EP1190080A1

EP1190080A1 - $g(D)6-DESATURASEGENE EXPRIMIERENDE PFLANZEN UND PUFAS ENTHALTENDE ÖLE AUS DIESEN PFLANZEN UND EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG UNGESÄTTIGTER FETTSÄUREN

Info

Publication number: EP1190080A1
Application number: EP00952997A
Authority: EP
Inventors: Ernst Heinz; Thomas Girke; Jodi Scheffler; Oswaldo Da Costa E Silva
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 1999-07-06
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2002-03-27
Also published as: AU6560700A; AU776417B2; WO2001002591A1; CA2378423A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismuses bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Doppelbindungen aufgrund der Expression einer Δ-6-Desaturase aus Moos. Ausserdem betrifft die Erfindung transgene Organismen, die ein Δ6-Desaturasegen enthalten, sowie die Verwendung der im Verfahren hergestellten ungesättigten Fettsäuren bzw. Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren.

Description

Δ6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismusses bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Doppelbindungen aufgrund der Expression einer Δ-6-Desaturase aus Moos.

Außerdem betrifft die Erfindung transgene Organismen, die ein Δ6-Desaturasegen enthalten, sowie die Verwendung der im Verfahren hergestellten ungesättigten Fettsäuren bzw. Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren.

Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Phar abereich. Je nachdem ob es sich um freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Hauptsächlich werden die ver- schiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Sonnenblume und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vor- teilhaft durch Verseifung hergestellt.

Je nach Anwendungszweck sind Öle mit gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bevorzugt, so sind z.B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren speziell mehrfach ungesättig- ten Fettsäuren bevorzugt, da sie einen positiven Einfluß auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Möglichkeit einer Herzerkrankung haben. Auch eine positive Wirkung auf die Carcino- genese wird den ungesättigten Fettsäuren zugeschrieben. Sie sind außerdem wichtige Ausgangsstoffe für die Synthese von Verbindungen, die wichtige biologische Vorgänge innerhalb des Organismus steuern. Sie finden deshalb in verschiedenen diätischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.

Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften hat es in der Vergangen- 5 heit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ9-Desaturase

10 beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ15-Desaturase in

WO 94/11516 wird eine Δ12-Desaturase beansprucht. Δ6-Desaturasen werden in Girke et al . (The Plant Journal, 15, 1998: 39-48), Napier et al . (Biochem. J., 330, 1998: 611-614), Murata et al . (Biosynthesis of γ-linolenic acid in cyanobacterium Spirulina

15 patensis, pp 22-32, In: γ-linolenic acid, metabolism an its roles in nutrition and medicine, Huang, Y. and Milles, D.E. [eds.], AOC Press, Champaign, Illinois), Sayanova et al . (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 1997: 4211-4216), WO 98/46764, Cho et al . (J. Biol . Che ., 274, 1999: 471-477), Aki et al . (Biochem. Biophys . Res .

20 Commun., 255, 1999: 575-579), und Reddy et al . (Plant Mol. Biol., 27, 1993: 293-300) beschrieben. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al . , J. Biol. Che ., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al . , Nature 347, 1990:

25 200-203 oder Huang et al . , Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben. Weitere Δ6-Desaturasen werden in WO 93/06712, US 5,614,393, US5,614,393, WO 96/21022, WO00/21557 und WO 99/27111 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als

30 membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und charakterisieren sind (McKeon et al . , Methods in Enzymol . 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Einbringung in einen

35 geeigneten Organismus, der anschließend auf Enzymaktivität mittels Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. Die Anwendung zur Produktion in transgenen Organismen beschrieben wie in WO 98/46763 W098/46764, W098/46765. Dabei wird auch die Expression verschiedener Desaturasen wie in W099/64616 oder 0 W098/46776 und Bildung polyungesättigter Fettsäuren beschrieben und beansprucht. Bezüglich der Effektivität der Expression von Desaturasen und ihren Einfluß auf die Bildung polyungesättigter Fettsäuren ist anzumerken, daß durch Expression einer einzelnen Desaturase wie im vorgenannten Stand der Technik beschrieben 5 lediglich geringe Gehalte an ungesättigten Fettsäuren beispielsweise an Δ-6 ungesättigten Fettsäuren/Lipiden wie z.B. γ-Linolen- säure erreicht wurden und werden. Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen und besser geeigneten Genen, die für Enzyme codieren, die an der Biosynthese ungesättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese in einem technischen Maßstab herzustellen. Weiterhin besteht nach wie vor ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Gewinnung möglichst hoher Gehalte an polyungesättigten Fettsäuren.

Es bestand daher die Aufgabe ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren unter Verwendung von Genen, die beispielsweise für Desaturase-Enzyme codieren und die an der Synthese mehrfach ungesättigter Fettsäuren in den Samen einer Ölsaat beteiligt sind, bereitzustellen und so den Gehalt polyungesättigter Fettsäuren zu erhöhen. Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren gelöst, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine isolierte Nukleinsäuresequenz , die für ein Polypeptid mit Δδ-Desaturase- aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dar- gestellten Sequenz,

b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 ableiten

c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist,

in einen Organismus eingebracht wird, dieser Organismus angezogen wird, wobei der angezogene Organismus mindestens 1 Mol-% ungesättigte Fettsäuren bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt im Organismus enthält.

Unter Anzucht des Organismus ist die Kultivierung von Pflanzen ebenso zu verstehen wie die Anzucht von eukaryontisehen oder prokaryontisehen Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilzen, Ciliaten, Algen, Cyanobakterien, tierischen oder pflanzlichen Zellen oder Zellverbänden oder die Anzucht von Tieren.

Die in den im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Organismen enthalten in der Regel ungesättigte Fettsäuren in Form von gebundenen Fettsäuren, das heißt die ungesättigten Fettsäuren liegen überwiegend in Form ihrer Mono-, Di- oder Triglyceride, Glycolipide, Lipoproteine oder Phospholipide wie Öle oder Lipide oder sonstig als Ester oder Amide gebundenen Fettsäuren vor. Auch freie Fettsäuren sind in den Organismen in Form der freien Fettsäuren oder in Form ihrer Salze enthalten. Die freien oder gebundenen ungesättigten Fettsäuren enthalten vorteilhaft gegen- über den Ausgangsorganismen einen erhöhten Gehalt an Fettsäuren mit Δ6-Doppelbindungen wie vorteilhaft γ-Linolensäure . Die durch Anzucht im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Organismen und die in ihnen enthaltenen ungesättigten Fettsäuren können direkt beispielsweise zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, von Agrochemikalien, Futtermitteln oder Lebensmitteln verwendet werden oder aber nach Isolierung aus den Organismen. Dabei können alle Stufen der Aufreinigung der ungesättigten Fettsäuren verwendet werden, das heißt von Rohextrakten der Fettsäuren bis zu vollständig gereinigten Fettsäuren sind für die Herstellung der vorgenannten Produkte geeignet . In einer vorteilhaften Ausführungsform können die gebundenen Fettsäuren aus beispielsweise den Ölen bzw. Lipiden beispielsweise über eine basische Hydrolyse z.B. mit NaOH oder KOH freigesetzt werden. Diese freien Fettsäuren können direkt im erhaltenen Gemisch oder nach weiterer Aufreinigung zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, von Agrochemikalien, Futtermitteln oder Lebensmitteln verwendet werden. Auch können die gebundenen oder freien Fettsäuren zur Umesterung oder Veresterung beispielsweise mit anderen Mono-, Di- oder Triglyceriden oder Glycerin verwendet werden, um den Anteil an ungesättigten Fettsäuren in diesen Verbindungen beispielsweise in den Triglyceriden zu erhöhen.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an unge- sättigten Fettsäuren, indem man Triglyceride mit gesättigten oder ungesättigten oder gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit mindestens einem der Protein, das durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 codiert wird, inkubiert. Vorteilhaft wird das Verfahren in Gegenwart von Verbindungen durchgeführt, die Reduktionsäquivalente aufnehmen oder abgeben können. Anschließend können die Fettsäuren aus den Triglyceriden freigesetzt werden.

Die oben genannten Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Synthese von Fettsäuren oder gebundenen Fettsäuren wie Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an Fettsäuren mit Δ6-Doppelbindungen.

Als Organismen für die genannten Verfahren seien beispielhaft Pflanzen wie Arabidopsis, Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Tee, Karotte, Paprika, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Triticale, Tabak, Tomate, Raps, Kaffee, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Erdnuß, Rizinus, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) , Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Cyanobakterien, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Mikroorganismen wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Canola, Färbersaflor (Carthamus tinctorius), Rizinus, Calendula, Lein, Borretsch, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume, besonders bevorzugt werden Soja, Raps oder Sonnenblume.

Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Ciliaten, pflanzliche oder tierische Zellen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter je nach Organismus Sauerstoffbegasung oder in Abwesenheit von Sauerstoff angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt der pH wird während der Anzucht reguliert oder der pH wird nicht reguliert und verändert sich während der Anzucht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuier- lieh nach gefüttert werden. Auch eine Anzucht auf festen Medien ist möglich.

Pflanzen werden nach Transformation in der Regel zunächst regeneriert und anschließend wie üblich angezogen bzw. angebaut. Dies kann im Gewächshaus oder im Freiland erfolgen.

Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare

Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Über- schuß an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuß von Lösungsmittel zu Biomasse von 1:4. Das Lösungsmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt . Die Extraktion kann auch mit superkritischem CO₂ erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.

Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über chromatographische Verfahren, Destillation oder Kristallisation ist möglich.

Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicher Weise, wie oben beschrieben, verseift.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind ungesättigte Fettsäuren sowie Trigylceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, die nach den oben genannten Verfahren hergestellt wurden, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika . Hierzu werden diese den Nahrungsmitteln, dem Tierfutter, den Kosmetika oder Pharmazeutika in üblichen Mengen zugesetzt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wurden durch Expression einer Δ6-Desaturase aus Moos in Organismen wie Pilze, Bakterien, Tieren oder Pflanzen, bevorzugt Pilzen, Bakterien und Pflanzen, besonders bevorzugt in Pflanzen, ganz besonders bevorzugt in Ölfruchtpflanzen wie Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnenblume, Borretsch, Rizinus, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius), Kokosnuß, Erdnuß oder Kakaobohne höhere Gehalte an ungesättigten Fettsäuren wie γ-Linolensäure erhalten. Auch die Expression in Feldfrüchten, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Alfalfa, oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee) ist vorteilhaft. Durch die Expression eines Gens, das für eine Δ-6-Desaturase aus Moos codiert, in den oben genannten Organismen können Gehalte an ungesättigten Fettsäuren in den Organismen von mindestens 1 Mol-%, bevorzugt mindestens 3 Mol-%, besonders bevorzugt mindestens 4 Mol-%, ganz besonders bevorzugt mindestens 5 Mol-% erreicht werden.

Unter Derivate (n) sind beispielsweise funktioneile Homologe der von SEQ ID NO: 1 codierten Enzyme oder deren enzymatischer Aktivität, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1 katalysieren, zu verstehen. Diese Gene ermöglichen ebenfalls eine vorteilhafte Herstellung von ungesättigten Fettsäuren mit Doppelbindungen in Δ6-Position. Unter ungesättigten Fettsäuren sind im folgenden doppelt oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die Doppelbindungen aufweisen, zu verstehen. Die Doppelbindungen können konjugiert oder nicht konjugiert sein. Die in SEQ ID NO : 1 genannte Sequenz codiert für ein Enzym, das eine Δ6-Desaturase-Aktivität aufweist.

5 Das erfindungsgemäße Enzym Δ6-Desaturase führt vorteilhaft in Fettsäurereste von Glycerolipiden eine cis-Doppelbindung in Position C₆~C ein (siehe SEQ ID NO : 1) . Das Enzym hat außerdem eine Δ6-Desaturase-Aktivität , die vorteilhaft in Fettsäurereste von Glycerolipiden ausschließlich eine cis-Doppelbindung in 10 Position Cg-C einführt. Diese Aktivität hat auch das Enzym mit der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz, bei dem es sich um eine monofunktionelle Δ6-Desaturase handelt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure- 15 sequenz (en) (für die Anmeldung soll der singular den plural umfassen und umgekehrt) oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologie- screening verwendet werden.

20 Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen eukaryontisehen Organismen wie Pflanzen wie speziell Moosen, Dinoflagellaten oder Pilze isolieren.

Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktioneilen Derivaten der

25 in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 50 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, vorteilhaft mindestens 70 % Homologie, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85 % Homologie, ganz besonders bevorzugt 90 % Homologie aufweisen.

30 Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE bzw. BACKTRANSLATE (= Bestandteil des Programmpaketes UWGCG, Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Deverux et al . , Nucleic. Acid Res . , 12,

35 1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al . , CABIOS, 5 1989: 151-153). Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenz ist Sequenz SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu verstehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens

40 50 % identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nuklein- säureebene mindestens 65 % homolog, bevorzugt mindestens 70 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 %.

45 Allelvarianten umfassen insbesondere funktioneile Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von der in SEQ ID NO: 1 beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilen dieser

Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise den oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen Desaturasegenen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Vorteilhaft werden die Histidin-Box- Sequenzen verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure : Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standard- bedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge .

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein- säure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC - 0,15 M NaCl, 15 M Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30^CC bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al . , "Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al .

(eds) , 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds) , 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID No : 1 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Außerdem sind unter Homologen der Sequenz SEQ ID NO: 1 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -2000 vor dem Startcodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3 ' -Ende verändert wurden.

Die Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ6-Desaturase codiert, können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Δ6-Desaturase-Gen- abschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al . (1992) Nucleic Acids Res . 20:2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt .

Funktioneil äquivalente Sequenzen, die für das Δ6-Desaturase-Gen codieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenz, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die enzymatische Aktivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Codon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotidsequenzen.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispiels- weise der Erhöhung des Gehaltes von Δ6-Doppelbindungen in Fettsäuren, Ölen oder Lipiden in der Pflanze durch Überexpression des Δ6-Desaturase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die Δ6-Desaturase-Aktivität aufweisen oder durch in vitro- Selektion ermittelt werden. Mögliche Techniken zur in vitro- Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA- Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P.A. et al . , Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 ( 1997) oder bei Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen odon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Codon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.

Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine codieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein Δ6-Desaturase-Polypeptid oder ein funktioneil äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf Δ6-Desaturase-Expression mög- lieh ist (z.B. mye-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signalsequenz für das ER, das das Δ6-Desaturase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.

Vorteilhaft können die Δ6-Desaturase-Gene im erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert werden. Beispiele für derartige Gene sind die Acetyltransferasen, weitere Desaturasen oder Elongasen ungesättigter oder gesättigter Fettsäuren wie in WO 00/12720 beschrieben. Für die in-vivo und speziell in-vitro Synthese ist die Kombination mit z.B. NADH- Cytochrom B5 Reduktasen vorteilhaft, die Reduktionsäquivalente aufnehmen oder abgeben können. Unter den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteine sind Proteine zu verstehen, die eine in der Sequenz SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder 5 mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die enzymatische Aktivität des in SEQ ID NO : 2 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird. Unter nicht wesentlich reduziert sind alle Enzyme zu verstehen, die noch mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt

10 30 % der enzymatischen Aktivität des Ausgangsenzyms aufweisen. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucin-

15 reste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht . Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden .

20

Unter Derivaten sind auch funktioneile Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für Δ6-Desaturase codierende Sequenz beinhalten, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen, das

25 heißt das deren enzymatische Aktivität nicht wesentlich reduziert ist. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotid- reste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch 0 Modifikation der Δ6-Desaturase Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.

5 Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist (= Enzymaktivität ist stärker als die Aktivität des Ausgangsenzym, das heißt Aktivität ist höher als 100 %, bevorzugt höher 0 als 110 %, besonders bevorzugt höher als 130 %) .

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten oben genannten Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhaft zum Einbringen in einen Wirtsorganismus in eine Expressionskassette inseriert . 5 Die Nukleinsäuresequenzen können jedoch auch direkt in den Wirtsorganismus eingebracht werden. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete codierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine Δ6-Desaturase mit den oben beschriebenen Sequenzen codieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Doppelbindungen in Δ6-Position verleihen. Diese Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.

Unter einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt oder -fragment) ist die in SEQ ID NO: 1 genannte Sequenz, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktioneilen oder nicht funktioneilen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktioneil verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Struktur- genen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Das Δ6-Desaturase-Gen kann in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Auch eventuell mit exprimierte Gene, die vorteilhaft an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind, können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette vorhanden sein. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder Promotoren, die beispielsweise aus einem Pflanzen- virus entstammen. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacl^-- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02 , in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al . , Cell 21(1980) 285-294], RUBISCO SSU, OCS, B33, nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Δ6-Desaturase-Gens in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der PRPl-Promotor [Ward et al . , Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366], ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al . , (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443) , ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind insbesondere solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen/-Organen sicherstellen, in denen die Fettsäurebiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet wie beispielsweise im Endosperm oder im sich entwickelnden Embryo. Ins- besondere zu nennen sind vorteilhafte Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der USP- Promotor oder Derivate davon, der LEB4-Promotor , der Phaseolin- Promotor oder der Napin-Promotor . Der erfindungsgemäß aufgeführte 5 und besonders vorteilhafte USP-Promotor oder dessen Derivate vermitteln in der Samenentwicklung eine sehr früh Genexpression (Baeumlein et al . , Mol Gen Genet , 1991, 225 (3): 459-67). Weitere vorteilhafte samenspezifische Promotoren, die für monokotyle und dikotyle Pflanzen verwendet werden können, sind die für Dikotyle

10 geeignete Promotoren wie ebenfalls beispielhaft ausgeführte Napingen-Promotor aus Raps (US5 , 608 , 152 ) , der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (W098/45461) , der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US5 , 504 , 200) , der Bce4-Promotor aus Brassica (W091/13980) oder der Leguminosen B4-Promotor (LeB4, Baeumlein

15 et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233 - 239) oder für Monokotyle geeignete Promotoren wie die Promotoren die Promotoren des lpt2- oder Iptl-Gens aus Gerste (W095/15389 und WO95/23230) oder die Promotoren des Gersten Hordein-Gens , des Reis Glutelin-Gens , des Reis Oryzin-Gens, des Reis Prolamin-Gens , des Weizen Gliadin-

20 Gens, des Weizen Glutelin-Gens, des Mais Zein-Gens, des Hafer Glutelin-Gens, des Sorghum Kasirin-Gens oder des Roggen Secalin- Gens, die in W099/16890 beschrieben werden.

Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die 25 die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen und Lipiden bzw. deren Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor des Napin-Gens aus Raps 30 (US 5,608,152), des USP-Promotor aus Vicia faba (USP=unbekanntes Samenprotein, Baeumlein et al . , Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), des Oleosin-Gens aus Arabidopsis (W098/45461) , des Phaseolin-Promotors (US 5,504,200) oder der Promotor des Legumin B4-Gens (LeB4; Baeumlein et al . , 1992, Plant Journal, 2 (2): 35 233-9) . Weiterhin sind zu nennen Promotoren, wie der des lpt2 oder Iptl-Gens aus Gerste (W095/15389 und WO95/23230) , die in monokotylen Pflanzen samenspezifische Expression vermitteln.

In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekon- 40 strukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie das Δ6-Desaturase-Gen liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene 5 vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese, die eine gesteigerte

Synthese ermöglichen. Beispielsweise seien die Gene für die Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ5-, Δ4-Desaturase, die verschiedenen Hydroxylasen, die Acyl-ACP-Thioesterasen, ß-Ketoacyl-Synthasen oder ß-Ketoacyl- Reductasen genannt. Vorteilhaft werden die Desaturasegene im Nukleinsäurekonstrukt verwendet .

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungsgemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie unten beschrieben, verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Es können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung gelesen wird und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Poly- linker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die

Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp . Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. hetero- log zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5 ' -3 ' -Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für ein im er- findungsgemäßen Verfahren verwendetes Δ6-Desaturase-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar .

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, -primer- repair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, -chewing-back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden . Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u.a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al . , Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden .

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Poly- adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al . , EMBO J.3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Δ6-Desaturase- DNA-Sequenz sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Ber an und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.

Die DNA Sequenz codierend für eine Δ6-Desaturase aus Phsyco- mitrella patens beinhaltet alle Sequenzmerkmale, die notwendig sind, um eine dem Ort der Fettsäure-, Lipid- oder Ölbiosynthese korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren Targetingsequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche Lokalisation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künst- lieh verändert oder verstärkt werden, sodaß auch solche Fusions- konstrukte eine bevorzugte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sind.

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in Piastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423) z.B. in in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER) , Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, wünschenswert sein. Vorteilhafterweise werden die für Δ6-Desaturase-Gene codierenden Nukleinsäuresequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen

Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenz- assay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumin- eszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das ß-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6- phosphat-Phosphatasegen, das ß-Glucuronidase-Gen, ß-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotrans- ferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz) -Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Meßbarkeit und Quantifizier- barkeit der Transkriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressions- kassette stromaufwärts, d.h. am 5 ' -Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Poly- adenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für die Δ6-Desaturase DNA Sequenz operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation in Piastiden. Aber auch Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum

(= ER) , im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten sind bei Bedarf einsetzbar sowie Translationsverstärker wie die 5 '-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al . , Nucl. Acids Res . 15 (1987), 8693-8711).

Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den USP- oder Napin-Pro otor) , das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure , Glutaminsäure, Leucin) verwendet. Die Expressionskassette wird zur Expression in einem pro- karyontischen oder eukaryontisehen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR- Serie wie z.B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder pUC19, M113mp- Serie, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2 , pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-Bl, λgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, PIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBllO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBBllδ, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M.A. et al . , [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review" , Yeast 8: 423-488] und von van den Hondel, C.A.M.J.J. et al . [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied

Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al . , eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefevektoren sind beispielsweise 2μM, pAG-1, YEp6, YEpl3 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al . Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle- Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.

Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden, bevorzugt ist eine chromoso ale Replikation. In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Expressionskassette auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette als Vektor oder den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bestehen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.

Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor oder mehrere Gene zusammen in verschiedenen Vektoren in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.

Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ6-Desaturase codieren, und/oder der Expressionskassette .

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Transformationsvektor pRT ( (a) Toepfer et al . , 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al . 1987, Nucl. Acids. Res . 15: 5890 ff.) eingebaut werden.

Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor ) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.

In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw Fusions- oligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C-terminal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die Expressionsrate der RNA zu erhöhen ii.) die erzielbare Proteinsyntheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen, iv. ) oder die Reinigung durch einen für die Affinitäts- chromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins auch der Reinigung ermöglicht. Solche ErkennungsSequenzen für Proteasen erkennen sind z.B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase .

Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Ine ; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST) , Maltose Bindeprotein, oder Protein A.

Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc

[Amann et al . , (1988) Gene 69:301-315] und pET Vektoren [Studier et al . , Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande] .

Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSecl (Baldari, et al . , (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54 : 113-123 ) , and pYES-Derivate (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren für die Nutzung in fila- mentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al . , eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al . (1983) Mol . Cell Biol . 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39) .

Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzen- expressionsvektoren finden sich in Becker, D. , et al . (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol . Biol . 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Ägrobacte ium vectors for plant transformation" , Nucl . Acid . Res . 12: 8711-8721.

Weiterhin können die für die Δ6-Desaturase codierenden Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 5 1989.

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispielsweise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann 0 bekannten Methoden erfolgen.

Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al . (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von 5 F.M. Ausubel et al . (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al . , DNA Cloning Vol.l, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al . (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al . Guide to Yeast Genetics and Molecular 0 Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academie Press entnehmen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus 5 Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode -, die Elektroporation, die Inku- 0 bation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro- injektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. 5 Wu, Academie Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec . Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res . 0 12 (1984) 8711) . Mit einem solchen Vektor transformierte Agro- bakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl . Acid Res . (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academie Press, 1993, S. 15-38.

Mit einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Triticale, Reis, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Kaffee, Kakao, Tee, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, insbesondere von Öl-haltigen Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Borretsch, Lein, Sonnenblume,

Canola, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterien- lösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die verwendete Expressionskassette oder den verwendeten Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baum- wolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Cyanobakterien, Ciliaten, Thrausto- oder Schizichytrien, Algen oder Protozoen wie Dino- flagellaten wie Crypthecodinium genannt . Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze der Gattungen Mortierella oder Pythium wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Rizinus, Mortierella oder Pythium. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans .

Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, CA (1990) .

Verwendbare Expressionsstämme z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression des Δ6-Desaturase-Gens spezifisch in den Blättern, in den Samen, den Knollen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche Fettsäuren, Öle oder Lipide mit Δ6-Doppelbindungen überproduzierenden transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Gegen- stand sind transgene Pflanzen beispielsweise Kulturpflanzen wie Mais, Hafer, Roggen, Weizen, Gerste, Mais, Reis, Soja, Zuckerrübe, Canola, Triticale, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Tabak, Tomate, Kaffee, Kakao, Tee, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, Kartoffel, insbesondere Öl-haltige Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Borretsch, Lein, Sonnenblume, Canola, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Testpflanzen wie Arabidopsis oder sonstige Pflanzen wie Moose oder Algen ent- haltend eine erfindungsgemäße funktionelle Nukleinsäuresequenz oder eine funktionelle Expressionskassette. Funktioneil bedeutet hierbei, daß ein enzymatisch aktives Enzym gebildet wird.

Die Expressionskassette oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Sequenzen enthaltend eine Δ6-Desaturasegensequenz kann darüber hinaus auch zur Transformation der oben beispielhaft genannten Organismen wie Bakterien, Cyanobakterien, filamentösen Pilzen, Ciliaten, Tiere oder Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden Δ6-Doppelbindungen ein- gesetzt werden. Bevorzugte transgene Organismen sind Bakterien, Cyanobakterien, filamentöse Pilze oder Algen.

Unter transgenen Organismen sind Organismen zu verstehen, die eine Fremde aus einem anderen Organismus stammende Nuklein- säure, die für eine im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Δ6-Desaturase codiert, enthalten. Unter transgenen Organismen sind auch Organismen zu verstehen, die eine Nukleinsäure, die aus demselben Organismus stammt und die für eine Δ6-Desaturase codiert, enthält, wobei diese Nukleinsäure als zusätzliche Genkopie enthalten ist oder nicht in der natürlichen Nuklein- säureumgebung des Δ6-Desaturase-Gens enthalten ist. Transgene Organismen sind auch Organismen bei denen die natürliche 3'- und/oder 5 ' -Region des Δ6-Desaturase-Gens durch gezielte gentechnologische Veränderungen gegenüber dem Ausgangsorganismus verändert wurde. Bevorzugt sind transgene Organismen bei denen eine Fremd-DNA eingebracht wurde. Besonders bevorzugt sind trans- gene Pflanzen, in die Fremd-DNA eingebracht wurde. Unter transgenen Pflanzen sind einzelne Pflanzenzellen und deren Kulturen wie beispielsweise Kalluskulturen auf Festmedien oder in Flüssigkultur, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu verstehen.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind transgene Organismen ausgewählt aus der Gruppe Pflanzen, Pilze, Ciliaten, Algen, Bakterien, Cyanobakterien oder Tiere, bevorzugt transgene Pflanzen oder Algen, die mindestens eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit Δ6-Desaturase- aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Sequenz,

c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist .

Erhöhung des Gehaltes von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit

Δ6-Doppelbindungen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielsweise die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung durch funktionelle Überexpression des Δ6-Desaturase-Gens in den erfindungsgemäßen Organismen vorteil- haft in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gegenüber den nicht gentechnisch modifizierten Ausgangspflanzen zumindest für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Der Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden beispiels- weise ist im allgemeinen der Samen oder Zellschichten des Samens, so daß eine samenspezifische Expression des Δ6-Desaturase-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden nicht auf das Samengewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in Epidermiszellen oder in den Knollen -gewebe spezifisch erfolgen kann.

Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Δ6-Desaturase-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression des Δ6-Desaturase-Gens kann beispielsweise in vi tro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des Δ6-Desaturase-Gens und deren Auswirkung auf die Fettsäure-, Öl- oder Lipidbiosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshaus- versuchen getestet werden.

Gegenstand der Erfindung sind wie oben beschrieben transgene Pflanzen, transformiert mit einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Δ6-Desaturase codiert, einem Vektor oder einer Expressions- kassette enthaltend eine Δ6-Desaturase-Gensequenz oder mit dieser hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen wie oben beschrieben.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:

- Verwendung einer Δ6-Desaturase-DNA-Gensequenz mit der in

SEQ ID N0:1 genannten Sequenz oder mit dieser hybridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pilzen, Bakterien, Tieren oder Pflanzen bevorzugt Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Doppelbindungen durch Expression dieser Δ6-Desaturase DNA-Sequenz in Pflanzen.

- Verwendung der Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 zur

Herstellung von ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder Tieren bevorzugt Pflanzen. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiele

5 Beispiel 1: Allgemeine Klonierungsverfahren und Anzuchtsverfahren:

Die Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer

10 von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Organismen und die Sequenzanalyse rekombinan- ter DNA wurden wie bei Sambrook et al . (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.

15 Das Protonema von Physcomitrella patens (= P. patens) wurde in Flüssigmedium, wie von Reski et al . (Mol. Gen. Genet., 244, 1994: 352-359) beschrieben, angezogen.

Beispiel 2 : Sequenzanalyse rekombinanter DNA

20

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al . (1977) Proc . Natl. Acad. Sei. USA74, 5463-5467) . Fragmente resultierend aus einer Polymerase Ketten- 25 reaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.

Beispiel 3: Lipidanalyse aus dem Protonema von P. patens und aus Hefezellen

30

Die Lipide wurden mit Chloroform/Methanol wie bei Siebertz et al. (Eur. J. Biochem., 101, 1979: 429-438) beschrieben aus dem Protonema von S. patens oder aus Hefezellen extrahiert und über Dünnschichtchromatographie (= TLC) mit Diethylether ge-

35 reinigt . Die erhaltenen Fettsäuren wurden zu den entsprechenden Methylestern transmethyliert und mit Gaschromatographie (= GC) analysiert. Die verschiedenen Methylester wurden mit den entsprechenden Standards identifiziert. Entsprechende Fettsäure- pyrrolididen wurden, wie bei Anderson et al . (Lipids, 9, 1974:

40 185-190) beschrieben, erhalten und mit GC-MS bestimmt.

45 Beispiel 4 Funktionelle Expression der Δ6-Desaturase cDNA von P. patens in Hefen

Die Expression-Experimente in Hefen wurden mit PPDES6-cDNA durch- geführt. Knock-out-Exprimente hatten gezeigt (Daten und Versuchsdurchführung nicht gezeigt bzw. beschrieben) , daß der Knock-out zu einem Verlust an 20 : 3¹¹- ¹⁴< ¹⁷- , 20 : 4⁵<^8, n, ¹⁴_ , 20 : 4^{5 1!}- ¹⁴< ¹⁷- und 20:5⁵ _' ⁸ _' ^1:L _' ¹⁴ _' ¹⁷-Fettsäuren führt. Gleichzeitig steigen die 18:2⁹ _' ¹²- und 18 : 3⁹ _' ¹ _' ¹⁵-Fettsäuren an. Für die Expression in Hefe wurde der PPDES6-cDNA in den Hefe-Expressionsvektor pYES2 (Invitrogen) subkloniert. Der erhaltene Vektor erhielt die Bezeichnung pYES- deltaβ. Mit pYES2 (Kontrolle) und pYESdeltaδ (Δ6-Desaturase-cDNA) transformierte Hefekulturen wurden auf Uracil-dop-out Medium mit 2 % Raffinose und 1 % Tergitol NP-40 (zur Stabilisierung der Fettsäuren) angezogen. Für die Expression wurden die Zellen mit Galactose (Endkonzentration 2 %) bis zu einer optischen Dichte (= OD) von 0,5 bei 600nm angezogen. In Fütterungsexperimenten wurden Fettsäuren in 5 % Tergitol solubilisiert und mit einer Endkonzentration von 0,0003 % zugesetzt. Die Ergebnisse der Expression sind Tabelle I zu entnehmen. Die Synthese von Fettsäuren mit einer Doppelbindung an Position 6 ist nur in Gegenwart des Expressionskonstrukts mit der Δ6-Desaturase-cDNA möglich. Dieses Δ6-Desaturase-Enzym hat eine größere Aktivität gegenüber Fettsäuren, die schon eine Doppelbindung an Position 9 oder 12 (Bezug auf Kohlenstoffatom in der Kette) enthalten. Es wurden die Fettsäuremethylester des gesamten Lipids der Hefen mit GC analysiert. Die einzelnen synthetisierten Fettsäuren werden in der Tabelle in Mol-% der gesamten Fettsäuren angegeben.

Tabelle I: Fettsäurezusammensetzung in transformierten Hefen gegenüber der Kontrolle

Beispiel 5: Transformation von P. patens

Die Polyethylenglycol vermittelte direkte DNA-Transformation von Protoplasten wurde, wie von Schäfer et al . (Mol. Gen. Genet., 5 226, 1991: 418-424) beschrieben, durchgeführt. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf G418-enthaltenden Medium (Girke et al., The Plant Journal, 15, 1998: 39-48).

Beispiel 6 : Isolierung von Δ6-Desaturase cDNA und genomischen 10 Clonen von P. patens

Mit Hilfe eines PCR-Ansatzes mit den folgenden degenerierten Oligonukleotiden als Primer:

15 A: TGGTGGAA(A/G)TGGA(C/A)ICA(T/C)AA und

B: GG(A/G)AA(A/C/G/T)A(A/G) (G/A) TG (G/A) TG (C/T) TC]

und dem folgenden Temperaturprogramm:

94°C, 3 min; [94°C, 20 sec; 45°C, 30 sec; 72°C, 1 min], 30 Zyklen;

20 72°C, 5 min, wurden schließlich Fragmente einer Δ6-Desaturase-Gen kloniert. Für die Klonierung wurde poly(A)RNA aus 12 Tage alten P. patens Protonema-Kultur isoliert. Mit dieser poly(A)RNA wurde die oben beschriebene PCR durchgeführt. Fragmente der erwarteten Fragmentlänge (500 bis 600 bp) wurden in pUC18 kloniert und

25 sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz eines PCR-Frag- ments zeigte Ähnlichkeiten zu bekannten Δ6-Desaturasen. Da bekannt war, daß P. patens eine Δ6-Desaturase besitzt, wurde angenommen, daß dieser Klon für einen Teil einer Δ6-Desaturase codiert .

30 Ein vollständiger cDNA-Klon (= PPDES6-CDNA) wurde aus einer

P. patens cDNA-Bank von 12 Tage alten Protonemata mit Hilfe des oben genannten PCR-Fragments isoliert . Die Nukleotidsequenz wird in SEQ ID NO:l wiedergegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Die zugehörige genomische Sequenz

35 (= PPDES6-Gen) konnte mit Hilfe der PCR und den folgenden Oligonukleotiden als Primer isoliert werden:

C: CCGAGTCGCGGATCAGCC

D : CAGTACATTCGGTCATTCACC : 0

Tabelle II gibt die Ergebnisse des Vergleichs zwischen der neuen P. patens Δ6-Desaturase über die gesamte Nukleinsäuresequenz mit folgenden bekannten Δ6-Desaturase wieder: Borago officinalis (U79010), Synechocystis sp (L11421) , Spirulina platensis 5 (X87094) , Caenorhabiditis elegans (AF031477), Mortierella alpina (WO 98/46764), Homo sapiens (Cho et al . , J. Biol. Chem., 274, 1999: 471-477), Rattus norvegicus (AB021980) und Mus musculus (Cho et al., J. Biol. Chem., 274, 1999: 471-477). Die Analyse wurde mit dem Gap Programm (GCG-Package, Version 9,1) und den folgenden Analysenparametern durchgeführt: scoring matrix, blosum62, gap creation penalty, 12; gap extension penalty, 4. Die Ergebnisse geben die bestimmte Identität oder Ähnlichkeit [] in Prozent (%) im Vergleich zur P. patens-Sequenz wieder.

Tabelle II: Sequenzvergleich zwischen P. patens Δ6-Desaturase und anderen Δ6-Desaturasen

Beispiel 7 : Klonierung der Δ6-Desaturase aus Physcomitrella patens

Die genomische Δ6-Acyllipid-Desaturase aus Physcomitrella patens wurde auf Grundlage der veröffentlichten Sequenz (Girke et al . , Plant J., 15, 1998: 39-48) mittels Polymerasekettenreaktion und Klonierung modifiziert, isoliert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt. Dazu wurde zunächst mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von zwei genspezifischen Primern ein Desaturase-Fragment isoliert und in das bei Girke et al . (siehe oben) beschriebene Desaturasegen eingesetzt.

Primer TG5 5 ' - ccgctcgagcgaggttgttgtggagcggc und Primer TG3 : 5 ^λ -ctgaaatagtcttgctcc-3 '

dienten zunächst zur Amplifizierung eines Genfragmentes mittels Polymerasekettenreaktion (30 Zyklen, 30 sek. 94° V, 30 sek. 50°C, 60 sek. 72°C, 10 min Nachinkubation bei 72°C, in einem Perkin Eimer Thermocycler) . a) Klonierung eines Expressionsplasmids, das die Δ6-Desaturase unter Kontrolle des 35S CaMV Promotors exprimiert:

Durch Primer TG5 wurde eine Xhol Schnittstelle in das Fragment eingeführt. Ein XhoI/Eco47lII Fragment wurde durch

Restriktion erhalten und in die bei Girke et al . beschriebene PPDES6-Gensequenz nach analoger Restriktion mit XhoI/Eco47III ausgetauscht. Das Konstrukt erhielt den Namen pZK. Das Insert von pZK wurde als Xhol/Hindlll Fragment nach Auffüllen der Hindlll-Schnittstelle mit Nukleotiden durch Behandlung mit dem Klenow Fragment der DNA Polymerase I in die Xhol/Smal Schnittstellen von pRT99/35S kloniert. Das resultierende Plasmid pSK enthält den 35S-Promotor [Cauliflower-Mosaik-Vi- rus, Franck et al . (1980) Cell 21, 285], die Δ6-Desaturase aus Moos und den 35S-Terminator im Vektor pRT.

b) Konstruktion eines Expressionskonstruktes unter Kontrolle des Napin-Promotors :

Durch Schneiden des Plasmides pSK mit Xhol, Behandlung mit T4-DNA Polymerase und Pstl-Restriktion wurde das erhaltene Promotor-Desaturase-Fragment mit Terminator in den Vektor pJH3 kloniert. Dazu wurde der Vektor BamHI geschnitten und mit Klenow-Enzym die Überhänge aufgefüllt sowie anschließend mit PstI nachgeschnitten. Es entstand durch Ligation des

Desaturase-Terminator-Fragmentes in den Vektor das Plasmid pJH7 , das einen Napin-Promotor beinhaltet (Scofield et al . , 1987, J. Biol. Chem. 262, 12202-8) . Die Expressionskassette aus pJH7 wurde mit Bspl20l und Notl geschnitten und in den binären Vektor pRE kloniert. Es entstand das Plasmid pRE- Ppdesδ .

In einer PCR Reaktion wurde die erfindungsgemäße Δ6-Desaturase cDNA aus P. patens als Matrize verwendet. Mithilfe der nachfolgend aufgeführten Oligonukleotide wurde eine BamHI-Restriktionsschnittstelle vor dem Startcodon und drei Adeninnukleotide als Konsensustranslationssequenz für Eukaryoten in die Δ6-Desaturase cDNA eingeführt . Es wurde ein 1512 Basenpaarfragment der Δ6-Desaturase amplifiziert und sequenziert.

Pp-d6Desl: 5 ' - CC GGTACC aaaatggtattcgcgggcggtg -3' Pp-d6Des2: 3 ' - CC GGTACC ttaactggtggtagcatgct -3'

Die Reaktionsgemische enthielten ca. 1 ng/micro 1 Matrizen

DNA, 0,5 UM der Oligonukleotide und, 200 μM Desoxy-Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C, 1,5 mM MgCl₂> und 0,02 U/μl Pwo Polymerase (Boehringer Mannheim) und werden in einer PCR-Maschine der Firma Perkin Eimer mit folgendem Temperaturprogramm inkubiert:

Anlagerungstemperatur: 50°C, 30 sec

Denaturierungstemperatur : 95°C, 30 sec

Elongationstemperatur : 72°C, 90 sec

Anzahl der Zyklen: 30

c) Konstruktion eines Expressionskonstruktes unter Kontrolle des USP-Promotors :

Das erhaltene Fragment von ca. 1,5 kB Basenpaaren wurde in den mit EcoRV gespaltenen Vektor pBluescript SK- (Stratagene) ligiert und stand für weitere Klonierungen als BamHI Fragment zur Verfügung .

Für die Transformation von Pflanzen wurde ein weiterer Transformationsvektor auf Basis von pBin-USP erzeugt, der das BamHI-Fragment der Δ6-Desaturase enthält. pBin-USP ist ein Derivat des Plasmides pBinl9. pBinUSP entstand aus pBinl9, indem in pBinl9 [Bevan et al . (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711] ein USP-Promotor als EcoRI-BaMHI-Fragment inseriert wurde. Das Polyadenylierungssignal ist das des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al . , (1984) EMBO J. 3, 835), wobei Nukleotide 11749-11939 als PvuII-Hindlll- Fragment isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SpHI-Hindlll Schnittstelle des Vektors kloniert. Der USP-Promotor entspricht den Nukleo- tiden 1-684 (Genbank Accession X56240) , wobei ein Teil der nichtcodierenden Region des USP-Gens im Promotor enthalten ist. Das 684 Basenpaar große Promotorfragment wurde mittels käuflichen T7-Standardprimer (Stratagene) und mit Hilfe eines synthetisierten Primers über eine PCR-Reaktion nach Standardmethoden amplifiziert (Primersequenz: 5 ' -GTCGACCCGCGGACTAGTG- GGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3 ' ) . Das PCR- Fragment wurde mit EcoRI/Sall nachgeschnitten und in den Vektor pBinl9 mit OCS Terminator eingesetzt . Es entstand das Plasmid mit der Bezeichnung pBinUSP.

d) Konstruktion eines Expressionskonstruktes unter Kontrolle des vATPase-Cl-Promotors aus Beta vulgaris :

Analog zum Expressionsplasmid mit dem USP-Promotor wurde ein Konstrukt unter Verwendung des v-ATPase-cl-Promotors erstellt. Der Promotor wurde als EcoRI/Kpnl Fragment in das Plasmid pBinl9 mit OCS Terminator kloniert und über BamHI das Δ6-Desaturasegen aus P. patens zwischen Promotor und Terminator inseriert. Der Promotor entspricht einem 1153 Basenpaarfragment aus beta-Vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39:463-475) .

Das Konstrukt wurde zur Transformation von Arabidopsis thaliana und Rapspflanzen eingesetzt.

Beispiel 8: Erzeugung transgener Rapspflanzen (verändert nach

Moloney et al . , 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)

Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen wurden binäre Vektoren in Agrobacterium tumefaciens C58C1 :pGV2260 oder Escherichia coli genutzt (Deblaere et al , 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Nord- deutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Deutschland), wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3 % Saccharose (SMS- Medium) benutzt . Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm²) wurden in einer Petri- schale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 3-tägige Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weiter- geführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/1 Claforan (Cefotaxi e-Natrium) , 50 mg/1 Kanamycin, 20 μM Benzyl- aminopurin (BAP) und 1,6 g/1 Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2 % Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Bildeten sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstumshormon 2-Indol- buttersäure zum Bewurzeln zum Medium zugegeben.

Regenerierte Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf Δ6-Desaturase-Expression mittels Lipidanalysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an oder Doppelbindungen an der Δ6-Position würden identifiziert. Es konnte in den stabil transformierten transgenen Linien, die das Transgen funktioneil exprimierten, ein erhöhter Gehalt von Doppelbindungen an der Δ6-Position im Vergleich zu untransformierten Kontrollpflanzen feststellt werden. Beispiel 8 : Lipidextraktion aus Samen

Das Pflanzenmaterial wurde zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.

Dann wurde es 10 min bei 100°C abgekocht und nach dem Abkühlen auf Eis sedimentiert . Das Zellsediment wurde mit 1 N methanolischer Schwefelsäure und 2 % Dimethoxypropan lh bei 90°C hydrolysiert und die Lipide transmethyliert . Die resultierenden Fettsäure- methylester (FAME) wurden in Petrolether extrahiert. Die extrahierten FAME wurden durch Gasflüssigkeitschromatographie mit einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) und einem Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert. Die Identität der Fett- säuremethylester wurde durch Vergleich mit entsprechenden FAME- Standards (Sigma) bestätigt. Die Identität und die Position der Doppelbindung konnte durch geeignete chemische Derivatisierung der FAME-Gemische z.B. zu 4, 4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1997, in: Advances in Lipid Methodology, 4. Auflage: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169, und 1998, Gaschromato- graphie-Massenspektrometrie Verfahren, Lipide 33:343-353) mittels GC-MS weiter analysiert werden. Die GC-Analysen der Fettsäuremethylester aus den transgenen Rapssamen, die samenspezifisch die Δ6-Desaturase exprimierten sind in Tabelle III dargestellt. Die transgenen Rapssamen weisen mindestens 4,95 % γ-Linolensäure im Samen auf .

Tabelle III gibt die GC-Analysen der Fettsäuremethylester aus reifen, transgenen Rapssamen, die Δ6-Desaturase samen- spezifisch exprimieren, wieder. Die Fettsäurezusammensetzung ist in [mol %] der Gesamtfettsäuren angegeben. Es ist festzustellen, daß einzelne Pflanzen der T2 Generation, die aus positiv transformierten und geselbsteten Pflanzen erhalten wurden, bis zu ca. 4,95 % γ-Linolensäure enthalten.

Tabelle III: GC-Analysen der Fettsäuremethylester von Raps

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, da- durch gekennzeichnet, daß mindestens eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Δ6-Desaturase- aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dar- gestellten Sequenz,

c) Derivate der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens

50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist,

in einen Organismus eingebracht wird, dieser Organismus angezogen wird, wobei der angezogene Organismus mindestens 1 Mol-% ungesättigte Fettsäuren bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt im Organismus enthält .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz von einer Pflanze oder Alge stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz von Physcomitrella patens stammt .

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn- zeichnet, daß es sich bei dem Organismus um ein Organismus ausgewählt aus der Gruppe Bakterium, Pilz, Ciliat, Alge, Cyanobakterium, Tier oder Pflanze handelt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Pflanze oder Alge handelt .

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Ölfruchtpflanzen handelt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der angezogene Organismus mindestens 5 Gew-% ungesättigte Fettsäuren bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt im Organismus enthält.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die ungesättigten Fettsäuren aus dem Organismus isoliert werden.

9. Transgener Organismus ausgewählt aus der Gruppe Pflanzen, Pilze, Ciliaten, Algen, Bakterien, Cyanobakterien oder Tiere, die mindestens eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit Δ6-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,

b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO : 1 ableiten

c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten AminosäureSequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

10. Transgener Organismus nach Anspruch 9, dadurch gekenn- zeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Pflanze oder Alge handelt .

11. Öl, Lipide oder Fettsäuren oder eine Fraktion davon, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

12. Verwendung der Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung nach Anspruch 11 oder transgene Organismen nach Anspruch 9 in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.