JP2002335786A - 植物において脂肪酸合成を促進させる方法 - Google Patents

植物において脂肪酸合成を促進させる方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物油の生産量を増やすために、植物におい
て脂肪酸合成を促進させるための、新規な方法を提供す
る。 【解決手段】 本発明により、植物において脂肪酸合成
を促進させるための、新規な方法が与えられた。大腸菌
型アセチルCoA カルボキシラーゼaccD遺伝子の上流に、
葉緑体において高発現している遺伝子のプロモーター配
列を葉緑体形質転換法により導入することにより、accD
遺伝子がコードするカルボキシルトランスフェラーゼβ
サブユニットの蛋白質量を増強した。それに伴い、アセ
チルCoA カルボキシラーゼを構成する他のサブユニット
の蛋白質量もまた増加した。アセチルCoA カルボキシラ
ーゼは脂肪酸合成の最初の段階の鍵酵素であるため、本
発明の方法により脂肪酸合成を促進させることが可能で
ある。本発明の方法により作製された形質転換植物は顕
著な脂肪酸合成の促進を示した。また葉の寿命が延び、
多数の種子を結実し、植物体の生産力が向上した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大腸菌型アセチル
CoA カルボキシラーゼのaccDサブユニットの発現量を増
強することにより植物において脂肪酸合成を促進させる
方法、及び当該方法により脂肪酸合成を促進させた形質
転換植物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】地球環境を汚染しない石油に変わる物質
として、植物油の需要は年々増加している。光合成産物
に固定された炭酸ガスは、その産物を燃やしたとき同じ
量だけの炭酸ガスを放出し循環するので、石油とは異な
り、地球環境を汚染しないクリーンなエネルギーとな
る。特に、油は澱粉やセルロースと異なり、結晶水を含
まないので、嵩低く且つエネルギー含量の高い物質で、
付加価値が高い。すでに、植物油を改変し、これを潤滑
油、界面活性剤など工業用に利用されている。これらの
需要に応えるためには、大量に油をつくることが必要で
あり、これまでに分子育種により油の質と量を改変した
形質転換植物が開発されている。
【０００３】植物は光合成で炭酸ガスを有機化合物に変
換後、過剰の産物を澱粉又は油に変え、主に種子に貯蔵
し、次代のエネルギー源としている。種子には油性種子
と澱粉種子とがあるが、有機物を油と澱粉への配分する
量を決める仕組みはわかっていない。しかし、油の量の
関しては、主成分である脂肪酸を合成する最初の反応に
関与する鍵酵素である、アセチルCoA カルボキシラーゼ
の量により規定されると考えられている。アセチルCoA
カルボキシラーゼが触媒する反応は、下記に示す通りで
ある。 CH3COSCoA （アセチル-CoA）+ CO2 → HOOCCH2COSCoA
（マロニル-CoA）
【０００４】この反応によって生じるマロニル-CoAは、
主に脂肪酸の合成に使われる。炭素数16のパルミチン酸
は脂肪酸合成酵素により、１分子のアセチル-CoAと７分
子のマロニル-CoAとから作られ、順次二つずつ炭素数を
伸ばし、その都度炭酸ガスを発生して生合成される。脂
肪酸合成の律速段階はマロニル-CoA生成の段階で、アセ
チルCoA カルボキシラーゼの活性は厳密に調節されてい
る。脂肪酸からは膜のグリセロリピド、種子の貯蔵リピ
ド、表皮細胞からの水の蒸散を防ぐクチクラリピドをは
じめとし、細胞の必須成分が合成される。アセチルCoA
カルボキシラーゼは、細胞に必須なマロニル-CoAを必要
に応じて供給する重要な酵素である。よって、この酵素
に注目し、アセチルCoA カルボキシラーゼの量を増加さ
せて脂肪酸合成を盛んにし、油を多量に作らせる試みが
なされている。
【０００５】植物においてアセチルCoA カルボキシラー
ゼは、動物タイプと大腸菌タイプの２種類の酵素が存在
していることが知られている。両酵素の構造を、図１に
示す。本発明者らは、1993年に大腸菌タイプのアセチル
CoA カルボキシラーゼを植物で初めて同定した (J. Bio
l. Chem. 268, 25118-25123, 1993)。大腸菌タイプのア
セチルCoA カルボキシラーゼは、解離可能な４成分、即
ちビオチンカルボキシラーゼ（BC）、ビオチンカルボキ
シル担体蛋白質（BCCP）、及びカルボキシルトランスフ
ェラーゼ（CT）α及びβサブユニットからなり、これら
を構成する４つの遺伝子は、それぞれaccC、accB、acc
A、accDと呼ばれている。大腸菌タイプのアセチルCoA
カルボキシラーゼは、４種類の各サブユニットの二量体
からなる分子量約27万の多酵素複合体である。それに対
して、動物タイプのアセチルCoA カルボキシラーゼは、
必要な３つの活性が分子量約24万の単一の多機能ポリペ
プチドにあり、このポリペプチドの二量体からなる。
【０００６】尚、動物タイプの酵素は細胞質ゾルに、大
腸菌タイプは葉緑体に局在することが知られている。こ
れまでの研究で、形質転換し易い動物タイプの酵素量を
増加させ、これを葉緑体に移行させることにより、ナタ
ネ種子の油含量を５％増加させた報告がある(Plant Phy
siol; 113, 75-81, 1997) 。この知見は動物タイプの酵
素のものであるが、葉緑体内でアセチルCoA カルボキシ
ラーゼ量を増加させて、油量を増加できることを示して
いる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかし、葉緑体に存在
する大腸菌タイプの酵素量を増加させることにより、油
含量を増加させた例はこれまでに存在しなかった。脂肪
酸の合成は、主に葉緑体またはプラスチドで行われるの
で、上記の大腸菌タイプの酵素が脂肪酸合成量を支配し
ていると考えられている。そこで、脂肪酸の合成を効率
よく増加させる為に、大腸菌タイプのアセチルCoA カル
ボキシラーゼの量を増加させることを可能とする技術が
求められていた。かかる課題を解決するために、葉緑体
形質転換法により、大腸菌タイプのアセチルCoA カルボ
キシラーゼの量を、効率的に増加させる方法を提供する
ことが、本発明の課題である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の第一の観点は、
大腸菌型アセチルCoA カルボキシラーゼのaccD遺伝子の
発現量を増加させることにより、植物において脂肪酸合
成を促進させる方法である。accD遺伝子、葉緑体におい
て高発現している遺伝子のプロモーター配列、及び葉緑
体ゲノムでの相同組み換えを可能にする相同配列の３種
類のDNA をプラスミドに導入したコンストラクトを作製
し、このコンストラクトにより植物の葉緑体を形質転換
することにより、前記accD遺伝子の発現量を増加させる
ことを特徴とする前記の方法もまた、本発明の更なる観
点である。
【０００９】本発明の他の観点は、大腸菌型アセチルCo
A カルボキシラーゼのaccD遺伝子の発現量を増加させる
事により、その遺伝子によりコードされるカルボキシル
トランスフェラーゼ（CT）βサブユニットの蛋白質量を
増加し、同時に大腸菌型アセチルCoA カルボキシラーゼ
を構成する他のサブユニットの蛋白質量もまた増加する
事を特徴とする、前記の方法である。本発明の方法にお
いて、大腸菌型アセチルCoA カルボキシラーゼを構成す
る他のサブユニットが、ビオチンカルボキシラーゼ（B
C）蛋白質、ビオチンカルボキシル担体蛋白質（BCCP）
及びカルボキシルトランスフェラーゼ（CT）αサブユニ
ット蛋白質である前記の方法もまた、本発明の更なる観
点である。
【００１０】本発明の更なる観点は、大腸菌型アセチル
CoA カルボキシラーゼのaccD遺伝子、葉緑体において高
発現している遺伝子のプロモーター配列、及び葉緑体ゲ
ノムでの相同組み換えを可能にする相同配列の３種類の
DNA を含むコンストラクトにより、植物において葉緑体
の形質転換を行った、形質転換植物である。対照株植物
と比較して葉における脂肪酸含量が増加し、かつ澱粉含
量が減少している事を特徴とする前記の形質転換植物、
対照株植物と比較して植物体の葉の寿命が延びているこ
とを特徴とする前記の形質転換植物もまた本発明の更な
る観点である。更に、対照株植物と比較して種子あたり
の脂肪酸含量が増加し、かつ澱粉含量が減少しているこ
とを特徴とする前記の形質転換植物もまた本発明の更な
る観点である。更に、対照株植物と比較して植物体あた
りの種子数が増加し、その結果植物体あたりの全脂肪酸
含量が対照株植物と比較して増加している事を特徴とす
る前記の形質転換植物、対照株植物と比較して種子にお
ける脂肪酸と澱粉の比率が改善されていることを特徴と
する前記の形質転換植物もまた本発明の更なる観点であ
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】大腸菌タイプのアセチルCoA カル
ボキシラーゼは、上記に述べた様に４種類のサブユニッ
トからなり、１つのサブユニットの遺伝子(accD)だけが
葉緑体ゲノムにあり、他は核ゲノムにコードされてい
る、という知見に本発明者らは注目した。アセチルCoA
カルボキシラーゼの発現量を増やすためには、これら４
種類の遺伝子の発現量を増加させなければならない。し
かし、核ゲノムにコードされた遺伝子の発現量を増加し
ても、アセチルCoA カルボキシラーゼ量は増加しないこ
とが示されている。これらの結果より、葉緑体ゲノムに
コードされた遺伝子の発現量が酵素量を規定していると
推定される。すなわち、このaccDの発現量を増やすこと
により酵素の発現量を増加させて、脂肪酸合成を促進で
きる可能性がある。そこで本発明者らは、アセチルCoA
カルボキシラーゼaccD遺伝子の発現量のみを増加させ、
その効果を検討した。
【００１２】即ち、下記の実施例で示される様に、タバ
コaccD遺伝子本来のプロモーターを除去して、ここに葉
緑体において発現量の多いリボソーマルRNA (rRNA)のプ
ロモーターをつなぎ、タバコ葉緑体へ形質転換した。Ma
ligaにより開発された葉緑体形質転換法（Maliga et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1993) 90,913-917）は改
良され、タバコで実用化されている。通常はaccD遺伝子
の発現量は少ないが、上記のrRNAのプロモーターを使用
することにより、accD遺伝子の発現量が増加することが
示された。
【００１３】アセチルCoA カルボキシラーゼの酵素量が
増加する為には、葉緑体に存在するaccD遺伝子がコード
するカルボキシルトランスフェラーゼ（CT）βサブユニ
ットの蛋白質量のみならず、他のサブユニットであるビ
オチンカルボキシラーゼ（BC）、ビオチンカルボキシル
担体蛋白質（BCCP）、及びカルボキシルトランスフェラ
ーゼ（CT）αサブユニットの、他の３つのサブユニット
の蛋白質量もまた、増加することが必要である。
【００１４】これらの３つのサブユニットの遺伝子は、
上記で述べた様に、核ゲノムに存在することが知られて
いる。検討の結果、得られた形質転換植物ではaccDサブ
ユニットだけではなく、他の３つのサブユニットの発現
量も増え、アセチルCoA カルボキシラーゼ量が増加した
ことが示された。更に、種子当たりの油量を増加させる
ことに成功し、油量を改変する新方法を確立することが
できた。将来、分子育種により、大量に簡単に油糧作物
から植物油が得られるようになれば、石油に変わる炭化
水素として幅広く利用され、社会に貢献すると考える。
この様な現象の原因は以下のように考えている。核ゲノ
ムに存在する３つの蛋白質はaccDサブユニットよりも多
く生産され、葉緑体に移動する。これらの蛋白質は葉緑
体でaccDサブユニットと会合し、この分子数に見合った
量の酵素を形成し、過剰のサブユニットは直ちに分解さ
れる。形質転換体ではaccDサブユニットの分子数が増加
し、上記の過剰のサブユニットとも会合するため、酵素
量が増加する。これまで分解されていたサブユニットが
安定な酵素を形成するので、他のサブユニット量も増加
して見えるのである。すなわち、他のサブユニットの増
加は分解の減少による。
【００１５】本発明の方法において、大腸菌型アセチル
CoA カルボキシラーゼのaccD遺伝子、葉緑体において高
発現している遺伝子のプロモーター配列、及び葉緑体ゲ
ノムでの相同組み換えを可能にする相同配列の３種類の
DNA をプラスミドに導入したコンストラクトを作製す
る。ここで、葉緑体において高発現しているプロモータ
ー配列はaccD遺伝子の上流に挿入され、それによりaccD
遺伝子の発現を活性化する機能を有する。尚、下記の実
施例においては、形質転換体の選抜のために薬剤耐性遺
伝子であるスペクチノマイシン耐性遺伝子（aadA：amin
oglycoside3"-adenylyltransferase遺伝子）を、共にプ
ラスミドに挿入している。この様に、選抜に役立つ遺伝
子を共にコンストラクトに導入する事は、本発明の実施
において好ましい態様である。作製した上記コンストラ
クトにより、植物の葉緑体を形質転換する。目的遺伝子
を導入したコンストラクトの作製は、適切なプラスミド
と制限酵素等を用いて、本技術分野において汎用される
技術を採用することにより行う事ができる。ここで使用
するプラスミドは特に限定される物ではなく、pZErO2.
1,pUC18,pBluescript等、本技術分野で一般的に使用さ
れているプラスミドを使用することができる。
【００１６】ところで、これまでに知られた先行技術
は、全て核コード遺伝子を形質転換したものであり、カ
リフラワーモザイクウイルス３５S プロモーター、ノパ
リンシンターゼターミネーターなどの構成的に発現する
プロモーターが用いられ、いわゆるペナルテイーが懸念
される。そのために、このような懸念のない別の方法に
よる分子育種が必要とされる。
【００１７】一方、本発明の方法の特徴の一つは、葉緑
体に存在するaccD遺伝子の発現量を増加するために、葉
緑体形質転換の方法を用いていることである。葉緑体の
形質転換法に関する教示は、Maligaらの文献（Maliga e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1993) 90,913-917）に
記載されている。本発明において用いている方法は、葉
緑体ゲノムのaccD遺伝子により形質転換する方法であ
り、本発明において用いている葉緑体形質転換法はこれ
に応える形質転換法である。実施例においては、上記の
選抜の目的で、スペクチノマイシン耐性遺伝子もまた挿
入しているが、ペナルテイーは少ないと予測される。
【００１８】本発明において用いられている葉緑体形質
転換法は、相同組み換えにより起こるので、特定の位置
に遺伝子を挿入できるため、得られた転換体は斉一であ
る。尚、相同組み換え（homologous recombination）と
は、ほぼあるいは全く同一の塩基配列間に起こる組み換
えのことをいう。なお相同組み換えは、DNA の特定の塩
基配列において起こる、部位特異的組み換え（site-spe
cific recombination）や、相同性のないDNA どうしで
起こる非相同組み換え（non-homologous recombinatio
n）とは異なった遺伝子組み換えの態様である。従来用
いられてきたアグロバクテリウムを用いた形質転換方法
では、導入した遺伝子は予期出来ない位置に入る、とい
う欠点がある。その点、葉緑体では相同組み換えにより
遺伝子を導入するので、上記の相同組み換えの特質より
判る様に所定の位置に入り、得られた形質転換体は斉ー
であり、トラブルの可能性をはらむようなことはない。
【００１９】上記の様に、本発明で用いている葉緑体の
形質転換は、相同組み換えで起こるために、相同配列と
して用いることが可能な配列を同時に導入する必要があ
る。下記の実施例においては、accD遺伝子の隣にあるRu
bisco large subunit （rbcL）遺伝子とその3'下流配列
からなる配列を、相同配列として用いている。accD遺伝
子の上流にrbcL遺伝子が存在するので、このaccD遺伝子
とrbcL遺伝子の配列を使って相同組み換えを行うことに
成功した。原理的には、導入をしようとする目的配列
（下記の実施例においてはribosomal RNA operon 16 プ
ロモーター）の前後に、宿主植物体の葉緑体遺伝子にお
いて組み換えようとする場所の相同配列（下記の実施例
accD遺伝子とrbcL遺伝子）が存在する構造のコンストラ
クトを作製することにより、相同組み換えを起こすこと
が可能である。よって、相同配列としてはrbcL遺伝子と
その3'下流配列に限定されるものではなく、相同組み換
えに使用する事ができる限り、他の配列を使用する事も
可能である。よって、本願明細書において「葉緑体ゲノ
ムでの相同組み換えを可能にする相同配列」とは、相同
組み換えを起こしてプロモーターを導入することを可能
とする、任意の塩基配列を意味するものである。
【００２０】宿主として用いる植物種という点では、下
記の実施例においては、タバコを用いて形質転換を行っ
ているが、使用する植物はそれに限られるものではな
い。葉緑体形質転換の技術は、タバコにおいて最も成功
し、実用化されている。また、シロイヌナズナ、ポテト
やトマトにおいても成功しているという報告もある。本
発明の方法は、原理的にはナタネ、ダイズ、イネなど種
々の植物において適用することが可能である。その様な
植物も、本発明の方法により葉緑体形質転換を行ってac
cD遺伝子の発現を誘導することができる限り、本発明の
目的に使用することが可能である。
【００２１】accD遺伝子の発現を増強するためのプロモ
ーターとしては、実施例で使用したribosomal RNA oper
on 16 プロモーターが最も好ましい。しかし、それに限
定されるものではなく、葉緑体においてaccD遺伝子の発
現を増加させる事が可能である限り、他のプロモーター
を使用することが可能であり、例えばPSII 32kDa prote
in(psbA), ribosomal protein S16(rps16)等のプロモー
ターを使用することが可能である。よって、本願明細書
において「葉緑体において高発現している遺伝子のプロ
モーター配列」とは、葉緑体においてaccD遺伝子の発現
を増加させる活性を有する、任意のプロモーターの塩基
配列を意味するものである。
【００２２】形質転換を行う方法としては、下記の実施
例においてはパーティクルガン法を使用している。葉緑
体の形質転換を行う方法としては、パーティクルガン法
が簡便かつ確実であるので、最も好ましいが、それに限
定されるものではない。PEGを用いてプロトプラストに
遺伝子を導入し、葉緑体の形質転換に成功した例もあ
り、例えばPEG を用いた方法等も使用可能であり、その
様な方法で葉緑体形質転換を行ってaccD遺伝子の発現を
増強することも、本発明の実施態様の一つであるであ
る。
【００２３】また本発明の方法によりaccD遺伝子の発現
が増加する様に形質転換した植物体もまた、本発明の範
囲内である。下記の実施例において本発明者らは実際に
形質転換した植物体の株を作製している。そして、形質
転換を行った株より得られた種子において、明らかに種
子の油量が増加していることを確認している。今後、更
に改良をおこなうことにより、更に油の産生を促進させ
る事が可能と思われる。なお、本願明細書において「対
照株植物」とは、accD遺伝子の発現を増強させていない
植物を意味するものであり、下記の実施例においてはカ
セット導入株がそれに相当する。また、「脂肪酸と澱粉
の比率が改善されている」とは、脂肪酸の比率が増加し
て澱粉の比率が減少することを意味する。
【００２４】更に、本発明の方法を用いることにより，
植物において脂肪酸合成が促進されることに伴って、澱
粉の合成が抑制されることが認められた。言い換える
と、アセチルCoA カルボキシラーゼの発現量を増加させ
ることにより、澱粉と脂肪酸の分配が変化するために、
葉や種子あたりの脂肪酸含量が増加して澱粉含量が減少
するという知見が得られた。この知見は、本発明の方法
による脂肪酸合成の促進は本質的には、一定の光合成エ
ネルギーから得られる産物の分配を改変することにより
達成されることを意味している。
【００２５】更に、下記の実施例で示している様に、ac
cD遺伝子の発現を増加させた形質転換植物において、葉
の寿命が延びるという現象と植物体あたりの種子数が増
加するという現象が認められた。得られる種子数が増加
する原因については、アセチルCoA カルボキシラーゼが
高発現した植物体において、葉の寿命が延びると光合成
により得られるエネルギーの絶対量が増加することによ
るのではないかと考えられる。accD遺伝子が高発現した
形質転換体においては種子当たりの脂肪酸含量も増加し
ているために、種子の数の増加も考慮すると、下記の実
施例においては植物体あたりの脂肪酸含量は２倍以上に
上昇している。
【００２６】
【実施例】（accD遺伝子及びrbcL遺伝子、rrn16 プロモ
ーターの単離）本研究では、葉緑体形質転換に実用化さ
れているN.tabacum cv. Xanthiを用いるので、この栽培
種の必要な断片をクローニングした。高発現させるaccD
遺伝子、相同組み換えで相同配列として用いるaccD遺伝
子の隣にあるrbcL（Rubisco large subunit ）遺伝子、
高発現プロモーターのrrn （ribosomal RNA operon）16
プロモーターをクローニングした。
【００２７】Shinozaki 等（EMBO J.5,2043-2049,1986
）はN.tabacum cv. bright yellow4のDNA 配列を決定
しているので、この情報からプライマーを作成し、Xant
hiのゲノムDNA を鋳型にしてPCR で各遺伝子及びプロモ
ーターを増幅した。増幅断片はpZErO-2.1 (Invitrogen)
のEcoRV 部位にサブクローニングし、配列を確認した。
【００２８】accD遺伝子の増幅断片の配列はbright yel
low 4 と同じであった。accD遺伝子の配列を、図２及び
配列表の配列番号１に示す。rbcL遺伝子の増幅断片の配
列は２カ所異なっていた（□で囲んだ塩基）。rbcL遺伝
子の配列を、図３及び配列表の配列番号２に示す。既知
の報告と塩基配列は異なるが、コードするアミノ酸はbr
ight yellow 4 と同じであり、この違いはタバコの栽培
種が異なることによると思われる。
【００２９】rrn16 プロモーターは２種類存在すること
が報告されている（Curr.Genet.27,280-284,1995）。葉
緑体にコードされるRNA ポリメラーゼ（PEP ：plastid-
encoded plastid RNA polymerase）と核にコードされる
RNA ポリメラーゼ（NEP ：nuclear-encoded plastid RN
A polymerase）が結合するプロモーターである。rrn16
プロモーターの配列を、図４及び配列表の配列番号３に
示す。accDはNEP 用のプロモーターを持つ遺伝子である
ことが知られている（Trends Plant Sci.4,169-170,199
9 ）。本実験では、rrn16 の両プロモーターを共に増幅
した。増幅断片の配列はbright yellow 4 と同じであっ
た。
【００３０】（コンストラクトの作製）葉緑体形質転換
に用いるコンストラクトを作製した。accD遺伝子の発現
量は少ないので、本来のプロモーターを除去し、強いrr
n16 プロモーターに組み換えた。また、形質転換体の選
抜に葉緑体のタンパク質合成を阻害するスペクチノマイ
シンを用いるため、薬剤耐性遺伝子、aadA（aminoglyco
side3"-adenylyltransferase）遺伝子を共に挿入した。
更にコントロールとして、aadA遺伝子の挿入が植物体に
害を与えないことを確認するため、aadA遺伝子のみを挿
入するコンストラクトも作製した。
【００３１】accD遺伝子のプロモーターを組み換えるた
めのコンストラクトは図５である。accD遺伝子本来のプ
ロモーターを除去し、rrn16 プロモーターに置き換え
た。aadA遺伝子はrbcLとaccD遺伝子の間に挿入した。aa
dA遺伝子は上流にrrn16 のPEP用のプロモーター、下流
にpsbA（PSII 32kDa protein）のターミネーターをつな
いだ（aadAカセットと呼ぶ）。aadA遺伝子のみを挿入す
るためのコンストラクトは図６である。本来のaccDプロ
モーターの上流にaadAカセットを挿入した。
【００３２】具体的な作製手順は次の通りである。rbcL
遺伝子の構造遺伝子領域と3'下流領域を増幅した。Forw
ard プライマー：5'-GTCGAGTAGACCTTGTTGTTGTGAG-3' ：
配列表の配列番号４）とReverse プライマー：5'-CCCGG
GCGGCCGCGGAACCCCCTTTATATTAT-3'：配列表の配列番号
５）を用いた。Reverse プライマーは5'側にSmaI、Not
I、SacII の制限酵素サイトを含む。プライマー増幅断
片はpZErO-2.1 (Invitrogen)のEcoRV 部位にサブクロー
ニングし、EcoRI とSmaIで消化した。DNA 断片を電気泳
動で分離し、DNA 抽出キット（アマシャム・ファルマシ
ア）により目的のDNA 断片を回収した。accD遺伝子は構
造遺伝子領域と転写開始点を基準に-18 から+86 の領域
を削除し、+87 から1674までを増幅した。Forward プラ
イマー（5'-CCGCGGCCGCCCGGGGTCTGATAGGAAATAAG-3'：配
列表の配列番号６）とReverse プライマー（5'-GTCGACG
TGCTCTACTTGATTTTGC-3' ：配列表の配列番号７）を用い
た。Forward プライマーは5'端にSacII 、NotI、SmaIを
含み、Reverse プライマーは5'端にSalIサイトを含む。
増幅断片はpZErO-2.1 (Invitrogen)のEcoRV 部位にサブ
クローニングし、SmaIとSalIで消化した。
【００３３】DNA 断片を電気泳動で分離し、DNA 抽出キ
ットにより目的のDNA 断片を回収した。この断片をSmaI
とSaI で消化したpUC18 と結合させた。次いで、このプ
ラスミドをEcoRI とSmaIで消化し、上述のrbcL遺伝子の
増幅、回収断片と結合させ、rbcL遺伝子とプロモーター
領域の省かれたaccD遺伝子を含むプラスミドを作製し
た。rrn16 プロモーターはForward プライマー（5'-GTC
GACGCTCCCCCGCCGTCGTTC-3'：配列表の配列番号８）とRe
verse プライマー（5'-GGTACCCGGGATTCGGAATTGTCTTTC-
3' ：配列表の配列番号９）を用いて増幅した。Forward
プライマーは5'端にSalIサイトを含み、Reverse プラ
イマーは5'端にKpnIとSmaIサイトを含む。増幅断片はpZ
ErO-2.1 のEcoRV 部位にサブクローニングし、SaIlとKp
nIで消化した。DNA 断片を低融点のアガロースゲルで電
気泳動して分離し、目的のDNA 断片をフェノール抽出
後、回収した。この断片をSaIlとKpnIで消化したaadAカ
セットを含むpCT08 ベクターと結合させ、aadAカセット
とrrn16 プロモーターを含むプラスミドを作製した。最
後に、aadAカセットとrrn16 プロモーターを含むプラス
ミドをSmaIとNotIで消化し、DNA 断片を電気泳動で分離
し、DNA 抽出キットによりDNA 断片を回収した。この断
片をSmaIとNotIで消化したrbcL遺伝子とプロモーター領
域の省かれたaccD遺伝子を含むプラスミドと結合させ、
目的のコンストラクトを完成した（図５）。
【００３４】aadA遺伝子のみを挿入するコンストラクト
は次のように作製した。Forward プライマー（5'-GTCGA
CAACATATTAATATATAGTG-3' ：配列表の配列番号１０）と
Reverse プライマー（5'-GTCGACGTGCTCTACTTGATTTTGC-
3' ：配列表の配列番号１１）で本来のaccDプロモータ
ーのついたaccD遺伝子を増幅した。Forward プライマー
は5'端にSalIサイトを含み、Reverse プライマーは5'端
にSalIサイトを含む。増幅断片はpZErO-2.1 のEcoRV 部
位にサブクローニングし、SalIで消化した。DNA断片を
電気泳動で分離し、DNA 抽出キットにより目的のDNA 断
片を回収した。図５に示したドナーDNA をSalIで消化し
て、rrn16 プロモーターのついたaccD遺伝子を除去した
プラスミドに、本来のプロモーターを持つaccDを結合さ
せ、コンストラクトを完成した（図６）。各コンストラ
クトは全配列を確認後、キアゲンカラムで精製し、葉緑
体の形質転換に用いた。
【００３５】（葉緑体の形質転換）Maliga等（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA;90,913-917,1993）によって開発さ
れた系により葉緑体遺伝子の形質転換をした。滅菌処理
したタバコ種子を薬剤を含まないRM培地（MS salts、30
g/l sucrose 、6g/l Agar ）で発芽させ、温度25℃、照
度40μmol/m2・s 、16時間明所 / 8時間暗所の人工気象
器で6-8 週間生育させた。アグリポットの丈ほどに生育
した植物体の上部から3 、4 枚目の葉を形質転換に用い
た。葉は濾紙をひいたRMOP培地（MS salts、0.005% FeE
DTA 、1mg/lThiamine、0.1mg/l NAA 、1mg/l BAP 、100
mg/l inositol、30g/l sucrose 、6g/l Agar ）に背側
を上部にしておき、葉脈や葉の周辺に切れ込みを入れて
濾紙に完全に広げた。その状態で、25℃で一晩、クリー
ンベンチ内で放置した。パーティクルガンのボンバード
メントで用いるタングステン粒子（1.1 μm ）はエタノ
ールで2 時間、95℃で処理後、超音波処理し、エタノー
ルを除いて滅菌水に懸濁した。タングステン溶液50μl
、作製したコンストラクト10μg 分、2.5mM 塩化カル
シウム50μl 、0.1mM スペルミジン20μl を混合し、4
℃で30分間懸濁した。
【００３６】次いで、エタノールで3 回洗浄後、粒子を
30μl のエタノールに懸濁した。これを5 回のボンバー
ドメントに用いた。各コンストラクトは、一晩放置した
タバコの葉10枚にボンバードメントした（1 回のボンバ
ードメントに1 枚の葉を用いる）。パーティクルガンは
Bio-Rad のPDS1000He を使用した。サンプルは5 段目、
ストッピングスクリーンは2 段目にセットした。27.5ま
で真空を引いた後、1100psi のラプチャーディスクを用
いてボンバードメントした。ボンバードメント後、直ち
に常圧に戻し、温度25℃、照度40μmol/m2・s 、16時間
明所 / 8時間暗所の人工気象器で2 日間、葉をincubate
した。その後、葉を5mm 四方に切り、500mg/l 濃度のス
ペクチノマイシンを含むRMOP培地に植えた。
【００３７】約1 ヶ月で緑色のシュートを形成した個体
を500mg/l 濃度のスペクチノマイシンを含むRM培地に移
植して発根させた。発根しなかったものは葉を切り、再
びスペクチノマイシンを含むRMOP培地に植えて再分化を
行った。形成されたシュートはスペクチノマイシンを含
むRM培地に移植して発根させた。1-2 週間ほどで発根し
た個体はアグリポットの丈ほどに生育したところで数枚
の葉をとり、ゲノムDNA を抽出、PCR によって挿入遺伝
子を確認した。遺伝子が挿入された個体は腋芽をスペク
チノマイシンを含むRM培地に移植して個体数を増やし
た。本研究ではaccDプロモーターを組み換えた形質転換
株（accD高発現株）、aadA遺伝子のみを挿入した対照株
（カセット導入株）ともに数系統の個体が得られた。
【００３８】（形質転換植物体のゲノミックサザン解
析）葉緑体ゲノムのコピー数は多く、細胞内で50から1
万コピーにもなる。葉緑体形質転換では、その全ての葉
緑体ゲノムを組み換えることは困難で、形質転換体では
野生型の葉緑体ゲノムと形質転換された葉緑体ゲノムの
両方が混在することが多い。そこで、得られた形質転換
体における野生型と形質転換型の葉緑体ゲノムの混在比
をゲノミックサザンで調べた。
【００３９】アグリポットで生育した個体を土に移植
し、薬剤の非存在下、温度25℃、照度300 μmol/m2・s
、12時間明所 / 12 時間暗所の温室で生育させた。3-4
枚の葉が形成されたところで、数系統の個体の葉、約5
00mg からCTAB（cetyltrimethylammonium bromide）法
でゲノムDNA を抽出した。このゲノムDNA2μg をEcoRI
で消化後、0.8%のアガロースゲルで電気泳動した。ゲル
を酸処理、次いでアルカリ処理後、HybondN+膜（アマシ
ャム・ファルマシア）に転写した。転写した膜は1%(w/
v)PVP K30、1mM EDTA、500mM ナトリウムリン酸緩衝液
(pH7.2) 、7%(w/v) SDS を含むハイブリダイゼイション
溶液で1 時間、65℃で前処理後、32P で標識したプロー
ブを2 ×106cpm/ml となるように溶液に加え、65℃で16
時間ハイブリダイズした。プローブはaccD及びaadA遺伝
子の全長を含む断片をBcaBest labelingkit（TAKARA）
を用いて、α-32P dCTP で標識して作製した。ハイブリ
ダイズ後、膜を0.1%SDS を含む2 ×SSPE（1 ×SSPE: 0.
15M NaCl、10mM NaH2PO4［pH7.4］、1mM EDTA）で室温
で15分、2 回洗浄後、Fuji Imaging Plateに一晩露出
し、BAS2000 imaging analyzer（Fuji Film Co. ）でシ
グナルを検出した。
【００４０】accD遺伝子は野生株では約4.3kbpに検出さ
れた（図７）。対照株（カセット導入株）、accD高発現
株では薬剤遺伝子マーカーの挿入により野生株よりも約
1.4kbp大きい、5.7kbpのバンドのみが検出され、目的の
位置で相同組み換えが起こった遺伝子だけを確認した。
更に、野生型の葉緑体ゲノムが増幅するプライマーを用
いてPCR で確認しても増幅断片が検出されず、完全に葉
緑体ゲノムが組み換わったことを確認した。aadA遺伝子
は野生株では検出されない。対照株、accD高発現株では
5.7kbpの位置に検出され、aadA遺伝子の挿入も確認した
（図８）。
【００４１】（形質転換植物体のノザン解析）accDのプ
ロモーターが高発現のrrn16 プロモーターに置き換わっ
たので、次にaccD遺伝子の発現量をノザン法で解析し
た。9 枚の葉をつけている植物体で解析した。野生株、
対照株およびaccD高発現株の上部から2-4 枚目の葉を採
取し、SDS-フェノール法により核酸を抽出した。得られ
た核酸画分からLiCl沈殿法により全RNA を回収した。各
レーン1 μg の全RNA を0.66M ホルムアルデヒドを含む
1%アガロースゲルで電気泳動した。泳動後、ゲルをHybo
ndN+膜に転写した。転写した膜は50%(v/v)ホルムアミ
ド、6 ×SSPE、0.5%(w/v) SDS 、0.1mg/ml変性サケ精巣
DNA 、5%(v/v) アイリッシュクリームを含むハイブリダ
イゼイション溶液で1時間、42℃で前処理後、32P で標
識したプローブを2 ×106cpm/ml となるように溶液に加
え、42℃で16時間ハイブリダイズした。プローブはaccD
遺伝子の全長を含む断片をBcaBest labeling kitを用い
て、α-32P dCTP で標識して作製した。ハイブリダイズ
後、膜を0.1%SDS を含む2 ×SSPEで室温で15分、2 回、
次いで0.1%SDS を含む2 ×SSPEで65℃、30分、2 回洗浄
した。洗浄後、ハイブリダイズした膜は一晩、Fuji Ima
ging Plateに一晩露出し、BAS2000 imaging analyzer
（Fuji Film Co. ）でシグナルを検出した。
【００４２】野生株、対照株、accD高発現株すべてに2.
3kb の転写産物が検出された（図９）。これは、すでに
報告されているタバコaccD mRNA のサイズと一致してい
る（EMBO J.16,4041-4048,1997）。野生株においてはmR
NA量は少なく、対照株ではわずかに増加した。accD高発
現株は発現量が莫大に増加した。accD遺伝子のプロモー
ターを高発現のプロモーターに組み換え、accD mRNA 量
を増加させることに成功した。
【００４３】（形質転換植物体のウェスタン解析）葉緑
体ゲノムにあるaccD mRNA 量が増加したので、その翻訳
産物CTβ（カルボキシルトランスフェラーゼβサブユニ
ット）が増加するか調べた。同時に、核ゲノムにコード
される3 つのサブユニットであるCTα（カルボキシルト
ランスフェラーゼαサブユニット）、BC（ビオチンカル
ボキシラーゼ）及びBCCP（ビオチンカルボキシル担体タ
ンパク質）も調べた。最終的にはアセチルCoA カルボキ
シラーゼ（ACCase）量を増加させなくてはならない。AC
Caseが増加するには全てのサブユニットが増加しなけれ
ばならない。ACCase活性を測定するのは難しいため、こ
こではウェスタンでACCaseの各サブユニット量について
調べた。
【００４４】9 枚の葉をつけている植物体で解析した。
野生株およびaccD高発現株の上部から2-4 枚目の葉を採
取し、S-300 buffer（50mM Tris-HCl ［pH8.0 ］、5mM
アミノカプロン酸、1mM EDTA、1mM Benzamidine 、20mM
β-mercaptoethanol、1mM PMSF）で酸化アルミニウムを
加えて粉砕し、タンパク質を抽出した。次いで、等量の
2 ×SDS loading buffer（6% SDS、125mM Tris-HCl［pH
6.8 ］、20% glycerol）を加えて、99℃、3 分間加熱
後、遠心して上清を回収した。タンパク質の定量にはLo
wry 法に準じたDC Protein Assay（BIO-RAD ）を用い
た。SDS-PAGEの際にはβ-mercaptoethanol、BPB を加え
て分離を行った（10% 分離ゲル濃度）。タンパク質は各
レーン10μg を供した。泳動後、ゲルをニトロセルロー
ス膜に転写、ブロッキングを行い、膜を各ポリクローナ
ル抗体と反応させた（抗CTβ抗体は1000分の1 希釈、抗
BC、CTα抗体は3000分の1 希釈で使用した）。反応後、
膜を洗浄し、3000分の1 希釈した二次抗体（HRP 標識さ
れた抗ウサギ抗体）と反応させた。最後に膜を洗浄、EC
L kit （アマシャム・ファルマシア）を用いてシグナル
を検出した。BCCPは転写、ブロッキング後に1000分の1
希釈のHRP 標識されたストレプトアビジンと反応させ、
洗浄した後、ECL kit を用いてシグナルを検出した。
【００４５】CTβは、accD高発現株で野生株よりも増加
していることを確認した（図１０）。また核ゲノムコー
ドのサブユニットタンパク質（BC、BCCP、CTα）もすべ
てaccD高発現株で野生株よりも増加していることを確認
した。accD高発現株ですべてのサブユニットが増加し、
最終的に原核細胞型ACCase量を増加させることに成功し
た。
【００４６】（脂肪酸含量のガスクロマトグラフィー分
析）ACCase量の増加で脂肪酸合成が盛んになり、種子に
おいて油量が増加するか解析した。野生株、対照株およ
びaccD高発現株から得られた種子において、油の主成分
である脂肪酸の量をガスクロマトグラフィーで分析し
た。各株の種子50個に5%塩酸- メタノール250 μl を加
え、80℃で1.5 時間処理して脂肪酸をメチルエステルに
した。反応後、1.5ml の0.9%(w/v) 塩化ナトリウム、0.
5ml のヘキサンを加えてメチル化された脂肪酸を抽出し
た。ヘキサン層を回収し、その溶液1 μl をガスクロマ
トグラフィー分析に用いた。機種はGL-353（GL Science
s Inc.）、キャピラリーカラムはCP-sil88（0.25mm×50
m ）を用いた。カラム圧160kPa、温度190 ℃、時間15分
で分析した。
【００４７】タバコの種子において、C16:0 、C18:0 、
C18:1 、C18:2 、c18:3 の脂肪酸を検出した。検出した
ピークから脂肪酸量を算出し、乾燥種子当たりの脂肪酸
含量を比較した（表１）。野生株の種子における脂肪酸
含量は平均42.5mg/g dry wt.であった。対照株の種子は
平均43.3mg/g dry wt.で野生株と同等の値を示した。ac
cD高発現株の種子は平均47.6mg/g dry wt.で、野生株よ
りも12% 程の脂肪酸含量の増加を確認した。最も脂肪酸
含量の多かった株D では22% 増加した。これはナタネに
おいて真核型ACCaseに葉緑体移行シグナルをつけて高発
現させた植物体よりも高い数値である（5%の増加が確認
されている）。よって、本発明において、ではaccDを高
発現し、ACCase量が増加、そして種子油の蓄積量が増加
する植物体が提供された。
【００４８】
【表１】
【００４９】（形質転換体の表現型）accDプロモーター
がrrn16 の両プロモーターに置き換わった植物体の表現
型を観察した。成長速度、草丈、葉の大きさは野生株、
対照株と同じであったが、葉の老化において違いが見ら
れた（図１１）。成長期（12週齢）の野生株、対照株で
は下部の葉が老化して黄色くなる（図１１、野生株、対
照株の矢印）。accD高発現株は緑色のまま（図１１、ac
cD高発現株の矢印）で、株の葉の老化は７日から１０日
程遅れて始まった。accD高発現株の葉は寿命が延びた。
【００５０】（形質転換植物体の葉緑体の観察）accD高
発現株でACCase量が増加し、また葉の寿命が延びるとい
う現象が見られたので、この葉の葉緑体を電子顕微鏡で
観察した。12週齢の植物体の成熟葉を5%(v/v) グルタル
アルデヒドを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)
で８時間固定後、2%(v/v) 四酸化オスミウム溶液で後固
定した。次いでアセトンシリーズで脱水後、Epon812 樹
脂に包埋した。超薄切片は2%酢酸ウラシルとクエン酸鉛
で染色し、電子顕微鏡で観察した。図１２に野生株にお
ける結果、図１３にaccD高発現株における結果を示す。
accD高発現株の葉の葉緑体では、澱粉粒が小さくなり
（図１３、黒矢印）、多くの油滴（図１３、白矢印）が
観察された。ACCase量の増加により、葉の葉緑体で澱粉
が減少し、油が増加することが分かった。
【００５１】（葉の脂肪酸含量および澱粉含量の分析）
accD高発現株の葉での澱粉の減少、油の増加を確認する
為に、脂肪酸量と澱粉量の化学分析をした。油の主成分
である脂肪酸の量は以下の様に分析した。各株の葉の組
織片（直径 4.8mmの組織片を４枚）に5%塩酸- メタノー
ル250 μl を加え、80℃で1.5 時間処理して脂肪酸をメ
チルエステルにした。反応後、1.5ml の0.9%(w/v) 塩化
ナトリウム、0.5ml のヘキサンを加えてメチル化された
脂肪酸を抽出した。ヘキサン層を回収し、その溶液1 μ
l をガスクロマトグラフィー分析に用いた。機種はGL-3
53（GL Sciences Inc.）、キャピラリーカラムはCP-sil
88（0.25mm×50m ）を用いた。カラム圧160kPa、温度19
0 ℃、時間15分で分析した。
【００５２】澱粉量は以下の様に分析した。各株の葉の
組織片（直径4.8mm の組織片を１枚）を80% エタノール
中で潰し、80℃で１時間加温した。この操作を２回繰り
返した。残さに0.2N水酸化ナトリウム溶液を加え、95℃
で１時間加温後、酢酸で中和し、上清を回収した（澱粉
画分とする）。澱粉画分をα- アミラーゼ（pH5.2 、37
℃、30分間）、アミログルコシダーゼ（pH4.6 、55℃、
１時間）で処理して単糖に分解した。次いで、この単糖
を反応バッファー（100mM イミダゾール、1.5mM 塩化マ
グネシウム、1.1mM ATP 、0.5mM β-NADP+）中、30℃で
グルコース6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキ
ナーゼと反応し、340nm の吸光度を測定し、その数値か
ら澱粉量を算出した。検量線の作成にはグルコース溶液
を用いた。脂肪酸、澱粉量共に４分析（２株から２分
析）し、平均値を出した。
【００５３】タバコの葉において、C16:0 、C18:0 、C1
8:1 、C18:2 、C18:3 の脂肪酸が検出された。検出した
ピークから脂肪酸量を算出し、生重量あたりの脂肪酸含
量を比較した。澱粉量も生重量当たりの含量で比較し
た。対照株の含量は脂肪酸含量：3.9 μg/mg fresh wei
ght （新鮮重量）、澱粉含量：182 μg/mg fresh weigh
t （新鮮重量）であった。これらの値を1.0 とし、相対
値で表した。脂肪酸含量の結果を図１４に、澱粉含量の
結果を図１５に示す。accD高発現株で脂肪酸含量は１割
程増加、澱粉含量は0.7 割程減少した。ACCase量の増加
により、葉において澱粉が減少し、脂肪酸が増加するこ
とを確認した。
【００５４】（種子の脂肪酸含量、澱粉含量の分析）ac
cD高発現株の葉で寿命が延びると、長い間光合成が行わ
れ、貯蔵器官である種子の数の増加が期待される。更
に、ACCase量の増加により種子においても澱粉含量が減
少し、脂肪酸含量が増加する可能性がある。そこで種子
あたりと植物あたりの脂肪酸、澱粉含量を分析した。
【００５５】株ごとに全ての種子を集め、その中から脂
肪酸含量は種子50個を用い、葉と同様の方法で定量し
た。種子において、C16:0 、C18:0 、C18:1 、C18:2 、
C18:3の脂肪酸を検出した。検出したピークから脂肪酸
量を算出した。澱粉量は種子100 個を用い、Starch ass
ay kit (Sigma)の手順に従って定量した。脂肪酸、澱粉
量共に１株につき３分析した。対照株は３株、accD高発
現株A は４株、accD高発現株B は３株分析し、平均値を
出した。
【００５６】対照株の乾燥種子1000個当たりの脂肪酸は
3.8mg 、澱粉は0.4mg であった。これらの値を1.0 とし
て比較した。脂肪酸含量の結果を図１６に、澱粉含量の
結果を図１７に示す。accD高発現株の種子で脂肪酸含量
は４割程増加、澱粉含量は２割程減少した。葉と同様
に、ACCase量の増加により、種子においても澱粉が減少
し、脂肪酸が増加することを確認した。
【００５７】次に植物体当たりの含量を比較した。脂肪
酸含量の結果を図１８に、澱粉含量の結果を図１９に、
分配を検討した結果を図２０に示す。植物体当たりの種
子数の平均は、対照株は5200個（３株の平均）、accD高
発現株A1は13000 個（４株の平均）、A2は9000個（３株
の平均）であった。accD高発現株は種子数が1.7-2.5倍
増加した。この数値から植物体当たりの含量を算出した
ところ、全脂肪酸量は2.3-3.3 倍増加した。全澱粉量も
1.4-1.9 倍増加した。植物体全体で脂肪酸と澱粉の割合
を比較すると、accD高発現株では脂肪酸の比率が大きく
なることを確認した。ACCase量の増加により澱粉と脂肪
酸の分配を変化させ、種子当たりの脂肪酸含量を増加さ
せることに成功した。また、葉の寿命を延ばし、植物体
の種子数を増加させ、最終的に植物体あたりの脂肪酸量
を増加させることにも成功した。種子の脂肪酸は大部分
油として存在するので、油含量が飛躍的に増加した。
【００５８】更に本発明において、accDを高発現してAC
Case量が増加した植物体の作出に成功した。そして、そ
の植物体の葉は寿命が延び、長い間、光合成を行うこと
ができるため、貯蔵器官である種子の数が増加した。ま
た、ACCase量増加により脂肪酸合成が盛んになり、澱粉
の割合が減少した。つまり光合成産物の分配が変化し
た。これらの成果により、植物体当たりの脂肪酸含量を
増加させることに成功した。本発明は、今後の更なる改
良で、より脂肪酸含量を増加させることが可能となると
考えられる。また、作物、園芸植物、観葉植物などに応
用可能な新技術である。
【００５９】
【発明の効果】本発明により、植物において脂肪酸合成
を促進させるための、新規な方法が与えられた。大腸菌
型アセチルCoA カルボキシラーゼaccD遺伝子の上流に、
葉緑体において高発現している遺伝子のプロモーター配
列を葉緑体形質転換法により導入することにより、accD
遺伝子がコードするカルボキシルトランスフェラーゼβ
サブユニット蛋白質の量を増強した。それに伴い、アセ
チルCoA カルボキシラーゼを構成する他のサブユニット
の蛋白質量もまた増加した。アセチルCoA カルボキシラ
ーゼは脂肪酸合成の鍵酵素であるため、本発明の方法に
より脂肪酸合成を促進させることが可能である。本発明
の方法により作製された形質転換植物は顕著な脂肪酸合
成の促進を示した。また葉の寿命が延び、多数の種子を
結実し、植物体の生産力が向上した。
【００６０】
【配列表】 ＜１１０＞出願人氏名：奈良先端科学技術大学院大学長 ＜１２０＞発明の名称：植物において脂肪酸合成を促進させる方法 ＜１６０＞配列の数：１１ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：１８３０ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：N.tabacum cv.Xanthi ＜４００＞配列 CGAATTTGAC ACGACATAGG AGAAGCCGCC CTTTATTAAA AATTATATTA TTTTAAATAA 60 TATAAAGGGG GTTCCAACAT ATTAATATAT AGTGAAGTGT TCCCCCAGAT TCAGAACTTT 120 TTTTCAATAC TCACAATCCT TATTAGTTAA TAATCCTAGT GATTGGATTT CTATGCTTAG 180 TCTGATAGGA AATAAGATAT TCAAATAAAT AATTTTATAG CGAATGACTA TTCATCTATT 240 GTATTTTCAT GCAAATAGGG GGCAAGAAAA CTCTATGGAA AGATGGTGGT TTAATTCGAT 300 GTTGTTTAAG AAGGAGTTCG AACGCAGGTG TGGGCTAAAT AAATCAATGG GCAGTCTTGG 360 TCCTATTGAA AATACCAATG AAGATCCAAA TCGAAAAGTG AAAAACATTC ATAGTTGGAG 420 GAATCGTGAC AATTCTAGTT GCAGTAATGT TGATTATTTA TTCGGCGTTA AAGACATTCG 480 GAATTTCATC TCTGATGACA CTTTTTTAGT TAGTGATAGG AATGGAGACA GTTATTCCAT 540 CTATTTTGAT ATTGAAAATC ATATTTTTGA GATTGACAAC GATCATTCTT TTCTGAGTGA 600 ACTAGAAAGT TCTTTTTATA GTTATCGAAA CTCGAATTAT CGGAATAATG GATTTAGGGG 660 CGAAGATCCC TACTATAATT CTTACATGTA TGATACTCAA TATAGTTGGA ATAATCACAT 720 TAATAGTTGC ATTGATAGTT ATCTTCAGTC TCAAATCTGT ATAGATACTT CCATTATAAG 780 TGGTAGTGAG AATTACGGTG ACAGTTACAT TTATAGGGCC GTTTGTGGTG GTGAAAGTCG 840 AAATAGTAGT GAAAACGAGG GTTCCAGTAG ACGAACTCGC ACGAAGGGCA GTGATTTAAC 900 TATAAGAGAA AGTTCTAATG ATCTCGAGGT AACTCAAAAA TACAGGCATT TGTGGGTTCA 960 ATGCGAAAAT TGTTATGGAT TAAATTATAA GAAATTTTTG AAATCAAAAA TGAATATTTG 1020 TGAACAATGT GGATATCATT TGAAAATGAG TAGTTCAGAT AGAATTGAAC TTTTGATCGA 1080 TCCGGGTACT TGGGATCCTA TGGATGAAGA CATGGTCTCT CTAGATCCCA TTGAATTTCA 1140 TTCGGAGGAG GAGCCTTATA AAGATCGTAT TGATTCTTAT CAAAGAAAGA CAGGATTAAC 1200 CGAGGCTGTT CAAACAGGCA TAGGCCAACT AAACGGCATT CCCGTAGCAA TTGGGGTTAT 1260 GGATTTTCAG TTTATGGGGG GTAGTATGGG ATCCGTAGTC GGAGAGAAAA TCACCCGTTT 1320 GATTGAATAC GCTGCCAATC AAATTTTACC CCTTATTATA GTGTGTGCTT CTGGGGGGGC 1380 GCGCATGCAG GAAGGAAGTT TGAGCTTGAT GCAAATGGCT AAAATATCGT CTGCTTTATA 1440 TGATTATCAA TTAAATAAAA AGTTATTTTA TGTATCAATC CTTACATCTC CGACAACTGG 1500 TGGAGTGACA GCTAGTTTTG GTATGTTGGG GGATATCATT ATTGCCGAAC CCAACGCCTA 1560 CATTGCATTT GCAGGTAAAA GAGTAATTGA ACAAACATTG AATAAAACAG TACCCGAAGG 1620 TTCACAAGCA GCTGAATACT TATTCCAGAA GGGTTTATTC GACCTAATTG TACCACGTAA 1680 TCTTTTAAAA AGCGTTCTGA GTGAGTTATT TAAGCTCCAC GCCTTTTTTC CTTTGAATCA 1740 AAAGTCAAGC AAAATCAAGT AGAGCACTAA GTTCAATTAT TTTATTTGTG TTTGTAGCAA 1800 AAAAGTAGTT AGTTTGTCGG AATCAAAGTA 1830 ＜２１０＞配列番号：２ ＜２１１＞配列の長さ：２１５０ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：N.tabacum cv.Xanthi ＜４００＞配列 GTCGAGTAGA CCTTGTTGTT GTGAGAATTC TTAATTCATG AGTTGTAGGG AGGGATTTAT 60 GTCACCACAA ACAGAGACTA AAGCAAGTGT TGGATTCAAA GCTGGTGTTA AAGAGTACAA 120 ATTGACTTAT TATACTCCTG AGTACCAAAC CAAGGATACT GATATATTGG CAGCATTCCG 180 AGTAACTCCT CAACCTGGAG TTCCACCTGA AGAAGCAGGG GCCGCGGTAG CTGCCGAATC 240 TTCTACTGGT ACATGGACAA CTGTATGGAC CGATGGACTT ACCAGCCTTG ATCGTTACAA 300 AGGGCGATGC TACCGCATCG AGCGTGTTGT TGGAGAAAAA GATCAATATA TTGCTTATGT 360 AGCTTACCCT TTAGACCTTT TTGAAGAAGG TTCTGTTACC AACATGTTTA CTTCCATTGT 420 AGGTAACGTA TTTGGGTTCA AAGCCCTGCG CGCTCTACGT CTGGAAGATC TGCGAATCCC 480 TCCTGCTTAT GTTAAAACTT TCCAAGGTCC GCCTCATGGG ATCCAAGTTG AAAGAGATAA 540 ATTGAACAAG TATGGTCGTC CCCTGTTGGG ATGTACTATT AAACCTAAAT TGGGGTTATC 600 TGCTAAAAAC TACGGTAGAG CTGTTTATGA ATGTCTTCGC GGTGGACTTG ATTTTACCAA 660 AGATGATGAG AACGTGAACT CACAACCATT TATGCGTTGG AGAGATCGTT TCTTATTTTG 720 TGCCGAAGCA CTTTATAAAG CACAGGCTGA AACAGGTGAA ATCAAAGGGC ATTACTTGAA 780 TGCTACTGCA GGTACATGCG AAGAAATGAT CAAAAGAGCT GTATTTGCTA GAGAATTGGG 840 CGTTCCGATC GTAATGCATG ACTACTTAAC GGGGGGATTC ACCGCAAATA CTAGCTTGGC 900 TCATTATTGC CGAGATAATG GTCTACTTCT TCACATCCAC CGTGCAATGC ATGCGGTTAT 960 TGATAGACAG AAGAATCATG GTATCCACTT CCGGGTATTA GCAAAAGCGT TACGTATGTC 1020 TGGTGGAGAT CATATTCACT CTGGTACCGT AGTAGGTAAA CTTGAAGGTG AAAGAGACAT 1080 AACTTTGGGC TTTGTTGATT TACTGCGTGA TGATTTTGTT GAACAAGATC GAAGTCGCGG 1140 TATTTATTTC ACTCAAGATT GGGTCTCTTT ACCAGGTGTT CTACCCGTGG CTTCAGGAGG 1200 TATTCACGTT TGGCATATGC CTGCTCTGAC CGAGATCTTT GGGGATGATT CCGTACTACA 1260 GTTCGGTGGA GGAACTTTAG GACATCCTTG GGGTAATGCG CCAGGTGCCG TAGCTAATCG 1320 AGTAGCTCTA GAAGCATGTG TAAAAGCTCG TAATGAAGGA CGTGATCTTG CTCAGGAAGG 1380 TAATGAAATT ATTCGCGAGG CTTGCAAATG GAGCCCGGAA CTAGCTGCTG CTTGTGAAGT 1440 ATGGAAAGAG ATCGTATTTA ATTTTGCAGC AGTGGACGTT TTGGATAAGT AAAAACAGTA 1500 GACATTAGCA GATAAATTAG CAGGAAATAA AGAAGGATAA GGAGAAAGAA CTCAAGTAAT 1560 TATCCTTCGT TCTCTTAATT GAATTGCAAT TAAACTCGGC CCAATCTTTT ACTAAAAGGA 1620 TTGAGCCGAA TACAACAAAG ATTCTATTGC ATATATTTTG ACTAAGTATA TACTTACCTA 1680 GATATACAAG ATTTGAAATA CAAAATCTAG AAAACTAAAT CAAAATCTAA GACTCAAATC 1740 TTTCTATTGT TGTCTTGGAT CCACAATTAA TCCTACGGAT CCTTAGGATT GGTATATTCT 1800 TTTCTATCCT GTAGTTTGTA GTTTCCCTGA ATCAAGCCAA GTATCACACC TCTTTCTACC 1860 CATCCTGTAT ATTGTCCCCT TTGTTCCGTG TTGAAATAGA ACCTTAATTT ATTACTTATT 1920 TTTTTATTAA ATTTTAGATT TGTTAGTGAT TAGATATTAG TATTAGACGA GATTTTACGA 1980 AACAATTATT TTTTTATTTC TTTATAGGAG AGGACAAATC TCTTTTTTCG ATGCGAATTT 2040 GACACGACAT AGGAGAAGCC GCCCTTTATT AAAAATTATA TTATTTTAAA TAATATAAAG 2100 GGGGTTCCAA CATATTAATA TATAGTGAAG TGTTCCCCCA GATTCAGAAC 2150 ＜２１０＞配列番号：３ ＜２１１＞配列の長さ：２２０ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：N.tabacum cv.Xanthi ＜４００＞配列 GCCCAATGTG AGTTTTTCTA GTTGGATTTG CTCCCCCGCC GTCGTTCAAT GAGAATGGAT 60 AAGAGGCTCG TGGGATTGAC GTGAGGGGGC AGGGATGGCT ATATTTCTGG GAGCGAACTC 120 CGGGCGAATA TGAAGCGCAT GGATACAAGT TATGCCTTGG AATGAAAGAC AATTCCGAAT 180 CCGCTTTGTC TACGAACAAG GAAGCTATAA GTAATGCAAC 220 ＜２１０＞配列番号：４ ＜２１１＞配列の長さ：２５ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 GTCGAGTAGA CCTTGTTGTT GTGAG ＜２１０＞配列番号：５ ＜２１１＞配列の長さ：３２ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 CCCGGGCGGC CGCGGAACCC CCTTTATATT AT ＜２１０＞配列番号：６ ＜２１１＞配列の長さ：３２ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 CCGCGGCCGC CCGGGGTCTG ATAGGAAATA AG ＜２１０＞配列番号：７ ＜２１１＞配列の長さ：２５ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 GTCGACGTGC TCTACTTGAT TTTGC ＜２１０＞配列番号：８ ＜２１１＞配列の長さ：２４ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 GTCGACGCTC CCCCGCCGTC GTTC ＜２１０＞配列番号：９ ＜２１１＞配列の長さ：２７ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 GGTACCCGGG ATTCGGAATT GTCTTTC ＜２１０＞配列番号：１０ ＜２１１＞配列の長さ：２５ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 GTCGACAACA TATTAATATA TAGTG ＜２１０＞配列番号：１１ ＜２１１＞配列の長さ：２５ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：人工的な配列 ＜４００＞配列 GTCGACGTGC TCTACTTGAT TTTGC
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、大腸菌型アセチルCoA カルボキシラ
ーゼと動物型アセチルCoA カルボキシラーゼの構造を示
す、模式図である。
【図２】 図２は、accDの構造遺伝子領域及び５’上流
領域配列を示す図である。
【図３】 図３は、rbcLの構造遺伝子領域及び３’下流
領域配列を示す図である。
【図４】 図４は、rrn16 プロモーター配列を示す図で
ある。
【図５】 図５は、accD高発現株の作成に使用する、ac
cDプロモーター改変用コンストラクトの構造を示す、模
式図である。
【図６】 図６は、対照株の作成に使用する、コントロ
ール用コンストラクトの構造を示す、模式図である。
【図７】 図７は、ゲノミックサザンブロット解析によ
り、accD遺伝子の導入の検討を行った写真である。
【図８】 図８は、ゲノミックサザンブロット解析によ
り、aadA遺伝子の導入の検討を行った写真である。
【図９】 図９は、ノザンブロット解析により、accD遺
伝子の発現の検討を行った写真である。
【図１０】 図１０は、ウエスタンブロット解析によ
り、アセチルCoA カルボキシラーゼの各サブユニットの
発現の検討を行った写真である。
【図１１】 図１１は、形質転換植物体の表現型を示
す、12週齢の植物体の写真である。
【図１２】 図１２は、野生株の葉緑体における澱粉粒
と油滴の分布を示す、電子顕微鏡写真である。
【図１３】 図１３は、accD高発現株の葉緑体における
澱粉粒と油滴の分布を示す、電子顕微鏡写真である。
【図１４】 図１４は、葉において脂肪酸含量の分析を
行った結果のグラフである。
【図１５】 図１５は、葉において澱粉含量の分析を行
った結果のグラフである。
【図１６】 図１６は、種子において脂肪酸含量の分析
を行った結果のグラフである。
【図１７】 図１７は、種子において澱粉含量の分析を
行った結果のグラフである。
【図１８】 図１８は、植物体あたり（全種子）の脂肪
酸含量を示すグラフである。
【図１９】 図１９は、植物体あたり（全種子）の澱粉
含量を示すグラフである。
【図２０】 図２０は、脂肪酸と澱粉の分配を、全脂肪
酸含量と全澱粉含量の比率で示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD09 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD21 4B024 AA08 AA17 BA80 CA01 DA01 EA01 FA02 GA11 HA01 HA20

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 大腸菌型アセチルCoA カルボキシラーゼ
    のaccD遺伝子の発現量を増加させることにより、植物に
    おいて脂肪酸合成を促進させる方法。
  2. 【請求項２】 前記accD遺伝子、葉緑体において高発現
    している遺伝子のプロモーター配列、及び葉緑体ゲノム
    での相同組み換えを可能にする相同配列の３種類のDNA
    をプラスミドに導入したコンストラクトを作製し、当該
    コンストラクトにより植物の葉緑体を形質転換すること
    により、前記accD遺伝子の発現量を増加させることを特
    徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記葉緑体ゲノムでの相同組み換えを可
    能にする相同配列が配列表の配列番号２記載のRubisco
    large subunit 遺伝子とその3'下流配列からなる配列で
    あり、前記葉緑体において高発現している遺伝子のプロ
    モーター配列が配列表の配列番号３記載のribosomal RN
    A operon 16 プロモーター配列である、請求項２記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 前記accD遺伝子の発現量を増加させる事
    により、当該遺伝子によりコードされるカルボキシルト
    ランスフェラーゼ（CT）βサブユニットの蛋白質量を増
    加し、同時に大腸菌型アセチルCoA カルボキシラーゼを
    構成する他のサブユニットの蛋白質量もまた増加する事
    を特徴とする、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記大腸菌型アセチルCoA カルボキシラ
    ーゼを構成する他のサブユニットが、ビオチンカルボキ
    シラーゼ（BC）蛋白質、ビオチンカルボキシル担体蛋白
    質（BCCP）及びカルボキシルトランスフェラーゼ（CT）
    αサブユニット蛋白質である、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 請求項１ないし請求項５記載の方法によ
    り、植物において脂肪酸合成を促進させた、形質転換植
    物。
  7. 【請求項７】 大腸菌型アセチルCoA カルボキシラーゼ
    のaccD遺伝子、葉緑体において高発現している遺伝子の
    プロモーター配列、及び葉緑体ゲノムでの相同組み換え
    を可能にする相同配列の３種類のDNA を含むコンストラ
    クトにより、植物において葉緑体の形質転換を行った、
    形質転換植物。
  8. 【請求項８】 前記葉緑体ゲノムでの相同組み換えを可
    能にする相同配列が配列表の配列番号２記載のRubisco
    large subunit 遺伝子とその3'下流配列からなる配列で
    あり、前記葉緑体において高発現している遺伝子のプロ
    モーター配列が配列表の配列番号３記載のribosomal RN
    A operon 16 プロモーター配列である、請求項７記載の
    形質転換植物。
  9. 【請求項９】 対照株植物と比較して葉における脂肪酸
    含量が増加し、かつ澱粉含量が減少している事を特徴と
    する、請求項７記載の形質転換植物。
  10. 【請求項１０】 対照株植物と比較して植物体の葉の寿
    命が延びていることを特徴とする、請求項７記載の形質
    転換植物。
  11. 【請求項１１】 対照株植物と比較して種子あたりの脂
    肪酸含量が増加し、かつ澱粉含量が減少していることを
    特徴とする、請求項７記載の形質転換植物。
  12. 【請求項１２】 対照株植物と比較して植物体あたりの
    種子数が増加し、その結果植物体あたりの全脂肪酸含量
    が対照株植物と比較して増加している事を特徴とする、
    請求項７記載の形質転換植物。
  13. 【請求項１３】 対照株植物と比較して種子における脂
    肪酸と澱粉の比率が改善されていることを特徴とする、
    請求項７記載の形質転換植物。
  14. 【請求項１４】 前記植物がタバコである、請求項７記
    載の形質転換植物。
  15. 【請求項１５】 請求項６ないし請求項１４記載の形質
    転換植物より得られた、種子。
  16. 【請求項１６】 前記accD遺伝子、葉緑体において高発
    現している遺伝子のプロモーター配列、及び葉緑体ゲノ
    ムでの相同組み換えを可能にする相同配列の３種類のDN
    A をプラスミドに導入した、コンストラクト。
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