JPH11511015A

JPH11511015A - 高等植物のプラスチドにおける核コード転写系

Info

Publication number: JPH11511015A
Application number: JP9508569A
Authority: JP
Inventors: マリガ，パル; アリソン，ロリ・エイ; ハジドゥキーウィッツ，ピーター・ティ
Original assignee: ラトガーズ・ユニバーシティ
Priority date: 1995-08-10
Filing date: 1996-08-01
Publication date: 1999-09-28
Also published as: CN1199423A; NZ315226A; US6472586B1; EP0846167A4; MX9801108A; WO1997006250A1; EP0846167A1; BR9609896A; EP0846167B1; AU6688796A; AU703838B2; CN1138858C; DE69632403D1; RU2192466C2; DE69632403T2; GEP20012558B; CA2225652A1; CA2225652C; ATE266093T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、高等植物のプラスチドを安定に形質転換するための新規なＤＮＡ構築物および方法を提供する。本明細書に記載した構築物は、核コードプラスチドポリメラーゼおよびプラスチドコードプラスチドポリメラーゼの両方によって転写される独特のプロモーターを含む。本発明の新規な構築物の使用は、広範囲の植物種の形質転換を容易にし、多細胞植物のプラスチドにおける形質転換ＤＮＡの組織特異的発現を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】高等植物のプラスチドにおける核コード転写系発明の分野本発明は、植物遺伝学的操作、特に高等植物におけるプラスチド形質転換に関する。本発明は、様々な植物種において目的とする外来遺伝子の発現に有用な新規プロモーター配列を提供する。発明の背景葉緑体遺伝子は、イー・コリ（E．coli）ＲＮＡポリメラーゼのα、βおよび β’サブユニットに相同なプラスチドコードサブユニットを含有するＲＮＡポリメラーゼによって転写される。該酵素によって利用されるプロモーターは、−３５および−１０共通エレメントからなるイー・コリσ⁷⁰−プロモーターに類似する(G.L．IgloiおよびH．Kossel，Crit．Rev．Plant Sci．10，525，1992；W．Gr uissemおよびJ.C．Tonkyn，Crit．Rev．Plant．Sci．12：−19，1993)。プラスチドコードＲＮＡポリメラーゼによるプロモーター選択は、核コードシグマ様因子に依存する(Link ら1994，Plant promoters and transcription factors，Spr inger Verlag，Heidelberg，pp63−83)。さらに、いくつかのプロモーター由来の転写活性を、コアプロモーターの上流のエレメントと相互作用する核コード転写因子によって調節する(L.A．Allison およびP．Maliga，EMBO J.， 14：3721 −3730；R．Itratni，L．Baeza，A．Andreeva，R．Mache，S．Lerbs-Mache，Gen es Dev．8， 2928，1994)。これらの因子は、発達的および環境的合図に応答して、プラスチド遺伝子発現の核調節を媒介する。そこでは、プラスチドにおける二次転写系の存在が推測された。しかしながら、かかる推測を指示する直接的な証拠を、これまでは入手できなかった。プラスチドにおける新規な二次転写系の同定は、植物遺伝学的操作の分野における重要な進歩を表わす。かかる系は、プラスチド形質転換に利用できる植物種において、より大きな柔軟性および範囲を与え、組替えＤＮＡ技術によって操作できる構築物によって、外来タンパク質およびＲＮＡの組織特異的発現を容易にする。発明の概要本発明は、多細胞植物のプラスチドを安定に形質転換するためのＤＮＡ構築物および方法を提供する。本発明のＤＮＡ構築物は、形質転換して、目的とする外来遺伝子の組織特異的発現を容易にし得る植物種の範囲を広げる。本発明の一の態様に従って、核コードプラスチド（ＮＥＰ： nuclear encode d plastid）ＲＮＡポリメラーゼによって認識される新規なプロモーター配列を含有するＤＮＡ構築物を提供する。ＤＮＡ構築物は、標的セグメント、少なくとも１個の目的とする外来遺伝子の挿入に適合する少なくとも１個のクローニング部位、ＮＥＰポリメラーゼによって認識されるプロモーターによって調節されている目的とする外来遺伝子の発現、およびプラスチド選択マーカー遺伝子を含む形質転換ＤＮＡを含有する。目的とする外来遺伝子の発現を増幅するためのプラスチドコードプラスチド（ＰＥＰ：plastid encoded plastid）ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターエレメントの使用は、本発明の別の態様である。前記の構築物のように、これらの構築物もまた、標的セグメント、および目的とする外来遺伝子の発現のためのクローニング部位を含有する。プラスチドコードプラスチドＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターは、葉のような光合成組織においてよく特徴付けられてきた。対照的に、本発明の核コードポリメラーゼ転写系は、根、種子および分裂組織においても、プラスチド遺伝子の発現を指示する。トウモロコシ、綿および小麦を包含する多くの植物において、植物再生は、体細胞不定胚形成（すなわち、分裂組織を伴う）によって成し遂げられる。本発明の好ましい具体例において、これらの範囲における有効なプラスチド形質転換は、本発明のＮＥＰプラスチド転写系、プロモーターおよびポリメラーゼによって、大いに容易になるであろう。本発明のＮＥＰプロモーターは、現在入手可能なプラスチド形質転換ベクターおよびその使用のためのプロトコール、例えば、米国特許第５４５１５１３号ならびに係属中の米国特許出願第０８／１８９２５６号における記載および、Svab およびMaliga.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，913(1993)による記載に組み込まれており、それらは全て、本明細書中に参考文献として記載されている。トランスジェニック植物を得るために、非光合成組織のプラスチドを、ＮＥＰプロモーターから発現した選択マーカー遺伝子で形質転換し、核コードポリメラーゼによって転写する。同様に、目的とするタンパク質を発現するために、核コードポリメラーゼから転写したＮＥＰプロモーターを用いて、発現カセットを非光合成組織において高レベルで発現するように構築する。本発明の別の態様において、本発明のＰＥＰプロモーターは、現在入手可能なプラスチド形質転換ベクターおよびその使用のためのプロトコールに組み込まれる。本発明のまた別の態様において、ＮＥＰ転写系はまた、ＮＥＰ／ＰＥＰプロモーターの両方の使用によって、σ⁷⁰-型系と組み合わせることができる。図の簡単な説明図１．標的遺伝子置換によるタバコプラスチドゲノムからのrpoBの欠失。 (Ａ)プラスミドｐLAA57におけるaadAを側面に配したプラスチドＤＮＡ配列を経た相同組替え（斜めで結んだ線）の結果、野生型プラスチドゲノム(ptDNA)におけるrpoB（Sac Ｉ〜Sma Ｉフラグメント）のaadA配列での置換を生じ、ΔrpoBプラスチドゲノム（ΔrpoB ptDNA）を生じる。略号：rpoB，rpoC1，rpoC2は、ィー・コリ様ＲＮＡポリメラーゼのβ、β’およびβ''サブユニットをコードするプラスチド遺伝子であり；aadAは、キメラスペクチノマイシン耐性遺伝子である。制限酵素認識部位：P，PstＩ；Sm，SmaＩ；Sc，SacＩ。(Ｂ)色素欠損は、rpoBの欠失に関連する。全細胞ＤＮＡを３つの独立の形質転換株（Nt-pLAA57-11B株、レーン１および２；Nt-pLAA57-16B株、レーン３および４；Nt-ｐLAA57-18C株、レーン５および６）由来の緑色（レーン１，３，５）および白色（レーン２，４，６）の葉組織から、および野生型緑色葉組織（Nt、レーン７）から単離した。ＤＮＡをPstＩで消化し、ゲルブロットをrpoC1部分（図１Ａの太い黒線）を含有するＤＮＡフラグメント（K．Shinozakiら（EMBO J．5， 2043，1986）に従って番号をつけると、ptDNAのヌクレオチド位置22883-24486）でハイブリダイズした。プローブを野生型ゲノム由来の９．０ｋｂフラグメントおよびΔrpoB ptDNA由来の４．２ｋｂフラグメントに対してハイブリダイズする。(Ｃ)ＤＮＡゲルブロット分析は、Nt-pLAA57-10Aの白色苗条（レーン２）および同じ株由来の接ぎ木したキメラ植物の白色種子（レーン３）における野生型pt DNAコピーの欠失を確証する。野生型緑色葉組織由来のＤＮＡをレーン１にロードした。野生型ptDNA９．０ｋｂフラグメントがΔrpoB植物に存在しないことに注目する。ブロットを図１Ｂ用として調製した。図２．rpoBの欠失の結果、色素欠損表現型を生じる。(Ａ)緑色野生型(左)、色素欠損ΔrpoB(右)、およびキメラ（中央）植物を示す。(Ｂ)温室内で開花しているキメラ植物。白色の葉縁が生殖細胞系を形成する二次葉層におけるΔrpoBプラスチドを示すことに注目する。図３．（Ａ）ΔrpoB植物の葉肉細胞におけるプラスチド（Ｐ）は、組織化された光合成膜を欠失する。略号：N，核；V，液胞、M，ミトコンドリア。(Ｂ)野生型の葉の葉緑体（Cp）とチラコイド膜（T）の電子顕微鏡写真の比較を示す。（Ａ）および（Ｂ）の両方における拡大は、７８００倍である。図４．（上方）ΔrpoB植物における（Ａ）光合成遺伝子および（Ｂ）遺伝系遺伝子のプラスチドｍＲＮＡの蓄積。ゲルブロットを野生型（レーン１，３，５）およびΔrpoB（レーン２，４，６）葉組織由来の全細胞ＲＮＡ（Ａ，レーンあたり３μｇ；Ｂ，レーンあたり５μｇ）で調製し、示したプラスチド遺伝子配列に対してハイブリダイズした。(下方)前記のブロットを２５ＳｒＤＮＡ配列で再プローブした。ハイブリダイゼーションシグナルをMolecular Dynamics Phosphor Imagerで定量化し、２５ＳｒＲＮＡシグナルに対して標準化した。各プローブに対するΔrpoBシグナル感受性に関して野生型の過剰倍率を線の下に示す。図５．ΔrpoB植物における転写は、非規範的プロモーターから開始する。（Ａ）プライマー伸長分析を使用して、野生型（レーン１，３）ならびにΔrpoB （レーン２，４）植物におけるrbcLおよび１６ＳｒＤＮＡ転写物の５’末端を位置決定した。一次転写産物を丸（野生型は白抜き、ΔrpoBは黒塗り）でマークし、三角形によって処理中の転写産物をマークする。未知起源の転写産物に星印をつける。付随する配列はしご（オーダーGATCを負荷している）は、プライマー伸長反応において用いた同じプライマーを用いて生じた。各伸長産物の横の数字は、rbcLのコーディング配列の最初のヌクレオチドからおよび成熟１６ＳｒＲＮＡの最初のヌクレオチドからの距離を示す。(Ｂ)野生型（レーン２）およびΔrp oB（レーン３）植物における１６ＳｒＲＮＡの一次転写産物のマッピング。全葉ＲＮＡ（２０μｇ）をin vitroでキャップし、キャップした１６ＳｒＲＮＡ種を相補的ＲＮＡプローブとハイブリダイゼーション後、ＲＮＡse保護によって同定した。キャップした保護産物を（Ａ）におけるようにマークする。レーン１は、示したサイズの標準ＲＮＡを含む。(Ｃ)プラスチドコード（σ⁷⁰型、Ｐ１）および核コード（Ｐ２）ポリメラーゼのプロモーターから開始する転写を伴う１６ＳｒＤＮＡ上流領域のＤＮＡ配列(Ｐ１およびＰ２の設計は、A．VeraおよびM．Sug iura，Curr．Genet．27，280，1995に基づく)。共通σ⁷⁰プロモーターエレメント（−35および−10）をボックスで囲む。開始部位を（Ａ）および（Ｂ）におけるように、丸でマークする。番号付けは、１６ＳｒＤＮＡコーディング領域の上流の最初のヌクレオチドから開始する(−１＝タバコプラスチドゲノムにおけるヌクレオチド１０２７５７)。図６．野生型およびΔrpoBタバコ葉におけるプラスチドｍＲＮＡの蓄積。プラスチド遺伝子のブロット（実施例Ｉ参照）は、以下のようにグループ分けされる。（Ａ）ｍＲＮＡは、ΔrpoB植物におけるよりも野生型の葉における方が、有意により豊富である。(Ｂ)ｍＲＮＡレベルは、野生型およびΔrpoB葉において比較でき、または（Ｃ）ΔrpoB葉において、より高い。ゲルブロットを野生型（レーン１）およびΔrpoB（レーン２）葉組織由来の全細胞ＲＮＡ（１レーンあたり３ μｇ）を用いて調製し、示したプラスチド遺伝子配列に対してハイブリダイズした。(下方パネル)ローディングのコントロールのために、前記のブロットを２５ＳｒＤＮＡ配列で再プローブした。図７．野生型およびΔrpoBタバコ葉におけるatpB転写開始部位のマッピング。（Ａ）プライマー伸長分析。野生型（wt）およびΔrpoB（T57）試料由来の末端標識化プライマー伸長産物を、同じプライマーを用いることによって得られた相同配列の横に流した。該配列の横の数字は、ＡＴＧ転写開始コドンからの距離を示す。ＮＥＰおよびＰＥＰプロモーター由来の一次転写産物を黒塗りおよび白抜き丸で、それぞれマークする。(Ｂ)一次転写産物５’末端を同定するための、in vitroでのキャッピングおよびＲＮase保護アッセイ。レーンは、相補的アンチセンスＲＮＡの保護を用いる（２，４）および用いない(１，５)、ΔrpoB（T57 ；１，２）および野生型（wt；４，５）ＲＮＡ試料でロードした。分子量（ＭＷ）マーカー（１００，２００，３００，４００および５００ヌクレオチド）をレーン３にロードした。(Ａ)における転写産物５’末端は、括弧内の保護されたフラグメントサイズに相当する：-254(277nt)、-289(311)。非保護ＲＮＡ試料に存在する200ntマーカーよりわずかに低い産物に注目する。(Ｃ)atpB-rbcL遺伝子間領域の物理的地図。atpBＮＥＰおよびＰＥＰプロモーターのための一次転写産物５’末端の地図位置は、(Ａ)におけるように示す。図８．野生型およびΔrpoBタバコ葉におけるatpＩ転写開始部位のマッピング。（Ａ）プライマー伸長分析。野生型（wt）およびΔrpoB（T57）試料由来の末端標識化プライマー伸長産物を、同じプライマーを用いることによって得られた相同配列の横に流した。該配列の横の数字は、ＡＴＧ転写開始コドンからの距離を示す。ＮＥＰおよびＰＥＰプロモーター由来の一次転写産物を黒塗りおよび白抜き丸で、それぞれマークする。(Ｂ)一次転写産物５’末端を同定するための、 in vitroでのキャッピングおよびＲＮＡase保護アッセイ。レーンは、相補的アンチセンスＲＮＡの保護を用いる（２，４）および用いない(１，５)、ΔrpoB（ T57；１，２）および野生型（wt；４，５）ＲＮＡ試料でロードした。分子量（ＭＷ）マーカー（１００，２００，３００，４００および５００ヌクレオチド）をレーン３にロードした。(Ａ)における転写産物５’末端は、括弧内の保護されたフラグメントサイズに相当する：-130(235nt)、-207、209、212(303、305、30 9；分解されない)。非保護ＲＮＡ試料に存在する200ntマーカーよりわずかに低い産物に注目する。(Ｃ)rps２−atpＩ遺伝子間領域の物理的地図。 atpIＮＥＰおよびＰＥＰプロモーターのための一次転写産物５’末端の地図位置は、(Ａ)におけるように示す。図９．野生型およびΔrpoBタバコ葉におけるclpP転写開始部位のマッピング。（Ａ）プライマー伸長分析。野生型（wt）およびΔrpoB（T57）試料由来の末端標識化プライマー伸長産物を、同じプライマーを用いることによって得られた相同配列の横に流した。該配列の横の数字は、ＡＴＧ転写開始コドンからの距離を示す。ＮＥＰおよびＰＥＰプロモーター由来の一次転写産物を黒塗りおよび白抜き丸で、それぞれマークする。(Ｂ)一次転写産物５’末端を同定するための、in vitroでのキャッピングおよびＲＮＡase保護アッセイ。レーンは、相補的アンチセンスＲＮＡの保護を用いる（２，４）および用いない(１，５)、ΔrpoB（T5 7；１，２）および野生型（wt；４，５）ＲＮＡ試料でロードした。分子量（ＭＷ）マーカー（１００，２００，３００，４００および５００ヌクレオチド）をレーン３にロードした。(Ａ)における転写産物５’末端は、括弧内の保護されたフラグメントサイズに相当する：-53(96nt)、-95(138nt)、-173(216nt)および-5 11(69nt)。非保護ＲＮＡ試料に存在する200ntマーカーよりわずかに低い産物に注目する。(Ｃ)clpP−psbB遺伝子間領域の物理的地図。clpPＮＥＰおよびＰＥＰプロモーターのための一次転写産物５’末端の地図位置は、(Ａ)におけるように示す。図10．野生型およびΔrpoBタバコ葉におけるaccD転写開始部位のマッピング。（Ａ）プライマー伸長分析。野生型（wt）およびΔrpoB（T57）試料由来の末端標識化プライマー伸長産物を、同じプライマーを用いることによって得られた相同配列の横に流した。該配列の横の数字は、ＡＴＧ転写開始コドンからの距離を示す。PaccD−ＮＥＰプロモーター由来の一次転写産物を黒塗りおよび白抜き丸で、それぞれマークする。(Ｂ)一次転写産物５’末端を同定するための、in vit roでのキャッピングおよびＲＮＡase保護アッセイ。レーンは、相補的アンチセンスＲＮＡの保護を用いる（２，４）および用いない(１，５)、ΔrpoB（T57；１，２）および野生型（wt；４，５）ＲＮＡ試料でロードした。分子量（ＭＷ）マーカー（１００，２００，３００，４００および５００ヌクレオチド）をレーン３にロードした。(Ａ)における−５７転写産物５’末端は、保護された103ntフラグメントに相当する。非保護ＲＮＡ試料に存在する200ntマーカーよりわずかに低い産物に注目する。(Ｃ)accD−−rbcL遺伝子間領域の物理的地図。PaccD−129ＮＥＰプロモーターのための一次転写産物５’末端の地図位置を示す。図11．ＮＥＰプロモーター転写開始部位の横に位置するＤＮＡ配列の整列。６以上合致するヌクレオチドをボックスで囲む。転写開始部位に近接する共通配列を以下に示す。５’末端部分を黒塗り丸でマークする。Prps12-152およびPrps16 -107の５’末端は、キャップされず、一次転写産物ではないであろうことに注目する。図12．ＮＥＰおよびＰＥＰポリメラーゼは、別個のプロモーターの認識によって、プラスチド遺伝子の選択的転写のメカニズムを提供する。いくつかの遺伝子がＰＥＰプロモーターのみを有し(光化学系Ｉおよび光化学系ＩＩ)、その他はＰＥＰおよびＮＥＰプロモーターの両方(ほとんどのハウスキーピング遺伝子)、またはＮＥＰプロモーターのみ（accD）を有することに注目する。図13．ＮＥＰプロモーターから発現したキメラプラスチド遺伝子の概略図。発明の記載いくつかの報告は、タバコのイー・コリ様ＲＮＡポリメラーゼの必須βサブユニットをコードするrpoB遺伝子を欠失させることによって、付加的にプラスチドに配置された、核コードＲＮＡポリメラーゼの存在を示唆した(GruissemおよびT onkyn，1993；IgloiおよびKossel,1992；Mullet,1993；Link，1994において概説された)。核によってコードされる二次プラスチド転写系の存在が確立された(Al lisonら、1996，EMBO J．15：2802−2809)。rpoBの欠失は、光合成に欠陥のある色素欠損植物を生じた。ΔrpoB植物の葉の葉肉細胞におけるプラスチド微細構造の研究は、光合成活性な葉緑体の特性を示す積み重なったチラコイド膜の層を欠く、プロプラスチド様細胞小器官を明らかにした。rbcL、psbAおよびpsbD光合成遺伝子の転写は低く、一方、rpl16、atpIおよび１６ＳｒＤＮＡ遺伝子のｍＲＮＡは、野生型と同じ程度まで、または野生型レベルよりも高く蓄積した。光合成遺伝子の転写産物蓄積の欠損は、σ⁷⁰−型プロモーター活性の欠損に起因した。野生型タバコ葉において、リボソームＲＮＡオペロンは、普通にσ⁷⁰−型プロモーターから転写されるが、ΔrpoB植物において、ｒＲＮＡオペロンは、非σ⁷⁰プロモーターから転写された。ｒＲＮＡオペロンは、プラスチドコードおよび核コードプラスチドＲＮＡポリメラーゼ（それぞれ、ＰＥＰおよびＮＥＰ）の両方を同定した最初の転写単位である。他の遺伝子のプロモーター領域の分析は、ｒＲＮＡオペロンが特有でないことを明らかにした。それは、２個のプラスチドＲＮＡポリメラーゼのいずれかによって発現する潜在性を伴う、各ＰＥＰおよびＮＥＰの少なくとも１個のプロモーターを有するプラスチド遺伝子の大きなクラスのメンバーである。さらに、ＮＥＰによって独占的に転写されるプラスチド遺伝子を同定した。さらに、データは、付加的な遺伝子特異的メカニズムが、異なるプラスチド型においてＮＥＰ転写レベルを調節することを示唆する。ＮＥＰ転写開始部位は、成熟１６ＳｒＲＮＡ５’末端の上流約６２塩基と同定された。開始部位の周囲の配列は、試験した多数の植物種の間で高く保存され、ＰＥＰプロモーター共通配列に似ていない。核コードポリメラーゼ認識および結合に重要なＮＥＰプロモーター共通配列（イー・コリ型転写開始部位の-10および-35配列に類似している）は、ＮＥＰ転写開始部位のいずれかの方向における約５０ヌクレオチド内に優先的に位置する。実施例Ｉにより詳細に記載するように、いくつかの異なるＮＥＰプロモーターが存在し、ＮＥＰプロモーターは、ときどきＰＥＰプロモーターとの結合に見られる。本発明のポリメラーゼをクロマトグラフィーによって、標準法を用いて精製しても良い。カラムフラクション中のＮＥＰポリメラーゼ活性は、in vitroでの転写反応において、鋳型としてＮＥＰプロモーター領域を含むＤＮＡセグメントを利用することによってアッセイすることができる。別法で、ＮＥＰプロモーターセグメントは、いくつかの方法(例えば、磁性ビーズ)によって分離できるマトリックスに結合し得る。マトリックス結合ＤＮＡを核コードポリメラーゼがＤＮＡに結合すると思われる条件下で、植物抽出液を用いてインキュベートする。マトリックス／ＤＮＡ／ポリメラーゼ複合体を次いで、植物抽出液から分離し、次いで、結合タンパク質を単離し、特徴づけし得る。前記のいずれかのプロトコールによって精製したタンパク質を使用して、核コードポリメラーゼをコードする核遺伝子またはｃＤＮＡの単離を目的として、発現ライブラリーをプローブするための抗体を生産し得る。ＮＥＰポリメラーゼの単離のための別法のアプローチとして、プロモーターフラグメントに特異的に親和性を有するタンパク質を単離でき、Ｎ末端アミノ酸配列を微量配列決定によって決定できる。次いで、該アミノ酸配列を使用して、遺伝子単離に適したＰＣＲプライマーを設計することができる。既知のプラスチドコードσ⁷⁰−型転写系の活性は、葉のような光合成活性組織において、よく特徴付けられている。対照的に、本発明の核コードポリメラーゼ転写系は、根、種子および分裂組織においても、プラスチド遺伝子の発現を指示する。トウモロコシ、綿および小麦を包含するほとんどの植物において、植物再生は、不定形胚形成（すなわち、分裂組織を伴う）によって成し遂げられる。これらの作物における有効なプラスチド形質転換は、本発明のＮＥＰプラスチド転写系の使用によって、可能になり、または大いに容易になるであろう。本発明のＮＥＰプロモーターは、現在入手可能なプラスチド形質転換ベクターおよびその使用のためのプロトコール、例えば、米国特許第５４５１５１３号ならびに係属中の米国特許出願第０８／１８９２５６号における記載および、また Svab & Maliga.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，913(1993)における記載に組み込まれ得れ、それら全ては、本明細書中に参考文献として記載されている。トランスジェニック植物を得るために、非光合成組織のプラスチドを、ＮＥＰプロモーターから発現した選択マーカー遺伝子で形質転換し、核コードポリメラーゼによって転写する。同様に、目的とするタンパク質を発現するために、核コードポリメラーゼから転写したＮＥＰプロモーターを用いて、発現カセットを非光合成組織において高レベルで発現するように構築する。ＮＥＰ転写系はまた、ＮＥＰ／ＰＥＰプロモーターの両方の使用によって、σ⁷⁰−型と組み合わせることができる。いくつかの場合、光合成組織におけるＮＥＰプロモーター由来の導入遺伝子の発現もまた、望ましい。詳細な説明は、本発明のＤＮＡ構築物を作製および使用するために、および本発明の方法を実施するために、好ましい方法を記載する下記の実施例Ｉ〜ＩＩＩに示す。特別に記載されないいずれの分子クローニングおよび組替えＤＮＡ技術も、一般的に示すような、例えばAusubel(ed.)，Current Protocols in Molecul ar Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)における標準法によって行われる。以下の制限しない実施例は、より詳細に本発明を説明する。実施例Ｉ rpoB の欠失による二次特有プラスチド転写系（Second Distinct Plastid Transcription System ）の実施プラスチドにおける非イー・コリ様ＲＮＡポリメラーゼの存在を確証するために、イー・コリ様酵素の必須サブユニットの１つの遺伝子をタバコプラスチドゲノムから欠失させた。次いで、ｍＲＮＡレベルを突然変異プラスチドにおいて評価した。データは、プラスチドコードイー・コリ様酵素の非存在下で、いくつかの光遺伝子の発現が著しく減少することを示す。対照的に、遺伝子発現器官をコードするプラスチド遺伝子の転写レベルは、野生型植物におけるレベルに類似する。従って、非イー・コリ様ＲＮＡポリメラーゼは、選択的にプラスチド遺伝子のサブユニットを転写する。該二次転写機構は、典型的なイー・コリσ⁷⁰−プロモーターから開始しないが、新規なプロモーター配列を認識しない。実施例Ｉの材料および方法プラスミド構築。プラスミドpLAA57は、ptDNAのSacＩ〜Bam HIフラグメント（ヌクレオチド22658〜29820）を運搬するｐBSKS+(Stratagene)誘導体である。ptD NA挿入部分内のSacＩ〜SmaＩＤＮＡフラグメント内、ヌクレオチド24456〜28192 間を、キメラスペクチノマイシン耐性(aadA)遺伝子によって置き換えた。 aadA遺伝子は、記載（J．M．StaubおよびP．Maliga，Plant J.6，547，1994）のようにpsbA３’領域がより短く、XbaＩ〜DraＩフラグメント内に含まれることを除いて、記載（Z．SvabおよびP．Maliga，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，91 3，1993）に一致する。植物形質転換。プラスチド形質転換の場合、タングステン粒子をpLAA57ＤＮＡで被覆し(Z．SvabおよびP．Maliga，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，913，19 93)、１１００ｐ．ｓ．ｉ．にてDuPont PDS1000He Biolistic gunを用いて、ニコチアーナ・タバカム（Nicotiana tabacum）植物の葉に導入した。トランスジェニック苗条を５００ｍｇ／ｍｌスペクチノマイシン二塩酸塩を含むRMOP培地（ Z．Svab，P．Hajdukiewicz，P．Maliga，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，8526 ,1990）上で、無菌的に選抜した。トランスジェニック切削を定着させ、３％スクロースを含む寒天−凝固MS塩（T．MurashigeおよびF．Skoog，Physiol．Plant .，15，493，1962）を含有するRM培地上で保持した。電子顕微鏡。３％スクロースを含むRM培地上での無菌培養で生育させた野生型およびΔrpoB切削由来の完全に広げた葉上で、電子顕微鏡を行った。組織を室温で２時間、２％グルタルアルデヒド、０．２Ｍスクロース、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中で固定し、０．２Ｍスクロース、０．１Ｍリン酸緩衝液中で３回洗浄した。固定した組織を０．２Ｍスクロースを含む１％四酸化オスミウム緩衝液中で二次固定し、一連の濃度勾配エタノールで脱水し、Spurrのエポキシ樹脂（固い）中に埋め込み、薄片に切り、透過電子顕微鏡用の酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。ゲルブロット。全葉ＤＮＡを記載（I．J．Mettler，Plant Mol．Biol．Rep.， 5，346，1987）のように調製し、制限エンドヌクレアーゼPstＩで消化し、０．７％アガロースゲル上で分離し、Posiblot Transfer装置（Stratagene）を用いて、Hybond N（Amersham）へ転写した。ランダムプライム標識化フラグメントへのハイブリダイゼーションをRapid Hybridization Buffer（Amersham）中で、６５℃で一晩行った。製造者のプロトコールに従って、全葉ＲＮＡをTRIzol（GIBC O BRL）を用いて調製した。ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、次いで、ナイロン膜へ転写して、ＤＮＡブロットの場合のようにプローブした。プローブの合成。psbA、atpI、およびrpl16のための二本鎖ＤＮＡプローブをＰＣＲで生じたＤＮＡフラグメントのランダムプライム³²Ｐ標識によって調製した。ＰＣＲで使用したプライマーの配列は、タバコptDNA（K．Shinozakiら、EMB O J．5，2043，1986）内の位置を加えて：psbA、５’プライマー＝５’−ＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＡＣＴＧＧ−３’(ptDNAのヌクレオチド１５５０〜１５３６に相補的)、３’プライマー＝５’−ＴＧＡＣＴＧＴＣＡＡＣＴＡＣＡＧ−３’(ヌクレオチド６６７〜６８２)；atpI５’プライマー＝５’−ＧＴＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＣＴＣ−３’(ヌクレオチド１５９８５〜１５９７１に相補的)、３’プライマー＝５’−ＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＡＡＧＴＴ−３’(ヌクレオチド１５２９２〜１５３０６)；rpl16５’プライマー＝５’−ＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＡＡＧＧＴ −３’(ヌクレオチド８４２４４〜８４２３０に相補的)、３’プライマー＝５’ −ＴＧＡＧＴＴＣＧＴＡＴＡＧＧＣ−３’(ヌクレオチド８３６８５〜８３６９９)である。rbcL、psbD/Cおよび１６ＳｒＲＮＡのためのプローブを生じるために、以下の切断ＤＮＡフラグメント：rbcL、Bam HIフラグメント(ptDNAにおけるヌクレオチド５８０４７〜５９２８５)；psbD/C、タバコpsbD/CオペロンのSac I I〜Hind IIIフラグメント(ヌクレオチド３４６９１−３６３９３)；１６ＳｒＲＮＡ、Eco RI〜Eco RVフラグメント（ptDNAにおけるヌクレオチド１３８４４７〜１４０８５５）を³²Ｐ標識した。タバコ２５ＳｒＲＮＡのためのプローブは、プラスミドｐBR325においてクローン化したタバコ２５Ｓ/１８Ｓ部位由来の３．７５ｋｂEco RIフラグメントを含有するプラスミドpKDR１（D．Dempsey，K．W．Wobbe，D．F．Klessing，Mol． Plant Path．83，1021，1993）由来であった。２５ＳｒＲＮＡのためのゲルブロットをハイブリダイズするとき、32Ｐ標識化二本鎖ＤＮＡプローブを、フィルター上に存在するＲＮＡ量の２倍過剰に相当する非標識化プラスミドpKDR1 と混合した。プラスチドゲノムコピー数によるＤＮＡレベルの標準化。プラスチドゲノムコピー数における変化が遺伝子発現における評価差異の一因となるかどうかを試験するために、全細胞ＤＮＡおよびＲＮＡを野生型およびΔrpoB植物由来の等量の葉組織から調製した。等量の葉当たりのプラスチドゲノムコピー数を比較するために、ＤＮＡゲルブロットを等容量の各ＤＮＡ調製を用いて行い、１６ＳｒＤＮＡ配列の放射能標識化Eco RI〜Eco RVフラグメント（ptDNA（K．Shinozakiら、E MBO J．５，2043，1986）のヌクレオチド１３８４４７〜１４０８４５由来）を用いてプローブした。PhosphorImage分析による定量化は、各試料における等数のプラスチドゲノムコピーを実証した。等しい組織試料由来の１６ＳｒＲＮＡ量は、等容量の各ＲＮＡ調製でのＲＮＡゲルブロットによって測定したとき、Δrp oB植物において２．５倍減少した。該値は、細胞質２５ＳｒＲＮＡシグナルで標準化するとき評価された３倍の減少に類似する(図３Ｂ)。プライマー伸長反応。プライマー伸長反応を記載（L．A．AllisonおよびP．Ma liga，EMBO J.，in press）のように、以下のプライマー：１６ＳｒＲＮＡ：５ ’−ＴＴＣＡＴＡＧＴＴＧＣＡＴＴＡＣＴＴＡＴＡＧＣＴＴＣ−３’(ヌクレオチド１０２７５７−１０２７３２に相補的)；rbcL：５’−ＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＴ（ヌクレオチド５７６１６−５７５８７に相補的）を用いて、全葉ＲＮＡの３μｇ（野生型）または１０μｇ（Δ rpoB）で行った。配列はしごは、Sequenase IIキット（USB）を用いて、同じプライマーで生じた。 in vitroキャッピングによる一次転写産物の同定。野生型およびΔrpoB植物由来の全葉ＲＮＡ(２０μｇ)を［α−³²P］GTP存在下でキャップした(J．C． KennellおよびD．R．Pring，Mol．Gen．Genet，216，16，1989)。標識化１６SｒＲＮＡをRPAIIキット（Ambion）を用いるリボヌクレアーゼ保護（A．Veraおよび M．Sugiura，Plant Mol．Biol．19，309，1992）によって検出した。保護相補的ＲＮＡを調製するために、１６ＳｒＤＮＡ上流領域（ptDNAのヌクレオチド１０２５２６−１０２７６１）を以下のプライマー：５’プライマーは、XbaＩ部位を加えたptDNAのヌクレオチド１０２５２６および１０２５４１（K．Shinozaki ら、EMBO J．5，2043，1986、下線部）に相当する５’−ＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＡＡＧＣＣＣＡＡＴＧＴＧ −３’であり；３’プライマーは、KpnＩ部位を加えたptDNAのヌクレオチド１０２７６１〜１０２７４２（下線部）に相補的な５’−ＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＴＣＡＴＡＧＴＴＧＣＡＴＴＡＣ−３’を用いて、ＰＣＲ増幅した。増副産物をXbaＩ〜KpnＩフラグメントとして、XbaＩおよびKpnＩ切断pBSKS＋ベクター（Stratagene）内でクローン化した。１６ＳｒＲＮＡの５’末端に相補的な非標識化ＲＮＡを生じるために、生じるプラスミドを XbaＩで線状にし、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いるMegascript（Ambion）反応中で転写した。マーカー（１００，２００，３００，４００および５００ヌクレオチド）をRNA Century Markers Template Set(Ambion)を用いて、製造者のプロトコールに従って調製した。７２ヌクレオチドマーカーは、プラスチドtrnV遺伝子由来の成熟過程転写産物であり、ＲＮＡse保護によって生じた。結果および考察タバコプラスチドにおけるイー・コリ様ＲＮＡポリメラーゼ活性の崩壊の結果、色素欠損表現型を生じる。rpoB遺伝子は、独占的にイー・コリ様プラスチドポリメラーゼのサブユニットをコードするオペロンの最初のリーディングフレームなので、他の機能のためのプラスチイド遺伝子の崩壊を回避するために、rpoB遺伝子を欠失の標的とした(K．Shinozakiら、EMBO J．5，2043，1986)。欠失は、クローン化プラスチドＤＮＡ(ptDNA)フラグメントにおいて、ほとんどのrpoBコーディング領域（３２１２塩基対のうち３０１５）および上流非コーディング配列６９１ｂｐを、キメラスペクチノマイシン耐性(aadA)遺伝子（Z．S vabおよびP．Maliga，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，913，1993）で置き換えることによって成し遂げられた。生じたプラスミドを粒子衝撃によってタバコ葉緑体へ導入し、そこでは、図１Ａにおける図解のように、aadA遺伝子がプラスチドＤＮＡ配列を側面に配してプラスチドゲノムへ統合した。プラスチド遺伝学系は大いに倍数体なので、ptDNAの同じ１００００コピーまでを含有するあらゆる葉細胞を用いて、形質転換ゲノムコピーの選択的増幅を、衝撃を加えた組織をスペクチノマイシン含有培地上で生育させることによって行った(P．Maliga，Tr ends Biotechnol．11，101，1993)。最初の選抜から、白色葉組織のセクターを示す数個のスペクチノマイシン耐性植物を得た(図２Ａ)。白色および緑色セクターのＤＮＡゲルブロット分析は、３つの独立した形質転換株において、色素欠損がrpoBの欠失と相関があることを示した(図１Ｂ)。色素欠損組織由来のほとんどのＤＮＡ試料、例えば図１Ｂのレーン４は、野生型と形質転換ゲノムコピーの混合物を含んだ。野生型ptDNAコピーの完全な欠如は、データの解釈のために重大であった。従って、形質転換プラスチドゲノムのみを含む植物を得るために、苗条を白色組織セクターから再生した。該手順は、ＤＮＡゲルブロット分析（図１Ｃ）によって判断されるように野生型ptDNAを含まない白色植物（図２Ａ）を均等に生じた。スペクチノマイシン非含有培地上でのこれらの白色葉からの再生は、独占的に色素欠損苗条を生じ、全ての葉層および細胞型において野生型プラスチドゲノムが完全に存在しないことを確証した。無菌培養で生育したタバコ植物から種子を得ることは困難である。偶然に、一次形質転換細胞からの植物再生の間に、発明者らは、Ｌ２葉層におけるプラスチド突然変異のために同一形成した周縁部キメラ（S．Poething，Trends Genetics 5,273，1989）を得た(図２Ａ)。該株を野生型タバコに接ぎ木し、温室内で成熟させた(図２Ｂ)。自己受粉した花由来の種子は、白色幼植物を均等に導き、該幼植物において、野生型プラスチドゲノムをＤＮＡゲルブロット分析によって検出できなかった(図１Ｃ)。 ΔrpoB植物の葉におけるプラスチドは、チラコイド膜を欠損する。色素欠損Δ rpoB植物は、光合成無機栄養的に生育できなかった。しかしながら、光合成の欠如を補うためにスクロース含有培地上で維持するならば、それらは普通に生育するが、野生型に比べて速度が減少しており、器官形態における顕著な変化は示さなかった。さらに、ΔrpoB幼植物は、高い効率で発芽し、植物に発達した。これらの観察は、イー・コリ様プラスチドＲＮＡポリメラーゼが、植物の生育および分化に必要な非光合成プラスチド機能の維持に必要とされないことを示す。 ΔrpoBの葉分裂細胞におけるプラスチド微細構造の研究は、突然変異プラスチドが野生型葉緑体よりも小さくて丸く、野生型葉緑体の５〜９μｍと比較して平均２〜５μｍの長さであったことを明らかにした。従って、ΔrpoBプラスチドは、平均サイズが１μｍである非分化プロプラスチドよりも大きい(M．R．Thomas およびR．J．Rose，Planta 158，329，1983)。さらに、ΔrpoBプラスチドは、典型的に、不規則なサイズおよび形の多くの液胞を含み、光合成活性葉緑体の性質を有する積み重なったチラコイド膜の層を欠いた(図３)。プラスチド遺伝子の転写は、ΔrpoBプラスチドにおいて維持されている。βサブユニットの非存在下で、プラスチドσ⁷⁰-型プロモーター由来の転写は予想されなかった。いずれかの転写活性がΔrpoBプラスチドにおいて維持されたかどうかを決定するために、ＲＮＡの蓄積をＲＮＡゲルブロット分析によって試験した。転写をプラスチド遺伝子の２個の異なるクラスについて調べた(K．Shinozaki ら、EMBO J．5，2043，1986)。第一のグループは、光合成器官のサブユニットをコードする遺伝子：光化学系IIのサブユニットＤ２およびＣＰ４３をコードする psbD/Cオペロン；リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの大きなサブユニットをコードするrbcL；光化学系II反応中心のＤ１サブユニットをコードするpsbAを包含した。第二のグループは、遺伝子発現器官の成分遺伝子：リボソームタンパク質サブユニットをコードするrpl16、および１６ＳｒＤＮＡ遺伝子を含有した。全てのプラスチドＲＮＡ量を細胞質２５ＳリボソームＲＮＡレベルに標準化した。驚くべき事に、ｍＲＮＡの蓄積は、試験した全遺伝子で検出された。しかしながら、転写産物蓄積におけるrpoB欠失の効果は、遺伝子の２つのクラスで著しく異なった。光合成遺伝子psbD/C、rbcL、およびpsbAの安定状態のｍＲＮＡレベルは、野生型レベルと比較して４０〜１００倍減少した(図４Ａ；シグナルは、より長く暴露した全ΔrpoBレーンで見られる)。対照的に、核コードポリメラーゼ遺伝子の転写レベルは、ほとんど影響しなかった。１６ＳｒＲＮＡの３倍の減少が測定され、rpl16遺伝子を含有する多シストロン性オペロンから生じる多数の転写産物の実際の増加もまた、観察された(図４Ｂ)。これらのデータは、光合成器官をコードする遺伝子の発現はΔrpoB植物において欠如するが、ハウスキーピング機能において伴われる遺伝子のＲＮＡは、野生型と同じくらいか、またはより高いレベルまで蓄積することを示す。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子は、ΔrpoB植物における新規なプロモーターから転写する。プラスチドＲＮＡの蓄積は、イー・コリ様酵素のβサブユニットを欠くプラスチドにおいて、ＲＮＡポリメラーゼ活性が存在することを確証した。しかしながら、プラスチド遺伝子の核への移動が報告された(S．L．BaldaufおよびJ．D． Palmer，Nature 334，262，1990; J．S．Gantt，S．L．Baldauf，P．J．Calie， N．F．Weeden，J．D．Palmer，EMBO J．10，3073，1991；M．W．Gray，Curr．Op ．Genet．Dev．3，884，1993)。従って、ΔrpoBプラスチドにおける転写は、依然として考えられるところでは、rpoBの核コピーが存在するならば、σ⁷⁰-型プロモーターから開始することができ、その産物は、プラスチドへ引き入れられ、機能的イー・コリ様酵素に構成され得た。ΔrpoB植物において検出したプラスチド転写産物がσ⁷⁰型プロモーター由来の転写産物であったかどうかを確証するために、転写開始部位が以前に確立している、４個の遺伝子、rbcL(K．Shinozaki およびM．Sugiura，Gene 20，91，1982)、１６ＳｒＲＮＡ(A．VeraおよびM．Sug iura，Curr．Genet．27，280，1995)、psbA（M．SugitaおよびM．Sugiura，Mol ．Gen．Genet．195，308，1984）およびpsbD(W．B．Yao，B．Y．Meng，M．Tanak a，M．Sugiura，Nucl．Acids Res．17，9583， 1989)の５’転写末端を位置決定した。σ⁷⁰-型プロモーター開始部位に位置決定された５’末端は無かった(図５ＡにおいてrbcLおよび１６ＳｒＲＮＡのデータを示す)。従って、ΔrpoBプラスチドにおける残余ＲＮＡポリメラーゼ活性が、イー・コリ様酵素に起因しなかったという結論になったが、第二の独特のプラスチド転写系を表わす。この別個のＲＮＡポリメラーゼ酵素を、発明者らは、プラスチドコードプラスチドＲＮＡポリメラーゼ（Plastid Encoded Plastid RNA po lymerase：PEP）と称するイー・コリ様酵素と区別するために、核コードプラスチドＲＮＡポリメラーゼ（Nuclear Encoded Plastid RNA polynlerase：NEP）と称する。タバコプラスチドゲノムを完全に配列決定して、既知ＲＮＡポリメラーゼサブユニット（K．Shinozaki ら、EMBO J．5，2043，1986）と類似の配列を有さない非同定リーディングフレームはほとんど無かったので、核コードＲＮＡポリメラーゼによる転写は、核遺伝子産物に依存する。 ΔrpoB植物におけるσ⁷⁰−型プロモーター由来の転写非存在下で、何のプロモーターがプラスチドＲＮＡの起源であるのかという疑問が残った。ΔrpoB植物において検出された１６ＳｒＲＮＡ５’末端は、成熟１６ＳｒＲＮＡ５’末端の上流で６２ヌクレオチドを位置決定した(図５Ａ)。該５’末端は、in vitroキャッピングによる一次転写産物であると決定した(図５Ｂ)。類似した５’末端を有する顕著な一次転写産物が近年、有機栄養的に培養されたタバコ細胞のプロプラスチドにおいて報告され、Ｐ２（A．VeraおよびM．Sugiura，Curr．Genet．27，28 0，1995）と称し、該転写産物はまた、とても低レベルで野生型葉細胞に存在する(A．VeraおよびH．Sugiura，Curr．Genet．27，280，1995；図５Ａより長い暴露、データを示さない)。開始部位を取り囲む配列は、試験した全植物種の間で大いに保存され、σ⁷⁰共通配列（A．VeraおよびM．Sugiura，Curr．Genet．27， 280，1995）に似ている配列を有さない。ΔrpoB植物におけるその顕著な用法に基づいて、該独特なプロモーターは、ＮＥＰ転写機構によって利用されると結論づけた。１６ＳｒＲＮＡと対照的に、光合成遺伝子rbcLおよびpsbD/Cの主な転写産物は、以前に特徴付けられた処理末端（rbcL図５のためにデータを示す；L． Hanley-Bowdoin，E．M．Orozco，N．−H．Chua，Mol．Cell．Biol．5，2733，19 85; J．E．Mullet，E．M．Orozco，N．-H．Chua，Plant Mol．Biol．4，39，198 5; S．Reinbothe，C．Reinbothe，C．Heintzen，C．Seidenbecher，B．Parthier ，EMBO J.，12，1505，1993）に対して位置決定した。付加的な少数の転写末端は、処理末端の上流を位置決定した。従って、これらの光合成遺伝子のための低レベルの転写産物蓄積は、上流プロモーター活性および次に続く、正しいサイズの転写産物を生じるための読み合わせ(readthrough)ＲＮＡのプロセッシングの結果である。２つのプラスチドの提案される役割転写系。ΔrpoB植物において、ＮＥＰ系によって転写されたＲＮＡ蓄積がある。これは、プラスチドハウスキーピング遺伝子の発現を保持することにおける核コードＲＮＡポリメラーゼの役割を示す。明らかに、これらの発現レベルは、非光合成無機栄養植物の生育および分化を指示するのに十分である。対照的に、イー・コリ様ＰＥＰＲＮＡポリメラーゼは、光合成活性葉緑体の発達に必要な高レベルのプラスチド遺伝子転写産物を提供するのに必要とされる。核コードＲＮＡポリメラーゼの提案される役割は、ＰＥＰＲＮＡポリメラーゼが活性化する前に、葉緑体発達の初期段階の間に、その機能の高い要求を示す(J．E．Mullet，Plant Physiol.，103，309，1993)。核コードＲＮＡポリメラーゼの発達調節は、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の核コードポリメラーゼＰ２プロモーターが、葉葉緑体におけるよりも培養タバコ細胞のプロプラスチドにおいて活性であるという観察によって支持される(A．VeraおよびM．Sugiura，Curr．Genet．27，280，1995)。実施例ＩＩ２つの別個のＲＮＡポリメラーゼによる転写は、高等植物における遺伝子発現の一般的な調節メカニズムである。実施例Ｉに記載したように、ＰＥＰポリメラーゼを欠損している植物における転写産物の蓄積は、プラスチドリボソームＲＮＡオペロン(Allisonら、1996， EMBO J．14:3721-3730)のためのＮＥＰプロモーターの同定を導く。付加的なＮＥＰプロモーターのマッピングを容易にするために、ｍＲＮＡ蓄積をΔrpoB植物において、プラスチド遺伝子のほとんどのクラスについて試験した。本明細書に記載の新規なプロモーター配列は、かかるプラスチド形質転換が可能な種の範囲を広げ、組織特異的方法において目的とする外来遺伝子の発現を行うために使用し得る。実施例IIの材料および方法ＲＮＡゲルブロット。全葉ＲＮＡをTRIzol（GIBCO BRL）を用いて、製造者のプロトコールに従って調製した。ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、次いでPosiblot Transfer装置（Stratagene）を用いて、Hyb ond N（Amersham）に転写した。ランダムプライマー標識化フラグメントへのハイブリダイゼーションは、Rapid Hybridization Buffer（Amersham）中で、６５ ℃にて一晩行った。二本鎖ＤＮＡプローブをＰＣＲで生じたＤＮＡフラグメントのランダムプライム³²Ｐ標識によって調製した。ＰＣＲに使用したプライマーの配列は、タバコptDNA（Shinozakiら、1986，Supra）内のそれらの位置といっしょに、以下に示す。 rps16ｍＲＮＡを、タバコptDNA（Shinozakiら、1986，supra）のヌクレオチド４９３８／５３６３〜６１４９／６６５６配列を含有するプラスミドpJS40から単離したEcoRIフラグメントでプローブした。タバコ２５SｒＲＮＡのためのプローブは、プラスミドpBR325中でクローン化したタバコ２５S/１８Ｓ部由来の３．７５ｋｂEcoRIフラグメントを含有するプラスミドpKDR1（Dempseyら、Mol．Plan t Path．83:1021，1993）由来であった。２５SｒＲＮＡのためにゲルブロットをハイブリダイズするとき、³²Ｐ標識化二本鎖ＤＮＡプローブをフィルター上に存在するＲＮＡ量の２倍過剰量に相当する非標識化プラスミドpKDR1と混合した。プライマー伸長反応。プライマー伸長反応は、記載(AllisonおよびMaliga，19 95 EMBO J．15:2802-2809)のように、全葉ＲＮＡの10μｇ（野生型）または10μ ｇ（ΔrpoB）で行った。プライマーを以下に挙げた。下線を付したオリゴヌクレオチドはまた、キャッピング構築物の作製にも使用した。配列はしごは、Sequenase IIキット（USB）を用いて、同じプライマーで生じた。 in vitroキャッピングによる一次転写産物の同定。野生型およびΔrpoB植物由来の全葉ＲＮＡ（２０ｍｇ）を［α−³²Ｐ］ＧＴＰの存在下でキャップした(Ken nellおよびPring，1989 Mol Gen．Genet.，216:16-24)。標識化ＲＮＡをRPAIIキット（Ambion）を用いて、リボヌクレアーゼ保護（VeraおよびSugiura，1992，s upra）によって検出した。保護相補的ＲＮＡを調製するために、１６ＳｒＤＮＡ上流領域（ptDNAのヌクレオチド１０２５２６−１０２７６１）を以下に挙げたプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅した。XbaＩ制限部位（下線部）を増幅フラグメントの上流に加えるために、５’プライマーを設計した。KpnＩ部位（下線部）を増幅配列の下流に加えるために、３’プライマーを設計した。増副産物をXb aＩ-およびKpnＩ-切断ｐBSKS+ベクター（Stratagene）中へXbaＩ〜KpnＩフラグメントとしてクローン化した。ＲＮＡの５’末端に相補的な非標識化ＲＮＡを生じるために、生じるプラスミドをXbaIで線状にし、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いるMegascript（Ambion）反応において転写した。マーカー（１００，２００，３００，４００および５００ヌクレオチド）をRNA Century Markers Template S et(Ambion)を用いて、製造者のプロトコールに従って調製した。ＤＮＡ配列分析。ＤＮＡ配列分析をWisconsin Sequence Analysis Package(Ge netics Computer Group，INC.)を使用して行った。結果および考察野性型およびΔrpoB葉におけるｍＲＮＡの蓄積に基づいて、プラスチド遺伝子を３つのクラスに分けことができる。第一のクラスは、野生型においてｍＲＮＡを高レベルに蓄積し、ΔrpoB植物の葉において低レベルに蓄積する遺伝子を包含する(図６Ａ)。該クラスに属する遺伝子は、psaA(光化学系Ｉ遺伝子)、psbBおよびpcbE(光化学系II遺伝子)、petB(シトクロムb6/f複合遺伝子)、ndhA（呼吸鎖ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ相同体；Matsubayashi ら、1987 Mol．Gen．Genet．210 :385:393）およびrps14（リボソームタンパク質遺伝子）である。第二のクラスは、ｍＲＮＡを野生型およびΔrpoB葉においておよそ等レベルまで蓄積するプラスチド遺伝子を包含する(図６Ｂ)。該クラスは、atpB(ＡＴＰシンターゼ遺伝子) 、ndhF(呼吸鎖ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ相同体遺伝子；Matsubayashiら、1987 ，supra)、rps16（リボソームタンパク質遺伝子）およびORF1901(未知機能を有する遺伝子；Wolfeら、1992、J．Mol．Biol．223:95-104)を包含する。第三のクラスは、野生型植物の葉におけるよりも、ΔrpoB葉において有意に多くのｍＲＮＡが存在する遺伝子を包含する(図６Ｃ)。典型的に該クラスの場合、rpl33およびrpl18(リボソームタンパク質遺伝子)、accD（アセチルCoAカルボキシラーゼのサブユニットをコードする；Sasakiら、1993 Plant Physiol．108：445-449）およびORF2280(未知機能を有する推定ATPase；Wolfe ら、1994，Curr．Genet．25: 379-383)である。該クラスの２個の付加的遺伝子、ndhB（呼吸鎖ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ相同体；Matsubayashiら、1987，supra）およびclpP（Clp ATP依存プロテアーゼのタンパク質分解サブユニットをコードする；Mauriziら、1990 J．B iol．Chem．265:12546-12552;Grayら、1990 Plant Mol．Biol．15: 947-950）は、野生型葉において有意なレベルのｍＲＮＡを実証する該クラスのサブグループを形成する。 atpBおよびatpIＡＴＰシンターゼ遺伝子は、ＮＥＰおよびＰＥＰプロモーターの両方を有する。ＲＮＡゲルブロット分析は、高転写レベルがΔrpoB葉において保持されている多くの遺伝子およびオペロンを同定した。付加的なＮＥＰプロモーターを同定するために、いくつかの転写産物の５’末端をプライマー伸長分析によって位置決定した。５’末端は、プロモーターを同定する一次転写産物の末端であり得、またはＲＮＡプロセッシングによって生じ得る。一次プラスチド転写産物が三リン酸基を５’末端に保持するので、酵素グアニリルトランスフェラーゼによるこれらのＲＮＡ分子への特異的［³²Ｐ］ＧＭＰ転移は、一次転写産物および処理末端間に厳密な差異を与えた。タバコatpBオペロンの場合、転写産物５’末端は、Or ozco ら（1990 Curr．Genet．17:65-71）によって、転写開始コドンの上流でヌクレオチド位置−６１１、−５０２、−４８８、−２８９および−２５５で同定された(図７Ｃ)。５’末端は、Ａの直接上流のヌクレオチドが、−１位置であるとき、転写開始コドン（ＡＴＧ）と比較して番号付けした。プライマー伸長分析は、これらの各５’末端を発明者らの野生型植物において同定した(図７Ａ)。Δ rpoB試料において、−２８９ＲＮＡ種のみが存在し、その５’末端はグアニリルトランスフェラーゼの基質であった(図７Ｂ)。従って、−２８９ＲＮＡは、ＮＥＰプロモーター、PatpB−２８９から転写される。おもしろいことに、−２８９転写産物は、ΔrpoB植物におけるよりも豊富ではないけれど、野生型葉に存在する。−２５５、−４８８および−６１１転写産物は、ΔrpoB植物に存在しない( 図７Ａ)。これらのプロモーター（PatpB-289ではないが）を含むＤＮＡフラグメントは、イー・コリＲＮＡポリメラーゼ（Orozco ら、1990,supra）によって認識され、ＰＥＰによってプラスチドにおいて転写される。atpAオペロンは、atpI 、-atpH-atpF-atpA遺伝子を包含する(図８Ｃ)。野生型タバコ葉において、ｍＲＮＡ５’末端は、atpIの上流３領域：ヌクレオチド−２１２、−２０９ならびに −２０７に対して位置決定する５’末端を有する-２０９領域、およびヌクレオチド−１３０ならびに−８５での５’末端に対して位置決定した。ΔrpoB葉において、−２０７転写産物のみが検出可能である(図８Ａ)。該転写産物をΔrpoBＲＮＡ試料中でキャップすることができ(図８Ｂ)、従って、ＮＥＰプロモーターから転写する。該位置でのシグナルもまた、野生型ＲＮＡ試料のin vitroキャッピング反応において得られた。−２０９および−２１２転写産物は、オーバーラップするＰＥＰプロモーターの活性、または野生型におけるＮＥＰプロモーター由来の多くの転写産物の形成に起因し得る。野生型葉ＲＮＡにのみ存在する−１３０転写産物もまた、キャップすることができた( 図８Ａ、８Ｂ)。−１０／−３５エレメントに類似する配列は、該５’末端の正確な上流スペースに存在するので、それは、ＰＥＰポリメラーゼによって転写される。 clpPＮＥＰプロモーターは、葉緑体内で大いに発現する。 clpPプロテアーゼサブユニット遺伝子はまた、ＮＥＰおよびＰＥＰプロモーターの両方を有するクラスに属する。ΔrpoB植物５’末端を−５３、−１７３、および−５１１ヌクレオチド位置に対して位置決定する一方で、野生型植物におけるプライマー伸長分析は、ＲＮＡ５’末端をヌクレオチド位置−５３、−９５、および−１７３で同定した(図９Ａ)。in vitroキャッピング反応は、これら各々が一次転写産物であることを証明した(図９Ｂ)。該転写産物の３個は、ＮＥＰプロモーター由来である。PclpP-53プロモーターは、野生型およびΔrpoB植物の両方において発現され、従って、異なる組織型における高レベル発現の潜在性を有するＮＥＰプロモーターの別個のクラスを表わす。PclpP-53プロモーターは、ホウレンソウにおいてよく保存されている(Westhoff，1985 Mol．Gen．Genet．201 :115-123)。ＮＥＰのための付加的なclpPプロモーターは、PclpP-173およびPclp P-511である。PclpP-511転写産物は、ΔrpoB植物にのみ蓄積するので(図９Ａ)、それはおそらく、調節されたＮＥＰプロモーターである。また、PclpP-511がpsb Bコーディング領域内に位置すること、およびその発現が相近のpsbBＰＥＰプロモーターによって影響され得ることに注目する(図９Ｃ)。 clpPの直接上流にある唯一のＰＥＰプロモーターは、PclpP-95である。該プロモーター由来のＲＮＡは、野生型葉のみに蓄積し、PclpP-95は、−１０／− ３５保存エレメントを暗示する配列をに有する(データを示さない)。 accD遺伝子は、独占的にＮＥＰプロモーターから転写される。脂質生合成遺伝子accDの場合、ｍＲＮＡは、高レベルでΔrpoB植物にのみ蓄積する。主な転写産物は、in vitroでキャップできる（図１０Ｂ）ヌクレオチド位置−１２９で開始する(図１０Ａ)。従って、該ＲＮＡは、ＮＥＰプロモーターから転写する。PaccD-129は、光合成活性葉分裂細胞における有意な活性を有さないので、それは、別個の組織特異的発現パターンを伴う調節されたＮＥＰプロモーターであると思われるものを提供する。ＮＥＰプロモーターは、転写開始部位に近接した緩やかな共通配列を共有する。保存ＮＥＰプロモーターエレメントを同定するために、転写開始部位の側面に位置する配列を整列した(図11)。該配列の整列に包含されるものは、本研究で同定した９個のプロモーター、およびAllison ら（1996，supra）において記載されたＮＥＰプロモーターであるPrrn-62である。in vitroでのキャッピングによって５’末端が一次転写産物であることが明らかになったPORF2280-1577およびP ORF-1901-41の配列も、包含する(データを示さない)。これらのプロモーターの両方は、ΔrpoB葉において活性であるが、野生型植物の葉において活性ではない。また該配列の整列に包含されるものは、rps2およびrps16のための試験的なＮＥＰプロモーターであり、その場合、より多くのｍＲＮＡがΔrpoB葉に存在する。これらの転写産物の５’末端をプライマー伸長分析によって位置決定した。in vitroキャッピングアッセイは、ｍＲＮＡがあまり豊富になかったので、失敗した(データを示さない)。ＮＥＰ５’末端をすぐ側面に配する領域の多くの配列の整列は、転写開始部位のまわりに緩やかな１０ヌクレオチド共通配列を同定した (図１１)。付加的なヌクレオチド上流および下流の保存もまた、明らかである。印象的なことは、葉緑体内で高活性な唯一のＮＥＰプロモーターであるPclpP-53 と多くのＮＥＰプロモーター間の配列保存の欠損である。配列類似の欠損を与えられたので、該配列を整列に包含しなかった。PclpP-53 転写開始部位のまわりの配列を図11の下に分けて示す。ＮＥＰおよびＰＥＰポリメラーゼは、別個のプロモーターの認識によって、プラスチド遺伝子の選択的転写のメカニズムを提供する(図12)。本明細書におけるデータは、多くの遺伝子がＰＥＰおよびＮＥＰ調節配列の両方を有する一方で、いくつかの遺伝子は、ＰＥＰプロモーターまたはＮＥＰプロモーターのみを有することを実証する。実施例ＩＩＩ選択マーカー遺伝子の発現のためのＮＥＰプロモーター多才なおよび一般的な応用の場合、プラスチド形質転換のための選択マーカー遺伝子の発現は、全ての組織型において高レベルであるのが望ましい。現在利用されるプラスチド形質転換ベクターにおける選択マーカー遺伝子は、プラスチドコードＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＰＥＰプロモーターから発現する。ＰＥＰポリメラーゼは、光合成遺伝子およびハウスキーピング遺伝子のいくつかを転写し、従って、光合成活性葉組織における優勢なＲＮＡポリメラーゼであることが明らかである。有効なプラスチド形質転換は、葉細胞における葉緑体形質転換に基づいて、タバコにおいて成し遂げられた。しかしながら、植物再生は不可能であり、またはトウモロコシ、コメ、コムギおよび綿を包含する多くの農業的に重要な穀類作物の葉では、実際的ではない。これらの穀類において、トランスジェニック植物は、典型的に、胚形成組織培養細胞または幼植物組織を形質転換することによって得る。これらの組織は非光合成組織であるので、非緑色組織において活性なＮＥＰプロモーターによるマーカー遺伝子の発現は、特に有益であり、全非光合成組織型におけるプラスチドの形質転換を容易にするであろう。マーカー遺伝子を発現させるために特に適したプロモーターは、PclpP-53プロモーターである。該プロモーターは、ΔrpoB植物において大いに発現し、従って、トランスジェニック穀類植物を生じる胚形成細胞培養体のプロプラスチドにおいても大いに発現し得る。これらのプロモーターから発現したマーカー遺伝子は、葉緑体において活性であることがわかったので、該プロモーターはまた、衝撃を与えた葉培養体におけるプラスチド形質転換体の選択にも適するであろう。PclpP-53プロモーターのようなプロモーターから発現したマーカー遺伝子は、形質転換したプラスチドを得るために幅広い応用を有するであろう。選択マーカー遺伝子は、その主題が参考文献として本明細書中に記載された米国特許第５４５１５１３号および係属中の米国特許出願第０８／１８９２５６号に概説された原理を用いて、構築されるであろう。形質転換ＤＮＡ構築物を図１３に示す。さらに明確に、PclpP-53プロモーターは、プラスチド選択マーカーをコードするＤＮＡセグメントの上流でクローン化されるであろう。翻訳のシグナルは、適当なＤＮＡ配列をプロモーターフラグメントおよび選択マーカーコーディング領域の間に組み込むことによって、提供されるであろう。転写終止シグナルを提供するための、およびキメラｍＲＮＡを安定化するためのプラスチド遺伝子の３’非翻訳セグメントは、選択マーカーの下流でクローン化されるであろう。ＮＥＰおよびＰＥＰポリメラーゼの転写終止のための必要条件が異なり得るので、ＮＥＰプロモーターから発現した遺伝子の３’非翻訳領域の利用が好ましい。 PclpP-53は、特に強力なＮＥＰプロモーターである。しかしながら、形質転換したプラスチドを有する植物は、むしろ弱いプロモーターで得ることができる。前記の実施例においてかかる弱いプロモーターのいくつかの例、例えばPclpP-17 3がある。ＮＥＰプロモーターによる組織特異的プラスチド導入遺伝子の発現プラスチド導入遺伝子の組織特異的発現は、多くの応用において望ましい。根の線虫を寄せ付けない、または根の線虫に有毒な植物組織を作るタンパク質の組織特異的発現は、根において望まれるであろう。しかしながら、葉における同じタンパク質の発現は、植物資源を消耗し、着生植物部分の利用に影響するであろう。ほとんどがしばしば非緑色組織内で発現したので、本明細書に記載されたＮＥＰプロモーター、および一般にＮＥＰポリメラーゼから発現されるプロモーターは、導入遺伝子発現のための組織特異的プロモーターの豊富な供給源である。ＮＥＰプロモーターのいくつか、例えばPclpP-511は、ΔrpoB植物のプロプラスチドにおいて大いに発現する。プロプラスチドは、カリフラワーの食用部分に存在する。従って、カリフラワーにおける外来遺伝子の高レベルな発現では、植物の食用部分における該プロモーターが予想される。プラスチド遺伝子accDは、脂質生合成に伴われる酵素である、原核生物のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニットをコードする。興味深いことに、野生型葉において、accDｍＲＮＡのレベルは低いが、ΔrpoB植物のプロプラスチドにおいて高い。この観察は、PaccD-129が、脂質生合成に伴われる活性な組織の非緑色プラスチド、例えば、油脂が豊富な発達中の種子のプラスチドにおいて活性であることを示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アリソン，ロリ・エイアメリカ合衆国08904ニュージャージー州ハイランド・パーク、シーダー・レイン 32エイ番 (72)発明者ハジドゥキーウィッツ，ピーター・ティアメリカ合衆国ニュージャージー州サマーセット、ラーソン・ロード８番

Claims

【特許請求の範囲】１．相同組替えによる形質転換ＤＮＡの該プラスチドゲノム中への挿入を行う標的セグメント、選択可能表現型を該形質転換プラスチドを含有する植物細胞へ与える選択マーカー遺伝子、および目的とする外来遺伝子をコードする付加的な発現可能ＤＮＡの挿入のためのクローニング部位を有する多細胞植物のプラスチドを安定に形質転換するためのＤＮＡ構築物において、核コードプラスチドＲＮＡポリメラーゼによって認識および転写される５’プロモーターエレメントを特徴とする改良されたＤＮＡ構築物。２．構築物がプラスチドの形質転換に適したベクター中へ組み込まれる請求項１記載のＤＮＡ構築物。３．該５’プロモーターエレメントがプラスチドコードプラスチドＲＮＡポリメラーゼによって認識および転写される請求項１記載のＤＮＡ構築物。４．該プロモーターエレメントがPrrn-62、PORF2280-1577、PatpB-289、PORF1 901-41、Prbs2-152、Prps16-107、PatpI-207、Pclp-511、Pclp-173、Pclp-53およびPaccD-129よりなる群から選択されるプラスチド遺伝子のプロモーターエレメントから選択される請求項１記載のＤＮＡ構築物。５．該プロモーターエレメントがPclp-95である請求項２記載のＤＮＡ構築物。６．植物細胞のプラスチドを安定に形質転換するための、および少なくとも１個の付加的遺伝子産物をそこに発現するためのＤＮＡ構築物であって：ａ）形質転換するためのプラスチドを有する予め決定されたプラスチドゲノム配列に対して実質上相同なＤＮＡ配列を含む標的セグメントであって、予め決定されたプラスチドゲノム配列との相同組替えが可能な標的セグメント；およびｂ）非致死選択可能表現型を、該ＤＮＡ構築物を有するプラスチドを含有する細胞へ与える、該標的セグメント内に配置された選択マーカー遺伝子；およびｃ）タンパク質またはその前駆体をコードする遺伝子の転写単位を含む、付加的なＤＮＡセグメント；およびｄ）該転写単位への結合が可能なプロモーター配列、核コードポリメラーゼによって認識されている該プロモーター配列、該プロモーターによって調節されている該タンパク質をコードする該遺伝子を含むＤＮＡ構築物。７．該転写単位が選択マーカー遺伝子をコードする請求項６記載のＤＮＡ構築物。８．該選択マーカー遺伝子が核コードプラスチドポリメラーゼによって転写されたプロモーターによって調節される請求項７記載のＤＮＡ構築物。９．該転写単位がレポーター遺伝子をコードする請求項６記載のＤＮＡ構築物。１０．該構築物がプラスチドの形質転換に適したベクター中へ組み込まれる請求項６記載のＤＮＡ構築物。１１．請求項１記載のＤＮＡ構築物を用いて安定に形質転換された多細胞植物。１２．請求項２記載のＤＮＡ構築物を用いて安定に形質転換された多細胞植物。１３．プラスチド細胞が少なくとも１個の目的とする外来遺伝子によって安定に形質転換された、植物細胞または多細胞植物を得る方法であって：ａ）形質転換するためのプラスチドを有する予め決定されたプラスチドゲノム配列に対して実質上相同なＤＮＡ配列を含む標的セグメントであって、予め決定されたプラスチドゲノム配列との相同組替えが可能な標的セグメント；およびｂ）選択可能プラスチド表現型を、該ＤＮＡ構築物を有するプラスチドを含有する細胞へ与える、該標的セグメント内に配置された選択マーカー遺伝子；およびｃ）核コードプラスチドＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターにより調節されている目的とする外来遺伝子を含むＤＮＡ構築物を植物細胞へ投与すること；ｄ）該表現型を発現する細胞を選択すること；およびｅ）安定に形質転換されたプラスチドを含有する該細胞から植物を再生することを特徴とする方法。