JP4639150B2 - ゼニゴケ由来の不飽和脂肪酸合成系酵素遺伝子及びその利用 - Google Patents

ゼニゴケ由来の不飽和脂肪酸合成系酵素遺伝子及びその利用 Download PDF

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Description

本発明は、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来の不飽和脂肪酸合成系遺伝子、すなわち、Δ５脂肪酸不飽和化酵素、Δ６脂肪酸不飽和化酵素、及びΔ６脂肪酸鎖長延長酵素の遺伝子とその利用に関するものである。
アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（以下、適宜「ＥＰＡ」と略記する）等の高度不飽和脂肪酸（Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ；ＰＵＦＡ）は、ヒトにおいて神経系を中心とした細胞膜脂質に多く含まれている。これらの高度不飽和脂肪酸は、プロスタグランジンやロイコトリエンといった、生理活性物質の前駆体として作用しており、薬理学的に非常に重要である。近年、アラキドン酸やＥＰＡを含む健康食品も販売されている。また、脂肪酸は、洗剤や生分解性プラスチックの原料にもなるため、素材としても注目されている。
高度不飽和脂肪酸は、現在、培養微生物又は魚油からの抽出により生産されている。このため、生産コストが高いこと、エネルギー使用量・廃棄物量が多くなること、特に魚油から調製する方法では、魚資源が限られていることが問題になっている。
アラキドン酸及びＥＰＡは、それぞれリノール酸及びα−リノレン酸を起点として、Δ６不飽和化、脂肪酸鎖長延長及びΔ５不飽和化という３つの連続した反応により生合成されると考えられている。これらの反応は、それぞれ、Δ６脂肪酸不飽和化酵素（以下、「Δ６不飽和化酵素」と略記する）、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素（以下、「Δ６鎖長延長酵素」と略記する）及びΔ５脂肪酸不飽和化酵素（以下、「Δ５不飽和化酵素」と略記する）により触媒される。
Δ６不飽和化酵素の遺伝子は、いくつかの植物種でクローン化されている。例えば、ケイ藻、ヒメツリガネゴケ、ヤノウエノアカゴケ、ボリジ、ムラサキ、サクラソウ及びアネモネからΔ６不飽和化酵素の遺伝子がクローン化されている。また、植物以外では、糸状菌、線虫、ラン藻、ラット及びヒトからΔ６不飽和化酵素遺伝子がクローン化されている（非特許文献１：「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，ｐ４１０５，２００２」、非特許文献２：「Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５，ｐ３９，１９９８」、非特許文献３：「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７．ｐ３８０１，２０００」、非特許文献４：「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，ｐ４２１１，１９９７」、非特許文献５：「Ｌｉｐｉｄｓ ３７，４１７，２００２」、非特許文献６：「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４２，ｐ１００，２００３」、非特許文献７：「Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ Ｅｐｕｂ ２００３」、非特許文献８：「Ｌｉｐｉｄｓ ３４，ｐ６４９，１９９９」、非特許文献９：「Ｇｅｎｅ，２３８，ｐ４４５ １９９９」、非特許文献１０：「Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３０，ｐ６１１ １９９８」、非特許文献１１：「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，ｐ２９３ １９９３」、非特許文献１２：「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５，ｐ５７５，１９９９」、非特許文献１３：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐ４７１，１９９９」参照）。また、ラン藻のものを除いて、これらのΔ６不飽和化酵素は、いずれもＮ末端にシトクロムｂ５ドメインが存在する。
Δ６鎖長延長酵素の遺伝子は、最初に糸状菌及び線虫からクローン化された（非特許文献１４：「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，ｐ８２８４，２０００」、非特許文献１５：「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，ｐ６４２１，２０００」参照）。植物種では、唯一ヒメツリガネからクローン化されている（非特許文献１６：「Ｐｌａｎｔ Ｊ．３１，ｐ２５５，２００２」参照）。
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、スフィンゴ脂質の長鎖飽和アシル鎖合成に関与するＥＬＯ２蛋白及びＥＬＯ３蛋白が存在し（非特許文献１７：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐ１７３７６，１９９７」参照）、Δ６鎖長延長酵素のアミノ酸配列は、これらと相同性を示す。一方、植物には、別タイプの脂肪酸鎖長延長酵素であるβ−ケトアシルＣｏＡ合成酵素（ＫＣＳ）が存在する。この酵素は、長鎖飽和／一価不飽和脂肪酸の鎖長延長を触媒する（非特許文献１５及び非特許文献１８：「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７，ｐ３０９，１９９５」参照）。しかしながら、Δ６鎖長延長酵素遺伝子及び酵母ＥＬＯ２／ＥＬＯ３遺伝子は、ＫＣＳ遺伝子との直接的な進化上の関係は見られない（非特許文献１５及び１６参照）。
Δ５不飽和化酵素の遺伝子は、糸状菌から、初めてクローン化された（非特許文献１９：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ２９３６０，１９９８」、非特許文献２０：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ１９０５５」参照）。Δ５不飽和化酵素の構造はΔ６不飽和化酵素と共通しており、Ｎ末端にシトクロムｂ５ドメインを有する。Δ５不飽和化酵素遺伝子は、ケイ藻、線虫、ラット、ヒト、ヒメツリガネゴケなどからクローン化されている（非特許文献１，非特許文献２１：「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３９，ｐ２１５，１９９８」、非特許文献２２：「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３９１，ｐ８，２００１」、非特許文献２３：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐ３７３３５，１９９９」、非特許文献２４：「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３５１１５，２００３」参照）。
陸上植物は、コケ植物（コケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ））、シダ植物、裸子植物及び被子植物から構成されている。コケ植物は陸上植物の中で最も古くに分岐した群であり、セン類（セン類網（Ｂｒｙｏｓｉｄａ））、タイ類（タイ類網（Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｓｉｄａ））及びツノゴケ類の３つのグループから構成されている。ゼニゴケは、上記生物のうちヒメツリガネゴケに分類上最も近いが、ヒメツリゴケはセン類に属しており、ゼニゴケはタイ類網の中のゼニゴケ亞網（Ｍａｒｃｈａｎｔｉｉｄａｅ）に属している。上記３つのグループは、約４億３千年前には、すでに分岐していたことは確かである。したがって、同じコケといっても、ヒメツリガネゴケとゼニゴケとは、例えば２億年前に分化したシロイナズナとイネとの違いどころでなく、進化上大きく異なる（非特許文献２５：「１１０３６１５１４３９６８＿０．ｈｔｍｌ」参照）。
ゼニゴケ由来の高度不飽和脂肪酸合成系酵素遺伝子としては、上記のＫＣＳ様の鎖長延長酵素遺伝子のＭｐＦＡＥ２及びＭｐＦＡＥ３が取得されている（非特許文献２６：「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３」、非特許文献２７：「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ１６６７，２００３」参照）。しかしながら、ＭｐＦＡＥ２及びＭｐＦＡＥ３はΔ６鎖長延長酵素遺伝子ではない。
上述のように、多くの高度不飽和脂肪酸合成系酵素遺伝子が様々な生物種からクローン化されているが、アラキドン酸、ＥＰＡ等の、Ｃ２０以上で不飽和度４以上の高度不飽和脂肪酸を植物中で生産させた例は少ない。このような例として、ケイ藻由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子及びΔ５不飽和化酵素遺伝子と、ヒメツリガネゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素遺伝子とをアマで発現させ、アラキドン酸及びＥＰＡを生産させた報告があるが、その詳細は不明である（非特許文献２４参照）。
上述のように、アラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸の生産は、培養微生物又は魚油からの抽出により生産されているため、生産コストが高いこと、エネルギー使用量・廃棄物量が多くなること、魚資源が限られていること等の問題点を有している。アラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸は、分子内に二重結合を複数有するというユニークな物性を持っているため、様々な工業用途（例えばフィルム、生分解性プラスチック、機能性繊維、潤滑油、洗剤の素材等）にも利用可能となる。このような高度不飽和脂肪酸を遺伝子組み換え植物により生産することにより、生産コストを低減でき、同時に、より環境にやさしい生産プロセスを実現することができると期待される。遺伝子組み換え技術を用いて、これらの高度不飽和脂肪酸を、油糧植物で大量生産できるようになれば、安価な多目的原料として非常に有用である。
一方、植物に異種生物の遺伝子を発現させる場合、その遺伝子が植物内でどの程度良好に機能するかは、転写、翻訳、その後の修飾などの過程があるため、予想することは困難である。特に、複数の異種生物の遺伝子を発現させる場合、上記非特許文献２４のように異なる生物種由来の複数の遺伝子を発現させるより、同一の種に由来する複数の遺伝子を発現させるほうが植物内で良好に機能することが予想される。また、最初の陸上植物であるコケ類のゼニゴケは、高等植物のモデル系として注目されており、その遺伝子は植物内で良好に機能することが期待できる。したがって、ゼニゴケ由来の高度不飽和脂肪酸合成酵素遺伝子、すなわちΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子を取得することができれば、これらの遺伝子を植物に導入することにより、アラキドン酸やＥＰＡが植物内で効率よく蓄積されることが期待できる。
また、ゼニゴケと同じコケ植物のヒメツリガネゴケからはΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子がクローン化されているが、ゼニゴケとヒメツリガネゴケは進化上大きく異なっており、ヒメツリガネゴケの遺伝子に基づいてゼニゴケの遺伝子を取得することは、現在の技術水準をもってしても容易にできることではない。
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、高等植物中でアラキドン酸やＥＰＡを生産し得る、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来の不飽和脂肪酸合成酵素遺伝子、すなわちΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子、及びその利用法を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来のｃＤＮＡクローンから、上記Δ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素及びΔ６鎖長延長酵素をコードする遺伝子を同定し、更にこれらの遺伝子をメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に導入して発現させることに成功し、これらの遺伝子を発現させたたんぱく質が、それぞれΔ６不飽和化、Δ５不飽和化及びΔ６鎖長延長の酵素活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子。
（２）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
（３）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
（４）Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
（５）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子。
（６）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
（７）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
（８）Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
（９）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部、あるいは当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子。
（１０）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
（１１）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を有する遺伝子。（ｂ）配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
（１２）Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子。（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質、（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
（１３）上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子によってコードされるたんぱく質。
（１４）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質。
（１５）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質。
（１６）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質。
（１７）上記（１３）〜（１６）の何れかに記載のたんぱく質を認識する抗体。
（１８）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
（１９）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
（２０）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子が発現可能に導入された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織。
（２１）少なくとも上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子が発現可能に導入され、脂肪酸組成が改変された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織。
（２２）上記（２０）又は（２１）に記載の植物体の繁殖材料。
（２３）上記（２１）に記載の植物体又は植物体の組織を用いる脂肪酸生産方法。
（２４）上記（２３）に記載の脂肪酸生産方法により得られた、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、およびエイコサペンタエン酸から選択される少なくとも１つ含む素材。
（２５）少なくとも（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子を用いて脂肪酸組成を改変する方法。
（２６）上記（１）〜（１２）の何れかに記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
（２７）上記（１３）〜（１６）の何れかに記載のたんぱく質を用いて、当該たんぱく質を調節する遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法。
（２８）上記（２７）に記載のスクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質。
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
実施例６で用いたＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＥＬＯ１遺伝子及びＭｐＤＥＳ５遺伝子の各遺伝子の発現カセットが連結されたコンストラクトの構築手順を示す説明図である。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
以下、アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の合成経路、本発明に係る遺伝子、本発明に係るたんぱく質、本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法、並びに本発明に係る遺伝子及びたんぱく質の利用方法（有用性）の順で、本発明を詳細に説明する。
（１）アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の合成経路
アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、それぞれリノール酸及びα−リノレン酸を起点として、Δ６不飽和化、Δ６鎖長延長及びΔ５不飽和化という３つの連続した反応により、生合成されると考えられる。これらの反応は、それぞれΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素により触媒され、それぞれ、ｎ−６経路（アラキドン酸合成経路）及びｎ−３経路（ＥＰＡ合成経路）と呼ばれている。
これまでに報告されているΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及び、Δ５不飽和化酵素は、いずれもｎ−６及びｎ−３経路の両方に関与していることが示されている。すなわち、Δ６不飽和化酵素は、ｎ−６経路ではリノール酸（18:2Δ 9,12 、18は炭素数を表し、2は二重結合の数を表し、9、12は二重結合の位置を表す。以下同様である。）をγ-リノレン酸（GLA;18:3Δ 6,9,12 ）に変換し、ｎ−３経路ではα−リノレン酸（ALA; 18:3Δ 9,12,15 ）をステアリドン酸 (STA; 18:4Δ 6,9,12,15 ) に変換する。Δ６鎖長延長酵素は、ｎ−６経路ではGLAをジホモ‐γ‐リノレン酸（DGLA; 20:3Δ8,11,14）に変換し、ｎ−３経路ではSTAをエイコサテトラエン酸（ETA; 20:4Δ8,11,14,17）に変換する。Δ５不飽和化酵素は、ｎ−６経路ではDGLAをアラキドン酸（20:4Δ5,8,11,14）に、ｎ−３経路ではETAをエイコサペンタエン酸（EPA; 20:5Δ5,8,11,14,17）に変換する。
（２）本発明に係る遺伝子
〔本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子は、Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であればよい。
１．配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子。
２．配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
３．配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
４．配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列を有する遺伝子。なお、配列番号１に示される塩基配列の２５３ないし１６９８番目の塩基配列は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
５．配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
６．配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
７．配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
〔本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子は、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であればよい。
１．配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子。
２．配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
３．配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
４．配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列を有する遺伝子。なお、配列番号３に示される塩基配列の１９４ないし１０６６番目の塩基配列は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
５．配列番号３に示される塩基配列のうち、１９４ないし１０６６番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
６．配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
７．配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
〔本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子〕
本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質をコードするゼニゴケ目生物由来の遺伝子であり、以下の条件に適合する遺伝子であればよい。
１．配列番号５に示される塩基配列を有する遺伝子。
２．配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
３．配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡの一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
４．配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列を有する遺伝子。なお、配列番号５に示される塩基配列の３７５ないし１８２９番目の塩基配列は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。
５．配列番号５に示される塩基配列のうち、３７５ないし１８２９番目の塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
６．配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
７．配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同な遺伝子を取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ）が挙げられる。
上記「ゼニゴケ目生物」とは、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）に限定されるものではなく、ゼニゴケ亞網ゼニゴケ目（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）に属する生物が含まれる。これらのうち、Ｍｏｎｏｃｌｅａ ｆｏｒｓｔｅｒｉ（Ｍｏｎｏｃｌｅａｌｅｓ）、Ｃｏｒｓｉｎｉａ ｃｏｒｉａｎｄｒｉｎａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｏｘｉｍｉｔｒａ ｐａｌｅａｃｅａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃｉｏｃａｒｐｏｓ ｎａｔａｎｓ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｈｕｅｂｅｎｅｒｉａｎａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｆｌｕｉｔａｎｓ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｄｕｐｌｅｘ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｂｉｆｕｒｃａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｃｉｌｉｉｆｅｒａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｇｌａｕｃａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｓｏｒｏｃａｒｐａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｗａｒｎｓｔｏｒｆｉｉ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｍｉｃｈｅｌｉｉ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）、Ｒｉｃｃａ ｐａｐｉｌｌｏｓａ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）及びＲｉｃｃａ ｚａｃｈａｒｉａｅ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｌｅｓ）には、超長鎖長高度不飽和脂肪酸が存在することが知られている（Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２，ｐ２８１，１９９３参照）。これらの生物からΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素の遺伝子を取得することは現在の技術水準を持ってすれば容易である。例えば、近縁生物の同じ機能を有する酵素をコードする遺伝子は、クロスハイブリダイゼーションすることが一般に知られている。
本発明の遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス化合物として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明の遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
（３）本発明に係るたんぱく質
〔本発明に係るΔ６不飽和化酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ６不飽和化酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であってΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示すたんぱく質であればよい。
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ６不飽和化酵素遺伝子によってコードされるたんぱく質。
２．配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
３．配列番号２に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
〔本発明に係るΔ６鎖長延長酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ６鎖長延長酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であってΔ６脂肪酸鎖長延長活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示すたんぱく質であればよい。
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ６鎖長延長酵素遺伝子によってコードされるたんぱく質。
２．配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
３．配列番号４に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
〔本発明に係るΔ５不飽和化酵素たんぱく質〕
本発明に係るΔ５不飽和化酵素たんぱく質は、ゼニゴケ目生物由来のたんぱく質であってΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質であればよい。より具体的には、以下に示すたんぱく質であればよい。
１．上記（２）に記載した本発明に係るΔ５不飽和化酵素遺伝子によってコードされるたんぱく質。
２．配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質。
３．配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質。
上記「Δ６脂肪酸不飽和化活性」とは、リノール酸又はα−リノレン酸に対して基質特異性を有し、それぞれγ−リノレン酸又はステアリドン酸に変換する作用を意味する。また、上記「Δ６脂肪酸鎖長延長活性」とは、γ−リノレン酸又はステアリドン酸に対して基質特異性を有し、それぞれジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサテトラエン酸に変換する作用を意味する。また、上記「Δ５脂肪酸不飽和化活性」とは、ジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサテトラエン酸に対して基質特異性を有し、それぞれアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）に変換する作用を意味する。
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異たんぱく質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このような変異たんぱく質は、公知の変異たんぱく質作製法により人為的に導入された変異を有するたんぱく質に限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異たんぱく質を単離精製したものであってもよい。
なお、本発明のたんぱく質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合たんぱく質であってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
また、本発明のたんぱく質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明のたんぱく質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
また、本発明のたんぱく質は、前述した本発明の遺伝子（本発明のたんぱく質をコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのたんぱく質を細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、本発明のたんぱく質は、他のたんぱく質とつながった融合たんぱく質であってもよい。さらに本発明のたんぱく質は、化学合成されたものであってもよい。
（４）本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法
本発明に係るたんぱく質及び遺伝子の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
〔たんぱく質の取得方法〕
本発明のたんぱく質を取得する方法（生産方法）は、上述したように特に限定されるものではないが、まず、本発明のたんぱく質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法で細胞や組織から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。
また、本発明のたんぱく質を取得する方法として、遺伝子組み換え技術等を用いる方法も挙げられる。この場合、例えば、本発明の遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記たんぱく質を精製するという方法などを採用することができる。
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたたんぱく質を精製する方法は、用いた宿主、たんぱく質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のたんぱく質を精製することが可能である。
変異たんぱく質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異たんぱく質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異たんぱく質作製法を用いることができる。変異たんぱく質の作製には市販のキットを利用してもよい。
本発明のたんぱく質の取得方法は上述の方法限定されることはなく、例えば、化学合成されたものであってもよい。例えば、無細胞系のたんぱく質合成液を利用して本発明の遺伝子から本発明のたんぱく質を合成してもよい。
〔遺伝子の取得方法〕
本発明の遺伝子を取得する方法（生産方法）も特に限定されるものではないが、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（サブトラクションクローニング）を利用する方法を挙げることができる。この方法では、公知の技術に従って、試験管内での直接的ハイブリダイゼーションを繰り返し、目的のｃＤＮＡ（本発明の遺伝子）を濃縮すればよい。
上記ディファレンシャルスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。これによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明の遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、本発明の遺伝子を取得する方法として、公知の技術により、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明の遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。
また、上記プローブの配列を、上述したゼニゴケ間で良好に保存されている領域の中から選択し、他のゼニゴケのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記たんぱく質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる。
あるいは、本発明の遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明の遺伝子のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
（５）本発明に係る遺伝子及びたんぱく質の利用方法（有用性）
（５−１）組換え発現ベクター
本発明に係る組換え発現ベクターは、前記（２）に記載した本発明に係る遺伝子を含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明の遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明のたんぱく質を融合たんぱく質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱく質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明のたんぱく質をＧＦＰ融合たんぱく質として発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソ−ム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のたんぱく質を昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を採用することができる。
（５−２）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、前記（２）に記載した本発明に係る遺伝子導入された形質転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換え発現ベクターをホスト細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記ホスト細胞で例示した各種微生物や動物を挙げることができる。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子が発現可能に導入された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織の組織であることが好ましい。このような形質転換植物により、低コストかつ環境にやさしい生産プロセスでアラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸を生産することができる。
ここで「遺伝子が発現可能に導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。
植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に限定しない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることができる。なお、この植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
植物細胞への組み換え発現ベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
例えば、タバコにおいて形質転換植物体を作出する手法については、形質転換したアグロバクテリウムをタバコリーフディスクに感染させる方法、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子を導入し植物体に再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立されている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
また、タバコは、シロイヌナズナと並んで遺伝子工学的手法を用いる植物育種のモデル植物である。このタバコにおいて、アラキドン酸やＥＰＡの含量が増加した形質転換体を取得できるということは、植物全般において形質転換体を取得することができるといっても過言ではない。なお、本明細書では、後述する実施例に示すように、タバコだけでなく、イネの形質転換体をも取得しており、本発明によれば、あらゆる種類の形質転換植物体を取得できることを実証している。
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子を導入し、植物体に再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立されている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
上記形質転換植物体がイネである場合、イネ内のアラキドン酸やＥＰＡの含量が増加するので、この形質転換植物体から得られる種子、すなわち、米を食べることで、容易にアラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸を、体内に摂取することが可能になる。したがって、イネの形質転換植物体は、食糧としての価値が高く、食品産業、農業分野に極めて有用である。また、現在あまり利用されていない米ぬか、モミガラ、ヒコバエ等でアラキドン酸やＥＰＡを生産すれば、ここからこれら脂肪酸を抽出することにより、健康食品の原料として有効利用できる。また、家畜の飼料としても利用できる。
ゲノム内に本発明の遺伝子が導入された形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができる。また、当該植物体、又は、その子孫、あるいは、クローンから、繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に当該植物体を量産することも可能である。したがって、本発明には、本発明の遺伝子が発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は、当該植物体の組織、あるいは、当該植物体の繁殖材料も含まれる。
また、当該植物体、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、及び、当該植物体の組織には、栄養増殖された植物体も含まれる。栄養増殖は、栄養生殖、クローン成長とも呼ばれ、挿し芽、挿し木などによる増殖が一般的であり、試験管内では、葉、茎、根などの器官からの植物体の再分化やカルスによる増殖が可能である。植物種によっては、枝の先端が特殊な冬芽を作る、腋芽が多肉化する、花がムカゴ化する、芋を形成するなどの場合がある。
さらに、本発明に係る遺伝子が発現可能に導入され、脂肪酸組成が改変された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織、当該植物体の繁殖材料も本発明に含まれる。「脂肪酸組成が改変された」とは形質転換前の植物体における脂肪酸組成と形質転換後における植物体の脂肪酸組成が異なっていることを意味する。例えば、本来脂肪酸組成にアラキドン酸やＥＰＡが含まれていなかった植物を本発明に係る遺伝子で形質転換することにより、形質転換植物の脂肪酸組成にアラキドン酸やＥＰＡが含まれる場合等を挙げることができる。
（５−３）脂肪酸生産方法
本発明には、本発明に係る遺伝子で形質転換され、脂肪酸組成が改変された植物体又は植物体の組織を用いて脂肪酸を生産する方法が含まれる。
例えば、上述のようにアラキドン酸やＥＰＡの含量が増加した本発明に係る形質転換植物から製造された食用油はアラキドン酸やＥＰＡの含量が高く、価値の高いものになる。上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、塊根等も、アラキドン酸やＥＰＡを含む食料として価値の高いものになる。
（５−４）素材
本発明には、上述の脂肪酸生産方法により得られた物質、すなわち、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸を少なくとも１つ含む素材も含まれる。この「素材」とは、上述の食料としての種子、果実、切穂、塊茎、又は、塊根の他に、工業原料用途に利用できる素材全般を意味する。
上記素材としては、例えば、アラキドン酸やＥＰＡを含む健康食品、フィルム、生分解性プラスチック、機能性繊維、潤滑油、洗剤の素材等が挙げられる。上記の不飽和脂肪酸は、分子内に二重結合を複数有するという、ユニークな物性を持つ。このため、例えば、本発明の形質転換植物体により、アラキドン酸やＥＰＡを生産させることにより、生産コストを低減できる。また、本発明により、環境にやさしい生産プロセスを実現できる。
（５−５）脂肪酸組成改変方法
本発明には、本発明に係る遺伝子を用いて脂肪酸組成を改変する方法が含まれる。例えば、上述のように本発明に係る遺伝子を導入した形質転換体を作製することによりホスト細胞の脂肪酸組成を改変することが可能となる。脂肪酸組成を改変する対象は特に限定されるものではなく、植物以外にも動物、細菌、酵母等、あらゆる生物を対象とすることが可能である。
（５−６）遺伝子検出器具
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子の少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明の遺伝子の発現パタ−ンの検出・測定などに利用することができる。
本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができる。具体的には、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）等を挙げることができる。
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィ−技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
本発明に係る遺伝子検出器具は、上記例示したＤＮＡチップに限定されるものではなく、本発明に係る遺伝子の少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いたものであればよい。
（５−７）抗体
本発明に係る抗体は、本発明に係るたんぱく質、又はその部分たんぱく質・部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクロ−ナル抗体又はモノクロ−ナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」）に記載の方法が挙げられる。このようにして得られる抗体は、本発明のたんぱく質の検出・測定などに利用できる。
（５−８）スクリーニング方法
本発明に係るスクリーニング方法は、本発明に係るたんぱく質を用いて、当該たんぱく質を調節する遺伝子、又は当該たんぱく質を調節する物質をスクリーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るたんぱく質の活性（Δ６不飽和化活性、Δ６鎖長延長活性及び／又はΔ５不飽和化活性）を促進するような物質のスクリーニングを挙げることができる。
また、本発明には、上記スクリーニング方法により得られた遺伝子又は物質も含まれる。
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本実施例において、実験手法は、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に従った。
〔実施例１：ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子の単離〕
これまでにクローニングされたΔ６不飽和化酵素のアミノ酸配列の比較により、アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ（配列番号３７）及びＴｒｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号３８）が保存されていることがわかった。そこで、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子を単離するために、上記のアミノ酸配列をコードする下記の縮退プライマーを用いた。
ｄＤ６ＤＥＳ−Ｆ ５’−ＴＧＧＴＧＧＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＡ−３’（配列番号７）
ｄＤ６ＤＥＳ−Ｒ ５’−（Ａ／Ｇ）ＴＴＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＣＣＩＣＣＩＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＡＣＣＡ−３’ （配列番号８）
（Ｉはイノシン、（）内は複数の塩基）
試料にはＥ系統ゼニゴケ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９，ｐ１７９，２０００参照）の葉状体を用いた。葉状体からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの単離については、文献（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３；Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ１６６７，２００３）に記載の方法に従った。単離したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ １．５μｌを、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲは、上記ｃＤＮＡ約１０ｎｇを鋳型とし、上記プライマー（ｄＤ６ＤＥＳ−Ｆ及びｄＤ６ＤＥＳ−Ｒ）及び酵素（Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕとを用いて、製造者の推奨する方法で行った。反応液量は２０μｌとし、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃２分間保持後、９４℃で１分間、４５℃で１．５分間、７２℃で２分間の反応を３５回繰り返し、その後４℃に冷却した。
得られたＰＣＲ産物を１％（ｗ／ｖ）アガロ−スゲルで電気泳動し、従来のΔ６不飽和化酵素のアミノ酸配列から予想されるサイズを有する増幅断片を、Ｐｒｅｐ−Ａ Ｇｅｎｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いてゲルより回収した。回収した増幅断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ社製）に連結し、大腸菌Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｍａｘ ＤＨ１０Ｂ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて得られた全クローンの塩基配列を決定し、目的のｃＤＮＡ配列をもつものを探索した。
さらに、全長ｃＤＮＡ配列を取得するために、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥを行った。これには、５’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）及び下記のプライマー（ＭｐＤＥＳ６−０２Ｒ及びＭｐＤＥＳ６−０１Ｆ）を用い、製造者の推奨する方法で行った。
ＭｐＤＥＳ６−０２Ｒ：５’−ＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号９）
ＭｐＤＥＳ６−０１Ｆ：５’−ＧＣＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号１０）
その結果、１種類のホモログ遺伝子候補が単離され、この遺伝子をＭｐＤＥＳ６遺伝子とした。単離されたＭｐＤＥＳ６遺伝子のｃＤＮＡの長さ（ポリＡ部分を除く）は、２，５２２ｂｐであり、そのコードする推定アミノ酸配列は４８１残基であった。その塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
ＭｐＤＥＳ６ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列をヒメツリガネゴケのΔ６不飽和化酵素のアミノ酸配列と比較した結果、４７．５％の同一性しか示さなかった。
〔実施例２：ゼニゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素遺伝子の単離〕
これまでにクローニングされたΔ６鎖長延長酵素のアミノ酸配列の比較により、アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号３９）及びＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４０）が保存されていることがわかった。そこで、ゼニゴケ由来のΔ６鎖長延長酵素遺伝子を単離するために、上記のアミノ酸配列をコードする下記の縮退プライマーを用いた。
ｄＤ６ＥＬＯ−Ｆ ５’−ＧＴＩＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＣＩＧＴ−３’ （配列番号１１）
ｄＤ６ＥＬＯ−Ｒ ５’−Ｃ（Ｇ／Ｔ）ＩＣＣＣＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ−３’（配列番号１２）
上記のプライマー（ｄＤ６ＥＬＯ−Ｆ及びｄＤ６ＥＬＯ−Ｒ）を用いてＰＣＲをい、得られたＤＮＡ断片をサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し、目的のｃＤＮＡ配列をもつクローンについて下記のプライマー（ＭｐＥＬＯ１−０２Ｒ及びＭｐＥＬＯ１−０１Ｆ）を用いて完全長ｃＤＮＡを取得した。なお、実験材料及び方法は、実施例１と同様である。
ＭｐＥＬＯ１−０２Ｒ：５’−ＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１３）
ＭｐＥＬＯ１−０１Ｆ：５’−ＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＣＡＣＧ−３’（配列番号１４）
その結果、１種類のホモログ遺伝子候補が単離され、この遺伝子をＭｐＥＬＯ１遺伝子とした。ＭｐＥＬＯ１遺伝子のｃＤＮＡの長さ（ポリＡ部分を除く）は、１，５５９ｂｐで、推定アミノ酸配列は２９０残基であった。その塩基配列を配列番号３、アミノ酸配列を配列番号４に示した。
ＭｐＥＬＯ１ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列をヒメツリガネゴケのΔ６鎖延長酵素のアミノ酸配列と比較した結果、同一性は６２．７％であった。
〔実施例３：ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素遺伝子の単離〕
他生物種のΔ５不飽和化酵素は、そのＮ末端にシトクロムｂ５ドメインを有する。このことから、ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素遺伝子は、Δ６不飽和化酵素遺伝子と同じく、シトクロムｂ５ドメイン融合型不飽和化酵素遺伝子ファミリーに属することが予想された。しかしながら、ケイ藻や真菌においては、Δ５不飽和化酵素及びΔ６不飽和化酵素間のアミノ酸配列レベルでの相同性は非常に低い。そこで、糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）のΔ５不飽和化酵素及びΔ６不飽和化酵素間のアミノ酸配列を比較した結果、縮退プライマー設計に最低限必要な４から５残基程度の連続した保存配列が局所的に存在することを見出した。驚くべきことに、これらの保存配列は、異種のΔ５不飽和化酵素のアミノ酸配列間より、同種内のΔ５不飽和化酵素とΔ６不飽和化酵素との間で、より保存されていることを見出した。このことから、シトクロムｂ５ドメイン融合型不飽和化酵素遺伝子には、種特異的な保存配列が存在する場合があると考えられた。そこで、上述のＭｐＤＥＳ６と、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５９，ｐ９８１，２００１に記載されている機能未知のＭｐＤＥＳとで、塩基配列を鋭意比較検討した結果、２箇所のアミノ酸配列（Ｉ（Ｅ／Ｎ）（Ｇ／Ｄ）ＫＶＹＤＶ（配列番号４１）、及び、ＤＰＤＩ（Ｑ／Ｄ）（Ｙ／Ｔ）（Ｍ／Ｖ）Ｐ（配列番号４２））のアミノ酸配列が保存されていることを見出した。それぞれのアミノ酸配列に対応する縮退プライマーの配列を次に示す。
ｄＤ５ＤＥＳ−Ｆ ５’−ＡＴ（Ａ／Ｔ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）ＡＩＧ（Ａ／Ｇ）ＩＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＩＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ−３’（配列番号１５）
ｄＤ５ＤＥＳ−Ｒ ５’−ＧＧＩＡ（Ｔ／Ｃ）Ｉ（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＩＴ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣＩＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣ−３’（配列番号１６）
上記プライマー（ｄＤ５ＤＥＳ−Ｆ及びｄＤ５ＤＥＳ−Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をサブクローニングした。得られたクローンの塩基配列を決定し、目的のｃＤＮＡ配列をもつクローンについて下記のプライマー（ＭｐＤＥＳ５−０２Ｒ及びＭｐＤＥＳ５−０１Ｆ）を用いて完全長ｃＤＮＡを取得した。なお、実験材料及び方法は、実施例１と同様である。
ＭｐＤＥＳ５−０２Ｒ：５’−ＧＴＧＴＧＴＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＴＡＣＣ−３’（配列番号１７）
ＭｐＤＥＳ５−０１Ｆ：５’−ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１８）
その結果、ゼニゴケ由来のΔ５不飽和化酵素遺伝子の候補として、２種類の長さの異なるクローンｃ１及びｃ２を単離した（ｃ１：２，４２７ｂｐ、ｃ２：２，２８５ｂｐ）。ｃ１とｃ２との塩基配列を比較したところ、５’非翻訳領域で、オルタナティブ・スプライシング（選択的スプライシング）が起こっていることが明らかとなった。オルタナティブ・スプライシングによる読み枠の変化はなく、いずれのクローンも４８４個のアミノ酸をコードしていた（配列番号６）。以下、２，４２７ｂｐの長さのクローンｃ１をＭｐＤＥＳ５遺伝子（配列番号５）とし、以下の実施例に用いた。
ＭｐＤＥＳ５ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を糸状菌（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）のΔ５不飽和化酵素のアミノ酸配列と比較した結果、３１．４％の同一性であった。ゼニゴケと近縁なヒメツリガネゴケのΔ５不飽和化酵素に関しては、配列情報が公表されていないため、ここでは比較を行わなかった。
〔実施例４：メタノール資化性酵母（Pichia pastoris）を用いた機能解析〕
ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５のｃＤＮＡの機能を調べるために、まず個々のＯＲＦを、メタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１の下流に配置したコンストラクトを作製した。これらのコンストラクトをメタノール資化性酵母（Pichia pastoris）に導入し、その脂肪酸組成を解析した。ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１、及び、ＭｐＤＥＳ５のｃＤＮＡ塩基配列のＯＲＦ部分を、下記のプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。
（ＭｐＤＥＳ６ＯＲＦ増幅用プライマー）
MpD6‐17F: 5’‐GGAATTCGCGATGGCCTCGTCCACCACCAC‐3’ （配列番号１９）
MpD6‐18F: 5’‐GGAATTCTACTTTCGCAGCGTATGCTACC‐3’ （配列番号２０）
（ＭｐＥＬＯ１ＯＲＦ増幅用プライマー）
MpD6ELO1‐15F: 5’‐GGAATTCGCGATGGAGGCGTACGAGATGG‐3’ （配列番号２１）
MpD6ELO1‐16F: 5’‐GGAATTCTTCTGCCTTTTTGCTCTTGATC‐3’ （配列番号２２）
（ＭｐＤＥＳ５ＯＲＦ増幅用プライマー）
MpD5‐11F: 5’ ‐GTTGAATTCGACAGTTATGCCGCCACACGC‐3’ （配列番号２３）
MpD5‐12R: 5’ ‐GTTGAATTCAGGCCCAAAGCATGCTGTCAC‐3’ （配列番号２４）
これらのプライマーは、下線で示したＥｃｏＲＩ認識配列を含んでおり、これを以下のクローニングに利用した。また、ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って反応液量２０μｌで行った。反応条件は、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られた各ＯＲＦ断片をＥｃｏＲＩで消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行った。そして、メタノール資化性酵母の発現ベクターｐＰＩＣＺＡ（マーカー：ゼオシン耐性遺伝子，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内のメタノール誘導性プロモーター５’ＡＯＸ１下流のＥｃｏＲＩ部位にセンス方向に連結した。
各々の発現コンストラクト及び対照としてのｐＰＩＣＺＡベクターを、Ｐｉｃｈｉａ ＥａｓｙＣｏｍｐ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてメタノール資化性酵母のＰＰＹ１系統に導入し、ゼオシン耐性をマーカーとして形質転換体を取得した。なお、メタノール資化性酵母は、Δ６不飽和化酵素の基質であるリノール酸とα−リノレン酸を合成することができるが、アラキドン酸やＥＰＡのその他の前駆体を合成することはできない。
導入した遺伝子を発現させるため、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、当該キットの推奨する方法に従いて、各形質転換体を１．０％グリセロールのみを炭素源とする最小培地中でＯＤ（６００ｎｍ）が０．５になるまで培養した後、０．５％メタノールのみを炭素源とする最小培地中で３０℃、３日間、飽和状態になるまで培養した。その後、各々の形質転換体の脂肪酸組成を、ＧＣ−ＭＳを用いて公知の方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，ｐ６０５，２００３）により測定した。
ＭｐＤＥＳ６遺伝子を発現させた形質転換体では、Δ６不飽和化酵素の反応産物であるγ-リノレン酸及びステアリドン酸が、全脂肪酸のそれぞれ７．４％及び０．７％新たに検出された。対照としてpPICZAベクターを導入した酵母ではこれらは検出されなかった。以上のことから、ＭｐＤＥＳ６はΔ６不飽和化酵素をコードしていることが示された。
ＭｐＥＬＯ１遺伝子を発現させた形質転換体では、γ-リノレン酸を添加した場合にジホモ-γ-リノレン酸が全脂肪酸の１４．１％、ステアリドン酸を添加した場合にエイコサテトラエン酸が１．５％新たに検出された。対照としてpPICZAベクターを導入した酵母では、これらは検出されなかった。以上のことから、ＭｐＥＬＯ１はΔ６鎖長延長酵素をコードしていることが示された。
ＭｐＤＥＳ５遺伝子を発現させた形質転換体では、ジホモ-γ-リノレン酸を添加した場合にアラキドン酸が全脂肪酸の１．１％、エイコサテトラエン酸を添加した場合にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が０．１％検出された。対照としてpPICZAベクターを導入した酵母ではこれらは検出されなかった。以上から、ＭｐＤＥＳ５は、Δ５不飽和化酵素をコードすることが示された。
以上のようにゼニゴケから、Δ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素をコードする遺伝子として、それぞれＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５を取得することができた。
〔実施例５：メタノール資化性酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるゼニゴケ高度不飽和脂肪酸生合成系の再構成〕
ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５を共発現させるために、上記実施例４で作製した、ＥｃｏＲＩ消化したＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５のＯＲＦ増幅断片を、各々別のメタノール資化性酵母発現ベクターｐＰＩＣ３Ｋ（マーカー：ＨＩＳ４遺伝子、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製社）及びｐＰＩＣ６Ａ（マーカー：ブラスチシジン耐性遺伝子、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製社）の５’ＡＯＸ１プロモーター下流のＥｃｏＲＩ部位にセンス方向に連結した。また、ＭｐＤＥＳ６に関しては、実施例４で作製した発現ベクターを用いた。以下各発現ベクターを、それぞれｐＰＩＣＺＡ−ＭｐＤＥＳ６、ｐＰＩＣ３Ｋ−ＭｐＥＬＯ１及びｐＰＩＣ６Ａ−ＭｐＤＥＳ５と表記する。
まず、pPICZA-MpDES6、又は、対照としてのpPICZAベクターのみを、上記実施例４で用いたメタノール資化性酵母PPY1系統と同じ脂肪酸組成を持つメタノール資化性酵母PPY1２系統（his4,arg4）に形質転換し、ゼオシン耐性をマーカーにして形質転換体を取得した。続いて、pPIC３Ｋ-MpEＬO１、又は、対照としてのpPIC３Ｋベクターのみを、それぞれ、pPICZA-MpDES6、又はpPICZAのみがゲノム中に組み込まれた形質転換体に導入し、ヒスチジン合成能をマーカーにして形質転換体を取得した。最後に、pPIC６A-MpDES5、又は、対照としてのpPIC６Ａベクターのみを、pPICZA-MpDES6及びpPIC３Ｋ-MpEＬO１又はpPICZA及びpPIC３Ｋがゲノム中に組み込まれた上記形質転換体に導入し、ブラスチシジン耐性をマーカーとして形質転換体を取得した。
得られた２種類又は３種類の遺伝子が導入された形質転換体を用いて、ゼニゴケのアラキドン酸／ＥＰＡ生合成系の再構成実験を行った。まず、上記２種類の遺伝子（MpDES6及びMpELO1）を導入した。形質転換体を用いて、ＭｐＤＥＳ６遺伝子及びＭｐＥＬＯ１遺伝子をメタノール資化性酵母内で共発現させた。その結果、Δ６不飽和化反応産物であるγ-リノレン酸（全脂肪酸の2.9％）及びステアリドン酸（全脂肪酸の0.4％）に加え、それらの鎖長延長反応産物であるジホモ-γ-リノレン酸（全脂肪酸の2.8％）及びエイコサテトラエン酸（全脂肪酸の0.2％）が生じた。対照とした形質転換体では、これらの脂肪酸は検出されなかった。上記形質転換体に、さらにＭｐＤＥＳ５を導入した形質転換体では、γ-リノレン酸（全脂肪酸の2.8％）、ステアリドン酸（全脂肪酸の0.5％）、ジホモ-γ-リノレン酸（全脂肪酸の1.5％）及びエイコサテトラエン酸（全脂肪酸の0.1％）の４種の脂肪酸に加えて、アラキドン酸(全脂肪酸の0.1％)及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、全脂肪酸の0.03％）の生成が認められた。対照とした形質転換体では、これらの脂肪酸は検出されなかった。この結果から、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素、Δ６鎖長延長酵素及びΔ５不飽和化酵素の遺伝子を発現させることで、ゼニゴケ以外の生物種においても、高度不飽和脂肪酸生合成系の再構築が可能であることが示された。
〔実施例６：イネに導入するベクターの構築及び当該ベクターのイネへの導入〕
イネにおいて、ＭｐＤＥＳ６、ＭｐＥＬＯ１及びＭｐＤＥＳ５遺伝子を発現させるために、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に示す手順で発現コンストラクトを作製した。また、作製手順を図１に示した。
（ｉ）ｐＢＩ２２１（ＴＯＹＯＢＯ社製）のカリフラワ−モザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、及び、ＮＯＳターミネーター間に設計した以下のプライマーを用いたＰＣＲにより、β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）遺伝子部分を除いた発現ベクターｐ３５Ｓ−ＮＯＳを作製した。
ＭＫ００１（Ｆ）：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣ−３’（配列番号２５）
ＭＫ００２（Ｒ）：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧ−３’（配列番号２６）
なお、プライマーＭＫ００１（Ｆ）は下線で示すＢａｍＨＩ認識配列を含み、ＧＵＳ遺伝子の３’末端にアニールし、プライマーＭＫ００２（Ｒ）はＧＵＳ遺伝子の５’末端にアニールする（ＢａｍＨＩサイトがアニール部位の上流に存在する）。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って反応液量５０μｌで行った。反応条件は、９６℃５分間保持後、９４℃で３０秒間、６８℃で４分間の反応を３０回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られた各ＯＲＦ断片をＢａｍＨＩ消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行った後、自己連結させた。
（ｉｉ）次にｐ３５Ｓ−ＮＯＳのＸｂａＩサイトに、ＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＥＬＯ１遺伝子及びＭｐＤＥＳ５遺伝子のＯＲＦを各々連結した。ＯＲＦ増幅には、下線で示すＸｂａＩ認識配列を含む以下のプライマーを用いた。
（ＭｐＤＥＳ６ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６−２１Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２７）
ＭｐＤ６−１１Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＴＧＣ−３’（配列番号２８）
（ＭｐＥＬＯ１ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１８Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号２９）
ＭｐＤ６ＥＬＯ１−１３Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣ−３’ （配列番号３０）
（ＭｐＤＥＳ５ ＯＲＦ増幅用プライマー）
ＭｐＤ５−２２Ｆ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号３１）
ＭｐＤ５−２３Ｒ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣ−３’（配列番号３２）
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られた各ＯＲＦ断片をＸｂａＩで消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行いクローニングに用いた。
（ｉｉｉ）得られた各遺伝子の発現コンストラクト（それぞれをｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６、ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５と表記する）がいずれもＣａＭＶ３５Ｓプロモーター５’末端にＰｓｔＩサイトを、ＮＯＳターミネーター３’末端にＥｃｏＲＩサイトを持つことを利用して、上記３遺伝子の発現カセットを連結した。まず、以下に示すプライマーを用いてｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５を鋳型としてＰＣＲを行い、ＭｐＤＥＳ５遺伝子の発現カセット部分を増幅し、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター５’末端にあるＰｓｔＩサイトにクローニングした（図１参照）。
（ＭｐＤＥＳ５ 遺伝子発現カセット増幅用プライマー）
Ｍ１３Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号３３）
ＮＯＳ−Ｒ４−ＰＳＴ：５’−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧ−３’（配列番号３４）
なお、Ｍ１３Ｒプライマーは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター上流のベクター配列にアニールする。また、ＮＯＳ−Ｒ４−ＰＳＴプライマーは、下線で示すＰｓｔＩ認識配列を含み、ＮＯＳターミネーター３’末端にアニールする。同じくＮＯＳターミネーター３’末端に存在するＥｃｏＲＩサイトは含まない。
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られたＤＮＡ断片をＰｓｔＩで消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行い、ＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カセットを含むプラスミド（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６）のＰｓｔＩサイトにクローニングした。
（ｉｖ）上記で得られた、ＭｐＤＥＳ５及びＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カセットを連結させたコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６と表記する）に、さらにＭｐＥＬＯ１遺伝子の発現カセットを連結した。以下のプライマーを用いてｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１を鋳型としてＰＣＲを行い、ＭｐＥＬＯ１遺伝子の発現カセット部分を増幅し、ＭｐＤＥＳ６遺伝子発現カセット内のＮＯＳターミネーター３’末端にあるＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。
（ＭｐＥＬＯ１ 遺伝子発現カセット増幅用プライマー）
３５Ｓ−Ｆ３−ＥＩ：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＡ−３’（配列番号３５）
Ｍ１３Ｆ：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’ （配列番号３６）
なお、３５Ｓ−Ｆ３−ＥＩプライマーは、下線で示すＥｃｏＲＩ認識配列を含み、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５’末端にアニールする。また、Ｍ１３ＦプライマーはＮＯＳターミネーター下流のベクター配列にアニールする。
ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）０．５Ｕを用い、製造者の推奨する方法に従って、反応液量２０μｌで行った。反応条件は、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２５回繰り返し、その後４℃に冷却した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した後、実施例１に記載の方法でゲル精製を行い、ＭｐＤＥＳ５及びＭｐＤＥＳ６遺伝子の発現カセットを連結させたコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
以上の操作により、３遺伝子の発現カセットが、ＭｐＤＥＳ５，ＭｐＤＥＳ６，ＭｐＥＬＯ１の順で連結した発現コンストラクト（ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５／３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６／ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１）を作製した。
このようにして得られた上記コンストラクトを、公知の方法（Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７３，ｐ２１９，１９９８）で、ビアラフォスを選抜マーカーとして持つプラスミドとともに、パーティクルガンでイネに導入し、形質転換イネを取得した。
〔実施例７：タバコ（N. tabacum SR-1）におけるゼニゴケ高度不飽和脂肪酸合成系の再構成〕
本実施例では、上述のゼニゴケ由来の不飽和脂肪酸合成酵素遺伝子、すなわち、ＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、およびＭｐＥＬＯ１遺伝子が、植物体中で良好に機能することを確認した。
具体的には、タバコにＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、およびＭｐＥＬＯ１遺伝子を導入し、このタバコ中でアラキドン酸等が生産されることを確認した。比較対照として、糸状菌（M.alpina）由来のΔ６不飽和化酵素遺伝子（ＭａＤＥＳ６）、Δ５不飽和化酵素遺伝子（ＭａＤＥＳ５）、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素（ＭａＥＬＯ）の３遺伝子を導入したタバコを作製した。
（ｉ）糸状菌由来遺伝子を含むベクター（ｐＳＰＢ１５１９）の構築
ｐＥ２１１３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９ １９９６）は、エンハンサー配列の繰り返しを有するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅｌ２３５Ｓ）プロモーター、および、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターを有する。
ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化した後、ＸｈｏＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することで、プラスミドを作製した。このプラスミドをＳａｃＩで消化後、平滑末端化し、さらにＢａｍＨＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することによって、ｐＵＥ７を作製した。ｐＵＥ７をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化することによって得られるＤＮＡ断片のうちＥｌ２３５Ｓプロモーターを有する断片と、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，ｐ２８８，１９９５）とを連結することで、ｐＳＰＢ５０５を作製した。
一方、ＭａＤＥＳ６遺伝子を含むプラスミドであるｐＭＬＤ１０１をＸｈｏＩで消化後、さらにＢａｍＨＩで部分消化することで、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片と、ｐＳＰＢ５０５をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して得られるバイナリーベクター部分のＤＮＡ断片とを連結することで、ｐＳＰＢ５５９を作製した。
ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，ｐ２８８，１９９５）をＡｓｃＩで消化した後平滑末端化し、ＰａｃＩリンカーと連結することで、ｐＵＣＡＰＰを作製した。
ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化した後、ＢａｍＨＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することで、ｐＵＥ６を作製した。ｐＵＥ６をＳａｃＩで消化した後、平滑末端化し、ＳａｌＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ社）と連結することで、ｐＵＥ８を作製した。ｐＵＥ８をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片のうちＥｌ２３５Ｓプロモーターを有する断片を、ｐＵＣＡＰＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入することで、プラスミドを作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ＭａＥＬＯ遺伝子のｃＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して得られたＤＮＡ断片とを連結し、ｐＳＰＢ１１３０を作製した。ｐＳＰＢ１１３０をＰａｃＩで消化し、得られる約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＢＩＮＰＬＵＳのＰａｃＩサイトに挿入した。ＭａＥＬＯ遺伝子の転写方向と、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上のｎｐｔＩＩ遺伝子の転写方向とが、同じ向きになっているプラスミドを選択し、そのプラスミドをｐＳＰＢ１１５７Ｐとした。
また、上述したｐＳＰＢ５５９をＰａｃＩで消化した後、平滑末端化し、ＡｓｃＩリンカーと連結することで、ｐＳＰＢ５５９Ａを作製した。そして、ｐＳＰＢ５５９ＡをＡｓｃＩで消化して得られるＭａＤＥＳ６遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＳＰＢ１１５７ＰのＡｓｃＩサイトに挿入することで、ｐＳＰＢ１１５７を作製した。
ｐＣＧＰ１３６４（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３，１９９５）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＣＧＰ１３６４をＰｓｔＩで消化し、平滑末端化した後さらにＳａｃＩＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＵＣＡＰＡをＳａｃＩで消化し、平滑末端化した後さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる約２．７ｋｂのＤＮＡ断片とを連結することにより、ｐＳＰＢ１８４を得た。
一方、ＭａＤＥＳ５遺伝子がサブクローニングされたｐＣＲＩＩベクターから、ＸｂａＩとＫｐｎＩによる消化によってＭａＤＥＳ５遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出した。このＤＮＡ断片と、上述のｐＳＰＢ１８４をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られたＤＮＡ断片とを連結することで、ｐＳＰＢ１５１９Ａを作製した。ｐＳＰＢ１５１９ＡをＡｓｃＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＰＢ１１５７のＡｓｃＩサイトに挿入し、ｐＳＰＢ１５１９を作製した。このｐＳＰＢ１５１９上で、ＭａＤＥＳ６遺伝子、ＭａＤＥＳ５遺伝子、およびＭａＥＬＯ遺伝子は、同じ向きに転写され、同じ構成的プロモーターの制御下にある。
（ｉｉ）ゼニゴケ由来遺伝子のベクター（ｐＳＰＢ２３６８）の構築
ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）をＡｓｃＩで消化した後ＳｇｆＩリンカーと連結し、さらに、ＰａｃＩで消化した後ＦｓｅＩリンカーと連結することで、ｐＵＣＳＡＰＦを作製した。また、ｐＢＩＮＰＬＵＳにも同様の処理を施し、ｐＢＩＮＳＡＰＦを作製した。
他にサブクローニング用のベクターとして、ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ＰａｃＩリンカーと連結し、さらにＥｃｏＲＩで消化した後ＦｓｅＩリンカーと連結することで、ｐＵＣＰＦを作製した。また、ｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後ＳｇｆＩリンカーと連結し、さらに、ＥｃｏＲＩで消化した後ＡｓｃＩリンカーと連結することで、ｐＵＣＳＡを作製した。ｐＵＣＳＡＰＦのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ間にＥｌ２３５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ間にマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターをそれぞれ挿入したベクターを、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化した後、末端を平滑化することで、ｐＳＰＢ２３５３Ａを得た。ｐＳＰＢ２３５３Ａの平滑末端に、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ６からＸｂａＩで切り出して末端を平滑化したＭｐＤＥＳ６遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結し、ｐＳＰＢ２３５３作製した。
ｐＵＣＳＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ間にＥｌ２３５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ間にマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターをそれぞれ挿入したベクターを、ＸｂａＩ、ＳａｃＩで消化することで、ｐＳＰＢ２３５５Ａを作製した。
一方、ｐ３５Ｓ−ＭｐＥＬＯ１を鋳型として、下記のプライマー、ＸｂａＭｐＥＬＯｆおよびＳａｃＭｐＥＬＯｒを用いてＰＣＲを行った。
ＸｂａＭｐＥＬＯｆ：５‘−ＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧ−３’（配列番号４３）
ＳａｃＭｐＥＬＯｒ：５‘−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号４４）
ＰＣＲには、酵素として高精度なＫＯＤ＋ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を用い、９４℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒、６８℃で１−３分のサイクルを２５回繰り返した。このようにして調製されたＭｐＥＬＯ１ＤＮＡ断片をＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化したものを、上述のｐＳＰＢ２３５５Ａに連結し、ｐＳＰＢ２３５５を作製した。さらに、ｐＳＰＢ２３５５をＳｇｆＩ、ＡｓｃＩで消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｇｆＩおよびＡｓｃＩで消化したｐＳＰＢ２３５３に連結し、ｐＳＰＢ２３６１を作製した。
ｐＵＣＰＦのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイトにＥｌ２３５Ｓを、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩサイトにマノピン合成酵素（ｍａｓ）遺伝子ターミネーターをそれぞれ挿入したベクターを、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化することで、ｐＳＰＢ２３５２Ａを作製した。
一方、ｐ３５Ｓ−ＭｐＤＥＳ５を鋳型に、下記のプライマー、ＸｂａＭｐＤ５ｆおよびＳａｃＭｐＤ５ｒを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、上記のＰＣＲ条件と同様である。
ＸｂａＭｐＤ５ｆ：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＣＣＣ−３’（配列番号４５）
ＳａｃＭｐＤ５ｒ：５’−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＧＴ−３’ （配列番号４６）
ＰＣＲによって調製されたＭｐＤ５ＤＮＡ断片をＸｂａＩ、ＳａｃＩで消化したものを、ｐＳＰＢ２３５２Ａに連結し、ｐＳＰＢ２３５２を作製した。
ｐＢＩＮＳＡＰＦをＰａｃＩおよびＦｓｅＩで消化して得られたＤＮＡ断片に、ｐＳＰＢ２３５２よりＰａｃＩおよびＦｓｅＩで切り出したＭｐＤＥＳ５遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結し、ｐＳＰＢ２３６８Ａを作製した。さらにｐＳＰＢ２３６８ＡをＳｇｆＩおよびＰａｃＩで消化したものに、ｐＳＰＢ２３６１よりＳｇｆＩおよびＰａｃＩで切り出されたＭｐＤＥＳ６遺伝子およびＭｐＥＬＯ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結することで、ｐＳＰＢ２３６８を得た。このプラスミド上でＭｐＤＥＳ６遺伝子、ＭｐＤＥＳ５遺伝子、およびＭｐＥＬＯ１遺伝子は、同じ向きに転写され、同じ構成的プロモーターの制御下にある。
（ｉｉｉ）タバコへの遺伝子導入
引き続いて、公知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８１，１９９４）に基づいて、ｐＳＰＢ２３６８またはｐＳＰＢ１５１９を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（菌株：ＡｇｌＯ（Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９６３−９６７））を形質転換した。このｐＳＰＢ２３６８またはｐＳＰＢ１５１９を有する形質転換体アグロバクテリウムを、タバコリーフディスクに感染させた。このようにして得られた組換えタバコの葉から、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔｍｉｎｉＫｉｔ（キアゲン）を用いてＲＮＡを抽出し、定法に従って、ＲＴ−ＰＣＲにより、導入した遺伝子が発現している系統を選択した。
このようにして得られた糸状菌由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ１５１９を導入したタバコ（ｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコ）、ゼニゴケ由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ２３６８を導入したタバコ（ｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコ）の葉から、公知の方法（藤野安彦編（１９７８）生物化学実験法９ 学会出版センター、山田晃弘編（１９８９）生物化学実験法２４ 学会出版センター）にしたがって、脂質の抽出を行った。得られた脂質をガスクロマトグラフィー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社 ＨＰ−６８００）で分析し、その結果を表１に示す。
なお、コントロールとして、遺伝子が導入されていないタバコの葉を用いて、同様の分析を行った。
Figure 0004639150
本実施例のガスクロマトグラフィーによる分析条件を以下に示す。
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ ＳＰ−２３３０、Ｆｕｓｅｄ Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｃｏｌｕｍｎ、３０ｍ ｘ ０．３２ｍｍ ＩＤ、０．２μｍ
温度：Ｉｎｊ：２４０℃、Ｄｅｔ：２５０℃、Ｏｖｅｎ：１８０℃ ３分、１８０℃→２２０℃（２℃／ｍｉｎ）
カラム流量：３０ｃｍ／ｓｅｃ、圧力２００ｋＰａ、検出器 ＦＩＤ
クロマトグラム中の各ピークは標準脂肪酸のメチルエステルのリテンションタイムとＧＣ−ＭＡＳＳ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社、ＨＰ−５９７３）分析により決定し、またピーク面積より各脂肪酸の割合を決定した。
表１において、Ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールを、ｐＳＰＢ２３６８はｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコを、ｐＳＰＢ１５１９はｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコを表す。
表１に示す結果から、糸状菌由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ１５１９を導入したタバコ（ｐＳＰＢ１５１９形質転換タバコ）では、ジホモγリノレン酸の蓄積は確認できたが、アラキドン酸の蓄積は認められなかった。一方、ゼニゴケ由来の酵素遺伝子から成るｐＳＰＢ２３６８を導入したタバコ（ｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコ）ではアラキドン酸だけでなく、エイコサテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸の蓄積も確認できた。このことから、高等植物においては、糸状菌由来の酵素よりもゼニゴケ由来の酵素の方が機能的に優れており、リノール酸やαリノレン酸を基質として、アラキドン酸を始めとする高度不飽和脂肪酸を合成できると考えられた。
Ａｂｂａｄｉらは、ケイソウ（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）のΔ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素、およびヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）の鎖長延長酵素の遺伝子を、タバコおよびアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に導入することで、アラキドン酸を、タバコの種子に１．５％、アマの種子に１．０％蓄積させたことを報告している（Ａｍｉｎｅ Ａｂｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６，２７３４−２７４８，２００４）。
本実施例においては、ゼニゴケ由来のΔ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素および鎖長延長酵素の各遺伝子をタバコに導入したことで、タバコの葉にアラキドン酸を１０％以上蓄積させている。この結果から、本実施例のｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコは、上述の報告と比較しても、より効率的に高度不飽和脂肪酸を合成できる能力があることが示唆された。
また、ハプト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）のΔ９鎖長延長酵素、ミドリムシ（Ｅｎｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ８不飽和化酵素、糸状菌のΔ５不飽和化酵素の３種類の遺伝子を用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）で脂質の改変を行った報告では、葉中でアラキドン酸が総脂質に対して６．６ｍｏｌ％、Ｃ２０以上の脂質が２２．５ｍｏｌ％であった（Ｂａｏｘｉｕ Ｑｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２，７３９−７４５，２００４）。この報告では、Δ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素、および鎖長延長酵素を用いる経路とは別の修飾経路で高度不飽和脂肪酸を作っており、単純比較は出来ないが、ゼニゴケの酵素を用いたほうがより多くの高度不飽和脂肪酸を蓄積することがわかった。
総脂質の３０％以上が改変脂肪酸になっているｐＳＰＢ２３６８形質転換タバコでは、形態的な異常は見られなかった。さらに、稔性にも問題なく、多くの種子をつけたことから、異所的な高度不飽和脂肪酸の増加が植物の生育に及ぼす影響は少ないと考えられた。
これまでに報告されている遺伝子組換え植物におけるＣ２０以上の高度不飽和脂肪酸の生産は総脂質の２０％前後、アラキドン酸に限ると６％前後が限界である。しかし、本実施例のように、ゼニゴケ由来の脂肪酸合成酵素を用いることにより、この限界を打ち破り、より多くの高度不飽和脂肪酸を植物で生産することが出来ると考えられる。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
本発明に係る遺伝子は、同一種のゼニゴケから単離されたΔ５不飽和化酵素遺伝子、Δ６不飽和化酵素遺伝子及びΔ６鎖長延長酵素遺伝子である。したがって、これら３種類の遺伝子を植物内で同時に発現させた場合に、異なる生物種由来の複数の遺伝子を発現させるより、植物内で良好に機能するという効果を奏する。さらに、ゼニゴケは、高等植物のモデル系と考えられるため、これらの遺伝子は、植物以外の生物種由来の遺伝子より植物内で良好に機能することができるという効果を奏する。
また、本発明に係る形質転換体は、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等の高度不飽和脂肪酸を生産することができるという効果を奏する。特に、本発明に係る形質転換植物は、低コストかつ環境にやさしい生産プロセスでアラキドン酸やＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸を生産することができるという効果を奏する。こうして得られたアラキドン酸やＥＰＡは、安価な多目的材料として活用できるという効果を奏する。さらに、上記形質転換植物体を食料として用いた場合、アラキドン酸やＥＰＡの含量が高い食料としての価値が高まるという効果を奏する。
以上にように、本発明の遺伝子・たんぱく質は、アラキドン酸やＥＰＡの生産に有用である。また、本発明の遺伝子を発現可能に導入した形質転換体は、製薬産業、食品産業、各種素材産業等において、アラキドン酸やＥＰＡを生産するうえで、極めて有用である。また、特に、上記形質転換体が植物体である場合、植物体内のアラキドン酸やＥＰＡの含量が増加するので、農業分野等において非常に有用である。

Claims (11)

  1. Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子：
    （ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子；又は
    （ｂ）配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子。
  2. Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子：
    （ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列を有する遺伝子；又は
    （ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、２５３ないし１６９８番目の塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子。
  3. Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するゼニゴケ目生物由来のたんぱく質をコードする、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の遺伝子：
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子；又は
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする遺伝子。
  4. 請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子によってコードされるたんぱく質。
  5. 以下の（ａ）又は（ｂ）記載のたんぱく質。
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質；又は
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Δ６脂肪酸不飽和化活性を有するたんぱく質。
  6. 少なくとも請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
  7. 少なくとも請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
  8. 少なくとも請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子が発現可能に導入された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織。
  9. 少なくとも請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子が発現可能に導入され、脂肪酸組成が改変された植物体、もしくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫となる植物体、又は当該植物体の組織。
  10. 請求項９に記載の植物体又は植物体の組織を用いることを特徴とする脂肪酸生産方法。
  11. 少なくとも請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子を用いて植物体、細菌または酵母の脂肪酸組成を改変する方法。
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