziert und in den pYES2 Vektor kloniert:
Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

dNTP-Mix (10 mM) 1,0 μl

Forward Primer (10 μM) 4,0 μl

Reverse Primer (10 μM) 4,0 μl

Template (1/50 verdünnte

pSE-PAI Plasmid-DNA) 1,0 μl

10-Fach Puffer 5,0 μl

Polymerase (3,5 U /μl) 0,5 μl

Wasser 34,5 μl

Gesamtvolumen 50,0 μl
Es wurde folgende PCR-Programm verwendet:
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus einem präparativen Agarosegel geschnitten, mit GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience) eluiert und in den pGEM-T-Vector (Promega) nach Herstellerangaben kloniert. Nach einer Amplifikation der Plasmid-DNA in E. coli, wurde die Isomerase-cDNA über die Ndel und Xhol Schnittstellen herausgeschnitten und die cDNA-Enden mit der T4-Polymerase geglättet. Der pYES2 Vektor wurde mit EcoRl geöffnet, die cDNA-Enden mit der T4-Polymerase geglättet und mit einer alkalischen Phosphatase dephosphoryliert. Beide DNA-Fragmente wurden mit der T4-Ligase zueinander legiert und die Insertionsrichtung durch einen BamHl-Verdau überprüft. Das so hergestellte pY2-PAI-Konstrukt wurde in E. coli amplifiziert und zur Hefe-Expression in den Hefestamm INVSc1 (Invitrogen) mit der LiAc-Methode (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995) transformiert.

a) Expression in Hefezellen Die Expression von PAI in S. cerevisiae INVSc1 erfolgte, wie oben beschrieben, modifiziert nach Avery et al. (Appl. Environ. Microbiol., 62, 1996: 3960-3966) und Girke et al. (The Plant Journal, 5, 1998: 39-48).
b) Lipidextraktion der Fettsäuren aus transgener Hefe Die lyophilisierten Pellets von transgenen pY2-PAl-Hefezellen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben extrahiert.
c) Extraktion der freien Fettsäuren aus transgener Hefe Die freien Fettsäuren aus transgenen pY2-PAI-Hefezellen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit der HIP-Methode extrahiert, methyliert und anschließend mittels GC oder GC/MS nachgewiesen.
d) GC-Analyse Die GC-Analyse wurde wie oben in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.

Resultate
In Beispiel 2 wurde gezeigt, dass die codon-optimierte Isomerase aus Propionibacterium acnes (coPAI), wenn in Hefezellen exprimiert, die zugefütterte Linolsäure in das t10,c12-CLA-Isomer umsetzen kann. In analogen Experimenten mit der PAI aus WO 01/00846 konnte ebenfalls eine Umsetzung von Linolsäure in das t10,c12-CLA-Isomer in transgenen Hefezellen gezeigt werden, wenn auch in weit vermindertem Maße. Wir zeigen also, dass durch eine Codon Optimierung die Expression eines aktiven Isomerase Proteins, welches Linolsäure in t10,c12 CLA umsetzen kann, in einer eukaryontischen Zellen wie S. cerevisiae deutlich gesteigert werden kann.
In 4 ist die Produktion von t10,c12-CLA in Hefezellen dargestellt (Hefeexpression PAI – transmethyliert), die mit der bakteriellen CLA-Isomerase aus Propionibacterium acnes (= PAl-Isomerase oder kurz bakt.PAI) transformiert wurden. 4A zeigt das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen, die mit dem Leervektor pYES2 transformiert wurden. Die Zellen wurden 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retentionszeit von t10,c12-CLA auf. In 4B ist das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen transformiert mit pY2-bakt.PAI dargestellt. Die Zellen wurden wiederum 72 h lang bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure angezogen. Das Gas-Chromatogramm weist einen sehr kleinen Peak mit einer Retentionszeit von 14,37 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. 4A). Als Vergleich ist in 4C das Gas-Chromatogramm der Lipidextrakte aus Hefezellen, die mit pY2-PAI transformiert wurden und unter gleichen Bedingungen wie in 4A und b kultiviert wurden, dargestellt. Das Chromatogramm zeigt wie in 1 B einen deutlichen Peak mit einer Retentionszeit von 14,37 min auf, der Retentionszeit von t10,c12-CLA (siehe 1 C) . Die Expression erfolgte im Stamm INVSc1, der 3 Tage bei 30°C auf Linolsäure angezogen wurde, anschließend erfolgte eine Transmethylierung der Fettsäuren.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der GC-Analysen dargestellt. Die Leerkontrolle zeigt die Fettsäurezusammensetzung von transgenen Hefezellen, die mit dem leeren pYES Vektor transformiert wurden. PAI 4.3.1, PAI 4.3.2, PAI 6.1.1 und PAI 6.1.2 entsprechen unabhängigen Wiederholungen der coPAI-Expression in transgenen Hefezellen.
Bakt.PAI 4.1, 4.2, 9.1, 9.2 entsprechen unabhängigen Wiederholungen der bakt.PAI-Expression in transgenen Hefezellen. Experiment E stellt die FAME-Analysen der Lipide nach Inkubation für 72 h bei 30°C mit 0,02 % Linolsäure dar. Experiment Fstellt die FAME-Analysen der freien Fettsäuren nach Inkubation für 72 h bei 30°C mit 0,02 Linolsäure dar.
Beispiel 4: Inkubation aufgeschlossener transgener Hefezellen mit Linolsäure
Neben der funktionalen Expression der PAI und coPAI in transgenen Hefezellen wurde auch die Umsetzung von Linolsäure in das t10,c12-CLA-Isomer in vitro untersucht. Dazu wurden beide Klone in Hefezellen transformiert, und nach einer Hauptkultur wurden die Hefezellen mechanisch aufgeschlossen und mit freier Linolsäure inkubiert. Die Aktivität beider Isomerasen wurde über GC bzw. GC/MS bestimmt.
Eine Hauptkultur mit transgenen Hefen die entweder das pY2-PAI oder pY2-coPAI Konstrukt trugen wurde wie oben beschrieben angezogen. Nach einer Bestimmung der OD600 wurde die Hauptkultur durch Zentrifugation (7 min, 3800 rpm, 4°C) in sterilen Zentrifugenröhrchen geerntet. Die Zellpellets wurden mit 5 ml sterilem H₂O gewaschen und erneut geerntet (7 min, 3800 rpm, 4°C). Das Zellpellet wurde mit 5 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, gewaschen und erneut geerntet durch Zentrifugation (7 min, 3800 rpm, 4°C). Der Überstand wurde möglichst vollständig abgenommen und die Hefepellets für mindesten 2 h bei –80°C schockgefroren. Anschließend wurden die Pellets in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 aufgenommen, so dass ein OD600 von 30 entsteht. Es wurden 3 große Glaskugeln (Durchmesser 0,4 cm) und 1,3 g kleinen Glaskugeln (Durchmesser 0,25 bis 0,5 mm) pro Zentrifugenröhrchen dazugegeben. Das Zellmaterial wurde 1 min bei maximaler Schüttelfrequenz gevortext und anschließend für 1 min im Eisbad inkubiert. Dieser Vorgang wurde 6 mal wiederholt. Nach der letzten Wiederholung wurde das Zellmaterial abzentrifugiert (7 min, 3800 rpm, 4°C) und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieser Überstand wurde nochmals abzentrifugiert (10 min, 13000 rpm, 4°C) und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Letztendlich wurden 900 ml Zelllysat mit 250 ng Linolsäure für 30 min bei RT (= ca. 23 °C) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Fettsäuren nach Bligh und Dyer (Can. J. Biochem. Physiol., 37, 1959: 911-917) extrahiert; es wurden 100 ml Eisessig sowie 1,5 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, 2,5 ml Methanol und 2,5 ml Chloroform dazugegeben und das Gemisch für 1 min geschüttelt. Nach einer Phasentrennung durch Zentrifugation (10 min, 4000 rpm, RT) wurde die untere Phase in ein neues Reagenzglas überführt und unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde mit 2 mal 500 ml Chloroform in ein Reaktionsgefäß überführt und wiederum unter Stickstoff eingedampft. Der Rückstand wurde letztendlich in 100 μl Methanol gelöst.
Die restliche Probe von 90 μl wurde wie oben beschrieben methyliert und per GC gemessen. Tabelle 1: Ergebnisse der GC-Analysen
Resultate
Die Resultate der in vitro Umsetzung von Linolsäure in das t10,c12-Clr4-Isomer durch PAI und coPAI verhielten sich analog zu den Ergebnissen aus Beispiel 2. In 3 ist zu sehen, dass aufgeschlossene Hefezellen welche die codon-optimierte PAI exprimieren in der Lage sind zugefütterte Linolsäure in t10,c12-CLA umzusetzen. 3A zeigt das Gas-Chromatogramm der methylierten Fettsäuren aus Hefezelllysaten die mit dem leeren pYES2-Vektor transformiert wurden. Die Zelllysate wurden 30 min lang bei RT mit 200 ng Linolsäure inkubiert. Das Gas-Chromatogramm weist keine FAME mit einer Retentionszeit von t10,c12-CLA auf. In 3B ist das Gas-Chromatogramm der methylierte Fettsäuren aus Hefezelllysaten transformiert mit pY2-coPAI dargestellt. Die Zelllysate wurden wiederum 30 min lang bei RT mit 200 ng Linolsäure inkubiert. Das Gas-Chromatogramm weist einen deutlichen Peak mit einer Retentionszeit von 14,34 min auf, der im Kontrollansatz nicht auftritt (vgl. 3A) und die gleiche Retentionszeit wie das t10,c12-CLA-Isomer aufweist (vgl. 3C). Die Expression erfolgte im Stamm INVSc1, der 3 Tage bei 30°C angezogen wurde, anschließend erfolgte ein mechanischer Aufschluss und eine Inkubation in Gegenwart von Linolsäure mit anschließender Methylierung der Fettsäuren.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der GC-Analysen dargestellt. Die Leerkontrolle zeigt die Fettsäurezusammensetzung von transgenen Hefezellen, die mit dem leeren pYES Vektor transformiert wurden. PAI 4.3.1, PAI 4.3.2, PAI 6.1.1 und PAI 6.1.2 entsprechen unabhängigen Wiederholungen der coPAl-Expression in transgenen Hefezellen. Experiment D zeigt die Ergebnisse der FAME-Analysen von methylierten freien Fettsäuren nach Inkubation von Hefezelllysaten für 30 min bei RT mit 200 ng Linolsäure. Experiment E ist eine unabhängige Wiederholung von Experiment D.
Die in 3 und Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine Umsetzung von Linolsäure in das t10,c12-CLA-Isomer durch die codon-optimierte Isomerase aus Propionibacterium acnes auch in vitro möglich ist.
Beispiel 5: Expression in E. coli BL21(DE3)pLysS-Zellen

a) Zellanzucht Das entsprechend dem Beispiel 3 isolierte PAI-tragende DNA-Fragment wurde in den Vektor pET24a (Novagen) mit Hilfe der T4-Ligase (MBI-Fermentas) cloniert und anschließend zunächst in E. coli XL1-Blue-Zellen transformiert. Aus diesen wurden nach Bestätigung einer erfolgreichen Clonierung das entstandene Plasmid pET24a-PaI (0,2 μg) zur Transformation von E.coli BL21(DE3)pLysS-Zellen verwendet. Eine Einzelkolonie der entstandenen mit pET24a-PaI transformierten E.coli BL21(DE3)pLysS-Zellen wurde zum Animpfen von 3 ml LB-Medium-Vorkultur verwendet, die als Zusatz die Antibiotika Kanamycin und Chloramphenicol zur Selektion enthielt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C, 200 rpm angezogen. Anschließend wurde eine Hauptkultur mit 25 ml LB-Medium, der Kanamycin und Chloramphenicol zur Selektion zugesetzt wurde, mit 250 μl dieser Vorkultur angeimpft und bei 37°C, 200 rpm bis zu einer OD₆₀₀ von 0,5 – 0,6 angezogen. Je zweimal 5 ml dieser Kultur wurden in ein Zentrifugenröhrchen überführt, abzentrifugiert (3800 rpm, 15 min, 4°C), der Überstand verworfen und das Pellet bei –80°C eingefroren. Die restliche Hauptkultur wurde mit 10 μl 1 M IPTG induziert und weitere 3 h schüttelnd bei 37°C inkubiert und anschließend in Zentrifugenröhrchen überführt, abzentrifugiert (3800 rpm, 15 min, 4°C), der Überstand verworfen und das Pellet bei –80°C eingefroren.
b) Umsetzung von Fettsäuren Für die Umsetzung verschiedener Fettsäuren wurden die Zellen aufgeschlossen und mit den Fettsäuren inkubiert.

Lysispuffer 10 mM NaCl
100 mM Tris/HCl pH 7,3
10 % (v/v) Glycerol
2 mM DTT
1,5 ml Lysispuffer wurde zu den vor der Induktion geernteten Zell-Pellets und 5 ml zu den nach Induktion geernteten Zell-Pellets gegeben.
Die Zellen wurden durch vortexen resuspendiert und zum Zellaufschluss in flüssigem N₂ schockgefroren und danach bei 37 °C im Wasserbad aufgetaut. Dieser Prozess wurde nochmals wiederholt. Der Aufschluss und das Scheren der genomischen DNA erfolgte nach vollständiger Resuspendierung der Zell-Pellets schließlich durch Ultraschall: 45 sec. bei 50 % Leistung im Eis. Anschließend wurden je 1,5 ml Lysat mit den umzusetzenden Fettsäuren bei 37°C unter schütteln 180 rpm, für 1 bis 3 h inkubiert.
Die Extraktion der Fettsäuren erfolgt nach der Methode von Bligh und Dyer durch Zugabe von 100 μl Eisessig, 900 μl 0, 1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0; 2,5 ml Methanol und 2,5 ml Chloroform. Der ganze Ansatz wurde 1 min geschüttelt, abzentrifugiert (4000 rpm, 10 min, RT d.h. bei ca. 23 °C). Die organische untere Phase wurde in ein Reagenzglas überführt und unter N₂ zur Trockene geblasen und mit 2 x 500 μl Chloroform in ein weiteres Reagenzglas überführt und wieder mit N₂ getrocknet. Die Rückstände wurden mit 400 μl gelöst.

Die so extrahierte Probe wurde mit 10 μl EDAC-Lösung (EDAC: N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarodümid-hydrochlorid, 1 mg/10 μl Methanol) versetzt und 2 h bei RT geschüttelt. Danach wurden 200 μl 0,1 M Tris/HCl-Lösung pH 7,5 und 1 ml Hexan zugegeben, kräftig geschüttelt (vortexen) und abzentrifugiert (5 min, 12000 rpm, RT). Die obere Phase wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Extraktion mit 1 ml Hexan wiederholt. Die Nexanphasen wurden anschließend vereinigt und unter N₂-Strom bis zur Trockne eingengt. Der Rückstand wurde in 40 μl Acetonitril aufgenommen. 7 μl dieser Probe wurden für die GC-Analytik verwendet. Es wurde 1 μl in die GC injiziert.

Säule:	HP-DB23 (Cross-Linked PEG), 30mx0,32mmx0,5μm
Flußrate:	1,5ml/min (konstanter Fluß) Helium 150°C
Injektion:	220°C
Ofen:	150°C (1 min), auf 200°C (15k/min), auf 250°C (2K/min), 250°C (5 min)
Detektion:	FID 275°C

Die Tabelle 2 zeigt deutlich, dass die verschiedensten Fettsäuren als Substrate in der Reaktion umgesetzt werden. Je nach Substrat können konjugierte Diene und Triene oder Mischungen beider entstehen. Tabelle 2: Umsetzungen der verschiedenen Fettsäuren
Beispiel 6: Klonierung und Expression der Bifidobacterium breve Isomerase (= BBI) und der Lactobacillus reuteri Isomerase (= LRI)
Analog der unter Beispiel 1 bis 3 beschriebenen Beispiele wurden die Isomerasen aus Bifidobacterium breve Isomerase (= BBI) und der Lactobacillus reuteri Isomerase (= LRI) kloniert und in E. coli bzw. Hefe exprimiert.
Die Modifikation der BBI-Isomerase, das heißt die Anpassung des codon-usage erfolgte mit folgenden Primern:
Die Original Bifidobacterium breve Isomerase Sequenz (SEQ ID NO: 9) lautet wie folgt:
atg --- tac tac agc agc ggc aac tat gag gcg ttt gcc cgt ccg aag aag cca gcc ggc gta g
Die Codon-usage optimierte modifizierte Sequenz (SEQ ID NO: 3) ergibt sich dann wie folgt:
atg ggt tac tac tcc tcc ggt aac tac gaa gct ttc gct aga cca aag aag cca gct ggt gtt g
Die Modifikation der LRI-Isomerase wurde mit den folgenden Primern durchgeführt:
Die Original Lactobacillus reuteri Isomerase Sequenz ist SEQ ID NO: 11 zu entnehmen. Die ersten Basenpaare der Nukleinsäuresequenz lauten wie folgt:
atg --- tat tat tca aac ggg aat tat gaa gcc ttt gct cga cca aag aag cct gct ggc g
Die entsprechende modifizierte Sequenz (SEQ ID NO: 5) lautet wie folgt:
atg ggt tac tac tcc aac ggt aac tac gaa gct ttc gct aga cca aag aag cca gct ggt g

Der PCR-Reaktionsansatz wurde mit Expand Fidelity-PCR-System von Roche Diagnostics durchgeführt und setzte sich wie folgt zusammen:

dNTP-Mix (10 mM)	1,0 μl
5'-Forward Primer (10 μM)	4,0 μl
3'-Reverse Primer (10 μM)	4,0 μl
Template (1/50 verdünnte
pSE380-PaI Plasmid-DNA)	1,0 μl
10-Fach Puffer	5,0 μl
Polymerase (3,5 U /μl)	0,5 μl
Wasser	34,5 μl
Gesamtvolumen	50,0 μl

Es wurde folgende PCR-Programm verwendet:
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus einem präparativen Agarosegel geschnitten, mit GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience) eluiert und in den pGEM-T-Vector (Promega) nach Herstellerangaben kloniert. Nach einer Amplifikation der Plasmid-DNA in E. coli, wurde die Isomerase-cDNA über die KpnI und Xhol Schnittstellen bzw. EcoRl und Xhol Schnittstellen herausgeschnitten und die cDNA-Enden mit der T4-Polymerase geglättet. pYES2 Vektor wurde mit EcoRl geöffnet, die cDNA-Enden mit der T4-Polymerase geglättet und mit einer alkalischen Phosphatase dephosphoryliert. Beide DNA-Fragmente wurden mit der T4-Ligase zueinander legiert und die Insertionsrichtung durch einen BamHl-Verdau überprüft. Das so hergestellte pY2-PAI-Konstrukt wurde in E. coli amplifiziert und zur Hefe-Expression in den Hefestamm INVSc1 (Invitrogen) mit der LiAc-Methode (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995) transformiert. Wurde eine Klonierung im pET24a-Vektor vorgenommen, so wurde der Vektor mit denselben Enzymen zur Klonierung geschnitten und die Isomerasegene über diese Schnittstellen in den Vektor mit Hilfe der T4-Ligase kloniert.
Die Analysen der Fettsäuren erfolgten wie unter den Beispielen für die Propionbacterium acnes beschrieben.
Beispiel 7: Expression der Bifidobacterium breve Isomerase (= BBI) und der Lactobacillus reuteri Isomerase (= LRI)in Pflanzen
Die Expression der Isomerase aus Bifidobacterium breve oder Lactobacillus reuteri in transgenen Pflanzen ist vorteilhaft, um den CLA-Gehalt in diesen Pflanzen zu erhöhen. Dazu wurde die cDNA, die für die Isomerasen kodieren in binäre Vektoren kloniert und über Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer in Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Brassica napus und Linum usitatissimum übertragen. Die Expression der Isomerasen-cDNA stand dabei unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV 35 S-Promotors bzw. des samenspezifischen USP-Promotors.
Arabidopsis ist als Modellpflanze besonders geeignet, da sie eine kurze Generationszeit und ausreichende Mengen an Linolsäure, dem Substrat der Isomerase zur Herstellung von CLA.
Tabak und Hoch-Linolsäure-Sorten von Lein, wie die Varietät Linola, sind als Ölsaaten mit einem hohen Gehalt an Linolsäure besonders geeignet zur heterologen Expression von Isomerase-Genen, da Linolsäure das Substrat der Isomerasen zur Bildung von konjugierter Linolsäure darstellt.
Als Expressionsvektoren wurden der Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science, 66, 1990: 221 – 230) bzw. das pBinAR Derivat pBinAR-USP, bei dem der CaMV 35 S-Promotor gegen den USP-Promotor aus V. faba ausgetauscht war, verwendet. Ebenfalls verwendet wurden die Vektoren pGPTV und pGPTV-USP. Zur Umklonierung mußte die Isomerase-cDNA aus dem Vektor pGEM-T ausgeschnitten und in pBinAR bzw. pBinAR-USP kloniert werden.
Die entstandenen Plasmide wurden in Agrobacterium tumefaciens transformiert (Höfgen und Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16, 1988: 9877). Die Transformation von A. thaliana erfolgte mittels "floral dip" (Clough und Bent, Plant Journal, 16, 1998: 735 – 743), die von N. tabacum über Cokultivierung von Tabakblattstückchen mit transformierten A. tumefaciens Zellen, die von Lein und Raps durch Cokultivierung von Hypokotylstücken mit transformierten A. tumefaciens Zellen.
Die Expression der Isomerase-Gene in transgenen Arabidopsis-, Tabak-, Raps- und Leinpflanzen wurde über Northern-Blot Analyse untersucht. Ausgewählte Pflanzen wurden auf ihren Gehalt an CLA im Samenöl untersucht.
Analog zum USP-Promotor kann auch der Napin-Promotor verwendet werden, um eine samenspezifische Expression der Isomerase zu erreichen.
Tabelle 3 gibt die Ergebnisse in Pflanzen wieder.

Claims

Verfahren zur Herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in transgenen eurkaryontischen Organismen gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 in einen ungesättigte Fettsäuren produzierenden Organismus; oder b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder c) Einbringen mindestens eines Derivates der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist, und d) Expression der Nukleinsäure im nach (a), (b) oder (c) hergestellten Organismus, und b) Anzucht und Ernte des nach (a), (b) oder (c) hergestellten Organismus.
Verfahren zur Herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäure um konjugierte Linolsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die im – Organismus enthaltenen Öle bzw. die im Organismus enthaltenen Triglyceride isoliert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die im Öl oder in den Triglyceriden enthaltenden Fettsäuren freigesetzt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem transgenen eurkaryontischen Organismus um einen Öl-produzierenden Organismus handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem transgenen eurkaryontischen Organismus um eine Pflanze, eine Hefe oder einen Pilz handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine Alge, eine Ölfruchtpflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Bonetsch, Ölpalme, Kokosnuss oder Walnuss oder eine Feldfruchtpflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao oder Tee handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in den transgenen eurkaryonstischen Organismus zusätzlich mindestens eine weitere Nukleinsäure eingebracht wird, die für ein Polypeptid der Fettsäurebiosynthese codiert.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Nukleinsäure, die für ein Polypeptid der Fettsäurebiosynthese codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Acyl-CoA-Dehydrogenase, eine Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase, eine Acyl-ACP-Thioesterase, eine Fettsäure-Acyl-Transferase, eine Fettsäure-Synthase, eine Fettsäure-Hydroxylase, eine Acetyl-Coenzym A-Carboxylase, eine Acyl-Coenzym A-Oxidase, eine Fettsäure-Desaturase, eine Fettsäure-Acetylenase, eine Lipoxygenase, eine Triacylglycerol-Lipase, eine Allenoxid-Synthase, eine Hydroperoxid-Lyase, einen Fettsäuretransporter oder eine Fettsäure-Elongase codieren.
Öle, Triglyceride oder Fettsäuregemisch mit einem erhöhten Gehalt an konjugierter mehrfach ungesättigten Fettsäuren, hergestellt nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9.
Öle oder Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an konjugierter Linolsäure, hergestellt nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 10.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe: a) Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, oder b) Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestell ten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist, oder d) einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokaryontischen codon-usage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 %, vorteilhaft mindestens 1, 2, 3 oder 5 % bevorzugt mindestens 6, 7, 8, 9 oder 10 %, besonders bevorzugt mindestens 20, 30, 40 oder 50 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90 eines eukaryontischen codon-usage unterscheidet, oder e) Derivate der unter (d) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein, vorteilhaft mindestens 2, bevorzugt mindestens 3, besonders bevorzugt mindestens 4, ganz besonders bevorzugt mindestens 5 – Codontripletts vorteilhaft am 5' Ende der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäure codieren, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist, zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 12 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer Nukleinsäuresequenz über Homologiescreening.
Verwendung von Triglyceriden oder Fettsäuregemischen gemäß Anspruch 10 oder 11 mit einem erhöhten Gehalt an konjugierter mehrfach ungesättigter Fettsäuren oder konjugierter Linolsäure zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Futtermitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Isomeraseaktivität codiert ausgewählt aus der Gruppe: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, oder b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, oder d) einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokaryontischen codon-usage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 %, vorteilhaft mindestens 1, 2, 3 oder 5 % bevorzugt mindestens 6, 7, 8, 9 oder 10 %, besonders bevorzugt mindestens 20, 30, 40 oder 50 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90 % eines eukaryontischen codon-usage unterscheidet, oder e) Derivate der unter (d) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein, vorteilhaft mindestens 2, bevorzugt mindestens 3, besonders bevorzugt mindestens 4, ganz besonders bevorzugt mindestens 5 Codontripletts vorteilhaft am 5' Ende der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäure codieren, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die unter (d) codon-usage am aminoterminalen Ende eingeführt wird.
Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 14 (d) und (e) oder Anspruch 16.
Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
Vektor, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 15 oder 16 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 18.
Transgener Organismus, enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 15 oder 16, mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 18 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 19.
Transgener Organismus nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Organismus um eine Hefe, einen Pilz oder eine Pflanze handelt.
Lebensmittel-, Nahrungsergänzungsmittel-, Tierfuttermittel- oder Arzneimittelzubereitung, enthaltend Öle oder Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an konjugierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren oder konjugierter Linolsäure gemäß Anspruch 10 oder 11.
Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsäure mit transgenen eurkaryontischen Organismen, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 in einen ungesättigte Fettsäuren produzierenden Organismus; oder b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die sich durch Rückübersetzung in eine Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufgrund des degenerierten genetischen Codes ableitet, oder c) Einbringen mindestens eines Derivates der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90 % Identität auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich verändert ist, oder d) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die sich von dem prokaryontischen codon-usage der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch mindestens 0,5 % eines eukaryontischen codon-usage unterscheidet, oder e) Einbringen mindestens eines Derivate der unter (d) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen, die um mindestens ein Codontriplett der Nukleinsäuresequenzen, das für eine Aminosäure codiert, verlängert ist, ohne dass die enzymatische Wirkung der durch die Nukleinsäuren codierten Polypeptide wesentlich verändert ist. f) Expression der Nukleinsäure im nach (a), (b), (c), (d) oder (e) hergestellten Organismus.
Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsäure nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass dem Organismus Linolsäure gefüttert wird.
Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsäure nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass der nach (a), (b), (c), (d) oder (e) hergestellte Organismus angezogen und geerntet wird.
Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsäure nach den Ansprüchen 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus aufgeschlossen wird und die Umsetzung von Linolensäure zu CLA in vitro erfolgt.