DE112011101574T5 - Thioesterase und Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden unter Verwendung der Thioesterase - Google Patents

Thioesterase und Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden unter Verwendung der Thioesterase Download PDF

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Abstract

Thioesterase umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, ein Thioesterase-Gen codierend die Thioesterase, eine Transformante umfassend das Gen und ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden unter Verwendung der Transformante.

Description

  • Technischer Hintergrund
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Thioesterase sowie ein Gen, welches die Thioesterase codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Transformante, die ein Gen enthält, welches die Thioesterase codiert, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden unter Verwendung der Thioesterase.
  • Hintergrund des Fachgebiets
  • Fettsäuren sind eine der Hauptbestandteilkomponenten von Lipiden. Die Fettsäuren bilden Lipide wie Triacylglycerol durch die Bindung an Glycerol über eine Esterbindung in vivo und werden in vielen Tieren und Pflanzen als Energiequellen gespeichert und genutzt. Diese in Tieren und Pflanzen gespeicherten Fettsäuren und Lipide werden häufig für Nahrungsmittel verwendet oder industriell genutzt, etwa als Zwischenproduktmaterialien für Nahrungsmittel, wie Monoacylglycerol und Diacylglycerol, und als Zusatzstoffe oder Zwischenproduktmaterialien für verschiedene industrielle Produkte. Darüber hinaus werden höhere Alkoholderivate, welche durch Reduktion von höheren Fettsäuren mit etwa 12 bis 18 Kohlenstoffatomen erhalten werden, als Tenside verwendet. Beispielsweise werden Alkylschwefelsäureestersalze und Alkylbenzolsulfonsäuresalze als anionische Tenside verwendet, und Polyoxyalkylenalkylether und Alkylpolyglykoside werden als nichtionische Tenside eingesetzt, wobei diese Tenside für Detergenzien oder Desinfektionsmittel verwendet werden. Ebenso werden andere höhere Alkoholderivate wie Alkylaminsalze und quaternäre Mono- oder Dialkylaminsalze gewöhnlich als kationische Tenside für Faserbehandlungsmittel, Haarkonditionierungsmittel oder Desinfektionsmittel verwendet, und quaternäre Ammoniumsalze vom Benzalkonium-Typ werden im Allgemeinen für Desinfektionsmittel oder antiseptische Mittel verwendet.
  • Insbesondere sind anionische Tenside und nichtionische Tenside, jeweils enthaltend einen Alkylrest mit etwa 12 Kohlenstoffatomen, als Ausgangsmaterialien für Waschmittel mit einer hohen Reinigungskraft nützlich, und kationische Tenside, jeweils enthaltend einen Alkylrest mit etwa 14 Kohlenstoffatomen, sind insbesondere als Haarspülmittel oder dergleichen nützlich. Weiterhin sind höhere Alkohole mit etwa 18 Kohlenstoffatomen auch als wachstumsfördernde Mittel für Pflanzen verwendbar.
  • Wie oben erwähnt, werden Fettsäuren für viele verschiedene Anwendungen verwendet, und daher wurde versucht, die Produktivität von Fettsäuren oder Lipiden in vivo durch Tiere und Pflanzen zu verbessern. Beispielsweise sind Verfahren zur Erhöhung des Lipidgehalts in Samen durch das Einbringen einer Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase) (Patentliteratur 1, Nichtpatentliteratur 1 und Patentliteratur 5); Verfahren zur Erhöhung des Lipidgehalts in Samen durch das Einbringen einer sn-2-Acyltransferase aus Hefe (SLC1-1) (Patentliteratur 2, Patentliteratur 3 und Nichtpatentliteratur 2); und auch Verfahren zur Erhöhung des Lipidgehalts in Samen durch das Einbringen eines Diacylglycerol-Acyltransferase-Gens (DGAT) (Patentliteratur 4 und Nichtpatentliteratur 3) vorgeschlagen worden. Außerdem wurde versucht, die Anzahl der Kohlenstoffatome in einer Fettsäure (d. h., die Kettenlänge der Fettsäuren) zu kontrollieren, da der Nutzen oder die Verwendbarkeit der Fettsäuren im Wesentlichen von der Anzahl der Kohlenstoffatome abhängt. Beispielsweise ist ein Verfahren zur Anreicherung von Fettsäuren mit 12 Kohlenstoffatomen durch das Einbringen einer Acyl-ACP-Thioesterase aus Umbellularia californica (California Bay) (Patentliteratur 6 und Nichtpatentliteratur 4); ein Verfahren zur Anreicherung von Fettsäuren mit 8 oder 10 Kohlenstoffatomen durch das Einbringen einer Acyl-ACP-Thioesterase aus Cuphea hookeriana (Patentliteratur 7); und auch ein Verfahren zur Anreicherung von Fettsäuren mit 14 Kohlenstoffatomen durch das Einbringen einer Acyl-ACP-Thioesterase aus Cinnamomum camphorum (Nichtpatentliteratur 5) vorgeschlagen worden.
  • Literaturliste
  • Patentliteratur
    • Patentliteratur 1: JP-A-2002-335786 (”JP-A” bedeutet ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung).
    • Patentliteratur 2: JP-A-11-506323 .
    • Patentliteratur 3: WO 2008/076377 , Broschüre.
    • Patentliteratur 4: WO 2000/036114 , Broschüre.
    • Patentliteratur 5: US-Patent Nr. 5,925,805 .
    • Patentliteratur 6: JP-A-7-501924 .
    • Patentliteratur 7: JP-A-8-502892 .
  • Nichtpatentliteratur
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Probleme, welche die Erfindung lösen soll
  • Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Bereitstellung einer neuen Thioesterase und auch eines Thioesterase-Gens, welches die Thioesterase codiert. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt auch die Bereitstellung einer Transformante, worin das Thioesterase-Gen eingeführt wurde, deren Fähigkeit, Fettsäuren oder Fettsäuren enthaltende Lipide herzustellen, verbessert ist. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Fettsäuren oder Fettsäuren enthaltenden Lipiden unter Verwendung der Transformante.
  • Mittel zur Lösung des Problems
  • Die genannten Erfinder führten umfassende Studien durch, um die Lipid-produktivität in Tieren und Pflanzen zu erhöhen. Die Erfinder richteten ihre Aufmerksamkeit auf das Enzym Thioesterase, welches eine wichtige Funktion bei der Biosynthese von Fettsäuren und Lipiden in lebenden Organismen hat, mit dem Ziel, eine neue Thioesterase zu finden, welche mit einer höheren Produktivität als herkömmliche Enzyme produziert werden kann. Die Erfinder isolierten aus Cocos nucifera L. (Kokosnusspalme) ein Gen, welches eine neue Thioesterase codiert, und schleusten das Gen dann in einen Wirt ein, um eine Transformante zu erhalten. Als Ergebnis stellten die Erfinder fest, dass in der Transformante die Produktivität der Fettsäuren oder Lipide signifikant erhöht ist, verglichen mit Transformanten, welche andere eingeschleuste Thioesterase-Gene enthalten, und dass sich die Zusammensetzung der Fettsäuren, welche in den Lipiden enthalten sind, von der Zusammensetzung im Endosperm von Cocos nucifera L. unterscheidet. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf diesen Ergebnissen vollendet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein ausgewählt aus den folgenden (a) bis (c) (nachstehend bezeichnet als ”das/die Protein(e) der vorliegenden Erfindung”):
    • (a) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist,
    • (b) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz, worin eine bis mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt wurden, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist, und
    • (c) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität (Homologie) zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Gen, welches das Protein der vorliegenden Erfindung codiert (nachstehend bezeichnet als ”das/die Gen(e) der vorliegenden Erfindung”), und vorzugsweise ein Gen, welches eine der folgenden DNAs (d) bis (f) umfasst:
    • (d) DNA umfassend eine Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die DNA ein Protein mit einer Thioesterase-Aktivität codiert,
    • (e) DNA mit der Fähigkeit, unter stringenten Bedingungen an eine DNA umfassend eine Sequenz, die komplementär zu der Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ist, zu hybridisieren, wobei die DNA ein Protein mit einer Thioesterase-Aktivität codiert, und
    • (f) DNA umfassend eine Nucleotidsequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität (Homologie) zu der Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die DNA ein Protein mit einer Thioesterase-Aktivität codiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, der das Gen umfasst, sowie eine Transformante, welche das Gen oder den rekombinanten Vektor umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure oder eines Lipids enthaltend eine Fettsäure, umfassend das Züchten der Transformante in einem Kulturmedium und das Gewinnen einer Fettsäure (vorzugsweise Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure und Palmitoleinsäure) oder eines Lipids enthaltend eine Fettsäure aus dem Kulturmedium.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erhöhung der Produktivität einer Fettsäure oder eines Lipids enthaltend eine Fettsäure, umfassend das Einbringen des Gens, welches eines der obigen Proteine (a) bis (c) codiert, in einen Wirt.
  • Effekte der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Thioesterase sowie ein Gen, welches die Thioesterase codiert, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Transformante bereit, worin das Thioesterase-Gen eingeschleust wurde, wobei die Fähigkeit der Transformante, Fettsäuren oder Lipide herzustellen, verbessert ist. Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren (vorzugsweise Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure und Palmitoleinsäure) oder Lipiden unter Verwendung der Transformante bereit. Die Transformante und das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung stellen Fettsäuren und Lipide mit einer charakteristischen Fettsäurezusammensetzung bereit, wobei die Produktivität außerordentlich hoch ist, so dass die Transformante und das Herstellungsverfahren geeigneterweise bei der industriellen Herstellung von Fettsäuren und Lipiden verwendet werden können.
  • Andere oder darüber hinausgehende Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Diagramm, das den jeweiligen Gehalt der einzelnen Fettsäuren in transformierten Escherichia coli-Zellen veranschaulicht, wobei in die Zellen entweder das Thioesterase-Gen (BTE) aus Umbellularia californica oder das Thioesterase-Gen (CTE) aus Cocos nucifera L. eingeschleust wurde.
  • 2 ist ein Diagramm, das den Gesamtgehalt der einzelnen Fettsäuren in transformierten Escherichia coli-Zellen veranschaulicht, wobei in die Zellen entweder das Thioesterase-Gen (BTE) aus Umbellularia californica oder das Thioesterase-Gen (CTE) aus Cocos nucifera L. eingeschleust wurde.
  • 3(a) ist ein Diagramm, das die Zusammensetzungsverhältnisse der Fettsäuren im Endosperm von Cocos nucifera L. veranschaulicht, und 3(b) ist ein Diagramm, das die Zusammensetzungsverhältnisse der Fettsäuren in einer Transformante veranschaulicht, worin das Thioesterase-Gen (CTE) aus Cocos nucifera L. eingeschleust wurde.
  • 4 ist ein Diagramm, das den Gesamtgehalt der einzelnen in Samen enthaltenen Fettsäuren, welche von einem Wildtypstamm von Arabidopsis thaliana und einer Transformante von Arabidopsis thaliana (Pnapin-CTE, eingeführt mit dem Thioesterase-Gen aus Cocos nucifera L.) erhalten wurden, veranschaulicht.
  • 5 ist ein Diagramm, das die Zusammensetzungsverhältnisse der Fettsäuren in den Samen eines Wildtypstamms von Arabidopsis thaliana und einer Transformante von Arabidopsis thaliana (Pnapin-CTE eingeführt mit dem Thioesterase-Gen aus Cocos nucifera L.) veranschaulicht.
  • Ausführungsform der Erfindung
  • 1. Thioesterase-Enzym
  • Das Protein der vorliegenden Erfindung ist ein Protein ausgewählt aus den folgenden (a) bis (c) (nachstehend bezeichnet als ”Thioesterase der vorliegenden Erfindung”):
    • (a) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist,
    • (b) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz, worin eine bis mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt wurden, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist, und
    • (c) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität (Homologie) zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist.
  • Das Gen der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, welches das Protein codiert.
  • Das Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 ist eine neue Thioesterase, welche aus Cocos nucifera L. abgeleitet wurde (nachstehend wird die neue Thioesterase auch bezeichnet als ”CTE”).
  • Thioesterasen sind Acyl-Acyl-Trägerprotein(Acyl-ACP)-Thioesterasen, welche Enzyme sind, die an dem Triglycerid-Biosyntheseweg beteiligt sind. Thioesterasen hydrolysieren eine Thioesterbindung eines Acyl-Acyl-Trägerproteins, wobei freie Fettsäuren gebildet werden. Das Acyl-Acyl-Trägerprotein stellt eine Zusammensetzung dar, welche aus einem Acylrest als einem Fettsäurerest und einem Acyl-Trägerprotein besteht, wobei das Acyl-Acyl-Trägerprotein ein Zwischenprodukt des Fettsäure-Biosynthese-Prozesses in Chloroplasten oder Plastiden ist. Thioesterasen katalysieren die Fettsäuresynthese an dem Acyl-Trägerprotein, wobei freie Fettsäuren gebildet werden, welche aus den Plastiden abtransportiert und dann der Triglyceridsynthese zugeführt werden. Thioesterasen haben abhängig von der Art des Fettsäurerestes, welcher Bestandteil des Acyl-Acyl-Trägerproteins ist, unterschiedliche Reaktionsspezifitäten, so dass die Thioesterasen einen wichtigen Faktor bei der Festlegung der Fettsäurezusammensetzung eines Organismus darstellen.
  • Das Protein der vorliegenden Erfindung umfasst (a) ein Protein umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist, wie auch Proteine, welche funktionell äquivalent zu dem Protein (a) sind.
  • Es ist allgemein bekannt, dass bei Aminosäuresequenzen, welche Enzymproteine codieren, die Beibehaltung der vollständigen Aminosäuresequenz eines Enzyms nicht immer erforderlich ist, um dessen Aktivität aufrechtzuerhalten, und dass eine Veränderung der ursprünglichen Sequenz in einigen Regionen keine oder nur eine geringe Auswirkung auf die Enzymaktivität hat. In einer solchen Region, welche für die Enzymaktivität nicht essentiell ist, kann die Enzymaktivität auch dann aufrechterhalten werden, wenn einige Variationen (Mutationen) wie Deletionen, Substitutionen, Insertionen oder Hinzufügungen in die Aminosäuresequenz innerhalb dieser Region eingeführt werden. Die vorliegende Erfindung kann in gleicher Weise auf Varianten angewendet werden, bei denen die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 partiell verändert wurde, während die Thioesterase-Aktivität aufrechterhalten wird.
  • Die Proteine, welche funktionell äquivalent zu der Thioesterase umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 sind, schließen die folgenden Proteine (b) und (c) ein. Diese Proteine (b) und (c) sind durch die Proteine der vorliegenden Erfindung umfasst:
    • (b) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz, worin eine bis mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt wurden, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist, und
    • (c) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität (Homologie) zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist.
  • Bei Protein (b) beträgt die Anzahl der Aminosäuren, welche deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt wurden, vorzugsweise 1 bis 20, mehr bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 bis 5 und besonders bevorzugt 1 bis 2. Die Hinzufügung, wie oben beschrieben, schließt das Hinzufügen von einer bis mehreren Aminosäuren an beiden Enden ein.
  • Bei Protein (c) beträgt die Sequenzidentität (Homologie) der Aminosäuresequenz vorzugsweise 95% oder mehr, mehr bevorzugt 96% oder mehr, stärker bevorzugt 97% oder mehr und besonders bevorzugt 98% oder mehr.
  • Die Erfinder verglichen die Aminosäuresequenz der Thioesterase gemäß SEQ ID NO: 1 mit den Aminosäuresequenzen von anderen bekannten Thioesterasen, wie in den nachstehend beschriebenen Beispielen veranschaulicht wird. Als Ergebnis betrugen die Sequenzidentitäten zwischen der Thioesterase der vorliegenden Erfindung und den anderen bekannten Thioesterasen etwa 50% bis 60%. Beispielsweise betrug die Identität zu der Aminosäuresequenz einer von California Bay (Umbellularia californica; auch bezeichnet als California Bay Tree) abgeleiteten Thioesterase etwa 50%, und die Identität zu der Aminosäuresequenz der Thioesterase aus Arabidopsis thaliana betrug etwa 60%.
  • Die Sequenzidentität (Homologie) der Aminosäuresequenz und der Nucleotidsequenz wird gemäß der Lipman-Pearson-Methode (vgl. Science 227 (1985), S. 1435) berechnet. Insbesondere kann die Identität unter Verwendung des Homologieanalyse(Homologie-Suche)-Programms der Geninformation-Verarbeitungssoftware Genetyx-Win (Software Development Co., Ltd.), wobei die Kalibriereinheit für den Vergleich (ktup) auf einen Wert = 2 eingestellt wird, bestimmt werden.
  • Von den oben beschriebenen Proteinen (b) und (c) wird eine Thioesterase-Variante mit einer Thioesterase-Aktivität bevorzugt, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz aufweist, worin die Aminosäuren, welche den spezifischen Resten in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, wie folgt konserviert sind: der 34. Rest ist Arginin; der 35. Rest ist Serin; der 37. Rest ist Glutaminsäure; der 39. Rest ist Glycin; der 41. Rest ist Asparaginsäure; der 51. Rest ist Asparagin; der 54. Rest ist Glutamin; der 59. Rest ist Asparagin; der 65. Rest ist Glycin; der 70. Rest ist Glycin; der 72. Rest ist Glycin; der 74. Rest ist Threonin; der 77. Rest ist Methionin; der 82. Rest ist Leucin; der 84. Rest ist Tryptophan; der 85. Rest ist Valin; der 96. Rest ist Tyrosin; der 98. Rest ist Tryptophan; der 99. Rest ist Tryptophan; der 108. Rest ist Tryptophan; der 113. Rest ist Glycin; der 137. Rest ist Serin; der 142. Rest ist Methionin; der 147. Rest ist Arginin; der 177. Rest ist Lysin; der 192. Rest ist Glycin; der 193. Rest ist Leucin; der 195. Rest ist Prolin; der 197. Rest ist Tryptophan; der 199. Rest ist Asparaginsäure; der 201. Rest ist Asparaginsäure; der 203. Rest ist Asparagin; der 205. Rest ist Histidin; der 206. Rest ist Valin; der 210. Rest ist Lysin; der 211. Rest ist Tyrosin; der 214. Rest ist Tryptophan; der 220. Rest ist Prolin; der 236. Rest ist Tyrosin; der 239. Rest ist Glutaminsäure; der 248. Rest ist Serin; der 266. Rest ist Histidin; und der 283. Rest ist Tryptophan; und worin die anderen Aminosäuren mit Ausnahme der vorstehenden Reste zum Teil verändert sind.
  • Die Thioesterase der vorliegenden Erfindung hat die folgenden Merkmale.
    • (1) Eine Transformante umfassend eine darin eingeführte Thioesterase der vorliegenden Erfindung weist im Vergleich zu Transformanten, worin andere Thioesterasen aus Pflanzen (zum Beispiel eine Thioesterase aus Umbellularia californi ca) eingeführt wurden, eine überragende Produktivität für Fettsäuren oder Lipide auf.
    • (2) Eine Transformante umfassend eine darin eingeführte Thioesterase der vorliegenden Erfindung produziert Fettsäuren mit einer anderen Zusammensetzung als die Fettsäuren im Endosperm von Cocos nucifera L. Insbesondere ist die Produktion von Myristinsäure (C14:0) erhöht. Außerdem werden ungesättigte Fettsäuren hergestellt, welche im Endosperm von Cocos nucifera L. nur selten zu beobachten sind (insbesondere Palmitoleinsäure (C16:1)).
    • (3) In einer Transformante umfassend eine darin eingeführte Thioesterase der vorliegenden Erfindung werden überwiegend Laurinsäure (C12:0), Myristinsäure (C14:0), Palmitinsäure (C16:0) und Palmitoleinsäure (C16:1) hergestellt.
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck ”mit einer Thioesterase-Aktivität” verweist auf eine Aktivität, wobei eine Thioesterbindung eines Acyl-Acyl-Trägerproteins hydrolysiert wird. Die Thioesterase-Aktivität eines Proteins kann zum Beispiel durch das Einbringen eines Fusionsgens, das durch Verknüpfung des Thioesterase-Gens mit einem stromabwärts hiervon angeordneten Promotor, der in Wirtszellen wie Escherichia coli wirksam ist, erzeugt wurde, in eine Wirtszelle, welche kein Fettsäure-Abbausystem umfasst, das Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, welche für die Expression des eingeführten Thioesterase-Gens geeignet sind, und das Analysieren einer dadurch hervorgerufenen Veränderung in der Fettsäurezusammensetzung der Wirtszelle, mittels einer gaschromatographischen Analyse oder dergleichen gemessen werden. Alternativ kann die Thioesterase-Aktivität durch das Einbringen eines Fusionsgens gemessen werden, das durch Verknüpfung des Thioesterase-Gens mit einem stromabwärts hiervon angeordneten Promotor, der in Wirtszellen wie Escherichia coli wirksam ist, erzeugt wurde, in eine Wirtszelle, das Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, welche für die Expression des eingeführten Thioesterase-Gens geeignet sind, und das Aussetzen einer mittels Disruption erhaltenen Zellflüssigkeit einer Reaktion unter Verwendung von Acyl-ACPs als Substrate, welche gemäß der Methode von Yuan et al., PNAS 92 (1995), S. 10639–10643 (Nichtpatentliteratur 5, wie oben beschrieben) hergestellt wurden.
  • Es gibt keine besonderen Beschränkungen hinsichtlich des Verfahrens zum Erhalt des Proteins der vorliegenden Erfindung, wobei das Protein durch herkömmliche chemische Techniken oder gentechnische Verfahren erhalten werden kann.
  • Beispielsweise kann ein aus einem natürlichen Produkt abgeleitetes Protein durch Isolierung, Reinigung und dergleichen aus dem Endosperm von Cocos nucifera L. gewonnen werden. Ferner kann das Protein auch auf Basis der Informationen für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 künstlich synthetisiert werden, wobei die Proteinsynthese mittels chemischer Synthese erfolgen kann. Alternativ kann auch ein rekombinantes Protein durch Genrekombinationstechniken hergestellt werden. Im Falle der Herstellung eines rekombinanten Proteins kann das Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welches nachstehend beschrieben wird.
  • 2. Thioesterase-Gen
  • Das Gen der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, welches das oben beschriebene Protein der vorliegenden Erfindung codiert (nachstehend bezeichnet als ”Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung”). Das Gen der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise (d) ein Gen, umfassend eine DNA, welche die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei die DNA ein Protein mit einer Thioesterase-Aktivität codiert, und auch Gene, welche funktionell äquivalent zu dem Gen (d) sind.
  • Die Gene, welche funktionell äquivalent zu dem Thioesterase-Gen sind, das eine DNA umfasst, welche die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, schließend die folgenden Gene (e) bis (g) ein. Die Gene (e) bis (g) sind durch die Gene der vorliegenden Erfindung umfasst.
    • (e) Gen umfassend eine DNA, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen an eine DNA, umfassend eine Sequenz, die komplementär zu der Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ist, zu hybridisieren, wobei die DNA ein Protein mit einer Thioesterase-Aktivität codiert,
    • (f) Gen umfassend eine DNA, die eine Nucleotidsequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität (Homologie) zu der Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei die DNA ein Protein mit einer Thioesterase-Aktivität codiert, und
    • (g) Gen umfassend eine DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, worin ein bis mehrere Nucleotide in der Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt wurden, wobei die DNA ein Protein mit einer Thioesterase-Aktivität codiert.
  • Die oben erwähnten ”stringenten Bedingungen” sind zum Beispiel die in ”Molecular Cloning – A Laboratory Manual”, dritte Auflage [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press] beschriebenen Bedingungen. Diese Bedingungen sind zum Beispiel die Hybridisierungsbedingungen eines Gens mit einer Sonde durch Inkubation mit der Sonde in einer Lösung, enthaltend 6 × SSC (Zusammensetzung von 1 × SCC: 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,5% SDS, 5 × Denhardt-Lösung und 100 mg/ml Heringssperma-DNA bei 65°C für 8 bis 16 Stunden.
  • Bei Gen (f) beträgt die Sequenzidentität (Homologie) der Nucleotidsequenz vorzugsweise 95% oder mehr, mehr bevorzugt 96% oder mehr, stärker bevorzugt 97% oder mehr und besonders bevorzugt 98% oder mehr.
  • Die Sequenzidentität (Homologie) der Nucleotidsequenz wird gemäß der Lipman-Pearson-Methode (vgl. Science 227 (1985), S. 1435) berechnet. Insbesondere kann die Identität unter Verwendung des Homologieanalyse (Homologie-Suche)-Programms der Geninformation-Verarbeitungssoftware Genetyx-Win (Software Development Co., Ltd.) bestimmt werden, wobei die Kalibriereinheit für den Vergleich (ktup) auf einen Wert = 2 eingestellt wird.
  • Bei Gen (g) beträgt die Anzahl der Nucleotide, welche deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt werden, vorzugsweise 1 bis 60, mehr bevorzugt 1 bis 30, stärker bevorzugt 1 bis 15 und besonders bevorzugt 1 bis 6. Die Hinzufügung, wie oben beschrieben, schließt das Hinzufügen von ein bis mehreren Nucleotiden an beiden Enden ein.
  • Von den oben beschriebenen Genen (e) und (g) wird ein Gen bevorzugt, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die einer Aminosäuresequenz entspricht, worin die Aminosäuren, welche den spezifischen Resten in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, wie folgt konserviert sind: der 34. Rest ist Arginin; der 35. Rest ist Serin; der 37. Rest ist Glutaminsäure; der 39. Rest ist Glycin; der 41. Rest ist Asparaginsäure; der 51. Rest ist Asparagin; der 54. Rest ist Glutamin; der 59. Rest ist Asparagin; der 65. Rest ist Glycin; der 70. Rest ist Glycin; der 72. Rest ist Glycin; der 74. Rest ist Threonin; der 77. Rest ist Methionin; der 82. Rest ist Leucin; der 84. Rest ist Tryptophan; der 85. Rest ist Valin; der 96. Rest ist Tyrosin; der 98. Rest ist Tryptophan; der 99. Rest ist Tryptophan; der 108. Rest ist Tryptophan; der 113. Rest ist Glycin; der 137. Rest ist Serin; der 142. Rest ist Methionin; der 147. Rest ist Arginin; der 177. Rest ist Lysin; der 192. Rest ist Glycin; der 193. Rest ist Leucin; der 195. Rest ist Prolin; der 197. Rest ist Tryptophan; der 199. Rest ist Asparaginsäure; der 201. Rest ist Asparaginsäure; der 203. Rest ist Asparagin; der 205. Rest ist Histidin; der 206. Rest ist Valin; der 210. Rest ist Lysin; der 211. Rest ist Tyrosin; der 214. Rest ist Tryptophan; der 220. Rest ist Prolin; der 236. Rest ist Tyrosin; der 239. Rest ist Glutaminsäure; der 248. Rest ist Serin; der 266. Rest ist Histidin; und der 283. Rest ist Tryptophan und in der Nucleotidsequenz sind die Nucleotide, die den Aminosäuren entsprechen, die nicht die oben genannten konservierten Aminosäurereste sind, zum Teil verändert und die Nucleotidsequenz codiert ein Protein, das Thioesterase-Aktivität aufweist.
  • Das Verfahren zum Erhalt des Thioesterase-Gens der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt, wobei das Thioesterase-Gen durch herkömmliche Genmanipulationstechniken erhalten werden kann. Zum Beispiel kann das Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung basierend auf der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder der Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 durch künstliche Synthese erhalten werden. Die künstliche Synthese eines Gens kann mit Hilfe von Dienstleistern wie Invitrogen, Inc., durchgeführt werden. Des Weiteren kann das Gen auch durch Clonierung aus Cocos nucifera L. erhalten werden, wobei die Clonierung zum Beispiel gemäß den in ”Molecular Cloning – A Laboratory Manual”, dritte Auflage [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press], und dergleichen beschriebenen Methoden durchgeführt werden kann.
  • Wenn Mutationen in die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 eingeführt werden, kann hierzu ein Verfahren zur Einführung einer ortsspezifischen Mutation und dergleichen angewendet werden. Beispiele für das Verfahren zur Einführung einer ortsspezifischen Mutation schließen ein Verfahren mittels Spleißen durch Überlappungs-Verlängerungs(SOE)-PCR (Horton et al., Gene 77 (1989), 61–68); die ODA-Methode (Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152 (1995), 271–276); und die Kunkel-Methode (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 488) ein. Ferner können auch im Handel erhältliche Kits wie der Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km-Kit (Takara Bio, Inc.), der Transformer TM Site-Directed Mutagenesis-Kit (Clonetech Laboratories, Inc.) und der KOD-Plus-Mutagenesis-Kit (Toyobo Co., Ltd.) verwendet werden. Das Mutationen enthaltende Gen kann auch durch die zufällige Einführung genetischer Mutationen und eine anschließende Evaluierung der Enzymaktivitäten und einer Genanalyse mittels geeigneter Methoden erhalten werden. Insbesondere können zufällige Genmutationen durch homologe Rekombination mit einem DNA-Fragment, welches zufällig cloniert wurde, oder durch Bestrahlung mit γ-Strahlung oder dergleichen eingeführt werden.
  • 3. Transformante
  • Die Transformante der vorliegenden Erfindung schließt das Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung oder einen rekombinanten Vektor, welcher das Thioesterase-Gen enthält, ein. Wie in Beispielen erläutert, welche nachstehend beschrieben werden, hat die Transformante der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, Fettsäuren, vorzugsweise langkettige Fettsäuren mit 12 oder mehr Kohlenstoffatomen und mehr bevorzugt Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure und Palmitoleinsäure, oder Lipide enthaltend diese Fettsäuren in einem größeren Ausmaß zu produzieren. Bei der vorliegenden Erfindung kann die Fähigkeit der Transformante, Fettsäuren zu produzieren, durch das in den nachstehend beschriebenen Beispielen angewendete Verfahren gemessen werden.
  • Die Transformante der vorliegenden Erfindung wird durch das Einbringen des Thioesterase-Gens in einen Wirt gemäß einem herkömmlichen Genmanipulationsverfahren erhalten. Vorzugsweise kann die Transformante durch das Herstellen eines rekombinanten Vektors, welcher fähig ist, das Thioesterase-Gen in einer Wirtszelle zu exprimieren, das Einführen dieses Vektors in Wirtszellen und auf diese Weise das Transformieren der Wirtszellen hergestellt werden. Die erhaltene Transformante zeigt eine verbesserte Fähigkeit, Fettsäuren oder Lipide enthaltend die Fettsäuren zu produzieren.
  • Zunächst wird ein rekombinanter Vektor, umfassend das Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung, beschrieben.
  • Der verwendete Vektor kann ein beliebiger Vektor sein, welcher fähig ist, das Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung in einen Wirt einzuführen und das Gen in den Wirtszellen zu exprimieren. Zum Beispiel kann ein Expressionsvektor, umfassend Expressionsregulationsregionen wie einen Promotor und einen Terminator entsprechend der Art des verwendeten Wirtes und einen Replikationsinitiationspunkt, einen Selektionsmarker oder dergleichen, verwendet werden. Des Weiteren kann der Vektor auch ein Vektor sein, welcher zur Selbst-Proliferation und Selbst-Replikation außerhalb des Chromosoms befähigt ist, wie ein Plasmid, oder der Vektor kann auch ein Vektor sein, welcher in das Chromosom eingebaut wird.
  • Spezifische Beispiele des Vektors schließen im Falle der Verwendung eines Mikroorganismus als einen Wirt die folgenden ein: pBluescript II SK(–) (hergestellt von Stratagene Corp.), pUC119 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), einen pET-basierten Vektor (hergestellt von Takara Bio, Inc.), einen pGEX-basierten Vektor (hergestellt von GE Healthcare, Inc.), einen pCold-basierten Vektor (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), pHY300PLK (hergestellt von Takara Bio, Inc.), pUB110 (Mackenzie, T. et al., Plasmid 15 (2) (1986), S. 93–103), pBR322 (hergestellt von Takara Bio, Inc.), pRS403 (hergestellt von Stratagene Corp.) und pMW218/219 (hergestellt von Nippon Gene Co., Ltd.). Im Falle der Verwendung einer Pflanzenzelle als einen Wirt schließen Beispiele des Vektors einen pRI-basierten Vektor (hergestellt von Takara Bio, Inc.), einen pBI-basierten Vektor (hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.) und einen IN3-basierten Vektor (hergestellt von Inplanta Innovations, Inc.) ein. Falls Escherichia coli als Wirt verwendet wird, werden vorzugsweise pBluescript II SK(–) (hergestellt von Stratagene Corp.) und pMW218/219 (hergestellt von Nippon Gene Co., Ltd.) verwendet. Im Falle der Verwendung von Arabidopsis thaliana als einen Wirt werden vorzugsweise ein pRI-basierter Vektor (hergestellt von Takara Bio, Inc.) und ein pBI-basierter Vektor (hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.) verwendet.
  • Die Expressionsregulationsregionen wie ein Promotor und ein Terminator, sowie der Selektionsmarker sind nicht besonders beschränkt und können geeigneterweise aus herkömmliche verwendeten Promotoren, Markern und dergleichen in Übereinstimmung mit dem verwendeten Wirtstyp ausgewählt werden. Spezifische Beispiele des Promotors schließen den lac-Promotor, trp-Promotor, tac-Promotor, trc-Promotor, T7-Promotor, SpoVG-Promotor, Blumenkohlmosaikvirus-35S-RNA-Promotor, Promotoren für Haushaltsgene wie Aktin und Ubiquitin, den aus Rapssaat isolierten Napin-Gen-Promotor und den aus Pflanzen abgeleiteten Rubisco-Promotor ein. Beispiele des Selektionsmarkers schließen Wirkstoffresistenzgene wie Antibiotikaresistenzgene (Ampicillin-Resistenzgen, Chloramphenicol-Resistenzgen, Erythromycin-Resistenzgen, Neomycin-Resistenzgen, Kanamycin-Resistenzgen, Spectinomycin-Resistenzgen, Tetracyclin-Resistenzgen, Blasticidin S-Resistenzgen, Bialaphos-Resistenzgen und Hygromycin-Resistenzgen) ein. Es ist des Weiteren möglich, eine Deletion eines mit Auxotrophie assoziierten Gens oder dergleichen als einen Selektionsmarker zu verwenden.
  • Ein Transformationsvektor kann durch das Einbringen des Thioesterase-Gens der vorliegenden Erfindung in den oben beschriebenen Vektor gemäß einer herkömmlichen Technik, wie einer Restriktionsenzymbehandlung oder Ligierung, konstruiert werden. Das Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung kann durch das oben beschriebene Verfahren erhalten werden.
  • Der rekombinante Vektor kann das Thioesterase-Gen in einen Wirt einschleusen, um eine Transformante zu konstruieren.
  • Der Wirt für die Transformante ist nicht besonders beschränkt, wobei ein Mikroorganismus, eine Pflanze oder ein Tier verwendet werden kann. Die Thioesterase der vorliegenden Erfindung kann für die Herstellung von langkettigen Fettsäuren, insbesondere Fettsäuren mit 12 oder mehr Kohlenstoffatomen, verwendet werden, wie nachfolgend beschrieben wird. Es kann auch ein Organismus als Wirt verwendet werden, welcher von Natur aus keine Thioesterase besitzt, die einen Fettsäurerest mit 12 Kohlenstoffatomen als Substrat erkennt.
  • Im Einklang mit der Erfindung wird unter dem Gesichtspunkt der Produktionseffizienz der Fettsäuren und Lipide sowie der Verwendbarkeit der erhaltenen Fettsäuren die Verwendung eines Mikroorganismus oder einer Pflanze als Wirt bevorzugt. Als Mikroorganismus können Prokaryonten wie Mikroorganismen der Gattung Escherichia oder Mikroorganismen der Gattung Bacillus oder Eukaryonten wie Hefen oder filamentöse Pilze verwendet werden. Von diesen Mikroorganismus werden Escherichia coli, Bacillus subtilis, Rhodosporidium toruloides und Mortierella bevorzugt, wobei Escherichia coli besonders bevorzugt wird. Als Pflanze werden Arabidopsis thaliana, Raps, Kokosnuss, Palme, Cuphea und Jatropha bevorzugt, wobei Arabidopsis thaliana besonders bevorzugt wird.
  • Das Verfahren zur Transformation ist nicht besonders beschränkt, so lange es sich um ein Verfahren handelt, welches ein Zielgen in einen Wirt einschleusen kann. Beispielsweise kann ein Verfahren unter Verwendung von Calciumionen, ein allgemeines Verfahren zur Transformation von kompetenten Zellen (J. Bacterial. 93 (1967), 1925), ein Protoplasten-Transformationsverfahren (Mol. Gen. Genet. 168 (1979), 111), ein Elektroporationsverfahren (FEMS Microbiol. Lett. 55 (1990), 135), ein LP-Transformationsverfahren (T. Akamatsu und J. Sekiguchi, Archives of Microbiology 146 (1987), S. 353–357; T. Akamatsu und H. Taguchi, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65 (4) (2001), S. 823–829) und dergleichen verwendet werden.
  • Die Selektion auf eine Transformante mit einem darin eingeführten Zielgen-Fragment kann unter Verwendung eines Selektionsmarkers oder dergleichen erfolgen. Zum Beispiel kann die Selektion unter Verwendung eines Indikators erfolgen, welcher anzeigt, ob eine Transformante eine Wirkstoffresistenz als Ergebnis der Einführung eines Wirkstoffresistenzgens zusammen mit einem DNA-Zielfragment durch einen Vektor in eine Wirtszelle erworben hat. Die Einführung eines DNA-Zielfragments kann auch durch PCR unter Verwendung eines Genoms als Matrize bestätigt werden.
  • 4. Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure oder eines Lipids
  • Das Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden enthaltend die Fettsäuren der vorliegenden Erfindung verwendet die oben beschriebene Thioesterase der vorliegenden Erfindung. Insbesondere kann ein Verfahren unter Verwendung einer Transformante (rekombinante Mikroorganismen, Pflanzen oder dergleichen) enthaltend das Thioesterase-Gen der vorliegenden Erfindung und ein Verfahren zur Durchführung einer Exzision einer Fettsäure aus Acyl-ACP in vitro unter Verwendung einer gereinigten Acyl-ACP und der Thioesterase der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden (Yuan et al., PNAS 92 (1995), S. 10639–10643) verwendet werden. Insbesondere bevorzugt wird ein Verfahren, welches das Herstellen einer Transformante mittels der oben beschriebenen Techniken umfasst, wobei die Transformante ein darin eingeführtes Gen aufweist, welches die Thioesterase der vorliegenden Erfindung codiert, das anschließende Züchten der Transformante unter geeigneten Bedingungen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, um Fettsäuren oder Lipide enthaltend diese Fettsäuren herzustellen, und das Gewinnen der Fettsäuren oder Lipide aus der Kultur. Der Arbeitsschritt des Züchtens einer Transformante in einem Medium gemäß der vorliegenden Erfindung schließt das Züchten eines Mikroorganismus, eines Tieres, einer Pflanze oder von Zellgeweben hiervon, sowie das Anziehen einer Pflanze in Erde oder dergleichen ein. Darüber hinaus umfasst die Kultur auch die Transformante selbst, welche gezüchtet oder kultiviert wurde.
  • Die Bedingungen für die Kultur und die Vermehrung einer Transformante können entsprechend dem Typ des Wirtes mit dem darin eingeführten Thioesterase-Gen gewählt werden, wobei jegliche bevorzugte Bedingungen verwendet werden können. Beispielsweise kann die Kultur im Falle der Verwendung von Escherichia coli als Wirt für die Transformation in LB-Medium bei 30°C bis 37°C über einen Zeitraum von einem halben Tag bis zu einem Tag durchgeführt werden. Im Falle der Verwendung von Arabidopsis thaliana als Wirt für die Transformation kann die Vermehrung in Erde unter Temperaturbedingungen von 20°C bis 25°C durch kontinuierliche Bestrahlung mit Weißlicht oder unter Beleuchtungsbedingungen mit einem Beleuchtungszeitraum von 16 Stunden und einem Dunkelzeitraum von 8 Stunden für einen bis zwei Monate erfolgen.
  • Unter dem Gesichtspunkt der Produktionseffizienz von Fettsäuren und Lipiden können Substrate für die Thioesterase oder Vorläufersubstanzen, welche an dem Fettsäure-Biosyntheseweg beteiligt sind, wie Glycerin, Essigsäure, Malonsäure und dergleichen, zu dem Medium zugegeben werden.
  • Nach Herstellung der Fettsäuren oder der Lipide durch das Züchten und das Vermehren der Transformante werden die Fettsäuren und die Lipide enthaltend die Fettsäuren durch Durchführung eines Isolierungsschritts, Reinigungsschritts und dergleichen aus der Kultur (der Transformante, dem Kulturmedium oder dergleichen) gewonnen.
  • Das Verfahren zur Isolierung und Gewinnung der Fettsäuren und der Lipide enthaltend die Fettsäuren, welche in der Transformante hergestellt werden, ist nicht besonders beschränkt, wobei herkömmliche Verfahren, welche angewendet werden, um Lipidkomponenten und dergleichen aus Organismen zu isolieren, verwendet werden können. Beispielsweise können die Fettsäuren oder die Lipide enthaltend die Fettsäuren aus der Kultur oder der Transformante mittels Filtration, Zentrifugation, Zellaufbrechen, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Chloroform/Methanol-Extraktion, Hexan-Extraktion, Ethanol-Extraktion oder dergleichen isoliert und gewonnen werden. Im Falle einer Isolierung und Gewinnung im großen Maßstab können die Lipide durch das Gewinnen der Ölkomponenten aus der Kultur oder der Transformante mittels Pressung oder Extraktion gewonnen und dann allgemeinen Reinigungsprozessen wie einer Entgummierung, Entsäuerung, Entfärbung, Entwachsung und Desodorierung unterzogen werden. Nach Isolierung der die Fettsäuren enthaltenden Lipidkomponenten als solche können die Fettsäuren durch Hydrolyse der isolierten Lipide erhalten werden. Spezifische Beispiele für das Verfahren zur Isolierung von Fettsäuren aus Lipidkomponenten schließen ein Verfahren zur Behandlung der Lipidkomponenten bei einer hohen Temperatur von etwa 70°C in einer alkalischen Lösung, ein Verfahren zur Durchführung einer Lipasebehandlung und ein Verfahren zum Abbau der Lipidkomponenten unter Verwendung von heißem Wasser bei hohem Druck ein.
  • Auf diese Weise können Fettsäuren oder Lipide unter Verwendung des Thioesterase-Gens der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
  • Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise bei der Herstellung von langkettigen Fettsäuren mit 12 oder mehr Kohlenstoffatomen oder von Lipiden enthaltend solche Fettsäuren, mehr bevorzugt bei der Herstellung von Fettsäuren mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen oder von Lipiden enthaltend solche Fettsäuren, stärker bevorzugt bei der Herstellung von Fettsäuren mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen oder von Lipiden enthaltend solche Fettsäuren und besonders bevorzugt bei der Herstellung von Laurinsäure (C12:0), Myristinsäure (C14:0), Palmitinsäure (C16:0) und Palmitoleinsäure (C16:1) verwendet werden.
  • Die Fettsäuren oder Derivate hiervon, welche durch das Herstellungsverfahren und die Transformante der vorliegenden Erfindung erhalten werden, können für Nahrungsmittel sowie als ein Emulgiermittel zur Einbeziehung in kosmetische Produkte oder dergleichen, ein Reinigungsmittel wie eine Seife oder ein Detergens, ein Faserbehandlungsmittel, ein Haarkonditionierungsmittel, ein Desinfektionsmittel oder ein Antiseptikum verwendet werden. Insbesondere kann Palmitoleinsäure als ein die Hautfunktion verbesserndes Mittel (mit einem hauterweichenden Effekt, einem hautschützenden Effekt, einem entzündungshemmenden Effekt, einem lindernden Effekt bei Juckreiz und Hautreizungen, einem schmerzlindernden Effekt bei leichten Verbrennungen und dergleichen) verwendet werden.
  • Beispiele
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlicher beschrieben, wobei aber die vorliegende Erfindung nicht darauf begrenzt ist.
  • Beispiel 1: Isolierung des Acyl-ACP-Thioesterase-Gens aus Cocos nucifera L.
  • 1. Herstellung von cDNA aus dem Endosperm von Cocos nucifera L.
  • Hierzu wurde die RNA aus dem Endosperm von Cocos nucifera L. extrahiert. Für die RNA-Extraktion wurde der RNeasy Plant Mini-Kit (Qiagen, Valencia, Kalifornien) verwendet. Das Endosperm von Cocos nucifera L. wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann mit Hilfe eines Mörsers und eines Stößels pulverisiert. Eine geeignete Menge des pulverisierten Produkts wurde in ein 1,5 ml-Röhrchen überführt, anschließend wurden 450 μl RLT-Puffer, enthaltend ein 1/100 Volumen 1 M Dithiothreit, zu dem Röhrchen zugegeben, und die Mischung wurde mit einem Vortexgerät gemischt. Die gesamte Menge wurde auf eine QIA-Shredder-Spin-Säule aufgegeben. Der nachfolgende Arbeitsschritt wurde gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung ausgeführt, wobei die Gesamt-RNA von Cocos nucifera L. erhalten wurde. Die Gesamt-RNA (3,2 μg) wurde als Matrize für eine reverse Transkriptase-Reaktion verwendet. Die Reaktion wurde unter Verwendung des SuperScript III First-Strand Synthesis-Systems (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung durchgeführt, wobei eine aus dem Endosperm von Cocos nucifera L. abgeleitete cDNA erhalten wurde.
  • 2. Clonierung des Thioesterase-Gens aus Cocos nucifera L. (CTE-Gen)
  • Genomische Informationen über Cocos nucifera L. und genetische Informationen über die Acyl-ACP-Thioesterase aus Cocos nucifera L. sind nicht bekannt. Daher wurden bereits bekannte Aminosäuresequenzen ausgewählt, welche bei Thioesterasen aus verschiedenen Pflanzen stark konserviert sind. Mit deren Hilfe wurden degenerierte Primer konstruiert, die diesen stark konservierten Regionen entsprechen, wie in Tabelle 1 angegeben ist (Primer Nr. 1 bis Nr. 5 (SEQ ID NOs: 5 bis 9)). Insbesondere wurden degenerierte Primer für Sequenzen der Pflanzen-Thioesterasen konstruiert, die den Aminosäuren an den Positionen 105 bis 110 (AAEKQW), den Positionen 250 bis 255 (WVMMN), den Positionen 310 bis 318 (DLDVNQHV) und den Positionen 315 bis 324 (NQHVNNVKY) in der Thioesterase aus Arabidopsis thaliana (GenBank ID (GI): 804947) entsprechen. Anschließend wurde unter Verwendung der degenerierten Primer und der aus dem Endosperm von Cocos nucifera L. abgeleiteten cDNA als eine Matrize eine PCR-Reaktion durchgeführt. Die PCR-Reaktion ergab verschiedene DNA-Fragmente, deren Sequenzen mittels Sequenzanalyse bestimmt wurden. Insbesondere wurde durch eine Sequenzabgleichung basierend auf den Sequenzen, welche durch die PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer Nr. 2 und Nr. 4 erhalten wurden, die Information für eine Teilsequenz des CTE-Gens erhalten. Unter Zugrundelegung der Information für die Teilsequenz wurde ein Oligo-DNA-Primer (Tabelle 1; Primer Nr. 6 (SEQ ID NO: 10)) und ein Oligo-dT-Primer (Tabelle 1; Primer Nr. 7 (SEQ ID NO: 11)) konstruiert. Anschließend wurde unter Verwendung dieser Primer eine PCR-Reaktion durchgeführt, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, wobei als Ergebnis die Nucleotidsequenz eines Gens, welches die funktionelle Region der Thioesterase aus Cocos nucifera L. codiert, erhalten bzw. verifiziert wurde (SEQ ID NO: 2). Tabelle 1: Primersequenzen
    Figure 00230001
    * Der Buchstabe ”h” in den Sequenzen von Nr. 1 bis Nr. 5 entspricht ”a, c oder t”; der Buchstabe ”r” entspricht ”g oder a”; der Buchstabe ”y” entspricht ”c oder t”; und der Buchstabe ”n” entspricht Inosin.
  • 3. Analyse der Aminosäuresequenz der Thioesterase aus Cocos nucifera L.
  • Die Aminosäuresequenz der Thioesterase aus Cocos nucifera L. (SEQ ID NO: 1), welche aus der oben beschriebenen Nucleotidsequenz des CTE-Gens abgeleitet wurde, wurde analysiert. Die Identität (Homologie) der Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung des Homologieanalyse(Homologie-Suche)-Programms, welches auf der Lipman-Pearson-Methode (Science 227 (1985), 1435) basiert, der Geninformation-Verarbeitungssoftware Genetyx-Win (Software Development, Inc.), berechnet, wobei die Kalibriereinheit für einen Vergleich (ktup) auf den Wert = 2 eingestellt wurde. Ferner wurde eine Abgleichung mit anderen Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Clustal W Multiple Alignment-Programms (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 4673) bei einer Standardeinstellung durchgeführt.
  • Die Sequenzen der Thioesterasen aus anderen Pflanzen und die Sequenz der oben beschriebenen Thioesterase aus Cocos nucifera L. wurden mit Hilfe der Genetyx-Win-Software miteinander verglichen und analysiert. Als ein Ergebnis zeigte die Thioesterase aus Cocos nucifera L. eine Aminosäuresequenzhomologie von 50% zu der Thioesterase aus Umbellularia californica (SEQ ID NO: 3), eine Aminosäuresequenzhomologie von 59% zu der Thioesterase aus Arabidopsis thaliana (GI: 804947), eine Aminosäuresequenzhomologie von 55% zu der Thioesterase aus Cuphea (GI: 1292906), eine Aminosäuresequenzhomologie von 49% zu der Thioesterase aus Mais (GI: 226529781), eine Aminosäuresequenzhomologie von 62% zu der Thioesterase E aus der Palme (GI: 90018255), eine Aminosäuresequenzhomologie von 59% zu der Thioesterase aus Reis (GI: 125554012) und eine Aminosäuresequenzhomologie von 57% zu der Thioesterase aus Sojabohnen (GI: 90192131). Somit wurde bestätigt, dass das CTE-Gen keine ausgeprägte Homologie zu den Thioesterasen aus anderen Pflanzen aufweist (zum Beispiel zeigte die Thioesterase aus Arabidopsis thaliana eine Aminosäuresequenzhomologie von 82% zu der Thioesterase aus Sojabohnen).
  • Eine multiple Sequenzabgleichung der Aminosäuresequenzen der Thioesterase aus Cocos nucifera L. und der Thioesterasen aus anderen Pflanzen wurde unter Verwendung des Clustal W Multiple Alignment-Programms durchgeführt. Anschließend wurde die Aminosäuresequenz der Thioesterase aus Cocos nucifera L. mit der Aminosäuresequenz der Thioesterase aus Umbellularia californica verglichen. Die Aminosäuresequenz der Thioesterase aus Umbellularia californica umfasste einen Methioninrest an der Position 197 (welcher dem Methioninrest an der Position 114 in SEQ ID NO: 3 entspricht), einen Argininrest an der Position 199 (welcher dem Argininrest an der Position 116 in SEQ ID NO: 3 entspricht) und einen Threoninrest an der Position 231 (welcher dem Threoninrest an der Position 148 in SEQ ID NO: 3 entspricht), wobei angenommen wird, das diese Positionen für die Erkennung von C12:0-Fettsäuren bedeutsam sind, wie in dem Bericht von Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 92 (1995), S. 10639–10643) offenbart wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass der Methioninrest an der Position 197 (welcher dem Methioninrest an der Position 117 in SEQ ID NO: 1 entspricht) und der Argininrest an der Position 199 (welcher dem Argininrest an der Position 119 in SEQ ID NO: 1 entspricht) in der Thioesterase aus Cocos nucifera L. konserviert sind; jedoch umfasste die Aminosäure an der Position 231 einen Lysinrest (der dem Lysinrest an der Position 151 in SEQ ID NO: 1 entspricht), welcher Lysinrest häufig in den Thioesterasen von Pflanzen mit Ausnahme der Thioesterase aus Umbellularia californica beobachtet wird. Die Kombination aus dem Methioninrest an der Position 197, dem Argininrest an der Position 199 und dem Lysinrest an der Position 231 war auch bei den Thioesterasen konserviert, welche hauptsächlich C16:0-Fettsäuren erkennen, wie den Thioesterasen aus Arabidopsis thaliana und Mais. Aus diesem Grund könnte die Erkennung der C12:0-Fettsäuren bei der Thioesterase aus Cocos nucifera L. möglicherweise auf einem anderen Weg als bei der Thioesterase aus Umbellularia californica erreicht werden.
  • Zum Beispiel wies die aus Cocos nucifera L. abgeleitete Thioesterase der vorliegenden Erfindung eine verhältnismäßig geringe Aminosäuresequenzhomologie zu den bereits bekannten Thioesterasen aus anderen Pflanzen auf, wobei die Substraterkennung bei den Thioesterasen ebenfalls unterschiedlich war.
  • Beispiel 2: Herstellung einer Transformante von Escherichia coli mit einem Thioesterase-Gen
  • Das in Beispiel 1 erhaltene Thioesterase-Gen (CTE-Gen) aus Cocos nucifera L. wurde mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Technik in Escherichia coli eingeführt, um auf diese Weise eine Transformante herzustellen. Als Kontrollexperiment wurde mittels der gleichen Technik eine Transformante von Escherichia coli hergestellt, welche das Acyl-ACP-Thioesterase-Gen (BTE-Gen) aus Umbellularia californica enthält.
  • 1: Konstruktion eines Plasmids für die Expression des CTE-Gens
  • Durch eine PCR-Reaktion unter Verwendung eines DNA-Fragments, das die funktionelle Region des in Beispiel 1 erhaltenen Thioesterase-Gens aus Cocos nucifera L. codiert (SEQ ID NO: 2), als eine Matrize und der in Tabelle 1 angegebenen Oligo-DNA-Primer (Primer Nr. 8 und Nr. 9 (SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13)) wurde ein DNA-Fragment, umfassend das CTE-Genfragment, worin eine partielle Sequenz des Plasmidvektors pMW219 (hergestellt von Nippon Gene Co., Ltd.) an beide Enden des CTE-Genfragments angehängt wurde, erhalten. Ferner wurde ein pMW219-Fragment in einer linearen Form durch eine PCR-Reaktion unter Verwendung von pMW219 als eine Matrize und der in Tabelle 1 angegebenen Oligo-DNA-Primer (Primer Nr. 10 und Nr. 11 (SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15)) amplifiziert. Das CTE-Genfragment und das pMW219-Fragment wurden unter Verwendung des In-Fusion Advantage PCR-Clonierungskits (Clontech, Mountain View, Kalifornien) miteinander ligiert, wodurch ein Plasmid konstruiert wurde, welches das CTE-Gen in einer Form exprimiert, welche mit der Aminosäure 27 am N-terminalen Ende des LacZ-Proteins des Vektors verbunden ist.
  • 2. Konstruktion eines Plasmids für die Expression des BTE-Gens
  • Durch eine PCR-Reaktion unter Verwendung eines Plasmids, welches ein künstlich synthetisiertes DNA-Fragment enthält, das die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4 umfasst und das das Thioesterase-Gen (BTE-Gen) aus Umbellularia californica codiert, als eine Matrize und unter Verwendung von Oligo-DNA-Primern (Tabelle 1; Primer Nr. 12 und Nr. 13 (SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17)) wurde ein DNA-Fragment erhalten, worin eine partielle Sequenz von pMW219 an beide Enden eines BTE-Genfragments angehängt wurde. Das Gen umfassend die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4 wurde durch den Synthese-Kundenservice der Firma Invitrogen, Inc. erhalten. Das BTE-Genfragment und das oben beschriebene pMW219-Fragment wurden unter Verwendung des In-Fusion Advantage PCR-Clonierungskits miteinander ligiert, wodurch ein Plasmid konstruiert wurde, welches das BTE-Gen in einer Form exprimiert, welche mit der Aminosäure 27 am N-terminalen Ende des LacZ-Proteins des Vektors verbunden ist.
  • 3. Expression des CTE-Gens und des BTE-Gens in transformierten Escherichia coli-Zellen
  • Der Escherichia coli-Mutantenstamm K27 (fadD88) (Overath et al., Eur. J. Biochem. 7 (4) (1969), 559–574; CSCG#: 5478) wurde unter Verwendung des Expressionsplasmids für das CTE-Gen oder des Expressionsplasmids für das BTE-Gen, welche wie oben beschrieben konstruiert wurden, transformiert. K27 ist eine Stamm-Variante, welche kein Fettsäure-Abbausystem umfasst. Die transformierten K27-Zellen wurden bei 30°C über Nacht stehen gelassen, und die so erhaltenen Kolonien wurden auf 1 ml LB-Km-Flüssigmedium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl und 50 μg/ml Kanamycin) überimpft. Das erhaltene Zellgemisch wurde für 12 Stunden einer Schüttelkultur bei 30°C unterzogen (Vorkultur). 20 μl der Vorkultur wurden auf 2 ml Overnight ExpressTM Instant TB-Medium (Takara Bio, Inc.), enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, überimpft, und das erhaltene Zellgemisch wurde für 24 Stunden einer Schüttelkultur (180 UpM) bei 30°C unterzogen. Nach Beendigung der Kulturphase wurde die Trübung (OD600) der Kultur gemessen. Die in dem erhaltenen Kulturmedium enthaltenen Lipidkomponenten wurden in Beispiel 3 analysiert.
  • Beispiel 3: Herstellung von Fettsäuren durch transformierte Escherichia coli-Zellen
  • 1. Extraktion der Lipide aus den transformierten Escherichia coli-Zellen und Analyse der darin enthaltenen Fettsäuren
  • 40 μl Essigsäure und 40 μl 7-Pentadecanon (0,5 mg/ml) gelöst in Methanol als interner Standard wurden zu 900 μl des in Beispiel 2 erhaltenen Kulturmediums nach dem Verstreichen eines Zeitraums von 24 Stunden nach Beginn der Kultur zugegeben. Anschließend wurden 0,5 ml Chloroform und 1 ml Methanol zu der Flüssigkeit zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät ausreichend gemischt und dann für 15 Minuten stehen gelassen. Des Weiteren wurden 0,5 ml einer 1,5%igen wässrigen Lösung von Kaliumchlorid und 0,5 ml Chloroform dazu zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät ausreichend gemischt und dann für 15 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wurde bei 1500 UpM für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und anschließend wurde die untere Schicht gewonnen und mit Stickstoffgas getrocknet. 1 ml einer Bortrifluorid-Methanol-Komplex-Lösung wurde zu der getrockneten Probe zugegeben, und das Gemisch wurde für 10 Minuten bei 80°C erwärmt, um auf diese Weise eine Methylveresterungsbehandlung der Fettsäuren durchzuführen. Anschließend wurden 1 ml gesättigte Kochsalzlösung und 1 ml Hexan dazu zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät ausreichend gemischt und dann für 30 Minuten stehen gelassen. Die obere Schicht wurde gewonnen und einer gaschromatographischen Analyse (Hewlett Packard 6890) unterzogen. Die Gaschromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Kapillarsäule: DB-1 MS, 30 m × 200 μm × 0,25 μm (J & W Scientific, Inc.); mobile Phase: hochreines Helium; Flussrate innerhalb der Säule: 1,0 ml/min; Temperaturerhöhungsprogramm: 100°C (für 1 min) → 10°C/min → 300°C (für 5 min); Equilibrierungszeit: 1 min; Injektionsport: Splitinjektion (Splitverhältnis: 100:1; Druck: 14,49 psi, 104 ml/min; Injektionsmenge: 1 μl; Phiolenreinigung: Methanol/Chloroform; Detektortemperatur: 300°C.
  • 2. Analyse des Fettsäuregehalts
  • Die Mengen der Fettsäuremethylester wurden anhand der Peakflächen der Wellenformdaten, welche durch die vorstehende gaschromatographische Analyse erhalten wurden, quantitativ bestimmt. Die den einzelnen Fettsäuren entsprechenden Peakflächen wurden mit der Peakfläche von 7-Pentadecanon als internen Standard verglichen, wobei Korrekturen zwischen den Proben vorgenommen wurden, und anschließend wurde der Gehalt der einzelnen Fettsäuren pro Liter des Kulturmediums berechnet. Außerdem wurde der vorstehend berechnete Gehalt der einzelnen Fettsäuren im Hinblick auf den zuvor gemessenen Lichtabsorptionswert (OD600) des Kulturmediums nach Beendigung der Kultur normalisiert. Die Ergebnisse sind in 1 veranschaulicht.
  • Ferner wurde der Gesamtgehalt der einzelnen Fettsäuren durch Aufsummierung der Werte für den oben beschriebenen Gehalt der einzelnen Fettsäuren berechnet. Die Ergebnisse sind in 2 veranschaulicht.
  • Wie aus 1 ersichtlich ist, wurden in der Transformante mit dem darin eingeführten Thioesterase-Gen aus Cocos nucifera L. vorwiegend Laurinsäure (C12:0), Myristinsäure (C14:0) und Palmitoleinsäure (C16:1) angereichert. Die angereicherte Menge an Laurinsäure (C12:0) war etwa gleich oder größer als die angereicherte Menge in der Transformante mit dem darin eingeführten Thioesterase-Gen (BTE-Gen) aus Umbellularia californica.
  • Anhand von 2 ist weiterhin ersichtlich, dass die Transformante mit der darin eingeführten Thioesterase aus Cocos nucifera L. eine etwa dreimal höhere Gesamtmenge an Fettsäuren im Vergleich zu der Gesamtmenge in der Transformante mit der darin eingeführten Thioesterase (BTE) aus Umbellularia californica aufwies. Somit wurde bestätigt, dass die Produktivität für Fettsäuren und Lipide in der Transformante mit der darin eingeführten Thioesterase aus Cocos nucifera L. in hohem Maße erhöht wurde.
  • 3. Gewinnung der Lipide aus dem Endosperm von Cocos nucifera L. und Analyse der Fettsäurezusammensetzung
  • 0,5 ml Chloroform, 0,5 ml Methanol und 0,25 ml einer 1,5%igen wässrigen Lösung von Kaliumchlorid wurden zu etwa 100 mg Endosperm von Cocos nucifera L. zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät gemischt. Zusätzlich wurden 40 μl Essigsäure und 40 μl 7-Pentadecanon (0,5 mg/ml) gelöst in Methanol zu dem Gemisch zugegeben. Des Weiteren wurden 0,5 ml Chloroform und 1 ml Methanol dazu zugegeben. Der nachfolgende Arbeitsschritt wurde in der gleichen Weise wie oben in Abschnitt 1 beschrieben durchgeführt, wobei die Fettsäuren gewonnen wurden und dann eine Analyse der Fettsäuren durchgeführt wurde.
  • Die Mengen der Fettsäuremethylester wurden anhand der Peakflächen der Wellenformdaten, welche durch die gaschromatographische Analyse erhalten wurden, quantitativ bestimmt. Das Fettsäure-Zusammensetzungsverhältnis wurde unter Zugrundelegung der Peakflächen berechnet. Die Ergebnisse sind in 3 veranschaulicht.
  • Wie aus 3 ersichtlich ist, wurde in dem Endosperm von Cocos nucifera L. überwiegend Laurinsäure (C12:0) angereichert, wobei andere Fettsäuren in der Reihenfolge Myristinsäure (C14:0), Palmitinsäure (C16:0) und Stearinsäure (C18:0) angereichert wurden.
  • Demgegenüber wurde in der Transformante mit der darin eingeführten Thioesterase aus Cocos nucifera L. überwiegend Myristinsäure (C14:0), gefolgt von Laurinsäure (C12:0) angereichert. Außerdem wurde Palmitoleinsäure (C16:1), deren Anreicherung im Endosperm nur in sehr geringen Mengen beobachtet wird, in demselben Maße wie Laurinsäure (C12:0) angereichert. Anhand dieser Ergebnisse wurde festgestellt, dass bei Verwendung der Thioesterase aus Cocos nucifera L. gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Transformante Fettsäuren mit einer Zusammensetzung hergestellt werden können, welche sich von der Zusammensetzung der Fettsäuren in dem Endosperm von Cocos nucifera L. unterscheidet.
  • Beispiel 4: Konstruktion einer Transformante durch Einführung des Thioesterase-Gens in Arabidopsis thaliana
  • Das in Beispiel 1 erhaltene Thioesterase-Gen aus Cocos nucifera L. (CTE-Gen) wurde mittels der nachstehend beschriebenen Techniken in Arabidopsis thaliana eingeführt, um auf diese Weise eine Transformante herzustellen.
  • 1. Konstruktion eines Plasmids für die Expression des CTE-Gens in Arabidopsis thaliana
  • (1) Clonierung der Promotorregion und der Terminatorregion des Napin-Gens
  • Die Promotorregion des Napin-Gens aus Brassica rapa wurde unter Verwendung einer wilden Rapspflanze, gesammelt in Itako City, Präfektur Ibaraki, erhalten, und die Terminatorregion des Napin-Gens aus Brassica rapa wurde unter Verwendung einer wilden Rapspflanze, gesammelt in Mashiko-cho, Präfektur Tochigi, erhalten, wobei jeweils das folgende Verfahren angewendet wurde.
  • Die genomische DNA wurde unter Verwendung des Power Plant DNA Isolation-Kits (MO BIO Laboratories, USA) aus den oben beschriebenen Pflanzen extrahiert. Die Promotor- und Terminatorregionen wurden mittels PCR unter Verwendung der genomischen DNA als eine Matrize und der DNA-Polymerase PrimeStar amplifiziert. Insbesondere wurde die Promotorregion des Napin-Gens aus Brassica rapa unter Verwendung eines Primerpaars bestehend aus Primer Nr. 1 und Nr. 2 (SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22), wie in Tabelle 2 angegeben, amplifiziert. Die Terminatorregion des Napin-Gens aus Brassica rapa wurde unter Verwendung eines Primerpaars bestehend aus Primer Nr. 3 und Nr. 4 (SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24) amplifiziert. Zusätzlich wurde auch eine PCR unter Verwendung der PCR-Produkte des amplifizierten Promotors und Terminators des Napin-Gens aus Brassica rapa als Matrizen durchgeführt. Bei dieser PCR wurde ein Primerpaar bestehend aus Primer Nr. 5 und Nr. 6 (SEQ ID NO: 25 und SEQ ID NO: 26), wie in Tabelle 2 angegeben, für die Amplifizierung des Promotors des Napin-Gens verwendet, und ein Primerpaar bestehend aus Primer Nr. 3 und Nr. 7 (SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 27), wie in Tabelle 2 angegeben, wurde für die Amplifizierung des Terminators des Napin-Gens verwendet. Die mittels PCR amplifizierten DNA-Fragmente wurden durch das Anhängen von Desoxyadenin (dA) an die beiden Enden des Fragments unter Verwendung des Mighty TA-Clonierungskits (hergestellt von Takara Bio, Inc.) behandelt. Anschließend wurden die DNA-Fragmente jeweils durch Ligierung in den Vektor pMD20-T (hergestellt von Takara Bio, Inc.) insertiert. Als Ergebnis wurde das Plasmid pPNapin1, enthaltend den Promotor des Napin-Gens, bzw. das Plasmid pTNapin1, enthaltend den Terminator des Napin-Gens, konstruiert. Diese Plasmide wurden einer Sequenzanalyse unterzogen, wodurch die Nucleotidsequenz der Promotorregion (SEQ ID NO: 18) und die Nucleotidsequenz der Terminatorregion (SEQ ID NO: 19) bestimmt wurden.
  • (2) Konstruktion eines Vektors für die Transfektion von Pflanzenzellen
  • Als Vektor für die Transfektion von Pflanzenzellen wurde der Vektor pRI909 (hergestellt von Takara Bio, Inc.) verwendet.
  • Zuerst wurden der Promotor und der Terminator des Napin-Gens aus Brassica rapa in den Vektor pRI909 eingeführt. Ein DNA-Fragment der Promotorregion mit einer darin eingefügten Restriktionsenzymerkennungssequenz an beiden Enden des Fragment wurde mittels PCR unter Verwendung der DNA-Polymerase PrimeSTAR mit dem vorstehend in Abschnitt (1) hergestellten Plasmid pPNapin1 als eine Matrize und einem Primerpaar bestehend aus Primer Nr. 8 und Nr. 9 (SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 29), wie in Tabelle 2 angegeben, amplifiziert. Ferner wurde ein DNA-Fragment der Terminatorregion mittels PCR unter Verwendung der DNA-Polymerase PrimeSTAR mit dem Plasmid pTNapin1 als eine Matrize und einem Primerpaar bestehend aus Primer Nr. 10 und Nr. 11 (SEQ ID NO: 30 und SEQ ID NO: 31), wie in Tabelle 2 angegeben, amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente wurden durch das Anhängen von Desoxyadenin (dA) an die beiden Enden des Fragments unter Verwendung des Mighty TA-Clonierungskits (hergestellt von Takara Bio, Inc.) behandelt. Anschließend wurden die Fragmente jeweils durch Ligierung in den Vektor pMD20-T (hergestellt von Takara Bio, Inc.) insertiert, wodurch das Plasmid pPNapin2 bzw. pTNapin2 konstruiert wurde. Das Plasmid pPNapin2 wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und NotI behandelt, und das Plasmid pTNapin2 wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI und NotI behandelt. Die behandelten Plasmide wurden durch Ligierung in den Vektor pRI909 (welcher vorher mit den Restriktionsenzymen SalI und SmaI behandelt wurde) insertiert, wodurch das Plasmid p909PTnapin konstruiert wurde.
  • Durch Inanspruchnahme des Synthese-Kundenservice der Firma Invitrogen, Inc. (Carlsbad, Kalifornien), wurde ein Gen erhalten, welches das Chloroplasten-Transport-Signalpeptid des Acyl-ACP-Thioesterase-Gens (BTE-Gen) codiert (SEQ ID NO: 20).
  • Ein Plasmid, enthaltend eine Sequenz des vorstehend erhaltenen Gens, wurde als eine Matrize verwendet, und das Genfragment, welches das Chloroplasten-Transport-Signalpeptid codiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der DNA-Polymerase PrimeSTAR und einem Primerpaar bestehend aus Primer Nr. 12 und Nr. 13 (SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 33), wie in Tabelle 2 angegeben, amplifiziert. Die amplifizierten Genfragmente wurden durch das Anhängen von Desoxyadenin (dA) an die beiden Enden der Fragmente unter Verwendung des Mighty TA-Clonierungskits (hergestellt von Takara Bio, Inc.) behandelt. Anschließend wurden die Genfragmente jeweils durch Ligierung in den Vektor pMD20-T (hergestellt von Takara Bio, Inc.) insertiert. Als Ergebnis wurde das Plasmid pSignal konstruiert. Das Plasmid pSignal wurde mit dem Restriktionsenzym NotI gespalten, und die Spaltungsfragmente wurden durch Ligierung mit der NotI-Stelle in p909PTnapin verknüpft. Als Ergebnis wurde das Plasmid p909PTnapin-S konstruiert.
  • Ein DNA-Fragment, welches das CTE-Gen codiert, wurde durch eine PCR-Reaktion unter Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen Gens, das die funktionelle Region der Thioesterase aus Cocos nucifera L. (CTE) codiert (SEQ ID NO: 2), als eine Matrize und unter Verwendung der DNA-Polymerase PrimeSTAR MAX und einem Primerpaar bestehend aus Primer Nr. 14 und Nr. 15 (SEQ ID NO: 34 und SEQ ID NO: 35), wie in Tabelle 2 angegeben, amplifiziert. Zusätzlich wurde das Plasmid p909PTnapin-S als ein lineares Fragment unter Verwendung von p909PTnapin-S als eine Matrize und unter Verwendung eines Primerpaars bestehend aus Primer Nr. 16 und Nr. 17 (SEQ ID NO: 36 und SEQ ID NO: 37) amplifiziert. Das CTE-Genfragment und das p909PTnapin-S-Fragment wurden unter Verwendung des In-Fusion Advantage PCR-Clonierungskits (hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.) miteinander ligiert.
  • Auf diese Weise wurde das Plasmid p909CTE, enthaltend die Thioesterase-Gensequenz aus Cocos nucifera L. (CTE), für die Transfektion von Pflanzenzellen konstruiert. In diesem Plasmid wurde die Expression der CTE-Gensequenz durch den Promotor des Napin-Gens aus Brassica rapa (Raps) kontrolliert, und die CTE-Gensequenz wurde durch das Chloroplasten-Transport-Signalpeptid des Thioesterase-Gens (BTE) aus Umbellularia californica in die Chloroplasten transportiert.
  • Tabelle 2:
    Figure 00330001
  • 2. Verfahren zur Transformation und Züchtung von Arabidopsis thaliana
  • Der Vektor p909CTE für die Transfektion von Pflanzenzellen wurde durch den Kundenservice der Firma Inplanta Innovations, Inc., für die Transformation von Arabidopsis thaliana bereitgestellt. Auf diese Weise wurde eine Transformante von Arabidopsis thaliana (Columbia) mit einem darin eingeführten CTE-Gen, Pnapin-CTE, erhalten.
  • Der Wildtypstamm von Arabidopsis thaliana und die Transformante Pnapin-CTE wurden in Erde bei einer Raumtemperatur von 22°C unter den Bedingungen eines Beleuchtungszeitraums von 16 Stunden (etwa 4000 Lux) unter Verwendung einer Fluoreszenz-Lampe und eines Dunkelzeitraums von 8 Stunden kultiviert. Nach der Kultivierung für etwa 2 Monate wurden die Samen geerntet.
  • Beispiel 5: Herstellung von Fettsäuren und Lipiden in der Transformante von Arabidopsis thaliana
  • Für die in Beispiel 4 konstruierte Transformante von Arabidopsis thaliana (Pnapin-CTE) und den Wildtypstamm von Arabidopsis thaliana wurde mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Techniken eine Analyse des Lipidgehalts und der Fettsäurezusammensetzung in den Samen durchgeführt.
  • 1. Lipidextraktion aus Samen und Methylveresterung der Fettsäuren
  • Mit Hilfe eines Samen-Messlöffels (Fassungsvermögen = 200 Körner; hergestellt von Biomedical Science Co., Ltd.) wurden etwa zwei Messlöffel der vorstehend geernteten Samen von Arabidopsis thaliana abgemessen und in ein Lysing-Matrix-D-Röhrchen (MP Biomedicals, Inc., USA) gegeben. Das Lysing-Matrix-D-Röhrchen wurde in einen FastPrep-Homogenisator (MP Biomedicals, LLC) eingebracht, und die Samen wurden für 20 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 6.0 Vibrationen ausgesetzt und dadurch zerkleinert. Anschließend wurden 20 μl 7-Pentadecanon (0,5 mg/ml in Methanol) (interner Standard) und 20 μl Essigsäure zu den zerkleinerten Samen zugegeben. Ferner wurden 0,25 ml Chloroform und 0,5 ml Methanol dazu zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät ausreichend gemischt und dann für 15 Minuten stehen gelassen. Anschließend wurden 0,25 ml einer 1,5%igen wässrigen Lösung von Kaliumchlorid und 0,25 ml Chloroform dazu zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät ausreichend gemischt und dann für 15 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wurde bei 1500 UpM für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und anschließend wurde die untere Schicht gewonnen und mit Stickstoffgas getrocknet. 100 μl 0,5 N KOH-Methanol-Lösung wurden zu den getrockneten Proben zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei einer konstanten Temperatur von 70°C gehalten, um das Triacylglycerol zu hydrolysieren. Das getrocknete Produkt wurde durch Zugabe von 0,3 ml einer Bortrifluorid-Methanol-Komplex-Lösung gelöst, und die Lösung wurde für 10 Minuten bei einer konstanten Temperatur von 80°C gehalten, um auf diese Weise eine Methylveresterung der Fettsäuren zu erreichen. Anschließend wurden 0,2 ml gesättigte Kochsalzlösung und 0,3 ml Hexan zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Vortexgerät ausreichend gemischt und dann für 30 Minuten stehen gelassen. Die Hexanschicht (obere Schicht), welche die Methylester der Fettsäuren enthält, wurde gewonnen und einer gaschromatographischen (GC) Analyse unterzogen.
  • 2. Gaschromatographische (GC) Analyse
  • Die vorstehend erhaltenen Methyl-veresterten Proben wurden mittels Gaschromatographie (GC) analysiert. Die GC wurde unter Verwendung einer DB1-MS-Säule (J & W Scientific, Inc., Folsom, Kalifornien) und des GC-Analyse-Systems 6890 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, Kalifornien) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Säulentemperatur: 100°C für 1 min → 100°C bis 300°C (Temperaturerhöhung um 10°C/min) → 300°C für 5 min (nach dem Durchlauf für 2 min) Injektionsport-Detektortemperatur: 300°C; Injektionsmethode: Splitmodus (Splitverhältnis: 193:1); Probeninjektionsmenge: 1 μl bis 2 μl; Säulendurchflussrate: konstant bei 0,5 ml/min; Detektor: FID; Trägergas: Wasserstoff; Spülgas: Helium. Die Mengen der Fettsäuremethylester wurden anhand der Peakflächen der Wellenformdaten, welche durch die GC-Analyse erhalten wurden, quantitativ bestimmt. Die den einzelnen Fettsäuren entsprechenden Peakflächen wurden mit der Peakfläche von 7-Pentadecanon als internen Standard verglichen, wobei Korrekturen zwischen den Proben vorgenommen wurden. Anschließend wurde der Gehalt der einzelnen Fettsäuren in den Samen, welche insgesamt für die Analyse verwendet wurden, berechnet. Außerdem wurde der Gehalt der einzelnen Fettsäuren pro 100 Samen durch das Dividieren des berechneten Fettsäuregehalts durch die Anzahl der zuvor abgemessenen Samen berechnet. Der den einzelnen Fettsäuren in den Samen entsprechende GC-Peak wurde anhand der Retentionszeit (RT) des Methylesters eines Standardprodukts der einzelnen Fettsäure und durch die nachstehend beschriebene GC/MS-Analyse identifiziert.
  • 3. GC/MS-Analyse
  • Im Anschluss an die GC-Analyse wurden die Proben gegebenenfalls einer GC/Massenspektrometrie(MS)-Analyse unterzogen. Die GC/MS-Analyse wurde mit Hilfe einer DB1-MS-Kapillarsäule, des GC-Analyse-Systems 7890A (Agilent Technologies, Inc.) und des MS-Analyse-Systems 5975C (Agilent Technologies, Inc.) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Säulentemperatur: 100°C für 2 min 100°C bis 300°C (Temperaturerhöhung um 10°C/min) 300°C für 5 min (Equilibrierungszeit 2 min; nach dem Durchlauf für 5 min bei 320°C) oder 100°C für 2 min → 100°C bis 200°C (Temperaturerhöhung um 10°C/min) 200°C bis 320°C (Temperaturerhöhung um 50°C/min) 320°C für 5 min (Equilibrierungszeit 2 min; nach dem Durchlauf für 5 min bei 320°C); Injektionsport-Detektortemperatur: 250°C; Injektionsmethode: Splitless-Modus; Probeninjektionsmenge: 1 μl; Säulendurchflussrate: konstant bei 1 ml/min; Detektor: FID; Trägergas: Wasserstoff; Spülgas: Helium; Lösungsmittel-Retentionszeit: 7 min oder 3,5 min; Ionisationsmethode: EI-Methode; Ionenquellentemperatur: 250°C; Grenzflächentemperatur: 300°C; Messmethode: Scan-Modus (m/z: 20 bis 550 oder 10 bis 550).
  • Anhand der Peakflächen der Wellenformdaten, welche durch die GC-Analyse erhalten wurden, wurde der Gehalt der einzelnen Fettsäuren in den Samen der Transformante von Arabidopsis thaliana (Pnapin-CTE) oder des Wildtypstamms von Arabidopsis thaliana berechnet. 4 zeigt den Fettsäuregesamtgehalt (den Lipidgesamtgehalt), und 5 veranschaulicht den Anteil der einzelnen Fettsäuren an dem Fettsäuregesamtgehalt. In 4 und 5 entspricht der Lipidgehalt der Samen des Wildtypstamms dem Durchschnittswert der für zwei unabhängige Gruppen von Samen erhaltenen Ergebnisse, und entspricht der Lipidgehalt der Transformante Pnapin-CTE dem Durchschnittswert von fünf unabhängigen Linien.
  • Wie aus 4 ersichtlich ist, ist der Fettsäuregesamtgehalt (der Lipidgehalt) in den geernteten Samen der Transformante Pnapin-CTE umfassend das CTE-Gen höher als in den geernteten Samen des Wildtypstamms von Arabidopsis thaliana.
  • Aus 5 ist ferner ersichtlich, dass die Transformante Pnapin-CTE Laurinsäure (C12:0) und Myristinsäure (C14:0) enthielt, welche Säuren nicht in dem Wildtyp von Arabidopsis thaliana enthalten waren, wobei auch die Menge an Palmitinsäure (C16:0) erhöht war. Außerdem war die in der Transformante Pnapin-CTE enthaltene Menge an Myristinsäure (C14:0) und Palmitinsäure (C16:0) größer als die Menge an Laurinsäure (C12:0), wobei es allem Anschein nach Unterschiede in der Fettsäurezusammensetzung der Transformante und der Fettsäurezusammensetzung des Endosperms von Cocos nucifera L. gab.
  • Auf diese Weise wurde gezeigt, dass die Produktivität einer Transformante im Hinblick auf Fettsäuren und Lipide durch die erfindungsgemäße Thioesterase aus Cocos nucifera L. erhöht werden kann, und dass die Fettsäuren in Verhältnissen hergestellt werden können, welche sich von der Fettsäurezusammensetzung des Endosperms von Cocos nucifera L. unterscheiden.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Die Thioesterase der vorliegenden Erfindung weist eine exzellente Produktivität im Hinblick auf Fettsäuren auf. Die Produktivität einer Transformante im Hinblick auf Fettsäuren und Lipiden kann dadurch erhöht werden, dass die Transformante durch das Einführen eines Gens, welches die Thioesterase codiert, in einen Mikroorganismus, eine Pflanze oder dergleichen erhalten wird. Die durch die Transformante hergestellten Fettsäuren, Lipide und Derivate davon können für Nahrungsmittel oder als ein Emulgiermittel für kosmetische Produkte und dergleichen, ein Reinigungsmittel wie eine Seife oder ein Detergens, ein Faserbehandlungsmittel, ein Haarkonditionierungsmittel, ein Desinfektionsmittel, ein Antiseptikum und dergleichen verwendet werden.
  • Durch die Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die vorliegenden Ausführungsformen ist nicht beabsichtigt, die Erfindung auf irgendwelche Einzelheiten in der Beschreibung zu begrenzen, sofern nicht anders angegeben, wobei die Erfindung weit ausgelegt werden kann, ohne den Geist und den Schutzumfang, wie in den beigefügten Patentansprüchen dargelegt, zu verlassen.
  • Diese Anmeldung beansprucht Priorität für die Patentanmeldung Nr. 2010-106570, eingereicht in Japan am 6. Mai 2010, und für die Patentanmeldung Nr. 2011-20737, eingereicht in Japan am 2. Februar 2011, welche jeweils in ihrer Gesamtheit unter Bezugnahme darauf eingeschlossen sind.
  • Sequenzprotokoll – freier Text
    • SEQ ID NO: 5 Oligonucleotid-Primer Nr. 1 Position 15: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar. Position 18: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar.
    • SEQ ID NO: 6 Oligonucleotid-Primer Nr. 2 Position 3: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar. Position 6: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar.
    • SEQ ID NO: 7 Oligonucleotid-Primer Nr. 3 Position 7: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar. Position 16: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar.
    • SEQ ID NO: 8 Oligonucleotid-Primer Nr. 4 Position 10: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar.
    • SEQ ID NO: 9 Oligonucleotid-Primer Nr. 5 Position 12: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar. Position 18: Das Symbol ”n” stellt i (Inosin) dar.
    • SEQ ID NO: 10 Oligonucleotid-Primer Nr. 6
    • SEQ ID NO: 11 Oligonucleotid-Primer Nr. 7
    • SEQ ID NO: 12 Oligonucleotid-Primer Nr. 8
    • SEQ ID NO: 13 Oligonucleotid-Primer Nr. 9
    • SEQ ID NO: 14 Oligonucleotid-Primer Nr. 10
    • SEQ ID NO: 15 Oligonucleotid-Primer Nr. 11
    • SEQ ID NO: 16 Oligonucleotid-Primer Nr. 12
    • SEQ ID NO: 17 Oligonucleotid-Primer Nr. 13
    • SEQ ID NO: 21 Oligonucleotid-Primer Nr. 1 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 22 Oligonucleotid-Primer Nr. 2 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 23 Oligonucleotid-Primer Nr. 3 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 24 Oligonucleotid-Primer Nr. 4 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 25 Oligonucleotid-Primer Nr. 5 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 26 Oligonucleotid-Primer Nr. 6 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 27 Oligonucleotid-Primer Nr. 7 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 28 Oligonucleotid-Primer Nr. 8 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 29 Oligonucleotid-Primer Nr. 9 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 30 Oligonucleotid-Primer Nr. 10 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 31 Oligonucleotid-Primer Nr. 11 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 32 Oligonucleotid-Primer Nr. 12 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 33 Oligonucleotid-Primer Nr. 13 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 34 Oligonucleotid-Primer Nr. 14 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 35 Oligonucleotid-Primer Nr. 15 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 36 Oligonucleotid-Primer Nr. 16 für Arabidopsis thaliana
    • SEQ ID NO: 37 Oligonucleotid-Primer Nr. 17 für Arabidopsis thaliana
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Science 227 (1985), S. 1435 [0031]
    • Yuan et al., PNAS 92 (1995), S. 10639–10643 [0034]
    • Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press [0039]
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    • Horton et al., Gene 77 (1989), 61–68 [0045]
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    • Kunkel-Methode (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 488 [0045]
    • Mackenzie, T. et al., Plasmid 15 (2) (1986), S. 93–103 [0050]
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Claims (13)

  1. Protein ausgewählt aus den folgenden (a) bis (c): (a) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, das eine Thioesterase-Aktivität aufweist, (b) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz in der eine bis mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt wurden, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist, und (c) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist.
  2. Gen, welches das Protein nach Anspruch 1 codiert.
  3. Gen umfassend eine der folgenden DNAs (d) bis (f): (d) DNA umfassend eine Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die DNA ein Protein mit Thioesterase-Aktivität codiert, (e) DNA, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen an eine DNA umfassend eine Sequenz, die komplementär zur Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ist, zu hybridisieren, wobei die DNA ein Protein mit Thioesterase-Aktivität codiert, und (f) DNA umfassend eine Nucleotidsequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die DNA ein Protein mit Thioesterase-Aktivität codiert.
  4. Rekombinanter Vektor umfassend das Gen nach Anspruch 2 oder 3.
  5. Transformante umfassend das Gen nach Anspruch 2 oder 3 oder den rekombinanten Vektor nach Anspruch 4.
  6. Transformante nach Anspruch 5, wobei der Wirt der Transformanten eine Pflanze oder ein Mikroorganismus ist.
  7. Transformante nach Anspruch 5, wobei der Wirt der Transformanten Escherichia coli ist.
  8. Transformante nach Anspruch 5, wobei der Wirt der Transformanten Arabidopsis thaliana ist.
  9. Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure, umfassend das Züchten der Transformanten nach einem der Ansprüche 5 bis 8 in einem Kulturmedium und das Sammeln einer Fettsäure aus der Kultur des Mediums.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Lipids enthaltend eine Fettsäure, umfassend das Züchten der Transformanten nach einem der Ansprüche 5 bis 8 in einem Kulturmedium und das Sammeln des Lipids, das eine Fettsäure enthält, aus der Kultur des Mediums.
  11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Fettsäure eine langkettige Fettsäure mit 12 oder mehr Kohlenstoffatomen ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Fettsäure mindestens eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure und Palmitoleinsäure ist.
  13. Verfahren zur Verstärkung der Produktivität einer Fettsäure oder eines Lipids enthaltend eine Fettsäure, umfassend das Einbringen eines Gens, das eines der folgenden Proteine (a) bis (c) codiert, in einen Wirt: (a) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, das eine Thioesterase-Aktivität aufweist, (b) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz in der eine bis mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 deletiert, substituiert, insertiert und/oder hinzugefügt wurden, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist, und (c) Protein umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, wobei das Protein eine Thioesterase-Aktivität aufweist.
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