KR100515123B1 - 식물 지방산 합성효소 및 중쇄 지방산을 생성하기 위한 개선된 방법에서의 용도 - Google Patents

식물 지방산 합성효소 및 중쇄 지방산을 생성하기 위한 개선된 방법에서의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR100515123B1
KR100515123B1 KR10-1999-7009358A KR19997009358A KR100515123B1 KR 100515123 B1 KR100515123 B1 KR 100515123B1 KR 19997009358 A KR19997009358 A KR 19997009358A KR 100515123 B1 KR100515123 B1 KR 100515123B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
heavy chain
plant
kas
fatty acid
Prior art date
Application number
KR10-1999-7009358A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010006274A (ko
Inventor
카타윤 데헤쉬
Original Assignee
칼진 엘엘시
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 칼진 엘엘시 filed Critical 칼진 엘엘시
Publication of KR20010006274A publication Critical patent/KR20010006274A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100515123B1 publication Critical patent/KR100515123B1/ko

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/1025Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C11ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11BPRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00Production of fats or fatty oils from raw materials
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)

Abstract

본 발명은 쿠피아 종으로부터 수득할 수 있는 특히 중요한 β-케토아실-ACP 합성효소에 관한 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 합성효소 단백질 인자에 대한 아미노산과 핵산 뿐만 아니라, 이러한 서열을, 개질된 지방산 조성물을 갖는 유전공학처리된 식물을 생성하기 위한 구성물에 사용하는 방법이 제공된다. 본 발명에서 특히 중요한 것은, 형질전환된 식물 종자의 오일 중의 중쇄 지방산의 수준을 증가시키고/거나 중쇄 지방산의 비를 변화시키기 위해, 식물 중쇄 아실-ACP 티오에스테라제의 발현과 함께 합성효소 단백질 인자를 발현시키는 것이다.

Description

식물 지방산 합성효소 및 중쇄 지방산을 생성하기 위한 개선된 방법에서의 용도 {PLANT FATTY ACID SYNTHASES AND USE IN IMPROVED METHODS FOR PRODUCTION OF MEDIUM-CHAIN FATTY ACIDS}
본 발명은 식물의 지방산 합성에 관련된 식물 지방산 합성효소를 코드화하는 유전자 및 이러한 유전자를 식물 중쇄 선택성 티오에스테라제 단백질을 코드화하는 유전자와 함께 사용하는 방법에 관한 것이다. 이렇게 사용함으로써, 형질전환된 식물의 종자유에서 생성될 수 있는 중쇄 지방산의 수준을 증가시키는 방법이 제공된다.
고등 식물은 공통적인 대사 경로를 통해 지방산을 합성한다. 트리글리세리드에 부착된 지방산이 추가 발아를 위한 에너지원으로서 저장되어 있는 발육중인 종자의 경우, 지방산 합성 경로는 색소체에 위치한다. 첫 번째 단계는, 단쇄 선택성 축합 효소인 β-케토아실-ACP 합성효소 (KAS) III에 의해 촉매되는, 아세틸-CoA와 ACP로부터의 아세틸-ACP (아실 담체 단백질)의 형성이다. 아세틸-ACP는 하기 반응 순서의 순환 작용을 포함하여 C16와 C18 지방산으로 연장된다: 말로닐-ACP로부터의 2탄소 단위와 축합되어, 긴 β-케토아실-ACP (β-케토아실-ACP 합성효소)를 형성하고; 케토 작용기가 알코올로 환원되고 (β-케토아실-ACP 환원효소); 탈수되어, 에노일-ACP를 형성하고 (β-히드록시아실-ACP 탈수효소); 최종적으로 에노일-ACP가 환원되어, 연장된 포화 아실-ACP를 형성한다 (에노일-ACP 환원효소). β-케토아실-ACP 합성효소 I (KAS I)은 팔미토일-ACP (C16:0)까지의 연장을 주로 초래하는 반면에, β-케토아실-ACP 합성효소 II (KAS II)는 스테아로일-ACP (C18:0)로의 최종 연장을 주로 초래한다.
β-케토아실-ACP 합성효소 I과 II의 펩타이드 성분을 코드화하는 유전자는 아주까리 (Ricinus communis) 및 브라시카(Brassica) 종을 포함하는 다수의 고등 식물종으로부터 클로닝되어 왔다 (USPN 5,510,255). KAS I 활성은 대략적인 분자량이 50kD인 하나의 합성효소 단백질 인자 (합성효소 인자 B)와 관련이 있고, KAS II 활성은 두 합성효소 단백질 인자, 즉, 50kD 합성효소 인자 B와 46kd 단백질로 표시되는 합성효소 인자 A의 조합체와 관련이 있었다. KAS III 단백질을 코드화하는 식물 유전자의 클로닝 및 서열은 타이(Tai)와 자보르스키(Jaworski)의 문헌[Plant Physiol. (1993) 103:1361-1367]에 기재되어 있다.
식물 지방산 합성효소 활성을 갖는 최종 생성물은 C16와 C18 지방산인 것이 일반적이다. 그러나, 다량의 C8와 C14 (중쇄) 지방산이 유지종자(oilseed)에 저장되어 있는 수 가지 식물종이 존재한다. 라우르산이 풍부한 (12:0) 종자유를 생성하는 식물인 움벨룰라리아 캘리포니카 (Umbellularia californica) (캘리포니아 만)에 대한 최근 연구에 의해, 종자 색소체에 아실-ACP 티오에스테라제의 중쇄 특이적 이소자임이 존재함이 입증되었다. 움벨룰라리아 캘리포니카로부터의 12:0 ACP 티오에스테라제가 추가 정제됨으로써, 아라비돕시스 (Arabidopsis)와 브라시카의 종자에서 발현되어, 이들 형질전환된 종자의 트리글리세리드 풀(pool)에 라우르산을 현저히 축적시키는 티오에스테라제 cDNA가 클로닝되었다 (USPN 5,512,482). 이들 결과 및 그 밖의 식물종으로부터의 중쇄 티오에스테라제에 대한 후속 실험에 의해, 새로운 지방산 생합성 도중에 아실-ACP 티오에스테라제가 쇄 길이를 결정한다는 것이 확인되었다 [참조: T. Voelker (1996) Genetic Engineering, Ed. J. K. Setlow, Vol. 18, pgs. 111-133].
도 1은 쿠피아 후커리아나 (Cuphea hookeriana) KAS 인자 B 클론 chKAS B-2의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 B 클론 chKAS B-31-7의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 3은 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 A 클론 chKAS A-2-7의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 4는 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 A 클론 chKAS A-1-6의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 5는 쿠피아 풀체리마 (Cuphea pullcherrima) KAS 인자 B 클론 cpuKAS B/7-8의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 6은 쿠피아 풀체리마 KAS 인자 B 클론 cpuKAS B/8-7A의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 7은 쿠피아 풀체리마 KAS 인자 A 클론 cpuKAS A/p7-6A의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 8은 쿠피아 풀체리마 KAS 인자 A 클론 cpuKAS A/p8-9A의 임시적 DNA 서열을 도시한다.
도 9는 쿠피아 후커리아나 KASIII 클론 chKASIII-27의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도시한다.
도 10은 다양한 아실-ACP 기질을 사용하여 작성된 정제된 cpuKAS B/8-7A에 대한 활성 프로파일을 도시한다.
도 11은 다양한 아실-ACP 기질을 사용하여 작성된 정제된 chKAS A-2-7과 chKAS A-1-6에 대한 활성 프로파일을 도시한다.
도 12는 다양한 아실-ACP 기질을 사용하여 작성된 아주까리 KAS 인자 A에 대한 활성 프로파일을 도시한다.
도 13는 다양한 아실-ACP 기질을 사용하여 작성된 아주까리 KAS 인자 B에 대한 활성 프로파일을 도시한다.
도 14는 CpFatB1을 함유하는 형질전환된 식물 대 CpFatB1 + chKAS A-2-7을 함유하는 형질전환된 식물에 대한 C8:0 함량에 따라 배열된 식물의 수를 도시하는 그래프이다.
도 15는 ChFatB2를 함유하는 형질전환된 식물 (4804-22-357)과, 4804-22-357과 5401-9의 교배로 수득한 식물 (chKAS A-2-7 식물)에서의 %C10/%C8 비를 도시하는 그래프이다.
도 16은 ChFatB2를 함유하는 형질전환된 식물 (4804-22-357)과, 4804-22-357과 5401-9의 교배로 수득한 식물 (chKAS A-2-7 식물)에서의 %C10 + %C8 함량을 도시하는 그래프이다.
도 17은 ChFatB2를 함유하는 형질전환된 식물 (4804-22-357)과, 4804-22-357과 5413-17의 교배로 수득한 식물 (chKAS A-2-7 + CpFatB1 식물)에서의 %C10/%C8 비를 도시하는 그래프이다.
도 18은 ChFatB2를 함유하는 형질전환된 식물 (4804-22-357)과, 4804-22-357과 5413-17의 교배로 수득한 식물 (chKAS A-2-7 + CpFatB1 식물)에서의 %C10 + %C8 함량을 도시하는 그래프이다.
도 19는 Uc FatB1을 함유하는 형질전환된 식물 (LA86DH186)과, 야생형 (X WT) 및 Ch KAS A-2-7을 발현시키는 계열과의 교배로 수득한 식물에서의 %C12:0을 도시하는 그래프이다.
도 20은 Uc FatB1을 함유하는 형질전환된 식물 (LA86DH186)의 종자와, 야생형 (X WT) 및 Ch KAS A-2-7을 발현시키는 계열과의 교배로 수득한 식물에서의 C12:0 및 C14:0 지방산의 상대적 비율을 도시하는 그래프이다.
도 21은 Garm FatB1을 함유하는 형질전환된 식물 (5266)과, 야생형 (X WT) 및 Ch KAS A-2-7을 발현시키는 계열과의 교배로 수득한 식물의 종자에서의 %C18:0을 도시하는 그래프이다.
도 22는 Ch KAS A-2-7을 함유하는 형질전환된 식물로부터의 단백질 추출물에서의 Ch KAS A의 활성 프로파일을 도시한다. 지시된 농도의 세룰레닌을 이용하여 추출물을 사전 처리하였다.
발명의 요약
본 발명은 β-케토아실-ACP 합성효소 (KAS)에 관한 조성물 및 사용 방법을 제공한다. 또한 중요한 것은, 생물학적 활성 식물 합성효소(들)에 관한 아미노산과 핵산 서열의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
특히, 쿠피아 종으로부터의 KAS 단백질 인자 A와 B를 코드화하는 유전자가 제공된다. KAS 유전자는 다수의 분야에 사용되는 관심있는 유전자로서, 대장균과 같은 세균 세포 및 식물 세포를 포함하여, 형질전환된 숙주 세포에 합성효소 I 및/또는 합성효소 II 활성을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 합성효소 활성은 긴 아실-ACP와 짧은 아실-ACP에 대한 선택적 활성 뿐만 아니라 KAS 특이적 억제물질인 세룰레닌에 대한 감응성에 의해 구별된다. 중쇄 길이의 아실-ACP에 대해 선택적 활성을 갖는 합성효소 단백질 제제는 합성효소 I 타입 또는 KAS I 이다. KAS I 클래스는 1μM의 저농도로 존재하는 세룰레닌에 의한 억제에 대해 민감하다. 장쇄 길이의 아실-ACP에 대해 선택적 활성을 갖는 합성효소는 합성효소 II 타입 또는 KAS II 이다. II 타입의 KAS 효소는 또한 세룰레닌에 대해 민감하지만, 고농도 (50μM)에서만 민감하다. 합성효소 III 타입 효소는 단쇄 길이의 아실-ACP에 대해 선택적 활성을 가지며, 세룰레닌 억제에 대해 비감응성이다.
합성효소 단백질을 코드화하는 핵산 서열은, 핵산 구성물(construct)에 사용되어, 숙주 세포내에 존재하는 활성 합성효소의 양, 특히, 숙주 세포가 식물 숙주 세포인 경우에는 합성효소 I 타입, 합성효소 II 타입 및 합성효소 III 타입 활성의 상대적인 양을 조절할 수 있다. 또한, 핵산 구성물은 식물 세포 중에서의 내인성 합성효소의 발현을 감소시키도록 고안될 수 있다. 일례로는, 안티센스 합성효소 서열을, 효소를 정상적으로 생성시키는 적어도 식물 세포에서 발현시킬 수 있는 프로모터의 조절하에 사용하는 것이 있다.
본 발명에서 특히 중요한 것은, 합성효소 단백질을 티오에스테라제 단백질과 대등 발현시키는 데에 있다. 예를 들어, 합성효소 인자 A와 중쇄 티오에스테라제를 대등 발현시키면 형질전환된 식물 종자로부터 수득될 수 있는 중쇄 지방산의 수준을 증가시키는 방법이 제공된다. 또한, 합성효소 인자 A 유전자를 식물 중쇄 티오에스테라제 단백질과 대등 발현시키면, 형질전환된 식물에서 생성된 다양한 중쇄 지방산의 비를 변형시킬 수 있는 방법이 제공된다. 예를 들어, 합성효소 인자 A를 발현시킴으로써, C8 및 C10 지방산에 대한 활성을 갖는 티오에스테라제의 발현의 결과로서 식물 종자유에서 생성되는 C10/C8 지방산의 비를 증가시킬 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 식물 합성효소 인자 단백질은 식물 숙주 세포 중의 C2 내지 C16의 쇄 길이를 갖는 아실-ACP와 말로닐-ACP 사이의 축합 반응의 촉매작용에 필요한 아미노산 또는 폴리펩타이드의 서열을 포함한다. 특정 식물 합성효소 인자 단백질은 식물 숙주 세포에서 합성효소 반응을 촉매할 수 있거나 (예를 들어, 단량체 또는 동종이량체로서), 식물 숙주 세포에서 합성효소 반응을 촉매할 수 있는 다중 펩타이드 효소의 한 성분, 예를 들어 이종이량체의 1개의 펩타이드일 수 있다.
합성효소 I (KAS I)은 짧은 탄소 사슬인 C2-C14를 갖는 아실-ACP에 대해 선택적 활성을 나타내며, 1μM 농도의 세룰레닌에 의한 억제에 대해 민감하다. 합성효소 II (KAS II)는 긴 탄소 사슬인 C14-C16를 갖는 아실-ACP에 대해 선택적 활성을 나타내며, 세룰레닌의 농도 (50μM)에 의해 억제된다. 합성효소 III는 매우 짧은 탄소 사슬인 C2 내지 C6을 갖는 아실-CoA에 대해 선택적 활성을 나타내며, 세룰레닌에 의한 억제에 대해 비감응성이다.
중쇄 지방산을 생성시키는 쿠피아 속의 식물 종으로부터 수득된 합성효소 인자 A와 B, 및 합성효소 III 단백질을 본원에 기술하였다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 쿠피아 후커리아나로부터의 합성효소 A는 본래 고수준으로 발현되며, 종자에서만 발현된다. 쿠피아 후커리아나 합성효소 B는 조사된 모든 조직에서 저수준으로 발현된다. 대장균에서의 합성효소 A와 합성효소 B의 발현, 및 생성된 단백질의 정제 과정을 이용하여 다양한 합성효소 인자의 활성을 결정한다. 이들 분석의 결과, 쿠피아 후커리아나로부터의 합성효소 인자 A는 6:0-ACP 기질에 대해 최대 활성을 갖는 반면에, 쿠피아 풀체리마로부터의 합성효소 인자 B는 14:0-ACP에 대해 최대 활성을 갖는 것으로 나타났다. 아주까리로부터의 합성효소 인자 A와 B를 사용한 유사 실험의 결과, 쿠피아와 아주까리로부터의 인자 B 합성효소 단백질 사이에 유사한 활성 프로파일이 나타났다. 그러나, 아주까리로부터의 합성효소 A 클론은 14:0-ACP 기질에 대해 선택성을 나타낸다.
중쇄 지방산을 정상적으로 생성시키지 않는 형질전환된 식물 종자에서 쿠피아 후커리아나 KAS A 단백질을 발현시키면, 이러한 종자에서 생성된 지방산 타입과 함량의 검출가능한 변화는 나타나지 않는다. 그러나, 쿠피아 후커리아나 KAS A 단백질을, 식물 종자유에 C8 및 C10 지방산을 생성시킬 수 있는 중쇄 아실-ACP 티오에스테라제의 발현과 함께 발현시킨 결과, 중쇄 지방산의 수준이 중쇄 티오에스테라제만이 발현되는 경우에 수득될 수 있는 수준 보다 증가함이 관찰된다. 또한, 상당량의 C8 및 C10 지방산이 중쇄 티오에스테라제 발현의 결과로서 생성되는 경우, 쿠피아 KAS A 단백질이 동시 발현되면, 수득되는 C8 및 C10 지방산의 비율이 또한 변한다. 예를 들어, C10 지방산의 비율 증가는 쿠피아 후커리아나 ChFatB2 티오에스테라제와 chKAS A 합성효소 인자 단백질의 동시 발현에 의해 수득될 수 있다.
또한, 쿠피아 후커리아나 KAS A 단백질이 식물 종자유에 C12 지방산을 생성시킬 수 있는 중쇄 아실-ACP 티오에스테라제의 발현과 함께 발현되는 경우에, 중쇄 지방산의 수준이 중쇄 티오에스테라제만이 발현되는 경우에 수득될 수 있는 수준 보다 증가함이 또한 관찰된다. 또한, 상당량의 C12와 C14 지방산이 중쇄 티오에스테라제 발현의 결과로서 생성되는 경우에, 쿠피아 KAS A 단백질이 동시 발현되면, 수득되는 C12 및 C14 지방산의 비율이 또한 변한다. 예를 들어, C12 지방산의 비율 증가는 Uc FatB1 티오에스테라제와 chKAS A 합성효소 인자 단백질의 동시 발현에 의해 수득될 수 있다.
그러나, 쿠피아 후커리아나 KAS A 단백질이, 식물 종자유에 C18과 C18:1 지방산을 생성킬 수 있는 장쇄 아실-ACP 티오에스테라제의 발현과 함께 발현되는 경우에는, 장쇄 지방산의 생성에 대한 효과가 관찰되지 않았다. 또한, C18:0과 C18:1 지방족 아실-ACP를 우선적으로 가수분해시키는, 망고스틴으로부터의 장쇄 아실-ACP 티오에스테라제 (GarmFatA1, U.S. Patent Application No. 08/440,845)를 발현시키도록 형질전환된 식물을 형질전환되지 않은 대조 식물과 교배시킨 경우에, C18:0의 수준의 현저한 감소가 수득된다. 유사한 감소는, GarmFatA1을 발현시키도록 형질전환된 식물과 쿠피아 후커리아나 KAS A 단백질을 발현시키는 식물의 교배로 수득된 식물의 종자 중의 C18:0의 수준에서도 관찰된다.
따라서, 본 발명은 중쇄 아실-ACP 티오에스테라제를 합성효소 인자 단백질과 동시 발현시킴으로써 형질전환된 식물 종자유 중의 중쇄 지방산 조성을 증가시키고/거나 변화시키는 방법을 제공한다. 또한, 합성효소 인자와 중쇄 티오에스테라제의 다양한 조합은 원하는 특정 지방산에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, C14 지방산의 생성을 증가시키기 위해, 합성효소 단백질 인자는 예를 들어, 쿠피아 팔루스트리스 (Cuphea palustris)로부터의 C14 티오에스테라제와 조합된 형태로 발현될 수 있거나, 육두구(nutmeg)가 사용될 수 있다 (WO 96/23892). 또한, 티오에스테라제 발현은 중쇄 지방산 조성에 대한 추가 효과를 위한 다수의 상이한 합성효소 인자 단백질과 조합될 수 있다.
본 발명에 사용되는 합성효소는 변형된 아미노산 서열, 예를 들어 변이, 절단, 증가 등이 일어난 서열 뿐만 아니라 부분 또는 전체적으로 인공 합성된 이러한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 합성효소 단백질 코드화 서열은 추가 스크리닝을 위한 프로브로 사용되거나, 숙주 세포, 특히, 식물 숙주 세포에서의 전사 또는 전사와 번역을 위한 유전공학처리된 구성물에 사용될 수 있다. 당업자라면 항체 제제, 핵산 프로브 (DNA 및 RNA) 등이 그 밖의 공급원으로부터의 합성효소 및/또는 합성효소 핵산 서열을 스크리닝하고 회수하기 위해 제조되고 사용될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 전형적으로, 상동성 관련된 핵산 서열은, 존재할 수 있는 임의의 결실을 제외하고는, 알. 코뮤니스 (R. communis) 합성효소와 주어진 목적 식물 합성효소 사이에서, 약 60% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 상동성을 나타낼 것이다. 상동성은 서열 정보, 핵산 또는 아미노산의 비교, 또는 하이브리드화 반응을 통해 결정된다.
합성효소 단백질 인자를 코드화하는 핵산 서열 또는 합성효소 단백질 인자와 중쇄 아실-ACP 티오에스테라제를 코드화하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 구성물은 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 구성물은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 합성효소를 생성시키기 위해 고안될 수 있다. 특히 중쇄 티오에스테라제의 발현과 관련된 식물 세포에서의 합성효소의 발현 증가, 또는 식물 세포에서 관찰된 내인성 합성효소의 양의 감소가 특히 중요하다.
합성효소 단백질 인자를 단독으로 또는 조합된 형태로 사용하여, 원하는 결과에 좌우되는 지방산 합성의 연장 축합 반응을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 속도에 영향을 주는 합성효소 활성은 합성효소 I 타입, 합성효소 II 타입, 합성효소 III 타입 또는 이들 효소의 배합물에 존재할 수 있다. 또한, 합성효소 활성은 본원에 기술된 다양한 합성효소 인자의 조합에 좌우될 수 있다.
목적 핵산 서열을 숙주 세포에서 전사시키고 번역시키는 요소를 함유하는 구성물은 "발현 카세트" 이다. 숙주에 따라, 조절 영역은, 바이러스로부터의 구조 유전자, 플라스미드 또는 염색체 유전자 등으로부터의 영역을 포함하여 다양할 것이다. 원핵 또는 진핵 미생물, 특히, 단세포 숙주에서의 발현을 위해서는, 광범한 구성 또는 조절성 프로모터가 사용될 수 있다. 기술되어 온 전사 개시 영역 중에서, β-갈락토시다제, T7 중합효소, trp-lac (tac), trp E 등과 같은 유전자를 포함하는, 박테리아 및 효모 숙주, 예를 들어 대장균, 바실러스 서브틸리스, 사카로마이시스 세레비시아로부터의 영역이 있다.
식물 세포에서 합성효소의 발현을 위한 발현 카세트는, 5′에서 3′의 전사 방향으로, 식물 세포에서 작용성인 전사 및 번역 개시 조절 영역 ("프로모터"로서 또한 알려져 있음), 합성효소를 코드화하는 핵산 서열 및 전사 종결 영역을 포함할 것이다. 탈포화효소 구조 유전자의 광범한 구성 또는 조절성 전사, 예를 들어 유도성 전사를 제공하는 다수의 전사 개시 영역이 사용될 수 있다. 식물에 대해 사용되는 전사 개시 영역으로는, 콜리플라워 모자이크 바이러스와 관련된 영역 (35S, 19S), 및 구조 유전자, 예를 들어 노팔린(nopaline) 합성효소 또는 만노핀(mannopine) 합성효소 또는 나핀(napin)과 ACP 프로모터 등에 대한 구조 유전자가 있다. 이러한 구조 유전자에 상응하는 전사/번역 개시 영역은 각각의 개시 코돈에 대해 5′업스트림에 인접하여 발견된다. 따라서, 사용 목적에 따라, 다양한 프로모터가 바람직할 수 있다.
본 발명에서 특히 중요한 것은, 합성효소를 종자 조직에서, 특히, 종자유 형성의 초기 단계에 우선적으로 발현시킬 수 있는 프로모터를 사용하는 것이다. 이러한 종자 특이적 프로모터의 예로는 미국 특허 제 5,420,034호에 기재된 바와 같은 나핀 또는 종자 ACP 유전자의 5′업스트림에 인접한 영역, 톰슨(Thompson) 등의 문헌[Proc. Nat. Acad. Sci. (1991) 88:2578-2582]에 기재된 바와 같은 탈포화효소 유전자, 또는 미국 특허 제 5,530,194호에 기재된 바와 같은 Bce-4 유전자가 있다. 대안적으로, 식물 합성효소 구조 유전자와 관련된 5′조절 영역, 즉, 식물 합성효소 구조 유전자에 대해 5′업스트림에 인접한 영역 및/또는 식물 합성효소 구조 유전자에 대해 3′다운스트림에 인접하여 발견되는 전사 종결 영역을 사용하는 것이 종종 바람직할 수 있다. 일반적으로, 프로모터는 특정 적용에 따라 변할 수 있는 이들의 발현 프로파일을 기초로 하여 선택될 것이다.
또한, 하나 이상의 그 밖의 관심있는 서열을, 합성효소 서열, 특히 미국 특허 제 5,512,482호에 기재된 바와 같은 중쇄 식물 티오에스테라제의 발현 또는 안티-센스와 함께 전사 또는 전사 및 번역시켜서, 식물 오일의 양 및/또는 조성의 변화에 영향을 미치도록 선택할 수 있다.
하나 이상의 관심있는 핵산 서열의 조합된 효과를 위해 형질전환된 식물을 제공하고자 하는 경우에, 각각의 핵산 구성물은 각각 제공될 수 있거나, 구성물은 동일한 식물 형질전환 구성물에 모두 존재할 수 있다. 구성물은, 생성되는 생성물이 둘 모두의 특성이 게놈에 통합된 식물인 한은, 형질전환된 식물을 통상의 식물 육종법에 의해 교배시킴으로써 이러한 특성을 도입시키는 것을 포함하여, 동일하거나 상이한 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
정상적으로, DNA 구성물에 포함되는 것은 숙주에서 발현에 필요한 조절 영역을 갖고, 형질전환된 세포를 선택할 수 있게 하는 구조 유전자일 것이다. 유전자는 세포독성제, 예를 들어 항생제, 중금속, 독소 등에 대한 내성, 독립영양 숙주에 프로토트로피를 제공하는 보충성, 바이러스 면역 등을 제공할 수 있다. 발현 구성물 또는 이것의 성분이 도입되는 다수의 숙주종의 수에 따라, 1종 이상의 마커가 사용될 수 있으며, 여기서, 선택을 위한 상이한 조건이 상이한 숙주에 대해 사용된다.
DNA 구성물이 식물 숙주에 도입되는 방식은 본 발명에서 중요하지 않다. 효율적인 형질전환을 제공하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 식물 세포 형질전환을 위한 다수의 방법으로는 Ti-플라스미드 또는 Ri-플라스미드의 사용, 마이크로주사, 일렉트로포레이션, 리포솜 융합, DNA 충격 등이 있다. 많은 경우, T-DNA에 의해 한 면 또는 두 면 모두에 보더를 갖는 구성물, 특히 좌측 및 우측 보더, 더욱 특히 우측 보더를 갖는 구성물을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 구성물이 에이. 투메파시엔스 (A. tumefaciens) 또는 에이. 리조제네스 (A. rhizogenes)를 형질전환을 위한 모드로서 사용하는 경우에 특히 유용하더라도, T-DNA 보더는 그 밖의 형질전환 모드로 사용될 수 있다.
발현 구성물은 광범한 식물체, 특히 식물유의 생성에 관여하는 식물체에 대해 사용될 수 있다. 이들 식물체로는, 평지씨, 땅콩, 해바라기, 홍화, 목화, 대두, 옥수수 및 유지종자 야자가 있다.
식물 세포를 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 사용하여 형질전환시키기 위해, 외식편을 조합하고, 형질전환된 아그로박테리움과 함께 형질전환에 충분한 시간 동안 인큐베이팅시키고, 세균을 치사시키고, 식물 세포를 적당한 선택 배지에서 배양시킬 수 있다. 캘러스(callus)가 형성되면, 어린싹 형성을, 공지된 방법에 따라 적당한 식물 호르몬을 사용하여 촉진시킬 수 있고, 어린싹을 식물의 재생을 위해 루팅(rooting) 배지에 옮길 수 있다. 그 후, 식물을 종자로 성장시키고, 종자를 사용하여 반복 발생시키고, 식물유를 단리시킬 수 있다.
상기 일반적으로 기술된 본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것이지만, 이들 실시예는 예시만을 목적으로 포함되는 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1 쿠피아 KAS 인자 A 및 B 유전자 클로닝
쿠피아 후커리아나와 쿠피아 풀체리마의 발육중인 종자로부터 단리된 전체 RNA를 사용하여 통상의 1 기초(1-based) 클로닝 벡터에서 cDNA를 합성하였다. 각각의 타입의 KAS 유전자를 클로닝하기 위해, 약 400,000개 내지 500,000개의 비증폭된 재조합 파지를 플레이팅하고, 플라크를 니트로셀룰로오스로 옮겼다. 쿠피아 후커리아나로부터의 KAS 인자 B를 클로닝하기 위해, 브라시카 나푸스 (Brassica napus) KAS 인자 B와 리시누스 커뮤니스 (Ricinus communis) (아주까리) KAS 인자 B 방사성표지된 cDNA 클론을 함유하는 혼합된 프로브를 사용하였다. 유사하게는, 브라시카 나푸스 KAS 인자 A와 리시누스 커뮤니스 KAS 인자 A cDNA 클론을 함유하는 혼합된 프로브를 사용하여, 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 A 유전자를 수득하였다. KASIII의 경우, 잔 자보르스키 (Jan Jaworski) 박사로부터 입수한 시금치 KASIII cDNA 클론을 방사성표지시키고, 프로브로서 사용하여 쿠피아 후커리아나로부터 KASIII 클론을 단리시켰다. 쿠피아 풀체리마로부터 KAS B와 KAS A를 클로닝하기 위해, 쿠피아 후커리아나 KAS B와 KAS A 유전자인 chKAS B-2와 chKAS A-2-7 (하기 참조)를 방사성표지시키고, 프로브로서 사용하였다.
쿠피아 KAS 클론에 대한 DNA 서열과 번역된 아미노산 서열을 도 1 내지 9에 나타내었다. 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 B 클론인 chKAS B-2와 chKAS B-31-7을 도 1과 2에 나타내었다. 클론은 둘 모두 전장이 아니다. 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 A 클론인 chKAS A-2-7과 chKAS A-1-6을 도 3과 4에 나타내었다. chKAS A-2-7은 KAS 인자 단백질에 대한 전체 코드화 서열을 함유한다. 기타 식물 합성효소 단백질과의 비교를 토대로 하면, 트랜싯(transit) 펩타이드는 뉴클레오타이드 125 내지 466에 의해 코드화되는 아미노산으로 표시되는 것으로 여겨진다. chKAS A-1-6은, 몇몇 트랜싯 펩타이드 코드화 서열이 존재한다고 하더라도 전장 클론이 아니다. 뉴클레오타이드 1 내지 180은 트랜싯 펩타이드 코드화 서열을 나타내고, 성숙 단백질 코드화 서열은 뉴클레오타이드 181에서 출발하는 것으로 여겨진다.
쿠피아 풀체리마 KAS 인자 B 클론인 cpuKAS B/7-8과 cpuKAS B/8-7A를 도 5와 6에 나타내었다. 클론은 둘 모두 KAS 인자 B 단백질에 대한 전체 코드화 서열을 함유한다. cpuKAS B/7-8의 최초 35개 아미노산은 트랜싯 펩타이드를 나타내고, 성숙 단백질 코드화 서열은 뉴클레오타이드 233에서 출발하는 것으로 여겨진다. cpuKAS B/8-7A의 최초 39개 아미노산은 트랜싯 펩타이드를 나타내고, 성숙 단백질 코드화 서열은 뉴클레오타이드 209에서 출발하는 것으로 여겨진다. 쿠피아 풀체리마 KAS 인자 A 클론인 cpuKAS A/p7-6A와 cpuKAS A-p8-9A를 도 7과 8에 나타내었다. 클론은 둘 모두 KAS 인자 A 단백질에 대한 전체 코드화 서열을 함유한다. cpuKAS A/p7-6A의 번역된 아미노산 서열을 나타내었다. 성숙 단백질은 리신 잔기가 코드화되는 595 내지 597에서 출발하는 것으로 여겨지고, 최초 126개 아미노산은 트랜싯 펩타이드를 나타내는 것으로 여겨진다. KAS A 클론인 cpuKAS A-p8-9A의 DNA 서열은 임시적이다. 추가 분석을 수행함으로써, 최종 DNA 서열이 결정되고, 이 유전자에 의해 코드화되는 아미노산 서열이 밝혀질 것이다.
쿠피아 후커리아나 KASIII 클론인 chKASIII-27의 DNA와 번역된 아미노산 서열을 도 9에 나타내었다. chKASIII-27의 뉴클레오타이드 37 내지 144로부터의 코드화 서열은 트랜싯 펩타이드를 코드화하는 것으로 여겨지며, 추정된 성숙 단백질 코드화 서열은 뉴클레오타이드 145 내지 1233 이다.
쿠피아 후커리아나 KAS 인자 B와 KAS 인자 A cDNA 클론의 추론된 아미노산 서열은 이미 공지된 브라시카 나푸스와 리시누스 커뮤니스 클론과 높은 상동성을 나타낸다. 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 B 클론은, 리시누스와 브라시카 KAS 인자 A 클론에 대한 상동성 (둘 모두 60%) 보다 리시누스와 브라시카 KAS 인자 B 클론에 대한 상동성 (각각 94%와 91%)이 더 높다. 또한, 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 A 클론은, 리시누스와 브라시카 KAS 인자 B 클론에 대한 상동성 (둘 모두 60%) 보다 리시누스와 브라시카 KAS 인자 A 클론에 대한 상동성 (각각 85%와 82%)이 더 높다. chKAS B-2와 chKAS B-31-7으로 표시된 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 B cDNA는 폴리펩타이드의 성숙 부분내에서 96% 동일하다. 유사하게는, 쿠피아 후커리아나 KAS 인자 A 클론인 chKAS A-2-7과 chKAS A-1-6의 성숙 단백질 영역의 추론된 아미노산 서열은 96% 동일하다. 쿠피아 풀체리마 KAS 클론은 리시누스 커뮤니스와 브라시카 나푸스 KAS 클론에 대한 상동성을 또한 나타낸다. 다양한 쿠피아 종 중의 모든 KAS 인자 A 군 일원의 성숙 단백질 부분은 95% 동일하다. 유사하게는, 쿠피아 중의 KAS 인자 B 유전자의 성숙 단백질 부분은 또한 서로 95 내지 97% 동일하다. 그러나, 동일하거나 상이한 쿠피아 종내에서 KAS 인자 B와 KAS 인자 A 클론 사이에는 약 60% 서열 동일성이 존재할 뿐이다.
실시예 2 발현의 수준 및 패턴
쿠피아 후커리아나에서의 KAS 발현의 조직 특이성을 조사하기 위해, 노던 블롯을, 종자, 뿌리, 잎 및 꽃 조직으로부터 단리된 전체 RNA를 사용하여 수행하였다. 2개의 별개이지만 동일한 블롯을 chKAS B-31-7 또는 chKAS A-2-7 코딩 영역 프로브를 사용하여 하이브리드화시켰다. 이 RNA 블롯 분석으로부터의 데이터는, KAS B는 조사된 모든 조직에서 유사한 수준으로 발현되는 반면에, KAS A 발현은 종자에서만 검출됨을 나타낸다. 이들 결과는 각각의 합성효소에 대한 발현의 다양한 수준을 또한 나타낸다. KAS A는 풍부한 메세지인 반면에, KAS B는 저수준으로 발현된다. 또한, 매우 엄격한 하이브리드화 조건 (65℃, 0.1 X SSC, 0.5% SDS)에서도, KAS A 프로브는 2.3과 1.9kb의 두 개의 종자 전사체와 동일하게 잘 하이브리드화한다. 거대한 하이브리드화 밴드는 아마도 KAS A-2-7 유전자의 전사체가 되는 데, 이는 이것의 cDNA의 크기가 2046bp 이기 때문이며, cDNA 스크리닝으로부터 수득된 클론의 수는 mRNA의 명백한 이동성 및 블롯상에서의 이것의 풍부함과 잘 상응한다.
실시예 3 대장균에서의 식물 KAS 유전자의 발현
쿠피아 후커리아나 KAS A cDNA와 쿠피아 풀체리마 KAS B cDNA의 성숙 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 PCR에 의해 수득하여, QIAexpress 발현 벡터 (Qiagene)내로 클로닝하였다. 발현의 최대 수준에 대한 실험 조건을 이들 모든 클론에 대해 결정하였고, 가용성 분획의 최고 수준에 대한 파라미터를 확인하였다. 세포를 1M 소르비톨과 2.5mM 베타인을 함유하는 ECLB 배지에서 밤새 성장시키고, 동일한 배지에 1:4 희석율로 계대배양시켰다. 그 후, 세포를 2시간 동안 증식시키고 (약 0.6 내지 0.8 O.D. 까지), 0.4mM IPTG로 유도시키고, 5시간 더 증식시켰다.
chKAS A-2-7과 cpuKAS B/8-7A 클론의 과발현으로부터 수득한 친화성 정제된 재조합 효소의 효소 활성을 다양한 아실-ACP 기질 (6:0- 내지 16:1-ACP)을 사용하여 측정하였다. cpuKAS B/8-7A에 대한 활성 프로파일을 도 10에 나타내었다. 데이터는, 조사된 모든 아실-ACP 기질에 대해 효소가 활성이더라도, 6:0 내지 14:0-ACP 기질에 대한 활성은 16:0 및 16:1 기질에 대한 활성 보다 실질적으로 크다는 것을 나타낸다.
쿠피아 후커리아나 KAS A 클론인 chKAS A-2-7과 chKAS A-1-6의 활성 프로파일을 도 11에 나타내었다. 쿠피아 후커리아나 KAS A 클론은 C:6에 대해 가장 활성이었고, C:16:0 기질에 대해 최소 활성을 가졌다. 그러나, 바람직한 C6:0 기질에 대한 이 클론의 활성은 쿠피아 풀체리마 KAS B 클론의 활성 보다 50배 낮았다.
리시누스 커뮤니스 KAS 인자 A 클론의 일부를 코드화하는 성숙 단백질을 함유하는 단편을 QIAexpress 발현 벡터내로 또한 클로닝시키고, 대장균에서 발현시키고, 효소 친화성을 전술한 바와 같이 정제하였다. 아주까리 KAS A에 대한 활성 프로파일을 도 12에 나타내었다. 최고 활성은 C14:0 기질에서 관찰되었다고 하더라도, 약간의 활성이 C6:0 및 C16:1에서 또한 관찰되었다. 비교로서, QIAexpress 발현 시스템을 또한 사용하여 리시누스 커뮤니스 KAS 인자 B로부터 수득한 활성 프로파일을 도 13에 나타내었다. KAS B 클론은 리시누스 커뮤니스 KAS A 클론 보다 실질적으로 높은 활성 수준 (10배 이상)을 나타내었다. 6:0- 내지 14:0-ACP 기질에 대한 KAS 인자 B의 선택은 이 단백질이 KAS I 활성을 제공한다는 종래의 결과와 일치한다.
실시예 4 형질전환된 종자에서의 KAS 및 TE 발현
CpFatB1 (쿠피아 후커리아나 티오에스테라제 cDNA; Dehesh et al. (1996) Plant Physiol. 110:203-210)과 chKAS A-2-7을 둘 모두 PCR 증폭시키고, 서열화시키고, 나핀 발현 카세트내로 클로닝시켰다. 나핀/cp FatB1과 나핀/KAS A-2-7 융합체를 이원(binary) 벡터 pCGN1558 (McBride and Summerfelt (Pl.Mol.Biol. (1990) 14:269-276))내로 각각 연결시키고, 에이. 투메파시엔스인 EHA101내로 형질전환시켰다. 생성된 CpFatB1 이원 구성물은 pCGN5400 이고, chKAS A-2-7 구성물은 pCGN5401 이었다. 브라시카 나푸스 카놀라 변종의 아그로박테리움 매개된 형질전환을 라드케(Radke) 등의 문헌[Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (1992) 11:49-505]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 수 개의 형질전환체를 각각의 pCGN5400과 pCGN5401 구성물에 대해 생성시켰다.
나핀/cpFatB1 발현 구성물을 나핀/chKAS A-2-7 발현 구성물과 함께 함유하는 이중 유전자 구성물을 또한 어셈블링하고, 이원 벡터내로 연결시켜서, 카놀라 브라시카 변종의 공동배양을 위해 사용하였다. ChFatB1과 chKAS A-2-7 발현 구성물을 함유하는 이원 구성물은 pCGN5413 이다.
chKAS A-2-7을 함유하는 26개 형질전환된 계열(5401 계열)을 지방산 분석한 결과, 형질전환된 변종의 야생형 카놀라 종자의 유사한 분석과 비교하여 오일 함량 또는 프로파일의 현저한 변화가 없었다.
cpFatB1을 함유하는 36개의 형질전환된 계열(5400 계열)을 지방산 분석한 결과, 형질전환된 종자의 C:8 및 C:10의 수준이 증가하였다. 풀(pool) 종자 샘플중에서 관찰된 C:8의 최고 수준은 4.2 mol% 였다. C:10 수준은 C:8 함량의 30 내지 35% 였다. TE/KAS A 탠덤을 함유하는 25개 형질전환된 계열(5413 계열)을 지방산 분석한 결과, TE 함유 계열 (5400)만으로 관찰된 C:8 및 C:10 수준 보다 C:8 및 C:10 수준이 둘 모두 전체적으로 증가하였다. cpFatB1 구성물만을 함유하는 계열의 경우, C:8의 평균 수준은 1.5 mol%인 반면에, TE/KAS A 탠덤 함유 계열의 C:8 평균 수준은 2.37 mol% 였다. C:8 내지 C:10의 비는 두 집단 모두에서 일정하였다. C:8 함량에 대한 형질전환체의 수를 표 14에 나타내었다. 이들 데이터는, 탠덤 TE/KAS A 구성물을 갖는 형질전환체가 하나의 TE 구성물을 갖는 형질전환체 보다 C:8의 수준이 높은 계열을 생성시킴을 나타낸다. 예를 들어, 거의 7 mol% C8을 함유하는 몇몇 계열은 TE/KAS A pCGN5413 구성물에 의해 수득되는 반면에, pCGN5400 TE만의 형질전환으로부터의 최고 C8 함유 계열은 4.2 mol% C8을 함유하였다.
ChFatB2 (쿠피아 후커리아나 티오에스테라제; Dehesh et al. (1996) The Plant Journal 9:167-172)를 발현하는 형질전환된 카놀라 식물의 T3 세대의 절반의 종자를 분석한 결과, 이들 식물이 8:0 및 10:0 지방산 (4804-22-357)을 22 중량% (33 mol%) 까지 축적할 수 있는 것으로 나타났다. 분리 분석의 결과, 이들 형질전환체가 두 개의 유전자좌를 함유하며, 이들이 동형접합성인 것으로 나타났다. 이들 절반의 종자로부터 성장시킨 선택된 식물을 온실로 옮긴 후, 쿠피아 후커리아나 KAS A (5401)만으로 또는 KAS A/CpFatB1 이원 구성물 (5413)로 형질전환시켜 놓은 T1 형질전환체와 교배시켰다.
ChFatB2 (4804-22-357)과 chKAS A-2-7 (5401-9)를 함유하는 형질전환된 계열간의 교배로 수득된 몇몇 계열을 지방산 분석한 결과, C:10/C:8 수준의 비의 증가를 나타내었다 (도 15). ChFatB2 TE만을 함유하는 거의 모든 형질전환된 계열의 이 C:10/C:8 비는 3 내지 6 사이에서 변동하는 반면에, TE와 KAS A-2-7을 모두 함유하는 형질전환체의 F1 세대의 경우, 비는 22 정도로 높을 수 있다. C:10 수준의 이 증가는 전체 C:8과 C:10 함량의 증가를 수반한다 (도 16). 이형접합성 F1 계열의 C:8과 C:10 지방산의 합은 동형접합성 모계열 (4804-22-357)의 합 정도로 높은 반면에, 이형접합성 계열은 동형접합성 계열 보다 실질적으로 낮은 C:8 및 C:10을함유하는 것이 일반적이다.
유사한 결과를, 4804-22-357 (ChFatB2)와 5413-17 (CpFatB1과 chKAS A-2-7 탠덤) 간에 수행된 교배로부터 생성된 F1 세대 종자에서 관찰하였다. 5413-17 계열의 C:8 및 C:10의 수준은 각각 6.3 및 2.8 mol% 였다. 도 17에 나타난 데이터는, 4804-22-357 (ChFatB2) x 5401-9 (chKAS A-2-7) 교배에 대해 관찰되는 바와 같이, C:10 지방산에 대한 변화가 존재함을 나타낸다. 또한, 도 18은 이형접합체의 두 개의 각각의 집단의 존재를 나타낸다. C:10 + C:8 약 9 내지 11 중량%를 함유하는 식물은 ChFatB1 TE 복사체 1개를 함유하고 5413으로부터의 CpFatB1과 chKAS A 유전자 복사체를 함유하지 않는 후손을 나타내는 것으로 여겨진다. C:10 + C:8 약 15 내지 20 중량%를 함유하는 식물은 하나의 ChFatB1 TE 유전자 뿐만 아니라 5413으로부터의 CpFatB1과 chKAS A 유전자를 함유하는 이형접합체를 나타내는 것으로 여겨진다. 따라서, C:10 + C:8 지방산의 수준은, ChKAS A 유전자의 한 복사체가 존재하는 경우에는 모계열에서 검출된 수준의 50%까지 감소하지 않는다.
쿠피아 후커리아나 KAS A 효소의 쇄 길이 특이성을 추가로 특징화하기 위해, 캘리포니아 월계수 (Umbellularia californica) 12:0 특이적 티오에스테라제를 함유하는 형질전환된 브라시카 나푸스 계열인 Uc FatB1 (미국 특허 제 5,344,771호)와 chKAS A-2-7 (5401-9) 사이의 교배체를 수득하였다. Uc fatB1를 함유하는 형질전환된 식물의 절반의 종자 분석 결과, 이들 식물이 동형접합성 디하플로이드(dihaploid) 계열 (LA86DH186)의 종자유에 C12:0를 52 mol%까지 축적할 수 있는 것으로 종래에 나타났다. 계열 LA86DH186과 형질전환되지 않은 대조 브라시카 간의 교배체는 C12:0 수준의 감소를 나타냈다.
그러나, LA86DH186과 5401-9 반접합성 계열을 교배시키면, F1 프로제니의 종자유에 C12:0가 57 mol%까지 축적되었다 (도 19). 흥미롭게도, LA86DH186 x 형질전환되지 않은 대조 계열 및 LA86DH186 x 5401-9에 대한 교배의 경우, F1 프로제니의 종자의 C14:0의 수준은 동형접합성 LA86DH186 계열에서 수득된 수준의 50%로 감소하였다 (도 20). 또한, C12:0 지방산의 비율이 증가하면, 모든 장쇄 지방족 아실기 (C16:0, C18:0, C18:2 및 C18:3)의 비율이 상당히 감소하였다. 이들 결과는 ChKAS A-2-7이 C6:0 내지 C10:0-ACP의 기질 특이성을 갖는 효소이며, 이것이 과발현되면 장쇄 아실-ACP 풀을 궁극적으로 감소시킨다는 것을 나타낸다.
5401-9 계열과, 가르시니아 망고스타나 (Garcinia mangostana) (GarmFatA1, 미국 특허 출원 제 08/440,845호)로부터의 18:1/18:0 TE를 발현시키는 형질전환된 계열 (5266)의 교배체에서의 ChKAS A-2-7의 쇄 길이 특이성을 지지하는 추가의 증거가 입수된다. 형질전환된 브라시카 계열 5266은 동형접합성 계열의 종자유에 C18:0를 24 mol%까지 축적하는 것으로 밝혀졌다 (도 21). 그러나, 5266과 5401-9 간의 교배체의 F1 프로제니의 종자유의 경우, C18:0의 수준은 약 12 mol%로 감소하였다. 또한, 이들 교배체로부터 생성된 C16:0의 수준은 비형질전환된 대조 식물의 종자유로부터 수득된 수준과 유사하였다.
실시예 5 식물 KAS 효소의 시험관내 분석
종자 추출물을, 슬라바우(Slabaugh) 등의 문헌[Plant Journal, 1998, 발행중]과 레오나드(Leonard) 등의 문헌[Plant Journal, 1998, 발행중]에 기재된 바와 같이, 비형질전환된 대조표준 또는 chKAS A-2-7를 발현시키는 형질전환된 브라시카로부터 제조하였다. 시험관내 지방산 합성 검정을 포스트-베이텐밀러(Post-Beittenmiller)의 문헌[J. Biol. Chem. (1991), 266:1858-1865]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 추출물을 황산 암모늄 침전 및 P-6 칼럼 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하는 탈염에 의해 농축시켰다. 반응물(65㎕)은 0.1M Tris/HCl (pH 8.0), 1mM 디티오트레이톨, 25mM 재조합 시금치 ACP1, 1mM NADH, 2mM NADPH, 50μM 말로닐-CoA, 10μM [1-14C]아세틸-CoA (50 mCi/mmol), 1㎎/㎖ BSA 및 0.25㎎/㎖ 종자 단백질을 함유하였다. 선택된 종자 추출물을 23℃에서 10분간 세룰레닌과 예비인큐베이팅시켰다. 반응 생성물을 2.25M 요소를 함유하는 18% 아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 니트로셀룰로오스상으로 면역블롯시키고, 이미지(Image) QuaNT 소프트웨어 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하는 포스포르이미징(phosphorimaging)에 의해 정량하였다. 순수 아실-ACP를 병렬식으로 조작하고, 면역블롯하고, 항-ACP 혈청에 의해 최종 검출하여, 지방산 쇄 길이를 확인하였다.
결과(도 22)는, 형질전환된 브라시카 (5401-9) 종자 추출물의 지방산 합성능이 C8:0- 및 C10:0-ACP의 상대적 다량에 의해 측정하여, 시험된 모든 시점에서, 비형질전환된 대조표준으로부터 수득되는 지방산 합성능 보다 높은 것으로 나타났다. 또한, 추출물을 세룰레닌으로 전처리하면, 형질전환된 종자 추출물 및 비형질전환된 대조 종자 추출물 둘 모두에서의 장쇄 지방산의 합성이 현저하게 감소하였다. 그러나, 시금치-ACP의 연장은 비형질전환된 대조 브라시카의 종자 추출물 보다 형질전환된 계열로부터의 종자 추출물에서 훨씬 덜 억제되었다.
이들 데이터는, Ch KAS A-2-7이 중쇄 아실-ACP에 대해 활성인 축합 효소이고, 식물에서 이 효소가 발현되면 중쇄 특이적 티오에스테라제에 의해 가수분해시키려는 기질 풀이 커진다는 것을 추가로 지지한다. 또한, 이들 데이터는 chKAS A-2-7가 또한 세룰레닌 내성 축합 효소임을 제시한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자의 기술 수준을 표시한다. 모든 공보 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보 또는 특허 출원을 참고문헌으로 인용하고 있음을 상세하고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 범위로 참고문헌으로서 본원에 인용되어 있다.
본 발명이 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예에 의해 어느 정도 상세히 기술되었다고 하더라도, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구의 범위내에서 이루어질 수 있음이 명백할 것이다.

Claims (31)

  1. C6:0-ACP(아실 담체 단백질), C8:0-ACP 및 C10:0-ACP의 중쇄 지방산 기질에 대해 선택적 활성을 나타내고, 도 1 내지 도 9에서 도시된 아미노산 서열로부터 선택된 서열을 가지는 KAS(β-케토아실-ACP 합성효소) 단백질에 대한 코드화 서열을 포함하는 DNA 구성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 chKAS(쿠피아 후커리아나 KAS) B-2인 DNA 구성물.
  7. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 chKAS B-31-7인 DNA 구성물.
  8. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 3의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 chKAS A-2-7인 DNA 구성물.
  9. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 chKAS A-1-6인 DNA 구성물.
  10. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 5의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 cpuKAS(쿠피아 풀체리마 KAS) B/7-8인 DNA 구성물.
  11. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 6의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 cpuKAS B/8-7A인 DNA 구성물.
  12. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 cpuKAS A/p8-9A인 DNA 구성물.
  13. 제 1항에 있어서, 코드화 서열이 도 9의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 chKASIII-27인 DNA 구성물.
  14. 형질전환된 식물에 대해 이종성인 식물 중쇄 티오에스테라제 단백질을 발현시킴으로써, 형질전환된 식물 종자에서 중쇄 지방산을 생성시키는 방법으로서,
    식물 중쇄 티오에스테라제의 발현과 함께, 형질전환된 식물에 대해 이종성인 식물 합성효소 인자 단백질을 발현시키는 것을 포함하여, 식물 합성효소 인자 단백질과 식물 중쇄 티오에스테라제 단백질 둘 모두를 발현시키는 종자에서 생성되는 중쇄 지방산의 백분율을 식물 중쇄 티오에스테라제 단백질만을 발현시키는 종자에서 생성되는 중쇄 지방산의 백분율과 비교하여 증가시키고, 상기 중쇄 티오에스테라제 단백질은 ChFat B2 단백질, CpFat B1 단백질, 또는 Uc FatB1 단백질이고, 상기 합성효소 인자 단백질은 제 1항에 따른 DNA 구성물로부터 발현되는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 중쇄 티오에스테라제 단백질이 ChFatB2 단백질인 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 중쇄 티오에스테라제 단백질이 CpFatB1 단백질인 방법.
  17. 제 14항에 있어서, 중쇄 티오에스테라제 단백질이 Uc FatB1 단백질인 방법.
  18. 삭제
  19. 제 14항에 있어서, 식물 합성효소 인자 단백질이 쿠피아 종으로부터 유래하는 방법.
  20. 삭제
  21. 이종성 식물 중쇄 선택성 티오에스테라제를 발현시키는 식물 종자 중의 중쇄 지방산 조성을 변화시키는 방법으로서,
    형질전환된 식물에 대해 이종성인 식물 중쇄 티오에스테라제 단백질의 발현과 함께, 형질전환된 식물에 대해 이종성인 식물 합성효소 인자 단백질을 발현시키는 것을 포함하여, 이 종자에서 생성되는 중쇄 지방산의 조성을, 식물 합성효소 인자 단백질의 발현의 부재하에 식물 중쇄 티오에스테라제 단백질을 발현시키는 종자에서 생성되는 중쇄 지방산의 조성과 비교하여 변화시키고, 상기 중쇄 티오에스테라제 단백질은 ChFat B2 단백질, CpFat B1 단백질, 또는 Uc FatB1 단백질이고, 상기 합성효소 인자 단백질은 제 1항에 따른 DNA 구성물로부터 발현되는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 중쇄 티오에스테라제 단백질이 ChFatB2 단백질인 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 중쇄 티오에스테라제 단백질이 CpFatB1 단백질인 방법.
  24. 제 21항에 있어서, 중쇄 티오에스테라제 단백질이 Uc FatB1 단백질인 방법.
  25. 삭제
  26. 제 21항에 있어서, 식물 합성효소 인자 단백질이 쿠피아 종으로부터 유래하는 방법.
  27. 삭제
  28. 제 21항에 있어서, 지방산 조성 중에서 C10 지방산이 부화되는 방법.
  29. 제 21항에 있어서, 지방산 조성 중에서 C12 지방산이 부화되는 방법.
  30. 제 21항에 있어서, 지방산 조성 중에서 1종 이상의 중쇄 지방산이 부화되고, 1종 이상의 그 밖의 중쇄 지방산이 감소되는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 부화된 지방산이 C12 이고, 감소된 지방산이 C14인 방법.
KR10-1999-7009358A 1997-04-11 1998-04-09 식물 지방산 합성효소 및 중쇄 지방산을 생성하기 위한 개선된 방법에서의 용도 KR100515123B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4181597P 1997-04-11 1997-04-11
US60/041,815 1997-04-11
PCT/US1998/007114 WO1998046776A2 (en) 1997-04-11 1998-04-09 Plant fatty acid synthases and use in improved methods for production of medium-chain fatty acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010006274A KR20010006274A (ko) 2001-01-26
KR100515123B1 true KR100515123B1 (ko) 2005-09-16

Family

ID=21918470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1999-7009358A KR100515123B1 (ko) 1997-04-11 1998-04-09 식물 지방산 합성효소 및 중쇄 지방산을 생성하기 위한 개선된 방법에서의 용도

Country Status (12)

Country Link
US (3) US6660849B1 (ko)
EP (1) EP1003890B1 (ko)
JP (2) JP2002515761A (ko)
KR (1) KR100515123B1 (ko)
AR (2) AR013633A1 (ko)
AT (1) ATE421592T1 (ko)
AU (1) AU735445B2 (ko)
BR (1) BR9808528A (ko)
CA (1) CA2284286A1 (ko)
DE (1) DE69840507D1 (ko)
TW (1) TW567226B (ko)
WO (1) WO1998046776A2 (ko)

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6483008B1 (en) * 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
WO2000075343A2 (en) * 1999-06-09 2000-12-14 Calgene Llc ENGINEERING β-KETOACYL ACP SYNTHASE FOR NOVEL SUBSTRATE SPECIFICITY
US6770465B1 (en) 1999-06-09 2004-08-03 Calgene Llc Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
DE19926456A1 (de) * 1999-06-10 2000-12-14 Norddeutsche Pflanzenzucht Han Verfahren zur Erhöhung des Fettsäuregehalts in Pflanzensamen
DE10030976A1 (de) 2000-06-30 2002-01-10 Basf Ag DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
ATE383433T1 (de) 1999-08-26 2008-01-15 Calgene Llc Pflanzen mit veränderten mehrfachungesättigten fettsäuren
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
DE10000978A1 (de) * 2000-01-12 2001-07-26 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Fettsäuren in Pflanzen und Mikroorganismen
HUP0300081A3 (en) 2000-02-09 2005-11-28 Basf Ag Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids
WO2002008403A2 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
US7294759B2 (en) 2001-06-29 2007-11-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alteration of oil traits in plants
US8242327B2 (en) * 2001-08-23 2012-08-14 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Reverse breeding
DE50312241D1 (de) 2002-01-30 2010-01-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter f
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
EP1484959A4 (en) 2002-03-21 2005-08-31 Monsanto Technology Llc NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND METHODS FOR PRODUCING MODIFIED SEED OIL COMPOSITIONS
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
CA2510462A1 (en) 2002-12-19 2004-07-08 University Of Bristol Method for producing polyunsaturated fatty acids in a transgenic plant or microorganism comprising an introduced delta-9-elongase and a delta-8-desaturase
BRPI0407138A (pt) 2003-02-27 2006-01-10 Basf Plant Science Gmbh Sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo transgênico não humano, processo para produzir ácidos graxos poliinsaturados, óleo, lipìdeo, ou um ácido graxo poliinsaturado ou uma fração dos mesmos, composições de óleo, de lipìdeos, ou de ácido graxo, e, uso do óleo, lipìdeos ou ácidos graxos ou de composições de óleo, de lipìdeos ou de ácido graxo
ATE422877T1 (de) 2003-03-24 2009-03-15 Unilever Nv Zusammensetzungen zur haarbehandlung
AU2004225838B2 (en) 2003-03-31 2009-11-05 University Of Bristol Novel plant acyltransferases specific for long-chained, multiply unsaturated fatty acids
EP1613744B1 (de) 2003-04-08 2015-09-09 BASF Plant Science GmbH Delta-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
WO2005012316A2 (de) 2003-08-01 2005-02-10 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen
US7371848B2 (en) 2004-01-20 2008-05-13 Monsanto Technology Llc Chimeric promoters comprising a caulimovirus promoter enhancer for use in plants
WO2005083053A2 (de) 2004-02-27 2005-09-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen
MXPA06009572A (es) 2004-02-27 2007-05-23 Basf Plant Science Gmbh Metodo para la produccion de acidos grasos poliinsaturados en plantas transgenicas.
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US8629195B2 (en) 2006-04-08 2014-01-14 Bayer Materialscience Ag Production of polyurethane foams
MX2008014663A (es) 2006-05-16 2008-11-27 Monsanto Technology Llc Uso de especies bacterianas no agrobacterium para transformacion vegetal.
RU2483057C2 (ru) * 2006-06-28 2013-05-27 Ньюселис Инк. Смеси жирных кислот и их применение
CA2659993C (en) 2006-08-24 2016-01-05 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
EP3066934A1 (de) 2006-10-06 2016-09-14 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
BRPI0808665B1 (pt) 2007-03-09 2022-05-10 Monsanto Technology Llc Métodos e construções para produção de plantas de soja, algodão ou canola transgênicas usando seleção de espectinomicina
WO2009016208A2 (de) 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
WO2009077478A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
US9181560B2 (en) 2008-03-17 2015-11-10 Monsanto Technology Llc Chimeric promoters and their uses thereof in plants
ES2457218T3 (es) 2008-04-07 2014-04-25 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos
CA2723072C (en) 2008-04-30 2017-01-10 Rothamsted Research Ltd. Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
CA2989798C (en) 2008-07-01 2019-11-05 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
EP2331695B1 (en) 2008-08-26 2014-07-23 BASF Plant Science GmbH Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
CN102164476A (zh) 2008-09-29 2011-08-24 孟山都技术公司 大豆转基因事件mon87705及其检测方法
DE112009003708T5 (de) 2008-12-12 2012-09-13 Basf Plant Science Gmbh Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenenOrganismen
WO2010099431A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Monsanto Technology Llc Hydroponic apparatus and methods of use
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
WO2011050271A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
AU2011205793B2 (en) 2010-01-14 2015-01-22 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
WO2011161093A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses therof in fatty acid production
RS57012B1 (sr) 2010-08-30 2018-05-31 Dow Agrosciences Llc Pospešivač bakterijskog virusa šećerne repe (scbv) i njegova upotreba u funkcionalnoj genomici biljke
WO2012083137A1 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Monsanto Technology Llc Methods for improving competency of plant cells
KR102003177B1 (ko) 2011-03-25 2019-07-24 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물 조절 요소 및 그의 용도
EA031587B1 (ru) 2011-05-13 2019-01-31 Монсанто Текнолоджи Ллс Регуляторные элементы растений и их применение
US8951762B2 (en) 2011-07-27 2015-02-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for using an acyl—acyl carrier protein thioesterase and mutants and chimeras thereof in fatty acid synthesis
US9399768B2 (en) 2011-07-27 2016-07-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for using an acyl-acyl carrier protein thioesterase and mutants and chimeras thereof in fatty acid synthesis
US10036030B2 (en) 2011-12-22 2018-07-31 E I Du Pont De Nemours And Company Use of the soybean sucrose synthase promoter to increase plant seed lipid content
AR090204A1 (es) 2012-02-29 2014-10-29 Dow Agrosciences Llc Potenciador viral baciliforme de caña de azucar (scbv) y su uso en la genomica funcional de plantas
US9663793B2 (en) 2012-04-20 2017-05-30 Monsanto Technology, Llc Plant regulatory elements and uses thereof
WO2014100009A2 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
WO2014116754A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Iowa State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for characterizing and using kasiii for production of bi-functional fatty acids
US10184140B2 (en) 2013-01-23 2019-01-22 Iowa State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for production of bi-functional fatty acids in recombinant bacteria
EP3575308A1 (en) 2013-03-14 2019-12-04 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
ES2769898T3 (es) 2013-03-14 2020-06-29 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores en plantas y usos de los mismos
US20160152998A1 (en) 2013-06-24 2016-06-02 North Carolina State University Transgenic Expression Of Archaea Superoxide Reductase
BR112016020517A2 (pt) 2014-03-03 2017-12-12 Kao Corp método de produção de lipídeo através da utilização de ss-cetoacil-acp sintase
WO2016007862A2 (en) 2014-07-10 2016-01-14 Solazyme, Inc. Novel ketoacyl acp synthase genes and uses thereof
US11519011B2 (en) 2015-03-26 2022-12-06 The Texas A&M University System Conversion of lignin into bioplastics and lipid fuels
JP6568718B2 (ja) 2015-05-22 2019-08-28 花王株式会社 脂質の製造方法
JP2017029122A (ja) * 2015-08-06 2017-02-09 花王株式会社 脂質の製造方法
CA2992488A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
CN108513583A (zh) 2015-10-02 2018-09-07 孟山都技术公司 重组玉米b染色体序列及其用途
AU2017229608B2 (en) 2016-03-11 2022-12-01 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
US10351866B2 (en) 2016-05-24 2019-07-16 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
EP3475427A4 (en) 2016-06-28 2019-11-06 Monsanto Technology LLC METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN GENOME MODIFICATION OF PLANTS
WO2018005589A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
JP6971607B2 (ja) * 2016-12-19 2021-11-24 花王株式会社 脂質の製造方法
EP3737747A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 The Texas A&M University System Increasing plant bioproduct yield
WO2022204466A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Production of circular polyribonucleotides in a prokaryotic system
AR125217A1 (es) 2021-03-26 2023-06-28 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Producción de polirribonucleótidos circulares en un sistema procariota
EP4314281A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system
CA3236416A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023141540A2 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2024052856A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585535A (en) 1990-01-05 1996-12-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans and soybean products having low palmitic acid content
US6426447B1 (en) * 1990-11-14 2002-07-30 Monsanto Technology Llc Plant seed oils
US5512482A (en) * 1990-04-26 1996-04-30 Calgene, Inc. Plant thioesterases
US5475099A (en) * 1990-08-15 1995-12-12 Calgene Inc. Plant fatty acid synthases
US5455167A (en) * 1991-05-21 1995-10-03 Calgene Inc. Medium-chain thioesterases in plants
JPH07501446A (ja) * 1991-11-15 1995-02-16 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物からのβ−ケトアシル−ACPシンテターゼ11遺伝子
US5679881A (en) * 1991-11-20 1997-10-21 Calgene, Inc. Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
US5850022A (en) 1992-10-30 1998-12-15 Calgene, Inc. Production of myristate in plant cells
WO1994010189A1 (en) 1992-11-02 1994-05-11 Calgene, Inc. Plant fatty acid synthases
CA2169094A1 (en) 1993-09-03 1995-03-09 Reinhard Topfer Medium chain-specific thioesterases
WO1995013390A2 (en) * 1993-11-10 1995-05-18 Calgene, Inc. Plant acyl acp thioesterase sequences
WO1998032770A1 (fr) 1997-01-24 1998-07-30 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ENZYME β-CETOACYL-ACP-SYNTHETASE ET GENE LA CODANT
WO1998046766A1 (en) 1997-04-14 1998-10-22 The University Of British Columbia Nucleic acids encoding a plant enzyme involved in very long chain fatty acid synthesis
US6414223B1 (en) 1998-08-03 2002-07-02 Cargill, Incorporated Plants, seeds and oils having an elevated total monounsaturated fatty acid content
WO2000075343A2 (en) 1999-06-09 2000-12-14 Calgene Llc ENGINEERING β-KETOACYL ACP SYNTHASE FOR NOVEL SUBSTRATE SPECIFICITY
DE19950589A1 (de) 1999-10-20 2001-05-23 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Elongasepromotoren für gewebespezifische Expression von Transgenen in Pflanzen

Also Published As

Publication number Publication date
AR013633A1 (es) 2001-01-10
JP2009045074A (ja) 2009-03-05
CA2284286A1 (en) 1998-10-22
EP1003890A2 (en) 2000-05-31
BR9808528A (pt) 2000-05-23
ATE421592T1 (de) 2009-02-15
TW567226B (en) 2003-12-21
KR20010006274A (ko) 2001-01-26
US20040068765A1 (en) 2004-04-08
AU6961198A (en) 1998-11-11
AR056758A2 (es) 2007-10-24
US7301070B2 (en) 2007-11-27
EP1003890B1 (en) 2009-01-21
WO1998046776A3 (en) 2000-04-06
JP2002515761A (ja) 2002-05-28
US6660849B1 (en) 2003-12-09
DE69840507D1 (de) 2009-03-12
WO1998046776A2 (en) 1998-10-22
AU735445B2 (en) 2001-07-05
WO1998046776A9 (en) 2000-07-06
US20080148434A1 (en) 2008-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100515123B1 (ko) 식물 지방산 합성효소 및 중쇄 지방산을 생성하기 위한 개선된 방법에서의 용도
US7148336B2 (en) Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acid levels
US5530186A (en) Nucleotide sequences of soybean acyl-ACP thioesterase genes
US5945585A (en) Specific for palmitoyl, stearoyl and oleoyl-alp thioesters nucleic acid fragments encoding acyl-acp thiosesterase enzymes and the use of these fragments in altering plant oil composition
US7812220B2 (en) Engineering β-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
EP2311959B1 (en) Nucleotide sequences of canola palmitoyl-ACP thioesterase genes and their use in the regulation of fatty acid content of the oils of soybean and canola plants
US7205457B1 (en) Altered linolenic and linoleic acid content in plants
CA2368414C (en) Methods for producing plants with elevated oleic acid content
JPH07501446A (ja) 植物からのβ−ケトアシル−ACPシンテターゼ11遺伝子
JP2002502263A (ja) 植物チオエステラーゼの工学的操作および新規な基質特異性を有する植物チオエステラーゼ
JP2004357709A (ja) ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子、タンパク質、およびそれらの使用方法
JPH11505115A (ja) 植物チオエステラーゼの遺伝子操作および新規な基質特異性を有する植物チオエステラーゼの開示
US8674176B2 (en) ADS genes for reducing saturated fatty acid levels in seed oils
AU777906B2 (en) Method of increasing the content of fatty acids in plant seeds
US5859342A (en) Antisense nucleotide sequences affecting fatty acid catabolism in plants
US7495149B2 (en) Limnanthes oil genes
US20130198904A1 (en) Beta-ketoacyl acp-synthase ii (kasii) gene from jessenia bataua
EP1624066A2 (en) Plant fatty acid synthases and use in improved methods for production of medium-chain fatty acids
JP2003501063A (ja) 新規基質特異性に関するβ−ケトアシルACPシンターゼの加工
CA2816177C (en) Desaturase introns and method of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
EP1908843A1 (en) Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120824

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130826

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140822

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150824

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160826

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170828

Year of fee payment: 13

EXPY Expiration of term