JPH05507199A

JPH05507199A - 植物チオエステラーゼ

Info

Publication number: JPH05507199A
Application number: JP91510152A
Authority: JP
Inventors: デビース，ヒュー　マーロー; ポラード，マイケル　ロマン; フェルカー，トニ　アロイス; トンプソン，グレゴリー　エー．
Original assignee: カルジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1990-04-26
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 1993-10-21
Also published as: CA2081122A1; DE69133283D1; US5344771A; DE69133283T2; ATE243743T1; EP0480024B1; WO1991016421A1; EP0480024A1; EP0480024A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２０、発現された植物チオエステラーゼを含んで成るトランスジェニック宿主細胞。２１、前記宿主細胞が植物細胞である請求の範囲第２０項記載の細胞。２２、前記植物チオエステラーゼが、中ぐらいの鎖を好むアシル−キャリヤーチオエステラーゼである請求の範囲第２１項記載の細胞。２３、形質転換されていない植物細胞が、中ぐらいの鎖を好むアシル−キャリヤーチオエステラーゼを有さない請求の範囲第２２項記載の細胞。２４、宿主細胞又はその子孫に植物チオエステラーゼを生成するための方法であって、請求の範囲第１０〜１２のいづれか１項記載の構造体を、前記植物チオエステラーゼの生成を可能にするであろう条件下で含んで成る宿主細胞又はその子孫を増殖することを含んで成る方法。２５、前記宿主細胞が植物細胞であり、そして前記構造体が前記植物細胞のゲノム中に組込まれる請求の範囲第２４項記載の方法。２６、前記植物細胞がインビボで存在する請求の範囲第２５項記載の方法。２７、請求の範囲第２４項記載の方法に従って生成される植物チオエステラーゼを含んで成る宿主細胞。２８、前記宿主細胞が植物宿主細胞であり、そして前記構造体が前記植物細胞のゲノム中に組込まれる請求の範囲第２７項記載の細胞。２９、他の植物タンパク質を実質的に含まず、そして１又は複数の中ぐらいの鎖の脂肪酸アシル−キャリヤー基質に対して選択的なヒドロラーゼ活性を有する植物チオエステラーゼ。３０、前記キャリヤーがアシルキャリヤータンパク質（“ＡＣＰ”）である請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３１、　Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３２、　ＣＩＯを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３３、未熟植物胚から得られる請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３４、ウンベルラリア　力リホルニ力から得られる、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３５、約３４ＫＤａの分子量を有する請求の範囲第３４項記載のチオエステラーゼ。３６、クツエアから得られる請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３７、クツエア　ツーケリアナから得られる、ＣＩＯを好む、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第３６項記載のチオエステラーゼ。３８、中ぐらいの鎖の遊ＭＨＪｉ肪酸を生成するための方法であって、酵素反応条件下で、（１）ｌ又は複数の中ぐらいの鎖の脂肪酸アジルーキャリヤー基質に対して選択的ヒドロラーゼ活性を存する植物チオエステラーゼ及び（２）前記植物チオエステラーゼにより加水分解できる脂肪酸アシル−キャリヤー基質を接触する段階を含んで成り、ここで前記接触が前記チオエステラーゼと天然において関連する植物外で存在し、そしてそれによって、中ぐらいの鎖の脂肪酸が前記キャリヤーから開放されることを特徴とする方法。３９、前記植物チオエステラーゼがウンベルラリア　カリホルニ力から得られる請求の範囲第３８項記載の方法。４０、前記植物チオエステラーゼがウンベルラリア　力リホルニ力の、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである請求の範囲第３８項記載の方法。４１、前記植物チオエステラーゼがクツエア　ツーケリアナから得られる請求の範囲第３８項記載の方法。４２、前記植物チオエステラーゼがクツエア　ツーケリアナの、ＣＩＯを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである請求の範囲第３８項記載の方法。４３、前記接触がインビトロで行なわれる請求の範囲第３８項記載のける遊離脂肪酸を変性するための方法であって：転写の５′から３′方向に、植物細胞中において機能する転写調節領域及び植物チオエステラーゼをコードする配列を含んで成るＤＩＩＡ構造体をそのゲノムに組込んだ植物細胞を、前記植物チオエステラーゼの転写を可能にするであろう条件下で増殖することを含んで成る方法。４５、前記植物チオエステラーゼをコードする配列がアンチ−センス配列である請求の範囲第４４項記載の方法。４６、前記構造体がさらに、前記植物チオエステラーゼをコードする配列に対してすく５′側での、前記植物細胞において機能する翻訳調節領域及び前記配列に対して３′側の転写／翻訳終結調節領域を含んで成り、そして前記植物チオエステラーゼをコードする配列がセンス配列である請求の範囲第４４項記載の方法。４７、前記植物細胞が脂肪種子胚植物細胞である請求の範囲第４４項記載の方法。４８、前記長鎖遊離脂肪酸の百分率が低められ、そして前記中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸の百分率が高められる請求の範囲第４４項記載の方法。４９、請求の範囲第４４〜４８のいづれか１項記載の方法により生成される変性遊離脂肪酸組成物を有する植物細胞。５０、脂質蓄積の間、種子において機能するｗ４節要素の＠宿下で植物チオエステラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を胚細胞のゲノム中に組込んでいる植物を成長せしめ、前記調節要素の活性を促進せしめるであろう条件下で種子を生成し、そして前記種子を収穫することを含んで成る方法に従って生成される、生来のレベルの脂肪酸を有する前記植物の種子に比べての、変性されたレベルの脂肪酸を有する植物種子。５１、前記植物がブラシカ　ナバス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）である請求の範囲第５０項記載の種子。５２、前記種子が脂肪種子である請求の範囲第５０項記載の種子。５３、一定百分率の長い鎖の脂肪酸から短い鎖の脂肪酸に脂肪種子収穫植物から生成されるトリグリセリドの脂肪酸組成を変性するための方法であって：転写の５′から３′方向に、植物細胞中において機能する転写調節領域及び植物チオエステラーゼをコードする配列を含んで成るＤＮＡ構造体をそのゲノムに組込んだ植物細胞を、前記植物チオエステラーゼの転写を可能にするであろう条件下で増殖することを含んで成る方法。５４、前記植物チオエステラーゼをコードする配列がアンチ−センス配列である請求の範囲第５３項記載の方法。５５、前記構造体がさらに、前記植物チオエステラーゼをコードする配列に対してすぐ５′側での、前記植物細胞において機能する翻訳調節領域及び前記配列に対して３′側の転写／翻訳終結１ｉ１節領域を含んで成り、そして前記植物チオエステラーゼをコードする配列がセンス配列である請求の範囲第５３項記載の方法。５６、前記植物細胞が脂肪種子胚植物細胞である請求の範囲第５３項記載の方法。５７、前記長鎖遊離脂肪酸の百分率が低められ、そして前記中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸の百分率が高められる請求の範囲第５３項記載の方法。５８、請求の範囲第５３〜５７のいづれか１項記載の方法に従って生成されたトリグリセリドの変性脂肪ｍ組成物を有する植物細胞。５９、前記収穫植物が、ナタネの種子、ヒマワリ、ベニバナ、綿、クツエア、ダイズ、ビーナン°へココナツツ、ギネアアブラヤシ及びトウモロコシから成る群から選択される請求の範囲第５３〜５７のいづれか１項記載の方法。６０、変性された割合の、短鎖脂肪酸に対する長鎖脂肪酸を有する植物種子油を含んで成る、内因性割合の、短鎖脂肪酸に対する長鎖脂肪酸を有する植物の植物種子油。６１、ブラシカ　ナバス油を含んで成る請求の範囲第６０項記載の油。６２゜請求の範囲第５０〜５２のいづれか１項記載の種子から分離され、た植物種子油。６３、ナタネの種子、ヒマワリ、綿、クツエア、ダイズ、ビーナツツ、ココナツツ、ギネアアブラヤシ及びトウモロコシから成る群から選択された植物からのトリグリセリド油であって、前記油中の脂肪酸鎖長組成が、転写の５′から３′方向に、植物細胞中において機能する転写調Ｗ１領域及び植物チオエステラーゼをコードする配列を含んで成るＤＮＡ構造体をそのゲノムに組込んだ植物細胞を、前記植物チオエステラーゼの転写を可能にするであろう条件下で増殖することを含んで成る方法により、一定百分率の長鎖脂肪酸から短鎖脂肪酸に変性されていることを特徴とする油。６４、前記植物チオエステラーゼをコードする配列がアンチ−センス配列である請求の範囲第６３項記載の油。６５、前記構造体がさらに、前記植物チオエステラーゼをコードする配列に対してすぐ５′側での、前記植物細胞において機能する翻訳調節領域及び前記配列に対して３′側の転写／翻訳終結調＆ｌｙ領域を含んで成り、そして前記植物チオエステラーゼをコードする配列がセンス配列である請求の範囲第６４項記載の油。６６、前記長鎖遊離脂肪酸の百分率が低められ、そして前記中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸の百分率が高められる請求の範囲第６５項記載の油。明細書植物チオエステラーゼ本出願は、１９９１年２月２７日出願されたＵＳＳＮ　０７／６６２，００７及び１９９０年４月２６日出願されたＵＳＳＮ　０７１５１４．０３０及び１９９０年１１月３０日出願されたＵＳＳＮ　０７／６２０，４２６の一部継続出願である。技術分野本発明は、タンパク質調製、アミノ酸及び核酸配列及び構造体、及びそれらに関する方法に間する。序論背景生合成又は天然植物源から脂肪酸組成物を得、又は操作するための“改良された ”手段が必要とされる。たとえば、新規油住成物、合成トリアジルグリセロール（トリグリセリド）の改良された源、市販の油、特に熱帯性波（すなわちヤシの実及びココナツツ油）の源、及び天然源から少量、見出される植物油は、種々の産業及び食品への使用のために所望される。最後に、植物及び細菌における脂肪酸合成（ＦＡＳ　）システム、すなわちＦＡＮ−ＩＩが研究されている。“長鎖の脂肪酸”、すなわち１６個に等しいか又はそれ以上の炭素原子（Ｃ１６）の炭素鎖長を有する脂肪酸を植物のアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）−依存性ブラスチドー局在ＦＡＳシステムを通して生成する機構は、比較的十分に特徴づけられている。しかしながら、この活性を担当する多くのタンパク質のアミノ酸及び対応する核酸配列はまた決定されていない。特に、長鎖の遊離脂肪酸を生成する酵素は、いくつかの異なった収穫物において研究されている。それにもかかわらず、植物が、短かい鎖の遊離脂肪酸（Ｃ４−Ｃ８）及び中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸（Ｃ８−Ｃ１４）を生成する機構は未解決のままである。チオエステラーゼ（また、ヒドロラーゼとしても知られている）の特徴化は、植物ＦＡＳシステムの追加の研究及び新規及び／又は他の油源の開発のために有用である。広いＣ４，Ｃ６及びＣ８の短鎖３−ケト脂肪酸の生成は、細菌及び植物に製造されるポリヒドロキシブチレー）　（ＰＨＢ）基材の生物分解性プラスチックにおけるキー改良点になる。中ぐらいの鎖の脂肪酸は、洗剤及び滑剤産業において、又は低カロリー値又は他の健康利点を有する食用油の配合において特別な重要性を有する。たとえば、アメリカ特許第４，８６３，７５３号及びＢａｒｃｈ、Ａ、Ｃ，＆　Ｂａｂａｙａｎ、Ｖ、Ｘ、、　Ａ＊、Ｊ、Ｃ１ｆｎ、Ｎａｔ、（１９８２）　３６　：　９５０〜９６２を参照のこと、長鎖の脂肪酸は一定の他の利用性を有し、すなわちＣ１６及びＣ１０はマーガリン及び他の固形油− 基材の生成物に特別な使用を有し、そしてひじょうに長い鎖の脂肪酸はまた、特定の使用を有し、すなわちＣ２２は、ピーナツツバターをより滑らかにするために使用される。異なった鎖長の脂肪酸を所望する割合で導入する貯蔵脂質を包含する、種々の脂肪酸長の源自体が、種々の産業及、び食品使用分野のために所望される。植物における脂肪酸の連鎖停止反応のための生合成路が決定される場合、そのシステムは、インビボ及びインビトロ適用のために適合され得る。従って、植物の連鎖停止機構の研究は、脂肪酸生成物又は得られるトリグリセリド及び油の長さをさらに増強し、制御し、変性し又は変えるための手段を提供することができる。そして、植物における遊離脂肪酸の天然生成に臨界である因子の解明、たとえばそのような因子の精製及びシステムの効能を高める要素及び／又は補因子の特徴化が所望される。遺伝子工学への通用のためにそのような遊離脂肪酸の生成に関連する因子をコードする遺伝子の核酸配列が特に興味の対象である。関連文献ＭｃＫｅｏｎ、Ｔ、Ａ、　＆　Ｓｔｕｍｐｆ、Ｐ、に、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ曽、（１９８２）　２５７：　１２１４１〜１２１４７は、ヒマワリのアシルＡＣＰ−チオエステラーゼの７００倍精製を報告する。長鎖のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの精製及び特徴化を報告する他の文献は、５ｈｉｒｅ、など、　、Ａｒｃｈ、旧ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。（１９７６）１７２：　１１０〜１１６　；　Ｃｈｌｒｏｏｇｅ、など、　、Ａｒｃｈ、Ｂｔｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。（１９７８）　１８９：　３８２〜３９１　；　ｒｍａｉ、など０、Ｐｌａｎｔ　Ｌｉｐｔｄ　ＢｉｏｃｈｅｗｉｓＬｒｙ＋Ｔｈｅ　Ｎ１ｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｙａｐｏｓｉｕ＋ｗ　ｏｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｌｉｐｉｄｓ、　Ｗｙｅ　Ｃｏｌ−Ｉｅｇｅ、　Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｌｏｎｄｏｎ、　７月８〜１３　（１９９０）；　Ｈｅ１ｌｙｅｒ、Ａ、　＆　５ｌａｂａｓ。Ａ、Ｒ，、Ｐｌａｎｔ　Ｌｉｐｉｄ　ＢｉｏｃｈｅｍｉＳｔｒｙ、　Ｔｈｅ　Ｎ１ｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍ−ｐｏｓｊｕｍ　ｏｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｌｉｐｉｄｓ、　Ｗｙｅ　ＣｏＣｏ１１ｅ、　Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｌｏｎｄｏｎ＋　７月８〜１．３　（１９９０）を包含する。Ｐ、に、Ｓｔｕｍｐｆ、　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ（Ｐ、に、Ｓｔｕｗｐｆ　＆　Ｅ、Ｃｏｎｎ。ｅｄｓ、）　（１９８７）　９：　１２１〜１３６ば、植物における種々の鎖長の脂肪酸鎖延長路の停止の機構を要約する。中ぐらいの鎖の脂肪酸を生成するための特定のチオエステラーゼ及び他の可能な説明が主張されている。　Ｈａｒｗｏｏｄ、Ｊ、Ｌ、＋　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ＰＩａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ、（１９８８）　３９　：ｉ０１〜１３８は、いくつかの植物組織における多量の中ぐらいの鎖長の脂肪酸の生成に関しての種々の可能性を文献において言及し、そして中ぐらいの鎖の脂肪酸生成を担当する適切な°′チオエステラーゼ”を見出すためのすべての試みは否定的であることがわかったことを報告する。Ｈａｒｗｏｏｄ、Ｊ、Ｌ、＋　Ｃｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、（１９８９）　８　：　１〜４３は、はとんど知られていない結論を伴って、植物における中ぐらいの鎖の脂肪酸の生成に間する現在の情報を言及する。また、Ｐｏ１ｌａｒｄ、Ｍ、Ｒ，ａｎｄ　Ｓｉｎｇｈ、Ｓ、Ｓ、、Ｔｈｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｌｉｐｉｄｓ、Ｓｔｕｍｐｆ、Ｐ、に、、Ｍｕｄｄ、Ｊ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｎｅｓ、ｌ１１゜Ｄ、、　ｅｄｓ、（Ｐｌｓｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　１９８７）　４５５〜４６３ページを参照のこと。図面の簡単な説明第１図、ゲッケイジュのチオエステラーゼ配列を得るためにＰＣＲ反応に使用される２種のペプチド配列及び変性オリゴヌクレオチドが示される。オリゴペプチド配列におけるＩ”は、ヌクレオチドイノシンを示す。低い部分において、ＤＮＡ配列は、２種の選択された制限酵素（制限部位は下線が引かれている）による続（クローニングを可能にするように企画された人工的な５′末端を示す。ペプチド７０１（配列番号１４）のためのオリゴヌクレオチドは、配列番号３２であり、そしてペプチド６９８（配列番号１２）のためのオリゴヌクレオチドは、配列番号３３である。第２図。ＰＣＲ生成ｃＤＮＡ及びＢａｙチオエステラーゼの最長ライブラリークローンの融合が示される。初めの２１０個の塩基（配列番号３４）は、８００ｂｐのＰＣＲ生成物からのものである。ギャップは、制限酵素地図により決定されるように、約２４０ｂｐの未配列決定ｆｌＮＡを示す。残る配列（配列番号３５）は、ＰＣＲフラグメント及びライブラリークローンからである。適切な読み取り枠への翻訳が、その配列下に示される０選択されたペプチド配列が、それぞれのタンパク質配列下で水平線により示される。示される数字は、第８表に供給される数字に対応する。タンパク質配列決定を通して提供される配列とのミスマツチが示される。第３図、配列比較が、例１４．　Ｃ，２ニ記載される８００ｂｐノＰＣＲ生成フラグメントを用いて単離された２種の関連するゲ、ケイシュのチオエステラーゼｃＤＮＡクローン間で示される。配列の同一性は、水平線により示される。第４図。ゲノケイジュのチオエステラーゼの完全な長さの配列が示される。第４Ａ図においては、構造遺伝子のアミノ酸配列が与えられる。第４Ｂ図においては、核酸配列が与えられる。第４Ａ図におけるアミノ酸配列は、１８１〜１８３でＡＴＧコドンと共に存在する。本明細書に示されるように、３個の可能なＡＴＧ出発コドンが、第４Ｂ図の核酸配列の初めの２１９個の塩基対に位置する。第５図。第９表に示されるフラグメントの配向の代表が提供されている。発明の要約本発明は、植物チオエステラーゼに関し、そして短鎖を好む及び長鎖を好むアジルーキャリヤーｉｔチオエステラーゼの両者を包含する。そのような短鎖の好ましい及びそのような長鎖の好ましいアシル−キャリヤーチオエステラーゼの間の保存されたアミノ酸又は核酸配列が特に興味の対象である。植物チオエステラーゼを得るためにそのような保存された配列を用いる方法が記載される。第１の態様において、本発明は、植物チオエステラーゼをコードする核酸配列に向けられる。これは、生物学的に活性な恥部チオエステラーゼをコードする配列及び形質転換又はクローニング中間体のためのヘクターをプローブとして使用される予定である配列を包含する。生物学的に活性な配列は、種々の構造体に見出される転写ｔＡ　！ｆｆ　領域に関してセンス又はアンチセンス配向で見出され得る。植物チオエステラーゼをコードする配列は、意図された使用に依存して完全な又は部分的な配列をコードすることができる。ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、前駆体植物チオエステラーゼ又は成熟植物チオエステラーゼのすべて又は一部が意図される。植物チオエステラーゼ配列の転写又は転写及び翻訳（発現）を提供することができる組換えＤＮＡ構造体が特に興味の対象である。特に、植物宿主細胞において転写又は転写及び翻訳することができる構造体が好ましい。そのような構造体は、植物の種子組織において優先的に発現される遺伝子から得られる転写開始領域を包含する種々の１１節領域を含むことができる。第２の観点において、本発明は、宿主細胞、特に植物宿主細胞におけるそのような構造体の存在に関する。異なった観点において、本発明は、発現された植物チオエステラーゼをそこに有するトランスジェニック宿主細胞に間する。さらに異なった観点において、本発明は細胞における構造体の発現を通して宿主細胞又はその子孫に植物チオエステラーゼを生成するための方法に関する。植物チオエステラーゼをコードする配列の生成の結果として植物チオエステラーゼを含む細胞がまた、本明細書において意図される。異なった態様において、本発明は、細胞、特に植物細胞内に生成される遊離脂肪酸の割合の変性のために植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列を用いる方法に関する。そのような変性された遊離脂肪酸組成物を有する植物細胞がまた、本明細書に言及される。本発明のもう１つの観点においては、中ぐらいの鎖を好む植物チオエステラーゼタンパク質及びそれに関係する配列、たとえばアミノ酸及び核酸配列が企画される。他の植物タンパク質を実質的に有さない中ぐらいの鎖を好むアシル−キャリヤーチオエステラーゼが記載されている。アシル−アシルキャリヤータンパク’ ｆ　（ＡＣＰ　）に対して選択的な加水分解活性を示す、中ぐらいの鎖を好むアシルーキ中リヤーチオエステラーゼが特に興味の対象である。そのようなタンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列が記載される。さらに、中ぐらいの鎖を好むアシル−キャリヤーチオエステラーゼを利用して中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸を生成する方法が提供される。本明細書に例示される植物チオエステラーゼは、ウンベルラリア力すホルニカ（ υｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）　（ゲ・ノケイジュ）、クツエア　ツーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ　ｈｏｏｋｅｒｉａｎａＨＣｕｐｈｅａ）及び力／Ｉｚタフ７１゜チンクチオリウス（Ｃａｒｔｈａａ＋ｕｓ　ｔｉｎｃｔｉｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）のチオエステラーゼを包含する。これらの例示されたチオエステラーゼは、本発明の他の植物チオエステラーゼを得るために使用され得る。発明の詳細な説明本発明の植物チオエステラーゼは、植物酵素反応性条件下で脂肪アシル−キャリヤー基質から遊離脂肪酸の生成を触媒する能力を示す、植物源から得られるアミノ酸、たとえばタンパク質、ポリペプチド又はペプチドフラグメントのいづれかの配列を含む、″′酵素反応性条件”とは、いづれか必要な条件が、酵素の機能を可能にするであろう環境（すなわち温度、ｐｌ、阻害物質の欠失のような要因）において利用できることを意味する。特定の鎖長脂肪アシル−キャリヤー基質に対する植物チオエステラーゼの選択的活性は、異なった鎖長基質当たりに得られる遊離脂肪酸生成物の量の比較に基づいて決定される。たとえば、゛Ｃ１２を好む″とは、酵素調製物の加水分解活性が、異なったアシル炭素の長さの他の基質よりも、ラウロイル、及びたぶんデカノイルを好むことを示す。同様の態様において、“Ｃ１，Ｏを好む”活性を有する植物チオエステラーゼは、異なったアシル炭素の長さの他の基質よりも、デカノイル基質及びたぶんオクタノイルに対してより高い活性レベルを示すであろう。有意に低い程度の活性が他の鎖長の脂肪アシル基質に対して観察され、すなわち特異性が実質的であるが、しかし絶対的ではないことが注目される。上記のように、本発明の植物チオエステラーゼは、脂肪アシル−キャリヤー基質に対して活性を示すであろう、植物細胞における脂質の生合成の間、脂肪酸は典型的には、ＡＣＰ又は補酵素Ａ　（ＣｏＡ）キャリヤーに共有結合される。アシル−ＡＣＰ基質に対して選択的な活性を示す植物チオエステラーゼは、それらが未熟の胚プラスミドにおいてＦＡＳ路に密接して関与される傾向があるので特に好ましい。しかしながら、たとえばアシル−ＣｏＡ基質又は他の合成基質に対する活性もまた、本明細書において企画される。他の植物チオエステラーゼは、本明細書に提供される特定の例示されるタンパク譬調製物及び配列から得られる。さらに、合成タンパク質型のための変性アミノ酸配列及び出発材料を包含する天然及び合成植物チオエステラーゼを、それらの例示された植物チオエステラーゼ、及びそのような例示された配列の使用を通して得られる植物チオエステラーゼから得ることができることは明らがあろう。変性アミノ酸配列は、そのような配列は部分的に合成されていても又は完全に合成されてようと、突然変異誘発された、切断された、拡張された及び同様にされた配列を包含する。タンパク質又は配列を得るために使用される方法にかかわらず、植物調製物から実際に精製され、又はそれらと同一であり又はそれらと同一のタンパク質をコードする配列が、天然において由来すると思われる。従って、当業者は、抗体調製物、核酸プローブ（ＤＮＡ及びＲＮＡ）及び同様のものが種々の植物源から調製され、そして“相同”又は゛関連する″チオエステラーゼをスクリーンし、そして回収するために使用され得ることを容易に認識するであろう、典型的には、核酸プローブは、好ましくは放射能による検出を可能するためにラベルされる（但し、酵素又は他の方法もまた使用される）、免疫学的スクリーニング方法に関しては、抗体調製物、たとえばモノクローナル又はポリクローナル抗体が使用される。低い特異性であるが、ポリクローナル抗体が典型的には、遺伝子単離においてより有用である。検出に関しては、抗体が放射能又は市販されている種々の第２抗体／酵素接合体システムのいづれか１つを用いてラベルされる。いくつかの市販の抗体検出システムの例は、０ｂｅｒｆｉｌｄｅｒ　（Ｆｏｃｕｓ　（１９８９）ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　１１　：　１〜５　）により記載される。相同配列は、同一の配列が存在する場合に見出され、そして配列情報、核酸又はアミノ酸の比較に基づいて、又は既知のチオエステラーゼと候補体源との間でのハイブリダイゼーシッン反応を通して決定され得る。保存性変化、たとえばＧｌｕ／Ａｓｐ、　Ｖａｌ／Ｉｌｅ、　Ｓｅｒ／Ｔｈｒ。Ａｒｇ／Ｌｙｓ及びＧｉｎ／Ａｓｎがまた、配列の相同性を決定する際に考慮され得る。典型的には、長い核酸配列は、標的配列と存在でき、そして関連すると思われるいづれかの欠失を排除する一定の対象の植物チオエステラーゼとの間で、５０〜６０％の配列の同−性及びより好ましくは少なくとも約７０％の配列の同一性を示す、アミノ酸配列は、２種の完全成塾タンパク質間で２５％はどの配列同一性で相同であると思われる。一般的には、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｒ，Ｆ、、　ＯＦ　ＩＩＲＦｓ　ａｎｄ　０ＲＦＳ（Ｌｌｎｊｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｂｏｏｋ、　ＣＡ＋　１９８６）を参照のこと。対象の植物候補体源から調製されるゲノム又は他の適切なライブラリーは、相同的に関連する配列を同定するために植物チオエステラーゼからの保存配列によりプローブされ得る。より短いプローブ配列が同定されない場合に、完全なｃＤＮＡ又は他の配列が使用される。次に陽性クローンが、制限酵素消化及び／又は配列決定により分析される。ゲノムライブラリーが使用される場合、コード領域及びそ給する１又は複数の配列が同定され得る。プローブは、完全な配列よりも相当に短い、オリゴヌクレオチドも使用され得るが、しかし少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも２０個の長さのヌクレオチドのものであるべきである。より短い長さの領域が比較のために使用される場合、より高い程度の配列同一性が、より長い配列に関してよりも必要とされる。より短いプローブは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のために、特に高い保存性配列が同定され得る場合に特に有用であるａ　（Ｇｏｕ＋ｄ、など、　、ＰＮＡＳＵＳＡ（１９８９）　８６　：　１９３４〜１９３８を参照のこと）。より長い核酸フラグメント（＞　１００ｂｐ）がプローブとして使用される場合、特に完全な又は大きなｃＤＮＡ配列を用いる場合、２０〜５０％の偏差、すなわち相同配列を伴って、標的サンプルからシグナルを得るために、低い緊縮性（たとえばプローブの溶融温度以下の４０〜５０’Ｃ）によりスクリーンすることができる＊　（Ｂｅｌｔｚ＋　など、　、Ｆ４ｅｔｈｏｄｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ　（１９８３）　１００　：　２６６〜２８５を参照のこと）。好ましい、Ｌｌｉ様においては、本発明の植物チオエステラーゼは、例示された植物エステラーゼ、又は植物チオエステラーゼ配列から得られた植物チオエステラーゼの少なくとも８個のアミノ酸の配列に関して、少なくとも約３０％の配列同一性、及びより好ましくは少なくとも約５０％の配列同一性を有する。他方、本発明の植物チオエステラーゼは、例示された植物チオエステラーゼ、又は一定の植物チオエステラーゼ配列から得られた植物チオエステラーゼに関して、少なくとも約６５％の配列同一性及びより好ましくは少なくとも約７５％の配列相同性を有するであろう。゛特に、ゲッケイジュのチオエステラーゼ（第４Ａ又はＢ図を参照のこと）のアミノ酸又は核酸配列、又は第９表のベニバナのアミノ酸配列（Ｎ１４）から得ることができ、るチオエステラーゼが特に好ましい、植物チオエステラーゼは、長い又は短い鎖の脂肪アシル基質に対して選択的な活性を有することができる。長鎖を好む脂肪アシル加水分解活性又は中ぐらいの鎖を好む脂肪アシル加水分解活性を存する植物チオエステラーゼは、下記にさらにより詳細に説明され゛るような理由のために、両者とも相同的に関連するタンパク質と思われる。再び、第４図及び第９表に示されるような配列が相同の植物チオエステラーゼを同定するために使用され得るのみならず、また、それらから得られる配列は、他の植物源から植物チオエステラーゼを得るための追加の方法も提供することができる。特に、ＰＣＲは、本明細書に提供される配列データから関連する植物チオエステラーゼを得るための有用な技法であり得る。当業者は、配列の比較又は典型的に高く保存された配列の領域に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを企画することができるであろう。第９表の５８２８又は５８２９フラグメントに基づくプローブが特に興味の対象である。それらのプローブを用いてのＰＣＩ？反応のための企画及び方法に関する詳細は、例により十分に説明されている。種々の源の植物チオエステラーゼは、広範囲の植物及びインビボ適用において植物脂肪酸生合成の連鎖停止出来事を研究するために使用され得ることがまた注目されるべきである。すべての植物は共通する代謝路を通して脂肪酸を合成すると思われるので、異種植物宿主への１つの植物チオエステラーゼの研究及び／又は適用は、種々の種において容易に達成され得る。他の適用において、植物チオエステラーゼは、インビトロでｔＩＩ製された脂肪酸の生成を高め、そして／又はその組成を変性するために、チオエステラーゼの天然の植物源外のブラスチド溶解物と共に使用され得る。核酸配列が得られた後すぐに、宿主細胞における植物チオエステラーゼの転写、又は転写及び翻訳（発現）は、酵素の容易な源を生成し、そして／又はそこに見出される脂肪酸及び／又はトリグリセリドの組成を変性することを所望される。他の有用な適用は、宿主細胞がインビトロ及びインビボで植物宿主細胞である場合に見出され得る。たとえば、植物ＦＡＳ複合体に利用できるそれぞれの短鎖を好むチオエステラーゼの量を高めることによって、高められた％の短鎖脂肪酸が供給され得る。同様の態様において、いくつかの適用に関して、アンチセンス技法により植物細胞に内因的に発現される短鎖を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの量を低め、たとえば長い鎖の脂肪酸の％を高めることが所望され、そして逆もまた真である。１９８８年８月３０日に出願された同時継続出願アメリカ特許第２４０．４０８号を参照のこと、与えられた脂肪−アシル基質に対する植物チオエステラーゼの特異性が高まるほど、ＦＡＳシステムにおいてよりＩＩＪｉＢを及ぼすことが可能である。ぐらいの′を　む　チオエステー−ゼ本発明によれば、植物における中ぐらいの鎖の脂肪酸の生合成のための機構が示される。すなわち、中ぐらいの鎖のアシル基質に対して選択的な活性を有する特異的植物チオエステラーゼは、少なくともいくつかの植物種における中ぐらいの鎖の脂肪酸の蓄積物に含まれる。鎖長特異的植物チオエステラーゼが中ぐらいの鎖の脂肪酸のインビボ生成において活性的である決定は、酵素植物源のためのいくつかの可能性を示唆する。事実、中ぐらいの鎮の脂肪酸は、いくつかの天然の植物種に多く見出される。たとえば、クツエア属におけるいくつかの種、たとえばプロクンベンス（ｐｒｏｃｕｎ＋ｂｅｎｓ）、ルチア（ＩｕＬｅａ）　、ツーケリアナ、ヒソビフォリア（ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）、リグヒチ（ｗｒｉｇｈｔｉｉ）及びインフラタ（ｆｆｌａｔａ）は、そらの種子に中ぐらいの鎖の脂肪酸を含むトリグリセリドを蓄積する。中くらいの鎖の脂肪酸のもう１つの天然の植物源は、ラウラセアエ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）科：たとえばカリホルニア　ゲノケイジュ（ウンヘルラリア　力リホルニカ）、ピサ（Ｐｉｓａ）　（アクチットフェン　ツーケリ（Ａｃｔｉｎｏｄｏｐｈｎｅｈｏｏｋｅｒｉ））　、スィート　ゲンケイジュ（ラウラス　ノビリス（Ｌａｕｒｕｓｎｏｂｉｌｉｓ））及びシナモミラム　カンフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕ＋ｉ　ｃａｍｐｈｏｒａ）（ショウノウ）の種子である。他の植物源は、ウルマセアエ（Ｕｌｍａ−ｃｅａｅ）　（−１−レ）、ミリスチカセアエ（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｅａｅ）　、シマルバセアエ（Ｓｉｍａｒｕｂａｃｅａｅ）、ボキシアセアエ（Ｖｏｃｈｙｓ　１ａｃｅａｅ）及びサルバドラセアエ（Ｓａ　Ｉｖａｄｏｒａｃｅａｅ）を包含する。そこに中ぐらいの鎖の脂肪酸の有意な存在を有する植物は、天然由来の中ぐらいの鎖を好む植物チオエステラーゼを得るための好ましい候補体である。しかしながら、中ぐらいの鎖の脂肪酸の存意な存在を有さない他の植物源が他の酵素源として容易にスクリーンされ得ることもまた認識されるであろう。さらに、中ぐらいの鎖を好む内因性植物チオエステラーゼ間及び長鎖及び／又は短鎖を好む植物チオエステラーゼ間の比較は、合成の中ぐらいの鎖を好む植物チオエステラーゼを上記のようにして創造するためにタンパク質型又は他の変性のための洞察力を付与することができる。脂肪アンルーＡＣＰ基譬に対して選択的な加水分解活性を示す中くらいの鎖を好む植物チオエステラーゼが特に興味の対象である。Ｃ１２アシル−ＡＣＰ、ＣＩＯアシル−ＡＣＰ又はＣ８アシル−ＡＣＰ基質に対して明白な選択性を示す中ぐらいの鎖を好む植物チオエステラーゼが最っとも好ましい。上記のように、他の植物源もまた、タンパク質精製、核酸プローブ、抗体調製物、タンパク質型又は配列比較の使用によりそれらの酵素のための源を供給することができ、そしてそのような植物チオエステラーゼに対応するそれぞれのアミノ酸及び核酸配列が特に興味の対象である。また、また前記のように、核酸配列が一定の植物チオエステラーゼのために得られた後すぐに、追加の植物配列が比較され、そして／又はそれらに相同的に関連するＤＮＡ配列を得るためにプローブされ得る。中ぐらいの鎖を好むアシル−ＡＣＰ植物チオエステラーゼは、この後“ゲッケイジュ”として、時々言及されるカリホルニア　ゲッケイジュ（ウンベルラリア　力リホルニカ）及びこの後“クツエア”として時々言及されるクツエア　ツーケリアナの未熟胚から一部精製されて来た。ゲッケイジュのチオエステラーゼ酵素活性は、約３４ＫＤの見掛Ｍｒを有するタンパク譬又は１対のタンパク質と共に、クロマトグラフィー及び電気泳動分離において一定して同時移動する。約４２ＫＯの生来の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより評価され、酵素は３４ＫＤのサブユニットのモノマーであることを示唆した。固定されたＡＣＰ上でのアフィニティークロマトグラフィーは、精製方法において臨界段階を形成し、そして中ぐらいの鎖の酵責が１８：１−ＡＣＰに対して無視できる作用を有することを十分に確かめるために、１２：０〜ＡＣＰ及び１８　：　１−ＡＣＰチオエステラーゼを識別する。種子の成長の間、１２　：　０−ＡＣＰチオエステラーゼの誘発の時間経過は、子葉の脂肪アシル組成が酵素活性の初期出現で長鎖のアシル基から優先的にＣＩＯ及びＣ１２に突然変化することを示す。例において十分に示されるように、他の植物タンパク質を実質的に有さないカリホルニア　ゲノケイジュの中ぐらいの鎖の脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する選択的なヒドロラーゼ活性を有する植物チオエステラーゼ調製物は、次のようにして得られる：粉砕されたカリホルニア　ゲンケイジュの未熟胚の上清製画分が、硫酸アンモニウム分別にゆだねられ、続いて再溶解されたベレットのヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにかけられ、溶出された両分がカルボキシメチルセファロースクロマトグラフィーにかけられ、そしてさらに、固定されたＥ、コリ　ＡＣＰのカラム上でクロマトグラフィー処理される。３４ＫＤのおおよその分子量を有する１又は２Ｎのタンパク質が、種々のクロマトグラフィー又は電気泳動技法を通して酵素活性を伴って同時溶離し又は同時移動する。これらのタンパク質は、中ぐらいの鎖のチオエステラーゼに相当する。（また、Ｐｏ１− Ｉａｒｄなど、　、Ａｒｃｈｉｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９９１）　２８４：　３０６〜３１２（本明細書に引用により組込まれる）を参照のこと）。部分的に精製されたクツエアの０１０を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを得るための方法がまた例に記載される。クツエアのチオエステラーゼは、他の植物タンパク質から部分的に精製され、そして活性がゲノケイジュのチオエステラーゼと同じ一般的な手段で確かめられた。例に十分に記載されるように、種々の緩衝液及び技法は、ゲッケイジュ抽出に使用される緩衝液及び技法とは異なる。酵素活性が種々のアシル−ＡＣＰ基譬に対して比較され、そして他の中ぐらいの鎖のアシル−ＡＣＰ基質に比較して、ＣＩＯアシル−ＡＣＰ基質に対して存意により高い活性を示す。得られたクツエア調製物はまた、中ぐらいの鎖の脂肪アシル−ＡＣＰ５Ｍの他に、長鎖の基質に対してもまた活性を示すが、上記ゲノケイジュ及びクツエアの両調製物は、それらが中くらいの鎖の脂肪アシル−ＡＣＰ蟇質に対して認識できる明確な選択的活性を示すことにおいて、°°他の植物タンパク質と実質的に有さないと”思われる。得られる部分的に精製された調製物は、種々のパラメーター、たとえば、比較インヒビター研究及び基質特異性により特徴づけられ得るが、但しこれだけには限定されない。クツエア及びゲッケイジュ調製物の両者に関して、追加の及び／又は他の精製段階が、タンパク質抽出物を均質に精製し、収率を高め又は同様のことを実施するために所望され得る。さらに、これらのタンパク質の存在が確かめられ、そして記載される種々の性質、他の精製手段及び／又は追加の精製段階は、当業者の能力内に存在する。血Ω蓋宜チオエステラーゼまた本発明によれば、ベニバナ（カルタマス　チンクチオリウス）から得られる長鎖チオエステラーゼに関する配列情報も記載される。興味あることには、ヒマワリのチオエステラーゼから配列決定された少なくとも２種のペプチドフラグメントが、ゲソケイジュの中ぐらいの鎖を好むチオエステラーゼの部分と高い配列同一性を示すことが発見された。例により詳細に記載されているが、ベニバナのチオエステラーゼペプチドフラグメントは、酸沈澱物にアセトン粉砕ベニバナ胚をゆだね、続いてＡＣＰカラム及びクロマトフオーカシングカラム上でクロマトグラフィー処理することによって得られる。ＡＣＰカラムから得られるタンパク質と比較しての酵素活性ピークの分析を通して、２種のタンパクＷ（１つは約３４Ｋ１１であり、そして他の１つは約４０Ｋｌ＋である）が、追加の分析のために選択された。シアノゲンブロミドブロッチングの後に配列決定されたフラグメントが、例１４の第９表に示される。特に、３４ＫＤのバンドに対応する配列決定されたすべてのフラグメントが４．０　Ｋ　Ｄバンドで検出されたことが見出された。さらに、３４にＤ生成物は、４０ＫＤ生成物と同じＮ末端を共有するように思われる。第９表からの種々のフラグメントの位置を予測する図的な代表が第５図に見出される。さらに、ゲンケイジュのチオエステラーゼアミノ酸配列のセグメントが、少なくとも２種の配列決定されたフラグメント、５８２８及び５８２９と高い配列同一性を示すことが見出された。゛　−工　への゛当業界において良く知られているように、植物チオエステラーゼが得られた後、それ番よ、その対応するアミノ酸及び／又は核酸配列を得るために使用され得る。代表的な例として、アミノ酸配列は、ゲルから回収されるタンパク質プロットのプロテアーゼ部分消化に起因するペプチドフラグメントの配列決定により得られる。配列決定のためには、二次元ゲルの使用が一次元ＳＤＳ　−ＰＡＧＥゲルよりも所望される。ペプチドフラグメントは、アミノ酸配列を推定するために使用され得、そして結果的に、アミノ酸配列が得られる。このアミノ酸配列から、情報が逆翻訳され、そして核酸プローブがＰＣＲ工程への使用のために又は遺伝子の回収におけるプローブとしての使用のために合成され得る。さらに異なった例として、精製されたタンパク質は、それらに対する抗体を高めるために使用され得る。抗体、ポリクローナル又はモノクローナル抗体はまた、他の免疫学的に関係する植物チオエステラーゼ遺伝子を単離するためにも使用され得る。他の方法もまた、当業者によく知られている方法により明らかであろう。たとえば、植物チオエステラーゼをコードする核酸配列は、追加の配列を得るためにプローブとして種々の構造体に使用され得る。他方、これらの配列は、インビトロ又はインビボでの酵素の回収又は研究のために宿主細胞における対象のそれぞれのチオエステラーゼのレベルを高めるために、又は宿主細胞が植物体、たとえば植物Ｈ１ｍ、植物部分（たとえば種子、切断部分又は組織であるが、これだけには限定されない）及び植物である場合、いくつかの適用のために対象のそれぞれのチオエステラーゼのレベルを低めるために、適切な調節配列と共に使用され得る。ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列を包含する。′コードする”とは、配列がセンス又はアンチセンス配向において特定のアミノ酸配列に対応することを意味する。“染色体外”とは、配列が、それが天然において関係される植物ゲノムの外部に存在することを意味する。ｕ組換え体”とは、配列が、突然変異誘発、制限酵素及び同様のものによる操作を通しての遺伝子工学的変性体を含むことを意味する。　ｃＤＰＪＡ配列は、プレープロセッシング配列、たとえば変異ペプチド配列を含んでも良く又は含まなくても良い、変異ペプチド配列は、一定の細胞小器官へのタンパク質の輸送を促進し、そしてその細胞小器官への侵入に基づいてアミノ酸成分から切断され、“成熟”配列を開放する。前駆体ＤＮＡ配列の使用は、植物細胞発現カセットにおいて好ましい。他のブラスチド変異ペプチド配列、たとえば種子＾ＣＰの変異ペプチドが、対象の種々の細胞小器官に本発明の植物チオエステラーゼをトランスロケートするために使用され得る。　１９８９年１１月１５日に出願されたアメリカ特許第０７／４３７．７６４号及びヨーロッパ特許出願第１８９．７０７号を参照のこと、同様の態様において、与えられた植物チオエステラーゼ変異ペプチドが得られた後、これは、その生来のコード領域以外の配列をトランスロケートするために使用され得る。さらに、上記のように、植物チオエステラーゼの完全ゲノム配列は、プローブ、たとえばｃＤＮＡプローブによりゲノムライブラリーをスクリーンし、そして種子組織において発現を調節するそれらの配列を単離することによって得られる。この１！様においては、植物チオエステラーゼの転写及び翻訳開始ＭＭ、イントロン及び／又は転写停止領域が、チオエステラーゼ構”造遺転子を伴って又は伴わないで、種々のＤＮＡ構造体への使用のために得られる。従って、本発明の植物チオエステラーゼに対応する核酸配列はまた、プラスミドへの輸送を指図するために有用なシグナル配列、有用な組織及びタイミングプロフィールを有する５ ′上流の非コード調節領域（プロモーター）、転写及び翻訳調節領域として有用な３′下流の非コード調ｔｆｆ領域を提供し、そして遺伝子の他の特徴へ研究を導びく。所望する植物チオエステラーゼの核酸配列が得られた後、それは種々の方法で操作され得る。配列が非コードフランキング領域を含む場合、そのフランキング領域は、切断、突然変異誘発、等にゆだねられる。従って、転位、トランスバージテン、欠失及び挿入が天然に存在する配列上で行なわれ得る。さらに、すべての又は一部の配列が合成され得る。構造遺伝子においては、１又は複数のコドンが変性されたアミノ酸配列を供給するために変性され、又は１又は複数のコドン変異が便利な制限部位、又は構成又は発現に関与する他の目的を提供するために導入され得る。構造遺伝子は、合成アダプター、工又は複数の便利な制限部位を導入するためのリンカ−１又は同様のものを用いることによってさらに変性され得る。本発明の植物チオエステラーゼをコードする核酸又はアミノ酸配列は、種々の方法で、他の非生来の又は“異種”配列と共に組合され得る。゛異種”配列とは、天然において一緒に連結されることが見出されていない同じ植物からの核酸配列の組合せを含む、Ｍ物チオエステラーゼに天然において連結されることが見出されていないいづれかの配列を意味する。本発明の植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列は、そのチオエステラーゼに通常関係される遺伝子配列のすべて又は一部と共に使用され得る。その成分部分においては、チオエステラーゼをコードするＤＩＩＡ配列が、宿主細胞において転写及び翻訳を促進することができる転写開始制御領域、植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列、及び転写及び翻訳停止領域を、転写の５′から３ ′の方向に有するＤＮＡＩＩＩ造体に組合される。可能な宿主細胞は、原核及び真核細胞を包含する。宿主細胞は、単細胞であり得、又は使用目的に依存して分化された又は分化されていない多細胞生物に見出され得る０本発明の細胞は、そこに存在する野生型細胞に対して外来性の植物チオエステラーゼを有することによって、たとえばそこに植物チオエステラーゼをコードする組換え核酸構造体を有することによって区別され得る。宿主に依存して、調節領域、たとえばウィルス、プラスミド又は染色体遺伝子、又は同様のものからの領域は変化するであろう。原核又は真核微生物、特に単細胞宿主における発現のためには、広範囲の種類の構成的又はｇＩｗＩ可能なプロモーターが使用され得る。微生物における発現は、植物酵素の源を提供することができる。記載されて来た転写開始領域の中には、細胞及び酵母宿主、たとえばＥ。コリ、Ｂ、サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）、サツカロミセス　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｅａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｆａｅ）からの領域（遺伝子、たとえばβ−ガラクトシダーゼ、Ｔ７ボリメラーゼ、トリプトファンＥ及び同様のものを包含する）が存在する。大部分、構造体は、植物チオエステラーゼの変性された生成及びたぶん、脂肪酸組成の変性を提供する植物において機能的な調節領域を包含するであろう。植物チオエステラーゼ又はその機能的フラグメントをコードする読み取り枠は、その５′末端で、転写開始調製領域、たとえばチオエステラーゼ構造遺伝子に対して５′上流に天然において見出される野生型配列に連結されるであろう、広範囲の種類の構成的又はｍ！ｆｆ可能な、たとえば誘発可能な、構造遺伝子機能の転写を提供する多くの他の転写開始領域が利用できる。植物のために使用される転写開始領域のなかには、たとえばナバリン及びマンノビンンンターゼのための構造遺伝子、又はナビン、ＡＣＰプロモーター及び同様のものに関係するような領域が存在する。そのような構造遺伝子に対応する転写／翻訳開始領域が、それぞれの開始コドンに対してすぐ５′上流に見出される。チオエステラーゼタンパク質の発現が植物宿主において所望される態様においては、完全植物チオエステラーゼ遺伝子のすべて又は一部の使用が所望され；すなわち構造遺伝子配列及び３′ 下流の非コード領域と共に５′上流の非コード領域（プロモーター）のすべて又は一部が使用され得る。異なったプロモーター、たとえば対象の植物宿主に生来のプロモーター又は対象の植物チオエステラーゼをコードする配列を包含する、１つの遺伝子源に由来する転写開始及び異なった遺伝子源に由来する翻訳開始領域を存する変性されたプロモーター、又は増強されたプロモーター、たとえば二重３５３　ＣａＭＶプロモーターが所望される場合、その配列は、標準技法を用いて一緒に連結され得る。５′上流の非コード領域が、種子の成熟の間、ｌ！節された他の遺伝子から得られる場合のような通用のためには、植物の胚Ｍ織に選択的に発現されるもの、たとえばＡＣＰ及びナビン由来の転写開始制御領域が所望される。そのような“種子特異的プロモーター”が得られ、そして１９８８年１月２５日に出願されたアメリカ特許第０７／１４７．７８１号（現在、１９９０年７月９日に出願されたアメリカ特許第０７１５５０、８０４号）及び＋Ｎｏｖｅｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ　Ｅａｒｌｙ　５ｅｅｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｈｅｒｅｔｏ’の標題を有する、１９９０年３月１６日に出願されたアメリカ特許第０，７／４９２．７２２号）（これらは引用により本明細書に組込まれる）の技法に従って使用され得る６種子＆ｌｌ織に選択的に発現される、すなわち他の植物部分に検出できない転写開始領域は、遺伝子生成物のいづれかの破壊的又は逆効果を最少にするために、脂肪酸変性のために所望されると思われる。調節転写停止領域はまた、本発明のＤＮＡ＠遺体に供給され得る。転写停止領域は、植物チオエステラーゼ又は種々の遺伝子源に由来する便利な転写停止領域、たとえば転写開始領域に天然において関与されない転写停止領域をコードするＤＮＡ配列により提供され得る。転写停止領域が異なった遺伝子源からである場合、それはその停止領域が由来する構造遺伝子に対して３′側の少なくとも約０．５ｋｂ、好ましくは約１〜３ｋｂの配列を含むであろう。高められた又は低められたその発現のために対象のＤＮＡ配列として植物チオエステラーゼを有する植物発現又は転写構造体が、広範囲の種類の植物生命、特に食用及び産業使用のための植物油の生成に包含される植物生命を伴って使用され得る。適切な油用種子収穫物が特に好ましい。対象の植物は、ナタネの種子（カノラ（Ｃａｎｏｌａ）及び高エルカ酸種）、ベニバナ、占嘘＃−午綿、クツエア、ダイズ、ビーナツツ、ココナツツ及びヤシ、並びにトウモロコシを包含するが、但しこれだけには限定されない。宿主細胞中に組換え構造体を導入するための方法に依存して、他のＤ）ＪＡ配列が必要とされる。重要なことには、本発明の双子葉及び重子集積に適用でき、そして新規及び／又は改良された形質転換及び調節技法に容易に適用できるであろう。形質転換方法は本発明において臨界ではなく；植物形質転換の種々の方法が現在利用できる。新規方法が収穫物を形質転換するために利用できるので、それらは本発明において直接的に適用され得る。たとえば、アグロバクテリウム感染に対して天然において敏感な多くの植物種は、アグロバクテリウム介在形質転換の三元又は二元ベクタ一方法を通して好都合良く形質転換され得る。さらに、種々の重子及び双子植物種の形質転換を可能にするマイクロインジエクシラン、ＤＮＡ粒子衝撃、エレクトロポレーションの技法が開発されて来た。ＤＮＡ構造体の開発においては、その構造体の種々の成分又はそのフラグメントが、細菌宿主、たとえばＥ、コリにおいて複製できる便利なりローニングベクター中に通常挿入されるであろう。文献に記載されて来た多くのベクターが存在する。個々のクローニングの後、プラスミドは単離され、そして所望する配列の成分を適合せしめるために追加の操作、たとえば制限、新規フラグメントの挿入、連結、欠失、挿入、再切断、等にゆだねられる。構造体が完結せしめられた後、次にそれは、宿主細胞の形質転換の態様に従って追加の操作のために適切なベクターに移される。通常、ＤＮＡ構造体と共に、宿主における発現のための必要な調節領域を有し、そして形質転換細胞の選択を提供する構造遺伝子が含まれるであろう、その遺伝子は、細胞毒性物質、たとえば抗生物質、重金属、毒素、等に対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養性を提供する補充、ウィルス免疫性又は同様のものを提供することができる。種々の宿主種の数に依存して、発現構造体又はその成分が導入され、１又は複数のマーカーが使用され、ここで選択のための種々の条件が種々の宿主のために使用される。ＤＮＡコードの縮退が、いくつかのコドン置換がアミノ酸配列のいづれか対応する変性を伴わないでＤＮＡ配列において可能にされることを提供することが注目される。いづれかの非植物由来のＤＮＡ配列が植物宿主細胞において発現される場合、“ 植物の好むコドン”の使用が所望される。上記のように、ＤＮＡ構造体が植物宿主中に導入される！！様は本発明において臨界ではない、効果的な形質転換を提供するいづれかの方法が使用され得る。植物細胞形質転換のための種々の方法は、Ｔｉ−又はＲｉ−プラスミド、マイクロインジエクシゴン、エレクトロポレーション、ＤＮＡ粒子衝撃、リポソーム融合、ＤＮＡ１ｉｉｌ！、又は同様のものの使用を包含する。多くの場合、特に左及び右ボーダー、より特定には右ボーダーを有するＴ−ＤＮＡにより片又は両側上に隣接される構造体を有することが所望されるであろう、これは、Ｔ−［ＩＮＡボーダーは形質転換の他の態様により使用され得るが、構造体が形質転換のためにＡ、ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕ＠ｅｆａｃｉｅｎｓ）又はＡ、リゾゲネス（Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用する場合に特に有用である。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ）が植物細胞形質転換のために使用される場合、アグロバクテリウム宿主に存在するＴ−ＤＮＡ又はＴｉ−又はＲｆ−プラスミドによる相同的組換えのためにアグロバクテリウム中に導入され得るベクターが使用され得る。形質転換のためのＴ−ＤＮＡを含むＴｉ−又はＲｉ−プラスミドは武装され得（ガル形成を引き起こすことができる）又は武装解除され（ゲル形成を引き起こすことができない）、後者はｖｉｒ遺伝子が形質転換されたアグロバクテリウム宿主に存在する限り可能である。武装されたプラスミドは、正常な植物細胞及びガルの混合物を付与することができる。アグロバクテリウムが植物細胞を形質転換するためのベクターとして使用される場合、Ｔ−ＤＮ＾ボーダーに隣接される発現構造体が広い宿主範囲のベクター中に挿入され、ここで前記広い宿主範囲のベクターは文献に記載されている。　ｐＲＫ２又はその誘導体が通常使用される。たとえば、Ｄｉｔｔａなと、　、ＰＮＡＳ　ｌｌ５Ａ、　（１９８０）　７７　：　７３４７〜７３５１及びＥＰＡ　０１２０５１５（これらは引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。発現構造体及びＴ−ＤＮＡと共に、形質転換されたアグロバクテリウム及び形質転換された植物細胞の選択を可能にする工又は複数のマーカーが含まれるであろう。多くのマーカー、たとえばクロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマインシ又は同様のものに対する耐性が、植物細胞に使用するために開発されて来た。使用される特定のマーカーは本発明において、必須ではなく、１つの又は他のマーカーが、特定の宿主及び構成の態様に依存して好まれる。アグロバクテリウムを用いての植物細胞の形質転換に関しては、外植片が組合され、そして形質転換されたアグロバクテリウムと共に形質転換のための十分な時間インキュベートされ、細菌が殺され、そして植物細胞が適切な選択培地中で培養される。カルスが形成した後すぐに、苗条形成が既知方法に従って適切な植物ホルモンを用いることによって促進され、そして苗条が植物の再生のための根用培地に移される０次に、植物は種子に成長し、そしてその種子を用いて反復再生を確立し、そして植物油が単離される。本発明は一般的に記載され、そして本発明の目的のために含まれる次の例により容易に理解されるが、しかしそれは本発明を制限するものではない。 ■ 次の実験において、特にことわらない限り、すべての温度は°Ｃであり、重量はｇ、ｗｇ又はμｇであり、濃度はＭ、ｍＭ又はμＭであり、そしてすへての体積は！、μｌ又はｉである。［１−ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼアッセイＣＩ２チオエステラーゼ活性についてアッセイするために、次の混合物を３０℃で３０分間インキュベートするニアｍＭのＫＨｇＰＯ４−ＫＯＨ、ｐＨ８，２０％ν／Ｖのグリセロール、ｌｆｆ１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１％ν／Ｖの丁ｒｉｔｏｎ　Ｘ１００を含む“緩衝液”　；例２に記載される“抽出緩衝液”と同じ又は類似する緩衝液における活性のために試験されるべきサンプル；及び１００ μ２の合計体積及び０．５μＭの最終ラウロイル−ＡＣＰ　ｆｉ度のための１４０−放射性ラベルされたラウロイル−ＡＣＰ基質５ｔｔ１．ラウロイル−ＡＣＰ基質を、Ｒｏｃｋ　ａｎｄ　Ｃｒｏｎａｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｆｆｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８１）　７１　：　３４１−３５１＞の方法によりＥ。１ｏｇｙ　（１９８１）　７２：　３９７−４０３）の方法に従って調製する。ラウレートのカルボキシレート基を、５０〜６０μＣｉ／μモルの放射能で放射性ラベルする。反応を、冷たい（０°Ｃ）の１０％Ｖ／Ｖ酢酸０．５ａｄの添加により停止する。加水分解酵素作用の脂肪酸生成物を、ジエチルエーテル１ｍを添加し、そして激しく混合することによって未加水分解基質から抽出する。数分間の沈降の後、上部のエーテル層を、液体シンチレーション分光計による放射能の決定のためにシンチレーション流体５ｉｄに移す、追加のエーテル抽出を行ない、所望により酵素活性のより正確な定量化のために残存する微量の反応生成物を回収する。エーテル抽出された放射能の量は、酵素の量が基質の約２５％以上を加水分解するのに十分でない場合、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の直接的な測定である。これよりも高い活性で、エーテル層における放射能と酵素の量との間の関係が著しく非直線的になる。次に酵素調製物を、アッセイの直線範囲に活性をするために適切に希釈すべきである。活性は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてのエーテル可溶性生成物の分析によりチオエステラーゼであることが確証される。生成物は、シリカＴＬＣプレート（溶媒二８０％ヘキサン、２０％ジエチルエーテル、１％酢酸、Ｖ／Ｖ）上で純粋なラウレートと同時移動する。フェナシルエステルが、アッセイ工程からのエーテル生成物含有層を用いて調製される場合（Ｂｏｒｃｈ、Ｒ，Ｆ、＋　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７５）４７　：　２４３７〜２４３９）　、その得られた放射性スポットは、ラウロイル＝ＡＣＰ基質の塩基加水分解の生成物と闘じように、Ｃ１１ｌｌ　ＴＬＣプレート（溶媒：１００％メタノール）上で純粋なラウロイルフエナシルエステルと同時移動する。これらの観察は、酵素反応のエーテル抽出された生成物が遊離ラウレートであることを確証する。対象の酵素はチオエステル結合を分解し、たとえばそれは基質のＡＣＰ成分を攻撃するプロテアーゼでなく、又はその生成物は、ＴＬｃ上で異なって移動したラウロイル−ホスホパンテティンであることがまた推測される。斑呈−ゲッケイジュチオエステラーゼの精製及び同定（ウンベルラリア　力リホルニカ）（“ゲッケイジュ″）の未熟種種子からの子葉を、他の種子部から切除し、そして−７０”Ｃで凍結保存する。これは、酵素抽出のための組織源を含んで成る。凍結された子葉を、ステンレス鋼の乳鉢及び乳棒を用いて約−７゜°Ｃで粉末化し、そしてその粉末を、必要とされるまで、流体窒素下で又は−７０°Ｃで貯蔵する。抽出は、５抛門のＫｆｌｚＰＯａ　ＫＯＨ，ｐＨ６，９，５顛門ノエチレンジアミンテトラアセテート（Ｅ［１ＴＡ）、２１ｇＦＩ（Ｄ　ＤＴＴ、ＩＩＩＭのナトリウムアスコルベート、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｔ！Ｍのロイペプチン及び１／／Ｍのベプステチンを含んで成る゛抽出緩衝液”４ｄを粉末１層当たりに０〜４℃で添加することによって達成される。粉末及び緩衝液の撹拌された混合物を、モーター付きの７セレーター（Ｂｒｉｎｋｍａｒ＋ｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、　ＮＹ）Ｐｏ１ｙＬｒｏｎ”。それぞれ４５秒の３回のバースト）でブレンドし、そして次に、４層のチーズクロスを通して濾過する。この及びすべての続く段階は０〜４°Ｃで行なわれる。得られた濾液を、約１４．ＯＯＯＸｇ　（最大）で３０分間、遠心分離する。上清法画分を、“Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ”　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ。Ｃｏｒｐ、＋　Ｌａ、Ｊｏｌｌ、ａ、　ＣＡ）を通して′ａ過し、そして得られた液体を゛粗抽出物”として言及する。粗抽出分を、次の通りにして硫酸アンモニウム分別にゆだねる。十分な固体硫酸アンモニウムを撹拌しながら、３０分間にわたって徐々に添加し、７０％の飽和を達成する０次に、その調製物をさらに３０分間撹拌する。上記のようにして遠心分離した後、ベレット化された材料を、抽出緩衝液（２ｄ／ｇの元の組織重量）に再懸濁し、そして溶解するまで、１０分間撹拌する０次に、硫酸アンモニウムを前記のようにして添加するが、但し５０％の飽和を達成するのに十分な時間である。前記のようにして遠心分離した後、上清法画分を捨てる。Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含むベレット化された材料を、液体窒素へ含浸により凍結し、そして次に、所望によりこの段階で、−７０° Ｃで貯蔵する。得られた材料を、“硫酸アンモニウム画分７として研究する。ひじょうに低いＣ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が、ベレットがひじょうに象、速に凍結される場合に失なわれる。必要により４℃に融解した後、ベレット材料を、５０ｒａＭのＫＨｔＰＯイーＫＯＬ　ｐＨ６，９，２５％０／／Ｖ）　ノグリセロール、１ｍＭ（７）ＤＴＴを含んで成る”ＨＡ　Ｉ　Ｍ衝液”　（ｌｄｌ１ｇ元の組織重量）に再懸濁する。再懸濁された調製物を、透析管（１２，０００〜１４，０００の分子量をカットオフする）に置き、そしてＩＩＡ　ｉｌｌ衝液に対して透析を開始する。（典型的には、子葉組織６００ｇかうの調製物は、少な（ともそれぞれ３時間、それぞれ４２の緩衝液に対して２回の連続的透析段階を必要とするであろう。）第１カラムに適用する前、透析された材料を、前記のようにして遠心分離し、そしてベレット化された材料を捨てる。後透析遠心分離からの上清法材料を、ＨＡ　ＩＭ衝液で平衡化されたヒドロキシアパタイトのカラム（ＩＢＦ　Ｂ＋ｏｔｅｃｈｎｉｃｓがらのＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ。カタログＮｏ、２４７７４１．　Ｓａｖａｇｅ、　ＭＤ；　５００〜１２００ｇの組織からの調製物のためには、典型的には１０ｃｍの直径Ｘ　１２．５ｃｎ＋のベッドの高さ）に通用する。次に、カラムを、２５０ｎ＋ｗでの溶出液の吸光度がもはや変化しなくなるまでｕＡＩ　Ｗｉ衝液により洗浄する。相当量のタンパク質及び時々、少量の、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性がカラムを結合するのに失敗し、そしてそれを通して洗浄される。多量の、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が結合し、そシテ４００ｒａＦＩ（ＤＫＨｚＰＯ，−ＫＯＨ１ｐＨ６，肌２５％（Ｗ／Ｖ）のグリセロール、１１のＤＴＴを含んで成る゛ＨＡ２緩衝液”を通用することによって溶離する。流出液を両分で集め（体積５〜１０ｄ）　、次にこれを、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性についてアッセイする。活性画分を組合し、そして上記のようにして、５ｍＭのＫＨ２ＰＯ，−ＫＯＩ（。ｐＨ６，５，２５％（Ｗ／Ｖ）のグ＋ＪセＣ１−）Ｌｉ、１　ｍＭ（７１ＥＤＴＡ、１　ｍＭ（７）ＤＴＴを含んで成る“ＣＭＩ緩衝液”に対して透析しく典型的には、それぞれ４２に対して少なくともそれぞれ３時間の３回の透析）。透析の後、その材料を、前記のようにして遠心分離により透明にし、ベレットをＩ舎てる。次に上清法画分を、ＣＭＩ緩衝液により平衡化されたカチオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、　Ｐｉｓｃａｔａｉｉａｙ＋　ＮＪ、カタログＮｏ、　１７−０７１９　０１．　］、、Ｏｃｍの直径Ｘ　１４ｃｍのベッドの高さ）に適用する。負荷の後、カラムを、２８０ｎｍでの流出液流の吸光度がもはや変化しなくなるまでＣＭＩ緩衝液により洗浄する。相当量のタンパク質及び有意なＮ（たとえば５０％）の、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性がカラムを結合するのに失敗し、そしてそれを通して洗浄される。Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのこの部分的結合を調べ、そして抽出の時点で、他の未同定タンパク質と共にこの酵素の凝集に起因することが見出される。実際、精製スケムのこの点まで、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの２種の集団、すなわち遊Ｍ＃素及び凝集体が存在する。カチオン交換カラムは、これらの２種の形を分離し、そして凝集体が捨てられる。Ｃ１２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの未凝集形を、５０＋ｓＭのにＨ□ＰＯ，−ＫＯＨ，ｐＨ６，９，１，５０ｙＨのＮａＣｌ２，２５％（Ｗ／Ｖ）　のグリセロール、１ｍＭのＨＤＴＡ、１１ＭのＩＩＴＴを含んで成る″ＣＭ２緩衝液 ”を適用することによってカラムから溶離する。流出液流を分別し、そして前記のようにしてアッセイし、そして活性画分をプールし、そしてＬｏｗ−のＫｌｈＰＯ４−ＫＯＨ，ｐＨ６，５，１５０１ＩＭ（７）　Ｍａｃｅ、　２５％（Ｗ／Ｖ）のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１　ｗＭのＤＴＴ、　０．１％（Ｗ／Ｖ）の３−（（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオゴー１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を含んで成る“へＣＰＩＩＩ衝液”に対して透析する。典型的には、それぞれ４１に対して少なくともそれぞれ３時間の２個の連結的透析が６００ｇの組織からの調製のために十分である。透析された材料を、次に、固定されたＡＣＰのカラム（２，５ｃｍの直径の充填の製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ−＋　Ｐ！ｓｃａｔａｗａｙ＋　ＮＪ）により供給される指示に従っ、て臭化シアン−活性化セファロース４已にＥ、コリを結合することによって製造される。Ｅ、コリＡＣＰば、例１におけるようにして調製される。使用の前、カラムをＡＣＰＩＩＩ街液により平衡化する。カチオン交換カラムか・らの透析された材料を、１〜１．３〆／分で適用し、８Ｉ１１の体積の両分を、その方法を通して集める。画分を、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性及び合計のタンパク質含存率についてクーマシーブルーアンセイ法（Ｂｉｏ−ＲａｄＩｎｃ、＋　ＦＮｃｈｍｏｎｔＬ　ＣＡ＋　カタログＮｏ、５００　０００１）を用いて分析する。実質的な量のタンパク質が、結合を伴わないでカラムを通して洗浄する。Ｃ１２を好むアシル−へＣＰチオエステラーゼ活性のほとんどすべてが結合する。カラムを、タンパク質アッセイが流出液流にタンパク質を検出しなくなるまで、ＡＣＰ］、Ｉｌ衝液により洗浄する１次に、それを、５０ｍＭのＫ）ＩＩＰＯ４−にＯｔｌ、　ｐＨ８，５，５０ｍＭのグリシン、２５％（Ｗ／Ｖ）のグリセａ　− Ｊし、１鵬門のＥＤＴＡ、１−門の［ｌＴＴ、　０．１％（Ｗ／Ｖ）　（７）　ＣＨＡＰＳを含んで成る”　ＡＣＰ２１１ｉ衝液”により洗浄する。この高いｐＨ洗浄は、非特異的に結合されるタンパク質を除去するように作用する。少量の、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性は、時々、それと共に同時溶離される。タンパク質アッセイが、タンパク質をもはや溶離しないことを再び示した後、線状″溶離グラジェント”を適用する。これは、”ＡＣＰ３Ｉ！ｌ衝液”（１０ｋＭのＫ）ｌｚＰＯａ　ＫＯＨ１ｐＨ６，９，２５％（Ｗ／Ｖ）のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１　ｍＭの［ｌＴＴ、　０．１％（Ｗ／Ｖ）　１７）ＣＨＡＰＳ）及び゛’ＡＣＰ４Ｊ３１衝液”　（５００ｍＦＩのＫＨｚＰＯ４−ＫＯＨ＋　ｐＨ６−９＋　２５％（Ｗ／Ｖ）のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１　ｍＭのＤＴＴ、　０．１％（Ｗ／Ｖ）　（７）ＣＨＡＰＳ）ノ５６０ｄの組合された体積を含んで成る。Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が、グラジェントが終結する場合、カラムからまた溶離している場合、その溶離は、一層のＡＣＰ４緩衝液を適用することによって完結され得る。集められた両分を前記のようにしてアッセイし、そしてＣ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの第２アツセイをまた、５０倍に希釈された百分により行なう。アッセイの非線状性を補足することによって、これは、最大の酵素活性のより正確な位置を付与する。ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性は典型的には、２つのピークとしてグラジェント溶離された画分に存在し、ここで小さい方のピークは、大きな方のピークのすく前でン容離する。個々のピークを含んで成る画分を、別々にプールする。大きな方の、後者の溶離ピークは、続く実験、タンパク質配列決定等のために使用される最も純粋な材料である。典型的なＳＯ３−ＰＡＧＥ法によるこの材料の分析は、約３４ＫＤでのおおよその分子量のバンドを包含するたった５〜６個の強く染色したバンド及び数種の弱く染色したバンドを示す。ＡＣＰカラムからの両分のアリコートを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）及び全染色法により分析する。溶離された活性のピークでのバンドパターンは、流出する及びＰＨ８，５で溶離される材料に対して著しく単純化される。バンドパターンは、１２；０−ＡＣＰチオエステラーゼ活性に関して強度が高まり、そして低くなるバンドを同定するために両分から画分に比較される。　３４Ｋｌ］のおおよその分子量に対応する１つのバンドパターンは、この基準を満たした。いくつかの調製物において、接近して間隔を保たれたタブレットが、ＳＯＳゲル上でのこの位置で見出される。他方、イオン交換クロマトグラフィー、固定化された染料クロマトグラフィー、及び活性ゲル電気泳動を包含する種々のクロマトグラフィー及び電気泳動技法が、ＡＣＰカラムからの実質的に精製された１２　：　０−ＡＣＰチオエステラーゼプールに適用され得る。それらのうちどれも、酵素を電気泳動的均質性に精製しない。しかしながら、すべての場合において、約３４ＫＤの分子量のバンド又は１対のバンドが、酵素活性を伴って同時溶離し、又は同時移動する。最良の分析が、Ｓ−セファロース、続＜　Ｂｌｕｅ　４アガロース上でのクロマトグラフィー処理により得られ、そして最っとも有益な分離が最後のＢｌｕｅ　４アガロースカラム上で生じる。最っとも多く溶離されるタンパク質は、約６５ＫＤ、　３９ＫＤ及び３４ＫＤ　（タブレット）の分子量のものである。３４ＫＤの対のみが、１２　：　０−ＡＣＰチオエステラーゼ活性のピークと同時に溶離する。ｆｌｉ３Ｌ−１２Ｃを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼインヒビターの研究第１表は、硫酸アンモニウム画分（例２を参照のこと）がアッセイ（例を参照のこと）される場合に観察されるチオール試薬によるゲンケイジュの子葉のＣ１，２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの阻害を報告する。ナシ（対照）　４３２２　− ０．５＋ｗＭのインドアセトアミド　４１８０　３５　ｍＭ　４０４７　６０．５剛ｉのＮ−エチルマレイミド　４３２０　０５　ｍＭ１０３　９８率二″平均活性”は、例１のエーテル層に観察されるようなｃｐｌｌで与えられる２個の平均評点の測定である。・Ｇ　２５−５０ゲル濾過媒体の小さなカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。ＮＪ）を通すことによる硫酸アンモニウム画分からのジチオトレイトールの除去の後、次のアッセイ結果が観察された。ナシ（対照）　３７７６　− ０．５ｍＭのヨードアセトアミド　３８５１　００．５ｍＭのＮ−エチルマレイミド　２６９　９３、１１平均活性”は、例１のエーテル層に観察されるようなｃｐｗｌで与えられる２個の平均評点の測定である。これらの予備阻害剤研究は、ゲンケイジュの、ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、５ｍＭのインドアセトアミドに対して感受性を有さす、そして５ｍＭのＮ−エチルマレイミドによりほとんど完全に阻害されることを示唆する。これらの結果は、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、°“活性セリン”タイプよりもむしろエステラーゼの“活性チオール”タイプであることを示す。 ±↓−鎖長の機能としてのゲッケイジュの、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ基質特異性例１のアッセイにおける種々の長さの、中ぐらいの鎖の脂肪酸に対する例２のゲンケイジュの、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの硫酸アンモニウム画分調製物の活性を比較する試験においては、最大活性が第３表に示されるように、Ｃ８，ＣＩＯ，Ｃ１２゜Ｃ１４及びＣ１６ＡＣＰ蟇質よりもＣ１２−ＡＣＰに対して明白であった。１主ｌ＊：ｉ、ｏに設定されたＣ３−ＡＣＰ活性［ｉ−ＡＣＰ対ＣｏＡの機能としてのゲッケイジュの、Ｃ１２を好むチオエステラーゼ基質特異性ゲッケイジュ子葉の粗抽出物は、ラウロイル補酵素Ａ　（ＣｏＡ）及びラウロイル−ＡＣＰを加水分解する。これは、それらの基質上でそれぞれ作用する別々の酵素の存在、すなわち、ラウロイル−ＡＣＰ上で作用するＣ１２を好むアシル− ＡＣＰチオエステラーゼ及びラウロイルＣｏＡ上で作用するもう１つの酵素による。これらの酵素の明確な性質は、精製スケムにおけるＡＣＰカラム段階でのそれらの分離により示される。ラウロイル−ＣｏＡ加水分解活性は、ＡＣＰカラムを結合するのに失敗した材料に主に見出され′、そしてＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性は、結合し、そして続いて、ホスフェート濃度グラジェントにより溶離される材料に見出される。未結合及び結合材料のピーク画分の活性は、次の表に示されるように、この分離を例示するように作用する。員土表面　分　Ｃｌ２−ＣｏＡ基質上　ＣＩＩＡＣＰ基質上での活性１　での活性流出（非結合）　１０８０８　３００グラジェント−溶離　２７　２７７２１１：エーテル−抽出可能生成物のｃｐ■従って、ゲッケイジュの、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ラウロイル−ＣｏＡに対してよりもラウロイル−ＡＣＰに対してより一層の活性を示す。肛−ラウレート生成における酵素の役割ＣＩ２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、ゲノケイジュの種子に卓越するラウレート基の生合成に関与する追加の証拠は、種子の成長の２つの異なった段階での酵素の抽出可能活性の比較に起因する。次の表に示されるように、単に長鎖の脂肪酸及び少量のラウレートを含むひじょうに若い種子は、有意な量のラウレートを蓄積した成熟種子よりも一層低いＣＩ２を好むＡＣＰチオエステラーゼを生成する。従って、この酵素の有意な活性は、種子がラウレートを蓄積する場合に単に存在すると思われる。さらに、ラウロイル−ＣｏＡ加水分解活性においてより低い差異が存在する思われ、このことは、例５において論ぜられたように、それらの異なった酵素と一致する。１ｄ友傘：エーテル抽出可能放射能のｃｐｓ［−インビトロでのゲッケイジュ脂肪酸合成アッセイゲッケイジュの胚抽出物の硫酸アンモニウム画分は、Ｅ、コリＡＣＰ　、マロニル−ＣｏＡ及びインビトロ脂肪酸合成システムの他の典型的な補因子及び基質必要体により供給される場合、成熟種子に見出される脂肪酸と同じ特定の脂肪酸を合成するであろう（ＪａｗｏｒｓｋＬなど、　、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、（１９７４）　１６３　：　７６９〜７７６）。このインビトロ活性の生成物は、たとえラウレートが主な遊離脂肪酸生成物であっても、水溶性オクタノイル及びデカノイルエステルを包含するが、しかしほとんどの水溶性ラウロイルエステルは検出できない。これらの結果は、連続的に高められた鎖長のアシル−ＡＣＰを生成する脂肪酸合成システム、及びアシル成分が、その段階でアシル及びＡＣＰ成分を別々に加水分解することによって、１２個の炭素原子まで拡張される場合、アシル−ＡＣＰを中断する特定のラウロイル−ＡＣＰチオエステラーゼによって最とも簡単に説明される。１−ＣＩＯを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼアッセイ例１に概略されるのと同じ一般的な方法に従って、Ｃ１０チオエステラーゼ活性をアッセイするために、次の混合物を３０°Ｃで１０〜６０分間インキュベートする：例９Ａに記載されるのと同じ又は類似するパ抽出緩衝液”において試験されるべきサンプル５０μｌ、及び０，５〜５．０μＭ、典型的には５０μＭの最終デカノイル−ＡＣＰ　Ｉ１１度のために、５０μ！の合計体積での約２５０　ｐモルのＣ”Ｃｌ− 放射性ラベルされたアシル−ＡＣＰ基ｔ（通常、デカノイル−ＡＣＰは５０〜６０μＣｉ／゛　ｐモルにカルボキシレート基においてラベルされる）。その反応は、１０％（Ｖ／Ｖ）　（７）冷たい（４°Ｃ）酢酸０．５ｄを添加し、ソシテソノ反応混合物を氷上に数分間１くことによって停止される。加水分解酵素作用の脂肪酸生成物は、ジエチルエーテル２−を添加し、そして激しく混合することによって未加水分解基質から抽出される。エーテルを、シンチレーション計数のためにシンチレーション流体５−に移す、追加のエーテル抽出を、所望により、活性のより正確な定量化のために残存する微量の生成物を回収するために行なうことができる。班工へ例８の他に、酵素活性を、スクリュー付きフタを有するガラスバイアルにサンプル２５０μＥを添加することによってアッセイする。次に、濃縮された放射性ラベル基質（”Ｃ）　−Ｃ１０：　０−ＡＣＰ　。５４．７μＣｉ／μモルをバイアルに添加し、その結果、基質濃度は１００μＥの最終アッセイ体積において０．５μＭになるであろう。最終的に、十分なアッセイ緩衝液（１００ｎ＋Ｍのグリシン−ｔ（ＣＣｐＨ９，０，２％のＣｔｌＡＰＳ、　１０１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）をバイアルに添加し１、その結果、合計体積は１００μｌになる。その混合物を、３０゛Ｃで３０分間インキュベートすることによって反応せしめる。反応を、１０％（Ｖ／ν）酢酸０．５ｍ及び次に、ジエチルエーテル（無水）ｌｉｄを添加することによって停止する。放射性ラベルされた遊離脂肪酸生成物を、前記停止せしめられた反応物を激しく混合することによって抽出する。エーテル相を５ｄのシンチレーション流体に移し、そして液体シンナレーション計数により放射能を測定する。１−クツエアの、ＣＩＯを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの精製及び同定クツエア　ツーケリアナの未熟成種子を収穫する。数個の収穫された種子の合計の脂肪酸組成を、それらが発育の正しい段階で存在することを確かめるために標準技法により分析する。これは、オクタノエート及びデカノエートが脂肪アシル組成物において卓越する段階として定義される。収穫された種子を、−７０″Ｃで凍結貯蔵する。これは酵素抽出のための組織源を含んで成る。 ■１人クツエアの、Ｃ１０を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの精製及び同定のための第１の方法が提供される。アセトン粉末を、乳鉢及び乳棒で種子を粉末に液体窒素下で粉砕し、そして次に乳鉢及び乳棒で冷アセトン（約−２０°Ｃ）と共に前記粉末を粉砕することによって調製する。粉末を濾過により集め、そして冷たいエーテルによりすすぎ、残存する微量のアセトンを除去する。次に、それを、アセトン粉末１ｇ当たり、５０鱈のＫＨよＰＯ４−ＫＯ）ｌ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含んで成る“抽出緩衝液”１０ｄにより抽出する（この及び続くすべての段階は０〜４°Ｃである）。均質物を１１，０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離し、そして上清液画分を、２層の旧ｒａｃｌｏｔｈ　（ＣａｌｂｉｏｃｈｅＩｌ、Ｉｎｃ、；　ＬａＪｏｌｌａ。ＣＡ）を通しての濾過の後、続く精製段階のために使用する。次に、上滑液画分を、硫酸アンモニウム分別にゆだねる。４０〜６０％の飽和硫酸アンモニウムベレット（例２において記載されるようにＬＴｔｌｌ製されｌ　を、５０１１Ｍ（７）ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ，ｐＨ６，９，１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含んで成る°°緩衝液 ”に再溶解し、そしてこの緩衝液に対して透析し、残存する硫酸アンモニウムを除去する。次に、得られた調製物を、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにゆだねる０次の方法が、新たな出発種子１［１００ｇからの硫酸アンモニウム画分に通用される。透析された硫酸アンモニウム画分（３５〜４（ｌｄ）を、５０１のｌ［ＨｚＰＯａ　ＫＯＩＩ、ｐｉ（６，９，１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含んで成る緩衝液により平衡化された、ヒドロキシアパタイトのカラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＩｎｃ、、　Ｒ４ｃｂｓｏｎ４．　ＣＡからのＢｌｏ−Ｇｅ１　ＨＴＰの２．５ｃｍＸ１４ｃｍのベッドの高さ；カタログｒｉｏ、　１３０−０４２０）に適用する０次に、カラムを同じ緩衝液に２８Ｍにより洗浄する（１．５ｄ／分の流速）。溶離を、３５０＋ｍＭのＫＨｚＰＯｎ　ＫＯＨ１ｐＦＩ６．９．１０％（ν／ν）のグリセロール、４％Ｍの２−メルカプｉ・エタノールの緩衝液に対するこれらの条件からの線状グラジエン）　５８０ｄにより達成し、１２ｄの体積の画分を集める。溶離された画分を、基質としてデカノイル−ＡＣＰを用いてヒドロラーゼ活性についてアッセイする。２つのピークの活性を得、１つは結合を伴わないでカラムを濾過し、そして他は結合し、そして続いて、ホスフェートグラジェントによりＮ１１ｌされる。ヒドロキシアパタイトカラムからの両ピークは、長鎖の基１ｔ（１４又はそれ以上の炭素原子のアシル基）に対する加水分解活性を含む。中ぐらいの鎖の基質が関与する限り、流動ピークは低い選択性を示し、そしてグラジェントピークは、デカノイル−ＡＣＰのための相当の選択性を示す（例１１Ａを参照のこと）。部分的精製における初期段階で、１００ｍＭのＨＥＰＥＳにより緩衝される場合、デカノイル−ＡＣＰ　ＣＩＯを含むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、アッセイｐＨの相当の耐性を示し、活性はｐＨ６，５〜８．５の間で最小限変化、そしてｐＨ７，５で最大である。対照的に、活性は３５０ｗＭのホスフェートにおいてまだ検出できるが、十スフエート濃度が高められるにつれて、アッセイ緩衝液活性は低下するので、たとえばリン酸カリウムを用いてのアッセイにおいてイオン強度に対して感受性が存在する。部分的に精製された調製物におけるＣＩＯを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性及び他のタンパク質は、ガラス及びプラスチック表面との広範な接触により濃度が低められる。この効果は、カラム及びアッセイ緩衝液に界面活性剤、たとえばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１００又はＣＨＡＰＳの包含により減じられる。いくつかの界面活性剤がアッセイにおいて刺激的である。ＣＩＯを好むアシル−へＣＰチオエステラーゼ活性は、２−メルカプトエタノールが上記のように緩衝液に存在しないなら、精製の硫酸アンモニウム沈殿段階の間に急速に失なわれる。記載される緩衝液において、その活性はＯ″Ｃで及び− ２０゛Ｃ又は−７０°Ｃに反復凍結される間、ひじように安定している。五ｌ旦例９Ａのより好ましい他の方法として、種子を次の通りにして抽出する。抽出ペーストを、１３７５ｄの抽出緩衝液（２００ｍＭのビス−トリス−ＨＣ１２、ｐＨ６，５，１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールビニルポリピロリドン及び１３．７５ｇの可溶性ポリビニルピロリドン（１０，０００の平均分子量）により製造する。すべての続く段階は４°Ｃで行なわれる。種子及びペーストを、その混合物が滑らかになり、そして完全な損なわれていない種子が存在しなくなるまでＰｏｌｙｔｒｏｎにより均質化する．その均質物を１０，ＯＯＯＸ　ｇで２０分間遠心分離する。上清液をデカントし、そしてＭｉｒａｃｌｏｔｈを通して濾過する。濾過された上清液を、抽出緩衝液により平衡化された沈降Ｂｌｕｅ　−４アガロース樹脂１００ＩＩｉと共にスラリーに混合する。そのスラリーをＢｕｃｈｎｅｒ漏斗上で、抽出緩衝液５００−により洗浄し、次にガラスカラム中に注ぎ、そして樹脂が充填されるまで、追加の抽出緩衝液によりすすぐ。カラムをまず、１００１のＮａＣ　ｌ　、２００ｎＭのビスート’Ｊ　−ＨＣｊ！　、　ｐＨ６．５．　１０ｄのβ−メルカプトエタノールにより洗浄する．　４００＋ＭＭのＮａＣ　ｌ　、２００１Ｍのビス−トリス−ＨＣ　ｊ！　、　ｐＨ６．５．　１０ｎ＋Ｍのβ−メルカプトエタノールをカラムに適用し、そして溶出液を画分に集める。酵素活性を存するそれらの画分をプールし、そして”ｓＩ！！衝液″　（５０ｄ（７）　ヒス−トリス−ＨＣｊｌ！．　ｐＦＩ６．０，　０．２％（Ｗ／Ｖ）のＣＪＩＡＰＳ，　１０ｄのβ−メルカプトエタノール）に対して透析する。次に、サンプルを次の通りにしてＳ−セファロースカラム上でクロマトグラフィー処理するａＢｌｕｅ−４カラムからの透析されたサンプルを、ＳｔＩｉ衝液により平衡化されたＳ−セファロース樹脂の５０−カラム上に負荷する。Ｓ−緩衝液によりカラムを洗浄した後、カラムを２００ｗＭのＮａＣ　ｉ！　、　５０ｍＭのビス−トリス−ＭＣ１．　ｐＨ６．０，　０．２％（Ｗ／Ｖ）のＣＨＡＰＳ，　１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールによりすすく。酵素活性を有するそれらの画分をプールし、そしてＳ緩衝液に対して透析する。次に、サンプルを次の通りにしてＰｈａｒｍａｃｉａ　ＦＰＬＣ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。ＮＪ）　Ｍｏｎｏ　−　Ｓカラム上でクロマトグラフィー処理する。Ｓ−セファロースカラムからの透析されたサンプルを、Ｓ緩衝液により平衡化された１ｌＭｏｎｏ−Ｓカラム上に負荷する．カラムを、２８０ｎｍの吸光度が同等になるまで、Ｓ−緩衝液により洗浄する。４５１１１のグラジェントを、Ｓ−緩衝液及びＮａＣ　ｌを含むＳ−緩衝液を用いてカラムに適用する，　７５ｍＭと１５０＋Ｍとの間のＮａＣ　Ｒ間に活性が溶離する。酵素活性を有するそれらの両分をプールし、そしてＳ緩衝液に対して透析する。最後に、サンプルを次の通りにしてＡＣＰカラム上でクロマトグラフィー処理する．セファロース結合されるアジルーキャリヤータンパク質１５−を含むカラムを、Ｓ−緩衝液により平衡化する＊　Ｍｏｎｏ　−Ｓカラムからの透析されたサンプルを、０．２ｄ／分でＡＣＰカラム上に負荷する。カラムを、２８０ｎ−の吸光度が基線レベルになるまで、Ｓ−緩衝液により洗浄する．　１３０ｄのグラジェントを、Ｓ−緩衝液及びＮａＣ　（ｌを含むＳ−３９衝液を用いてカラムに適用する．活性が５０ｍＭと８０ｍＭのＮａＣ　１間に溶離する。酵素活性を有するそれらの両分を例９Ａ又は９Ｂのより好ましい例として、４０ｇのポリビニルボリピＯ　ＩＪ　ｌ’　：／　（ＰＶＰＰ）を、２００１１Ｍ（７）ビス−トリス−ＭＣ１．　ｐ）１６．　１０ｇＭの２−メルカプトエタノール、１％（Ｗ／Ｖ）のポリビニルピロリドン−１０を含んで成る“抽出緩衝液″　５５０ｄと共に混合する。この混合物に、凍結されたクツエア種子４０ｇを添加する。次にその混合物を、損なわれていない種子が残存せず、そしてスラリーが滑らかになるまで、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモナイザーによりブレンドする．この及びすべての続く段階を、０〜４℃で行なう。調製物を１２，ＯＯＯＸ　ｇで２０分間遠心分離し、そしてさらに、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通しての濾過により透明にする。コノ調製物を、″緩衝液Ａ”　（５０ｍＭ（７）ビス−トリス−ＨＣｊｌ！，　ｐＨ６。１０ｇＭの２−メルカプトエタノール）により平衡化された沈降ヒドロキシアパタイト１００ｄと共に混合する．次に１０ｍＭの２−メルカプトエタノールの３［１の抽出体積物を、一定の撹拌下で、３０分間にわたってゆっくりと添加する．ヒドロキシアパタイトゲルを焼結されたガラス漏斗上に集め、そして溶出液が無色になるまで、緩衝液によりすすぐ。次に、集められたヒドロキシアパタイトをカラムに移し、そしてさらに、カラムを充填するまで、２ｄ／分で緩衝液Ａによりすすぐ．緩衝液Ａ−緩衝液Ｂ（緩衝液Ａにおいて３００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６，９）の４００ｄの溶出グラジェントを適用する（２ｄ／分）、溶出液画分を、１０　：　０−ＡＣＰの加水分解のためにアッセイする。２つのオーバーラツプする活性のピークを得る。後者の溶離ピークを含んで成る画分をプールし、そして緩衝液Ａに対して透析する。透析された材料を、緩衝液Ａ辷より平衡化されたＢｌｕ、ｅ　４アガロースの２．５Ｘ６．５ｃ−のカラム（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　：　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋　ＭＯ）に１．３Ｉ１１／分で適用する。カラムを緩衝液Ａにより洗浄し、そして続いて、酵素活性を、緩衝ＩＡ−緩衝液Ｃ（緩衝液ＡはＩＭのＮａＣｌを含む）の４００ｒ１１のグラジェントにより溶離する。溶離された画分は、１０：０−＾ＣＰ加水分解活性の３つのピークを含む。溶離する第２ピーク（約０．４１１ＭのＮａＣｌにより溶離される）を含んで成るそれらの百分をプールし、そして緩衝液Ａに対して透析する。透析された材料を、緩衝液Ａにより平衡化された固定１０　：　０−ＡＣＰ類似体の１．７ＸＳｃ−カラムに０．５ｍｌ！／分で通用する。（このカラムは、ジエチルエーテル中でヘプチルアミンと無水ヨード酢酸とを反応せしめ、そして精製され、減じられたＥ、コリ＾ＣＰに前記生成物を添加することによって調製される。残留試薬を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより除去し、そして得られた１０　：　０−ＡＣＰ類似体を、製造業者の方針に従ってＰｈａｒｍａｃｔａ　ＣＮＢｒ活性化セファロースに結合し、トリスにより未反応基を阻害する。）カラムを緩衝液Ａによりすすぎ、そして活性を、緩衝液Ａ−緩衝液Ｄ（緩衝ＷＬＡは０．５ＭのＮａＣｊ２を含む）の２００ｉのグラジェントを用いて溶離する。１０：０−　ＡＣＰ活性の溶離ビークに対応する両分をプールし、そして５０ｍＭのビス−トリス、ｐＨ６、ＩＯｆｆＭの２−メルカプトエタノール、０．２％（訂ν）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムに対して透析する。夕トＬす例９Ｃに記載される方法を、次の通りにさらに変性することができる。１０　：　０−ＡＣＰ活性の溶離ビークに対応する両分をプールし、そしテ緩衝液Ｅ　（５０ｍＭ（７）ヒス−ト！Ｊ　ス−ＨＣＣｐＨ６，０，０，２％のＣＨＡＰＳ、　１０＋ｗＭのβ−メルカプトエタノール）に対して透析する。ＦＰＬＣＭｏｎｏ　−Ｓカラム（Ｍｏｎｏ　３＠　ＨＲ５１５＋　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ、　ＮＪ）を、緩衝液Ｅにより平衡化する。透析されたプールを、カラム上に負荷する。すべてのＣＩＯ及びＣ１８：１活性は、カラムに結合するように見える。活性を、（緩衝液）〜（緩衝液＋ＩＭのＮａＣｊＮの１４０１の線状グラジェントにより溶離する。Ｃ１８：１活性は、７５ｍＭと１００ｍＭ（７）　ＮａＣＪ２間で溶離する。　１５０ｓｕｆと１７５ｍＭのＭａＣ１２間で溶離する第２ピークの活性が存在する。その第２活性ピークは、主にＣＩＯ及びＣ１８：１活性であり、そしてＣ１２゜Ｃ１４、又はＣ１６活性は比較的低い。第２ピークにおけるＣ１８：Ｉ活性は、残留ＣＡＢ：１活性による汚染による。［１−ＣＩＯアシル−ＡＣＰチオエステラーゼインヒビター研究例９Ａからの材料による予備インヒビター研究は、クツエアの、ＣＩＯを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼがフェニルメチルスルボニルフルオリドに対して非感受性であり、ヨードアセトアミドに対して非感受性であり１、そして５ｍＭのＮ−エチルマレイミドにより完全に阻害されることを示す。これは、それが“活性セリン”タイプよりもむしろエステラーゼの“活性チオール”タイプであることを示唆する。斑旦−鎖長の機能としてのクフェアＣＩＯアシルＡＣＰチオエステラーゼ基質特異性 ■旦へ中くらいの鎖のアシル−ＡＣＰに対するクフヱアＣＩＯアシル〜ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を、例９Ａに記載されるようにして、精製におけるヒドロキシアパタイト段階で決定した：Ｃ６−ＡＣＰ　１８８Ｃ８−ＡＣＰ　４８５Ｃ１０−ＡＣＰ　６９５０Ｃ１ｌ−ＡＣＰ　６４９ＣＩ２−ＡＣＰ　１０３２Ｃ１４−ＡＣＰ　４０５５長鎖の基ｔ１４．　：　０−ＡＣＰに対する活性は、出版された文献に記載されるベニバナ種子及びアボカド中果皮ＵＳの長鎖チオエステラーゼ活性にｉｆ以する長鎖チオエステラーゼ活性の存在によると思われる。そのような酵素の好ましい基質、ずなわち１８　：　１−ＡＣＰによる調製物のアッセイは、この仮説に一敗する、実質的な活性の存在を示す。１０　：　０−ＡＣＰに対する活性及び８　：　０−ＡＣＰに対する少量の活性は、クツエア　ツーケリアナ種子の成長において中くらいの鎖の脂肪酸生成を担当する中くらいの鎖特異的チオエステラーゼの存在を示す。触媒される反応は、単純な加水分解であることが示された。６；０−ＡＣＰ　、８　：　０−ＡＣＰ及び１．０　：　０−ＡＣＰ基質との゛時間ゼロ“での反応及び１時間の反応のエーテル抽出生成物を、シリカ０７３１層プレート（移動相；ヘキサン／シュチルエーテル／酢酸、８０：２０：ＩＶ／Ｖ＞上でクロマトグラフィー処理し、脂質種類を決定した。ラウリン酸を、生成された短鎖の遊離脂肪酸の蒸発を阻止するためにラベルされていないキャリヤーとして添加した。トリカプリン、シカプリン、テノカブリン及びラウリン酸を、対照として使用した。ＴＬＣプレートを、半分展開し、そして次に、５分間空気乾燥せしめた。次に、そのプレートを、タンクに戻し、そして展開を、プレートの上部１ｃｍ内に完結した。展開されたプレートを乾燥せしめ、そして次に放射性ラベルされたスボントを定量化するために、ＡＭＢＩＳ（Ａｌ’ｌＢ［５Ｓｙｓｔｅ＋ｍｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）　ラジオクロマトグラムスキャナー上で８００分間スキャンした。スキャンの後、プレートを沃素蒸気中で１５分間染色し、脂質を可視化した。主要の放射性ラベルされた生成物は、遊離脂肪酸と共に同時移動し、そしてゼロ時間の対照に比較して、１時間インキヱベートされたサンプルにおいて実質的により放射性であった。生成物の鎖長が対応する基質の鎖長であることを確証するために、エーテル抽出された生成物（キャリヤーとしてラベルされていない遊離酸混合物を有する）を、ＫＯ）Ｉによりフェノールフタレインエンドポイントに中和し、そして次に、臭化ブロモフェナシルにより誘導体化し、そして逆相ＨＰＬＣによりクロマトグラフィー処理した。Ｃ１，８カラムを、アセトニトリル／水グラジェントと共に使用した。すべての場合、基質鎖長と同一のたった１つの鎖長の生成物が観察例９Ｃからの調製物は、次の表に示されるように、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのその加水分解において比較的選択的である：（それらの活性を次のようにして決定した。２５μｌのサンプルを、１００ｍＭ　（７）グ’Ｊ　シフ　−ＫＯＨ，ｐＨ９，０，２％（Ｗ／Ｖ）　０）　ＣＨＡＰＳ、　１０ｍＭ（７）　２＝メルカプトエタノールを含んで成り、そして０．５ＭＭの最終濃度のために放射性ラベルされたアシル−ＡＣＰを含む７５μｌのアンセイ緩衝液に添加した。３０°Ｃで６０分間のインキュベーションの後、反応を１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸０．５ｄの添加により停止し、そして生成された脂肪酸生成物をジエチルエーテルｌｄにより抽出した。酵素活性を、このエーテル抽出物の放射能により測定し、液体シンチレーシゴンカウンチングにより決定した。補正を、行なわれる少量の非酵素的加水分解のために適用した。）玉工表一基一−ｌ−蛮−１１９１１（１：　０−ＡＣＰ　１０２０１２　：　０−ＡＣＰ　３９３１４　：　０−ＡＣＰ　３０１６　：　Ｏ−ＡＣＰ　２６２１８　：　０−ＡＣＰ　６９６長鎖のチオエステラーゼの除去は、Ｂｌｕｅ　４アガロースカラムからのすべてのピークの部分的オーバーラツプにより明らかなように不完全であり、そしてデータは、上記表に示される。ｆｉｉ−Ｃ１８を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼアッセイ長鎖チオエステラーゼ活性についてアッセイするために、分析されるべき酵素源１０μ／！を、１００ｍＭのトリシン−ＮａＯＦ［、ｐＨ８，５及び３μＭの１′Ｃステアロイル−ＡＣＰ又は３μＭの”Ｃオレオイル−ＡＣＰを含んで成る溶液において、合計５０μｌの体積で室温で１０分間インキエヘートする。アシル−ＡＣＰ基質を、ラウロイル−ＡＣＰの調製のために例Ｉに記載されるようにして調製し、そして５０〜６０μＣｉ／μモルの比放射能でカルボキシレート基において放射性ラベルする。反応を、それぞれ１１のステアリン酸及びオレイン酸を含む、５０μｌの水及び１００μｌのイソプロパツールの添加により停止する。加水分解酵素作用の脂肪酸生成物を、水中、５０％イソプロパツールにより飽和された石油エーテル１ｄの添加により未加水分解基質から抽出する。数分間の沈陣の後、石油エーテル層のアリコートを、液体シンチレーション分光計による放射能の決定のために除く。貫旦−ヘニハナの、Ｃ−１８を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ精製及び同定初めにＭｃＫｅｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｕｍｐｆ　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８２）　２５７　：　１２１４１〜１２１４７）の方法に従っての成長するベニバナ種子からのチオエステラーゼタンパク質の初期精製を記載する。温室で成長する植物からのベニバナ種子を、開花後１６〜１８日間で収穫し、液体窒素中で凍結し、そして−７０’Ｃで貯蔵する。約５０ｇの凍結種子を、液体窒素中で粉砕し、そして細かな粉末を得るために、大きな種子の被覆片を除去するために篩にかける。粉末を、すべての黄色の色が濾液から消えるまで、Ｂｕｃｈｎｅｒｉｉ斗上でアセトンにより洗浄する０次に、その粉末を空気乾燥せしめ、そして下記のようにしてさらに処理し、又は−７０°Ｃで凍結貯蔵する。乾燥せしめられたアセトン粉末を計量し、そしてその重量の５倍の２０ｆｆｉＭのリン酸カリウム（ｐＨ６，８）と共に粉末化する。次にその混合物を２０分間、１２，０ＯＯＸｇで遠心分離し、そしてＭｉｒａｃｌｏｔｈ層を通してデカントする。アセトン粉末抽出物、をｐＨ５，２に氷酢酸により酸性化し、氷上で３０分間保持し、そして次に、１２．ＯＣＩＯＸｇで１０分間、遠心分離する。上清液を、氷酢酸によりｐＨ４，４に調整し、氷上に３０分間保持し、そして次に上記のようにして遠心分離する。沈殿物を、０．０２Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６，８）に再懸濁し、そのｐＨを６．８に調節し、そして懸濁液を１．２，０ＯＯＸ　ｇで１０分間の遠心分離により透明にする。アフィニティークロマトグラフィーのためのＡＣＰ−セファロース４Ｂのカラムを、例２に記載しているようにして調製する。ＡＣＰを、例１に記載されるようにしてＥ、コリ株に−１２から単離する。酸沈澱からの透明にされた上清液を、ＡＣＰカラム緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム、２５％（Ｗ／Ｖ）　（７）グ＋）セｏ−ル、０．１％（Ｗ／Ｖ）　ノ（ＪＩＡＰＳ、　ｐＨ６，８）に溶解し、そして５０μｌ時の適用速度で２．５ｃｍＸ３．７ｃｍのＡＣＰ−セファロース４Ｂカラムに適用する。活性を、ＡＣＰカラム緩衝液中、２０〜４００ｍＭのリン酸カリウムの５ベンド体積グラジェントにより溶離する。活性は、１８０〜３２０１のリン酸カリウムで単一のピークとして溶離し、そしてチオエステラーゼの回収率は１００％であった。上記ＡＣ：Ｐ−セファロースカラムからの活性画分をプールし、２０１のリン酸カリウム、０．１％のＣＨＡＰＳ、　２５％のグリセロール溶液に希釈し、そして異なったＡＣＰ−セファロースカラムに適用し、そして上記のようにしてクロマトグラフィー処理した。、次に、得られた材料を、ベニバナのチオエステラーゼ活性の追加の精製のためにクロマトフオーカシングカラムに適用した。第２ＡＣＰカラムからのパ流動”緩衝液を、ＰＭ−１０膜を用いてのＡｍ１ｃｏｎ（Ｄａｎｖｅｒｓ＋　ＭＡ）撹拌細胞限外濾過装置での濃縮及び希釈により、２０− Ｈのビス−トリス−ＨＣｌ、２５％（Ｗ／Ｖ）のグリセロール、０．１％（Ｗ／Ｖ）のＣ）ＩＡＰＳ、　ｐｌ＋７．４の（“開始″緩衝液）に変えた。クロマトフオーカシングカラム（ｌ　ｃｍＸ７．３ｃ＋ｗ）を、゛°開始″緩衝液により平衡化されたＰｈａｒｗａｃｉａ　ＰＢＥ９４により充填する。サンプルを、３５μｌ時の速度でＰＢ２９４カラムに適用し、そしてカラムを、３ベッド体積の開始緩衝液により洗浄する。ｐＨグラジェントを形成し、そしてタンパク質を、】００ｄ当たり、１０ｄのＰｈａｒｍａｃｉａ　ｐＨ７４，２５ｇのグリセロール、１ｇのＣ１（ＡＰＳ、及びｐ）Ｉを４，０にするために十分なＩ（ＣＩｌを含む溶出緩衝液８２ｄの適用により、６０μｌ時で溶離する。さらに２ベッド体積の溶離緩衝液を、カラムのｐＨが４．０に達した後、適用する。ベニバナのチオエステラーゼ活性は、２つのピークで溶離し、１つはｐＨ５，２で、そして第２ピークはｐＨ４，５から４．０に及ぶ、これらの活性ピークを示す百分を、５Ｏ５−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｎｎｌｉ、前記）及び銀染色法により分析する。両ピークにおいて、チオエステラーゼ活性と相互間係する２つの主バンドが観察された。これらのバンドは、タンパク賀対照への比較により評価される場合、３４及び４０にＤの相対的分子量を有するタンパク質を示す。クロマトフオーカシングからの２つの活性ピークの両分を別々にプールし、そして上記のようにして濃縮する。３４及び４０ＫＤのチオエステラーゼタンパク質を、それらのタンパク質を、ＳＯ３−ＰＡＧＥに続いて、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ　（１＋＊５ｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　（Ｍｔｌｌｉｐｏｒｅ　；　Ｂｅｄ− ｆｏｒｄ、　ＭＡ）又はＰｒｏＢｌｏｔｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　；　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ））膜への移行によるアミノ酸配列決定のためにさらに単離する。タンパク質が続いて、酵素的に消化される場合、ニトロセルロースが好ましく、ところが、ＰｒｏＢ［ｏｔｔがＮ−末端配列決定法のために好ましく、そしてＩｗｓｏｂｉｌｏｎ　−Ｐが、臭化シアン消化にゆだねられるサンプルのために好ましい。、ｆｌ−植物のチオエステラーゼ配列決定この例においては、２種の典型的な植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸及び核酸配列決定が記載される。この技法はまた、本発明の他の植物チオエステラーゼの配列決定のためにも使用され得る。すべての配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ　Ｐｕ１ｓｅｄ−ＬｉｑｕｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ上でエドマン法により行なわれる；配列決定機により生成されたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を、オン−ラインのＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　１２Ａ　ＰＴＨＡｎａｌｙｚｅｒにより分析する。データを集め、そしてＡｐｐｌｅ　ＭａｃｊｎｔｏｓｈのためにＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ＋ｗｓモデル６１０＾データ分析システムを用いて、及びまた、ＰＥ　ＮＥＬＳＯＮ、　Ｉｎｃ、（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、　ＣＡ）からのＡＣＣＥＳＳ”　ＣＨＲＯ？Ｉソフトウェア−を用いてＤｉｇｆｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｖａｘ上に貯蔵する。配列データは、ＰＴＨＡｎａ　Ｉｙｚｅｒからの入力を受けるチャートレコーダーから読み取られ、そしてモデル６１０Ａソフトウェア−から得られた定量データを用いて確認される。すべての配列データを、データ分析システムの助けにより２つのオペレーターにより独立して読み取られる。！（ＰＬＣのピーク外として得られるペプチドサンプルのために、サンプルを、配列決定機における３回のプレーサイクルにゆだねられたＰｏ１ｙｂｒｅｎｅ被覆されたガラス繊維フィルター（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）上に負荷する。還元され、そしてアルキル化されたペプチドのために、個々の配列決定機サイクルからのＰＴＩＩ−アミノ酸生成物材料を、液体シンチレーションカウンターで計数する。ｆｍｏｂｉ　Ｊｏｎ　−Ｐに対してエレクトロプロットされたタンパク質サンプルのために、対象のバンドを切断し、そして次に、上記のようにしてブレーサイクルされたＰｏ！ｙｂｒｅｎｅ被覆されたガラス繊維フィルター上に置き、そして反応カートリッジを、製造業者の仕様に従ってアセンブルする。ＰｒｏＢＩｏｔｔに対してエレクトロプロットされたタンパク質サンプルのためには、ガラス繊維フィルターは必要とされない。少量のサンプル（５〜３０Ｐモル）からタンパク質配列を得るために、Ｔｅｍｐｓｔ　ａｎｄ　Ｒｉｖｉｅｒｅ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８９）　１８３　：　２９０）により記載されるようにして、４７７Ａ転換ザイクル及び１２０＾アナライザーを例２のＡＣＰ−セファロース段階を通して精製されたゲ、ケイシュのチオエステラーゼのサンプルを、タンパク質分解消化及び配列決定のために調製する。サンプル（８０μｉ中、チオエステラーゼ１２μｇ）を、２％ドデシル硫酸ナトリウム、５％のβ−メルカプトエタノール、２０％のグリセロール、２％の３　／１０両性電解賞及び２％Ｔｒｉｔｏｎに−１００を含むＡｎｄｅｒｓｏｎ’　ｓサンプル緩衝液（Ａｒ＋ｄｅｒｓｏｎ　＆　Ａｎｄｅ− ｒｓｏｎ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９７８）　８５　：　３３１〜３４０）　１６０μｍ中において９５°Ｃに５分間加熱することによって、変性し、そして還元する。２０μ２のアリコートでのタンパク質（それぞれにおいて１ μｇの合計タンパク質）を、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、（１９７８）　８５：３３１〜３４０及び３４１〜３５４）　（但し、二次元スラブゲルは、１．５ｖ＋＋の厚さである）により記載されるようにして二次元電気泳動により分離する。二次元電気泳動の後、個々のスラブゲルを除き、そしてゲル内のタンパク質を、Ｔｏｗｂｉｎなど（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７９）７６　：　４３５０〜４３５４）の方法を用いて、トランスプロットシステム（Ｂ　ｉ　ｏ　−Ｒａｄ、　Ｒｊｃｈｍｏｎｄ＋　ＣＡ）におけるニトロセルロース膜に直接的にプロットする。膜上でのタンパク質スポットは、５ａｌｉｎｏｖｔｃｈ　ａｎｄ　Ｍｏｎｔｅ−Ｉａｒｏ　（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　（１９８６）　１５６　：　３４１〜３４７）により記載されるようにして、Ｐｏｎｃｅａｕ　Ｓ　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、ＬｏＩＪｉｓ＋　ＭＯ）による可逆性染色により検出される。他方、スポットは、アミドブラックにより染色することによって検出され得る　（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｍａｎ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　（１９７３）５６　：　５０２〜５１４）。ゲッケイジュのチオエステラーゼ又は追加のクロマトグラフィー精製段階を受けたチオエステラーゼの調製のために、−次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、配列決定のために十分に純粋なタンパク質を生成するのに十分である。この場合、サンプル（８０μｉ中、チオエステラーゼ１２μｇ）を、２５％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール、２．５％（ｊｌ／Ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）及び２５％（Ｖ／Ｖ）のβ−メルカプトエタノールを０．１５６Ｍのトリス−ＨＣＣｐｉ（６，８に含むサンプル緩衝液２０μｌと共に９５°Ｃに５分間加熱することによって還元し、そして変性する。サンプルの別々のアリコート（３０〜３５μｌ）でのタンパク質を、Ｌａｅａ＋ｓｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７　：　６８０〜６８５）により記載されるようにして一次元電気泳動により分離し、１　、５ｆｆｉｍの厚さのゲル上でＩｃｍレーン当たり１つのアリコートが存在する。電気泳動の完結の後、ゲルを除去し、プロントし、そしてその後、サンプルを二次元の場合のために記載されるようにして処理する。消化のための調製においては、チオエステラーゼタンパク質に対応するスポットを、個々の膜プロントから切断し、そしてプラスチック試験管に一緒にプールする。処理及び消化方法は、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄなど（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４　：　６９７０〜６９７４）により記載される。膜断片を、１００１ｗＭの酢酸に溶解された、４０．０００の平均分子量を有する、新しく調製された０、５％（Ｗ／Ｖ）のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−４０，Ａ！ｄｒｉｃｈ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）１．０〜１．２　ｙｄにより３７°Ｃで３０分間処理する。過剰のＰＶＰ　−４０を、水３〜４ｄによる数回の洗浄により除去しくＨＰＬＣグレード）、ＰＶＰ　−４０の除去は、連続的洗浄の２１４ｍｍでの吸光度がもはや低下せず、又は水ブランクの吸光度に達する場合、完結する。次に、その断片を、洗浄管から除去し、細断し、そして１ｄのＥｐｐｅｎｄｏｒｆプラスチック管に配置し、そして１００ｍ）１のトリス−ＨＣ１！又は１００ｄの炭酸ナトリウム、ｐＨ８，２／アセトニトリル、９５　：　５　（Ｖ／Ｖ）を、液体がそれらの上部をちょうど被覆するように添加する。消化を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ…配列グレードのトリプシン（１％ＨＣＩＪ中、１１００ｕ／ｄのｉ液）　ｌ０ｔｔ　ｌの添加δ こより開始し、そしてサンプルを、時々、撹拌しながら、３７°Ｃで８〜２４時間、消化を可能にする。添加されるプロテアーゼの量は通常、消化されるタンパク質の重量の１／２０〜１　／ｆＯの間である。ペプチドは、膜から消化緩衝液中に、インキエヘーションの間に溶出する。消化を、１０％（ｖ／ν）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　１．０μＰの添加により停止する。他方、そのチップを、１００ｍＭのリン酸ナトリウム又は２５ＩＩＭの炭酸アンモニウム、ｐＨ１，８／アセトニトリル、９５　；　５　（Ｖ／ν）に懸濁し、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｗ配列グレードのエンドプロテイナーゼｇｌｕ　Ｃ（水中、１１００ｕ／ｄ溶液）１０μＮにより２５°Ｃで８〜２４時間、消化する。トリプシンによる消化は、リシン及びアルギニン残基での切断を可能にし、そしてｇｌｕ　Ｃによる消化は、緩衝液に依存してグルタミン酸残基（及びまた、いくつかの条件下でアスパラギン酸）で切断する。個々のプロテアーゼによる別々のサンプルの消化は、オーバーラツプペプチドの同定及びＰｃｔ？技法のために有用なより長いペプチド配列の構成を提供する。消化混合物が、ニトロセルロース片から除去され、そのニトロセルロース片を、１〜５回、１００μｊｌ！の体積の０．０５％（Ｖ／Ｖ）　ＴＦＡ　Ｉ、：より洗浄し、そしてそれらの体積を、５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ　（Ｓａｖａｎｔ；　Ｆａｒｍｉｎｇ−ｄｏｌｅ、　ＮＹ）により１００μ２以下の体積に濃縮する。次に、それらの濃縮物を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｔｔｙ＋　ＣＡ）モデル１３０高性能液体クロマトグラフィー（）ＩＰＬＣ）に取り付けられているＶｙｄａｃ逆相Ｐｒｏｔｅｉｎ　＆　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃ１Ｂカラム（２，１ｍｎ＋　Ｘ　１００ｍｍ）上に注入する。ペプチドを溶離するために使用される移動相は次のものであった：緩衝液Ａ　：　０．１ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ２，２；緩衝液Ｂ　：　０．１ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ２，２中において７０％のアセトニトリル。２時間にわたっての１０〜５５％緩衝液Ｂ、５分間にわたっての５５〜７５％緩衝液Ｂ及び１５分間にわたってイソクラティクな７５％緩衝液Ｂの５０μ！！／分の流速での３段階グラジェントが使用される。ペプチドを２１４ｍｍで検出し、手動的に集め、そして次に一２０℃で貯蔵する。開放されたペプチドの分離をまた、０．１％ＴＦＡ中、７％〜７０％のアセトニトリルの上昇する１２０分グラジェントを用いて、５０μｌ／分の流速で、Ｃ１８（２Ｘ　１５０ｍｍ）上での逆相）ＩＰＬｃを通して達成することができる。ペプチドの溶離を２１４ｎ＠での吸光度によりモニターし、個々のペプチドは、別々の両分管に集められる。ペプチドを、タンパク質配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ＋　Ｃ＾）に適用するまで、−２０“Ｃで凍結保存する。他方、ペプチドは、ＨＰＬＣ上での分離の前、アルキル化され得る。アルキル化は、検出されなくなるシスチン残基の配列決定機上での同定を可能にする。酸性化されなかった消化混合物は、１０％（％’／Ｖ）のβ−メルカプトエタノール１μＮ　（１，４３ｄモル）の添加により還元され、そして３７℃で２時間インキュベートする０次に、還元されたペプチドを、暗室において室温で３０分間、〔３Ｈ〕−ヨード酢酸（２００ｍＣｊ／ｍモル）約１．６μモルによりアルキル化する。β−メルカプトエタノールの濃度に依存して、〔３Ｈ〕−ヨード酢酸は、１：１．１の比に調節され得る。次に、その混合物を、１０％（Ｖ／Ｖ）　ＴＦＡ　１０μ！により酸性化し、逆相ＨＰＬＣカラムに適用し、そしてさらに上記のようにして処理する。他のアルキル化剤は、ヨードアセトアミド及び４−ビニルピリジンを包含する。後者の試薬は、その対応するＰＴＨ−アミノ酸誘導体のユニークな保持時間によりタンパク質配列決定機上で同定できるピリジルエチル−システィン残基の形成を導び（。３４ＫＤのタブレノトのゲッケイジュチオエステラーゼを、独立して配列決定する（Ａ及びＢ）、ペプチド配列は、第８表に示される。いくつかのバンドＡ及びＢペプチドは、配列において同一であるか又はほぼ同一であるかのいづれかであることが注目される。、ＬＬ友バンド”Ａ″ ＳＱ　７３６　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　Ｉ　ＹＰＴｌｔＰＮＦＶＬ−Ｔ（Ｍ）　Ｌ　（１）　（Ｇ）　（Ａ）　（Ｑ）ＳＱ　７３７　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２　ＤＬ）ＩＷＶＶＳＱ　７４０　ＬＮＤ−（＃　３後、Ｉ（ＰＬＣ粉砕される）Ｓｏ　７４１　ＳＥＱ　Ｉ［ｌ　Ｎｏ：　４　（Ｔ）−ＴＬＶＤＶＶ（Ｐ）ＦＶｒＷＦＶＦＩＤＮＶＡＶＫＳＱ　７４３　ＳＥＱ　Ｉｌｌ　Ｎｏ：　６　ＡＧ　（Ｇ）　ＷＶＦＥＴＶＰＤＸＩＦＥＳＱ　７４９　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　９　ＧＩＳＶＩＰＡＥＰ　（Ｒ）ＳＱ　６９７　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１１　ＳＶＧＩＬＧＤＧＦＧＴＴＬＸＭＳＫＳＱ　６９８　ＳＥＱ　Ｉｒｌ　Ｎｏ：　１２　ＧＩＳＶＩＰＡＥＰＲ５Ｑ　６９９　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１３　ＹＶＡ　（Ｅ）　ＶＦＥＴＶＰＤＸＩＦＳＱ　７０１　５ＢＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１４　Ｓ丁ＤＩＬＡＶＭＮＸＭ口ＦＡＴＬＮＸＡＸＳＱ　７０２　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１５　−ＩＧＰＡＦ　（１）　ＤＮＶＡＶＫＳΩ７０３　ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ：　１６　−ＩＧＰＡＦＩＤＮＶＡＶＫＳＱ　７０４５Ｅ［１１０Ｎｏ：　１７　（Ｓ）　ＴＳＬＳＶＬＭＮＴＳＱ、　７６５　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＱ：　ｔｓ　ＤＳＩＦＥＳＳＱ　７６６　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：　ｉｃｔ　ＤＹＩＱＧＧｌ、ＴＰ−ＷＳＱ　７６７　’ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２０　ＤＳＶＬ−５ＬＴＴＶ −ＧＧＳＳＥＡバンド°’Ｂ’　（続き）ＳＱ　７６９　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２２　Ｄ−ＦｒＧＩＳＶＩＰＡＥＰｒＳＱ　７７０　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２３　ＤＳＦｒＧＴＳＩｖＡＥＰｒＳＱ　７７２　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２４　ＤＷＶ［ＥＹｒＰＧＶＳＱ　７７３　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２５　ＤＨＬＬｅＬＥＧＧｓＥＶＬ−ａＮ−末端タンパク質をまた、消化しないで配列決定することができる。たとえば、タンパク質を、次の緩衝液において３０分間、Ｉｍｍｏ−ｂｉｌｏｎ−Ｐ　ＰＶ叶に対してエレクトロプロットする１１０％（Ｖ／Ｖ）メタノ−１し中、１２．．５ｍＭのトリス１５−Ｍのグリシン。エレクトロフ′口・ノドの後、膜を、５０％（Ｖ／Ｖ）　メ９　／−４／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中、０．１％（Ｗ／Ｖ）のクーマシーブルーにおいて５分間染色し、そして５０％（Ｖ／ν）メタノール７１０％（ν／Ｖ）酢酸の２〜３個の取り替えにより（それぞれの取り替えのために２分間）脱色する。この後、ＰＶＤＦ膜を、３０分間空気乾燥せしめ、そして次に、−２０℃ で加熱密閉されたプラスチ・ンクバックに貯蔵乾燥せしめる。ＰＶＤＦに対してプロットされたタンＲり質を用い、損なわれていないタンパク質のＮ−末端配列を直接的に決定する。この態様において、ゲッケイジュの３４ＫＤチオエステラーゼのＮ−末端アミノ酸を、下記のものとして決定する：ＳＱ　８３７５ＥＱ　１１）　Ｎｏ：　３９　ＬＥＨＫＰＫＦ’Ｋ　（Ｌ）　ＰＥ　（Ｌ）　ＬＤさらに、バンドＢペプチドよりもわずかに早く移動するゲ・ノケイジュのチオエステラーゼの配列を、下記のものとして決定する：ＳＱ　８４０　ＳＥＱ、　ＩＤ　Ｎｏ：　４０　ＬＬＤＤＨＦＧＬＨＧＬＶＦＲＲＴＦＡＩＲ５ＹＥＶＧＰＤＲば、３４及び４０にＤのベニバナのチオエステラーゼタンパク質により例示されるように、Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｉｎｃ、（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｍｌ）からのＰｒｏｂｅ−ＤｅｓｉｇｎＰｅｐｔｉｄｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅｔａｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ　に記載される方法が用いられる。下記第９表に示されるペプチドは、この態様で得られた。タンパク質を、５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌａｅｍｓｌ　Ｌ　前記）上で電気泳動し、そして上記のようにしてｆｓｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　ＰＶＤＦＩＩＩにプロットする。タンパク質バンドを、プロットから切断し、そして個々ノハンドを、７０％（Ｖ／Ｖ）蟻酸中、臭化シアンの１０ｍｇ／ｄ溶液２００μ！を含む１．５１ｄの遠心分離管に置く、タンパク質バンドを、この溶液中において室温で一晩インキユベートシ、そしてこのインキュベーションの後、臭化シアン溶液を除去し、そしてプールする。そのプールされた溶液を、Ｒｅａｃｔｉ−νａｐ　Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。ＩＬ）を用いて、連続窒素流下で乾燥せしめる。臭化シアンペプチドを、次の組成を有するペプチド溶離溶媒を用いてｆ＋ｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　ＰＶＤＦ膜から溶離する０７０％（ν／ｖ）のイソプロパツール、０．２％（ＩＴ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸、０．１ｓ＋Ｍのりシン及びＯ，Ｉｎ＋Ｍのチオグリコール酸。この溶離溶媒２００μｌを個々の管に添加し、そして管を室温で２時間、時おり振盪しながらインキュベートする０次に溶離溶媒を個々の管から除去し、プールし、乾燥せしめられた臭化シアン溶液を含む管に添加し、そして上記のようにして乾燥せしめる。溶離工程を、さらに２時間、新鮮な溶離溶媒によりくり返し、そしてプールされた溶媒を、前もって乾燥せしめられた材料に添加し、そして再び乾燥せしめる。ＨＰＬＣグレード水５０μｌを乾燥ペプチドに添加し、そして水を５ｐｅｅｄ−νａｃ（Ｓａｖａｎｔ＋　Ｉｎｃ−＋　Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ＋　ＮＹ）での蒸発により除去する。ペプチドを、Ｓｃｈａｇｇｅｒ　ａｎｄ　ｖｏｎ　Ｊａｇｏｗ（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８７）　１６６：３６８〜３７９）により記載されるシステムに類似するトリス／トリシンＳＯ３−ＰＡＧＥシステムを用いて分離する。１６％又は１０〜２０％（グラジェント）のアクリルアミドトリジン−３ＤＳ　− ＰＡＧＥブレーキャストゲル（Ｎｏｖｅｘ　Ｉｎｃ、＋　Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、　ＣＡ）を、分離のために使用する。ゲルを、Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ＋　ＣＡ）からの丁ａｌｌ　Ｍｉｇｈｔｙ　Ｓｍａｌｌ電気泳動装置にかける。ペプチドの電気泳動の前、ゲルを、３０ボルトの一定電圧で、３０〜６０分間、０．１〜Ｏ，ｈＭの濃度で、カソード緩衝液に添加されたチオグリコール酸によりブレーランする。使用されるランニング緩衝液は、Ｎｏｖｅｘからの１０×原液から製造され；最終濃度（１×）は０．１Ｍのトリス、０．ＩＭのトリシン及び０．１％（ｊｌ／Ｖ）のＳＤＳである。乾燥されたペプチドを、１５μＥの１（ＰＬＣグレード水及び次の成分から成る１５μｉの２×サンプル緩衝液に再！！！濁し：　０．１２５Ｍのトリス−ＨＣｊ！、２％（Ｗ／Ｖ）　（７）　ＳＤＳ。５％（Ｖ／Ｖ）のβ−メルカプトエタノール、２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール及び０．００２５％（Ｗ／Ｖ）のブロムフェノールプル、そしてゲル上に負荷する前、５分間煮沸する。ゲルを、約１時間、又はトラッキング染料がゲルの底部端を流出し始めるまで、１２５〜１５０ボルトの一定電圧でランする。ゲルを、移す前、１５〜３０分間、トランスファー緩衝液（１２５ｍ−のトリス、５０ｍＭのグリシン、１０％（Ｖ／Ｖ）のメタノール）に飽和する。ゲルを、５０ボルトの一定電圧で２時間、ＰｒｏＢＩｏｔｔ配列決定膜にプロットする。膜をクーマシーブルー（５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中において０．１％）により染色し、そして５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中において３×２分間脱色する。膜を、−２０”Ｃで貯蔵乾燥する前、３０〜４５分間、空気乾燥せしめる。ＰｒｏＢＩｏｔｔ上にプロットされたペプチドを、Ｐｏ１ｙｂｒｅｎｅ被覆されたガラス繊維フィルターの付加を伴わないタンパク質配列決定機の配列決定カートリッジに直接的に負荷することができる。ペプチドを、Ａｐｐｌｔｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給されるわずかに変性された反応サイクル、ＢＬＯＴ −１を用いて配列決定する。また、溶液Ｓ３（塩化ブチル）を、Ｓｌ及びＳ２　（ｎ−ヘプタン及び酢酸エチル）の５０　：　５０混合物により交換する。これらの２つの変性は、ＰｒｏＢＩｏｔｔにプロントされたサンプルが配列決定される場合いつでも使用される。３４及び４０ＫＤのペプチドの臭化シアンフラグメントのアミノ酸配列を、上記Ｎ−末端配列決定法により決定する。この態様で得られた配列は、第９表に示され、ここでアミノ酸のための１つの文字の略語が使用され、そしてＸは同定されていないアミノ酸を示す。１主１５８２８　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２６　ＧＳＬＴＥＤＧＬＳＹＫＥＶＦＩＩＲＸＹＥＶＧｉＮＫＴＡＳ８３０　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２８　ＡＶｌ？ＴＧＥＱＰＴＧＶＡＶＧＬＫＥＡＳ８３３　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２９　ＫＤＩ（ＡＳＧＱＶＩＧＳ８３４　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　３０　ＮＥＤＴｌｉＲＬＱＫＶＮＤＤＶＥＤＥＹＬＶＦＩＰＳ８３４Ｂ　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３１　［＋１ＥＩＹＸＹＰＡ上記手段が部分的臭化シアン切断をもたらす場合、共通するアミノ酸配列を有する種々の相対的分子量のペプチドが得られる。１つのペプチドのアミノ酸配列（示されていない配列）が、ベニバナのデサチュラーゼタンパク質のアミノ酸配列と対応することが決定された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎなど、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９９１）　８８　：　２５７８〜部分的アミノ酸配列が決定された後、それらは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）技法を通して植物チオエステラーゼのＤＮＡ配列を得るために使用され得る。従って、オリゴヌクレオチドフラグメントが、ＰＣＲプライマーとして使用するために最少の冗長性を有するアミノ酸配列にＡｐｐｌ　ｉｅｄ旧ｏｓｙｓｔｅｍＳモデル３８０ＡＤＮＡ合成機上で合成される。制限部位が、得られるＤＮＡフラグメントがクローニングにおいて容易に操作され得るように、オリゴヌクレオチドブライマーの末端中に企画される。植物チオエステラーゼ源から単離された精製ゲノムＤＮＡ又は１ｉＮＡを、反応における鋳型として使用する。ＰＣ）？反応を、５′−又は３′−プライマーとしてオリゴヌクレオチドの２種類の異なった組合せでＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　Ｋｉｔ＞及びＤＮＡ熱サイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を用いて行なう。得られたＤＮＡ生成物を、分離のためにアガロースゲル上で処理する。ＤＮＡ配列を、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２　Ｅｎｚｙａ＋ｅを有する７−Ｄｅａｚｅ−ｄＧＴＩＩＲｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ　（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を用いて、Ｓａｎｇｅｒなど、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ　（１９７７）　７４　：５４６３〜５４６７）のジデオキシ−鎖終結方法により決定する。配列データを、分子プログラムＧｅｌ及びＳＥＱのＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｔｃｓ　５ｕｉｔｅを用いて分析する。］、、ＲＮＡ単離全ＲＮＡを、↑ｕｒｐｅｎ　ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｔｈ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８６）　４　：　１１〜１５）の方法に従って成長するゲノケイジ１種子から単離する。手短には、新鮮な凍結材料５０ｇを、４Ｍのグアニジンチオシアネート及び２％サルコシル中で均質化する。透明な溶解物を５゜７ＭのＣｓＣ１クツシジン上で層化し、そして５０．０００ｒｐｍで５．５時間、遠心分離する。ＲＮＡベレットを、水に溶解し、フェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめる。得られたベレットが、水に再懸濁され、そして全ＲＮＡ画分を示す。ポリ（Ａ）ＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓなど、　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅ＋ｓ　Ｙｏｒｋ）に従ってこの材料から単離する。２．８　・チオエステラーゼｃＤＮＡのＰＣＩ＋第８表のペプチドからのタンパク質配列情報を用いて、変性オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３２ −３３）を構成する。（第１図を参照のこと）。それらのオリゴヌクレオチドを、ゲッケイジュ胚の全ｃＤＮＡからのチオエステラーゼ配列を増幅するためにプライマーとして使用する（Ｌｅｅなど、　５ｃｔｅｎｃｅ　（１９８８）　３３９　：　１２８１３４２９１）　、従って、ゲッケイジュ胚からのポリ（Ａ）　ＩＩＮＡを、Ｍ−１１ＬＶ逆転写酵素（ＢｉｉＬ。Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）により逆転写し、−重鎖ｃＤＮＡを得る。このｃＤＮＡを、ＰＣＲにおけるチオエステラーゼ特異的オリゴヌクレオチドのために鋳型として使用する。この反応を、次のサイクルプログラムのために設定された熱サイクラ−を用いて、製造業者の指針に従って行なう：３０回のサイクル；９４ °Ｃで１分、６５℃で１秒、６５°Ｃから５０’Ｃに２分の傾斜、及び７４°Ｃで２分。ＰＣＲ反応を、アガロースゲル電気泳動により分析する。得られた８００ｂｐバンドに対応するＤＮＡフラグメントをクローン化する。ＤＮＡ配列分析（ＳＥｏ　１０　ＮＯＳ：　３４−３５及び第２図）は、実際、このＤＮＡフラグメントがいくつかの本発明のチオエステラーゼペプチドをコードすることを示す。３、チオエステラーゼｃＤＮＡ？　Ｃ１二Ｚ図車里８００ｂｐのＰＣＲ生成されたＤＮＡフラグメントを、３ＺｐによりラベルしくＲａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｋｉｔ＋　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｓｉｌｌ＋＋Ｉｎｄｉａｎａｏｐｏｌｉｓ＋　ＩＮ）、そして従来通りに創造されたｃＤＮＡライブラリーの約２億個のフラークをスクリーンするためにプローブとして使用する：　（二本鎖のオリゴｄＴ感作ｃＤＮＡを、Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ。Ｇｅｎｅ　（１９８３）　２５　：　２６３〜２６９に従ってゲッケイジュ種子のポリ（Ａ）ＲＮＡから合成し；　ＥｃｏＲＩリンカ−をその末端に連結し、そして得られた材料を、バクテリオファージ発現ベクター、Ｌａａ＋ｂｄａ　ＺＡＰ（Ｓｔｒａ−ｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）中にクローン化する）。最長のライブラリークローンは、本発明のＰＣＲ配列と１１２ｂρでオーバーラツプする（１００％の配列がこの範囲でマツチする）、それは転写体の３′末端にさらに拡張する。第２図を参照のこと。ａｏｏｂｐのＰＣＩＩＩフラグメントと最長のバクテリオファージクローンとを共有する旧ｎｄ１１１部位で連結することによって（第２図、レーン（３４５）を参照のこと）、約１０００のコード塩基対の可能性ある読み取り枠と整合する１２００ｂｐの長さの隣接するＤＮＡフラグメントを創造する。完全なりローンを得るために、第２　ｃＤＮＡライブラリーを、プラスミドクローニングベクターｐｃＧＮ１７０３におけるゲソケイジュボリ（Ａ）　＋ＩＩＮＡから構成することができる。ｐｃＧＮ１７０３は、市販のベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｂａ　Ｈ１３−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ；　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。ＣＡ）に由来し、そして次の通りに製造される。　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｈ１３−のポリリンカーを、ＢａｍＨＩによる消化、ヤエナリ（ｓｕｎｇ　ｂｅａｎ）エンドヌクレアーゼによる処理及びプラント末端連結により変え、ＢａｍＨＩ −欠失プラスミド、ｐｃＧＮ１７００を創造する。ｐｃ［；Ｎ１７００をＥｃｏＲＩ及び５ｓｔｌ（隣接する成分部位）により消化し、そしてＢａｍＨＩ、ＰｓｔＴ。Ｘｂａ　Ｔ　、Ａｐａ　Ｉ及び５ｔａａ　ｒのための制限部位ををする合成リンカ−１ＡＡＴＴの５′オーバーハング及びＴＣＧＡの３′オーバーハングによりアニールする。　ｐｃＧＮ１７００へのそのリンカ−の挿入は、ＥｃｏＲ１部位を排除し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅに見出される５ｓｔｌ（また時々、”Ｓａｃ　Ｉ”として本明細書において言及される）部位を再創造し、そしてリンカ−上に含まれる新規の制限部位を付加する。得られたプラスミドｐｃＧＮ１７０２を、Ｈ４ｎｃｌｌｌｌにより消化し、そしてフレノウ酵素によりプラント末端化し；線状ＤＮＡをＰνｕ［Ｉにより部分的に消化し、そして希釈溶液においてＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結する。欠失されたＩａｃプロモーター６Ｎ域を有する形質転換体を選択しくｐｃＧＮ１７０３）　、そしてプラスミドクローニングベクターとして使用する。手短には、ｃＤＮ八合へは次の通りである。プラスミドクローニングベクターを、５ｓｔｌにより消化し、そしてホモポリマーニー末端を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてその得られた３′−オーバーハング付着端上に生成する。末端処理されたプラスミドを、オリゴ（ｄＡ）−セルロースクロマトグラフィーにより消化されていない又は末端処理されていないプラスミドから分離する。得られたベクターは、そのベクタープラスミドのいづれかの末端に共有結合されるｃＤＮＡ第１鎖の合成のためのプライマーとして作用する。　ｃＤＮＡ−ｇ＋ＲＮＡ−ベクター複合体を、デオキシグアノシントリホスフェートの存在下でターミナルトランスフェラーゼにより処理し、ｃＤＮＡｔＪｊの末端がＧ−末端を生成する。ＢａｍＨＩ部位に隣接する余分なｃＤＮＡ　−ｍＲＮＡ複合体をＢａｔａＨＩ消化により除去し、１つの末端でＢａｍＨＩ付着端及び他端でＧ−末端を有するｃＤＮＡ−＋１ＲＮＡ−ベクター複合体を残す、この複合体を、５　’　Ｂａｇ）Ｉ　Ｉ付着端、制限酵素Ｎｏｔ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ及び５ｓｔｒのための認識配列及び３’Ｃ−末端を存するアニールされた合成環化リンカ−を用いて環化する。連結及び修復の後、その環状複合体を、Ｅ、コリ株ＤＨ５ｃｒ　（ＢＲＬ＋　Ｇａｉｔｈｅｒｓ−ｂｕｒｇ、　ＭＤ）中に形質転換し、ｃＤＮＡライブラリーを生成する。プラスミドベクターｐｃＧＮ１７０３におけるゲンケイジュ胚のｃＤＮＡバンクは、約５００塩基対の平均的なｃＤＮＡ挿入体サイズを有する約１．５Ｘ１０’個のクローンを含む。ゲソケイジュのチオエステラーゼの完全な長さのｃＤＮＡ、３Ａ−１７（ｐＣＧＮ３８２２）を、上記のようにして、ｓｔＰ　−７ベルさレタ８００ｂｐＯ）ＰＣＲ生成フラグメントによりスクリーンすることによってｐｃＧＮ１７０３ライブラリーから単離した。４、並旦■万要約的には、約１２００ｂｐの隣接ＤＮＡ配列が第２図に示される。これは、成熱ゲッケイジュのチオエステラーゼのためのコードｆｆＩ［の約８０〜９０％及び翻訳停止及びボＩＪ（Ａ）付加配列を含む２００ｂρの３′未翻訳配列を含んで成る。配列決定された５８０ｂｐのコード領域は、成熟タンパク質の合計コード読み取り枠の約６０％であることが推定される。この部分的配列は、翻訳される場合、第８表から多くの配列（ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯＳ：　１−２５）（いくつかは第２図に整合して示される）を含むポリペプチドをコードする。コードされていないペプチドは、ｃＤＮＡのまだ配列決定されていない領域に位置し、又は完全に異なったタンパク質に由来する。ペプチド７０１　（ＳＥＱ　ＩＩＩ　Ｎｏ：　１４）のようないくつかの他のペプチドは、推定されるタンパク質配列とはわずかに異なる。第２回を参照のこと。これは、チオエステラーゼのため遺伝子群の存在を示す。ｃＤＮＡライブラリースクリーンを通して得られる第２の５８０ｂｐのＤＮＡフラグメントはまた、遺伝子群の証拠も提供することができる。この配列は、上記ＤＮＡレベルでクローンと約８０％の配列同一性を示す（第３図）、上方列における配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　３５）は、上記クローンを示し、そして下方列の配列（ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ：　３６）は、第２の５８０ｂｐのフラグメントを示す。アミノ酸レベルでは、より冗長性が見られる。完全な長さのチオエステラーゼｃＤＮＡ、３　Ａ　−１７の配列（ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋３８）は、第４Ｂ図に示される。このクローンの翻訳された配列（ＳＥ［１１０Ｎｏ：　３７）は、第４Ａ図に示される。余分な“出発”メチオニンは決定されていないが、しかし翻訳されたアミノ酸配列の位置１．　５及び１３に位置するメチオニンの１つである。五巨−ヘニハナの、Ｃ−１８を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡの単離例１４Ｂからの第９表のベニバナの３４及び４０Ｋ［＋タンパク質バンドの臭化シアンペプチド配列（ＳＥＱ　１０　ＮＯ３：　２Ｏ−３１）からの配列情報を分析し、ベニバナのチオエステラーゼタンパク質のペプチド地図を得る。共通アミノ酸配列を有するペプチドの分子質量（５０５−ＰＡＧＥにより評価されるような）の比較を用いて、チオエステラーゼタンパク質におけるそれらのペプチド間の順序及び距離を決定する。ゲッケイジュのチオエステラーゼのアミノ酸配列に対するそれらのペプチドの相同性比較（第４Ｂ図）が、第５図に示されるペプチド地図を確証する。ペプチド部位間の数字は、５８２８．５８２９．５８３０及び５８３４ペプチド配列に対応する配列のためのチオエステラーゼｃＤＮＡに基づいての評価された塩基対分離を示す。ＰＣＨのための変性オリゴヌクレオチドブライマーは、ベニバナのチオエステラーゼペプチドフラグメント５８２８．３８２９．３８３０及び５８３４のアミノ酸配列から構成される。８８３０由来のオリゴヌクレオチド混合物、８３０は、前方プライマー（アンチセンス鎖に結合し、蕎してセンスチオエステラーゼＤＮＡの合成をプライムする）として使用され、そして５８２９オリゴヌクレオチド混合物、８２９−　Ｉ！？及び８２９−２Ｒは、鋳型としてベニバナの種子ｃＤＮＡ　（下記ｃＤＮＡライブラリーからの）を利用するＰＣＩ？反応において、逆方向プライマー（センス鎖に結合し、そしてアンチセンスチオエステラーゼＤＮＡの合成をプライムする）として使用される。オリゴヌクレオチド混合物８３０は、ペプチド５８３０のアミノ酸５〜１１をコードするすべての可能な配列を含み、但し、位置５でグリシンのために選択されたコドンはＧＧＣであり、コドンＡＣＣは位置９でトレオニンのために選択され（イノシンと共にまた、その第３塩基で含まれる）、そして可能なコドンの初めのたった２つのヌクレオチドが、位置１１でバリンのために含まれる。　５８３０はまた、ＰＣＲ生成物のクローニングを促進するためにＮｃｏ　１部位をコードする５′末端で非チオエステラーゼ配列を含む。オリゴヌクレオチド混合物８２９−ＩＲは、ペプチド５８２９のアミノ酸１〜６をコードする配列のすべての可能な補体を含み、但し、可能なコドンの初めのたった２つのヌクレオチドが位置６でアスパラギンのために含まれる。８２９−ＩＲはまた、臭化シアン消化において切断された位置でメチオニン残基が存在することが仮定され得るように、３′末端でメチオニンコドンのための補体を含む。５８２９−　ＩＲはまた、Ｐｃｔ？生成物のクローニングを促進するためにＨ３ｎｄｍ部位をコードする、５′末端での非チオエステラーゼ配列を含む。オリゴヌクレオチド混合物８２９−２Ｒは、ペプチド５８２９のアミノ酸１９− ２５をコードする配列のすべての可能な補体を含むが、但し、イノシン塩基は、位置２２でイソロイシンのためのコドンの第３位置に含まれ、コドン＾ＣＧが、位置２４でトレオニンのために選択され（イノシンはまた、第３塩基で含まれる）、そして可能なコドンの初めのたった２つのヌクレオチドが、位置２５でヒスチジンのために含まれる。　８２９−２Ｒはまた、ＰＣ１ｉ生成物のクローニングを促進するために旧ｎｄｌ！１部位をコードする、５′末端で非−チオエステラーゼ配列末端でＢａｍ８１部位配列を有する前方プライマーである）のアミノ酸１．０−１．６、ペプチド８３４　（８３４は５′末端でＸｂａ　１部位配列を有する前方プライマーである）のアミノ酸１２−１８、及び５８３４　（８３４Ｒは５′末端で５ａｉ１部位配列を有する逆方向プライマーである）のアミノ酸８−１４から構成する。ＰＣ）１反応を、製造業者の規格に従って、Ｔａｑポリメラーゼ及びＯＮ＾熱サイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌ＠ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いて行なう。サイクルツバラメ−ターは、チオエステラーゼＰＣＲ生成物の最大収率を提供するために変えられ得る。ＰＣＲ生成物が、ゲル電気泳動により分析され、そして予測される〜８００ｂｐバンドが観察される。　５８３４及び５８２ｇに由来するオリゴヌクレオチドが、鋳型として５８３０１５８２９　Ｐｃｔ？生成物を用いての追加のＰｃｔ？により、又は５８３０１５８２９　ＰＣＲ生成物のサザンハイブリダイゼーシゴンにより、バンドがチオエステラーゼＤＮＡを示すことを確証するために使用される。〜８００ｂｐの生成物のＤＮＡ配列が、そのフラグメントがベニバナのチオエステラーゼタンパク質の一部をコードすることを確証するために決定される。〜８００ｂｐのチオエステラーゼフラグメントを、３Ｚｐによりラベルし、そしてプラスミドクローニングベクター、ＰＣＧＮ１７０３に構成されるベニバナｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするためにプローブとして使用する。　ｃＤＮＡライブラリーを、Ｇｏｌｄｂｅｒｇなと、（ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌ、　（１９８１）　８３　：　２０１〜２１７）により改良されたようなＪａｃｋｓｏｎ　ａｎｄＬａｒｋｉｎｓ　（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｔｏｌ、（１９７６）　５７　：　５〜１０）により初めに記載された方法により、開花後１４〜１７日目で収穫されたベニバナ胚から単離されたポリ（Ａ）　＋ＲＮＡから構成する。ポリアデニル化されたＲＮＡを、例１４．　Ｃ，３に記載されるようにして、プラスミドクローニングベクターｐｃＧＮ１７０３においてｃＤＮＡライブラリーを構成するために使用する。この態様で得られるベニバナ胚のｃＤＮＡバンクは、約１０００塩基対の平均的なｃＤＮＡ挿入体サイズを有する約３〜５Ｘ１０’ 個のクローンを含む。ｆｌＬ１８−Ｅ、　コリにおける、中ぐらいの鎖を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現この例においては、Ｅ、コリにおけるゲンケイジュのチオエステラーゼタンパク質の発現が記載される。１ｊ１４に記載される切断されたゲッケイジュのｃＤＮＡ　（１２００ｂｐ）は、Ｅ、コリ宿主細胞において３０にＤタンパク質として発現され、そしてそのｃＤＮＡフラグメントが、高められたＣ１２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性をその形質転換体上に付与することを示すデータが提供される。ｐＥＴ３８ベクター（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、など、　、Ｇｅｎｅ　（１９８７）　５０　：　１２５〜１３５）が、この研究のために、Ｅ、　コリ株ＢＬ２１（ＰＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔ。Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．（１９８６）１８９：　１１３〜１３０）宿主に使用される。そのｐＥＴ３ａベクターは、プロモーター及びバクテリオファージＴ７の３３ｂｐの５′読み取り枠を含む。Ｔ７ボリメラーゼは、Ｅ、コリＢＬ２１　（ＰＥ３）株に見出されるイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオザフクトビラノシド（ＩＰＴＧ）−誘発性１ａｃ　ＵＶ５プロモーターの調節的制御下にある。従って、ｐＥＴ３ａにより形質転換されたＥ、コリＢＬ２１（ＰＥ３）　ヘのｒＰＴＧの付加により、Ｔ７プロモーターが活性化されるであろう。ＢａｍＨｒ　／　ＥｃｏＲＩフラグメントの欠失及びチオエステラーゼ配列の置換により読み取り枠を整合して融合された第２図の切断されたｃＤＮＡを含む構造体を調製する。Ｅ、コリを、対照としてチオエステラーゼ（ｐＥＴ３ａ　−ＴＨＩＯ）及び変性されていないｐＥＴ３ａを含むｐＥＴ３ａ構造体により形質転換する。Ｅ、コリを３７°Ｃで、液体培地において増殖し、そして発現を、１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘発する。１時間の誘発の後、細胞を遠心分離により収穫し、アッセイ緩衝液に再懸濁し、そして高波処理により溶解する。細胞残骸を追加の遠心分離により除去し、そしてその上清液を、例１におけるように活性アッセイに使用する。１迎１ｐＥＴ３ａ　８　：　Ｏ−ＡＣＰ　３７０１．０　：　Ｏ−ＡＣＰ　７８７１２　；　０−ＡＣＰ　１０２８１４　：　Ｏ−ＡＣＰ　１２７１１６　：　０−ＡＣＰ　２８４Ｂ１８　：　１−ＡＣＰ　２８７７ｐＥＴ３ａ−ＴＨＩＯ８：　０−ＡＣＰ　３４９１０　：　０−ＡＣＰ　６２１１２　：　０−ＡＣＰ　２１２７１４　：　０−ＡＣＰ　１０３５＃　１６　：　Ｏ−ＡＣＰ　１９００、　１８　：　１−ＡＣＰ　２０２５その結果は、対照Ｅ、コリの溶解物が、試験されたすべてのアシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性及び長鎖の基質のための選択性を含むことを示す、ｐＥＴ３ａ　ＴＨＩＯ結果と対照とを比較すれば、基質選択性のパターンは異なることが明らかである。形質転換溶解物は、対照溶解物に比べて、他の基質に関して１２　：　０−ＡＣＰのひじょうに高められた活性を示す。これは、高められた１２　：　０−ＡＣＰ活性は、このｃＤＮＡフラグメントが、Ｅ、コリ細胞において活性酵素を生成するために十分のゲッケイジュ１２　：　０−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含むことを示す。さらに、完全な成熟ゲッケイジュチオエステラーゼタンパク質が、Ｅ、コリ細胞においてｌａｃ融合として発現される０例１４に記載される、ｐＣＧＮ３８２２の十分な長さのゲッケイジュチオエステラーゼｃＤＮＡの配列分析は、塩基３９４でのＸｂａ　１部位を示す、このＸｂａ　Ｉ部位での消化は、アミノ酸位置７２でロイシンを示すコドンのすぐ５′側のコード領域を切断する。このロイシンは、例１４Ａに記載されるようにアミノ末端残基のための候補体として同定された。ｐＣＧＮ３８２２　ｃＤＮＡの約１２００ｂｐフラグメントは、上記のようにして、仮定された成熟タンパク質開始部位で切断するχｂａＩによる消化により、そのｃＤＮＡの３′末端を端に有するベクター配列に生成される。Ｘｂａ　Ｉフラグメントは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ１３　（＋／　）（またＰＢＳ　＋　／　−と呼ばれる）クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　；　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）の−（マイナス）部のＸｂａ　Ｉ消化物上にクローンされる。チオエステラーゼ遺伝子クローンを、成熟タンパク質がＢｌｕｓｓｃｒｉｂｅベクターのＩａｃ　Ｚ遺伝子の部分と読み取り枠を整合して存在し、そしてＩａｃプロモーターの制御下に存在するように挿入する。得られた構造体ｐＣＧＮ３８２３及び反対の配向に挿入されたゲッケイジュチオエステラーゼを有する対照のＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ構造体を、Ｅ、コリ中に形質転換する。Ｅ、コリ細胞を、３７゛Ｃで液体培地中で増殖し、そしてＩａｃプロモーターからの発現を、０．１ｗＭのｒＰＴＧの最終濃度にｒＰＴＧの添加により誘発する。１時間の誘発の後、細胞を収穫し、溶解し、そして切断されたゲッケイジュチオエステラーゼについて上記のようにしてアンセイする。員旦麦ｐＣＧＮ３８２３　１／４０００　８　：　Ｏ−ＡＣＰ　０１０：０−ＡＣＰ　Ｏ〃１２　：　Ｏ−ＡＣＰ　１８４０１４　：　Ｏ−ＡＣＰ　１１６１６　：　Ｏ−ＡＣＰ　２０ｔａ：１−ｔｔｃｐ　５対照　１／４０００　８　：　０−ＡＣＰ　Ｏ、、ｌＱ：Ｑ−ＡＣＰ　０、　１２：０−ＡＣＰ　Ｏｓ　１４：Ｑ−ＡＣＰ　Ｏ＃　＃　１６：０−ＡＣＰ　１３１８：１−ＡＣＰ　６その結果は、仮定された成熟ゲッケイジュチオエステラーゼ酵素を発現するＥ、コリ細胞からの溶解物が、種々の長さの炭素鎖の他のＡＣＰ基質に対してよりも１２　：　０−ＡＣＰ基質に対して有意に高い活性を有することを示す。さらに、この活性は、切断されたゲノケイジュチオエステラーゼを発現するＥ、コリ細胞の溶解物における活性よりも２倍高い。Ｅ、コリ細胞におけるゲッケイジュチオエステラーゼタンパク質の発現がそれらの細胞の脂肪酸組成に対して効果を有するかどうかを決定するための研究を行なう。初期研究は、ゲッケイジュチオエステラーゼを含むＥ、コリ細胞の脂肪酸組成物における実質的を変化を同定するのに失敗した。例２に記載されるように成長する種子から精製されたゲ・７ケイジユチオエステラーゼ酵素の基質分析をまた行なう。結果は、下記第１２表に示される。第二０８：０−ＡＣＰ　Ｏｔｏ：ｏ−Ａｃｐ　Ｏ１２：　Ｏ−ＡＣＰ　１２６１１４　：　０−ＡＣＰ　６９１６　：　０−ＡＣＰ　１．２Ｉｌｌ！　：　ｌ　−ＡＣＰ　４３２Ｅ、コリ抽出物における及び成長するゲッケイジュ種子から精製されたチオエステラーゼの基質分析の結果の比較は、それらの２種の源からの酵素の活性プロフィールがＣ８，１０，１２，１４及び１６　ＡＣＰ基質による活性と実質的に同一であることを示す。胚から精製された酵素は、Ｅ、コリに発現されるチオエステラーゼよりもＣ１８：１Ｍ＆質に関してわずかに活性的であるが、この差異は、中ぐらいの鎖のチオエステラーゼタンパク質調製物から完全に除去されない長鎖のゲノケイジュチオエステラーゼの活性によると思われる。引１−植物チオニステラーゼによる形質転換Ａ、ファセオリン、ナビン、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＢｃｅ　４プロモーター領域を利用する、植物細胞におけるゲッケイジュチオエステラーゼの発現のための構造体を、次のようにして調製する。スエ±−オ」−４７夛オニステ之二護３Ａ−１，７の！、４５ｋｂフラグメントを、Ｂａ１ｌ及び５ａｉｌによる消化により得る。Ｂａ１１部位は、ｃＤＮＡ挿入体の位置１４９に位置し、そしてＳａｔ１部位は、ｃＤＮＡ挿入体の３′側に位置するポリリンカーに存在する。従って、このフラグメントは、完全なチオエステラーゼコード領域及び完全なｃＤＮＡ　３　’　領域、たとえば塩基１４４７〜１４５２に位置するポリアデニル化シグナル、ＡＡＡＴＡＡを含み、そしてまた、ｃＤＮＡのすぐ３′側に位置する制限消化部位Ｋｐｎ　Ｉ　、５ｔｓａ　Ｉ　、χｂａｌ及び５ａｉｌを含む。 β−ファセオリン５′非コード領域の８５０ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉｆフラグメントを、ｐ８．８ｐｒｏ　（Ｈｏｆｆｍａｎなど、　（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、　６　：　３２１３〜３２２１）から得、そしてＢａ５Ｈｒ部位でｐＬＩｃ９　（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、前記）中にクローンし、ｐＴＶ７９６を得る。　ｐＴＶ７９６におけるファセオリンフラグメンートは、ｐｊｃｑの５Ｉｌａ■部位がファセオリンプロモーターの３′側に位置するように配向される。〜ａｓｏｂｐのフラグメントを、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＳｍａ　ＩによるｐＴＶ７９６の消化により生成し、そしてゲル精製する。ファセオリンプロモーター（Ｈｉｎｄ　ｍ　／　Ｓｔｍａ　Ｉ　）及びチオエステラーゼコード領域（Ｂｇｌ　ＩＩ　／　Ｓａｔ　Ｉ　）を、Ｈｆｎｄ　Ｉ［［及び５ａｌｔにより消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クローニングベクター中に３段階連結により連結する。得られたプラスミドは、５　’　Ｂａｗｌ　１部位及び３’Ｋｐｒ＋１部位を含む、種々の制限部位を端に有する旧ｎｄｌ［［／５ａｌＩフラグメント上にファセオリンプロモーター／チオエステラーゼ構造体を含む、追加の植物の３′非コード領域は、チオエステラーゼフラグメントがボリアデニ化シグナルを含む場合、供給されない。ファセオリンプロモーター／チオエステラーゼフラグメントを、Ｂａｎ＋ＨＩ及びＫｐｎ　Ｉによる消化又はＸｂａ　Ｉによる部分的消化により得、そして植物形質転換のために、適切な二元ベクター、たとえばｐｃＧＮ１５５７又はｐＣＧＮ１５７Ｂ（ＭｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ＋　（１９９０）　ＰｌａｎｔＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、　１４　：　２６９〜２７６）中に連結する。３５Ｓ　チオエステラーゼ／ＩＩａｓ約１２００ｂｌｐを含み、そして完全なコード領域を含むチオエステラーゼｃＤＮＡ　３Ａ−１７のＢａｔ　Ｉ　／　Ｐｓｔ　Ｔフラグメントを、その１２００ｂ、フラプラントの制限酵素Ｂａ１ｌ及びＰｓｔｌによる部分的消化及びゲル精製により得る。そのフラグメントを、ＰｓｔＩ及びＢａ５ＨＩにより消化されたプラスミドクローニングベクター、たとえばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔヘクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉ　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ＋　ＣＡ）中に連結し、そしてＢａｗｌ（１部位を、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを用いてフィルインする。この工程において、Ｂａｍ８１部位は、チオエステラーゼｃＤＮＡのＢａ１１部位への連結により回復される。得られたプラスミドを、ＢａｍＨＩ及び［！ｃｏＲＩにより部分的に消化し、約１２００ｂｐのチオエステラーゼフラグメントを得る０次に、このフラグメントを、カリフラワーモザイク（ＣａＭＶ）　３５　Ｓ遺伝子（８ａＩＩＨ１部位のすぐ５′側）からの約０．９４ｋｂの５′非コ一ド配列、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕ＋ｗ　ｔｕｗｅｆａｃｉｅｎｓ）マノビンシンターゼ（Ｉｌａｓ）遺伝子（ＥｃｏＲ１部位のすぐ３′側）からの約０．７７ｋｂの３′非コ一ド配列、及びρυＣ１９（Ｎｅｗεｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ。Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）主鎖を含む約４．４ｋｂのＢａｍ［Ｉ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメント中にクローンする。Ｂａａ）ｌ　Ｔ　／ＥｃｏＦｊ　Ｉ　ＤＮＡフラグメントを、大きな方のプラスミドベクターの部分消化及び所望する４、４ｋｂのフラグメントのゲル精製により得る。３５５５’領域は、ＣＭ１８４１株（Ｃａｒｄｎｅｔ。など、　（１９８４）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：２８７１〜２８８７）の塩基６４９２〜７４３３からであり、これは、転写開始部位に関して約 −６４０〜約＋２である。端ａｓ３’非コード領域は、オクトビンＴｉプラスミドｐＴｉＡ６の塩基１９，２３９〜１８，４７４からである（番号は、Ｂａｒｋｅｒなと、　（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．−Ｂｉｏ！、（１９８３）　２　：　３３５〜３５０）により報告されているように、ひしように関連するｐＴｉ１５９５５の番号に対応する）。得られた３５Ｓ／チオエステラーゼ／ｌｌ１ａＳプラスミドを、フランキングＢｇｌ■部位で消化し、そしてＢａｍＨＩ消化された二元ベクター、たとえばｐｃＧＮ１５５７又はｐｃＧＮ１５７８　（ＭｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒ４ｅｌｔ＋　前記）中にクローンする。Ｂｃｅ　４　チオエステラーゼ！、４５ｋｂのチオエステラーゼｃＤＮＡ　Ｂａｌ　Ｉ　／　Ｓａｔ　Ｉフラグメントを、上記のようにして調製する。初期の種子の成長において好ましい発現を提供するＢｃｅ　４発現カセット、ｐｃＧＮ１８７０は、継続出願のアメリカ特許出願第０７／４９４，７２２号に記載される。３′末端がａｃｅ　４開始コドンのすぐ５′側に存在するＢｃｅ　４の５′非コード領域の約１ｋｂフラグメントを、Ｘｂａ　Ｉ及びＸｈｏ　ＩによるｐＣＧＮ１８７０の消化及び得られたｌｋｂのフラグメントのゲル精製により得る。Ｂｅｅ　４プロモーター（Ｘｂａ　Ｉ　／　Ｘｈｏ　Ｉ　）及びチオエステラーゼコード領域（Ｂａｌ　Ｉ　／　Ｓａｌ）を、χｂａｌ及び５ａｌｌにより消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クローニングベクター中に、三段階連結により連結する。得られたプラスミドは、種々の制限部位、たとえば５　’　ＢａｍＨ１部位及び３’ＫｐｎＩ部位を端に有するＸｂａ　Ｉ　／　Ｓａｔ　１フラグメント上に１ｉｃｅ　４プロモ一ター／チオエステラーゼ構造体を含む。追加の植物３′非コード領域は、チオエステラーゼフラグメントがポリアデニル化シグナルを含むので供給されない。Ｂｅｅ　４プロモーター／チオエステラーゼフラグメントを、ＢａｍＨＩによる消化及びにｐｎｌ（又は同じ認識配列を有するＡｓｐ７１８）による部分的消化により、又はＸｂａ　Ｉによる部分的消化により得、そして植物形質転換のために、適切な二元ベクター、たとえばｐｃＧＮ１５５７又はｐｃＧＮ１５７８（ＭｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、前記）中に連結する。ビン　チオエステーゼ　ビンナビン発現力セント、ｐｃＧＮ１８０８は、継続出願アメリカ特許第０７１５５０　、８０４号（これは引用により本明細書に組込まれる）に記載される。　ｐｃＧＮ１８０８を、耐抗生物質マーカーではなく発現配列のみの二元ベクター・たとえばｐｃＧＮ１５５１　（ＭｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｓｕｔｍｅｒｆｅｌｔ、前記）への移動を可能にするためにフランキング制限部位を含むように変性する。　Ｋｐｎｌ　、Ｎｏｔ　Ｉ及び旧ｎｄｌ［［制限部位を含む合成オリゴヌクレオチドをアニールし、そしてたった１つの）ｌｔｎｄ１部位が回収されるように、ｐｃＧＮ１８０８のユニークＨｉｎｄｌ１１部位で連結する。得られたプラスミドｐｃＧＮ３２００は、配列分析により確証されるように、ナビン３′−調節配列の３′末端でユニーク旧ｎｄｌｌｌ、Ｎｏｔｌ及びＫｐｎ　ｌ制限部位を含む。ナビン発現カセットの大部分を、Ｈｉｎｄ［ｌＩ及びＳａｃ　Ｉによる消化及びＨｌｎｄ　ｍ及びＳａｃ　Ｉ消化されたｐｌｃ１９Ｒ（Ｍａｒｓｈ、など、　（１９８４）　Ｇｅｎｅ３２：４３１〜４８５）への連結によりｐｃＧＮ３２００からサブクローンし、ｐｃＧＮ３２１２を製造する。ナビンプロモーター領域の末端５′−配列を、鋳型としてｐｃＧＮ３２００及びＳａｃ　１部位を末端に有する２つのプライマー並びにｐｃＧ８１８０８構成体からのｐｃＧＮ３２００のｐｔ＋ｃ主鎖を用いて、Ｐｃｔ？により再構成する。前方プライマーは、Ｃ１ａ　Ｉ　、旧ｎｄＩ［Ｉ、Ｎｏｔｌ及びＸｐｎ　ｌ制限部位並びにナビン５′−配列のヌクレオチド４０８−４２３（ＥｃｏＲＶ部位からの）を含み、そして逆方向プライマーは、５′−プロモーターにユニークＳａｃ　１部位を含むナビン配列７１８−７３９に対する補体を含む。ＰＣＲを、製造業者の規格に従って、ＰｅｒｋｉｎＥ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ熱サイクラ−を用いて行なった。　ＰＣＲフラグメントを、Ｈｉｎｃ　Ｕにより消化されたｐ［Ｊｃ８（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：２５９〜２６８）中にプラント−末端化されたフラグメントとしてサブクローンし、ｐｃＧＮ３２１７を得る。ナビン挿入体と交差してのｐｃＧＮ３２１７の配列決定は、不適切なヌクレオチドがＰＣ）ｌにより導入されなかったことを確証する。　ｐｃＧＮ３２１７におけるナビン５−配列を、Ｃ１ａ　Ｉ及びＳａｃ　Ｉによる消化及びＣ１ａ　Ｉ及びＳａｃ　Ｉにより消化されたｐｃＧＮ３２１２への連結によりナピン発現カセットの残りに連結する。得られた発現カセットｐｃＧＮ３２２１を、旧ｎｄｌ［［により消化し、そしてナビン発現配列をゲル精製し、そしてＨｉｎｄｌＵにより消化されたｐｒｃ２０Ｈ（Ｍａｒｓｈ、前記）に連結する。最終発現カセットは、ｐｃＧＮ１８０８に見出されるように、実質的に同一の１．７２５ナピン５′及び１．２６５３’調節配列を、耐アンピシリンバックグラウンドに含む、ｐＣＧＮ３２２３である。調節領域は、旧ｎｄｌ［［、Ｎｏｔｌ及びＫｐｎ　ｌ制限部位を端に有し、そしてユニーク５ａｉｌ、Ｂｇｌｌｌ、Ｐｓｔｌ及びＸｈｏ　Ｉクローニング部位は、５′及び３′非コード領域間に位置する。上記１２００ｂｐのＢａｌ　ｌ　／　Ｐｓｔ　ＩチオエステラーゼｃＤＮＡフラグメントを、５ａｉｌにより消化されたナビン発現カセットｐＣＧＮ３２２３中にクローンし、そしてＳａｌ　１部位をＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを用いてフィルインし、続いてＰｓｔｌにより消化する。Ｓａｌ１部位を、この連結により再構成する。これらの操作により生成されたナビン／チオエステラーゼ／ナピンプラスミドをＢａａ＋ＨＩにより消化し、そしてＫｐｎ　Ｉにより部分的に消化し、約３．３ｋｂのフラグメントを生成する。このフラグメントは、〜１．７ｋｂのナビン５ ′非コード配列、〜１２００ｂｐのＢａｌ　Ｉ　／　Ｐｓｔ　ＩチオエステラーゼｃＤＮＡフラグメント及び〜０．３３ｋｂの３′ナビン非コード領域を含み、ナビン３′の１．２６５ｋｂの残りは、この領域におけるＢａｍＨＩ部位により欠失された。〜３．３ｋｂのフラグメントを、植物形質転換のために、Ｋｐｎ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ消化ｐｃＧＮ１５５７又はｐｃＧＮ１５７８（ＭｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ＋前記）に連結する。Ｂ８種々の方法が、表現型変化をもたらす配列の転写又は転写及び翻訳を得るために、宿主のゲノム中に、対象のＩＪＮＡ配列を挿入するために開発されて来た。ブラシカ　（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のノ　−ブラシカ　ナバスｃｖ、ウェスター（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｃｖ、　Ｗｅｓｔａｒ）の種子を、９５％エタノールに２分間含浸し、表面を小満のＴｗｅｅｎ　２０を含む１．０％次亜塩素酸ナトリウム溶液で４５分間、殺菌し、そして滅菌されたＮ留水により３度すすぐ０次に種子を、ピリオドキシン（５０μｓ／ｊり　、ニコチン酸（５０ｇｇ／ｊり　、グリシン（２００μｇ／ｌ）及び０３６％Ｐｈｙｔａｇａｒ　（Ｇｉｂｃｏ）　ｐＨ５，８により補充されたＭｕｒａ−ｓｈｉｇｅ最少有機培地（Ｇｔｂｃｏ；　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）の１／１０濃度を有するＭａｇｅｎｔａボックスにプレートする０種子を、約６５μのアインシュタイン／ｍｔ　・秒（μＥｗ−”Ｓ−’）の強さの冷螢光及び赤光による１６時間の光期間において２２°ＣでＰｅｒｃｉｖａｌチャンバー中で発芽せしめる。胚軸を、５〜７日目の苗から切り出し、約４ｍｍの長さの断片に切断し、そして培養プレート上にプレートする（Ｈｏｒｓｃｈなど、　、５ｃｉ−ｅｎｃｅ（１９８５）　２２７　：　１２２９〜１２３１）　、培養プレートを、約３０１ｄのＵＳ塩基材（Ｃａｒｏｌｔｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、　Ｂｕｒｌｊｎｇｔｏｎ、　ＮＣ）、１００ｍｇ／ｌのイノシトール、１．３ｔａｇ／ｌのチアミン −）１ｃ４２．３％スクロースを含む２００ＢのＫＨ，ＰＯ４，２，４−Ｄ（１，０ｍｇ＃り、　０．６％Ｗ／ＶのＰｈｙｔａｇａｒを含むペトリ皿（１，００Ｘ　２５ｍｍ）上に１．０１１１のタバコ懸濁培養物をプレートすることによって、使用の１日前に調製し、オートクレーブする前、ｐＨを５．８に１ｉ節する（ＭＳ　Ｏ／　１　／、０培地）、無菌フィルター紙ディスコ（Ｗｈａｔｍａｎ　３　Ｉｌｍ）を、使用の前、培養層の上部に置く。タバコ懸濁培養物を、２．　４　Ｄ（０，２ｍｇ／ｆ）　、Ｋｉｎｅｔｉｎ　（０，１ａ＋ｇ／ｆｆ１）を含む培養プレートについて記載されているようにして、１００−の新鮮なＭＳ培地に】０−の培養物を移すことによって毎週、継代培養する。培養細胞が使用されない実験においては、胚軸外植物を切断し、そして１１ｓｏ／Ｉ１０培地の上部のフィルター紙ディスコ上に置く。すべての胚軸外植物を、３０ｕＥ＋＋＋−”Ｓ−’〜６５μＥＭ−”Ｓ−’の強さの連続光を伴って、２２°Ｃで２４時間、培養プレート上でプレインキュベ− １・する。二元プラスミドを含むＡ、ツメファシェンス株ＥＨＡＩＯＬの単一のコロニーを、５ｉのＭＧ／Ｌブイヨンに移し、そして３０℃で一晩増殖する。胚軸外植物を、１×１０″個の細菌／ｄに希釈された細菌を有する７〜１２ｄのＭＧ／Ｌブイヨンに含浸し、そして１０〜２５分後、培養プレート上に置く。ＩＩ！、当たりＭＧ／Ｌブイヨンは、５ｇのマンニトール、１ｇのし一グルタミン酸又は１．１５ｇのグルタミン酸ナトリウム、０．２５ｇのにＩｌ、ＰＯ，、０，１０ｇのＮａＣ１，０，１０ｇのＭＧＳＯ４−７１１，０，１ｍｇのビオチン、５ｇのトリプトン及び２．５ｇの酵母抽出物を含み、そしてブイヨンをｐＨ７，０に調節する。アグロバクテリウムとの４８時間の同時インキュベーションの後、胚軸外植物を、フィルター殺菌されたカルベニシリン（５００ｍｇ／　ｊ！、オートクレーブの後に添加される）及びカナマイシンスルフニー　ト（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍＨＩｎｄｉａｎａｐｏ−１ｉｓ、　ＩＮ）を２５ｍｇ／ｊ！の濃度で含むＢ５０／Ｉ１０力ルス誘発培地に移す。６５ｄＥＭ−”Ｓ−’の連続光での３〜７日の培養の後、カルス組織が、切断表面上に見えるようになり、そして胚軸外植物を、芽誘発培地、Ｂ５ＢＺ　（３ｍｇ／ｉ！（Ｄヘンジ）Ｌ／７ミノプリン、ｌ＠ｇ／ｆのゼアチン、１％のスクロース、０．６％のＰｈｙｔａｇａｒにより補充されたＢ５塩及びビタミン、５．８のｐＨに＋１１節されている）に移す。この培地はまた、カルベニシリン（５００ｍｇ／　ｌ　）及びカナマイシンスルフェート（２５ｍｇ／Ｉ！、）を含む。胚軸外植物を、新鮮な芽誘発培地上で２週ごとに継代培養する。芽を、１〜３力月後、胚軸カルスから再生する。少なくとも１ｃｍの高さの緑色の芽を、そのカルスから切除し、そしてＢ５塩及びビタミン、１％スクロース、カルベニシリン（３００ｍｇ／　ｌ）　、カナマイシンスルフェート　（５０ｎ＋ｇ／　ｉ！、）及び０．６％−／ＶのＰｈｙｔａｇａｒを含む培地上に置く、２〜４遇後、緑色のまま存続する芽を底部で切断し、そして根誘発培地（Ｂ５塩及びビタミン、１％スクロース、２　ｍｇ／２のインドール酪酸、５０ｔａｇ／ｌのカナマイシンスルフェート及び０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒ）を含むＭａｇｅｎ　ｔａボックスに移す。緑色の根を付けた芽を、チオエステラーゼ活性について試験する。ビーナンツの７　転対象のＤＮＡ配列を、少なくともプロモーター領域、対象の遺伝子及び終結領域を含んで成る発現力セントとして、ヨー口・ンノで特許出願第３３２８５５号及び継続出ＩＩＩ　ＵＳＳＮ　０７／２２５，３３２（１９８８年７月２７日に出願された）に記載されるような粒子面１！　（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）により植物ゲノム中に導入することができる。手短に言及すれば、０．５ｄＭ〜３μＭの範囲の大きさのタングステン又は全粒子を、発現カセットのＤＮＡにより被覆する。このＤＮＡは、水性混合物又は乾燥ＤＮＡ／粒子沈殿物の形で存在することができる。衝撃のための標的として使用される組織は、胚軸外植物、芽分製組織、未熟小葉又は弱からのものであり得る。ＤＮＡ被覆された粒子による＆ｌＩ織の衝撃を、Ｂｉｏｔｉｓｔｉｃｓ”粒子ガン（Ｄｕｐｏｎｔ　；　Ｗｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ＋　ＤＥ）を用いて行なう。粒子を、銃砲口から１〜１４ｃｍの範囲の目に見える距離で銃砲に配置する。衝撃を与えられる組織を、停止プレートの下に配置し；試験を２０ｃｍまでの距離で組織に対して行なう。発砲の瞬間で、組織を、ナイロンネ７）又は１０ｇＭ〜３００μＭの範囲のメツシュと六イロンネ・ントとの組合せにより保護する。衝撃の後、植物を、Ａｔｒｅｙａなど７、　（Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１，９８４）　３４：　３７９〜３８３）の方法に従って再生することができる。手短に言及すれば、胚軸組織又は胚軸セグメントを、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ、　Ｐｈｙｓｉｏ、ＰＩａｎｔ、（１９６２）　＋５：　４７３）（胚軸セグメントのためには門Ｓ＋　２．ＯＢ／　ｌの６−ヘンシルアデニン（ＢＡ））上に置き、そして２５±２℃で１週間、暗室でインキュベートし、そして続いて、連続した白色の冷螢光（６，８Ｗ／ｍ” ）に移す、培養の１０日日日、苗を、無菌土壌を含むポットに移し、そして３〜５日目、日陰に保持し、そして最後に、温室に移す。推定上のトランスジェニック芽は根を付ける。植物ゲノム中への外来性［ＩＮＡの組込みは、当業者に良く知られている種々の方法により確かめられ得る。 ■旦−他の植物チオエステラーゼの獲得ゲンケイジュのチオエステラーゼについての配列（アミノ酸及びＤＮＡ）を得たようにして、他の植物源からの類似する遺伝子を容易に単離することができる。この例においては、２種の方法が他のチオエステラーゼ遺伝子を単離するために記載されているコ（Ａ）ゲノケイジェのチオエステラーゼ遺伝子からの配列又はペプチド配列情報を用いてのＤＮＡハイブリダイゼーション技法及び（Ｂ）プローブとしてゲッケイジュタンパク質に対する抗体゛を用いて免疫学的交差反応性技法。これらのいづれかの技法においては、所望する植物からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーが必要とされる。　ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを構成するための多くの方法が、Ｍａｎｉａ’ｓ、など、　（Ｍ（＋ｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ′Ｉａｒ−ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）のチャプター８及び９に提供されている。例１４に記載される方法はまた、ｃＤＮＡライブラリーの構成のためにも使用され得る。Ａ、他の植物チオエステラーゼ遺伝子を単離するためにＤＮＡハイブリダイゼーションに使用するためのプローブは、供給されるゲッケイジェのチオエステラーゼ遺伝子配列から又は他方、供給されるゲノケイジュのチオエステラーゼペプチド配列を用いてのＰＣＨにより得られる。この例においては、８ｏｏｂｐのＰＣＲ生成［ＩＮＡフラグメントがプローブとして使用される。所望する植物種からの胚ＲＮ＾のノザン分析を、適切なハイブリダイゼーション条件を決定するために行なう。ＲＮＡを、例１４．０に記載されるようにして胚から単離し、ホルムアルデヒド／アガロースゲル下で電気泳動し、そしてＦｏｕｒｏｅｙ＋　など。（Ｆｏｃｕｓ　（１９８８）　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ−ｇｉｅｓ＋　Ｉｎｃ、＋　１０：　５〜７）により記載されるようにナイロン膜フィルターに移す。ｊｒｐ− ラベルされたプローブ＜Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡラベリングキント、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ；　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）を、５０％ホルムアミド、６ｘｓｓｃｃ又は６　Ｘ５ＳＰＥ）　、５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％ＳＤＳ、及びｌＯＯμｇ／−の変性サケ精子ＤＮＡフラグメントを含むハイブリダイゼーション溶液に添加する。ラベルされたプローブを含むハイブリダイゼーション溶液を、相同（５０〜８０％）配列へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするために約４０°Ｃで１８時間又はそれ以上の間、ノザンフィルターと共にインキュベートする。次に、フィルターを、低い緊縮下（約１ｘｓｓｃにおいて室温〜４２°Ｃ）、洗浄する。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度を、Ｂｅ　Ｉ　ｔｚ　、など、　（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８３）　１００　：　２６６〜２８５）に記載されるようにしてプローブの評価された溶融温度に基づいて調節することができる。追加の試験においては、温度は、ハイブリダイゼーション又は洗浄段階のいづれかにおいて高められ、そして／又は塩含有率は、特定のハイブリダイズする配列の検出を改良するために低められる。有用なプローブ及び適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件が上記のようにして同定された後、ｃＤＮＡライブラリーを、３Ｚｐラベルされたフラグメント及び最適化された条件を用いてスクリーンする。たとえば、樟脳（シナモマム　カンホラ（Ｃｉｎｎａ＠ｏｍｕｍ　ｃａａ＋ｐｈｏｒａ））のチオエステラーゼクローンを、ゲッケイジュ及びベニバナのチオエステラーゼクローンからの核酸及びアミノ酸配列情報を用いて単離する。成長する樟脳胚から単離されたＲＮＡに対するゲッケイジュのチオエステラーゼｃｒＪＮＡクローンの相同性を、次のようにしてノザン分析により観察する。全ＲＮＡを、Ｃａｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、　Ｍｏ！ｅｃｕｌａｒＢｔｏｌｏｇｙ、ページ４．３．１〜４．３．４　（Ａｕｓｕｂｅｌなど、　、（１，９８７）　；Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）に記載されているＳ［ｌＳ／フェノール抽出法の適用により、生長する樟脳胚１ｇから単離する。この抽出のための粉砕緩衝液は、１００ｍＭのＬｉＣ４２、１００ｍＭのトリス、ｐ１９，１ｈＭのＥＤＴＡ。１％ＳＯ８及び０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む、１ｇの胚からの抽出のためには、ｐＨ８に平衡化された、１０ａｉの粉砕緩衝液＋３ｄのフェノールを、粉末化された胚に添加する。均質化段階は、公開されている方法に記載されているように、ポリトロンの代わりに乳鉢で行なわれ、そして均質化に続く加熱段階は排除される。遠心分離、サンプルのフェノール／クロロホルム抽出及びＲＮＡのＬｉｆＪ！沈殿は、記載される通りである。全ＲＮＡ　（１０〜２０μｇ）を、ホルムアルデヒド／アガロースゲルにおいて電気泳動し、そしてＦｏｕｒｎｅｙなど、（前記）により記載されるようにしてナイロン膜フィルターに移す。ノザンフィルターのハイブリダイゼーションのためのプローブを、ｐＣＧＮ３８２２の５ａｌｌ消化物、すなわち十分な長さのゲッケイジュチオエステラーゼｃＤＮＡから、ベニバナチオエステラーゼｃＤＮＡ配列に対するオリゴヌクレオチドを用いてのＰＣＲにより調製し、約１３００ｂｐのフラグメントを生成する。前方プライマーは、ベニバナのチオエステラーゼ遺伝子配列のヌクレオチド２１２〜２１８（配列番号３日）を含み、そして逆方向プライマーは、そのｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５１０〜１５２６に対する補体である。そのフラグメントを、Ｐｒｅｐ−＾−Ｇｅｎｅ　ＤＮＡ精製キット（ＢｉｏＲａｄ　；　Ｒｔｃｈ曽ｏｎｄ。ＣＡ）を用いてゲル精製し、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＦＩａｎｎｈｅｉｍ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏ−１ｉｓ、　ＩＮ）のランダムブライミングラベルキットを用いて放射性ラベルする。ノザンフィルターを、５０％ホルムアミド、５　Ｘ５ＳＣ，５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）　、５　Ｘ（ｌｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％Ｓ０５．　５−ＨのＥＤＴＡ及び０．１ｍｇ／ｄの変性ＤＮＡ溶液において、３０℃で一晩ハイブリダイズする。フィルターを、ｏ、１ｘｓｓｃ、　ｏ、ｉ％ＳＤＳ溶液により２度洗浄する（それぞれの洗浄は１５分である）、ハイブリダイズされたフィルターのオートラジオグラフィーは、樟脳胚サンプルにおいて約１３００ｂｐのＲＮＡバンドに対して強いハイブリダイゼーシシンシグナルを示す、このバンドは、ゲッケイジュのチオエステラーゼ＠ＲＮＡとほぼ同じ大きさである。樟脳チオエステラーゼ遺伝子のフラグメントを得るために、ＰＣＲを、ゲッケイジュ及びベニバナのチオエステラーゼ間に観察されるペプチドに対するオリゴヌクレオチドを用いて行なう。前方プライマー（８２８−１−２８００）は、ゲッケイジュチオエステラーゼタンパク質のアミノ酸１０１−１０７　（配列番号３７）及びベニハナチオエステラーゼベブチド５８２８のアミノ酸１６−２２　（配列番号２６）のためのすべての可能なコード配列の混合物である。これらのアミノ酸配列は、５８２８の位置１８での未知のアミノ酸がセリンであることを仮定する場合、同一である。プライマー（２８ｂｐ）は、イノシン（Ｉ）又はシトシン（Ｃ）が、塩基がＡ、　Ｇ、　Ｔ又はＣのいづれかである場合に導入されるように構成される。最終アミノ酸の未知の第３塩基、すなわちグリシンが、オリゴヌクレオチド配列中に導入され、そして配列ＣＴＧＧＡＴＣＣが、Ｂａ■Ｈ１制限部位を含むように５′末端で付加される。逆方向プライマー（８２９−２ａ　−２７９８）は、ゲンケイジュチオエステラーゼタンパク質のアミノ酸２７１−２７６（配列番号３７）及びベニハナチオエステラーゼペプチド５８２９のアミノ酸１−６（配列番号２７）のためのコード配列に対するすべての可能な補体の混合物である。これらの６個のアミノ酸ペプチド領域は、それらの第２アミノ酸においてのみ異なり（この残基は、ゲッケイジュにおいてグルタミンとして及びベニバナペプチドにおいてリジンとして同定される）、そして両アミノ酸コドンは、オリゴヌクレオチド混合物において示される。逆方向プライマー（２０ｂｐ）は、塩基がＡ、Ｇ、Ｔ又はＣである場合、 ■又はＣを組込み、そして配列ＧＣＣＴＣＧＡＧが、Ｋｈｏ　Ｉ　制限部位を付加するために、５′末端で付加される。ポリメラーゼ鎖反応を、鋳型として、逆転写された樟脳ＲＮＡを用いて行なう。その反応は、次のサイクルでプログラムされたＢｉｏｓｙ−ｃｌｅｒ　０ｖｅｎ（Ｂｉａｓ　Ｃａｒｐ、　；　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ＋　ＣＴ）において行なわれる２８２９５°Ｃで２分間、　Ｐ：９５°Ｃで１５秒間、１秒後、６５℃に低下、　１秒後、６５°Ｃに低下、６５℃で１秒間保持、　６５°Ｃで１秒間保持、２分後、４５°Ｃに低下、　２分後、５５°Ｃに低下、４５°Ｃで３０秒間保持、　５５°Ｃで１５秒間保持、１秒後、７２°Ｃに上げ、　１秒後、７２°Ｃに上げ、７２℃で３０秒間保持、　７２°Ｃで１５秒間保持、１秒後、９５℃に上げる。　１秒後、９５°Ｃに上げる。サイクルＮを行ない、そして６回くり返し、この後、サイクルＰを行ない、そして３７回くり返す。約５００〜６００ｂｐのバンドを、ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動により同定する。これは、ゲッケイジュのチオエステラーゼ配列におけるペプチド間の距離の分析から予測されるおおよそのフラグメントの大きさである。Ｐｃｔ？フラグメントを、適切なりローニングベクター中にサブクローンし、そしてそのＤＮＡ配列を、チオエステラーゼ配列を確かめるために決定する０次に、そのフラグメントを用いて、樟脳ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーンし、樟脳チオエステラーゼクローンを単離する。Ｂ、免疫学的スクリーニングのために、ゲノケイジュチオエステラーゼに対する抗体を、ゲッケイジュから精製されたチオエステラーゼタンパク質又は例１６に記載されるようにＥ、コリに発現される切断されたチオエステラーゼタンパク質によりウサギ又はマウスを注射することによって調製する。関連タンパク質をコードする遺伝子を、Ｍａｎｉａｔｔｓ、　など、（前記）のチャプター１２に記載されるようにして、発現ベクターλｇｔｌｌに移行された対象の植物からｃＤＮＡライブラリーをスクリーンすることによって単離する。次に、そのライブラリーをプレートし、クローンされた遺伝子からのタンパク質を生成するために誘発し、そしてスクリーンのために固定するために膜上に移す。チオエステラーゼ抗体を、関連するタンパク質への抗体の結合を可能にするために固定されたタンパク質を含むフィルターに供給する。チオエステラーゼタンパク質をコードするクローンを、０ｂｅｒｆｅｌｄｅｒ　（Ｆｏｃｕｓ　（１９８９）ＢＲＬ／Ｌｔｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＋　Ｉｎｃ、　１１　：　１〜５　）により記載されるようにして、アルカリホスフェートを用いての第２抗体／酵素接合体システムを用いて、ニトロセルロースフィルター上での抗体／タンパク質複合体の検出により同定する。光−捉：ＤＮＡハイブリダイゼーション又は免疫学的スクリーニング技法を用いて同定されるクローンを、次に精製し、そしてＤＮＡを、Ｍａｎｉａ−ｉｉ５＋　など、（前記）に提供されるような技法を用いて単離する。その遺伝子ＤＮＡ配列を、例１４及び１５に記載されているようにして決定する。この態様においては、クローンは関連するチオエステラーゼをコードすることが確証される。他方、そのタンパク質は、それが所望する活性を有することを示すために、ゲッケイジュチオエステラーゼのために上記のようにしてＥ、コリに発現される。新しく単離された植物チオエステラーゼ配列は、上記技法を用いて、他の植物種からチオエステラーゼのための遺伝子を単離するためにも使用され得る。上記例によれば、長鎖及び中ぐらいの鎖の脂肪酸の生成における臨界的要因の例示が記載されている。カリホルニア　ゲッケイジュからの部分的に精製された、Ｃ１２を好むアシルＡＣＰチオエステラーゼを得るための手段が提供され、タンパク質の種々の性質が、アミノ酸及びそれに関連する核酸配列を得、そして使用するために記載されている。ゲッケイジュのチオエステラーゼの部分的ｃＤＮＡ配列がまた提供され、そしてそれによりコードされるポリペプチドの活性も示される。ゲッケイジュチオエステラーゼの十分な配列がまた、宿主細胞において使用するために種々の構造体と共に与えられている。さらに、クツエア　ツーケリアナからＣＩＯを好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの部分的精製された調製物を得るための方法も提供される。ベニバナからの長鎖を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼもまた記載される。本発明を通して、種々の源から及び種々の適用のために、植物チオエステラーゼをコードするアミノ酸及び核酸配列を得ることができる。本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルの表示である。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。前記発明は、明確に理解するためにいくらか詳細に例示的及び測的に記載されて来たが、いくらかの変更及び修飾が、本発明の範囲内で実施され得ることは、明らかであろう。配列の列挙（１）一般的情報（ｉ）出版者：　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｈｕｗ　ＭａｅｌｏｒＰｏｌｌａｒｄ、　Ｍｊｃｈａｅｌ　ＲｏｍａｎＶｏｅｋｌｅｒ、　Ｔｏｎｉ　ＡｌｏｉｓＴｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ａ（ｉｉ）発明の表題：植物チオエステラーゼ（ｉｉｉ）配列の数：４０（１ｖ）通信先：（Ａ）住所：　Ｃａｌｇｅｎｅ、　Ｉｎｃ。（Ｂ）ストリー）　：　１９２０　Ｆｉｆｔｈ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）町：　Ｄａｖｔｓ（Ｄ）州：　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ（Ｅ）国：　ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号：　９５６１６（■）コンピューター読取リフォーム：（Ａ）メジアムタイブ：　Ｄｉｓｋｅｔｔｅ、　３．５０インチ、　７２０ＫＢ貯蔵（Ｂ）コンピューター：　Ａｐｐｌｅ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｃ）操作システム：　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　６．０．７（Ｄ）ソフトウェアー：　ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷｏｒｄ　４．０（ｖｉ）現出願日：（Ａ）出願番号：表示されていない（Ｂ）提出日：（Ｃ）種類：（ｖｉ）前適用日：（Ａ）適用番号：　０７／６６２．００７（Ｂ）提出日：　２７−ＦＥＢ−１９９１（Ａ、）出願番号：　０７１５１４，０３０（Ｂ）提出日：　２６−ＡＰＲ −１９９０（Ａ）出願番号：　０７／６２０，４２６（Ｂ）提出日：　３Ｏ−ＮＯＶ−１９９０（ｖｉ）アトニー／エージェント情報：（Ａ）名称：　Ｅｌｊｚａｂｅｔｈ　Ｌａ５ｓｓｎ（Ｂ）登録番号：　３１，８４５（Ａ）名称：　Ｄｏｎｎａ　Ｅ、５ｃｈｅｒｅｒ（Ｂ）登録番号：　Ｐ−３４，７１９（Ｃ）参照／ドケット番号：　ＣＧＮＥ　７０−３　ＷＯ（ｉｘ）通信情報：（Ａ）電話：　９１６−７５３−６３１３（Ｂ）テレックス：　９１６−７５３４５１０（２）配列番号ｌについての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：１７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１：ｉｎ（２）配列番号２についての情報＝（ｉ）配列特徴；（Ａ）長さ＝６個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２：Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｖａ１（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝１２個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１ｊ）配列の種！１：ベブチド（ｘｉ）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列特徴；（Ａ、）長さ：２３個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４：（２）配列番号５についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ：１６個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ　）配列の種ｌｌ：ベブチド（ｘｉ）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列時＠：（Ａ）長さ：１５個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号６：Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝１７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列；配列番号７：（２）配列番号８についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ２１７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号８：ｙｓ（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：１０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー；直鎖状（ｉｉ　）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号９：Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（２）配列番号１０についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ、）長さ；】５個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ　）配列の種！！＝ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１０：（２）配列番号１１についての情報：（ｉ）配列時！！！：（Ａ）長さ２１７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｆ　）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１１：ｙｓ（２）配列番号１２についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ２１０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（にｉ）配列：配列番号１２二Ｇｌｙ　Ｉｃｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（２）配列番号Ｉ３についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ７１４個のアミノ酸ＣＢ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｊ）配列：配列番号１３：（２）配列番号１４についての情報：（ｉ）配列特＠：（Ａ、）長さ＝２０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１４：（２）配列番号１５についての情報：（ｉン配列特徴：（Ａ）長さ：１４個のアミノ酸− （Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ＩＪ）配列の種Ｗ４：ベブチド（ｘｉ）配列：配列番号１５：（２）配列番号１６についての情報＝（ｉ）配列特＠、：（Ａ）長さ：１４個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ　）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１６：（２）配列番号１７についての情報＝（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ２１０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１７：（２）配列番号１８についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ８６個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｊ）配列：配列番号１８：（２）配列番号Ｉ９についての情報：（ｉ）配列特＠：（Ａ）長さ：１１個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１９：（２）配列番号２０についての情報＝（ｉ）配列特＠：（Ａ）長さ１１７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｌ）配列；配列番号２０：１ａ（２）配列番号２１についての情報＝（ｉ）配列ｖＦ＠：（Ａ）長さ二１２個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２しく２）配列番号２２についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ：１４個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２２：Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（２）配列番号２３についての情報：（ｉ）配列特＠：（Ａ）長さ２１３個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直談状（ｉｔ　）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２３：Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ｒｌｅ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（２）配列番号２４についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ２１０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２４コ（２ン配列番号２５についての情ＩＩ。（ｉ）配列時＠：（Ａ）長さ２１５個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二車譲状（ｉｉ）配列の種類：ペプチドｂｉ）配列：配列番号２５；（２）配列番号２６についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ２２７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の側１ペプチド（Ｘｉ）配列：配列番号２６二＾ｒｇ　Ｘａａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ｆｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ（２）配列番号２７についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝３７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種Ｍ：ペプチド（にｉ）配列２配列番号２７：ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ（２）配列番号２日についての情報二（１）配列特徴：（Ａ）長さ二１８個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸〔Ｄ〕　トポロジー二車鎖状（１１）配列の種ＩＩ：ベブチド（Ｘｉ）配列：配列番号２８：Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓｌ　５　１０　１５Ｇｌｕ　Ａｌａ（２）配列番号２９についての情報：（ｉ＞配列特徴；（Ａ）長さ８１０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二車鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（Ｘｉ）配列：配列番号２９：Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｈｒｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｕｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ１５１゜（２）配列番号３ｏについての情報：（１）配列時＠：（Ａ＞長さ７２３個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種Ｉｌ：ベブチド（ｘｉ）配列：配列番号３０：Ａｓｎ　にＩｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐｌ　５　１０　１５（２）配列番号３】についての情報：（１）配列時＠：（Ａ）長さ＝９個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ　）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列；配列番号３１；（２）配列番号３２についての情報：（ｉ）配列時！！［＝（Ａ）長さ２２８個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本積（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉン配列のＭＭ、他の核酸（Ｘｉ）配列：配列番号３２：ＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡ　ＹＡＴ［ＩＹＴＮＧＣＮ　［、ＴＮＡＴＧＡＡ　２８（２）配列番号３３についての情報：（ｉ）配列時＠：（Ａ）長さ２２８個の塩基対（Ｂ）型；核酸（Ｃ）１１の数ニ一本積ＣＤ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種！！＝他の核酸（ｘｉ）配列：配列番号３３：ＧＣＣＴＣＧＡＩＩ：ＣＸ　ＩＩＧＧＹＴｃＮＧｃＮ　ＧＧＲＡＴＮＡＣ２８（２）配列番号３４についての情報＝（１）配列特徴：（Ａ）長さ１２１０個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本積（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ　）配列の種１！＝他の核酸（ｘｊ）配列：配列番号３４：（２）配列番号３５についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ２６２２個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）Ｈの散ニ一本饋（Ｄ）トポロジー：直鎖状（！１）配列の種１！：他の核酸（ｘｉ）配列：配列番号３５：ｍＧＴＡＴＴｃｃ　ＴＣＧＧＣＴＴＡＡＴ　（ＴＧＴＡＡＧＣＴＣｍＣＴＣＴＴＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＧ　６２２（２）配列番号３６についての情報＝（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５８１個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）［の数ニ一本領（Ｄ）トポロジー二面鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ〜ｍＲＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号３６：（２〕配列番号３７についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：３７０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二面鎖状（ｉｉ）配列の種Ｍ：タンパク質（ｘｉ）配列：配列番号３７：ＧＴｆ；ＧＡＡＣＧＧＴ　ＡＣＣＣＴＡＣＴＴＧ　ＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴ　ＧＴＡＧＡＡＧＴＡＧ　ＡＧＴＧＣＴＧＧＡＴ　ＴＧＧＴＧＣＡsＣＴ　７２０（２）配列番号３９についての情報：（１）配列時ｌ！１４：（Ａ）長さ１１４個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二面鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３９：（２）配列番号４０についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ８２８個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二面鎖状（ｉｉ）配列の種Ｉ！、ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４０：：Ｉ　：ｌ　の　り　１−＋　１　■　−Φ　コ０Φ　Φ　＞Ｃ＋　ぶ０　の　鈎　ω　−Φ１／′Ｉ−−−　−←さ　く　く　Σ　ｌ−４＋、２＋−１υ　ｅ　−υ　Ｑｌ　α　Φ　Ｈ飄　αω１　−　ぷ　■　−のの　−ｍ＋　のΣ　ｃＤ　ｓ　Σ　ト　く■　Ｈ〉　０　く、＋ｐ＞　鈎　（り　−Ｑ　１）　−いづ　ΦＯ＋−１０Ｊ、−＋　（１）＋Ｏ，−１　１’１５　Ｍ〉　−へ　ｅ　＋／）　Ｇ　−＜−＋４＞４づαＧ声φりΦり罰−のＨの　の１／′＋ｌ−１≧　の　ぶ　Φ−０飄＜＜＋ａｒｒ＞ｌ−＋＋−２−山　−一　の　−ｖＩｌ−ｔＧ）Ｑｉ：５Ｇ　−Φ　ノ０Ｉ−１飄　Φ　−の０　 −　−　ぷ　−＞ｎ　Φ−Ｃ／）Ｈ＜ＬＩ”Ｉｃ！＋Ｇ？１−１−、−ｔｃＱ？　０　１．０　＋Ｎ　ＣＣＩ　ｑＦ ′Ｏ（Ｎ　Ｏ）　′Ｏ＋、Ｏ（％１　″′　、、、ｌ　ゆ　ワ　、　。　。 −−ＮＦｌ　ｒｆ′Ｙ　寸　！要約書本発明は、植物チオエステラーゼ、そのようなタンパク質に関連するアミノ酸及び核酸を同定する手段、そのような植物チオエステラーゼを得るための、製造するための及び／又は使用するための方在が示される。国際調査報告ＰＣＴ／ＵＳ９１／Ｌ１２９６０Ｇｒｏｕｐ　１．　ｃｌａｉｍｓ　ｌ　−２５，ｄｒａｖｎ　ｔｏ　ｒｅｃｏｍｂ＋ｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓｃｏｍｐｒ＋＝＋ｎｌ＋ｔｕｏｅｓｔｅｒａｓｅａｎｄｈｏｓｔＣ１！ＩＩｓｃｏｍｐｒ＋ｓｔｎｇｔｔｕｏｅｓｔｅｒａｓｅｃｏｎｓ＋ｒ浮メ{５Ｇｒｏｕｐ　Ｉ　）、　ｃｌａｉｍｓ　２７−３７．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａ　ｐｌａｎｔ＋ｈＩｏｅｓ＋ｅｒ＊ｓｅ　Ｉｎ　ａ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　＋ｔｕｏｅｓｃｅｒａｓｅＧｒｏｕｐ　１１１．　ｃｌａｉｍｓ　３ｇ−５２，ｄｒａｖｎ　ＬＯａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃ＋ｎｇ　ｔｈ　ｍｅｄｉｕｍｃｈａｉｎＩｒＣｅｆＩＩｔｔｙａｃｉｄ、１ｍｅｔｈＯ（為ｏｆｍｏｄｄｙ＋ｎ１ｆｒｅｅｆａｔｔｙａｃｉｄｔｎａｐｌａｎｔｃｅ１１≠獅■ ｐｌＩＩｒｕ　ｃｄｌｌｓ　ａｎｄ　５ｅｅｄｓ　ｈａｖｉｎｇ　ａ　ｍｏｄｆｆｉｅｄ　【ｒｅｅ　ｒａｔｔｙ　ａｃｉｄ■ｍｐｏｓｉ＋PｏｃｈＧｒｏｕｐ　ＩＶ、　ｃｌａｉｍｓ　５３−５９．　ｄｒａｖｎ　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ　ｆａｔｔｙ　ａｃ奄■ Ｃｏｍｐｏｓ山ｏｎ　ｏｒ　＋ｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｍｏｏｒｉｅｄ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ。Ｇｒｏｕｐ　Ｖ、　ｃｌａｉｍ！６０−６６、　ｄｒａｖｎ　ｔｏ　ｐｌａｎｔ　５ｅｅｄ　０ＬＩＳ。Ｒゴ／ＵＳ９１１０２９６０Ａｌ［Ｊ（ｈｍｅｎｌ亀１）ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０ｐｌａｎＬｔｓｌ！ｅｑｕｅｎｃｅ　５ｅａｒｃｈ　ｏｒＦｉｇｕｒｅｓ　４＾＠ｎｄ　４ＢＢ１０の続き＠Ｉｎｔ、　ＣＩ−’　識別記号　庁内整理番号優先権主張　［相］１９９０年１１月３０日［相］米国（ＵＳ）［相］６２０，４２（＠１９９１年２月ｎ日［相］米国（Ｕ　Ｓ　）＠６６２，００７＠発　明　者　ボラード、マイケル　ロマン　アタノくン［相］発　明　者　フェルカー、トニ　アロイス　アメレイ０発　明　者　トンプソン、グレゴリ−エ　アメ−０ブー；：リカ合衆国、ウイスコンシン　５３７１６．マジソン、イースト′ケイ　ロード　５６４９、リカ合衆国、カリフォルニア　９５６１６．ディビス、コベル　ブス１２ｏ６リカ合衆国、カリフォルニア　９５６１６．ディビス、カラエル・ルバード　５１２７

Claims

【特許請求の範囲】１．植物チオエステラーゼをコードする配列の少なくとも一部を含んで成る組換えＤＮＡ構造体。２．生物学的に活性な植物チオエステラーゼをコードする請求の範囲第１項記載の構造体。３．前記配列が、前記第１配列に天然において連結されない第２核酸配列に連結される請求の範囲第１項記載の構造体。４．前記配列がラベルに連結される請求の範囲第１項記載の構造体。５．前記配列が前駆体植物チオエステラーゼをコードする請求の範囲第１項記載の構造体。５．転写の５′から３′の方向において、宿主細胞において機能的な転写調節領域及び前記配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の構造体。７．前記配列がセンス配列である請求の範囲第６項記載の構造体。８．前記配列がアンチーセンス配列である請求の範囲第６項記載の構造体。９．前記配列のすぐ５′側に宿主細胞において機能的な翻訳調節領域及び前記配列の３′側に転写／翻訳終結調節領域をさらに含んで成る請求の範囲第６項記載の構造体。１０．転写の５′から３′の方向に、前記宿主細胞において機能的な転写開始調節領域、前記宿主細胞において機能的な翻訳開始調節領域、生物学的に活性な植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡセンス配列及び前記宿主細胞において機能的な転写及び翻訳終結調節領域を含んで成る、宿主細胞において植物チオエステラーゼを生成できる発現カセットを含んで成り、ここで前記植物チオエステラーゼコード配列が前記調節領域の制御下にあることを特徴とする請求の範囲第１項記載の構造体。１１．前記宿主細胞が植物細胞である請求の範囲第１０項記載の構造体。１２．前記転写開始領域が植物種子組織に選択的に発現される遺伝子から得られる請求の範囲第１１項記載の構造体。１３．前記植物チオエステラーゼが、脂肪アシル−アシルキャリやータンパク質（ＡＣＰ）基質に対して選択的な加水分解活性を示す請求の範囲第１項記載の構造体。１４．前記植物チオエステラーゼが、１又は複数の中ぐらいの鎖の脂肪アシル− キャリヤー基質に対して選択的な加水分解活性を示す請求の範囲第１項記載の構造体。１５．前記配列が、ウンベルラリアカリホルニカ（ゲッケイジュ）、クフェアフーケリアナ（クフェア）又はカルタマスチンクチオリウス（ベニハナ）から得られる請求の範囲第１項記載の構造体。１６．請求の範囲第１〜１５のいづれか１項記載の植物チオエステラーゼコード配列構造体を含んで成る宿主細胞。１７．前記細胞が植物細胞である請求の範囲第１６項記載の細胞。１８．前記植物細胞がインビボで存在する請求の範囲第１７項記載の細胞。１９．前記植物細胞がアブラナ植物細胞である請求の範囲第１７項記載の細胞。２０．発現された植物チオエステラーゼを含んで成るトランスジェニック宿主細胞。２１．前記宿主細胞が植物細胞である請求の範囲第２０項記載の細胞。２２．前記植物チオエステラーゼが、中ぐらいの鎖を好むアシル−キャリヤーチオエステラーゼである請求の範囲第２１項記載の細胞。２３．形質転換されていない植物細胞が、中ぐらいの鎖を好むアシル−キャリヤーチオエステラーゼを有さない請求の範囲第２２項記載の細胞。２４．宿主細胞又はその子孫に植物チオエステラーゼを生成するための方法であって、請求の範囲第１０〜１２のいづれか１項記載の構造体を、前記植物チオエステラーゼの生成を可能にするであろう条件下で含んで成る宿主細胞又はその子孫を増殖することを含んで成る方法。２５．前記宿主細胞が植物細胞であり、そして前記構造体が前記植物細胞のゲノム中に組込まれる請求の範囲第２４項記載の方法。２６．前記植物細胞がインビボで存在する請求の範囲第２５項記載の方法。２７．請求の範囲第２４項記載の方法に従って生成される植物チオエステラーゼを含んで成る宿主細胞。２８．前記宿主細胞が植物宿主細胞であり、そして前記構造体が前記植物細胞のゲノム中に組込まれる請求の範囲第２７項記載の細胞。２９．他の植物タンパク質を実質的に含まず、そして１又は複数の中ぐらいの鎖の脂肪酸アシル−キャリヤー基質に対して選択的なヒドロラーゼ活性を有する植物チオエステラーゼ。３０．前記キャリヤーがアシルキャリヤータンパク質（“ＡＣＰ”）である請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３１．Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３２．Ｃ１０を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３３．未熟植物胚から得られる請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３４．ウンベルラリアカリホルニカから得られる、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３５．約３４ＫＤａの分子量を有する請求の範囲第３４項記載のチオエステラーゼ。３６．クフェアから得られる請求の範囲第２９項記載のチオエステラーゼ。３７．クフェアフーケリアナから得られる、Ｃ１０を好む、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含んで成る請求の範囲第３６項記載のチオェステラーゼ。３８．中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸を生成するための方法であって、酵素反応条件下で、（１）１又は複数の中ぐらいの鎖の脂肪酸アシル−キャリヤー基質に対して選択的ヒドロラーゼ活性を有する植物チオエステラーゼ及び（２）前記植物チオエステラーゼにより加水分解できる脂肪酸アシル−キャリヤー基質を接触する段階を含んで成り、ここで前記接触が前記チオエステラーゼと天然において関連する植物外で存在し、そしてそれによって、中ぐらいの鎖の脂肪酸が前記キャリヤーから開放されることを特徴とする方法。３９．前記植物チオエステラーゼがウンベルラリアカリホルニカから得られる請求の範囲第３８項記載の方法。４０．前記植物チオエステラーゼがウンベルラリアカリホルニカの、Ｃ１２を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである請求の範囲第３８項記載の方法。４１．前記植物チオエステラーゼがクフェアフーケリアナから得られる請求の範囲第３８項記載の方法。４２．前記植物チオエステラーゼがクフェアフーケリアナの、Ｃ１０を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである請求の範囲第３８項記載の方法。４３．前記接触がインビトロで行なわれる請求の範囲第３８項記載の方法。４４．一定百分率の長い鎖の脂肪酸から短い鎖の脂肪酸に植物細胞にお２ける遊離脂肪酸を変性するための方法であって：転写の５′から３′方向に、植物細胞中において機能する転写調節領域及び植物チオエステラーゼをコードする配列を含んで成るＤＮＡ構造体をそのゲノムに組込んだ植物細胞を、前記植物チオエステラーゼの転写を可能にするであろう条件下で増殖することを含んで成る方法。４５．前記植物チオエステラーゼをコードする配列がアンチーセンス配列である請求の範囲第４４項記載の方法。４６．前記構造体がさらに、前記植物チオエステラーゼをコードする配列に対してすぐ５′側での、前記植物細胞において機能する翻訳調節領域及び前記配列に対して３′側の転写／翻訳終結調節領域を含んで成り、そして前記植物チオエステラーゼをコードする配列がセンス配列である請求の範囲第４４項記載の方法。４７．前記植物細胞が脂肪種子胚植物細胞である請求の範囲第４４項記載の方法。４８．前記長鎖遊離脂肪酸の百分率が低められ、そして前記中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸の百分率が高められる請求の範囲第４４項記載の方法。４９．請求の範囲第４４〜４８のいづれか１項記載の方法により生成される変性遊離脂肪酸組成物を有する植物細胞。５０．脂質蓄積の間、種子において機能する調節要素の制御下で植物チオエステラーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を胚細胞のゲノム中に組込んでいる植物を成長せしめ、前記調節要素の活性を促進せしめるであろう条件下で種子を生成し、そして前記種子を収獲することを含んで成る方法に従って生成される、生来のレベルの脂肪酸を有する前記植物の種子に比べての、変性されたレベルの脂肪酸を有する植物種子。５１．前記植物がブラシカナバス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）である請求の範囲第５０項記載の種子。５２．前記種子が脂肪種子である請求の範囲第５０項記載の種子。５３．一定百分率の長い鎖の脂肪酸から短い鎖の脂肪酸に脂肪種子収穫植物から生成されるトリグリセリドの脂肪酸組成を変性するための方法であって；転写の５′から３′方向に、植物細胞中において機能する転写調節領域及び植物チオエステラーゼをコードする配列を含んで成るＤＮＡ構造体をそのゲノムに組込んだ植物細胞を、前記植物チオエステラーゼの転写を可能にするであろう条件下で増殖することを含んで成る方法。５４．前記植物チオエステラーゼをコードする配列がアンチーセンス配列である請求の範囲第５３項記載の方法。５５．前記構造体がさらに、前記植物チオエステラーゼをコードする配列に対してすぐ５′側での、前記植物細胞において機能する翻訳調節領域及び前記配列に対して３′側の転写／翻訳終結調節領域を含んで成り、そして前記植物チオエステラーゼをコードする配列がセンス配列である請求の範囲第５３項記載の方法。５６．前記植物細胞が脂肪種子胚植物細胞である請求の範囲第５３項記載の方法。５７．前記長鎖遊離脂肪酸の百分率が低められ、そして前記中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸の再分率が高められる請求の範囲第５３項記載の方法。５８．請求の範囲第５３〜５７のいづれか１項記載の方法に従って生成されたトリグリセリドの変性脂肪酸組成物を有する植物細胞。５９．前記収穫植物が、ナタネの種子、ヒマワリ、ベニハナ、綿、クフェア、ダイズ、ピーナッツ、ココナッツ、ギネアアプラヤシ及びトウモロコシから成る群から選択される請求の範囲第５３〜５７のいづれか１項記載の方法。６０．変性された割合の、短鎖脂肪酸に対する長鎖脂肪酸を有する植物種子油を含んで成る、内因性割合の、短鎖脂肪酸に対する長鎖脂肪酸を有する植物の植物種子油。６１．ブラシカナバス油を含んで成る請求の範囲第６０項記載の油。６２．請求の範囲第５０〜５２のいづれか１項記載の種子から分離された植物種子油。６３．ナタネの種子、ヒマワリ、綿、クフェア、ダイズ、ピーナッツ、ココナッツ、ギネアアブラヤシ及びトウモロコシから成る群から選択された植物からのトリグリセリド油であって、前記油中の脂肪酸鎖長組成が、転写の５′から３′方向に、植物細胞中において機能する転写調節領域及び植物チオエステラーゼをコードする配列を含んで成るＤＮＡ構造体をそのゲノムに組込んだ植物細胞を、前記植物チオエステラーゼの転写を可能にするであろう条件下で増殖することを含んで成る方法により、一定百分率の長鎖脂肪酸から短鎖脂肪酸に変性されていることを特徴とする油。６４．前記植物チオエステラーゼをコードする配列がアンチーセンス配列である請求の範囲第６３項記載の油。６５．前記構造体がさらに、前記植物チオエステラーゼをコードする配列に対してすぐ５′側での、前記植物細胞において機能する翻訳調節領域及び前記配列に対して３′側の転写／翻訳終結調節領域を含んで成り、そして前記植物チオエステラーゼをコードする配列がセンス配列である請求の範囲第６４項記載の油。６６．前記長鎖遊離脂肪酸の百分率が低められ、そして前記中ぐらいの鎖の遊離脂肪酸の百分率が高められる請求の範囲第６５項記載の油。