JPH07501924A - 植物の中位鎖チオエステラーゼ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 植物の中位類チオエステラーゼ 背景 いくつかの植物の族の構成員は特殊化された貯蔵組織の中に大量の主として中位 類（Ｃ８−ｃｔ４）のトリアジルグリセロール類を合成し、それらのあるものは 重要な食物または工業用の中位類脂肪酸の生産のために収穫される（Ｆ、　Ｄ、 　Ｇｕｎｓｔｏｎｅ、　Ｔｈｅ　Ｌｉｐｉｄ　）ｌａｎｄｂｏｏｋ（Ｃｈａｐｍ ａｎ　＆　Ｈａｌｌ、　＝ｓ−ヨーク、　１９８６）　ｐｐ、　５５−１１２） 、例えば、ラウレート（Ｃ１２：　０）は、現在、熱帯の樹木の種子から毎年百 方トンに近づく割合で抽出されている（Ｂａ　ｔ　ｔｅｙら、Ｔｉｂｔｅｃｈ） 　（１９８９）７１：１２２〜１２５）。 偏在する長鎖脂肪酸の合成が特殊化された中位類の生産に切り替えられるメカニ ズムは、多年にわたって考察の主題であった（）ｌａｒｗｏｏｄ、　Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８８）３９：　１ ０１　１３８）。 最近、Ｐｏ１ｌａｒｄら（Ａｒｃｈ、　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、（１９９１）　２８４　：１−７）は、カルフォルニア・ゲッケイ ジュ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、の発育する脂肪種子 の中に中位鎖アシルーＡＣＰチオエステラーゼ活性を同定した。この活性は、発 育する子葉がラウロイル（１２：Ｑ）およびカプロイル（１０：Ｏ）の脂肪酸と のトリグリセリドのほぼ独占的な生産を行うときにのみ、現れる。この研究は植 物における中位類脂肪酸の合成についてのメカニズムの最初の証拠を提供した： 延長の間、脂肪酸はアシル−キャリアータンパク質（ＡＣＰ）　、チオエステル が早期に加水分解される場合、延長は中位類脂肪酸の解放により停止される。ゲ ソケイジュ（Ｂａｙ）チオエステラーゼは引き続いてＤａｖｉｅｓら（Ａｒｃｈ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９９１）２９０　：３７−４５ ）により精製され、これは対応するｃＤＮへのクローニングを可能としそして関 係するクローンを得るためにかつ植物のトリグリセリドを変性するためにそれを 使用されることが記載された（１４０９１／１４２１）　。 発明の要約 本発明によれば、植物の中位類チオエステラーゼのそれ以上の性質および使用が 提供される。 ｆｆ４１のｍ樺において、本発明は植物の種子およびその種子から誘導化された 油に関し、前記油は通常ラウレートを含有しないが、ラウレートを含有すること が今回発見された。１．０％程度に少ないラウレートを有する種子は、種子のト リグリセリド油中に自然にラウレートを貯蔵しない野生型植物種と有意に異なる 。最小１５％より多いラウレート、３３％のラウレートまたは５０％のラウレー トを有する種子を以後考える。少なくとも２つの脂肪酸ラウロイルアシル基をも つ種子の中の、あるいは種子から誘導化されたトリグリセリドを同様に考える。 １．０％より多いラウレー・トを含有するブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子 およびこのような種子から誘導化された油はことに好ましい。 なお異なる態様において、本発明は特定の中位類チオエステラーゼの配列、ゲッ ケイジュ（Ｂａｙ）の中位類チオエステラーゼのＤＮ＾配列および宿主細胞の中 のこの酸素の発現のためのＤＮＡ構成体に関する。とくに、この配列について従 来報告された開始部位より上流の構造遺伝子配列の開始部位を記載する。 本発明の他の面は、植物の中位類チオエステラーゼを使用する方法に関する。中 位類脂肪酸を生産する細菌細胞の中の植物の中位類チオエステラーゼの発現が提 供される。この方法により、ある量の、二のような脂肪酸を細菌から結晶質の形 態で収穫することができる。 この出願において、ゲッケイジュ・チオエステラーゼの使用を例示する；　ｆａ ｄ口大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）突然変異株はとくに好ましい 、さらに、改良されたラウレートの生産のための温度範囲を記載する。 植物の中位類チオエステラーゼを使用して不飽和脂肪酸チオエステラーゼを生産 する方法を、また、ここに記載する。ある量の飽和中位鎖アシルー＾ＣＰ脂肪酸 をもっばら生産しかつトリグリセリドの中に組み込む植物においてさえ、チオエ ステラーゼは同一長さの不飽和脂肪酸に対して活性を有することができることが 今回発見された。 図面の説明 第１図、ヌクレオチド１４５−１４７にＡＴＧコドンを有するゲッケイジュ・チ オエステラーゼ（ｐＣＧＮ３８２２）の全長が記載されている。 ＩＡに、核酸配列が記載されている。ＩＢに、ヌクレオチド１４５−１４７にお けるＡＴＧコドンで開始する翻訳されたアミノ酸配列が記載されている。 第２図、Ａ　タリアナ（ｔｈａ　ｌ　１ａｎａ）の種子中のアシル１２：ｏの蓄 積とのラウロイル・チオエステラーゼ活性との相関関係が提供される。チオエス テラーゼ活性は、異なる独立のトランスジェニック植物の発育する種子の中で測 定する。１２：０％値は、定量的ガスクロマトグラフィーにより測定した、全体 の脂肪酸抽出物中のラウロイルアシル基を反映する。 第３図、ゲソケイジュ・チオエステラーゼ遺伝子の第２クラスを表す、ゲッケイ ジュ・チオエステラーゼのクローン、ゲノヶイジュＤ、の核酸および翻訳された アミノ酸配列が表されている。 第４図、２つのベニバナ・チオエステラーゼのクローン、ρＣＧＮ３２６４（４ Ａ）およびｐＣＧＮ３２６５　（４Ｂ）　、の核酸および翻訳されたアミノ酸配 列が表されている。ｐＣＧＮ３２６５の追加の３′非翻訳配列を包含する、ＤＮ Ａ配列が第４Ｃ図に表されている。 第５図、シゴウノウ・チオエステラーゼのＰＣＲ断片の核酸配列が第５Ａ図に表 されている。シゴウノウのＰＣＲ発生チオエステラーゼをエンコードする配列の 核酸および翻訳されたアミノ酸配列が第５Ｂ図に表されている。 第６図、ブラシカ・カンペストリス（Ｒｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓＬｒ４ｓ ）のチオエステラーゼの核酸配列が第６図に表されている。擾案されたＭＥＴ開 始コドンからの翻訳されたアミノ酸配列をまた示す。 第７図、トランスジェニックＢ、ナプス（ｎａｐｕｓ）からの種子についてのラ ウロイルのレヘＪしおよびＣＩ２：Ｏ−八ｃＰのチオエステラーゼ活性が表され ている。 第８図、ベニバナおよびゲノケイジュのチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較 が表されている。上部の線は、第４Ｂ図におけるベニバナ・チオエステラーゼの アミノ酸配列のアミノ酸６１−３８５を表す、下部の線は、第１Ｂ図におけるゲ ノケイジュ・チオエステラーゼのアミノ酸配列のアミノ酸８４−３８２を表す。 第９図、アラビ１゛ブンス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物３８２８−１３から の１００個の種子の脂肪酸組成を、対照アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓ）植物からの種子の脂肪酸組成に対して比較されている。 第１０図、２６のトランスジェニノクアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）植物の脂肪酸含量を、増加する脂肪酸含量の順序で、第１０ＡＩＩに記載する 。検出可能なレベルのラウレートを生産する形質転換体を示す、第１０Ｂ図にお いて、これらの植物の中のＣ１８：　３．Ｃ１８：　２およびＣ１６：Ｏ脂肪酸 の含量を示す。 第１１図、トランスジェニック・ブラシカ・ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐ ｕｓ）の発育する種子の中のラウレート含量のモル％を、示したラウレートのレ ベルを生ずるトランスジェニック事象の数としてを表ず。 ｐＣＧＮ３８２４形質転換体からの結果を第１１Ａ図に示し、そしてｐＣＧ８３ ８２Ｂ形質転換体からの結果を第１１Ｂ図に示す。 第１２図、りへア（Ｃｕｐｈｅａ）チオエステラーゼ遺伝子のＰＣＲ断片のＤＮ Ａ配列を表す。クヘア（Ｃｕｐｈｅａ）のチオエステラーゼ遺伝子に相当する領 域における翻訳されたアミノ酸配列をまた示す。 発明の詳細な説明 中位類植物チオエステラーゼを包含する植物のチオエステラーゼは、［９１／１ ６４２１　（ＰＣＴ／［５９１１０２９６０）およびＵＳＳＮＯ７／８２４．２ ４７　（これらの開示の全体をここに引用によって加える）に記載されている。 本発明の植物の中位類チオエステラーゼは、植物酵素の反応の条件下にＣＢ−Ｃ １４脂肪酸アンルー八〇Ｐ基質から１種または２種以上の遊離脂肪酸の生産を触 媒する能力を証明する植物源から得ることができるアミノ酸、ペプチド、ポリペ プチドまたはタンパク質の任意の配列を包含する。「酵素反応の条件」とは、酵 素を機能化させる環境（すなわち、温度、ｐ）Ｉ、阻害物質の欠如のような因子 ）において、任意の必要な条件が利用可能であることを意味する。 植物のチオエステラーゼは、ここにおいてかつ関係する源から提　。 供される、特定の例示する配列から得ることができる０例えば、りへア（Ｃｕｐ ｈｅａ）属の中のいくつかの種、例えば、プロクンヘンス（ｐｒｏｃｕｓｂｅｎ ｓ）　、ルテア（ｌｕＬｅａ）、フッケリアナ（ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）、ハイ ソビフォリア（ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）　、ライチイ　（ｗｒｉｇｈｔｉｉ ）およびインフラタ　（ｉｎｆｌａｔａ）は、それらの種子の中に中位類脂肪、 酸を含有するトリグリセリドを蓄積する。中位類脂肪酸の他の天然の植物源は、 クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）の族、例えば、ピサ（Ｐｉｓａ）（八ｃＬｉ ｎｏｄｏｐｈｎｅ　ｈｏｏｋｅｒｉ）およびゲノケイジｘ　（Ｌａｕｒｕｓ　ｎ ｏｂｉｌｉｓ）の種子である。他の植物源は、ニレ科（旧ｍａｃｅａｅ）　にし ・）、ニクズク科（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｅａｅ）、ニガキ科（Ｓｉｍａｒｕｂ ａｃｅａｅ）　、ボチシアセアエ（Ｖｏｃｈｙｓ　１ａｃｅａｅ）およびニレ科 （Ｓａ　１ｖａｄｏｒａｃｅａｅ）、およびＣ１４脂肪酸を蓄積すると報告され たエリスマ（Ｅｒｉｓｓａ）　、ピクランニア（Ｐｉｃｒａｓ＋ｎ１ａ）および ビロラ（ν１ｒｏｌａ）の雨林の種を包含４°る。 前述したように、その中に中位類脂肪酸が有意に存在するタンパク質は、天然に 誘導化された中位績の好ましい植物のチオエステラーゼを得るための好ましい候 補である。しかしながら、また、中位類脂肪酸がその中に有意に存在しない他の 植物源を他の酵素源として容易にスクリーニングできることを理解すべきである 。さらに、内因性中位績の好ましい植物のチオエステラーゼの間およびより長い および／またはより短い鎖の好ましい植物のチオエステラーゼの間の比較は、合 成の中位績の好ましい植物のチオエステラーゼならびに前述のものをつくるため のクンバク質のモデル化または他の修飾のための見識を生ずることができる。 当業者は容易に認識するように、抗体、核酸のプローブ（ＤＮＡおよびＲＮＡ） などを調製し、そして種々の植物源からの「相同的」または「関係する」チオエ ステラーゼをスクリーニングしそして回収することができる。免疫学的クローニ ング法のために、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体調製物を利用する 。検出のために、抗体を放射線で標識化するか、あるいは商業的に入手可能な種 々の第２抗体／酵素接合体系の任意の１つを使用して抗体を標識化する。 入手可能な抗体の検出系のいくつかの例は、０ｂｅｒｆｉｌｄｅｒ　（Ｆｏｃｕ ｓ（１９８９）　ＢＲＬ　１．ｉｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、 Ｉｆ　：　１−５　）により記載されている。 配列の同一性が存在するとき　相同配列が見いだされ、この同一性は配列の情報 、核酸またはアミノ酸を比較するか、あるいは既知のチオエステラーゼと候補源 との間のハイブリダイゼーション反応により決定することができる。保存的変化 、例えば、Ｇｌｕ／Ａｓｐ。 νａｌ／Ｉｌｅ、　Ｓｅｒ／、Ｔｈｒ、　Ａｒｇ／ＬｙｓおよびＧｉｎ／Ａｓｎ をまたアミノ酸配列の相同性の決定においζ）慮することかできる。アミノ酸配 列は２一つの完全な成熟タンパク質の間の２５％程度に少ない配列の同一性によ り相同性であると考えられる。（一般に、Ｄｏｏｌｔｔｌｅ、　＋？、Ｆ、＋Ｏ Ｆ　ＵＲＦＳ　ａｎｄ　０ＲＦＳ　（ＵｎｉｖｅｒｓｉＬｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　 Ｂｏｏｋｓ、カリフォルニア州、１９８６を参照のこと、）。典型的には、存在 しうるが、なお関係すると考えられる欠失を排除する、問題の所定の植物のチオ エステラーゼと標的配列との間で、長い核酸配列は５０−６０％程度に少ない配 列の同一性、より好ましくは少なくとも約７０％の配列の同一性を示すことがで きる。 問題の候補の植物源から調製されたゲノムまたは他の適当なライブラリーを植物 のチオエステラーゼからの保存された配列でブロービングして、相同的に関係す る配列を同定することができる。ことに高度に保存された配列を同定できるとき 、より短いプローブはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためにしばしばとくに 有用である。 より長い核酸断片（＞１００ｂρ）をプローブとして使用するとき、ことに完全 なまたは大きいｃＤＮ＾配列を使用するとき、低いストリンジエンシイ　（例え ば、プローブの融点より４０〜５０°Ｃ低い）でスクリーニングして、２０〜５ ０％の偏りをもつ標的試料、すなわち、相同配列からシグナルを得る。　（Ｂｅ ｌｔｚ　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗｏｌｏｇｙ　（１９８３）ｔｏ ｏ：　２６６−２８５を参照のこと）。 当業者に知られている方法を使用して、トランスジェニック植物の生産のための 植物細胞を包含する、酵素の発現のために選択した宿主細胞の中に導入すること ができる構成体の中に、植物の中位績チオエステラーゼをコードするＤＮ＾配列 を挿入することができる。 こうして、タンパク質の宿主細胞は原核生物および真核生物の両者の細胞を包含 する。宿主細胞は単細胞であるか、あるいは意図する用途に依存して多細胞の分 化したまたは未分化の生物の中に見いだすことができる。本発明の細胞は、その 中に存在する野生型細胞に対して外来の植物のチオエステラーゼを有することに よって、例えば、その中に植物のチオエステラーゼをエンコードする組み換え核 酸の構成体を有することによって区別することができる。 また、宿主に依存して、ウィルス、プラスミドまたは染色体の遺伝子などを包含 する調節領域は変化するであろう。原核生物または真核生物の微生物、とくに単 細胞の宿主の中の発現のために、広範な種類の構成的または調節可能なプロモー ターを使用することができる。記載した転写開始領域の中に、細菌または酵母の 宿主、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ） 　、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）からの、遺伝子、例えば、β−ガラクトンダーゼ、Ｔ７ボリメラー ゼ、トリプトファンＥなどを包含する、領域が存在する。 大部分について、植物の宿主細胞の中の発現を望むとき、構成体は植物の中で機 能的である調節領域（プロモーターおよび終結領域）を含むであろう。植物のチ オエステラーゼまたはその機能的断片をコードするオープンリーディングフレー ムは、その５末端において、転写開始調節領域、例えば、チオエステラーゼ構造 遺伝子より上流の５′に天然に見いだされる野生型配列に接合されるであろう。 広範な種類の構成的または調節可能な、例えば、誘発可能な、構造遺伝子機能の 転写を提供する、多数の他の転写開始領域が入手可能である。植物のために使用 する転写開始領域には、構造遺伝子、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓおよびツバリンま たはマンノパインシンターゼに関連する領域、あるいはナピン、ＡＣＰポリメラ ーゼなどに関連する。このような構造遺伝子に対応する転写／転写開始領域は、 それぞれの開始コドンに対して直ぐ５′上流に見いだされる。特定のプロモータ ー、例えば、問題の植物の宿主に対して天然のプロモーターまたは修飾されたプ ロモーター、すなわち、１つの遺伝子源から誘導化された転写開始領域および異 なる遺伝子源から誘導化された転写開始領域を有するプロモーター、問題の植物 のチオエステラーゼをエンコードする配列を含むプロモーター、または増強され たプロモーター、例えば、二重３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターを望む場合、配列 は標準の技術を使用して一緒に接合することができる。植物の中の中位績チオエ ステラーゼの発現を望む大部分の応用のために、種子特異的プロモーターの使用 は好ましい。細菌または異種植物細胞の中で発現させるとき、植物の中位績チオ エステラーゼは生物学的に活性であることが今回観察された。 とくに、通常中位績脂肪酸を遊離脂肪酸として、あるいはトリグリセリド分子の 中に組み込んで、含有しない植物の種子は、このような中位類脂肪酸を含有する ことを発見することができることが今回見られた。中位類脂肪酸を通常含有しな い種子とは、全体の脂肪酸の中の０，１モル％より少ない所定の中位類脂肪酸を 含有する種子を意味する。こうして、全体の脂肪酸の中の最小１．０モル％の所 定の中位類脂肪酸を含有する任意の植物の種子は有意に修飾される。 「全体の脂肪酸の中のモル％」は、全体の脂肪酸含量のうちの中位類脂肪酸の相 対比を記載するために使用する。これらの数値は必要に応じて重量％に変換する ことができる。 全体の脂肪酸の１．０モル％のラウレートから全体の脂肪酸の５０．０モル％の ラウレートまでの中位類脂肪酸の含量を測定した。植物の種子の全体の脂肪酸は 、胚、内胚乳および種子の外殻脂質を包含する。さらに、中位類脂肪酸を含有す る種子において、全体の脂肪酸の中のラウレートの含量はトリアジルグリセリド のラウレート含量に直接対応することが認められる。こうし７て、全体の脂肪酸 の含量を同様によく［全体の抽出可能な油」として考えることが適当である。 中位鎖脂＃５酸を組み込んだトリアジルグリセリドに関すると、グリセロールの 主鎖のどの位置が関係するかは明らかではない。しかしながら、測定した中位類 脂肪酸の高いレベルに基づくと、トリアジルグリセリドの少なくとも２つの位置 が関係することが明らかである。 アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびブラシカ　（Ｂｒａｓｓｉｃ ａ）の種子を含有する中位類をここにおいて例示する。とくに、種子特異的プロ モーターの調節コントロール下の異種中位類チオエステラーゼの構造遺伝子の発 現の結果として、新規な脂肪酸の組成を含有するトランスジエニノクアラビドプ シス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）の種子 を記載する。カルフォルニア・ゲノケイジュ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ　ｃａ ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（ゲノケイジュ）から得られる中位類チオエステラーゼを コードするＤＮＡ配列の発現により、ラウレートはこれらのそれぞれの種子の抽 出可能な油の中に今回発見された。 ラウレートの存在が増加するとき、オレイン酸（１８１）の対応する減少が観察 される。ラウレートの増加に伴う他の脂肪酸組成の変化はミリステート　（１４ ：０）の増加および、より少ない程度に、リノーＪレネー）（１８：３）および パルミテート（１６；０）の量の減少を含む。 アラビドプソス（＾ｒａｂｔｄｏｐｓｉｓ）において、１００個の種子のプール の分析は形質転換された植物の同定に導き、形質転換された植物の種子は、対照 の種子において測定されたほぼ０％のラウレートに比較して、２３．５モル％ま でのラウレートを含有した。ＴＩ植物（もとの形質転換体）からの成熟種子であ る１２種子は、分離する集団を表すので、１２種子から成長した第２世代の植物 （Ｉ２）からの種子において、なおより高いレベルのラウレートが期待されるで あろう。 ゲノケイジュ・チオエステラーゼの遺伝子を発現するトランスジェニックブラシ カ　（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子（２５〜３０個の種子のプール）の分析は、それ らの種子が３７モル％までのラウレートを含有する形質転換体の同定を与える。 これらの植物の単一および半分の種子のＴＡＧの分析は、分離する種子の集団の 中のラウレートのレベルが少なくとも５０モル％程度に高いことを証明する。半 分の種子の１八Ｇの分析は、最高のラウレートを生産する１２種子の同定を可能 とし、そして引き続いて残留する種子の部分は発芽して所望の高いラウレートの 種子をもつ第２世代の植物を生産することを明らかにする。 全体の脂肪酸の中の中位類脂肪酸のモル％と遺伝子のコピー数との間の相関関係 が観察された。したがって、測定された全体の脂肪酸の中の中位類脂肪酸の最小 のモル％はほぼ５０．０モル％であるが、より多くの遺伝子をさらに挿入するこ とによって中位類脂肪酸のレベルを増加することができる。このような技術は遺 伝子操作または植物の育種法を包含することができる。 中位類脂肪酸を増加するいくつかの遺伝子操作のアプローチは、植物のチオエス テラーゼの構造遺伝子をコードする追加のＤＮＡ配列の細胞の中への挿入、より 高いｍＲＮ＾のコピー数を証明する転写開始領域の使用、あるいは、例えば、基 質の利用可能性によりよく対応する改良されたタイミングの特異性のプロフィル を包含する。例えば、ブラシカ　（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の種子の中の、ナピ ンプロモーターの！Ｊ１節コントロール下の、ラウレート生産の時間過程の分析 は、中位類チオエステラーゼの出現が貯蔵油の合成の開始よりほぼ５〜７日間遅 れることを証明する。計算により、中位鎖ヂオエステラーゼが有意の衝撃をなｔ 前に、全体の脂肪酸の約２０％が既に合成されていることが示される。こうして 、チオエステラーゼ遺伝子が胚の発育のより早い段階で発現される場合、実質的 により高いラウレートのレベル（１０〜２０％）を得ることができるであろう。 さらに、翻訳の効率を増加する手段は、中位類チオエステラーゼ遺伝子の完全な 構造のコーディング配列の使用を包含することができる。こうして、第１Ｂ図に 示すゲノケイジュ・チオエステラーゼのコーディング配列の完全な５′領域はラ ウレートの生産を改良することができる。あるいは、中位類チオエステラーゼが 異常なトランシットペプチド配列、すなわち、色素体チラコイドのターゲツティ ングとの類似性を示すもの、例えば、ゲソケイジュ・チオエステラーゼとともに 見いだされるものを有する場合、いっそう典型的な植物トランシット、例えば、 ベニバナの中に見いだされるもの（第４図）、アシルキャリア−タンパク質また はｓｓｕの使用を置換することができる。 本発明は、また、植物細胞を包含する宿主細胞の巾で不飽和脂肪酸を生産する機 会を提供する。植物の中位類チオエステラーゼは、不飽和中位類脂肪酸をもたな い植物からのものでさえ、このような基質に対し、て活性である。それゆえ、植 物の中位類チオエステラーゼを使用して不飽和中位類脂肪酸を提供することがで きる。 例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中のゲノケイジュ・チオエステラーゼの発現 は、ラウレート　（ＣＩ２：０）、ミリステート　（Ｃ１４：０）およびまた中 位類脂肪酸の不飽和種（ＣＩ２：１およびＣ１４：１）の生産を生ずる。大腸菌 （Ｆ、、ｃｏｌｉ）の中の不飽和脂肪酸の生産は、β−ヒドロキシデカノイルチ オエステルデヒドラーゼにより触媒される。このデヒドラーゼの配列は発表され （Ｃｒｏｎａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。 （１９８８）　２６３　：　４６４１−４６４６）そして、こうして、中位類チ オエステラーゼと関連して使用するために、植物細胞を包含する問題の宿主細胞 の中に挿入することができる。 植物の中位類チオエステラーゼは細菌細胞、とくに脂肪酸を効率よく分解するこ とができない細菌細胞の中で発現するとき、豊富な中位類脂肪酸を生産し、そし て細胞から収穫することができる。ある場合において、中位類脂肪酸は結晶を形 成し、これらの結晶は細菌細胞から容易に分離することができる。アシル−Ｃｏ Ａ　シンターゼを欠如する細菌の突然変異株、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） 　ｆａｄＤおよびｆａｄＥを使用することができる。ｆａｄＤ突然変異株を使用 する研究において、ヘクターの形質転換された対照に関するｆａｄＤゲンケイジ ュ・チオエステラーゼ形質転換体の成長は３７°Ｃにおいて非常に遅延し、そし て２５〜３０°Ｃにおいてそれほど遅延しない。より低い温度で成長する液体培 養物は沈澱を蓄積し、そしてベトリ皿上に形成したコロニーは２５°Ｃにおいて 大量のラウレートの結晶をことに表面に堆積した。これらの堆積物は、ＦＡＲ質 量スペクトルで同定したとき、ラウレートとして同定された。ガスクロマトグラ フィーによる分離および定量後、ペトリ皿上にｆａｄＤ−ゲッケイジュ・チオエ ステラーゼにより堆積されたラウレート結晶は、生産する細菌の合計の乾燥重量 の約３０〜１００％を表すことが推定される。 中位類チオエステラーゼの発現を植物細胞の中で望むとき、問題の種々の植物は 次のものを包含するが、これらに限定されない：菜種（Ｃａｎｏｌａおよび旧ｇ ｈ　Ｅｒｕｃｉｃ　Ａｃ１ｄ変種）、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、クヘア（Ｃｕ ｐｈｅａ）　、ダイズ、ナンキンマメ、ココナツおよびギネアアブラヤシおよび トウモロコシ。組み換え構成体を宿主細胞の中に導入する方法に依存して、他の ＤＮＡ配列を必要とすることがある０重要なことには、本発明は双子葉および単 子葉の種に同様によく適用する。二とができ、そして新しいおよび／または０良 された形質転換および調節の技術に容易に適用することができる。 いずれの場合においても、形質転換の方法は本発明に対して臨界的ではない；植 物の形質転換の種々の方法を現在利用６Ｊ能である。 より新しい方法を利用して作物を形質転換することができるが、それらは以後に おいて直接適用することができる０例えば、癌腫菌（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ）の感染に対して自然に感受性である多数の植物種は、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕ＊）仲介形質転換の三部分または三部分ヘクターの方法により首尾 よく形質転換することができる。さらに、種々の単子葉および双子葉の植物種の 形質転換を可能とする、マイクロインジェクション、　ＤＮＡ粒子の衝撃、エレ クトツボ１／イシヨンの技術が開発された。 次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定 しない。 実施例 ｆｆｌ上　−アソルーＡＣＰチオエステラーゼのｃＤＮＡ配列全長のゲノケイジ ュ中位鎖チオエステラーゼｃＤＮＡクローン、ｐＣＧＮ３８２２、（３Ａ−１７ ）の配列は、第１Ａ図に表されている。 位置１４５−１４７におけるＡＴＧコドンで開始するゲソヶイジュ・チオエステ ラーゼの翻訳されたアミノ酸配列は第１Ｂ図に示されている。この＾ＴＧは、植 物の翻訳開始のルールに合致し、したがって１ｎｖｊｖｏで利用される開始コド ンであると思われる配列により取り囲まれている。開始のためにｂｐ１４５にお けるＡＴＧを使用して、３８２アミノ酸のポリペプチドをゲノケイジュ・チオエ ステラーゼｍＲＮＡから翻において検出されたからである（Ｏｈｌｒｏｇｇｅら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 訳することができる。ゲノヶイジトチメエステラーゼ遺伝子の第２クラスのＤＮ ＾配列は、第３図に記載されている。 発育する種子から単離された、成熟ゲソヶイジュ・チオエステラーゼのＮ−末端 配列５よ、誘導化されたタンパク質配列のアミノ酸残基８４において開始する。 したがって、Ｎ−末端の８３アミノ酸はトランシットペプブ・ドの配列を表す。 この配列は、通常４０−１００アミノ酸長さの間である、色素体トランシフトペ プチドに共通の特徴を有する（Ｋｅｅｇｓｔｒａら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌ ａｎｔ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。 Ｂｔｏｌｏｇｙ（１９８９）　４０　：　４７１−５０１）、このトランシフト ペプチド領域のヒドロパン−のプロットは、トランシット配列の各末端に疎水性 ドメインを明らかにする。他のトランシットペプチドの配列は同様な疎水性Ｎ− 末端ドメインを含有することが示された。このＮ−末端ドメインの意味は知られ ていないが、ある種の実験が示唆するように、脂質仲介結合はあるタンパク質の 色素体の取り入れのために重要である（ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＫｅｅｇｓｔｒ ａ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、（１９８９）８９　：９９３−９９９）。 Ｃ−末端ドメインに関すると、既知の葉緑体のストロマのタンパク質のトランシ ットペプチドのヒトロバシーのプロットの比較（Ｋｅｅｇｓ　ｔｒａら、前掲） により、これらのトランシットペプチドはＣ−末端ドメインに疎水性ドメインを もたないことが示される。 しかしながら、葉緑体のチラコイドのルーメンに予定されたプレプロタンパク質 は、それらのトランシットペプチドのＣ−末端にアラニンに冨んだ疎水性ドメイ ンを有する（　Ｓｍｅｅｋｅｎｓら、ＴｌＢ５　（１９９０）１５　：　７３− ７６）。ゲノケイジュ・チオエステラーゼのトランシット配列の中のこのような ドメインの存在は、それがチラコイド同等体のルーメンに、あるいは股間の空間 にこの酵素をターゲツティングする二重ドメインのトランシットペプチドを有す ることを示唆する。 これは予期せざることである６なぜなら、アシル−ＡＣＰはストロマ本発明のチ オエステラーゼのＰＣＲ遺伝子生産物をゲル精製し、そＳｃｉ、　（１９７９） 　７６：　１１９４　１１９８）　、ゲッケイジｊＬ’チオエステラーゼのプレ プロタンパク質の中のこのようなドメインの存在について別の説明は、それが精 製したとき切断され、人工的Ｎ−末端の配列の決定に導く成熟タンパク質の膜の アンカーを表すことができるということである。次いで、成熟チオエステラーゼ タンパク質のｉｎ　ｖｉｖ。 Ｎ−末端は、アミノ酸配列の分析により示されるよりさらに上流の位置に存在す るであろう。 誘導されたアミノ酸配列を使用して遺伝子バンクのサーチは、を椎動物の中位鎖 アシルーＡＣＰチオエステラーゼ■を包含する、いかなるエンドリートの有意な 合致も明らかにしない（ＮａｇｇｅｒＬ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　（１９ ８７）　２４３：　５９７　６０１）。また、ゲッケイジュ・チオエステラーゼ は脂肪酸シンターゼチオエステラーゼ活性部位のモチーフに類似する配列を含有 しない（八１Ｌｋｅｎ、１９９０，１ｄａｎＬｉｒｉｃａＬｉｏｎ　ｏｆＰｒｏ ｔｅｉｎ　Ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、　Ａｃｔｉｖｅ　５ｉｔｅ 　ＭｏＬｉｆｓ、　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｐｏ ５ｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（Ｅｌｌｉｓ 　Ｈｏｒｗｏｏｄ、チチェスター、ウエストサセソクス、英国、　ｐｐ、　４Ｏ −１４７）。 比較のために、長鎖アンルーＡＣＰチオエステラーゼの単離および配列を提供す る。ベニバナの３４および４０ｋＤのチオエステラーゼのタンパク質の臭化シア ンペプチド配列からの配列の情報を分析して、ベニバナ・チオエステラーゼのペ プチド地回を得る。これらのペプチドとゲノケイジュ・チオエステラーゼのアミ ノ酸配列との相同性の比較は、ベニバナ・チオエステラーゼのペプチド地図を確 証する。 縮重オリゴヌクレオチドのプライマーをベニバナ・チオエステラーゼのペプチド の配列のアミノ酸配列から設計し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にお いてプライマーとして使用してベニバナ・チオエステラーゼ遺伝子の断片を得る 。 してプローブとして使用してベニバナ胚ｃＤＮ＾ライブラリーをスクリーニング する。６クローンを単離する；制限マツピングはそれらが２つの遺伝子のクラス の中に入ることを示す。各クラスからの代表的なもの、ｐＣＧＮ３２６４　（２ −１＞およびｐＣＧＮ３２６５　（５−２）のヌクレオチドおよび翻訳されたア ミノ酸配列は、第４Ａ図および第４Ｂ図に表されている。Ｎ−末端アミノ酸配列 の情報に基づいて、成熟ベニバナ・チオエステラーゼのアミノ末端を第４Ａ図お よび第４Ｂ図における翻訳されたアミノ酸配列のアミノ酸６１のアラニン残基に 帰属させる。 ２つのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのｃＤＮ＾クローンの推定されたアミノ 酸配列の比較は、成熟タンパク質が８２％であるが、対応するＤＮＡ配列が８０ ％の同一性を共有することを示す。２つのタンパク質の等電点のコンピューター の推定はかなり異なる。２−１によりコードされる成熟クンバク質について推定 されたｐｉは５．８であるが、５−２によりコードされるタンパク質のそれは８ ．１である。 ベニバナ・チオエステラーゼの精製の結果は、ベニバナ・チオエステラーゼの潜 在的にいくつかの形態が存在することを示した。２つの明確な分子量のクラス、 ならびにクロマトフオーカシングからの２つの別々のピーク分画が観察された０ 両者の分子量種は各活性ピークの中に表される。しかしながら、各形態のタンパ ク質配列の分析は、これらのイソフオームが同様に単一のタンパク質の生産物で あることを示す。各種のＮ−末端の配列は同一であり、そして内部のＣＮＢｒ断 片のいかなるもののタンパク質配列においても差が観察されなかった。異なる分 子量種は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの処理によるか、あるいは抽出または精製の間の、 多分酸沈澱段階の間の減成の結果であることがある。 ペプチドの配列の証拠はベニバナ・チオエステラーゼの精製において観察された イソフオームのすべてを同一タンパク質から誘導化することができることを示す が、ｃＤＮＡの２つの高度に相同性であるが、明確なりラスがベニバナ胚ｃＤＮ ＾ライブラリーから単離された。 両者のクラスは、大腸菌（ε、ｃｏｌｉ）の中の発現に基づ＜Ｃ１８；１基質に 対する優先の活性を有するアシル−＾ＣＰチオエステラーゼをコードする。しか しながら、ペプチド配列のデータは２−１エンコードされたタンパク質からの翻 訳されたアミノ酸配列のみと合致しくアミノ酸の配列決定のための小さい不一致 を許容する）、そして５−２遺伝子によりコードされるチオエステラーゼに独特 に相当するペプチドは発見されなかった。多分、５−２によりエンコードされる タンパク質は量が少なく、そして配列決定について考慮すべき十分に優勢のバン ドではなかった。あるいは、５−２によりコードされるタンパク質は消化された 試料の小さい成分であることがあるので、その結果５Ｏ５−ＰＡＧＥおよびエレ クトロブロツエイング後に検出するために十分な量でＣＮＢｒ断片が存在しなか った。２つのタンパク質生産物の予測されたｐｌの検査は５−２が２−１より非 常にいっそう塩基性のタンパク質をコードすることを示すので、５−２に相当す るタンパク質は精製における沈澱工程の間に排除されることがある。 ヌ」１例−１−大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ の発現 Ｕ匠１人 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中のゲッケイジュ・チオエステラーゼのタンパク質の 発現を記載する。 切頭ゲノケイジュ（１２００ｂｐ）　ｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｊ）宿主 細胞の中で３０ｋＤのタンパク質として発現させ、そしてｃＤＮＡ断片が形質転 換体に増加したＣ１２アシル−へＣＰチオエステラーゼ活性を与えることを証明 するデータを提供する。 ｐｉ！Ｔ３ａベクター（Ｉｌｏｓｅｎｂｅｒｇ　ら、Ｇｅｎｅ　（１９Ｂ？）　 ５６　：　１２５−１３５）を、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＢＬＺＬ株（Ｓｔｕ ｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。 （１９８６）　１９８：　１１３−１３０）宿主の中でこの研究のために使用し た。 ｐＨＴ３ａベクターはプロモーターおよびバタテリオファージＴ７の３３ｂｐの ５′　リーディングフレームを含有する。Ｔ７ポリメラーゼは、大腸菌（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）　ＢＬ２１　（ＤＥ３）株の中に見いだされるイソプロピル−ｂ−Ｄ− チオガラクトプラノシド（ＩＰＴＧ）誘発可能なｌａｃ　ＵＶ５プロモーターの ｔＩｉ節コントロール下にある。こうして、ｐＥＴ３ａで形質転換された大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＢＬ２１　（ＤＥ３）へＩＰＴＧを添加することによって、 Ｔ７プロモーターは活性化されるであろう。 Ｂａ■旧／ＥｃｏＲＩ断片を欠失し、そしてチオエステラーゼ配列の置換により 、リーディングフレームで融合された第１図切頭ｃＤＮ＾を含有する構成体を調 製する。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）をチオエステラーゼ（ｐＥＴ３ａ　−Ｔ旧０ ）を含有するｐＥＴ３ａ構成体および対照として非修飾ｐｌ３ａで形質転換する 。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を３７℃において液体培地の中で成長させ、そして発 現を１−Ｍ　ＩＰＴＧの添加により誘発させる。 １時間インキュベーションした後、細胞を遠心により収獲し、アッセイ緩衝液の 中に再懸濁させ、そして超音波処理により溶解する。 細胞の破片をそれ以上の遠心により除去し、そして上澄み液を活性のアッセイに おいて、Ｐｏ１ｌａｒｄら、＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ。 （１９９１）　２８１　：　３０６−３１２に記載されているように使用した。 表土 加水分解活性（エーテル 太」［けイ土　１ムＬ已１１　狛上１扛引互ｊ紅−ｐＥＴ３ａ　８　：　Ｏ−Ａ ＣＰ　３７０１０　：　０−ＡＣＰ　１８１ １２：０−ＡＣＰ　１０２８ １４　：　０−ＡＣＰ　１２７１ １６　：　０−八ＣＰ　２８４８ １８　：　１−ＡＣＰ　２８７７ ｐＥＴ３ａ　−Ｔ旧０　８　：　０−ＡＣＰ　３４９１０　：　Ｏ−ＡＣＰ　６ ２１ １２；　０−ＡＣＰ　２１２Ｔ １４　：　０−ＡＣＰ　１０３５ １６：０−ＡＣＰ　１９００ １８：ｌ−ＡＣＰ　２０２５ これらの結果が示すように、対照大腸菌（ｔ！、ｃｏｌｉ）細胞の１ノゼイトは 、長鎖基質を参照して、試験したすべてのアシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解 活性を含有する。ｐＥＴ３ａ　−ＴＨＬＯの結果を対照の結果と比較すると、明 らかなように、基質の好ましさのツマターンしよ異なる。形質転換体のリゼイト は、対照のリゼイトと比較したとき、他の基質に関して１２　：　０−ＡＣＰと の大きく増加した活性を示す。この増加した１２：０−＾ｃｐ活性は、このｃＤ Ｎ＾断片刃く大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）細胞の中で活性酵素を生産するために十 分なゲンケイジュ１２　：　Ｏ−ＭＣＩ’チオエステラーゼ遺伝子を含んでなる ことを証明する。 さらに、全体の成熟ゲンケイジュ・チオエステラーゼのタンノぐり質は大腸菌（ Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞の中でＩａｃ融合体として発現される。実施例１に記載する 、全長のゲノケイジュ・チオエステラーゼｃＤＮＡ。 ｐＣＧＮ３８２２、の配列の分析は、塩基３９４におけるＸｂａ１部位を明らか にする。このＸｂａ１部位における消化は、アミノ酸位置７２におけるロイノン を表ずコドンの直ぐ５′のコーディング領域を切断する。このロイシンは、実施 例１ａに記載するようにアミノ末端残基のために候補として同定された。 ｐＣＧＮ３８２２　ｃＤＮＡのほぼ１２００ｂｐの断片を、前述したように、仮 定した成熟タンパク質の開始部位において切断するＸｂａ　ｌで消化することに よって、ｃＤＮＡの３′末端をフランキングするベクター配列の中で、発生させ る。Ｘｂａｌ断片をブルースクライブ（４１ｕｓｃｒｉｂｅ）　Ｍ　１３　（＋ 　／−）（また、ｐｕｓ　＋　／　−）クローニングヘククー（ＳＬｒａｔａｇ ｅｎｅ、サンジエゴ、カリフォルニア州）のマイナスバージョンのＸｂａｌ消化 物上でクローニングする。成熟タンパク質がブルースクライブ（Ｌｌｕｓｃｒｉ ｂｅ）ベクターの１ａｃＺｉ！伝子の部分とリーディングフレームの中にかつｌ ａｃプロモーターのコントロール下にあるように、チオエステラーゼ遺伝子のク ローンを挿入する。 生ずる構成体ｐＣＧＮ３８２３、および反対の向きで挿入されたゲ・ノケイジュ ・チオエステラーゼ遺伝子を有する対照ブルースクライブ（Ｂｌｕｓｃｒｉｂｅ ）構成体を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中に形質転換する。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）細胞を３７°Ｃにおいて液体培地の中で成長させ、そしてＩＰＴＧを０．１ｍ Ｍ　ＩＰＴＧの最終濃度に添加することによって、Ｉａｃプロモーターからの発 現を誘発する。誘発の１時間後、切頭ゲ・ンケイジュ・チオエステラーゼについ て前述したように、細胞を収獲し、溶解しそして測定する。 、Ｌ２− 誘発した　加水分解活性 大腸菌　（エーテル抽出物 ’）ｔ’イト　ＢＬＪＬ　７ｔ＋４０）　−（Ｄ”；ｃｍ−ｐＣＧＮ３８２３　 １／４０００　８　：　Ｏ−ＡＣＰ　ＯｌＯ：　０−＾ＣＰ　０ １２二　〇−八へ１’　１８４０ １４：　０−＾Ｃ１’　１１６ １６：　０−八ＣＰ　２０ １８　：　１−八ＣＰ　５ 対照　１／４０００　８　：　Ｏ−ＡＣＰ　０１０：０−ＡＣＰ　Ｏ １２：０−ＡＣＰ　Ｑ １０：０−ＡＣＰ　Ｏ １６：　Ｏ−ＡＣＰ　１３ １８：１−ＡＣＰ　に れらの残留物が証明するように、仮定した成熟ゲッケイジュ・チオエステラーゼ 酵素を発現する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞からのリゼイトは、変化する炭素鎖 長の他のへ〇Ｐ基質に対するより、１２：０−＾ＣＰ基質に対して有意により大 きい活性を有する。さらに、この活性は切頭ゲンケイジュ・チオエステラーゼを 発現する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞のリゼイトにおけるより２桁大きい。大腸 菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）細胞の中のゲノケイジュ・チオエステラーゼのタンパク質 の発現がこれらの細胞の脂肪酸組成に作用を有するかどうかを決定するために、 研究を実施している。初期の研究は、ゲソケイジュ・チオエステラーゼを含有す る大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞の脂肪酸複合体の実質的な変化を同定することが できなかった。しかしながら、後述するように、ペレット化した形質転換された 細胞又は形質転換された細胞をベレント化した成長培地のより大きい試料の分析 は、形質転換された細胞の脂肪酸のプロフィルの変化を示す、ＣＩ２脂肪酸は、 非形質転換対照細胞に比較して、ゲノケイジュ・チオエステラーゼを含有する細 胞の中でより高い量で生産される。 プラスミドベクターブルースクライブ（Ｂｌｕｓｅｒｉｂｅ）　（ＳＬｒａｔａ ｇｅｎｅ。 サンジエゴ、カリフォルニア州）で形質転換された大腸菌（［！、ｃｏｌｉ）対 照細胞および成熟チオエステラーゼ構成体で形質転換された細胞のほぼ１００１ を１、ＥＣＬＢ　（大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｌｕｒｉａブロス）培地の中でほ ぼ０．６の光学密度に成長させ、そして遠心によりペレット化した。細胞および 培地を次のようにして酸性方法を使用して抽出する。 ペレット化した細胞を４１のメタノール中の５％（ｖ　／　ｖ　）　ＨｌＳＯａ の中に再懸濁させる。この培地を遠心後に回収し、そして１０−１の酢酸を添加 する。試料を５０−１のエーテルと激しく震盪する。相を分離し、そして下の層 を廃棄する。エーテル層を一夜暴発させて、１〜２−１の残留溶液を得る。４１ のメタノール中の５％（ｖ　／　ｖ　）　Ｉｔ□５０４を残留する培地溶液に添 加する。 次の工程を前述の培地の溶液およびペレット化した細胞の両者の脂肪酸分析通用 する。細胞およびｕｚｓｏａ　／メタノールの中の培地の試料をねし込みキャン プの管に移し、そしてＱ、５＋ｓｇ／糟１のＣ１７標準を含有する２ｍｌのトル エンを添加する。管にキャップをきつく閉め、管を９０”Ｃにおいて２時間イン キュベーションし、次いで４ｍｌの０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣＩおよび２１のヘ キサンを添加する。次いで、各試料の上層（ヘキサン）をテーブルトップの遠心 機で］０ＯＯｒｐ−において５分間遠心して、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞の層 内に捕捉されることがある抽出された脂肪酸メチルエステルを分離した。 試料を気液クロマトグラフィー（ＣＣ）により温度のプログラムを使用して分析 して、１０個またはそれより少ない炭素原子を有する成分の分離を増強する。使 用した温度のプログラムは、１４０°Ｃの温度について３分間、次いで２３０° Ｃに到達するまでの５°Ｃ／分の温度増加を提供し、そして２３０°Ｃを１１分 間維持する。試料をヘラレット−バラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ）　５８９０　（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）のガスクロマトグラ フで分析する。脂肪酸含量の計算は内部Ｃ１７標準に基づく。 ＧＣ分析は、形質転換された細胞からの培地中の脂肪酸のほぼ７０％がＣＩ、２ 脂肪酸であることを示す。これは対照細胞からの培地中のＣ１２脂肪酸の約２％ のレベル上と比較される。さらに、非形質転換細胞の含量を越えた形質転換され た細胞の含量のほぼ２倍の増加が観察される。 Ｐｏ１ｌａｒｄら、前掲に記載されているように発育する種子から精製されたゲ ノケイジュ・チオエステラーゼ酵素の基質の分析をまた実施する。結果を下表３ に表す。 表１ 加水分解活性 遣足基１　（エーテル　の゛′−ｃ探 ８：０−八ＣＰＯ ＋ｏ：ｏ−ｔｃｐ　Ｏ １２；　０−八ＣＰ　１２６１ １４　：　０−八ＣＰ　６９ １６　：　Ｏ−ＡＣＰ　１２ １８　：　１−八ＣＰ　４３２ 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）抽出物の中および発育するゲッケイジュ種子から精製さ れたチオエステラーゼの基質の分析の結果を比較すると、２つの源からの酵素の 活性のプロフィルはＣ８，ｔｏ、　１２．１４および１６　ＡＣＰ基質に関して 本質的に同定であることが明らかである。胚から精製された酵素はＣ１，８：Ｉ 基質で大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）発現されたチオエステラーゼよりわずかに活性で あるが、この差は中位鎖チオエステラーゼから完全には除外されなかった長鎖ゲ ノケイジュ・チオエステラーゼの活性のためであると信じられる。 ｌ）立文上二上■生及 それ以上の研究のために、ゲノケイジュ・チオエステラーゼ発現プラスミド（ρ ＣＧＮ３８２３　）を、中位鎖特異的アシルーＣｏＡシンターゼを欠如しく０ｖ ｅｒａｎら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｒｉｏｃｈｅｍ、　（１９６９）　７　：　５５ ９−５７４）、したがって、ラウレートを分解することができない大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）ｆａｄＤ株の中で確立した。ヘクター形質転換された対照に関するｆ ａｄＤゲンケイジュ・チオエステラーゼ形質転換体の成長を２５°Ｃ，３０”Ｃ および３７゛Ｃにおいて研究した。液体培養において、ゲッケイジュ・チオエス テラーゼ形質転換されたｆａｄＤ細菌は、すべての３つの温度において、指数的 成長相の間に対照とほぼ同一速度で増殖する。しかしながら、３７℃において、 ゲソケイジュ・チオエステラーゼのプラスミドを収容するｆａｄＤ細胞は成長の 定常期に近い培養物から回収することができない。対照的に、プラスミドは数日 間より低い温度において安定に含有され、そしてこれらの定常期の培養物はメタ ノールまたはエーテルの中に可溶性の有意な量の沈澱を生産する。 寒天上のｆａｄＤ−ゲッケイジュ・チオエステラーゼのコロニーの成長は３７° Ｃにおいて厳しく遅延されたるが、より低い温度においてはほんのわずかである 。２５°Ｃにおいてペトリ皿上に形成したコロニーは、大量の結晶を、ことに表 面において、堆積するが、また細胞不含寒天マトリックスの中または表面におい て堆積する。これらの結晶の堆積は（ＦＡＢ）質量スペクトル測定によりカリウ ムラウレートと同定された。ガスクロマトグラフィーにより分離および定量後、 うｃｏｌｉ）　ｆａｄＤ細胞の中に存在しない０分析はこれらのピークの２つか の飽和および不飽和の脂肪酸シンターゼの経路から脂肪族アシル−ＡＣＰを加水 分解することができる。飽和の経路は後期対数期において１００％遮断され、そ して不飽和の経路は約７０％遮断される。これにより、主として１６：１および １８：１の置換された、細胞のリン脂質の中の飽和の減少が生ずる。蓄積された １２：１／１４：　１の比はほぼ０．９／１であるが、１２：ｏ／１４：Ｏの蓄 積の比はほぼ９／１である。これにより示すことができるように、不飽和脂肪族 アシル＾ｃＰのチオエステラーゼの鎖長さの特異性は飽和の基質のそれと異なる か、あるいは１４　：　１−ＡＣＰプールは１２；１−＾ｃｐブールより非常に 大きい、さらに飽和の経路のほぼ完全な遮断は成長の定常期の間に飽和脂肪酸の 連続的合成を生ずる。 ｆａｄＤ＋形質転換体とｆａｄＤ形質転換体との間のラウレート蓄積レベルの顕 著な差は、ゲノケイジュ・チオエステラーゼの基質の特異性の研究と一致する（ Ｐｏｌｌａｒｄら、前掲）　。ｆａｄＤ＋大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中の導入さ れたゲノケイジュ・チオエステラーゼにより発生したラウレートは、ゲッケイジ ュ・チオエステラーゼの非常に効果に劣る基質である、ＣｏＡにエステル化し、 そして引き続いてβ−酸化により分解するか、あるいは脂肪酸合成のために再循 環させることができる。したがって、小さい部分だけが蓄積し、そして培地の中 に逃げることができる。ｆａｄＤ株において、ラウレートはＣｏへにエステル化 されず、そして再循環されることはない、観察されたわずかの成長の遅延は、こ のような高いレベルへのラウレートの蓄積が大Ｕ％菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主細胞 への毒性作用を生ずることを示しうる。 ３７°Ｃにおいて、ｆａｄＤ株の中のラウレートシンターゼは指数的成長の間に のみ許容される。対数期の終わりにおけるゲッケイジュ・チオエステラーゼのプ ラスミドを含有する細胞の力価の急速な損失は、ラウレートの毒性の温度依存性 を反映するか、あるいは導入されたゲソケイジュ・チオエステラーゼの活性を致 死的とさせる、定常期の代謝−・の生理学的シフトを反映することがある。大腸 菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の脂肪酸組成は老化する培養物の中で変化し、そしてより低 い温度における飽和脂肪酸の要求の減少はこれらの温度におけるゲッケイジュ・ チオエステラーゼの発現のマイナスの衝撃を低下させることができる。大腸菌（ Ｅ、ｃｏｌｉ）の中の不飽和脂肪酸のための経路はＣＩＯ段階において発散し、 そしてゲノケイジュ・チオエステラーゼにより遮断される可能性は最も少ないで あろう。 培地の中のラウレートの蓄積は、より少量のカプレート（１０：０）の堆積によ り達成される。これはチオエステラーゼ活性と接触しており、ここで１４　：　 ０−ＡＣＰ加水分解は１０　：　０−ＡＣＰの加水分解よりいっそう有意である 。これらの細胞の中の高い量のゲッケイジュ・チオエステラーゼはアシル−ＡＣ Ｐのｉｎ　ｖｉｖｏのプールの大きさ≧１２二〇を効果的に減少するので、１４ ；０より小さいアシル＾ＣＰ基質は有効である。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）の中 のゲンケイジュ・チオエステラーゼによるカプレートの生産は、この酵素がゲッ ケイジュ種子の中のｌＯ：０および１２：０の両者の脂肪酸の堆積に関係するこ とを示すことができる。 実施■１旦 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の巾のベニバナ・チオエステラーゼのタンパク質の発現 を記載する。 ベニバナのアシフレーへＣＰチオエステラーゼのクローンｐＣＧＮ３２６４およ びｐＣＧＮ３２６５を、部位特異的突然変異誘発により変更して、これらのクロ ーンの成熟タンパク質コーディング領域の開始にすぐに接して５ａｌｔおよびＮ ｃｏ　１部位を挿入する。ｃ［ｌＮＡクローンの中の成熟コーディング領域＋３ ′非翻訳配列をＮｃｏ　Ｉ　／　Ｓｅａ　ｌ断片として除去し、そして３ａｍ） ＩＩで消化しかつＤＮ＾ポリメラーゼのクレノー断片で処理して平滑末端をつく ったｐＥＴ８ｃ　（ＳＬｕｄｉｅｒら、１９９０）の中に挿入し、次いでＮｃｏ 　Ｉで切断する。生ずる発現構成体、ｐｃＧＮ３２７０　（２−１）およびρｃ ｒ；Ｎ、３２７１　（５−２）をＴ７プロモーターから直接成熟へニバナアシル ーＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡ配列を発現するように設計する。発現の分析 のために、構成体をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＦ’ＴＧ ）　誘導可能なＩａｃＵＶ　５プロモーターのコントロール下にＴ７ＲＮ＾ポリ メラーゼ遺伝子を含有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＢＬ２１（ｒ）Ｅ３）株の 中に転移する（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９ ９０）１８５　；６Ｏ−８９）　。 チオエステラーゼ活性の測定のために、ｐｃＧＮ３２７０．　ｐｃＧＮ３２７１ または対照としてρＥ丁８ｃを含有する細胞を３７°Ｃにおいて０．４％のグル コースおよび３００μｇ／ｍｌのペニシリンを含有する２ＹＴ　（１６ｇ　）リ プトン、１０ｇ酵母エキス、５　ｇ　ＮａＣｌ／　ｌ　、　ｐ）１７．０）中で 約０．５の０Ｄｂｏ。 に成長させる。　ＩＰＴＧを０．４ｓＭに添加しそしてさらに１．５時間成長さ せることによって誘発を達成する。培養物のｌｈｌのアリコートを遠心により収 穫し、そして沈澱した細胞を一７０゛Ｃにおいて貯蔵した。 測定の前に、ベレットを５００μｍのチオエステラーゼ測定緩衝液の中に再懸濁 させ、そして各２０秒の３回のバーストで超音波処理する。 タンパク質濃度をバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイを使用し て決定する。 ｐｃＧＮ３２７０およびｐｃＧ１１３２７１を含有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） の全体のタンパク質のプロフィルをＳＤＳ　−ＰＡＩＪにより分析する。各場合 において、新しいタンパク質のバンドがＩＩ”ＴＧ誘発した培養物の中にｐＥ７ ８ｃ対照に関して観察される。２−１および５−２エンコードしたタンパク質の コンピューターで予測した分子量は非常に類似するが、ｐｃＧＮ３２７０および ｐｃＧＮ３２７１から発現されたこれらのタンパク質の移動性は有意に異なる。 ｐｃＧＮ３２７０によりエンコードされたタンパク質はほぼ４０ｋＤの移動性を 有するが、ｐｃ［；Ｎ３２７１によりエンコードされたタンパク質はほぼ３６ｋ Ｄである。誘発されたタンパク質をＮ−末端の配列決定にかけて、それらの同一 性を確証する。各場合において、タンパク質の配列はｃＤＮＡにより予測された 配列と合致した。さらに、ｐｃＧＮ３２７１における５−２インサートの３′領 域のヌクレオチド配列を再配列決定して、早期の停止コドンがクローニング工程 の間に導入されなかったことを確実にする。 ｐＥＴ８ｃ　（対照）　、ｐｃＧＮ３２７０またはｐｃＧＮ３２７１を発現する 細胞の全体の抽出物を１８　：　１−ＡＣＰを使用してチオエステラーゼ活性に つし）で測定する。ρＣＧＮ３２７０およびρＣＧＮ３２７１を含有する細胞の 中の１８　：　１−ＡＣＰチオエステラーゼ活性は、対照細胞における活性より 、それぞれ約１００倍および５０倍より高い。ベニバナのアシル−へ〇Ｐチオエ ステラーゼを特性決定するために、ｃＤＮ＾クローンから発現されたチオエステ ラーゼ活性の鎖長さ特異性を種々のアシル−へ〇Ｐ基質について試験し、そして 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）および粗製のべ二ノ１す胚抽出物の対照のチオエステラ ーゼ活性と比較する。ｐｃＧＮ３２７０オヨヒｐｃＧＮ３２７１０）培養物は、 ヘニハナ胚の特徴を示すチオエステラーゼ活性、すなわち、対照の大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）に比較して１８　：　１−ＡＣＰ　／１８　：　０−ＡＣ１’につい て非常により高い優先性を含有する。２つのベニバナのチオエステラーゼのクロ ーンの間で、ｐｃＧＮ３２７１から発現された活性は飽和１８　：　０−ＡＣＰ および１６：０−＾ＣＰ　Ｍ質についてわずかにより広い特異性を表す。 ス１月ユ　−　植物の形質転換の構成体および方法Ａ、ソファオリン、ナピン、 ＣａＭＶ３５ＳおよびＲｃｅ　４プロモーター領域を利用する植物細胞のゲッケ イジュ・チオエステラーゼの発現のための構成体を次のようにして調製する。 スＬ互ヱ四ｙＺｌｊニステラづ Ｂａ１ｌおよび５ａｌｌで消化することによって、ｐＣＧ８３８２２　（３Ａ　 −１７）の１．４５ｋｇの断片を形成する。Ｂａ１１部位はｃＤＮ＾インサート の位Ｗ１４９に位置し、そして５ａｉｌ部位はｃＤＮＡインサートに対して３′ に位置するポリリンカーの中に存在する。こうして、この断片は全体のチオエス テラーゼコーディング領域および、塩基１４４７−１４５２に位置するポリアデ ニル化シグナル、＾ＡＡＴＡＡ、を含む全体のｃＤＮＡ　３　’　Ｓｍ域を含有 し、そしてまたｃＤＮＡに対して３′に直接位置する制限消化部位Ｋｐｎｌ、　 Ｓ＋＊ａｌ、　Ｘｂａｌおよび５ａｉｌを含有する。 β−ファゼオリン５′非ココ−ディング領域８５０ｂｓのＢｇｌｌ＋断片をｐ８ ．８ｐｒｏ　（Ｈｏｆｆｍａｎら（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、６　：　３２１３ −３２２１）から形成し、そしてｐＵｃ　９　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉ ｎｇ　、前掲）の中にＢａｍ８１部位にクローニングしてｐＴシフ９６を生成し た。　ｐＴＶ７９６の中のフプゼオリン断片を配向して、ｐｕｃ　９のＳｍａ　 ［部位がファゼオリンプロモーターに対して３′に位置するようにした。ｐＴＶ ７９６を旧ｎｄ［Ｉ＋およびＳｍａ　１で消化して約８５０ｂｐの断片を発生さ せ、そしてゲル精製する。 ファゼオリンプロモーター（旧ｎｄｌｌｌ／Ｓｍａｌ）およびチオエステラーゼ コーディング領域（Ｂａ１１／５ａ１１）を、１ｌｉｎｄｌｌ＋および５ａｉｌ で消化したブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）クローニングベクターの中への３方結合により接合する。生ずるプラスミド は、５’　ＢａＪＴ部位および３　’　）ｉｐｎ１部位を含む、種々の制限部位 によりフランキングされた旧ｎｄｌｌｌ／５ａｉｌ断片上に、ノアゼオリンプロ モーター／チオエステラーゼ構成体を含有する。チオエステラーゼ断片はポリア デニル化シグナルを含有するので、追加の植物３′コーデイング領域は提供され ない。ノアゼオリンプロモーター／チオエステラーゼ断片は、Ｂａｇ旧およびに ｐｎｌで消化するか、あるいはＸｂａ　１で部分的に消化することによって発生 させ、そして適当なバイナリ−ベクター、例えば、ｐｃＧＮ１５５７またはｐｃ ＧＮ１５５８（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕ＊ｍｅｒｆｅｌｔ＋　（Ｌ９９０）　 Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４　：　２６９−２７６）の中に、 植物の形質転換のために、結合することができる。 Ｂａ＋＋ＨＩおよびＫｐｎ　Ｉ消化から生ずる、ノアゼオリンプロモーター／チ オエステラーゼ断片をｐＣＧＮ１５５８の中に結合すると、ｐｃＧＮ３８２１が 生ずる。 剥Σ／チオエに元うニづ５白咀り ほぼ１２００ｂｐを含有し、そして全体のコーディング領域を含む、チオエステ ラーゼｃＤＮＡ　３　Ａ−１７のＢａ１ｌ／Ｐｓｔｌ断片を、制限酵素Ｂａ１１ およびＰｓｔｌで部分的に消化しそして１２００ｂｐの断片をゲル精製すること によって得る。この断片をプラスミドのクローニングベクター、例えば、Ｐｓｔ ｌおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＩＩＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片を 使用してＢａｍ８１部位をフィルインしたブルースクリプト（ＢＩｕｅｓｃｒｉ ｐＬ）　ベクター（ＳｔｒａＬａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　； ラジョラ、カリフォルニア州）の中に結合する。この手順において、Ｂａｍ１ｌ ［部位はチオエステラーゼｃＤＮＡのＢａ１１部位への結合により回復される。 生ずるプラスミドのＢａａ旧およびＥｃｏＲＩで部分的に消化して、はぼ１２０ ０ｂｐのチオエステラーゼ断片を得る。次いで、この断片をほぼ４．４ｋｂのＢ ａｍＨＩ　／ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片の中にクローニングし、後者の断片はカリ フラワーモザイク（ＣａＭＶ）　３５Ｓ遺伝子からのほぼ０゜９４ｋｂの５′非 コーディング配列（Ｒａｍｌ１１部位にすぐに接して５′）、アグロバタテリウ ムパンメファシエンス（ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）モノパインシンターゼ（ｗａｓ）遺伝子からのほぼ０．７７ｋｂの３′非コー ディング配列（ＥｃｏＲｌ　部位にすぐに接して３′）およびｐＵｃ１９　（Ｎ ｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　、ベバリー、マサチュセンツ州）主鎖を 含有する。 Ｂａ顛旧／ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片を、より大きいプラスミドベクターの部分的 消化および所望の４．４ｋｂの断片のゲル精製により得る。３５Ｓの５′領域は ＣＭ１８４１株（Ｇａｒｄｎｅｒら（１９８１）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、　９　：　９８７１−２８８７　）の塩基６４９２−７４３３であり、こ れは転写開始部位に関して約−６４０〜約＋２である。ｐａａｓ３”非コーディ ング領域はオクトパインＴｉプラスミドｐＴｉＡ６の約塩基１９，２３９〜１８ ，４７４である（番号はＢａｋｅｒら（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ 　（１９８３）　２　：３３５　３５０））が報告するｐＴ　ｉ　１５９５５に 密接に関係する番号に相当する））。 生ずる３５Ｓ／チオ工ステラーゼ／ｍａｓプラスミドをフランキングＢｇｌｌ＋ において消化し、そしてＢａｍ１ｌｌ消化したバイナリ−ベクター、例えば、ｐ ｃＧＮＩ５５７またはｐｃＧＮ１５７８　（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒ ｆｅｌ　ｔ、前掲）の中にクローニングする。 Ｂｃｅ　４　チオエステラーゼ １．４５ｋｂのチオエステラーゼｃＤＮＡ　Ｂａ１ｌ　／Ｓａｌ！断片を前述し たように調製する。初期の種子発育において優先的な発現を提供するＢｃｅ４発 現力セントであるｐｃＧＮ１８７０は、同時係属米国特許出願第０７／４９４． ７２２号（開示をここに引用によって加える）に記載されている。 ｐｃＧ８１８７０をＸｂａ　ＩおよびＸｈｏｌで消化し、そして生ずるｌｋｂの 断片をゲル精製することによって、その３′末端がＢｃｅ　４開始コドンにすぐ に接しているＢｃｅ　４の５′非コーデイング領域のほぼｌｋｂの断片を得る。 Ｂｃｅ　４プロモーター（Ｘｂａ　ｌ　／　Ｘｈｏ　ｌ　）およびチオエステラ ーゼコーディング領域（Ｂａ１１／５ａ１１）を、Ｘｂａｌおよび５ａｉｌで消 化したブルースクライブ（Ｂｌｕｓｃｒｉｂｅ）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ク ローニングベクターの中への３方結合により接合する。生ずるプラスミドは、５ 　’　Ｂａｍｔ＋１部位および３　’　Ｋｐｎ１部位を含む、種々の制限部位に よりフランキングされたＸｂａｌ／５ａｉｌ断片上に、Ｂｃｅ　４プロモ一ター ／チオエステラーゼ構成体を含有する。チオエステラーゼ断片はポリアデニル化 シグナルを含有するので、追加の植物３′非コーデイング領域が得られる。Ｂｃ ｅ　４プロモ一ター／チオエステラーゼ断片は、Ｂａｍ１ｌｌ　を使用する消化 およびＫｐｎｌ　（または同一の認識配列を有するＡｓｐ７１Ｂ）を使用する部 分的消化によるか、あるいはＸｂａ　Ｉを使用する部分的消化により得ることが でき、そして植物の形質転換のために、適当なバイナリ−ベクター、例えば、ｐ ｃＧＮ１５５７またはｐｃＧＮ１５５Ｂ　（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒ ｆｅｌｔ、前掲）の中に結合することができる。Ｂａｍ１ｌＴおよびＫｐｎ　Ｉ の消化から生ずる、Ｂｅｅ　４プロモ一ター／チオエステラーゼ断片をｐｃＧＮ １５７８の中に結合すると、ρＣＧＮ３８２０が生ずる。 ナピン　チオエステラーゼ　ナビン ナピン発現カセットであるｐＣＧＮ１８０Ｂは、同時係属米国特許出願第０７１ ５５０、８０４号（開示をここに引用によって加える）に記載されている。ｐｃ ＧＮ１８０８をフランキング制限部位を含有するように修飾して、抗生物質耐性 マーカーではなく発現配列のみがバイナリ−ベクター、例えばｐｃＧＮ１５５７ へ動くことができるようにする（ＭＣ３ｒｉｄｅおよびＳｕＩＩｌｍｅｒｆｅｌ 　ｔ、前１ｌｌ）　、　Ｋｐｎｌ、　Ｎｏｔｌおよび旧ｎｄｌＴ＋制限部位を含 有する合成オリゴヌクレオチドをアニーリングしそしてｐｃＧＮ１８０８の独特 旧ｎ＋ＨＩＩ部位に結合し、こうしてただ１つの旧ｎｄ１１１部位が回復される ようにする。生ずるプラスミドｐｃＧＮ３２００は、配列分析により確証される ように、ナピン３′−調節配列の３′末端に独特旧ｎｄｌｌ＋。 Ｍｏ１ｌおよびＫｐｎｌ制限部位を含有する。 ナビン発現カ七ノドの大部分をρＣＧＮ３２００がらｌ１ｉｎｄ［ｌｌおよびＳ ａｃ　１で消化しそして旧ｎｄｌ１１および５ａｃｌ消化したｐｌｃ１１９Ｒ（ Ｍａｒｓｈら（１９８４）　Ｇｅｎｅ　３２：　４８１−４８５）に結合するこ とによってサブクローニングしてｐＣＧＮ３２１２をつくるや鋳型としてｐｃＧ Ｎ３２００およびＳａｃ、１部位と、ナピン５′−プロモーターおよびｐｃＧ８ １８０８構成体からのｐｃＧＮ３２００のｐＵｃ主鎖との接合とをフランキング する２つのプライマーを使用するＰＣＲにより、ナビンプロモーター領域の極端 の５′−配列を再構成する。前方プライマーはＣ１ａｌ、旧ｒ＋＋ＨＩ＋　、　 Ｎｏｔｌおよびにｐｎｌ制限部位ならびにナピン５′−配列のヌクレオチｌ−’ 　４０８−４２３（ＥｃｏＲＶ部位から）を含有し、そして逆プライマーは５′ −プロモーターの中に独特５ａｃＴ部位を含むナピン配列７］８−７３９に対す る補体を含有する。　ＰＣＲは製造業者の仕様書に従いパーキン・エルマー／セ ンス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）サーモサイクラ−を使用して実 施した。　ＰＣＲ断片を平滑末端の断片として旧ｎｃｌ＋で消化したｐＵＣ８（ ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９　：　２５ ９−２６８　）の中にサブクローニングしてｐｃＧＮ３２１７を得た。ナビンの 挿入を横切るρＣＧＮ３２１７の配列決定は、不適切なヌクレオチドがＰ（Ｊｌ により導入されなかったことを評価する。　ｐｃＧＮ３２１７の中のナピン５− 配列をナピン発現カセットの残部に、Ｃ１ａｌおよび５ａｃｌを使用する消化お よびＣ１ａｌおよび５ａｃｌで消化したｐｃＧＮ３２１２への結合により結合す る。生ずる発現カセ７　トｐｃＧＮ３２２１を旧ｎｄｌｌｌで消化し、そしてナ ビン発現配列をゲル精製し、そして旧ｎｄ１＋１で消化したｐｌｃ２０１１（門 ａｒｓｈ、前掲）に結合した。 最終の発現カセ７）はｐＣＧＮ３２２３であり、これはｐｃＧＮ１８０８の中に 見いだされるのと本質的に同一の１．７２５ナビン５′および１．２６５　３’ ！ｌｉｅ配列をアンピシリン耐性バックグラウンドの中に含有する。調節領域は 旧ｎｄｌｌｌ　、　ＮｏｔｌおよびＫｐｎ　Ｉ制限部位でフランキングされてお り、そして独特５ａｌｌ、　Ｂｇｌｌｌ　、　ＰｓＬＩおよびＸｈｏｌクローニ ング部位は５′および３′非コーデイング領域の間に位置する。 前述の１２００ｂｐのＢａ１ｌ／Ｐｓｔｌチオ工ステラーゼｃＤＮＡ断片を、５ ａｃｌで消化したナピン発現カセットｐＣＧＮ３２２３の中にクローニングし、 そして５ａｌ１部位をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を使用してフィルイ ンし、次いでＰｓＬＩで消化する。　５ａｌ１部位をこの結合において再構成す る。 これらの操作により発生したナピン／チオエステラーゼ／ナピンプラスミドをＲ ａｍ１ｌｌで消化しそしてＫｐｎ　Ｉで部分的に消化して、はぼ３．３ｋｂの断 片を発生させる。この断片を約１．７ｋｂのナピン５′非コーディング配列、約 １２００ｂ、のＢａ１ｌ／Ｐｓｔｌチオ工ステラーゼｃＤＮＡ断片および約０． ３３ｋｂの３′ナビン非コーデイング領域を含有し、ナピン３′の１．２６５ｋ ｂの残部はこの領域におけるＢａｍＨｒ部位のために欠失されていた。植物の形 質転換のために、約３．３ｋｂの断片をＫｐｎｌ／Ｒａｍ）１１消化したｐｃＧ ｈ　１５５７またはＩ’１ＣＧＮ１５７Ｂ（１１ｃＢｒｉｄｅおよびＳｕ＋ｓｍ ｅｒｆｅｌ　Ｌ。 前掲）に結合する。約３．３ｋｂの断片をｐｃＧＮ１５７Ｂの中に挿入するとｐ ｃＧＮ３８１６が生ずる。 去ＸヱＺｌｊエステラーゼ ｐＣＧＮ３８２２をＢａ潮旧およびＫｐｎｌで部分的に消化し、引き続いて生ず る１、５ｋｂの断片をゲル精製することによって、全長のチオエステラーゼｃＤ ＮＡのほぼ１．５ｋｂの断片を得る。Ｒａｍ）ｌ　Ｉ部位はｃＤＮ／ｌ配列のヌ クレオチド７４に存在し、にｐｎ１部位はｃＤＮ＾インサートに対して３′に位 置するベクターのポリリンカーの中に存在する。こうして、この断片は位ｉＺ　 １４５−１４７に＾ＴＧコドンを含む全体のチオエステラーゼコーディング領域 、および前述したようにポリアデニル化シグナルを含有する全体のｃＤＮＡ３’ ｓｆｆ域を含有する。 ｐＣＧＮ３２２３　（前述した）を旧ｎｄｌｌ＋およびＢｇｌｌｌで消化し、引 き続いて１．７ｋｂの断片をゲル精製することによって、ナピン５′非コーディ ング領域のほぼ１．７ｋｂの断片を得る。 ナピンプロモーター（旧ｎｄｌｌｌ／Ｂａ１ｌ＋）およびチオエステラーゼコー ディング領域（Ｒａｍ旧／Ｋｐｎｌ）を、ｌ１ｉｎｄｌｌｌおよびＫｐｎ　ｌで 消化したハイナリーヘクター、例えば、ｐｃＧＮ＋５５７またはｐｃＧＮ１５７ Ｂの中への３つの断片を結合することによゲて接合する。この領域において、Ｂ ａｍＨＩおよびＢｇｌ＋１部位の相補的オーハーハンギング末端は、チオエステ ラーゼ断片の５′末端へのナピン断片の３′末端の融合を可能とする。ρＣＧＮ Ｉ５７８．　ｐＣＧＮ３８２４の中への結合から植物の形質転換のために生ずる プラスミドは、ナピンプロモーターの調節コンドロールドに発現のために位置す るチオエステラーゼｃＤＮへを含有する。チオエステラーゼ断片はポリアデニル 化シグナルを含有するので、追加の植物３′非コーデイング領域は得られない。 ナピン　チオエステ乞−ｆ　ｌｔ　”　７ナビンプロモーターおよび３′転写停 止領域の転写および翻訳のコントロール下にチオエステラーゼの発現の構成体を 、次のようにしてつくる。第６Ａ図（配列識別番号：４１）に示すゲソケイジュ ・チオエステラーゼ配列の位置＋４０　（ＡＴＧ開始コドンがら５塩基上流）に おけるチミジンヌクレオチドにすぐに接して５′にＢａｍ８１部位を挿入するＰ ＣＲ技術により、ｐＣＧＮ３８２２　（前述した）を操作して、ｐＣＧＮ３８２ ６を生成する。全体のチオエステラーゼをコードする領域を含有するほぼ１２２ ５ｂｐの断片をＲａｍ旧　−１’ｓｔｌ断片としてｐＣＧＮ３８２６がら形成し 、そして［１ｇ１ｌｌ　／Ｐｓｔｌ消化したｐＣＧＮ３２２３、前述のナピン発 現カセット、の中に結合してｐｃＧ？＋３８２７を生成する。ｐＣＧＮ３８２８ をＫｐｎｌおよびＢａ＋ｍ旧で部分的に消化し、そしてナビン５′／チオエステ ラーゼ／ナビン３′構成体を含有するほぼ３．２ｋｂの断片をにｐｎ　ｌ　／　 Ｂａｍｔｌ　Ｉ消化ｐｃＧＮＩ５７８　（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆ ｅｌｔ、前掲）の中にクローニングすることによって、植物の形質転換のために ベクターであるｐＣＧＮ３８２８を構成する。 構成体ｐＣＧＮ３８３７を調製し、この構成体はｐＣＧＮ３８２Ｂに類伯するが 、ベニバナ・チオエステラーゼのトランシットペプチドをエンコードする配列と 置換したゲノケイジュ・トランシットペプチド領域およびクローン２−１からの 成熟ベニバナ・チオエステラーゼの６アミノ酸を有する。この構成体のためのベ ニバナ断片はＰＣＲ技術を使用して便利な制限消化部位を得るように調製するこ とができる。ナビン５′および３′調節領域を有する他の構成体を調製し、これ はゲノケイジュ・チオエステラーゼのトランシットペプチドおよび成熟ゲノケイ ジュ・チオエステラーゼのタンパク質の最初の１１アミノ酸をエンコードする領 域をベニバナ・チオエステラーゼのトランシットペプチドおよび成熟ベニバナ・ チオエステラーゼのタンパク質の最初の３１アミノ酸をエンコードする配列と置 換する。 適当な癌腫菌（ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ）株をバイナリ−構成体で形質転換 し、そして形質転換されたラウレート生産植物を発生させるために使用する。種 子を集め、そして前述したように分析して、色素体の輸送の効率および油の組成 を決定する。 Ｂ９問題のＤＮＡ配列を植物宿主のゲノムの中に挿入して表現型を変化させる配 列の転写または転写および翻訳を得るために、種々の方法が開発されてきている 。 ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　）の形ｌ（遺ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃ ａ　ｎａｐｕｓ）　ｃｖ、　Ｗｅｓｔａｒを９５％のエタノールの中で２分間ソ ーキングし、１滴のツイーン２０を含有する次亜塩素酸ナトリウムの１．０％の 溶液の中で４５分間表面を滅菌し、そして無菌の芸留水の中で３回すすく。次い で、】／１０の濃度のムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地（Ｇｉｂｃ ｏ；グランドアイランド、二二一ヨーク）を有し、ピリドキン（５０ｇｇ／ｆ） 、ニコチン酸（５０ｇｇ／Ｐ）、グ’Ｊ　シフ（２００μｇ　／　ｌ　）および ０．６％ノフィタガール（Ｐｈｙｔａｇａｒ）　（Ｇｉｂｃｏ）を補充したマゼ ンタ（Ｍａｇｅｎ　Ｌａ　）ボックスｐＨ５，８の中に種子をプレートする０種 子を２２℃においてパーシバル（１”ｅｒｃｉｖａｌ）チャンバーの中で１６時 間の冷蛍光およびほぼ６５μのティンシュタインｍ２フ秒（μＥ１’Ｓ−’）の 強度の赤色光を使用する光期間で発芽させる。 胚軸を発芽後５〜７日の実生から切取り、はぼ４ｍｍの長さの片に切り、そして フィーダープレート（Ｈｏｒｓｃｈら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２７　： １２２９−１２３１　）上にプレートする。使用の１日前に、約３０ｍ　ｌのＭ Ｓ塩塩１（Ｃａｒｏｌｉｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、バーリントン、ノースカ ロライナ州）、１００ｍｇ　／　ｌ　（７）イノシト−／Ｌ／、１．３ｍｇ／　 ｌ　ノチアミン−ＨＣｌ　、　２００ｍｇ（７）ＫＨ，ＰＯ４オよび３　％　０ ）　スフｏ　−ス、２　、　４−　Ｄ　（１，０＋ｍｇ／　１．　）、０．６％ のＷ　／　Ｖのフィタガールを含有しかつオートクレーブ処理前にｐｌ＋５．８ に調節した（ＭＳＯ／Ｉ１０培地）ペトリ皿（１００Ｘ２５ｍｍ）上に１．０１ のタバコ懸濁培養物をプレートすることによって、フィーダープレートを調製す る。無菌の濾紙のディスク（賀ｈａｔｍａｎ　３１１Ｔ１）を使用前にフィーダ 一層の上部上に配置する。２　、　４−　Ｄ　（０，２ｍｇ／　ｌ　）カイネチ ン（Ｋｉｎｅｔｉｎ）　（０，１ｍｇ／　Ｐ、）を有するフィーダープレートに ついて記載したように、毎週１０ｍ１の培養物をｌｏＯ＋ｍｌの新鮮なＭＳ培地 の中に移すことによって、タバコ懸濁培養物を継代培養する。フィーダー細胞を 使用しない実験において、胚軸外植体を切断し、そしてＭＳＯ／Ｉ１０培地上の 濾紙のディスク上に配置する。すべての胚軸外植体を、強度３０μＥＴｌ−”Ｓ −’〜６５μＥｍ−”Ｓ弓の連続的光の中で２２°Ｃにおいてフィーダープレー ト上で２４時間前インキュベーションする。 バイナリ−プラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、 　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｅｌｆ＾ｌＯ１株の単一のコロニーを５ｍｌの’ ＡＧ／Ｌブロスに移し、そして３０゛Ｃにおいて一夜成長させる。胚軸外植体を 細菌をｌＸｌ０”細菌／＋ｗｌに希釈した７〜１２１のＭＧ／Ｌプロスの中に浸 漬し、そして１０〜２５分後、フィーダープレート上に配置する。■リットル当 たりプロ又は５ｇのマンニトール、１ｇのし一グルタミン酸または１．１５　ｇ のグルタミン酸ナトリウム、０．２５ｇのＫＨｔｒ’Ｏａ、　０．ｌＯｇのＮａ Ｃ１，０，１０ｇのＭｇ５Ｏ＜　・７１１２０．１ｍｇのビオチン、５ｇのトリ プトン、および５．５ｇの酵母エキスを含有し、そしてブロスをｐＨ７，０に調 節する。癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と４８時間共インキュベーショ ンした後、胚軸外植体を濾過滅菌したカルベニシリン（５００ｍｇ／　Ｑ、オー トクレーブ処理後に添加した）および硫酸カナマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ｗ　：インジアナポリス、インジアナ州）を２５ｍｇ／ｊ！ の濃度で含有するＢ５　０／Ｉ１０力ルス誘発培地に移す。 ６５μＥ＋ｗ−”Ｓ−’の連続的光において３〜７日間培養した後、カルスの組 織は切断した表面上に見ることができ、そして胚軸外植体を苗条誘発培地Ｂ５Ｂ Ｚ（Ｂ５塩類およびビタミン類、３−ｇ／ｌのベンジルアミノプリン、ＩＩＩＩ ｇ／ＩＶ、のゼアチン、１％のスクロース、０．６％のフィタガールを補充しそ してｐ）１５．８に調節した）に移す。この培地は、また、カルへニジリン（５ ００ｍｇ／　ｌ　）および硫酸カナマイシン（２５ｍｇ／　ｌ　）を含有する。 胚軸外植体を新鮮な苗条誘発培地上に２週毎に継代培養する。 １〜３か月後、苗条は胚軸カルスから発生する。少なくとも１ｃ＋＋の高さの緑 色苗条をカルスから切取り、そしてＢ５塩類およびビタミン類、１％のスクロー ス、カルへニジリン（３００ｕｇ／　ｌ　）　、硫酸カナマイシンＣ３０ｍｇ／ 　ｌ　）および０．６％ｗ　／　ｖのフイタガールを含有する培地上に配置する 。２〜４月後、緑色のままである苗条を基部で切断し、そして根誘発培地（Ｂ５ 塩類およびビタミン類、１％のスクロース、５０ＩＩｇ／Ｉ！、の硫酸カナマイ シンおよび０．６％のフィクガール）を含有するマゼンタボックスに移す。緑色 の根が形成した苗条をチオエステラーゼ活性について試験する。 アービドプシス　Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）のノー。 トランスジエニソクアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａ ｌｉａｎａ）は、Ｖａｌｖｅｒｋｅｎｓら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　（１９８Ｂ）　８５　：５５３６−５５４０　）により記載され ているように、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形質転換により得る ことができる。構成体を癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞、例えばＥ ｌ（Ａ１０１株（Ｈｏｏｄら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８６）　１６Ｂ 　：　１２９１−１３０１）細胞の中に、Ｈｏ１ｓｔｅｒら（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ 。 Ｇｅｎｅｔ、（１９７８）　１６３　：　１８１−１８７）により記載されてい るように形質転換することができる。 ±２ま２で５りりし霞転遺。 問題のＤＮ＾配列を、少なくともプロモーター領域、問題の遺伝子および終結領 域からなる発現カ七ノドとして、欧州特許出願公開第３３２．８５５号および同 時係属米国特許出願第０７／２２５．３３２号、１９８８年７月２７日提出に記 載されているように、粒子衝撃を介して植物ゲノムの中に導入することができる 。 簡単に述べると、０．５μｍ〜３μｍの範囲の大きさのタングステンまたは金の 粒子を発現カ七ノドのＤＮＡで被覆する。このＤＮ＾は水性混合物四酸化オスミ ウム乾燥ＤＮＡ　７粒子の沈澱の形態であることができる。 衝撃のための標的として使用する組織を子葉外植体、苗条分裂組織、未熟の小葉 または朽からのものであることができる。 ＆Ｉｉ織とＤＮＡ被覆粒子との衝撃はバイオリスチフス（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ ”　）粒子ガン（Ｄｕｐｏｎｔ　；ウィルミントン、プラウエア州）を使用して 実施される。粒子をバレルの口からＩｃｍ−１４ｃｍの範囲の可変距離でバレル の中に入れる。衝撃ずべき組織をストツピングプレートの下に配置する：試験を ＆ｌ’ｌ織について２０ｃｍまでの距離で実施する。発射の瞬間に、＆ｒｌ＃ａ をナイＵンネノトまたはナイし１ソネツトと１０μｍ〜３００μｍのメツシュと の組み合わせで保護する。 衝撃後、植物を八ｔｒｅｙａら（１’１ａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　（１９８４）　３４　：３７９−３８３）の方法に従い再生することができ る。簡単に述べると、胚軸ｖｉｉ織または子葉のセグメントをＭＳ培地（Ｍｕｒ ａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ。 Ｐｈｙｓｉｏ、　Ｐｌａｎｔ、　（１９６２）　１５　：　４７３）　（ＭＳ＋ ２．０ｍｇ　／　１の６−ヘンシルアデニン（ＢＡ）子葉のセグメントのために ）上に配置し、そして暗所で２５土２°Ｃにおいて１週間インキュベーションし 、引き続いて連続的冷白色蛍光（６，８Ｗ／ｍ”　）に移す。培養の第１０日に 、小植物を無菌の土を含有するポットに移し、日陰に３〜５日間保持し、そして 最後に温室に移す。 推定のトランスジェニック苗条は根を形成する。植物ゲノムの中への外因性ＤＮ Ａの組み込みは、当業者に知られている種々の方法によって実施することができ る。 Ｃ，チオエステラーゼ構成体で形質転換されたトランスジェニック植物をチオエ ステラーゼ活性および脂肪酸およびトリグリセリドの組成について分析する。 ｐｃＧＮ３８１６およびｐｃＧＮ３８２１で形質転換された自家トランスジエニ ソクアラビドプシス・タリアナ（Ａ、Ｌｈａｌｉａｎａ）植物からのアラビドプ シス（Ａｒａｂｔｄｏｐｓｉｓ）種子を、１２：０および１４：０アシル−＾ｃ ｐチオエステラーゼ活性について分析する。発育する種子をチオエステラーゼ測 定緩衝液（実施例１）で抽出し、そして可溶性分画を測定する。トランスジェニ ック種子は対照を越えた１２：０チオエステラーゼ活性の有意の増加を示す。ま た、１４　：　０−ＡＣＰ加水分解は増加するが、より小さい規模で、形質転換 された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）からの酵素特異的データと一致す゛る。 成熱アラビドプシス・タリアナ（Ａ、　ｔｈａ目ａｎａ）種子の全体の脂肪酸分 析は、対照１物の種子において測定された０％のラウレートに比較して、前述の 構成体で形質転換された植物において５％までのラウレートを明らかにする。第 ７図が証明するように、ラウレート％はトランスジェニック種子においてラウロ イルチオエステラーゼ活性と直接的に相関関係を有する。また、トランスジェニ ック種子の中のミリステート含量は、０．１％（対照）から最高の発現体におけ る０、７％まで増加し、そしてまたミリストイルチオエステラーゼ活性と相関関 係を有する。薄層クロマトグラフィーによるトリグリセリドの分析は、全体の脂 肪酸分析により検出されたラウレートが中性の脂質分画の中に存在することを示 し、ラウレートがトリグリセリドの中に組み込まれた（エステル化された）こと を証明する。 ｐｃＧｌｌ：’１８２８で形質転換されたアラビドプシス・タリアナ（＾。 ｔｈａｌｉａｎａ）植物からの成熟種子を、実施例１６において詳述するように 、Ｂｒｏｗｓｅら（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８６）１５２　：　 １４１　１４５）に本質的に記載されているように全体の脂肪酸について分析す る。これらの研究は、その種子がほぼ１７重量％（２３，５モル％）までのラウ レートを含有する、少なくとも１つの植物３８２８−１３を明らかにする。この 形質転換された植物からの成熟種子を膵臓リパーゼ消化のプロトコル（Ｂｒｏｃ ｋｅｒｈｏｆｆ　（１９７５）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３５　：　３ １５−３２５）にかけて、５ｎ−２およびｓｎｌ＋３（＆［ｌみ合わされた）位 置のアシル組成を区別する。これらの分析からの予備的結果は次の通りである。 ５ｎ−１＋２＋３（メタノールシス）　１７．８％Ｃｌ２ｓｎ−１（リパーゼ消 化）　２゜９％Ｃｌ２ｓｎ−１＋３（上から計算した）　２５．３％Ｃｌ２ｓｎ ｌ＋３（リパーゼ消化）　２１．９％Ｃ１２これらの予備的結果が示唆するよう に、中位鎖脂肪酸はトリグリセリド分子の５ｎ−１および／または５ｎ−３位置 に効率よく組み込まれる。 合計２６のｐｃＧＮ３８２Ｂ形質転換アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）植物を１２　：　０−ＡＣＰチオエステラーゼ活性について試験し、７つが陽 性と試験された。ラウレートの発現について陰性の「形質転換体」の存在は、ア ラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の形質転換法が根を形成する段階にお ける選択を含まないので、驚くべきことではない、こうして、ラウレート陰性植 物は形質転換されない［エスケープ（ｅｓｃａｐｅｓ）　Ｊならびにゲノケイジ ュ・チオエステラーゼ遺伝子を発現しない形質転換された植物を包含することが 期待されるであろう。 これらの７つの陽性の植物からの成熟種子（１００個の種子のプール）の分析は 、陽性の植物が対照の中には存在しない有意な量の１２：０を含有することを示 す。１２：０の量は２．１〜２３．５モル％の範囲であり、そしてチオエステラ ーゼ活性とほぼ相関関係を有する。ｌｌ子の全体の脂肪酸の含量は典型的にアラ ビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において見られる範囲内であり、１２： ０の堆積が油の収量に悪影響を及ぼさないごとを示唆する。種子の発育または形 態に明らかな作用は観察されない、脂質のクラスの分析（ＴＬＣ）において、ト リグリセリド分画が全体の抽出可能な脂肪酸と同一比率のラウレートを含有する こと、すなわち、これらのレベルにおいて、１２：０がトリグリセリドの中に容 易に組み込まれることが証明される。 少量の１４二〇はまたトランスジエニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ ｉｓ）種子の中に蓄積する。種子の中の１２：　Ｏ／１４：　０の比（６〜８） は、１２　：　０−ＡＣＰおよび１４　：　０−ＡＣＰについてのｉｎνｉ　ｔ ｒｏチオエステラーゼ活性の比に類似する。１２：Ｏおよび１４：０生産物の間 の一定に近い比は、多分、１２：０−＾ＣＰおよび１４　：　０−＾ＣＰに向か うゲノケイジトチオエステラーゼの特異性を反映し、そしてその酵素がトランス ジ−ニック種子の中で１２　：　０−ＡＣＰおよび＋４　：　０−ＡＣＰの同様 な大きさのプールへの直接の作用によりｉｎν’ＩＶＯで機能することを示唆す る。ゲノケインユ・チオエステラーゼは１０　：　０−ＡＣＰに　ｉｎ　ｖｉｖ ｏで有意の作用をもたないように思われ、そしてほんの微量の１０二〇がｌ・ラ ンスジェニック種子において検出されるだけである。 追加の研究を実施して、中位鎖が「天然の」アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓ）の脂肪酸のすべてを、あるいはほんの一部分を犠牲にして合成されるか どうかを決定した。対照アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物からの １００個の成熟種子の平均の脂肪酸組成を、ｌ・ランスジェニック種子３８２８ １３からのそれと比較した。これらのｔｆｆ’Ｊの結果を第１４図に示す。２つ の植物の１２：０および１４：０の含量の差は明らかであるが、中位鎮生産の結 果、他の脂肪酸の含量の差は同定がいっそう困難であるや全体の脂肪酸含量はア ラビドプンス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の間でかなり変動し、絶対的脂肪 酸レベルの比較を非常に困難とする。これらの差を排除するためのデータの表示 （％）（全体の脂」力酸−１００）は、解釈をさらに困難とした。 こうしで、独特の脂肪酸の組成を典型的な植物間の変動と区別する１つの方法を 次のようにして案出した。２６のＴ１アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）植物からの成熟（Ｔ２）種子の全体の脂肪酸含量を増加する順序で配置し、そ して第１５Ａ図に示すように値のなめらかな広がりを生成した。６つの最高のラ ウレート生産物を、対応する重量％の１２：０のデータとともに、矢印で示す。 １２：０の生産のレベルと全体の脂肪酸含量の間に関係が存在しないように思わ れる。 第１５Ｂ図において、データは同一の方法であるが、３つの脂肪酸について個々 に序列して示されている。１８：２および１６：０についてのデータはまたなめ らかな線を形成したが、ただしラウレートが蓄積する陽性の事象を除外する。そ れらの場合において、１８：２および１６：０の含量は全体の傾向より顕著に低 く、１２：０がこれらの種子において１８：２および１６：０を犠牲にして生産 されたことを示す。 これはまたｔｓ：　１．２０：　１および２０：２について真実である。１２− 〇の生産により比較的影響を受けない唯一の主要な脂肪酸構成成分は、第１５Ｂ 図に示すように、１８：３であったが、低い１８：３の対照は、例えば、植物１ ０において見いだすことができる。 ｐｃＧＮ３８１６で形質転換されたブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａ ｐｕｓ）からの種子を、また、前述したように全体の脂肪酸について分析する。 Ｔ２形質転換された植物からの単一の分離する種子の分析は、形質転換されない 対照植物からの種子における０％に比較して、０〜１４．５％の範囲のＣ１６： Ｏのレベルを明らかにする。Ｃ１６：Ｏのレベルは、第７図に証明されているよ うに、対応する未熟の種子におけるＣ１６：Ｏ−へＣＰチオエステラーゼ活性と 相関関係を有する。 さらに、Ｃ１４：Ｏはまたこれらの種子の中にＣ１６：０のレベルと相関関係を 有するレベルで検出されるが、Ｃ１４：０のレベルはより低い。 ｐＣＧＮ３８２４　（ナビン／チオエステラーゼ）およびｐＣＧＮ３８２８　（ ナピン／チオエステラーゼ／ナビン）を含有する形質転換されたブラシカ・ナプ ス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）植物を分析して、種子の脂肪酸組成を決定 した。ｐＣＧＮ３８２４で形質転換された３４の植物およびｐｃＧ８３８２８で 形質転換された３１の植物からプールした種子を分析して（２５〜５０個の種子 ／測定）、種子の中のラウレートのレベルを決定する。所定％のラウレートを有 するトランスジェニック事象の数として表した、これらの分析の結果を、第１１ Ａ図及び第１１Ｂ図に表す。ρＣＧ）１３８２４−形質転換体は、その種子が１ ７モル％のラウレートを含有した単一の植物を除外して、０〜１１モル％の範囲 のラウレート含量を有した。 ｐＣＧＮ３８２８ｔｌ成体の植物は！−１７モル％のラウレート含量を有し、こ の範囲外の２つの代表的なものは３７モル％のラウレート（植物３８２８＝２３ ）および２７モル％のラウレート（植物３８２８−３５　）を有した。さらに、 これらの植物の種子の油は、また、はぼ１６％のラウレートレベルに相当する、 より少ない量の１４：ｏ脂肪酸を有する。微量のレベルのＣＩＯ：０が、また、 典型的には１％のラウレートレベルにおいて、観察されるゆ追加のＰＣＧＮ３８ ２８−形質転換体をまた分析して、なおいっそう高いラウレート含量を有する植 物を同定する。 半分の種子の分析をまた実施して、形質転換された植物からの成熟種子の中のラ ウレートレベルを決定する。半分の種子の分析のために、種子をベトリ皿の中の 湿った（２〜３１の水）濾紙のディスク上に配置し、これを密閉しそして室温ま たは３０℃において２０〜４８時間暗所に放置する。発芽した種子は種子の外殻 から突起する２〜５ｓｌｌの手相を有する。微細なピンセットを使用して各実生 をその外殻から取り出し、そして外側の子葉を裂く。細く切った子葉を４＊１の バイアルの中に入れ、そして脂肪酸の分析前に１１０°Ｃの炉内で２〜１２時間 乾燥する。細く切った実生を１２バンクの容器内の鉢植えの土の中に直接植え、 霧で覆い、透明なプラスチックのふたでカバーし、２２°Ｃの成長チャンバーの 中に１５０〜２００マイクロアインシュタインｍ−’Ｓ−’の光強度において１ ６時間７８時間の光期間で入れ、そして成長させてＴ２（第２世代の形質転換体 ）植物を生産させる。 あるいは、成熟した種子の削り取った部分を使用して半分の種子の肪酸が５ｎ− ２位置に組み込まれないことを示す。しかしながら、こ分析を実施する０種子を 細く切るスコープの下に保持し、そして、胚軸を回避して、種子のほぼ３０％の 千ノブを取り出す０種子のチップをＧＣにより脂肪酸分析に使用し、そして残り の種子の部分をマイクロタイター皿中の水の中で５・−７日間発芽させ、土に移 し１．そして成長させて１２種子を生産させる。 １４４個の測定したｐｃＧ１１３８２８−３５の半分の種子のラウレート含量は ４へ４２モル％の範囲であるや　２１４個の測定したｐＣＧＮ３８２８−２３の 半分の種子のラウレート含量は１２〜・５０モル％の範囲である。ｐＣＧＮ３８ ２８−２３またはｐＣＧＮ３８２８−３５植物から分析した種子はゼロのラウレ ートをもたず、これらの形質転換体がそれらのゲ、ツムの中に３またはそれ以上 のチオエステラーゼインサートを存することを示す。さらに、それらの種子の中 に１０〜２０モル％のラウレートを有するｐＣＧ８３８２Ｂ　−形質転換体のほ ぼ６０個の半分の種子を使用する分析は、これらの植物がゲノケイジュ・チオエ ステラーゼ遺伝子の１・−２つの挿入を有することを示す。 トランスジェニンクブラシ力・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）種子の 最終結果を検査するために、２つのトランスジェニック植物であるρＣＧＮ３８ ２８−２３およびｐＣＧ１１３８２８−７の成熟トランスジェニック種子から抽 出した異なる脂質クラスの脂肪酸組成を検査した。リン脂質のＴＬＣ分析は、ラ ウレートのほとんど１００％がＴＡＧ分画の中に存在することを示す、、ＴＡＧ の５ｎ−２および５ｎ−１＋３位置のアシル組成の分析を、膵臓リパーゼのプロ トコル（Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ　（１９７５）、前掲）を使用して実施する。 このプロトコルを使用して理想的には、リパーゼは脂肪酸を５ｎ−１および５ｎ −３位置から切断し、そして５ｎ−２位置から切断しない。こうして、生ずる七 ノーグリセリドの中の脂肪酸は５ｎ−２位置にあるものであると推定される。こ の方法を使用するラウレート形質転換体の中のＴＡＧの初期の研究は、Ｃ１６： Ｏ脂非特異的バックグラウンドの染色を減少するために、別のウェスの方法に従 いより短い鎖の脂肪酸を有するＴＡＧを研究しようとする従来の試みＣＥｎＬｒ ｅｓｓａｇｌｅｓら（１９６４）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ Ｌａ　８４　：１４０−１４８）は、５ｎ−２位置に位置するより短い鎖の脂肪 酸をこのような消化の間に２速に加水分解されることを報告し、これはジグリセ リドおよびモノグリセリドの中の外側の位置に向かう内部のより短い鎖の脂肪酸 の自発的移動の結果であるとして著者らは報告してることが認められる。 ＰＣＧＮ３８２８を含有する形質転換された植物の追加の分析を実施して、これ らの植物におけるゲノケイジュ・チオエステラーゼの発現を特徴づける。ρＣＧ Ｎ３８２８−２３形質転換体の発育する種子の中の抽出可能なＣ１６：Ｏチオエ ステラーゼ活性を測定し、そしてそれは内因性１８；１チオエステラーゼ活性よ りかなり高いと決定された。形質転換された植物における高いゲノケイジュ・チ オエステラーゼ活性にかんがみて、ラウレートの生産を最適化する追加の因子を 研究している。 形質転換された３８２８−２３の中の処理された（　３５ｋＤ　）ゲ、ケイシュ ・チオエステラーゼの存在を、この植物からの種子の発育の時間過程のウェスタ ン分析により研究する。ゲノケイジュ・チオエステラーゼに対するモノクローナ ル抗体およびビオチン標識化第２抗体を使用して、実験を実施する。これらの研 究において、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の中の主要な種子貯蔵タンパク質は ゲノケイジュ・チオエステラーゼと同一の移動度で移動し、非特異的パックグラ ウンドの染色を引き起こすことが示される。しかしながら、ゲノケイジュＡｂと 反応するほぼ４２ｋＤの見掛けの分子量のハンドが形質転換されたラウレート生 産性植物の中に検出される。この見掛けの分子量は未処理のゲノケイジュ・チオ エステラーゼのそれと一致する。 タン検出法が研究されている。例えば、第２抗体をアルカリ性ホスファターゼに カップリングする第２抗体法はバックグラウンドの染色を減少させる。ゲッケイ ジュ・チオエステラーゼの蓄積は授粉後筒２４日に低いレベルで検出可能であり 、強いシグナルは授粉後筒３０〜４０日から種子の中に観察される。初期の結果 が示唆するように、シグナルの大部分は４２ｋＤの未処理プレプロタンパク質で あり、チオエステラーゼ抗原のわずかに１０〜２０％が３４ｋＤで移動するだけ である。 これらの研究が示唆するように、ゲノケイジュ・チオエステラーゼの異常なトラ ンシットペプチドはブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　）において最適でない色素体 のターゲツティングを生ずることがある。 上の発育時間の過程の種子試料のＲＮＡ分析において、ナビン誘導化ゲッケイジ ュ・チオエステラーゼｍＲＮＡは全体の内因性ナピンのメツセージと同一の反応 速度論で蓄積し、ピークの転写は２７〜５０日の範囲内にある。こうしてゲソケ イジュ・チオエステラーゼ活性は貯蔵油の合成の開始より約５〜７日だけ遅れ、 そしてゲッケイジュ・チオエステラーゼのより早い発現は成熟種子の中の全体の ラウレートレベルに有意の衝撃を与えることができる。上の種子試料のＡＣＰお よびステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ転写体のノザン分析において、これら の遺伝子の天然の転写体はナビンプロモーターにより生産されたゲノケイジュ・ チオエステラーゼ転写体より３〜５日だけ早く蓄積することが示される。これら のデータが示唆するように、ＡＣＰおよびステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ 遺伝子のプロモーターはゲノケイジュ・チオエステラーゼ遺伝子のより早い発現 のため有用であることがある。ブラシカ・ラバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ） のステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼのためのｃＤＮ＾およびブラシカ・ラバ ＣＢ、ｒａｐａ）　ＡＣＰのためのプロモーター頭載のクローニングは記載され た（ＫｎｕＬｚｏｎら（１９９２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　８９　：　２６２（−２６２８：Ｓｒ、ｈｅｒｅｒ　ら（１９９２）　 Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８：　５９１　５９４）。 ブラシカ・ラバ（Ｂ、　ｒａｐａ）　ＡＣＰブロモ・−ターのほぼ１．５ｋｂの 範囲からの発現のために位置する１、２ｋｂのゲノヶイジュ・チオエステラーゼ 遺伝子の断片を有ｒる構成体（ρＣＧＮ３８３６）　、およびナビン３′調節領 域のほぼ０．３ｋｂを含有する、形質転換されたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ）植物が得られた。　ｐｃｔ、Ｎ３８３６形質転換された植物からの 種子をラウレート含量について分析すると、ラウ【・−トがこれらの種子におい て検出可能なレベルに蓄積しないことが示される。しかしながら、ゲノケイジュ ・チオエステラーゼの発現のタイミングおよびターゲツティングがトランスジェ ニックブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子において最適化されるとき、少量のチ オエステラーゼは大量のラウレートをつ（ることは、ゲソヶイジュにおいて起こ るように思われるので、可能であり、そしてゲノヶイジュ・チオエステラーゼの より低いレベルの発現は十分であることがある。 １ｍ　−トランスジェニック植物 チオエステラーゼ構成体で形質転換された植物を、チオエステラーゼ活性および 脂肪酸組成およびトリグリセリド組成について分析した。 Ａ、アラビドプ４Ｌ圓旦１肋ヰ旦 ｐｃＧＮ３８１６およびｐｃＧＮ３Ｂ２１で形質転換された自殖トランスジェニ ソクアラビドプシス・タリアナ（Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ）植物からのアラビド プシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種子を、１２：Ｏおよびｔ、ｉ：ｏアシル− ＡＣＰチオエステラーゼ活性について分析する０発育する種子をチオエステラー ゼ測定緩衝液（Ｐｏｌｌａｒｄら、前掲）で抽出し、そして可溶性分画を測定す る。トランスジェニック種子は、対照を越えた、１２：ｏチオエステラーゼ活性 の有意の増加を示す。また、１４　二０−ＡＣＰの加水分解は増加するが、より 小さい規模で、形質転換された大腸菌（Ｆ、。 ｃｏｌｉ）からの酵素特異性のデータと一致する。 成熟アラビドプシス・タリアナ（Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ）種子の全体の脂肪酸 分析は、対照植物の種子において測定された０％のラウレートに比較して、前述 の構成体で形質転換された植物において５％までのラウレートを明らかにする。 第２図が証明するように、ラウレート％はトランスジェニック種子においてラウ ロイルチオエステラーゼ活性と直接的に相関関係を有する。また、トランスジェ ニック種子の中のミリステーｉ・含量は０．１％（対照）がら最高の発現体にお ける０、７％まで増加し、そしてまたミリストイルチオエステラーゼ活性と相関 関係を有する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によるトリグリセリドの分析 は、全体の脂肪酸分析により検出されたラウレートが中性の脂質分画の中に存在 することを示し、ラウレートがトリグリセリドの中に組み込まれた（エステル化 された）ことを証明する。 ｐｃＧ１１３８２８で形質転換されたアラビドプシス・タリアナ（Ａ。 ｔｈａ　ｌ　１ａｎａ　）植物からの成熟種子を、実施例２において詳述するよ うに、Ｂｒｏｗｓｅら（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、　（１９８６）　１５ ２　：　１４１−１４５）に本質的に記載されているようにＧｃにより全体の脂 肪酸について分析する。これらの研究は、その種子がほぼ１７重量％（２３，５ モル％）までのラウレートを含有する、少なくとも１つの植物３８２８−１３を 明らかにする。 この形質転換された植物からの成熟種子を膵臓リパーゼ消化のプロトコル（Ｂｒ ｏｃｋｅｒｈｏｆｆ　（１９７５）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３５：　 ３１５−３２５）にかけて、５ｎ−２および５ｎ−１＋３（＆ｌみ合わされた） 位置のアシル組成を区別する。これらの分析からの予備的結果は次の通りである ：ｓｎ　−１＋　２ト３（メタノールンス）　１７．８％Ｃｌ２ｓｎ−１（リパ ーゼ消化）２．９％Ｃｌ２ｓｎ−１＋３（上から計算した）　２５．３％Ｃｌ２ ｓｎ−１ト３（リパーゼ消化＞　２１．９％Ｃ１２これらの予備的結果が示唆す るように、中位鎖脂肪酸はトリグリセリド分子の５ｎ−１および／または５ｎ− ３位置に効率よく組み込まれる。（この技術のそれ以上の論考は下に与えられて いる。）異なる実験において、１２：０−へＣＰチオエステラーゼ活性について 試験した２６のｐＣＧＮ３８２８形質転換アラビドプシス（＾ｒａｂｉｄｏｐｓ 　ｉｓ）植物のうらで、７つが陽性と試験された。ラウレートの発現について陰 性の「形質転換体」の存在は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の形 質転換法が棋を形成する段階における選択を含まないので、驚くべきことではな い、こうして、ラウレート陰性植物は形質転換されない「エスケープ（ｅｓｃａ ｐｅｓ）　Ｊならびにゲノケイジュ・チオエステラーゼ遺伝子を発現しない形質 転換された植物を包含することが期待されるであろう。これらの７つの陽性の植 物からの成熱種子（１００個の種子のプール）の分析は、陽性の植物が対照の中 には存在しない有意な量の１２：０を含有することを示す。ｉ２：ｏの量は２． １〜２３．５モル％の範囲であり、そしてチオエステラーゼ活性とほぼ相関関係 を有する。種子の全体の脂肪酸の含量は典型的にアラビドプンス（Ａｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ）において見られる範囲内であり、１２：ｏの堆積が油の収量に悪影 響を及ぼさないことを示唆する。種子の発育または形態に明らかな作用は観察さ れない。脂質のクラスの分析（且Ｃ）において、トリグリセリド分画が全体の抽 出可能な脂肪酸と同一比率のラウレートを含有すること、すなわち、これらのレ ベルにおいて、１２：Ｏがトリグリセリドの中に容易に組み込まれることが証明 される。 少量の１４二〇はまたトランスジェニソクアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ ｉｓ）種子の中に蓄積する０種子の中の１２：Ｏ／１４：Ｏの比は、１２：Ｏ− ＾ｃｐおよび１４：０−＾ｃｐについてのｉｎ　ｖｉｔｒｏチオエステラーゼ活 性の比に［１する。１２：０および１４：０生産物の間の一定に近い比は、多分 、１２　：　０−ＡＣＰおよび１４：０−＾ｃｐに向かうゲノケイジュ・チオエ ステラーゼの特異性を反映し、そしてその酵素がトランスジェニック種子の中で １２　：　０−ＡＣＰおよび１４　：　０−ＡＣＰの同様な大きさのプールへの 直接の作用によりｉｎ　ｖｉｖｏで機能することを示唆する。ゲッケイジュ・チ オエステラーゼは１０　：　０−ＡＣＰにｉｎ　ｖｉｖｏで有意の作用をもたな いように思われ、そしてほんの微量の１０：０がトランスジェニック種子におい て検出されるだけである。 追加の研究を実施して、中位鎖が「天然の」アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓ）の脂肪酸のすべてを、あるいはほんの一部分を犠牲にして合成されるか どうかを決定した。対照アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物からの １００個の成熟種子の平均の脂肪酸組成を、トランスジェニック植物３８２Ｂ− １３からのそれと比較した。これらの標準の結果を第９図に示す。２つの植物の １２：Ｏおよび１４：０の含量の差は明らかであるが、中位鎖生産の結果、他の 脂肪酸の含量の差は同定がいっそう困難である。全体の脂肪酸含量はアラビドプ シス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の間でかなり変動し、絶対的脂肪酸レベル の比較を非常に困難とする。これらの差を排除するためのデータの表示（％）（ 全体の脂肪酸−１００）は、解釈をさらに困難とした。 こうして、独特の脂肪酸の組成を典型的な植物間の変動と区別する１つの方法を 次のようにしで案出した。２６のＴ１アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）植物からの成熟（Ｔ２）種子の全体の脂肪酸含量を増加する順序で配置し、そ して第１０Ａ図に示すように値のなめらかな広がりを生成した。６つの最高のラ ウレート生産物を、対応する重量％の１２：０のデータとともに、矢印で示す、 １２：０の生産のレベルと全体の脂肪酸含量の間に関係が存在しないように思わ れる。 第１０Ｂ図において、データは同一の方法であるが、３つの脂肪酸について個々 に序列して示されている。１８：２および１６：０についてのデータはまたなめ らかな線を形成したが、ただしラウレー１〜が蓄積する陽性の事象を除外する。 それらの場合において、１８；２および１６：０の含量は全体の傾向より顕著に 低く、１２：０がこれらの種子において１８：２および１６：０を犠牲にして生 産されたことを示す。 これはまたｉｅ：　１，２０：　１および２０：２に・ついて真実である。１２ ；０の生産により比較的影響を受けない唯一の主要な脂肪酸構成成分は、第１０ ８図に示すように、１日：３であったが、低い１８：３の対照は、例えば、植物 ＩＯにおいて見いだすことができる。 Ｂ、ブーシカ　Ｂｒａｓｓｉｃａ ｐｃＧＮ３８１６で形質転換されたブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａ ｐｕｓ）からの種子を、また、前述したように全体の脂肪酸についてＧＣにより 分析する。形質転換された植物（ＴＩ植物）からの単一の分離する種子（７２種 子）の分析は、形質転換されない対照植物からの種子における０％に比較して、 ０〜１４．５％の範囲のＣ１６：Ｏのレベルを明らかにする。Ｃ１６：Ｏのレベ ルは、第７図に証明されているように、対応する未熟の種子におけるＣ１６：Ｏ −＾ＣＰチオエステラーゼ活性と相関関係を有する。さらに、Ｃ１４：Ｏはまた これらの種子の中にＣ１６：Ｏのレベルと相関関係を有するレベルで検出される が、Ｃ１４：０のレベルはより低い。 ラウレートを含有するＴＡＧの分析に使用したＧＣ温度のプログラムに対して小 さい変更を行うことができる。追加の有用な温度サイクルは次の通りである；１ ６０°Ｃで３分間、次いで５″／分で２４０″Ｃの温度への温度の傾斜、２４０ ”Ｃの温度を６分間保持する；これは２６分の合８１の実施時間を生ずる。 ｐＣＧＮ３８２４　（ナビン／チオエステラーゼ）および１ｌｃＧＮ３８２Ｂ　 （ナピン／チオエステラーゼ／ナピン）を含有する形質転換されたブラシカ・ナ ブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）植物を分析して、種子の脂肪酸組成を決 定した。　ｐＣＧ８３８２４で形質転換された３４の植物およびｐＣＧＮ３８２ ８で形質転換された３１の植物からプールした種子を分析して（２５〜５０個の 種子／測定）、種子の中のラウレートのしノベルを決定する。所定％のラウレー トを有するトランスジェニック事象の数として表した、これらの分析の結果を、 第１１図に表す、　ｐｃＧ＋１３８２４−形質転換体は、その種子が１７モル％ のラウレートを含有した単一の植物を除外して、０〜１１モル％の範囲のラウレ ート含量を有した。　ｐＣＧＮ３８２Ｂ構成体の植物は１〜１７モル％のラウレ ート含量を有し、この範囲外の２つの代表的なものは３７モル％のラウレート（ 植物３８２Ｂ　−２３）および２７モル％のラウレート（植物３８２８−３５　 ）を有した。ラウレートを含有することに加えて、これらの植物の種子の油は、 また、はぼ１６％のラウレートレベルに相当する、より少ない量の１４：０脂肪 酸を有する。 半分の種子の分析をまた実施して、形質転換された植物からの成熟種子の中のラ ウレートレベルを決定する。半分の種子の分析のために、種子をペトリ皿の中の 湿った（２〜３ｍｌの水）濾紙のディスク上に配置し、これを密閉しそして室温 または３０“Ｃにおいて２０〜４８時間暗所に放置する０発芽した種子は種子の 外殻から突起する２〜５Ｈの手相を有する。微細なビンセットを使用して各実生 をその外殻から取り出し、そして外側の子葉を裂く、細く切った子葉を４−１の バイアルの中に入れ、そして脂肪酸の分析前に１１０°Ｃの炉内で２〜１２時間 乾燥する。細く切った実生を１２パツクの容器内の鉢植えの土の中に直接植え、 霧で覆い、透明なプラスチックのふたでカバーし、２２°Ｃの成長チャンバーの 中に１５０〜２００マイクロアインシュタインｍ−”Ｓ−’の光強度において１ ６時間／８時間の死期間で入れ、そして成長させてＴ２（第２世代の形質転換体 ）植物を生産させる。 あるいは、成熟した種子の削り取った部分を使用して半分の種子の分析を実施す る。種子を細く切るスコープの下に保持し、そして、胚軸を回避して、種子のほ ぼ３０％のチップを取り出す０種子のチップをＧＣにより脂肪酸分析に使用し、 そして残りの種子の部分をマイクロタイター皿中の水の中で５〜７日間発芽させ 、土に移し、そして成長させてＴ２植物を生産させる。１５の代表的なｐＣＧＮ ３８２８−２３の半分の種子の全体の脂肪酸のモル％として脂肪酸組成を与える チャートを表４Ａに示す、形質転換しない再生された植物から集めた単一の種子 からの同様なデータを表４Ｂに示す、データは前述したようにＧＣの半分の種子 の分析からのものである。 １４４個の測定したｐＣＧ８３８２Ｂ　−３５の半分の種子（ＴＩ植物から得た １２種子）のラウレート含量は４〜４２モル％の範囲である６２１４個の測定し たｐＣＧＮ３８２８−２３の半分の種子のラウレート含量は１２〜５０モル％の 範囲である。　ｐＣＧＮ３８２８−２３またはｐＣＧＮ３８２Ｂ　−３５植物か ら分析した種子はゼロのラウレートをもたず、これらの形質転換体がそれらのゲ ノムの中に３またはそれ以上のチオエステラーゼインサートを有することを示す 。１２世代から生産された種子の分析はさらにこの結果を確証するであろう。さ らに、それらの種子の中に１０〜２０モル％のラウレートを有するｒ＋ＣＧＮ３ ８２８−形質転換体のほぼ６０個の半分の種子を使用する分析は、これらの植物 がゲノケイジ上・チオエステラーゼ遺伝子の１〜２つの挿入を有することを示す 。 トランスジェニックブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）種子の 最終結果を検査するために、２つのトランスジェニック植物であるｐｃＧＮ３８ ２８−２３およびｐＣＧＮ３８２Ｂ−７の成熟トランスジェニック種子から抽出 した異なる脂質クラスの脂肪酸組成を検査した。リン脂質のＴＬＣ分析は、ラウ レートのほとんど１００％がトリアジルグリセリド（ＴＡＧ　）分画の中に存在 することを示す。ＴＡＧの５ｎ−２および５ｎ−１＋３位置のア／ル組成の分析 を、膵臓リパーゼのプロトコル（Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｒｆ　（１９７５）、前掲 ）を使用して実施する。このプロトコルを使用して理想的には、リパーゼは脂肪 酸を５ｎ−１および５ｎ−３位置から切断し、そして５ｎ−２位置から切断しな い。こうして、生ずる千ノーグリセリドの中の脂肪酸は５ｎ−２位置にあるもの であると推定される。この方法を使用するラウレート形質転換体の中のＴＡＧの 初期の研究は、Ｃ１６：０脂肪酸が５ｎ−２位置に組み込まれないことを示す。 しかしながら、この方法に従いより短い鎖の脂肪酸を有するＴＡＧを研究しよう とする従来の試み（ＥｎＬｒｅｓｓａｇｌｅｓら（１９６４）Ｂｉｏｃｈｉｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　８４　：　１４０　１４８）は、５ｎ−２位置に 位置するより短い鎖の脂肪酸をこのような消化の間に急速に加水分解されること を報告し、これはジグリセリドおよびモノグリセリドの中の外側の位置に向かう 内部のより短い鎖の脂肪酸の自発的移動の結果であるとして著者らは報告しいる ことが認められる。 ｐＣＧＮ３８２８構成体を含む形質転換された植物の付加的な分析を、これらの 植物内でのゲノゲイノトチオエステラーゼの発現をさらに特徴づけするべ〈実施 する。ｐＣＧＮ３８２８−２３形質転換体の種子を発達させる上での抽出可能な Ｃ１２：Ｏチオエステラーゼの活性が測定され、内因性１８１千オニステラーゼ 活性よりもかなり高いものであることが見極められる。遺伝子導入植物における 高いゲノケイジュ・チオエステラーゼ活性を７Ｓ虜して、ラウリン酸塩の産生の 最適化のため付加的な因子が調査されつつある。 形質転換を受けた３８２８−２３植物中の処理された（３４ｋｏ）ゲノケイジヱ ・チオエステラーゼの存在は、この植物からの種子の発達過程のウェスタン分番 斤により１周査される。ゲ、ケイシュ・チオエステーゼーゼに対するポリクロー ナル抗体及びビオチンで標識付けされた第２の抗体を用いて実験が実施される。 これらの研究は、アブラナ内の主要な種子貯蔵タンパク質がゲノケイジュ　チオ エステラーゼと同し易動度で移動し、非特異的ハックグラウンド染色をひき起こ すことを示している。しかしながら、形質転換を受けたラウリン酸塩産土植物内 では、月桂樹抗体と反応する約４２ｋＤの見かけの分子量のハンドが検出される 。この見かけの分子量は未処理のゲソケイジュ・チオエステラーゼのものと一致 している。 非特異的ハックグラウンド染色を低減するため、代替的なウェスタン検出方法が 研究されつつある。例えば、第２の抗体がアルカリ性ホスファターゼに結合され ている第２の抗体方法は、結果としてハックグラウンド染色を低酸させる。ゲノ ケイジュ・チオエステラーゼの蓄積は、受む〕後２４０目で低レベルで検出でき 、受粉後３０口目〜４０日目で種子内に強いシグナルが観察される。最初の結果 は、大部分のシグナルが４２ｋＤの未処理プレタンパク質であり、チオエステラ ーゼ抗体のうられずか１０〜２０％だけが３４ｋＤで移動していることを示唆し ている。これらの研究は、ゲノケイジュ・チオエステラーゼの尋常でないトラン ジットペプチドがアブラナ内の最適でないプラスチド（有色体）ターゲティング という結果をもたらしうるということを示唆している。 上述の発達過程の種子試料のｌ？ＮＡ分析は、２７〜５０日の範囲内でのピーク 転写を伴ってナビン駆動のゲノケイジュ・チオエステラーゼｍＲＮＡが完全内因 性ナピンメノセージと同じ動態で蓄積することを示している。従って、ゲノケイ ジュ・チオエステラーゼ活性は、約５〜７日だけ貯蔵油合成の開始より遅れ、ゲ ノケイジュ・チオエステラーゼのより早い発現が成熟種子内の合計ラウリン酸塩 レベルに対し重大な影響を与えることができる。上述の種子試料内の八ＣＰ及び ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ転写物のノーザン分析は、これらの遺伝子 の未変性転写物がナピンプロモータにより産生された月桂樹チオエステラーゼ転 写物よりも３〜５日早く蓄積することを示している。これらのデータは、八ＣＰ 及びステアロイル−へＣＰデサチュラーゼ遺伝子プロモータがゲソケイジュ・チ オエステラーゼ遺伝子のより早い発現にとって有用でありうることを示唆してい る。 Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａステナロイＪレーＡＣＰデサチュラーゼのためのｃ ＤＮＡ及びＢ、ｒａｐａ　ＡＣＰのためのプロモータ領域のクローニングについ て記述されてきた（Ｘｒｕｔｚｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９２）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８９　：２６２４　２６２８　；　５ｃｈｅ ｒｅｒ　ｅＬ　ａｌ、（＋９９２）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　１８　 ：　５９１−５９４）　。 Ｂ、ｒａｐａ　ＡＣＰプロモータの約１．５ｋｂの領域及びナビン３′調１ＩＹ ＳＡＴ域の約０．３ｋｂから発現のために位置づけされた１、２ｋｂの月桂樹チ オエステラーゼ遺伝子フラグメントをもっ構成体（ｐＣＧＮ３８３６）を含む形 質転換されたＡｒａｋｉｄｓ−ｐｓｉｓ植物が得られた。ｐＣＧＮ３８３６形質 転換植物からの種子のラウリン酸塩含有量についての初期の分析は、ラウリン酸 塩がこれらの種子中で検出可能なレベルで蓄積しないことを示している。しかし ながら、遺伝子導入アブラナ種子内でゲノケイジュ・チオエステラーゼの発現タ イミング及びターゲティングが最適化された場合、ゲノケイジュ・において起こ ると思われるとおり少量のチオエステラーゼが大量のラウリン酸塩を作り、ゲソ ケイジュ・チオエステラーゼのより低いレベルの発現で充分でありうるというこ とが可能である。 例５−その他の植物チオエステラーゼの獲得Ａ−瘉惣±オ活ノ迂−ｉ二反久仕渡 咋象供藉葆前述の例で同定されたゲノケイジュ・及びサフラワーチオエステラー ゼに加えて、その他の植物も脂肪アソル鎖の長さ及び飽和度に関して変化する特 異性を有する望ましいチオエステラーゼの供給源である。このような付加的な植 物のチオエステラーゼは、さまざまな植物油のトリアツルグリセリド組成を分析 すること及び適切なアンルー八ＣＰ基質を用いて検定によりｉｔ認される特異的 チオエステラーゼの存在によって同定できる。 望ましいトリエステラーゼ酵素を有し得るその他の植物としてはニレ（旧ｍａｃ ｅａｅ　）及び樟Ｎｕ　（ＣｉｎｎａｍｏＩＩ＋ｕｍ　ｃａｍｐｈｏｒａ）があ る。ニレの種子内にはかなりのパーセントの１０二〇脂肪酸が検出され、樟脳か らの種子中には］０：Ｉ及び１２；０の脂肪酸の両方が顕著である。樟脳及びニ レからの発達中の胚芽内のチオエステラーゼ活性についてテストするための生化 学検定の結果が以下の表５に示されている。 紅 基質　■ （エーテル抽出物内の平均ｃｐｓ） 旦　」五 ｓ：ｏ−Ａｃｐ　８４　０ １０　：　Ｏ−ＡＣＰ　２１９９　４６５１２　：　Ｏ−ＡＣＰ　３８３　１５ ２９１４：０−ＡＣＰ　Ｉ　７７４　６４５＋６　：　Ｏ−ＡＣＰ　３４６０　 ９４０１８　：　１−ＡＣＰ　３９３１　３６４９ニレの場合、まり長鎖の基質 での有意な活性に加えて、ＣＩＯ：０−ＡＣＰ基質でチオエステラーゼ活性のピ ークが見られる。この事実は、ＣＩＯ：０−＾ｃｐ基質に向かっての特異的活性 を伴うチオエステラーゼがニレの胚芽の中に存在するということを示唆している 。 Ｃ１２：　０−ＡＣＰ基質に向かっての有意な活性が樟脳の抽出物の中に検出さ れている。さらに、樟脳抽出物は、月桂樹の胚芽からの類似の抽出物に比べてＣ ＩＯ：　０−ＡＣＰ基質に向かってのより大きな活性を立証している。この事実 はＣＩＯ：Ｏ−ＡＣＰ及びＣ１２：０ＡＣＰ基質に向かっての特異性を有する中 位鎖アシルーＡＣＰチオエステラーゼが樟脳の胚芽内に存在するということを示 唆している。 同様にして、より長鎖の脂肪アシルチオエステラーゼ（Ｃ１６又は０１８）も得 ることができる。例えば、ナンキンハゼ（Ｓａｐｉｔ＋ｓ＋Ｓｅｋ　ｉ　ｆ　ｅ ｒｕｍ）の種子の獣脂（タロー）層及び綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔ ｕｍ）の種子油の中にかなりの割合（４５％）の１６二〇脂肪酸が見られる。 （Ｇｕｎｓｔｏｎｅ、　Ｈａｒｌｌｏｏｄ　ａｎｄ　Ｐａｄｌｅｙ　ｅｄｓ、　 Ｔｈｅ　Ｌｉｐｉｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　（１９８６）Ｃｈａｐ＋ｍａｎ　ａｎ ｄ　Ｉ（ａｌｌ、　Ｌｔｄ、、　Ｔｈｅ　ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｃａｌｌｂｒｉｄｇｅ）。 発達中のナンキンハゼの組織、綿の胚芽（ｖａｒ、　５ｔｏｎｅｖｉｌｌｅ　５ ０６、開花後２１日目）又はＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓの胚芽（ｃｖ、　Ｄ ｅｌｔａ　、開花後２８日目）を各々約２５０ｍｇずつ、液体窒素下で乳鉢、乳 棒で絹粉末になるまで摩砕し、モーター駆動の乳棒の備わったガラスホモジナイ ザー内で１ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，５，２ＭＭのジチオトレイ トール、２　ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロー ル、１％Ｗ　／　Ｖのｒ’ＶＩ’ｌＯ及び５ｍＭのジエチルジチオカルバミン酸 塩の中で均質化することによって抽出する。マイクロ遠心分離管内で１５分間ホ モジネートを遠心分離し、上清分画のアリコートを以下のとおりチオエステラー ゼ活性について検定する。 ガラス製のネジトップ式バイアルの中で７０μｌの検定緩衝液に対し、検定緩衝 液（７ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８，ｏ、　２０％ｖ　／　ｖのグリセロール 、０，０２％ｗ　／　ｖのトリトンＸ−１００，１＋１１Ｍのジチオトレイトー ル）中の上清の１／２０希釈液２５／７１を付加する。反応を開始するため５０ ｐ＊ｏｌｅｓの（１４Ｃ）−放射線標識づけされたアシル基質を付加する。基質 は、ラウロイル−八ｃｐについてｒ’ｏｌｌａｒｄ、　ｅＬ　ａｌ、（前出）に 記されているように合成された、ミリストイル−八ＣＰ（１４：　０−　ＡＣＰ ）、バルミトイル− （１８：０−ＡＣＰ）又はオレオイル−ＡＣＰ（１８　：　ｌ−ＡＣＰ）である 。バイアルを３０分、３０°Ｃでインキュベートする。反応を酢酸で停止させ、 ０、ＳＰＡＩの１０％（Ｖ／Ｖ）低温（４°）酢酸を付加し数分間氷上に反応混 合物を置くことによりエーテルで遊離脂肪酸を抽出する。２ｍｌのジエチルエー テルを付加し勢いよく混合することにより、加水分解酵素作用の脂肪酸産物を加 水分解されていない基質から抽出する。 エーテルを、シンチレーション′３１数のため５ｍｌのシンチレーション流体へ と移送させる。望ましい場合には活性をさらに精確に測定するため、残留微量産 物を回収イるため付加的エーテル抽出を行なうこともできる。 綿、ナンキンハゼ及びアブラナに関する基質特異性分析の結果を表６に示す。 ２表」− １箕　断性 （エーテル抽出物中の平均ｃｐａ＋） ナンキンハゼ　簾　アブラナ １４　：　Ｏ　−ＡＣＰ　２５４　９４４　１８０１６　：　０　−八ＣＰ　１ ０３８　１５４２　５０６１８　：　Ｏ　−ＡＣＰ　７３３　８６０　５００１ ８　：　１　−ＡＣＰ　２５８６　３６６７　４３８９綿とナンキンハゼの両方 において１６　：　０−ＡＣＰ基質ならびに１８：１−ＡＣＰ基質で活性ピーク が見られるのに対し、アブラナの種子は１８：１〜ＡＣＰで有意な活性を示して いるにすぎない。１６：０脂肪−アシルＡＣＰに対する特異性をもつアシル−Ａ ＣＰチオエステラーゼが、ナンキンハゼ及び綿のトリアツルグリセリド組成を説 明しているように思われる。 ヘパリン−アガロース上でクロマトグラフィに付した綿の胚芽の抽出物中にチオ エステラーゼ活性の２つのピークが観察される。このクロマトグラフィは、２つ の異なるチオエステラーゼ、すなわちゲノケイジュ・抽出物からの１８：ｌチオ エステラーゼと１２　：　０　−ＡＣＰチオエステラーゼを分離するものである ことが立証されている（Ｐａｌｌａｒｄ，　ｅｔ　ａｌ．、　Ａｒｅｈ．　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ，　Ｂｉｏｐｈｙｓ，　（１９９１）　２８４　：　３０６−３１２ ）。綿抽出物のクロマトグラフィから観察された活性の２つのピークのうち、第 １のピークは１６二〇活性よりも高い１８：１活性を有し、第２のピークは１日 ：ｌ活性よりも高い１６：０活性を有する。 このデータは、綿の中に全く異なる特異性をもつ２つの酵素が存在することを示 唆している。 さらに、マンゴ−（Ｍａｎｇｉｒｅｒａ　１ｎｄｉｃａ）の仁の油は、トリアジ ルグリ七ロール中に２４〜４９％のステアリン酸及び６−１８％のバルミチン酸 を含んでおり、この油は、カカオ脂の代用品として使用できることが示唆されて きた（Ｏｓｍａｎ、　Ｓ、Ｍ、＋　’マンゴー脂肪Ｊ　、ＮｅｗＳｏｕｒｃｅｓ 　ｏｒ　Ｆａｔｓ　ａｎｄ　０ｉｌｓ（新たな油脂供給源）内、（１９８１年） 、Ｐｒｙｄｅ、Ｅ、Ｈ＋　Ｐｒ１ｎｃｉｎ、Ｌ、１１．＋及びＭｕｋｈｅｒｊｅ ｅ、Ｋ、Ｄ、、Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＯｉｌＣｈｅｍｉｓｔ　５ｏｃｉｅｔｙ）、 　Ｊ二速の例と同様に、胚芽抽出物の生化学検定により１８　：　０−ＡＣＰ特 異性をもつチオエステラーゼを立証することがゲソケイジュ・及びクフラワーの チオエステラーゼの配列（アミノ酸及びＤＮＡ）を獲得した後、上述のもののよ うなその他の植物供給源からの類似の遺伝子も容易に分離することができる。こ の例では、その他のチオエステラーゼ遺伝子を分離するのに２つの方法が記述さ れる：すなわちゲノケイジュ・及びサフラワーチオエステラーゼ遺伝子からの配 列又はペプチド配列情報を利用したＯＮパノ＼イブリダイゼーンシン技術による 方法及び（２）プローブとしてゲ・７ケイジユ・タンパク質に対する抗体を用い た免疫学的交叉怒受性による方法である。 これらの技術のいずれにおいても、望まれる植物からのｃＤＮＡ又はゲノミック ライブラリが必要とされる。ｃｎＮ八又はゲノミ・ツクライブラリを横築する数 多くの方法がＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、の第８章及び第９章において提供 されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙＭａｎｕａ　ｌ　（分子クローニング、研究室マニュアル）第２版（１９８ ９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。 その他の植物チオエステラーゼ遺伝子を分離するべく　ＤＮＡ／＼イブリダイゼ ーションにおいて使用するためのプローブは、提供されたゲノケイジュ・及びサ フラワーのチオエステラーゼ遺伝子配列から、又は代替的にはチオエステラーゼ ペプチド配列からのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＨによって得ることができ る。 この例においては、プローブとしてＰＣＩＩで生成し、たＤＮＡフラグメントを 用いる。適当なハイブリダイゼーション条件を決定するため望ましい植物の種か らの胚芽１２Ｎ＾のノーザン分析を行なう。ホルムアルデヒド／アガロースゲル 内でｌ？ＮＩｌを電気泳動し、Ｆｏｕｒｎｅｙ＋　ｅｔａ！により記述されてい るように、ナイロン膜フィルターへ移送させる（Ｆｏｃｕｓ　（１９８８）　Ｂ ６Ｌｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｉｅｓ　／ＬｉｆｅＴ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　１０　：　５−７　）　ａ　５０％の ホルムアミド、６ＸＳＳＣ（又ハロ　ＸｓＳ　ｐＥ）、５×デンハート試薬、０ ．５％ノｓｒ’ｓ及び１００μｇ７’ａＩの変性サケ精子ＤＮＡフラグメントを 含むハイブリダイゼーション溶液にｌｔｐ　ｉ識付けされたプローブ（Ｒａｎｄ ｏｍ　Ｐｒ１ｓｅｄ　ＤＮＡ（ランダムプライムドＩ）Ｎ＾）標識付はキット、 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ。 １ｎｄｉａｎａ−ｐｏｌｉｓ、　１８）を付加する。 標識付けされたプローブを含むハイブリダイゼーション溶液を１８時間以上約４ ０゛Ｃでノーザンフィルターを用いてインキュベートして相同（５０〜８０％） の配列に至るまでプローブをハイブリダイゼーションさせる。次にフィルターを 低ストリンジエン１〜性で洗浄する（約１ｘｓｓｃ内で室温から４２°Ｃまで） 　、Ｂｅ１Ｌｙ　ａｔ　ａｌ、　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｒｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 　（酵素学方法）（１９８３）１００：　２６６−２８５）で論述されているよ うにプローブの予測融点に基づいて、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を 調整することができる。さらなる試験においては、ハイブリダイゼーション又は 洗浄段階のいずれかで温度を上昇させ、及び／又は塩含有量を低下させて特異的 ハイブリダイゼーション配列の検出を改善する。 上述のように有用なプローブ及び適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を 識別した後、”Ｐｆｆｌｋ付はフラグメント及び最適化された条件を用いてｃｎ Ｎへライブラリをスクリーニングする。 例えば、チオエステラーゼクローンｐＣＧＮ３２６３の〜６００ｂｐ　Ｒａｍ旧 ／Ｘｈｏ　Ｉフラグメントを放射線標識付けし、Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ胚芽 ｃＤＮ＾ライブラリからチオエステラーゼクローンを分離するため非相同プ１１ −ブとしてこれを使用する。アブラナチオエステラーゼｃＤＮＡクローンのＤＮ ＾配列は図６に示されている。又、提案されるＡＴＧ開始コドンからの翻訳され たアミノ酸配列も共に示されている。ＤＮＡ配列内に幾分かの変動を示す付加的 なアブラナクローンも同様に分析されている。 プローブとして非相同チオエステラーゼ遺伝子を用いる直接ハイブリダイゼーシ ョン技術に加えて、ハイブリダイゼーションのためのプローブを作り出すため又 は望まれる植物供給源からのｍＲＮＡ又はＤＮＡからチオエステラーゼコーディ ング配列を生成するために、ｒＣＲ技術を使用することもできる。例えば、樟脳 （Ｃｉｎｎａｍｏ＊ｕ＊　ｃａｍｐｈｏｒａ）チオエステラーゼクローンを、月 桂樹及びサフラワーチオエステラーゼクローンからのアミノ酸及び核酸配列情報 を用いて分離することができる。発達中のＩ＆脳胚芽から分離したＲＮＡに対す るゲノケイジュ・チオエステラーゼｃＤＮＡクローンの相同性を、以下のとおリ ノーザン分析により観察する。［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現行のプロトコル）　Ｊ 　Ｐ４．３．１〜４．３．４（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、（１ ９８７）、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）に記述されている５ｔ）Ｓ ／フェノール抽出方法を適合させることによって、発達中の樟脳胚芽１ｇから全 ＲＮＡを分離する。この抽出のための摩砕緩衝液は、　１００ｗＭのいＣ１，１ ００＋ＭのＴｒｉｓｐＨ９、１０＋＋＋ＭのＥｌ）ＴＡ、１％の５ＩｌｌＳ及び ０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む。１ｇの胚芽からの抽出のためには 、ｐＨ８に平衡化した３係Ｉのフェノールと１０１１１１の摩砕緩衝液を粉末化 された胚芽に付加する。ホモジナイゼーシコン段階は、公表された方法において そうであるようにポリトロンを用いてではなく乳鉢の中で行なうこともでき、こ の方法でホモジナイゼーションに続く加熱段階は省かれる。遠心分離、試料のフ ェノール／クロロホルム抽出及びＲＮＡのＬｉＣ１沈降は、記述されているとお りである。 ホルムアルデヒド／アガロースゲル内で全ＲＮＡ　（１０〜２０μｇ）を電気泳 動させ、Ｆｏｕｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　（前出）が記述しているとおり、ナイ ロン膜フィルターへと移送する。ノーザンフィルタのハイブリダイゼーションの ためのプローブを、約１３００ｂｐフラグメントを生成するべくサフラワーチオ エステラーゼｃＤＮＡ配列に対しオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより全長 ゲンケイジュ・チオエステラーゼクローンであるｐＣＧＮ３８２２の５ａｉｌ消 化物から調製する。順方向プライマーはサフラワーチオエステラーゼｃＤＮＡ配 列（ＳＥロ■ロＮＯ：　３Ｂ）のヌクレオチド２１２〜２２８を含み、逆方向プ ライマーは、ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５１０〜１５２６に対する相補体で ある。フラグメントは、Ｐｒｅｐ−＾−ＧｅｎｅＤＮＡ精製キット（ＢｉｏＲａ ｄ　；　Ｒｔｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いてゲル精製され、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ　（ｒｎｄｉａｎａ−ｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）ｅンダムプラ イミング標識付はキットを用いて放射線標識づけされる。ノーザンフィルターを 、３０゛Ｃで、５０％のホルムアミド、５　ｘｓｓｃ　、　ｓｏ剛−のリン酸ナ トリウム（ｐ）１７）、５Ｘデンハート溶液、０．１％のＳＯ３，５ｍＨのＥＤ ＴＡ及び０．１＋＊ｇ／＋＊ｌの変性ＤＮＡの中で一晩ハイブリダイゼーション させる。 ０、ｌＸ５ＳＣ，０，１％の３１）Ｓの中でフィルタを２度（毎回１５分）洗浄 する。ハイブリダイズされたフィルタのオートラジオグラフィは、樟脳の胚芽試 料内で約１３００ｂｐのＲＮ＾ハンドまでの強いハイブリダイゼーションシグナ ルを明らかにする。このノ＼ンドは、ゲ・ノケイジュのｄＮＡとほぼ同しサイズ である。 樟脳チオエステラーゼ遺伝子のフラグメントを得るためには、樟脳及びサフラワ ーのチオエステラーゼの間に保存されたペプチドに対してオリゴヌクレオチドを 用いてＰＣＲを行なう。サフラワー及びゲノケイジュのチオエステラーゼの翻訳 されたアミノ酸配列の比較を図８に示す。 鋳型として逆転写された樟脳ＲＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行なう、こ れらの反応は、以下のサイクルにブｔコグラミングした旧ｏｓｙｃｌｅｒ　０ｖ ｅｎ（Ｂｉｏｓ　（、ｏｒｐ　；　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　ＣＴ）内で行なわれ る。 Ｎ　９５°Ｃで２分間　Ｐ　９５°Ｃで１５秒間１秒、６５゛Ｃまで低下　１秒 、６５°Ｃまで低下１秒間６５゛Ｃに保持　１秒間６５′ｃに保持２分、４５° Ｃまで低下　２分、５５°Ｃまで低下３０秒間４５°Ｃに保持　１５秒間５５° Ｃに保持１秒７２℃まで上界　１秒、７２°Ｃまでに昇３０秒間７２°Ｃに保持 　１５秒間７２°Ｃに保持１秒、９５°Ｃまで上昇　１秒９５°Ｃまで上昇サイ クルＮを６回実行反復し、その後、サイクルＰを３７回実行反復する。 ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動により約５００〜５ｏｏｂｐバンドが識別 される。これは、月桂樹チオエステラーゼ配列内のペプチドの間の距離の分析か ら予測されたおおよそのフラグメントサイズである。ＰＣＲフラグメントを、適 切なりローユングへフタ−へとりＩｊ−ユングさせ、チオエステラーゼ配列を確 認するためそのＤＮ＾配列を決定する。樟脳のＰＣＲフラグメントは、表５八に 示されている。 次に、樟脳チオエステラーゼクローンを分離するため樟脳ｃＤＮＡ又はゲノミノ タライブラリーをスクリーニングするのにこのフラグメントを用いることができ る。 遺伝子ライブラリをスクリーニングすることに代わって、全チオエステラーゼエ ンコーディング配列を回収するのに付加的なＰＣＲ技術を用いることができる０ 例えば、樟脳チオエステラーゼＰＣＲフラグメント配列を用いて付加的な樟脳チ オエステラーゼエンコーディング配列を生成する。３′からＩ’ＣＲフラグメン トの配列については、Ｆｒｏｈ＊ａｎ　ｅｔ　ａｌ、のＩＩＡｃＥ手順が利用さ れる（ｒ’ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ　Ｓｃ、ｉ。 （１９８８）　８５　：　８９９８−９００２）　、要するに、ｃＤＮ＾は、２ ００ｎｇのＲＮＡ　、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド（ＥｃｏＲＩ、　Ｘｈｏ［ 及び５ａｌＴについて５′の制限部位を伴う）、及び逆転写酵素を用いて、樟脳 の内胚乳ポリ（Ａ）　十ＲＮＡから生成される。この反応の産物はＦ、ｃｏＲｌ 、　Ｘｈｏｌ及び５ａｉｌ認識部位をコードするオリゴヌクレオチド及び図５Ａ の樟脳遺伝子フラグメントのヌクレオチド４４３−４６３を表わすオリゴヌクレ オチドと共にＰＣＲ３’　ＲＡＣＥにおいて用いられる。反応は、以下のプログ ラムでＢｉｏｓｙｃｌｅｒオーブン内で実行される：この要領で、樟脳チオエス テラーゼ遺伝子配列の３′部分を表わす約７００ｂｐのフラグメントが得られる 。 さらに、ＰＣＲを用いて、樟脳チオエステラーゼコーディング配列の５′配列も 同様に得ることができる。この反応のために、基本的にＦｒｏｈ＋ｗａｎ　ｅｔ 　ａｌ、　（前出）によって記述されているような逆転写反応においてランダム 六量体オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、樟脳内胚乳ポリ（Ａ）　＋ＲＮ Ａに対するｃＤＮ八が生成される。この反応のＣ口Ｎ＾産物は、末端デオキシヌ クレオチドトランスフェラーゼを用いてＡ−ティリングされ、Ｉ’ＣＲにおいて 使用される。この反応のためのオリゴヌクレオチドプライマは、図ＩＡ内のゲン ケイジュ・チオエステラーゼ配列のヌクレオチド１４０−１５５　＆び５　’　 Ｒａｍ　Ｈ１認識部位を含む１１ＥＴ−１−２８９８、及び図５への樟脳チオエ ステラーゼ遺伝子フラグメントのヌクレオチド１１５−１２６に対して相補的な 配列を含む縮重オリゴヌクレオチドである２３５６である。反応は以下のプログ ラムでＢｉｏｓｙｃｌｅｒオープン内で実行される；この要領で樟脳チオエステ ラーゼ遺伝子配列の５′部分を表わす約４５０ｂｐのフラグメントが得られる。 ＰＣＲ手順から挿入されたような制限部位を用いて適当なりローユングベクター の形にさまざまな樟脳チオエステラーゼ遺伝子フラグメントを組合わせる。この 要領で生成された樟脳チオエステラーゼ遺伝子の予備核酸配列及び翻訳されたア ミノ酸配列が、ｌ１ｉ４５Ｂに示されている。 Ｃｕｐｈｅａチオエステラーゼに相応するＯＮ＾配列も同様に、ＰＣＲ方法を用 いて得ることができる。プライマとして使用するための縮重オリゴヌクレオチド は、ゲノケイジュ・サフラワー及び樟脳のチオエステラーゼｃＤＮＡクローンの 間で保存されたペプチドフラグメントから指定できる。；順方向プライマＴＥＣ ｕ３は、ゲソケイジュ（図ＩＢ）及び樟脳（図５Ｂ’）チオエステラーゼタンパ ク質のアミノ酸２８３〜２８８及び図４へのサフラワーチオエステラーゼのアミ ノ酸２Ｂ２−２８７に対する考えられる全てのコーディング配列に１目応する１ ８のヌクレオチドを含む。逆方向プライマーＴＥＣｕ４Ａは、月桂樹（図ＩＢ） 及び樟脳（図５Ｂ）チオエステラーゼタンパク質のアミノ酸３１５−３２０及び 図４Ａのサフラワーチオエステラーゼのアミノ酸３１４−３１９に対する考えら れる全てのコーディング配列に相応する１７のヌクレオチドを含んでいる。さら に、順方向及び逆方向プライマは、それぞれ５′末端にＢａｍＸＩ又はＸｈｏｌ 制限部位を又３′末端にイノシンヌクレオチドを含んでいる。３′末端における イノシン残基は、縮重オリゴヌクレオチドプライマからの増幅を強化するもので あることが報告されている（Ｂａｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｎｕ ｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１９　：５０８１　）。サフラワーペプチドは、 措定されたペプチド領域の各々の中の１つのアミノ酸においてゲノケイジュ及び 樟脳の配列と異なっており、従ってオリゴヌクレオチドプライマーの縮重は、サ フラワー及びゲ、ケイシュ／樟脳の両方の配列をコードするようなものである。 ポリメラーゼ連鎖反応試料（１００μｍ）は、鋳型として逆転写されたＣｕｐｈ ｅａ　ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ　ＲＮＡ及び各オリゴヌクレオチドプライマー１μ Ｍずつを用いて調製される。試料を５分間沸とうさせ、Ｔａｑ酵素を付加する前 に７５°Ｃまで冷却する。ＰＣＲを、以下の温度サイクルにプログラミングされ たＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒサーモサイクラ−の中で行なう８１分間９４°Ｃ １秒間６５“Ｃ ２分、４０°Ｃまで低下 ３０秒間４０°Ｃに保持 １分、７２°Ｃまで上昇 １秒、９４°Ｃまで上昇 サイクルを４０回反復する。 次に７２゛Ｃで２分の終了サイクルを実行する。 ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、チオエステラ−ゼペプチド 配列からの予測されたサイズである約１２０ｂｐのＨ＾フラグメントを観察する 。　ＤＮＡフラグメントを分離し、ＰＣＲで挿入されたＲａｍ旧及びＸｈｏｌ制 限消化物部位を用いて適当なプラスミドベクターへとクローニングする。クロー ニングしたフラグメン）・を配列決定し、（プライマーによりコードされた１２ 個のアミノ酸を含む）相応するゲノケイジュ（図ＩＢ）チオエステラーゼ配列の ３８個のうちの２１個のアミノ酸と整合する３つのクローンを同定する。さらに １つのクローン、ＣｕＰＩ（Ｉ’、＾−１４−２を比較することにより、相応す る月桂ＩＤ（図３）領域内の２５個のアミノ酸、樟脳チオエステラーゼ中２２個 、そしてサフラワー２−１及び５−２でコードされたチオエステラーゼ配列内の それぞれ２２及び２３個のアミノ酸と、翻訳されたペプチド配列が整合している ということがわかる。ＣｕＰＨＥ　Ａ−１４−２クローンのＤＮＡ配列及びチオ エステラーゼコーディング領域のアミノ酸翻訳は図１２に示されている。チオエ ステラーゼコーディングフラグメントは標識づけされ、相応するチオエステラー ゼｃＤＮＡを分離するためＣｕｐｈｅａ　ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ　ｃＤＮＡライ ブラリをスクリーニングするのに用いられる。 ±オニステラー亙１ｆｆｉＪ＋］少分析ＤＮＡハイブリダイゼーシ式ン又は免疫 学的スクリーニング技術を用いて識別されたクローンを次に精製し、Ｍａｎｉａ Ｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、（前出）で提供されているような技術を用いてＤＮＡを分 離する。クローンが関係するチオエステラーゼをコードすることを確認するため 、遺伝子のＤＮＡ配列を決定する。代替的には、Ｅ、ｃｏｌｉ内でタンパク質を 発現させてそれが望ましい活性を存することを示す。上述の技術を用いてその他 の植物種からチオエステラーゼのための遺伝子を分離するため、新たに分離した 植物のチオエステラーゼ配列を使用することも可能である。 例えば、ゲノケイジヱ、樟脳及びサフラワーのチオエステラーゼのアミノ酸及び 核酸配列の比較は、付加的なチオエステラーゼ遺伝子の分離にとって役立つ相同 性を明らかにしている。ゲッケイジュ及び樟脳のクローンは、特にアミノ酸レベ ルで広範な相同性を示し、Ｃｕｐｈｅａ、ニレ、ニクズクなどの類似の短鎖又は 中位績アシルーＡｃＰ基質をもつその他のチオエステラーゼの分離にとって有用 でありうる。同様に、充分な相同性をもつサフラワー又はアブラナの長鎖チオエ ステラーゼ遺伝子は、１６：０脂肪−アシルＡＣＰ及びマンゴ−（１８：Ｏ）に 対する特異性をもつナンキンハゼ又は綿から同定されたものといった、より長鎖 のアシル−ＡＣＰ基質に対する特異性をもつ植物チオエステラーゼの分離のため に任用でありうる。 さらに、長鎖チオエステラーゼタンパク質及び短鎖又は中位鎖特異チオエステラ ーゼタンパク質の領域も同様に相同性を示す。これらの相同性領域は、付加的な 植物チオエステラーゼを分離するべくＰＣＲにおいて使用するだめの１１１重オ リゴヌクレオチドを指定するのに有用である。例えば上述のように、ゲッケイジ ュ及びサフラワーのチオエステラーゼ領域に対するオリゴヌクレオチドは、樟脳 チオエステラーゼコーディング配列を得るのに使用された。この保存された領域 は、それぞれ図ＩＢ及び５Ｂ内のゲッケイジュ及び樟脳のアミノ酸配列のアミノ 酸１１１１１９及び図４Ａ内のサフラワーアミノ酸のアミノ酸１０８−１１４に 相応する。同様にして、ゲッケイジュ及び樟脳の１７４〜１８８及びサフラワー の１６９〜１８３内、ゲッケイジュ及び樟脳の２１９−２２９及びサフラワーの ２１４−２２４　；及びゲッケイジュ及び樟脳の１３８−１４５及びサフラワー の１３３−１４０内といったように、ゲノケイジエ、樟脳及びサフラワーのアミ ノ酸配列（それぞれ図ＩＢ、５Ｂ及び４Ｂに示されているような）の中に、その 他の保存領域が見られる。 上述の植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、カルボキシ又はアミノ末端のい ずれかにおいてよりもタンパク質の中心に向かってより高レベルで保存されてい る。保存された領域は、酵素の触媒部位に関連する部域を表わす可能性があり、 又、観察された基質の特異性の差異をポリペプチド鎖のいずれかの末端における 領域内のアミノ酸配列の差異に関連づけることもできる。植物アシル−ＡＣＰチ オエステラーゼタンパク質配列配列動物及び酵母のチオエステラーゼ及びその他 の脂肪酸合成酵素内に見られる活性部位コンセンサス配列（Ｇ）ＩＳＸＧ）又は システィンベースの加水分解酵素の活性部位モチーフを含んでいない（ＡｉＬｋ ｅｎ　（１９９０）、「タンパク質のコンセンサス配列の同定」中、Ｅｌｌｉｓ 　Ｈｏｒｗｏｏｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ　、　ｐｐ８１−９１）　＠阻害物質の研究 により、植物のチオエステラーゼ酵素がＮ−エチルマレイミドといったスルフヒ ドリル特異試薬に対して感受性をもつことがわかっているため、ンステイン残基 が活性部位で関与している可能性がある。 従って、上述の方法によってその他の植物チオエステラーゼ遺伝子を分離し、植 物チオエステラーゼの発現のためにこれを用いることが可能である。特に、これ らのチオエステラーゼのアシル鎖の長さ特異性を確認するためにはＥ、ｃｏｌｉ 内での発現が任用であり、改質油を製造するためには植物の種子内での発現が有 用である。 肛−植物内の植物チオエステラーゼとデヒドラーゼここではデヒドラーゼとも呼 ぶ酵素３−ヒドロキシデカノイル−〔アシル−担体−タンパク質〕デヒドラター ゼ（ＥＣ４，２，１，６０）は、細菌内での不飽和脂肪酸の産生における主要な 段階である２−デセノイル−八ＣＰ（ＣＩＯ：　１−八ＣＰ）への３−ヒドロキ シデカノイＪレーＡＣＰ（ＣＩＯ：　０−ＡＣＰ）の脱水を触媒する。植物の種 子内でのこの酵素の発現は、ゲンケイジュの中位績アシルーＡＣＰチオエステラ ーゼ遺伝子をも含む植物中の不飽和脂肪酸アシル−＾ｃｐの産生にとって有利で ある。このようにして、Ｃ１２：１及びＣ１４：１基質上のゲッケイジュ・チオ エステラーゼの加水分解活性の結果として中位鎖不飽和遊離脂肪酸が形成される 。 植物の種子内のデヒドラーゼの発現にとって有用な構成体が、ナピンプロモータ 領域の制御下での植物種子組織内での酵素の発現を提供する。さらに、プラスチ ド内へのデヒドラーゼ酵素のトランスロケーシぢンのためのトランジットペプチ ド領域が提供される。 デヒドラーゼ酵素の最初のＮｅｔアミノ酸以外全てをコードするＥ。 ｃｏｌｉデヒドラーゼ遺伝子からのデヒドラーゼ核酸配列（Ｃｒｏｎａｎ　ｅｔ ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ、　２６３　：　４６４１−４ ６４６）を構築する。トランジットペプチド及びデヒドラーゼ配列が同じ読取り 枠内にくるように、成熟サフラワーチオエステラーゼ（クローン２−１から）の ６つのアミノ酸及びサフラワーチオエステラーゼトランジットペプチドをコード するＰＣＲＤＮＡフラグメントがデヒドラーゼに対する５′に真近に挿入される 。サフラワーチオエステラーゼトランジット／デヒドラーゼ配列は、５′と３′ のナピン調節配列の間でナビン発現カセットｐＣＧＮ３２２３内に挿入される。 デヒドラーゼ発現構成体は、植物の形質転換のため二元性構成体へと形質転換さ れる。カナマイシン以外の選択的標識をコードするベクターが好まれる。このよ うにして、挿入されたチオエステラーゼ構成体（例４に記されているようなもの ）の結果として中位鎖アシルー＾ｃｐ脂肪酸を産生ずる遺伝子導入アブラナ植物 を、デヒドラーゼ発現構成体で再度形質転換することができる。例えば、抗生物 質ハイグロマイシンＢに対する耐性をコードするデヒドラーゼ発現構成体を二元 性ベクターｐＣＧＮ２７６９　（以下で記述する）の中に挿入することが可能で ある。結果として得られる構成体を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋細胞が得 られ、例３に記されているようにアブラナ形質転換方法において利用される。 二元ベクターｐｃＧＮ２７６９は、＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ−ＤＮＡの 右及び左のボーダーを、又これらのボーダーの間には形質転換された植物細胞の 選択のための３５Ｓ／ハイグロマイシン／１ｒ７ｆｌｌ成体を含んでいる。 このベクターは、交互の選択可能な標識の使用以外、Ｍｃ　Ｂｒ１ｄｅ及びＳｕ ｍ■ｅｒ　ｆｅｌｔ（前出）が記述している二元性ベクターと直接相似性をもつ ように構築された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする ｈｐｈ遺伝子についてはＧｒｉｔｚ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ　（遺伝子（１９８ ３）　２５：１７９−１８８）によって記述されている０次に続＜　ｈｐｈ及び 植物調節配列を含むＤＮＡχｈｏｌフラグメントが、ポリメラーゼ連鎖反応技術 を用いて構築された：すなわちＣａＭＶ３５Ｓプロモータの−２８９〜＋１１４ （転写開始部位との関係において）；植物コンセンサス翻訳開始配列を提供する ための、配列ＡＴＣＡＴＧ＾＾Ａ内に含まれるＡＴＧ開始コドンを伴うｈｐｈコ ーディング領域ヌクレオチド２１１　１２３６　（Ｇｒｉｔｚａｎｄ　Ｄａｖｉ ｅｓ　１ｓｕｐｒａ）（Ｋｏｚａｋ　（１９８９）　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、１０８：　２２９　２４ｉ）；　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｐｌａｎｔ 　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、（１９８３）　２　：　３３５−３５０）により番号づけ されているＴ−ＤＮＡのヌクレオチド２９２１−２４０２からのＡｇｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ転写物７　（ｔｒ７）転写終結領域、である。ｐＴｉＡ６Ｔ−ＤＮ Ａの左側ボーダー、ｈｐｈ発現構成体、４２５ｂｐ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌａｃ　ａ ｌｐｈａコーディング領域を含むＨａｅｌｌ　フラグメント及びｐＴｉＡ６Ｔ− ＤＮＡの右側ボーダを含むＢｇｌｌｌ　フラグメントをもつｐＣＧＮ２７６８を 生み出すためＸｈｏｌｈｐｈ発現フラグメントをｐｃＧＮ１５４１に連結させた （Ｔ−ＤＮＡボーダー及びＩａｃ−α領域についてはＭｃＢｒｉｄｅ　ｅｔ　ａ ｌ、　（前出）に記述されている）。 上述のＢａ１１１　フラグメントは、ｐｃＧＮ１５３２　（ＭｃＢｒｉｄｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　（前出））のユニークＢａｍＨＩフラグメントにクローニングされ 、ｐＣＧＮ２７６９を結果として生しる。 あるいは、デヒドラーゼ発現構成体及びゲソケイジュ・チオエステラーゼ発現構 成体（例えば１）ＣＧＮ３８２８）を両方共、カナマイシン耐性植物の選択のた めの標識を含ｔＪＶＩｃＢｒｉｄｅ　ｅｔ　ａｔ、　（前出）ベクターといった 単一の二元性ベクターの中に挿入することができる。これらの方法のいずれにお いても、中位鎖不飽和及び飽和脂肪酸を産生ずることのできる植物が生み出され る。 本明細書内で言及されている全ての公報及び特許出願は、本発明が関係する当業 者の技術水準を例示するものである。全ての公報及び特許出願は、それが参考と して特定的にかつ個別に例示されている場合と同じ範囲で本書に参考として内含 される。 上述の発明は、明確に理解することを目的として例を用いて成る程度詳細に記述 されてきたが、添付のクレームの範囲内で幾分かの変更及び修正を行なうことが できるということは明白である。 １−Ｉ　■　弓　Ｉ−１弓　コ　■０ −ｅ　１−Ｉｃ）　−＋　■　−■　二。 ←　くへ　（ＣＱ　（−ｊ　Ｑ、− １−１勺　■　Φ　Φ　ｃｌ：　ψ 二　−ＷＬｎ　ｊ　二　ψ　・＝ ←　＜　＜円　へ　山　く　− 勺　コ　コ　ω　：＋　１−Ｉ　α −Φ　Φ　スロ　（ＬＩ　Ｊ：　ψ ＜　Ｊ−Ｊｕｔ　、Ａ　Ｅ−＋　＜ ω０　ψ　＞　口　ω　φ〇　− 一す　メ　−　の　二　スヘ　ω 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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．全脂肪酸中最低１．０モル％のラウリン酸塩を含む植物の種子において、ト リグリセリド分子の少なくとも１つの位置に取り込まれており、この植物の野生 型種子は脂肪酸中１．０モル％未満のラウリン酸塩を含んでいる植物種子。 ２．脂肪酸中最低約１５モル％のラウリン酸塩を含む、請求の範囲第１項に記載 の種子。 ３．脂肪酸中最低約３３モル％のラウリン酸塩を含む、請求の範囲第１項に記載 の種子。 ４．脂肪酸中最低約５０モル％のラウリン酸塩を含む、請求の範囲第１項に記載 の種子。 ５．トリグリセリド分子の少なくとも２つの位置に前記ラウリン酸塩が見い出さ れる、請求の範囲第１項に記載の種子。 ６．請求の範囲第１項に記載の種子から誘導された油。 ７．トリグリセリド分子の少なくとも１つの位置に取り込まれた脂肪酸中最低１ ５．０モル％のラウリン酸塩を含むアブラナの種子。 ８．脂肪酸中最低５０モル％のラウリン酸塩を含む請求の範囲第７項に記載のア ブラナの種子。 ９．請求の範囲第７項に記載の種子から誘導された油。 １０．５′→３′の転写方向で、宿主細胞内で機能的な転写開始領域、この宿主 細胞内で機能的な翻訳開始領域、図１Ｂの５′末端配列を少なくとも有するゲッ ケイジュ・チオエステラーゼをコードするＤＮＡ構造遺伝子配列、及びこの宿主 細胞内で機能的な転写及び翻訳終結領域を含む、宿主細胞内で植物チオエステラ ーゼを産生することのできるＤＮＡ構成体。 １１．請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ構成体を含むアブラナ植物の種子。 １２．細菌細胞から中位鎖脂肪酸を収穫する方法において、チオエステラーゼの 発現を結果としてもたらすような条件下でこの細胞内で機能的な調節配列の制御 下で植物中位鎖チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列をもつ細菌細胞を培養 する段階及び細胞を含まない培地から脂肪酸塩を回収する段階を含み、前記細胞 に脂肪酸分解が欠損している中位鎖脂肪酸収穫方法。 １３．前記細菌細胞がアシル−ＣｏＡシンターゼ欠損細胞であり、Ｅ．ｃｏｌｉ 　ｆａｄＤ及びＥ．ｃｏｌｉ　ｆａｄＥから成るグループの中から選択される、 請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４．前記細菌細胞が約２５〜３０℃の温度で培養される、請求の範囲第１３項 に記載の方法。 １５．前記脂肪酸塩が細胞外で沈着したラウリン酸塩の結晶である、請求の範囲 第１２項に記載の方法。 １６．前記脂肪酸塩が不飽和脂肪酸である請求の範囲第１２項に記載の方法。 １７．不飽和中位さ遊離脂肪酸を産生する方法において、酵素反応条件下で、（ １）不飽和脂肪アシル−ＡＣＰ基質と（２）植物中位鎖チオエステラーゼを接触 させる段階を含み、この植物チオエステラーゼは前記不飽和脂肪アシル−ＡＣＰ 基質と同じ長さの飽和脂肪アシル−ＡＣＰ基質を加水分解することができ、かく して中位鎖脂肪酸がＡＣＰから解放される不飽和中位さ遊離脂肪酸産生方法。 １８．前記植物中位鎖チオエステラーゼが月桂樹チオエステラーゼであり、前記 接触がＥ．ｃｏｌｉ細胞内のこの月桂樹チオエステラーゼの発現の結果起こる、 請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９．Ｃ１２：１又はＣ１４：１の少なくとも１つが産生される、請求の範囲第 １７項に記載の方法。 ２０．前記接触が植物細胞内で起こる、請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２１．前記不飽和脂肪アシル−ＡＣＰ基質が、酵素反応条件下で（ａ）飽和脂肪 アシル−ＡＣＰ基質及び（ｂ）β−ヒドロキシデカノイルチオエステラーゼデヒ ドラーゼを接触させる段階から産生される、請求の範囲第２０項に記載の方法。