KR101110972B1 - 우산이끼 유래의 불포화 지방산 합성효소 유전자 및 그이용 - Google Patents

우산이끼 유래의 불포화 지방산 합성효소 유전자 및 그이용 Download PDF

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Abstract

동일종의 우산이끼로부터, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자 및 Δ6 지방산 쇄장 연장효소 유전자를 단리(單離)한다. 이들 유전자를 고등 식물에 도입함으로써, 아라키돈산이나 에이코사펜타엔산(EPA)을 생산할 수 있는 형질 전환 식물체를 취득한다.

Description

우산이끼 유래의 불포화 지방산 합성효소 유전자 및 그 이용{UNSATURATED FATTY ACID SYNTHASE GENE ORIGINATING IN MARCHANTIALES PLANT AND UTILIZATION OF THE SAME}
본 발명은, 우산이끼(Marchantia polymorpha) 유래의 불포화 지방산 합성효소 유전자들, 즉, Δ5 지방산 불포화화 효소, Δ6 지방산 불포화화 효소, 및 Δ6 지방산 쇄장(鎖長) 연장효소의 유전자와 그 이용에 관한 것이다.
아라키돈산, 에이코사펜타엔산(이하, 적절히 「EPA」로 약기) 등의 다중 불포화 지방산(Polyunsaturated fatty acid;PUFA)은, 사람에 있어서 신경계를 중심으로 한 세포막 지질에 다량 포함되어 있다. 이들 다중 불포화 지방산은 프로스타글란딘이나 류코트리엔과 같은 생리 활성 물질의 전구체로서 작용하고 있어, 약리학적으로 매우 중요하다. 최근에는, 아라키돈산이나 EPA를 포함하는 건강 식품도 판매되고 있다. 또한, 지방산은 세제나 생분해성 플라스틱의 원료로도 되기 때문에, 소재로서도 주목받고 있다.
다중 불포화 지방산은, 현재, 배양 미생물 또는 어유(魚油)로부터의 추출에 의해 생산되고 있다. 이 때문에, 생산 비용이 높은 점, 에너지 사용량?폐기물량이 많아지는 점, 특히 어유로부터 조제하는 방법에서는, 어자원이 한정되어 있는 점이 문제가 되고 있다.
아라키돈산 및 EPA는, 각각 리놀레산 및 α-리놀렌산을 기점으로 하여, Δ6 불포화화, 지방산 쇄장 연장 및 Δ5 불포화화의 3개의 연속된 반응에 의해 생합성된다고 생각되고 있다. 이러한 반응은, 각각, Δ6 지방산 불포화화 효소(이하, 「Δ6 불포화화 효소」라고 약기), Δ6 지방산 쇄장 연장효소(이하, 「Δ6 쇄장 연장효소」라고 약기) 및 Δ5 지방산 불포화화 효소(이하, 「Δ5 불포화화 효소」라고 약기)에 의해 촉매된다.
Δ6 불포화화 효소의 유전자는 몇 개의 식물종에서 클론화되고 있다. 예를 들면, 규조(Phaeodactylum tricornutum), 피스코미트렐라(Physcomitrella patens), 세라토돈 푸르푸레우스(ceratodon purpureus), 보리지(borage), 지치(lithospermum erythrorhizon), 큰앵초(primrose) 및 아네모네(anemone)로부터 Δ6 불포화화 효소의 유전자가 클론화되고 있다. 또한, 식물 이외에는 사상균(filamentous fungi), 선충(nematodes), 시아노박테리아(cyanobacteria), 래트 및 사람으로부터 Δ6 불포화화 효소 유전자가 클론화되고 있다(비특허 문헌 1: 「Eur. J. Biochem. 269, p4105, 2002」, 비특허 문헌 2: 「Plant J. 15, p39, 1998」, 비특허 문헌 3: 「Eur. J. Biochem., 267. p3801, 2000」, 비특허 문헌 4: 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, p4211, 1997」, 비특허 문헌 5: 「Lipids 37, 417, 2002」, 비특허 문헌 6: 「FEBS Lett. 542, p100, 2003」, 비특허 문헌 7: 「Whitney et al., Planta Epub 2003」, 비특허 문헌 8: 「Lipids 34, p649, 1999」, 비특허 문헌 9: 「Gene, 238, p445 1999」, 비특허 문헌 10: 「Biochem J. 330, p611 1998」, 비특허 문헌 11: 「Plant Mol. Biol., 22, p293 1993」, 비특허 문헌 12: 「Biochem. Biophys. res. Commun. 255, p575, 1999」, 비특허 문헌 13: 「J. Biol. Chem. 274, p471, 1999」 참조). 또한, 시아노박테리아에서 얻은 것을 제외하고, 이들 Δ6 불포화화 효소는 모두 N 말단에 시토크롬 b5 도메인이 존재한다.
Δ6 쇄장 연장효소의 유전자는, 최초로 사상균 및 선충으로부터 클론화되었다(비특허 문헌 14: 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, p8284, 2000」, 비특허 문헌 15: 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, p6421, 2000」 참조). 식물종에서는, 유일하게 피스코미트렐라로부터 클론화되어 있다(비특허 문헌 16: 「Plant J. 31, p255, 2002」 참조).
효모(Saccharomyces cerevisiae)에는, 스핑고지질(sphingolipids)의 장쇄 포화 아실쇄 합성에 관여하는 ELO2 단백질 및 ELO3 단백질이 존재하고(비특허 문헌 17: 「J. Biol. Chem., 272, p17376, 1997」 참조), Δ6 쇄장 연장효소의 아미노산 서열은 이것들과 상동성(相同性)을 나타낸다. 한편, 식물에는, 또 다른 타입의 지방산 쇄장 연장효소인 β-케토아실 CoA 합성효소(KCS)가 존재한다. 이 효소는, 장쇄(長鎖) 포화/일가 불포화 지방산의 쇄장(鎖長) 연장을 촉매한다(비특허 문헌 15 및 비특허 문헌 18: 「Plant Cell 7, p309, 1995」 참조). 그러나, Δ6 쇄장 연장효소 유전자 및 효모 ELO2/ELO3 유전자는, KCS 유전자와의 직접적인 진화상의 관계는 보여지지 않는다(비특허 문헌 15 및 16 참조).
Δ5 불포화화 효소의 유전자는, 사상균으로부터 처음으로 클론화되었다(비특허 문헌 19: 「J. Biol. Chem. 273, p29360, 1998」, 비특허 문헌 20: 「J. Biol. Chem. 273, p19055」 참조). Δ5 불포화화 효소의 구조는 Δ6 불포화화 효소와 공통되고 있으며, N 말단에 시토크롬 b5 도메인을 갖는다. Δ5 불포화화 효소 유전자는, 규조, 선충, 래트, 사람, 피스코미트렐라 등으로부터 클론화되고 있다(비특허 문헌 1, 비특허 문헌 21: 「FEBS Lett. 439, p215, 1998」, 비특허 문헌 22: 「Arch. Biochem. Biophys. 391, p8, 2001」, 비특허 문헌 23: 「J. Biol. Chem. 274, p37335, 1999」, 비특허 문헌 24: 「J. Biol. Chem. 278, 35115, 2003」 참조).
육상 식물은 선태 식물(선태 식물문(Bryophyta)), 양치 식물, 겉씨 식물 및 속씨 식물로 구성되어 있다. 선태 식물은 육상 식물 중에서 가장 오래전에 분기한 군으로서, 선류(선류강(Bryosida)), 태류(태류강(Hepaticopsida)) 및 뿔이끼류(Hornwortz)의 3개 그룹으로 구성되어 있다. 우산이끼는, 상기 생물 중 피스코미트렐라와 분류상 가장 가깝지만, 피스코미트렐라는 선류에 속하고 우산이끼는 태류강 중의 우산이끼아강(Marchantiidae)에 속하고 있다. 상기 3개의 그룹은, 약 4억 3천년 전에 이미 분기되어 있었던 것이 확실하다. 따라서, 같은 선태라고 해도, 피스코미트렐라와 우산이끼는, 예를 들면 2억년 전에 분화한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)와 벼의 차이 정도가 아니라, 진화 상 크게 상이하다(비특허 문헌 25: 「http://www.nibb.ac.jp/～mhasebe/Physcomitrella.htm」 참조).
우산이끼 유래의 다중 불포화 지방산 합성 효소 유전자로서는, 상기한 KCS 유사 쇄장 연장효소 유전자인 MpFAE2 및 MpFAE3이 취득되어 있다(비특허 문헌 26: 「Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p605, 2003」, 비특허 문헌 27: 「Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p1667, 2003」 참조). 그러나, MpFAE2 및 MpFAE3은 Δ6 쇄장 연장효소 유전자는 아니다.
전술한 바와 같이, 많은 다중 불포화 지방산 합성 효소 유전자가 여러 가지 생물종으로부터 클론화되어 있지만, 아라키돈산, EPA 등의, C20 이상이고 불포화도 4 이상인 다중 불포화 지방산을 식물 내에서 생산시킨 예는 적다. 이러한 예로서, 규조 유래의 Δ6 불포화화 효소 유전자 및 Δ5 불포화화 효소 유전자와, 피스코미트렐라 유래의 Δ6 쇄장 연장효소 유전자를 아마(Linum usitatissimum)에서 발현시켜, 아라키돈산 및 EPA를 생산시킨 보고가 있지만, 그 상세는 불명하다(비특허 문헌 24 참조).
전술한 바와 같이, 아라키돈산이나 EPA 등의 다중 불포화 지방산의 생산은, 배양 미생물 또는 어유로부터의 추출에 의해 생산되고 있기 때문에, 생산 비용이 높은 점, 에너지 사용량?폐기물량이 많아지는 점, 어자원이 한정되어 있는 점 등의 문제점을 갖고 있다. 아라키돈산이나 EPA 등의 다중 불포화 지방산은, 분자 내에 이중 결합을 복수 갖는 독특한 물성을 갖고 있기 때문에, 여러 가지 공업 용도(예를 들면 필름, 생분해성 플라스틱, 기능성 섬유, 윤활유, 세제의 소재 등)에도 이용 가능해진다. 이와 같은 다중 불포화 지방산을 유전자 변형 식물에 의해 생산함으로써, 생산 비용을 저감할 수 있음과 동시에 보다 친환경 생산 프로세스를 실현할 수 있을 것으로 기대된다. 유전자 변형 기술을 이용하여, 이들 다중 불포화 지방산을 유량(油糧) 식물에서 대량 생산할 수 있게 되면, 염가의 다목적 원료로서 매우 유용하다.
한편, 식물에 이종 생물의 유전자를 발현시키는 경우, 그 유전자가 식물 내 에서 어느 정도 양호하게 기능할지는, 전사(transcription), 번역(translation), 그 후의 변형(modification) 등의 과정이 있기 때문에, 예상하기 어렵다. 특히, 복수의 이종 생물의 유전자를 발현시키는 경우, 상기 비특허 문헌 24와 같이 상이한 생물종 유래의 복수의 유전자를 발현시키는 것보다, 동일종에 유래하는 복수의 유전자를 발현시키는 편이 식물 내에서 양호하게 기능할 것으로 예상된다. 또한, 최초의 육상 식물인 선태류의 우산이끼는 고등 식물의 모델계로서 주목받고 있어, 그 유전자는 식물 내에서 양호하게 기능할 것으로 기대된다. 따라서, 우산이끼 유래의 다중 불포화 지방산 합성효소 유전자, 즉 Δ5 불포화화 효소 유전자, Δ6 불포화화 효소 유전자 및 Δ6 쇄장 연장효소 유전자를 취득할 수 있다면, 이들 유전자를 식물에 도입함으로써, 아라키돈산이나 EPA가 식물 내에서 효율적으로 축적될 것으로 기대된다.
또한, 우산이끼와 같은 선태 식물인 피스코미트렐라로부터는 Δ5 불포화화 효소 유전자, Δ6 불포화화 효소 유전자 및 Δ6 쇄장 연장효소 유전자가 클론화되어 있지만, 우산이끼와 피스코미트렐라는 진화 상 크게 상이하여, 피스코미트렐라의 유전자에 기초하여 우산이끼의 유전자를 취득하는 것은, 현재의 기술 수준을 가지고 용이하게 할 수 있는 것은 아니다.
본 발명은, 상기 종래의 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 고등 식물 중에서 아라키돈산이나 EPA를 생산할 수 있는, 우산이끼(Marchantia polymorpha) 유래의 불포화 지방산 합성효소 유전자, 즉 Δ5 불포화화 효소 유전자, Δ6 불포화화 효소 유전자 및 Δ6 쇄장 연장효소 유전자 및 그 이용법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 우산이끼(Marchantia polymorpha) 유래의 cDNA 클론으로부터, 상기 Δ6 불포화화 효소, Δ5 불포화화 효소 및 Δ6 쇄장 연장효소를 코딩하는 유전자를 동정(identification)하고, 또한 이들 유전자를 메탄올 자화성 효모(Pichia pastoris)에 도입하여 발현시키는 것에 성공하고, 이들 유전자를 발현시킨 단백질이 각각 Δ6 불포화화, Δ5 불포화화 및 Δ6 쇄장 연장의 효소 활성을 갖는 것을 찾아내, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은, 이하의 발명을 포함한다.
(1) 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA의 전부 또는 일부, 혹은 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA의 전부 또는 일부와 스트린전트 조건(stringent condition)하에서 하이브리다이즈(hybridize)하고, 또한 Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 우산이끼목 생물 유래의 유전자.
(2) Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열을 갖는 유전자. (b) 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
(3) Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열 가운데, 253 내지 1698번째의 염기 서열을 갖는 유전자. (b) 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열 가운데, 253 내지 1698번째의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
(4) Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자. (b) 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
(5) 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA의 전부 또는 일부, 혹은 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA의 전부 또는 일부와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 Δ6 지방산 쇄장 연장 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 우산이끼목 생물 유래의 유전자.
(6) Δ6 지방산 쇄장 연장 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열을 갖는 유전자. (b) 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
(7) Δ6 지방산 쇄장 연장 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열 가운데, 194 내지 1066번째의 염기 서열을 갖는 유전자. (b) 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열 가운데, 194 내지 1066번째의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
(8) Δ6 지방산 쇄장 연장 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, (b) 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
(9) 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA의 전부 또는 일부, 혹은 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA의 전부 또는 일부와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 우산이끼목 생물 유래의 유전자.
(10) Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열을 갖는 유전자. (b) 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
(11) Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열 가운데, 375 내지 1829번째의 염기 서열을 갖는 유전자. (b) 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열 가운데, 375 내지 1829번째의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
(12) Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재한 유전자. (a) 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, (b) 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재한 유전자에 의해 코딩되는 단백질.
(14) 이하의 (a) 또는 (b) 기재의 단백질. (a) 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질. (b) 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질.
(15) 이하의 (a) 또는 (b) 기재의 단백질. (a) 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질. (b) 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Δ6 지방산 쇄장 연장 활성을 갖는 단백질.
(16) 이하의 (a) 또는 (b) 기재의 단백질. (a) 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질. (b) 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질.
(17) 상기 (13) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재한 단백질을 인식하는 항체.
(18) 적어도 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재한 유전자를 포함하는 변형 발현 벡터.
(19) 적어도 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재한 유전자를 도입하여 이루어지는 형질 전환체.
(20) 적어도 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재한 유전자가 발현 가능하게 도입된 식물체, 혹은 당해 식물체와 동일한 성질을 갖는 당해 식물체의 자손이 되는 식물체, 또는 당해 식물체의 조직.
(21) 적어도 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재한 유전자가 발현 가능하게 도입되고, 지방산 조성이 변형된 식물체, 혹은 당해 식물체와 동일한 성질을 갖는 당해 식물체의 자손이 되는 식물체, 또는 당해 식물체의 조직.
(22) 상기 (20) 또는 (21)에 기재한 식물체의 번식 재료.
(23) 상기 (21)에 기재한 식물체 또는 식물체의 조직을 이용하는 지방산 생산 방법.
(24) 상기 (23)에 기재한 지방산 생산 방법에 의해 얻어진, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산 및 에이코사펜타엔산으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함하는 소재.
(25) 적어도 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재한 유전자를 이용하여 지방산 조성을 변형하는 방법.
(26) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재한 유전자에서의 적어도 일부의 염기 서열 또는 그 상보 서열을 프로브(probe)로서 이용한 유전자 검출 기구.
(27) 상기 (13) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재한 단백질을 이용하여, 당해 단백질을 조절하는 유전자, 또는 당해 단백질을 조절하는 물질을 스크리닝(screening)하는 방법.
(28) 상기 (27)에 기재한 스크리닝 방법에 의해 얻어진 유전자 또는 물질.
한편, 본 명세서에 있어서, 특별히 한정하지 않는 이상 A, C, G 및 T는, 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민의 각 염기를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 뛰어난 점은, 이하에 기술하는 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이점은, 첨부 도면을 참조한 다음의 설명에서 명백하게 될 것이다.
도 1은, 제6 실시예에서 이용한 MpDES6 유전자, MpELO1 유전자 및 MpDES5 유전자의 각 유전자의 발현 카세트가 연결된 컨스트럭트의 구축 순서를 나타내는 설명도이다.
본 발명의 일 실시 형태에 대해 설명하면, 이하와 같다. 한편, 본 발명은, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
이하, 아라키돈산 및 에이코사펜타엔산(EPA)의 합성 경로, 본 발명에 따른 유전자, 본 발명에 따른 단백질, 본 발명에 따른 단백질 및 유전자의 취득 방법, 그리고 본 발명에 따른 유전자 및 단백질의 이용 방법(유용성)의 순서로, 본 발명을 상세하게 설명한다.
(1) 아라키돈산 및 에이코사펜타엔산(EPA)의 합성 경로
아라키돈산 및 에이코사펜타엔산(EPA)은, 각각 리놀레산 및 α-리놀렌산을 기점으로 하여 Δ6 불포화화, Δ6 쇄장 연장 및 Δ5 불포화화의 3개의 연속한 반응에 의해 생합성된다고 생각된다. 이러한 반응은, 각각 Δ6 불포화화 효소, Δ6 쇄장 연장효소 및 Δ5 불포화화 효소에 의해 촉매되어, 각각, n-6 경로(아라키돈산 합성 경로) 및 n-3 경로(EPA 합성 경로)라고 불리고 있다.
지금까지 보고되고 있는 Δ6 불포화화 효소, Δ6 쇄장 연장효소 및 Δ5 불포화화 효소는, 모두 n-6 및 n-3 경로의 양쪽 모두에 관여하고 있는 것으로 드러났다. 즉, Δ6 불포화화 효소는, n-6 경로에서는 리놀레산(18:2Δ9,12, 18은 탄소수를, 2는 이중 결합의 수를, 9와 12는 이중 결합의 위치를 각각 나타낸다. 이하 동일)을 γ-리놀렌산(GLA; 18:3Δ6,9,12)으로 변환하고, n-3 경로에서는 α-리놀렌산(ALA; 18:3Δ9,12,15)을 스테아리돈산(STA; 18:4Δ6,9,12,15)으로 변환한다. Δ6 쇄장 연장효소는, n-6 경로에서는 GLA를 디호모-γ-리놀렌산(DGLA; 20:3Δ8,11,14)으로 변환하고, n-3 경로에서는 STA를 에이코사테트라엔산(ETA; 20:4Δ8,11,14,17)으로 변환한다. Δ5 불포화화 효소는, n-6 경로에서는 DGLA를 아라키돈산(20:4Δ5,8,11,14)으로, n-3 경로에서는 ETA를 에이코사펜타엔산(EPA; 20:5Δ5,8,11,14,17)으로 변환한다.
(2) 본 발명에 따른 유전자
[본 발명에 따른 Δ6 불포화화 효소 유전자]
본 발명에 따른 Δ6 불포화화 효소 유전자는, Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 우산이끼목 생물 유래의 유전자로서, 이하의 조건에 적합한 유전자이면 된다.
1. 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열을 갖는 유전자.
2. 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
3. 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA의 일부, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA의 일부와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
4. 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열 가운데, 253 내지 1698번째의 염기 서열을 갖는 유전자. 한편, 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열의 253 내지 1698번째의 염기 서열은 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로 번역되는 영역이다.
5. 서열 번호 1에 기재되는 염기 서열 가운데, 253 내지 1698번째의 염기 서 열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
6. 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
7. 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
[본 발명에 따른 Δ6 쇄장 연장효소 유전자]
본 발명에 따른 Δ6 쇄장 연장효소 유전자는, Δ6 지방산 쇄장 연장효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 우산이끼목 생물 유래의 유전자로서, 이하의 조건에 적합한 유전자이면 된다.
1. 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열을 갖는 유전자.
2. 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이프리다이즈하는 유전자.
3. 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA의 일부, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA의 일부와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
4. 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열 가운데, 194 내지 1066번째의 염기 서열을 갖는 유전자. 한편, 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열의 194 내지 1066번째 의 염기 서열은 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로 번역되는 영역이다.
5. 서열 번호 3에 기재되는 염기 서열 가운데, 194 내지 1066번째의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
6. 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
7. 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
[본 발명에 따른 Δ5 불포화화 효소 유전자]
본 발명에 따른 Δ5 불포화화 효소 유전자는, Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 우산이끼목 생물 유래의 유전자로서, 이하의 조건에 적합한 유전자이면 된다.
1. 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열을 갖는 유전자.
2. 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
3. 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열로 이루어지는 DNA의 일부, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA의 일부와 스트린전트 조건하에서 하이 브리다이즈하는 유전자.
4. 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열 가운데, 375 내지 1829번째의 염기 서열을 갖는 유전자. 한편, 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열의 375 내지 1829번째의 염기 서열은 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로 번역되는 영역이다.
5. 서열 번호 5에 기재되는 염기 서열 가운데, 375 내지 1829번째의 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 당해 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 유전자.
6. 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
7. 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
한편, 상기 「스트린전트 조건」이란, 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 95%의 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 97%의 동일성이 서열간에 존재할 경우에만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미한다.
상기 하이브리다이제이션은, J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)에 기재되어 있는 방법 등, 종래 공지의 방법으로 행할 수 있다. 통상적으로, 온도가 높을수록, 염농도가 낮을수록 스트린전시(stringency)는 높아져(하이브리다이즈하기 어려워 짐), 보다 상동한 유전자를 취득할 수 있다. 하이브리다이제이션의 조건으로는, 종래 공지의 조건을 적절하게 이용할 수 있어 특별히 한정하지 않지만, 예를 들면, 42℃, 6×SSPC, 50% 포름아미드, 1% SDS, 100㎍/㎖ salmon sperm DNA, 5×덴하르트(Denhardt′s) 용액(단, 1×SSPE; 0.18M 염화 나트륨, 10mM 인산 나트륨, pH7.7, 1mM EDTA)을 들 수 있다.
상기 “우산이끼목 생물”이란, 우산이끼(Marchantia polymorpha)로 한정되는 것이 아니라, 우산이끼 아강 우산이끼목(Marchantiales)에 속하는 생물이 포함된다. 이들 중, Monoclea forsteri(Monocleales), Corsinia coriandrina(Marchantiales), Oximitra paleacea(Marchantiales), Ricciocarpos natans(Marchantiales), Ricca huebeneriana(Marchantiales), Ricca fluitans(Marchantiales), Ricca duplex(Marchantiales), Ricca canaliculata(Marchantiales), Ricca bifurca(Marchantiales), Ricca ciliifera(Marchantiales), Ricca glauca(Marchantiales), Ricca sorocarpa(Marchantiales), Ricca warnstorfii(Marchantiales), Ricca michelii(Marchantiales), Ricca papillosa(Marchantiales) 및 Ricca zachariae(Marchantiales)에는, 초장쇄 다중 불포화 지방산이 존재하는 것이 알려져 있다(Prog. Lipid Res. 32, p281, 1993 참조). 이들 생물로부터 Δ6 불포화화 효소, Δ6 쇄장 연장효소 및 Δ5 불포화화 효소의 유전자를 취득하는 것은 현재의 기술 수준으로 용이하다. 예를 들면, 근연(近緣) 생물의 동일한 기능을 갖는 효소를 코딩하는 유전자는, 크로스 하이브리다이제이션하는 것이 일반적으로 알려져 있 다.
본 발명의 유전자는, 이중 가닥(double-strand) DNA 뿐만 아니라, 그것을 구성하는 센스 스트랜드(sense strand) 및 안티센스 스트랜드(anti-sense strnad)의 각 단일 가닥(single-strand) DNA나 RNA를 포함한다. 안티센스 스트랜드는, 프로브로서 또는 안티센스 화합물로서 이용할 수 있다. DNA에는, 예를 들면 클로닝(cloning)이나 화학 합성 기술 또는 그것을 조합하여 얻을 수 있는 cDNA나 게놈 DNA 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 유전자는, 비번역 영역(UTR)의 서열이나 벡터 서열(발현 벡터 서열을 포함) 등의 서열을 포함하는 것이라도 된다.
(3) 본 발명에 따른 단백질
[본 발명에 따른 Δ6 불포화화 효소 단백질]
본 발명에 따른 Δ6 불포화화 효소 단백질은, 우산이끼목 생물 유래의 단백질로서 Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질이면 된다. 보다 구체적으로는, 이하에 기술하는 단백질이면 된다.
1. 상기 (2)에 기재한 본 발명에 따른 Δ6 불포화화 효소 유전자에 의해 코딩되는 단백질.
2. 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
3. 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
[본 발명에 따른 Δ6 쇄장 연장효소 단백질]
본 발명에 따른 Δ6 쇄장 연장효소 단백질은, 우산이끼목 생물 유래의 단백 질로서 Δ6 지방산 쇄장 연장 활성을 갖는 단백질이면 된다. 보다 구체적으로는, 이하에 기술하는 단백질이면 된다.
1. 상기 (2)에 기재한 본 발명에 따른 Δ6 쇄장 연장효소 유전자에 의해 코딩되는 단백질.
2. 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
3. 서열 번호 4에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
[본 발명에 따른 Δ5 불포화화 효소 단백질]
본 발명에 따른 Δ5 불포화화 효소 단백질은, 우산이끼목 생물 유래의 단백질로서 Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 단백질이면 된다. 보다 구체적으로는, 이하에 기술하는 단백질이면 된다.
1. 상기 (2)에 기재한 본 발명에 따른 Δ5 불포화화 효소 유전자에 의해 코딩되는 단백질.
2. 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
3. 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열의 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
상기 “Δ6 지방산 불포화화 활성”이란, 리놀레산 또는 α-리놀렌산에 대해 기질 특이성을 갖고, 각각 γ-리놀렌산 또는 스테아리돈산으로 변환하는 작용을 의미한다. 또한, 상기 “Δ6 지방산 쇄장 연장 활성”이란, γ-리놀렌산 또는 스테아리돈산에 대해 기질 특이성을 갖고, 각각 디호모-γ-리놀렌산 또는 에이코사테트라 엔산으로 변환하는 작용을 의미한다. 또한, 상기 “Δ5 지방산 불포화화 활성”이란, 디호모-γ-리놀렌산 또는 에이코사테트라엔산에 대해 기질 특이성을 갖고, 각각 아라키돈산 또는 에이코사펜타엔산(EPA)으로 변환하는 작용을 의미한다.
상기 “1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되었다”란, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 공지의 변이 단백질 제작법에 의해 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가할 수 있는 정도의 수(바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 7개 이하, 더 바람직하게는 5개 이하)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되는 것을 의미한다. 이러한 변이 단백질은, 공지의 변이 단백질 제작법에 의해 인위적으로 도입된 변이를 갖는 단백질로 한정되는 것이 아니라, 자연에 존재하는 동일한 변이 단백질을 단리 정제한 것이라도 된다.
한편, 본 발명의 단백질은, 아미노산이 펩티드 결합하여 이루어지는 폴리펩티드이면 되지만, 이것으로 한정되는 것이 아니라, 폴리펩티드 이외의 구조를 포함하는 복합 단백질이라도 무방하다. 여기에서 말하는 폴리펩티드 이외의 구조로서는, 당쇄(糖鎖)나 이소프레노이드기 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 단백질은, 부가적인 폴리펩티드를 포함하는 것이라도 된다. 이와 같은 폴리펩티드가 부가되는 경우로서는, 예를 들면, His나 Myc, Flag 등에 의해 본 발명의 단백질이 에피토프(epitope) 표지되는 경우를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질은, 전술한 본 발명의 유전자(본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자)를 숙주 세포에 도입하고, 그 단백질을 세포 내 발현시킨 상태라도 되며, 세포, 조직 등으로부터 단리 정제된 상태라도 무방하다. 또한, 상기 숙주 세포에서의 발현 조건에 따라서는, 본 발명의 단백질은 다른 단백질과 연결된 융합 단백질이라도 된다. 또한, 본 발명의 단백질은 화학 합성된 것이라도 된다.
(4) 본 발명에 따른 단백질 및 유전자의 취득 방법
본 발명에 따른 단백질 및 유전자의 취득 방법(생산 방법)은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 대표적인 방법으로서 다음에 기술하는 각 방법을 들 수 있다.
[단백질의 취득 방법]
본 발명의 단백질을 취득하는 방법(생산 방법)은, 전술한 바와 같이 특별히 한정되는 것은 아니지만, 우선, 본 발명의 단백질을 발현하는 세포, 조직 등으로부터 단순 정제하는 방법을 들 수 있다. 정제 방법도 특별히 한정되는 것이 아니라, 공지의 방법으로 세포나 조직으로부터 세포 추출액을 조제하고, 이 세포 추출액을 공지의 방법, 예를 들면 컬럼 등을 이용하여 정제하면 된다.
또한, 본 발명의 단백질을 취득하는 방법으로서, 유전자 변형 기술 등을 이용하는 방법도 들 수 있다. 이 경우, 예를 들면, 본 발명의 유전자를 벡터 등에 삽입한 후, 공지의 방법에 의해 발현 가능하게 숙주 세포에 도입하고, 세포 내에서 번역되어 얻어지는 상기 단백질을 정제하는 방법 등을 채용할 수 있다.
한편, 이와 같이 숙수에 외래 유전자를 도입하는 경우, 외래 유전자의 발현을 위해 숙주 내에서 기능하는 프로모터를 삽입한 발현 벡터 및 숙주에는 여러 가지가 존재하므로, 목적에 부합하는 것을 선택하면 된다. 생산된 단백질을 정제하는 방법은, 이용한 숙주, 단백질의 성질에 따라 상이하지만, 태그의 이용 등에 의해 비교적 용이하게 목적하는 단백질을 정제하는 것이 가능하다.
변이 단백질을 제작하는 방법에 대해서도 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275(1995) 외), PCR법을 이용하여 염기 서열에 점 돌연변이(point mutation)를 도입하여 변이 단백질을 제작하는 방법, 혹은 트랜스포존(transposon)의 삽입에 의한 돌연변이주 제작법 등의 주지의 변이 단백질 제작법을 이용할 수 있다. 변이 단백질의 제작에는 시판의 키트를 이용해도 된다.
본 발명의 단백질의 취득 방법은 전술한 방법에 한정되지 않으며, 예를 들면, 화학 합성된 것이라도 된다. 예를 들면, 무세포계의 단백질 합성액을 이용하여 본 발명의 유전자로부터 본 발명의 단백질을 합성해도 된다.
[유전자의 취득 방법]
본 발명의 유전자를 취득하는 방법(생산 방법)도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 디퍼렌셜 스크리닝(differential screening)(서브트랙션 클로닝(subtraction cloning))을 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 방법에서는, 공지의 기술에 따라, 시험관 내에서의 직접적인 하이브리다이제이션을 반복하여, 목적하는 cDNA(본 발명의 유전자)를 농축하면 된다.
상기 디퍼렌셜 스크리닝에서의 각 스텝에 대해서는, 통상적으로 이용되는 조건하에서 행하면 된다. 이것에 의해 얻어진 클론은, 제한 효소 지도의 작성 및 그 염기 서열 결정(sequencing)에 의해, 더 자세하게 해석할 수 있다. 이들의 해석에 의해, 본 발명의 유전자 서열을 포함하는 DNA 단편을 취득했는지 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자를 취득하는 방법으로서, 공지의 기술에 의해 본 발명의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 단리하고 클로닝하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자의 염기 서열의 일부와 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 조제하고, 게놈 DNA 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 스크리닝하면 된다. 이와 같은 프로브로서는, 본 발명의 유전자의 염기 서열 또는 그 상보 서열의 적어도 일부에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브이면, 어떤 서열?길이의 것을 이용해도 무방하다.
또한, 상기 프로브의 서열을, 전술한 우산이끼 사이에서 양호하게 보존되고 있는 영역 중에서 선택하고, 다른 우산이끼의 게놈 DNA(또는 cDNA) 라이브러리를 스크리닝하면, 상기 단백질과 마찬가지의 기능을 갖는 상동 분자나 유연(類緣) 분자를 코딩하는 유전자를 단리하여 클로닝할 수 있다.
혹은, 본 발명의 유전자를 취득하는 방법으로서, PCR 등의 증폭 수단을 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자의 cDNA 서열 가운데, 5′측 및 3′측의 서열(또는 그 상보 서열) 중에서 각각 프라이머를 조제하고, 이들 프라이머를 이용하여 게놈 DNA(또는 cDNA) 등을 주형으로 하여 PCR 등을 행하여, 양 프라이머 사이에 끼워지는 DNA 영역을 증폭함으로써, 본 발명의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 대량으로 취득할 수 있다.
(5) 본 발명에 따른 유전자 및 단백질의 이용 방법(유용성)
(5-1) 변형 발현 벡터
본 발명에 따른 변형 발현 벡터는, 상기 (2)에 기재한 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 것이라면, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, cDNA가 삽입된 변형 발현 벡터를 들 수 있다. 변형 발현 벡터의 제작에는, 플라스미드(plasmid), 파지(phage), 또는 코스미드(cosmid) 등을 이용할 수 있지만 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 제작 방법도 공지의 방법을 이용하여 행하면 된다.
벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되는 것이 아니라, 호스트 세포 중에서 발현 가능한 벡터를 적절하게 선택하면 된다. 즉, 호스트 세포의 종류에 따라, 확실하게 유전자를 발현시키기 위해 적절하게 프로모터 서열을 선택하고, 이것과 본 발명의 유전자를 각종 플라스미드 등에 삽입한 것을 발현 벡터로서 이용하면 된다.
본 발명의 유전자가 호스트 세포에 도입되었는지의 여부, 또한 호스트 세포 내에서 확실하게 발현하고 있는지의 여부를 확인하기 위해, 각종 마커를 이용해도 된다. 예를 들면, 호스트 세포 내에서 결실되어 있는 유전자를 마커로서 이용하여, 이 마커와 본 발명의 유전자를 포함하는 플라미스드 등을 발현 벡터로서 호스트 세포에 도입한다. 이것에 의해 마커 유전자의 발현으로부터 본 발명의 유전자의 도입을 확인할 수 있다. 혹은, 본 발명의 단백질을 융합 단백질로서 발현시켜도 되고, 예를 들면, 애쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 녹색 형광 단백질 GFP(Green Fluorescent Protein)를 마커로서 이용하여, 본 발명의 단백질을 GFP 융합 단백질로서 발현시켜도 된다.
상기 호스트 세포는, 특별히 한정되는 것이 아니라, 종래 공지의 각종 세포를 적절하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 대장균(Escherichia coli) 등의 세균, 효모(발아 효모(Saccharomyces cerevisiae), 분열 효모(Schizosaccharomyces pombe)), 선충(Caenorhabditis elegans), 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)의 난모 세포(卵母細胞) 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 발현 벡터를 호스트 세포에 도입하는 방법, 즉 형질 전환 방법도 특별히 한정되는 것이 아니라, 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜(liposome)법, DEAE 덱스트란법 등의 종래 공지의 방법을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 곤충에서 전이 발현시키는 경우에는, 바큘로바이러스(baculovirus)를 이용한 발현계를 채용할 수 있다.
(5-2) 형질 전환체
본 발명에 따른 형질 전환체는, 상기 (2)에 기재한 본 발명에 따른 유전자 도입된 형질 전환체라면, 특별히 한정되는 것은 아니다. 여기에서 “형질 전환체”란, 세포?조직?기관 뿐만 아니라, 생물 개체를 포함하는 의미이다.
형질 전환체의 제작 방법(생산 방법)은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 전술한 변형 발현 벡터를 호스트 세포에 도입하여 형질 전환하는 방법을 들 수 있다. 또한, 형질 전환의 대상이 되는 생물도 특별히 한정되는 것은 아니며, 상기 호스트 세포에서 예시한 각종 미생물이나 동물을 들 수 있다.
본 발명에 따른 형질 전환체는, 본 발명에 따른 유전자가 발현 가능하게 도입된 식물체, 혹은 당해 식물체와 동일한 성질을 갖는 당해 식물체의 자손이 되는 식물체, 또는 당해 식물체의 조직인 것이 바람직하다. 이러한 형질 전환 식물에 의 해, 저비용이면서 친환경적인 생산 프로세스로 아라키돈산이나 EPA 등의 다중 불포화 지방산을 생산할 수 있다.
여기에서 “유전자가 발현 가능하게 도입되었다”란, 공지의 유전자 공학적 방법(유전자 조작 기술)에 의해, 대상 세포(숙주 세포) 내에 발현 가능하게 도입되는 것을 의미한다.
식물체의 형질 전환에 이용되는 변형 발현 벡터는, 당해 식물 세포 내에서 삽입 유전자를 발현시키는 것이 가능한 것이라면 특별히 한정하지 않는다. 예를 들면, 식물 세포 내에서 항상적으로 유전자를 발현시키는 프로모터(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)의 35S 프로모터)를 갖는 벡터나, 외적인 자극에 의해 유도적으로 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 이용할 수 있다. 한편, 이 식물 세포에는, 여러 가지 형태의 식물 세포, 예를 들면, 현탁 배양 세포, 프로토플라스트(protoplast), 잎의 절편, 캘러스(callus) 등이 포함된다.
식물 세포에의 변형 발현 벡터의 도입에는, 폴리에틸렌 글리콜법, 전기 천공법(electroporation), 아그로박테리움(agrobacterium)을 개재하는 방법, 파티클건법(particle gun method) 등, 당업자에게 공지인 여러 가지의 방법을 이용할 수 있다. 형질 전환 세포로부터 식물체의 재생은, 식물 세포의 종류에 따라 당업자에게 공지인 방법으로 행하는 것이 가능하다.
예를 들면, 담배에 있어서 형질 전환 식물체를 작출하는 방법에 대해서는, 형질 전환한 아그로박테리움을 담배잎 디스크(tobacco leaf disc)에 감염시키는 방법, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 프로토플라스트에 유전자를 도입하여 식물체에 재생시키는 방법, 전기 펄스에 의해 프로토플라스트에 유전자 도입하여 식물체를 재생시키는 방법, 파티클건법에 의해 세포에 유전자를 직접 도입하여 식물체를 재생시키는 방법 등, 몇 가지의 기술이 이미 확립되어 있다. 본 발명에 있어서는, 이러한 방법을 매우 적합하게 이용할 수 있다.
또한, 담배는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)와 함께, 유전자 공학적 방법을 이용하는 식물 육종의 모델 식물이다. 이 담배에서, 아라키돈산이나 EPA의 함량이 증가한 형질 전환체를 취득할 수 있다는 것은, 식물 전반에 있어서 형질 전환체를 취득할 수 있다고 해도 과언이 아니다. 한편, 본 명세서에서는, 후술하는 실시예에 기술하는 바와 같이, 담배뿐만이 아니라 벼의 형질 전환체도 취득하고 있어, 본 발명에 따르면, 모든 종류의 형질 전환 식물체를 취득할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
예를 들면, 벼에 있어서 형질 전환 식물체를 작출하는 방법에 대해서는, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 프로토플라스트에 유전자를 도입하고 식물체에 재생시키는 방법, 전기 펄스에 의해 프로토플라스트에 유전자를 도입하고 식물체를 재생시키는 방법, 파티클건법에 의해 세포에 유전자를 직접 도입하고 식물체를 재생시키는 방법 등, 몇 가지의 기술이 이미 확립되어 있다. 본 발명에 있어서는, 이들 방법을 적합하게 이용할 수 있다.
상기 형질 전환 식물체가 벼인 경우, 벼 내의 아라키돈산이나 EPA의 함량이 증가하므로, 이 형질 전환 식물체로부터 얻어지는 종자, 즉, 쌀을 먹음으로써 용이하게 아라키돈산이나 EPA 등의 다중 불포화 지방산을, 체내로 섭취하는 것이 가능 하게 된다. 따라서, 벼의 형질 전환 식물체는, 식량으로서의 가치가 높고, 식품 산업, 농업 분야에 매우 유용하다. 또한, 현재 그다지 이용되고 있지 않은 쌀겨, 왕겨, 곁눈 등에서 아라키돈산이나 EPA를 생산하면, 이것로부터 이들 지방산을 추출함으로써, 건강 식품의 원료로서 유효하게 이용할 수 있다. 또한, 가축의 사료로서도 이용할 수 있다.
게놈 내에 본 발명의 유전자가 도입된 형질 전환 식물체가 일단 얻어지면, 당해 식물체로부터 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻을 수 있다. 또한, 당해 식물체, 또는, 그 자손, 혹은, 클론으로부터, 번식 재료(예를 들면, 종자, 과실, 이삭, 덩이줄기, 덩이뿌리, 밑동줄기, 캘러스, 프로토플라스트 등)를 얻어, 그것들을 기초로 당해 식물체를 대량생산하는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명에는, 본 발명의 유전자가 발현 가능하게 도입된 식물체, 혹은, 당해 식물체와 동일한 성질을 갖는 당해 식물체의 자손이 되는 식물체, 또는, 당해 식물체의 조직, 혹은, 당해 식물체의 번식 재료도 포함된다.
또한, 당해 식물체, 당해 식물체와 동일한 성질을 갖는 당해 식물체의 자손이 되는 식물체, 및, 당해 식물체의 조직에는, 영양 증식된 식물체도 포함된다. 영양 증식은, 영양 생식, 클론 성장이라고도 불리며, 삽아법, 삽목법 등에 의한 증식이 일반적이고, 시험관 내에서는, 잎, 줄기, 뿌리 등의 기관으로부터의 식물체의 재분화나 캘러스에 의한 증식이 가능하다. 식물종에 따라서는, 가지의 선단이 특수한 겨울눈(冬芽)을 만들거나, 곁눈(腋芽)이 다육화되거나, 꽃이 주아(珠芽)화하거나, 덩이줄기를 형성하는 등의 경우가 있다.
또한, 본 발명에 따른 유전자가 발현 가능하게 도입되어, 지방산 조성이 변형된 식물체, 혹은 당해 식물체와 동일한 성질을 갖는 당해 식물체의 자손이 되는 식물체, 또는 당해 식물체의 조직, 당해 식물체의 번식 재료도 본 발명에 포함된다. “지방산 조성이 변형되었다”란 형질 전환 전의 식물체에서의 지방산 조성과 형질 전환 후의 식물체의 지방산 조성이 상이한 것을 의미한다. 예를 들면, 본래 지방산 조성에 아라키돈산이나 EPA가 포함되어 있지 않았던 식물을 본 발명에 따른 유전자로 형질 전환함으로써, 형질 전환 식물의 지방산 조성에 아라키돈산이나 EPA가 포함되는 경우 등을 들 수 있다.
(5-3) 지방산 생산 방법
본 발명에는, 본 발명에 따른 유전자로 형질 전환되어, 지방산 조성이 변형된 식물체 또는 식물체의 조직을 이용하여 지방산을 생산하는 방법이 포함된다.
예를 들면, 상술한 바와 같이 아라키돈산이나 EPA의 함량이 증가된 본 발명에 따른 형질 전환 식물로부터 제조된 식용유는 아라키돈산이나 EPA의 함량이 많아, 가치가 높은 것이 된다. 상기 형질 전환 식물체의 종자, 과실, 이삭, 덩이줄기, 덩이뿌리 등도, 아라키돈산이나 EPA를 포함하는 식료로서 가치가 높은 것이 된다.
(5-4) 소재
본 발명에는, 전술한 지방산 생산 방법에 의해 얻어진 물질, 즉, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산을 적어도 하나 포함하는 소재도 포함된다. 이 “소재”란, 전술한 식료 로서의 종자, 과실, 이삭, 덩이줄기, 또는, 덩이뿌리 외에, 공업 원료 용도에 이용할 수 있는 소재 전반을 의미한다.
상기 소재로서는, 예를 들면, 아라키돈산이나 EPA를 포함하는 건강 식품, 필름, 생분해성 플라스틱, 기능성 섬유, 윤활유, 세제의 소재 등을 들 수 있다. 상기의 불포화 지방산은, 분자 내에 이중 결합을 복수 갖는 독특한 물성을 가진다. 이 때문에, 예를 들면, 본 발명의 형질 전환 식물체에 의해 아라키돈산이나 EPA를 생산시킴으로써 생산 코스트를 저감할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해, 친환경 생산 프로세스를 실현할 수 있다.
(5-5) 지방산 조성 변형 방법
본 발명에는, 본 발명에 따른 유전자를 이용하여 지방산 조성을 변형하는 방법이 포함된다. 예를 들면, 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 유전자를 도입한 형질 전환체를 제작함으로써 호스트 세포의 지방산 조성을 변형하는 것이 가능해진다. 지방산 조성을 변형하는 대상은 특별히 한정되는 것이 아니라, 식물 이외에도 동물, 세균, 효모 등, 모든 생물을 대상으로 하는 것이 가능하다.
(5-6) 유전자 검출 기구
본 발명에 따른 유전자 검출 기구는, 본 발명에 따른 유전자의 적어도 일부의 염기 서열 또는 그 상보 서열을 프로브로서 이용한 것이다. 유전자 검출 기구는, 여러 가지의 조건하에 있어서 본 발명의 유전자의 발현 패턴의 검출?측정 등에 이용할 수 있다.
본 발명의 유전자 검출 기구로서는, 예를 들면, 본 발명의 유전자와 특이적 으로 하이브리다이즈하는 상기 프로브를 기질(담체) 상에 고정화한 DNA칩을 들 수 있다. 여기에서 “DNA칩”이란, 주로, 합성한 올리고 뉴클레오티드를 프로브에 이용하는 합성형 DNA칩을 의미하지만, PCR 산물 등의 cDNA를 프로브에 이용하는 접합형 DNA 마이크로 어레이도 포함하는 것으로 한다.
프로브로서 이용하는 서열은, cDNA 서열 중에서 특징적인 서열을 특정하는 종래 공지의 방법에 따라 결정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, SAGE:Serial Analysis of Gene Expression법(Science 276:1268, 1997; Cell 88:243, 1997; Science 270:484, 1995; Nature 389:300, 1997; 미국 특허 제5,695,937호) 등을 들 수 있다.
또한, DNA칩의 제조에는, 공지의 방법을 채용하면 된다. 예를 들면, 올리고 뉴클레오티드로서 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 포토리소그래피 기술과 고상(solid phase)법 DNA 합성 기술의 조합에 의해, 기질 상에서 올리고 뉴클레오티드를 합성하면 된다. 한편, 올리고 뉴클레오티드로서 cDNA를 이용하는 경우에는, 어레이기를 이용하여 기질 상에 접착시키면 된다.
또한, 일반적인 DNA칩과 마찬가지로, 퍼펙트 매치 프로브(올리고 뉴클레오티드)와, 퍼펙트 매치 프로브에 있어서 1염기 치환된 미스매치 프로브를 배치하여 유전자의 검출 정확도를 보다 향상시켜도 된다. 또한, 상이한 유전자를 병행하여 검출하기 위해, 복수종의 올리고 뉴클레오티드를 동일한 기질 상에 고정하여 DNA칩을 구성해도 된다.
본 발명에 따른 유전자 검출 기구는, 상기 예시한 DNA칩에 한정되는 것이 아 니라, 본 발명에 따른 유전자의 적어도 일부의 염기 서열 또는 그 상보 서열을 프로브로서 이용한 것이면 된다.
(5-7) 항체
본 발명에 따른 항체는, 본 발명에 따른 단백질, 또는 그 부분 단백질?부분 펩티드를 항원으로 하여, 공지의 방법에 의해 폴리클로널 항체 또는 모노클로널 항체로서 얻어지는 항체이다. 공지의 방법으로는, 예를 들면, 문헌(Harlow 등의 「Antibodies: A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988)), 이와사키 등의 「모노클로널 항체 하이브리드마와 ELISA, 코단샤(講談社)(1991)」)에 기재된 방법을 들 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 항체는, 본 발명의 단백질의 검산?측정 등에 이용할 수 있다.
(5-8) 스크리닝(screening) 방법
본 발명에 따른 스크리닝 방법은, 본 발명에 따른 단백질을 이용하여, 당해 단백질을 조절하는 유전자, 또는 당해 단백질을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법이다. 본 발명의 스크리닝 방법으로는, 물질 간의 결합의 유무나 해리의 유무를 조사하는 종래 공지의 여러 가지의 방법을 적용할 수 있으며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명에 따른 단백질의 활성(Δ6 불포화화 활성, Δ6 쇄장 연장 활성 및/또는 Δ5 불포화화 활성)을 촉진하도록 하는 물질의 스크리닝을 들 수 있다.
또한, 본 발명에는, 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 유전자 또는 물질도 포함된다.
이하, 실시예를 기술하고 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명하는데, 물론, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것이 아니라, 세부에 대해서는 여러 가지 형태가 가능한 것은 물론이다. 또한, 본 발명은 전술한 실시 형태로 한정되는 것이 아니라, 청구항에 기술한 범위에서 여러 가지의 변경이 가능하며, 개시된 기술적 수단을 적절하게 조합하여 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
[실시예]
본 실시예에 있어서, 실험 방법은 특별히 한정하지 않은 한 Molecular Cloning(Sambrook et.al. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)에 기재되어 있는 방법에 따랐다.
[제1 실시예: 우산이끼 유래의 Δ6 불포화화 효소 유전자의 단리]
지금까지 클로닝된 Δ6 불포화화 효소의 아미노산 서열의 비교에 의해, 아미노산 서열 Trp-Trp-Lys-(Glu/Asp)-Lys-His-Asn(서열 번호 37) 및 Trp-Phe-Thr-Gly-Gly-Leu-Asn(서열 번호 38)이 보존되고 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 우산이끼 유래의 Δ6 불포화화 효소 유전자를 단리하기 위해, 상기의 아미노산 서열을 코딩하는 하기의 축퇴 프라이머(degenerate primer)를 이용하였다.
dD6DES-F:
5′-TGGTGGAA(A/G)GA(A/G/T/C)AA(A/G)CA(T/C)AA-3′(서열 번호 7)
dD6DES-R:
5′-(A/G)TTIA(A/G)ICCICCIGT(A/G)AACCA-3′(서열 번호 8)
(I는 이노신, () 내는 복수의 염기)
시료로는 E계통 우산이끼(Transgenic Res. 9, p179, 2000 참조)의 엽상체를 이용하였다. 엽상체로부터의 poly(A)+ RNA의 단리에 대해서는, 문헌(Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p605, 2003; Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p1667, 2003)에 기재된 방법에 따랐다. 단리한 poly(A)+RNA 1.5㎕를, Ready-To-Go T-primed First Strand kit(Amersham사 제품)를 이용하여 cDNA에 역전사하였다. PCR는 상기 cDNA 약 10ng을 주형으로 하여, 상기 프라이머(dD6DES-F 및 dD6DES-R) 및 효소(Takara Ex Taq, Takara사 제품) 0.5U를 이용하여, 제조자가 추천하는 방법으로 행하였다. 반응액량은 20㎕로 하고, GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems사 제품)을 이용하여, 94℃ 2분간 유지한 후, 94℃에서 1분간, 45℃에서 1.5분간, 72℃에서 2분간의 반응을 35회 반복하고, 그 후 4℃로 냉각하였다.
얻어진 PCR 산물을 1%(w/v) 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여, 종래의 Δ6 불포화화 효소의 아미노산 서열로부터 예상되는 사이즈를 갖는 증폭 단편을, Prep-A Gene(Bio-rad사 제품)을 이용하여 겔로부터 회수하였다. 회수한 증폭 단편을 pT7Blue Vector(Takara사 제품)에 연결하여, 대장균 Electro-max DH10B cells(Invitrogen사 제품, Carlsbad, CA)에 형질 전환하였다.
BigDye Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems사 제품) 및 automated sequencer ABI PRISM 377(Applied Biosystems사 제품)을 이용하여 얻어진 전 클론의 염기 서열을 결정하여, 목적하는 cDNA 서열을 갖는 것을 탐색하였다.
또한, 전체 길이 cDNA 서열을 취득하기 위해, 5′-RACE 및 3′-RACE를 행하였다. 이것에는, 5′-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0(Invitrogen사 제품), Ready-To-Go T-primed First Strand kit(Amersham사 제품) 및 하기의 프라이머 (MpDES6-02R 및 MpDES6-01F)를 이용하여 제조자가 추천하는 방법으로 행하였다.
MpDES6-02R: 5′-AAGTTGCCTTCGATGTTTCTGG-3′(서열 번호 9)
MpDES6-01F: 5′-GCTCGCCTGGAGCAAGGAAATC-3′(서열 번호 10)
그 결과, 1종류의 호모로그 유전자 후보가 단리되어, 이 유전자를 MpDES6 유전자로 하였다. 단리된 MpDES6 유전자의 cDNA의 길이(폴리 A 부분을 제외)는 2,522bp이고, 그 코딩하는 추정 아미노산 서열은 481 잔기였다. 그 염기 서열을 서열 번호 1, 아미노산 서열을 서열 번호 2에 기재하였다.
MpDES6 cDNA의 추정 아미노산 서열을 피스코미트렐라의 Δ6 불포화화 효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 47.5%의 동일성만을 나타내었다.
[제2 실시예: 우산이끼 유래의 Δ6 쇄장 연장효소 유전자의 단리]
지금까지 클로닝된 Δ6 쇄장 연장효소의 아미노산 서열의 비교에 의해, 아미노산 서열 Val-Glu-Phe-Met-Asp-Thr-Val(서열 번호 39) 및 Lys-Tyr-Leu-Phe-Trp-Gly-Arg(서열 번호 40)가 보존되고 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 우산이끼 유래의 Δ6 쇄장 연장효소 유전자를 단리하기 위해, 상기의 아미노산 서열을 코딩하는 하기의 축퇴 프라이머를 이용하였다.
dD6ELO-F:
5′-GTIGA(A/G)TT(T/C)ATGGA(T/C)ACIGT-3′)(서열 번호 11)
dD6ELO-R:
5′-C(G/T)ICCCCA(A/G)AAIA(A/G)(A/G)TA(T/C)TT-3′(서열 번호 12)
상기의 프라이머 (dD6ELO-F 및 dD6ELO-R)를 이용하여 PCR를 행하고, 얻어진 DNA 단편을 서브 클로닝하였다. 얻어진 클론의 염기 서열을 결정하고, 목적하는 cDNA 서열을 갖는 클론에 대해 아래와 같은 프라이머(MpELO1-02R 및 MpELO1-01F)를 이용하여 완전장 cDNA(full-length cDNA)를 취득하였다. 한편, 실험 재료 및 방법은 제1 실시예와 마찬가지이다.
MpELO1-02R: 5′-GCGAGCTTTCTCGTTCTTTCCC-3′(서열 번호 13)
MpELO1-01F: 5′-TATGATTTTGAAGCGCAACACG-3′(서열 번호 14)
그 결과, 1종류의 호모로그 유전자 후보가 단리되어, 이 유전자를 MpELO1 유전자로 하였다. MpELO1 유전자의 cDNA의 길이(폴리 A 부분을 제외)는 1,559bp이고, 추정 아미노산 서열은 290 잔기였다. 그 염기 서열을 서열 번호 3, 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타내었다.
MpELO1 cDNA의 추정 아미노산 서열을 피스코미트렐라의 Δ6 쇄장 연장효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 동일성은 62.7%였다.
[제3 실시예: 우산이끼 유래의 Δ5 불포화화 효소 유전자의 단리]
타 생물종의 Δ5 불포화화 효소는, 그 N 말단에 시토크롬 b5 도메인을 갖는다. 이것으로부터, 우산이끼 유래의 Δ5 불포화화 효소 유전자는, Δ6 불포화화 효소 유전자와 마찬가지로, 시토크롬 b5 도메인 융합형 불포화화 효소 유전자 패밀리 에 속하는 것이 예상되었다. 그러나, 규조나 진균에 있어서는, Δ5 불포화화 효소 및 Δ6 불포화화 효소간의 아미노산 서열 레벨에서의 상동성은 매우 낮다. 따라서, 사상균(M. alpina)의 Δ5 불포화화 효소 및 Δ6 불포화화 효소간의 아미노산 서열을 비교한 결과, 축퇴 프라이머 설계에 최저로 필요한 4에서 5 잔기 정도가 연속한 보존 서열이 국소적으로 존재하는 것을 찾아냈다. 놀랍게도, 이들 보존 서열은 이종의 Δ5 불포화화 효소의 아미노산 서열간보다, 동종내의 Δ5 불포화화 효소와 Δ6 불포화화 효소 사이에서 더 보존되고 있는 것을 찾아냈다. 이것으로부터, 시토크롬 b5 도메인 융합형 불포화화 효소 유전자에는, 종 특이적인 보존 서열이 존재하는 경우가 있다고 생각되었다. 따라서, 전술한 MpDES6과 Genetics 159, p981, 2001에 기재되어 있는 기능 미지의 MpDES에서, 염기 서열을 비교 검토한 결과, 2개소의 아미노산 서열(I(E/N)(G/D)KVYDV(서열 번호 41) 및 DPDI(Q/D)(Y/T)(M/V)P(서열 번호 42))의 아미노산 서열이 보존되어 있는 것을 찾아냈다. 각각의 아미노산 서열에 대응하는 축퇴 프라이머의 서열을 다음에 기재한다.
dD5DES-F:
5′-AT(A/T/C)(A/G)AIG(A/G)IAA(A/G)TITA(T/C)GA(T/C)GT-3′(서열 번호 15)
dD5DES-R:
5′-GGIA(T/C)I(G/T)(A/T)IT(G/C)(A/G/T)AT(A/G)TCIGG(A/G)TC-3′(서열 번호 16)
상기 프라이머 (dD5DES-F 및 dD5DES-R)를 이용하여 PCR를 행하고, 얻어진 DNA 단편을 서브 클로닝하였다. 얻어진 클론의 염기 서열을 결정하고, 목적하는 cDNA 서열을 갖는 클론에 대해 하기의 프라이머 (MpDES5-02R 및 MpDES5-01F)를 이용하여 완전장 cDNA를 취득하였다. 한편, 실험 재료 및 방법은, 제1 실시예와 마찬가지이다.
MpDES5-02R: 5′-GTGTGTACGATCCGTGGTTACC-3′(서열 번호 17)
MpDES5-01F: 5′-AAGGCGGGACAGGATTCAACAC-3′(서열 번호 18)
그 결과, 우산이끼 유래의 Δ5 불포화화 효소 유전자의 후보로서, 2종류의 길이가 상이한 클론 c1 및 c2를 단리하였다(c1: 2,427bp, c2: 2,285bp). c1과 c2의 염기 서열을 비교한 결과, 5′ 비번역 영역에서 얼터너티브?스플라이싱(선택적 스플라이싱)이 일어나고 있는 것이 분명해졌다. 얼터너티브?스플라이싱에 의한 해독틀의 변화는 없고, 모든 클론이 484개의 아미노산을 코딩하고 있었다(서열 번호 6). 이하, 2,427bp 길이의 클론 c1을 MpDES5 유전자(서열 번호 5)로 하여, 이하의 실시예에 이용하였다.
MpDES5 cDNA의 추정 아미노산 서열을 사상균(M. alpina)의 Δ5 불포화화 효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 31.4%의 동일성이었다. 우산이끼와 근친인 피스코미트렐라의 Δ5 불포화화 효소에 관해서는, 서열 정보가 공표되어 있지 않기 때문에, 여기에서는 비교하지 않았다.
[제4 실시예: 메탄올 자화성 효모(Pichia pastoris)를 이용한 기능 해석]
MpDES6, MpELO1 및 MpDES5의 cDNA의 기능을 조사하기 위해, 우선 개개의 ORF를 메탄올 유도성 프로모터 AOX1의 하류에 배치한 컨스트럭트를 제작하였다. 이러한 컨스트럭트를 메탄올 자화성 효모(Pichia pastoris)에 도입하여, 그 지방산 조 성을 해석하였다. MpDES6, MpELO1, 및, MpDES5의 cDNA 염기 서열의 ORF 부분을, 하기의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
(MpDES6 ORF 증폭용 프라이머)
MpD6-17F:
5′-GGAATTCGCGATGGCCTCGTCCACCACCAC-3′(서열 번호 19)
MpD6-18F:
5′-GGAATTCTACTTTCGCAGCGTATGCTACC-3′(서열 번호 20)
(MpELO1 ORF 증폭용 프라이머)
MpD6ELO1-15F:
5′-GGAATTCGCGATGGAGGCGTACGAGATGG-3′(서열 번호 21)
MpD6ELO1-16F:
5′-GGAATTCTTCTGCCTTTTTGCTCTTGATC-3′(서열 번호 22)
(MpDES5 ORF 증폭용 프라이머)
MpD5-11F:
5′-GTTGAATTCGACAGTTATGCCGCCACACGC-3′(서열 번호 23)
MpD5-12R:
5′-GTTGAATTCAGGCCCAAAGCATGCTGTCAC-3′(서열 번호 24)
이들 프라이머는, 밑줄로 나타낸 EcoRI 인식 서열을 포함하고 있어, 이것을 이하의 클로닝에 이용하였다. 또한, PCR에는 Pyrobest DNA polymerase(Takara사 제품) 0.5U를 이용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 반응액량 20㎕로 행하였다. 반응 조건은, 94℃에서 2분간 유지한 후, 94℃에서 1분간, 57℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 반응을 25회 반복하고, 그 후 4℃로 냉각하였다. 얻어진 각 ORF 단편을 EcoRI로 소화한 후, 제1 실시예에 기재한 방법으로 겔 정제를 행하였다. 그리고, 메탄올 자화성 효모의 발현 벡터 pPICZA(마커: 제오신 내성 유전자, Invitrogen사 제품) 내의 메탄올 유도성 프로모터 5′AOX1 하류의 EcoRI 부위에 센스 방향으로 연결하였다.
각각의 발현 컨스트럭트 및 대조군으로서의 pPICZA 벡터를, Pichia EasyComp kit(Invitrogen사 제품)를 이용하여 메탄올 자화성 효모의 PPY1 계통에 도입하고, 제오신 내성을 마커로 하여 형질 전환체를 취득하였다. 한편, 메탄올 자화성 효모는, Δ6 불포화화 효소의 기질인 리놀레산과 α-리놀렌산을 합성할 수 있지만, 아라키돈산이나 EPA의 그 외의 선구체는 합성할 수 없다.
도입한 유전자를 발현시키기 위해, EasySelect Pichia Expression Kit(Invitrogen사 제품)를 이용하여 당해 키트가 추천하는 방법에 따라, 각 형질 전환체를 1.0% 글리세롤만을 탄소원으로 하는 최소 배기 내에서 OD(600㎚)가 0.5가 될 때까지 배양한 후, O.5% 메탄올만을 탄소원으로 하는 최소 배기 내에서 30℃, 3일간, 포화 상태가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 각각의 형질 전환체의 지방산 조성을, GC-MS를 이용하여 공지의 방법(Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p605, 2003)에 의해 측정하였다.
MpDES6 유전자를 발현시킨 형질 전환체에서는, Δ6 불포화화 효소의 반응 산물인 γ-리놀렌산 및 스테아리돈산이, 전체 지방산의 각각 7.4% 및 0.7% 새롭게 검출되었다. 대조군으로서 pPICZA 벡터를 도입한 효모에서는 이들이 검출되지 않았다. 이상의 결과부터, MpDES6는 Δ6 불포화화 효소를 코딩하고 있는 것을 알 수 있었다.
MpELO1 유전자를 발현시킨 형질 전환체에서는, γ-리놀렌산을 첨가했을 경우에 디호모-γ-리놀렌산이 전체 지방산의 14.1%, 스테아리돈산을 첨가했을 경우에 에이코사테트라엔산이 1.5% 새롭게 검출되었다. 대조군으로서 pPICZA 벡터를 도입한 효모에서는, 이들이 검출되지 않았다. 이상의 결과로부터, MpELO1는 Δ6 쇄장 연장효소를 코딩하고 있는 것을 알 수 있었다.
MpDES5 유전자를 발현시킨 형질 전환체에서는, 디호모-γ-리놀렌산을 첨가했을 경우에 아라키돈산이 전체 지방산의 1.1%, 에이코사테트라엔산을 첨가했을 경우에 에이코사펜타엔산(EPA)이 0.1% 검출되었다. 대조군으로서 pPICZA 벡터를 도입한 효모에서는 이들이 검출되지 않았다. 이상의 결과로부터, MpDES5는 Δ5 불포화화 효소를 코딩하는 것을 알 수 있었다.
이상과 같이 우산이끼로부터, Δ6 불포화화 효소, Δ6 쇄장 연장효소 및 Δ5 불포화화 효소를 코딩하는 유전자로서, 각각 MpDES6, MpELO1 및 MpDES5를 취득할 수 있었다.
[제5 실시예: 메탄올 자화성 효모(P. pastoris)에서의 우산이끼 다중 불포화 지방산 생합성계의 재구성]
MpDES6, MpELO1 및 MpDES5를 공발현(共發現)시키기 위해, 상기 제4 실시예에서 제작한, EcoRI로 소화한 MpELO1 및 MpDES5의 ORF 증폭 단편을, 각각 별개의 메 탄올 자화성 효모 발현 벡터 pPIC3K(마커: HIS4 유전자, Invitrogen사 제품) 및 pPIC6A(마커: 블라스티시딘 내성 유전자, Invitrogen사 제품)의 5′AOX1 프로모터 하류의 EcoRI 부위에 센스 방향으로 연결하였다. 또한, MpDES6에 관해서는, 제4 실시예에서 제작한 발현 벡터를 이용하였다. 이하 각 발현 벡터를, 각각 pPICZA-MpDES6, pPIC3K-MpELO1 및 pPIC6A-MpDES5라고 표기한다.
우선, pPICZA-MpDES6, 또는, 대조군으로서의 pPICZA 벡터만을, 상기 제4 실시예에서 이용한 메탄올 자화성 효모 PPY1 계통과 동일한 지방산 조성을 갖는 메탄올 자화성 효모 PPY12 계통(his4, arg4)으로 형질 전환하여, 제오신 내성을 마커로 하여 형질 전환체를 취득하였다. 계속해서, pPIC3K-MpELO1, 또는, 대조군으로서의 pPIC3K 벡터만을, 각각, pPICZA-MpDES6, 또는 pPICZA만이 게놈 내에 조합된 형질 전환체에 도입하고, 히스티딘 합성능을 마커로 하여 형질 전환체를 취득하였다. 마지막으로, pPIC6A-MpDES5, 또는, 대조군으로서의 pPIC6A 벡터만을 pPICZA-MpDES6 및 pPIC3K-MpELO1 또는 pPICZA 및 pPIC3K가 게놈 내에 조합된 상기 형질 전환체에 도입하고, 블라스티시딘 내성을 마커로 하여 형질 전환체를 취득하였다.
얻어진 2종류 또는 3종류의 유전자가 도입된 형질 전환체를 이용하여, 우산이끼의 아라키돈산/EPA 생합성계의 재구성 실험을 행하였다. 우선, 상기 2종류의 유전자(MpDES6 및 MpELO1)를 도입하였다. 형질 전환체를 이용하여, MpDES6 유전자 및 MpELO1 유전자를 메탄올 자화성 효모 내에서 공발현시켰다. 그 결과, Δ6 불포화화 반응 산물인 γ-리놀렌산(전체 지방산의 2.9%) 및 스테아리돈산(전체 지방산의 0.4%) 외에, 그들의 쇄장 연장 반응 산물인 디호모-γ-리놀렌산(전체 지방산의 2.8%) 및 에이코사테트라엔산(전체 지방산의 0.2%)이 생성되었다. 대조군으로 한 형질 전환체에서는, 이들 지방산은 검출되지 않았다. 상기 형질 전환체에 MpDES5를 더 도입한 형질 전환체에서는, γ-리놀렌산(전체 지방산의 2.8%), 스테아리돈산(전체 지방산의 0.5%), 디호모-γ-리놀렌산(전체 지방산의 1.5%) 및 에이코사테트라엔산(전체 지방산의 0.1%)의 4종의 지방산 외에, 아라키돈산(전체 지방산의 0.1%) 및 에이코사펜타엔산(EPA, 전체 지방산의 0.03%)의 생성이 확인되었다. 대조군으로 한 형질 전환체에서는, 이러한 지방산은 검출되지 않았다. 이 결과로부터, 우산이끼 유래의 Δ6 불포화화 효소, Δ6 쇄장 연장효소 및 Δ5 불포화화 효소의 유전자를 발현시킴으로써, 우산이끼 이외의 생물종에 있어서도 다중 불포화 지방산 생합성계의 재구축이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
[제6 실시예: 벼에 도입하는 벡터의 구축 및 당해 벡터의 벼로의 도입]
벼에 있어서, MpDES6, MpELO1 및 MpDES5 유전자를 발현시키기 위해, 이하의 (i)～(iv)에 나타내는 순서로 발현 컨스트럭트를 제작하였다. 또한, 제작 순서를 도 1에 나타냈다.
(i) pBI221(TOYOBO사 제품)의 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 및, NOS 터미네이터간에 설계한 이하의 프라이머를 이용한 PCR에 의해, β-Glucuronidase(GUS) 유전자 부분을 제외한 발현 벡터 p35S-NOS를 제작하였다.
MK001(F): 5′-CGGGATCCTCTCCTGGCGCACCATCGTC-3′(서열 번호 25)
MK002(R): 5′-GGGGTACCAACGCGCTTTCCCACCMCG-3′(서열 번호 26)
한편, 프라이머 MK001(F)는 밑줄로 나타내는 BamHI 인식 서열을 포함하며 GUS 유전자의 3′ 말단에 어닐링하고, 프라이머 MK002(R)는 GUS 유전자의 5′ 말단에 어닐링한다(BamHI 사이트가 어닐링 부위의 상류에 존재한다). PCR에는 Pyrobest DNA polymerase(Takara사 제품) 0.5U를 이용하여, 제조자가 추천하는 방법에 따라 반응액량 50㎕로 행하였다. 반응 조건은, 96℃에서 5분간 유지한 후, 94℃에서 30초간, 68℃에서 4분간의 반응을 30회 반복하고, 그 후 4℃로 냉각하였다. 얻어진 각 ORF 단편을 BamHI 소화한 다음, 제1 실시예에 기재한 방법으로 겔 정제를 행한 후, 자기 연결시켰다.
(ⅱ) 다음으로 p35S-NOS의 XbaI 사이트에, MpDES6 유전자, MpELO1 유전자 및 MpDES5 유전자의 ORF를 각각 연결하였다. ORF 증폭에는, 밑줄로 나타내는 XbaI 인식 서열을 포함하는 이하의 프라이머를 이용하였다.
(MpDES6 ORF 증폭용 프라이머)
MpD6-21F: 5′-GCTCTAGAGCGATGGCCTCGTCCACCACC-3′(서열 번호 27)
MpD6-11R: 5′-GCTCTAGACTATACTTTCGCAGCGTATGC-3′(서열 번호 28)
(MpELO1 ORF 증폭용 프라이머)
MpD6ELO1-18F: 5′-GCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACGAGATGG-3′(서열 번호 29)
MpD6ELO1-13R: 5′-GCTCTAGATTATTCTGCCTTTTTGCTC-3′(서열 번호 30)
(MpDES5 ORF 증폭용 프라이머)
MpD5-22F: 5′-GCTCTAGAGACAGTTATGCCGCCACACGC-3′(서열 번호 31)
MpD5-23R: 5′-GCTCTAGAAGGCCCAAAGCATGCTGTCAC-3′(서열 번호 32)
PCR에는 Pyrobest DNA polymerase(Takara사 제품) 0.5U를 이용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라, 반응액량 20㎕로 행하였다. 반응 조건은, 94℃에서 2분간 유지한 후, 94℃에서 1분간, 57℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 반응을 25회 반복하고, 그 다음 4℃로 냉각하였다. 얻어진 각 ORF 단편을 XbaI로 소화한 후, 제1 실시예에 기재한 방법으로 겔 정제를 행하여 클로닝에 이용하였다.
(ⅲ) 얻어진 각 유전자의 발현 컨스트럭트(각각을 p35S-MpDES6, p35S-MpELO1, p35S-MpDES5라고 표기)가 모두 CaMV35S 프로모터 5′ 말단에 PstI 사이트를, NOS 터미네이터 3′ 말단에 EcoRI 사이트를 갖는 것을 이용하여, 상기 3 유전자의 발현 카세트를 연결하였다. 우선, 이하에 기술하는 프라이머를 이용하여 p35S-MpDES5를 주형으로서 PCR를 행하고, MpDES5 유전자의 발현 카세트 부분을 증폭하여, p35S-MpDES6의 CaMV35S 프로모터 5′ 말단에 있는 PstI 사이트에 클로닝하였다(도 1 참조).
(MpDES5 유전자 발현 카세트 증폭용 프라이머)
M13R: 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′(서열 번호 33)
NOS-R4-PST: 5′-AAACTGCAGATTCCCGATCTAGTAACATAG-3′(서열 번호 34)
한편, M13R 프라이머는 CaMV35S 프로모터 상류의 벡터 서열에 어닐링한다. 또한, NOS-R4-PST 프라이머는, 밑줄로 나타내는 PstI 인식 서열을 포함하고, NOS 터미네이터 3′ 말단에 어닐링한다. 마찬가지로 NOS 터미네이터 3′ 말단에 존재하는 EcoRI 사이트는 포함하지 않는다.
PCR에는 Pyrobest DNA polymerase(Takara사 제품) 0.5U를 이용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라, 반응액량 20㎕로 행하였다. 반응 조건은, 94℃에서 2분간 유지한 후, 94℃에서 1분간, 57℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 반응을 25회 반복하고, 그 후 4℃로 냉각하였다. 얻어진 DNA 단편을 PstI로 소화한 다음, 제1 실시예에 기재한 방법으로 겔 정제를 행하여, MpDES6 유전자의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드(p35S-MpDES6)의 PstI 사이트에 클로닝하였다.
(ⅳ) 상기에서 얻어진, MpDES5 및 MpDES6 유전자의 발현 카세트를 연결시킨 컨스트럭트(p35S-MpDES5/35S-MpDES6으로 표기)에, 다시 MpELO1 유전자의 발현 카세트를 연결하였다. 이하의 프라이머를 이용하여 p35S-MpELO1을 주형으로서 PCR를 행하고, MpELO1 유전자의 발현 카세트 부분을 증폭하여 MpDES6 유전자 발현 카세트 내의 NOS 터미네이터 3′ 말단에 있는 EcoRI 사이트에 클로닝하였다.
(MpELO1 유전자 발현 카세트 증폭용 프라이머)
35S-F3-EI: 5′-CCGGAATTCGCATGCCTGCAGGTCCCCAGA-3′(서열 번호 35)
M13F: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′(서열 번호 36)
한편, 35S-F3-EI 프라이머는, 밑줄로 나타내는 EcoRI 인식 서열을 포함하고 CaMV35S 프로모터의 5′ 말단에 어닐링한다. 또한, M13F 프라이머는 NOS 터미네이터 하류의 벡터 서열에 어닐링한다.
PCR에는 Pyrobest DNA polymerase(Takara사 제품) 0.5U를 이용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라, 반응액량 20㎕로 행하였다. 반응 조건은, 94℃에서 2분간 유지한 후, 94℃에서 1분간, 57℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 반응을 25회 반복하고, 그 후 4℃로 냉각하였다. 얻어진 DNA 단편을 EcoRI로 소화한 후, 제1 실시예에 기재한 방법으로 겔 정제를 행하고, MpDES5 및 MpDES6 유전자의 발현 카세트를 연결시킨 컨스트럭트(p35S-MpDES5/35S-MpDES6)의 EcoRI 부위로 클로닝하였다.
이상의 조작에 의해, 3 유전자의 발현 카세트가 MpDES5, MpDES6, MpELO1의 순서로 연결된 발현 컨스트럭트(p35S-MpDES5/35S-MpDES6/p35S-MpELO 1)를 제작하였다.
이와 같이 하여 얻어진 상기 컨스트럭트를, 공지의 방법(Genes Genet. Syst. 73, p219, 1998)으로 비알라포스(bialaphos)를 선발 마커로서 갖는 플라스미드와 함께, 파티클건으로 벼에 도입하여 형질 전환 벼를 취득하였다.
[제7 실시예: 담배(N. tabacum SR-1)에서의 우산이끼 다중 불포화 지방산 합성계의 재구성]
본 실시예에서는, 전술한 우산이끼 유래의 불포화 지방산 합성효소 유전자, 즉, MpDES6 유전자, MpDES5 유전자 및 MpELO1 유전자가 식물체 내에서 양호하게 기능하는 것을 확인하였다.
구체적으로는, 담배에 MpDES6 유전자, MpDES5 유전자, 및 MpELO1 유전자를 도입하고, 이 담배 내에서 아라키돈산 등이 생산되는 것을 확인하였다. 비교 대조군으로서 사상균(M.alpina) 유래의 Δ6 불포화화 효소 유전자(MaDES6), Δ5 불포화화 효소 유전자(MaDES5), Δ6 지방산 쇄장 연장효소(MaELO)의 3 유전자를 도입한 담배를 제작하였다.
(i) 사상균 유래 유전자를 포함하는 벡터(pSPB1519)의 구축
pE2113(Mitsuhara et al. Plant Cell Physiol. 37, 45-59 1996)은, 인헨서 서열의 반복을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(El235S) 프로모터 및 노팔린 신타아제(nos) 터미네이터를 갖는다.
pE2113을 SnaBI로 소화한 후, XhoI 링커(TAKARA사)와 연결함으로써, 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드를 SacI로 소화한 후, 평활 말단화하고 BamHI 링커(TAKARA사)와 연결함으로써, pUE7을 제작하였다. pUE7을 HindIII와 EcoRI로 소화함으로써 얻어지는 DNA 단편 중 El235S 프로모터를 갖는 단편과, HindIII와 EcoRI로 소화한 식물 형질 전환용 바이너리(binary) 벡터 pBINPLUS(van Engelen et al. Transgenic research 4, p288, 1995)를 연결함으로써, pSPB505를 제작하였다.
한편, MaDES6 유전자를 포함하는 플라스미드인 pMLD101을 XhoI로 소화한 다음, 다시 BamHI로 부분 소화함으로써, 약 1.6kb의 DNA 단편을 얻었다. 이 단면과 pSB505를 XhoI와 BamHI로 소화하여 얻어지는 바이너리 벡터 부분의 DNA 단편을 연결함으로써, pSPB559를 제작하였다.
pUCAP(van Engelen et al. Transgenic research 4, p288, 1995)를 AscI로 소화한 후, 평활 말단화하고 PacI 링커와 연결함으로써 pUCAPP를 제작하였다.
pE2113을 SnaBI로 소화한 후, BamHI 링커(TAKARA사)와 연결함으로써 pUE6을 제작하였다. pUE6을 SacI로 소화한 후, 평활 말단화하고 SalI 링커(TAKARA사)와 연결함으로써 pUE8을 제작하였다. pUE8을 HindIII 및 EcoRI로 소화하여 얻어지는 DNA 단편 중 El235S 프로모터를 갖는 단편을, pUCAPP의 HindIII-EcoRI간에 삽입함으로써, 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드를 BamHI와 SalI로 소화하여 얻어진 DNA 단편과, MaELO 유전자의 cDNA를 BamHI 및 XhoI로 소화하여 얻어진 DNA 단편을 연결하여, pSPB1130을 제작하였다. pSPB1130을 PacI로 소화하여 얻어진 약 2.3kb의 DNA 단편을 pBINPLUS의 PacI 사이트에 삽입하였다. MaELO 유전자의 전사 방향과 pBINPLUS 상의 nptII 유전자의 전사 방향이 같은 방향으로 되어 있는 플라스미드를 선택하고 그 플라스미드를 pSPB1157P로 하였다.
또한, 전술한 pSPB559를 PacI로 소화한 후, 평활 말단화하여 AscI 링커와 연결함으로써, pSPB559A를 제작하였다. 그리고, pSPB559A를 AscI로 소화하여 얻어지는 MaDES6 유전자를 포함하는 DNA 단편을, pSPB1157P의 AscI 사이트에 삽입함으로써, pSPB1157을 제작하였다.
pCGP1364(Plant Cell Physiol. 36, 1023, 1995)를 HindIII 및 SacII로 소화하여 얻어지는 약 1.3kb의 DNA 단편과, pCGP1364를 PstI로 소화하고 평활 말단화한 다음 SacII로 소화하여 얻어지는 약 2.9kb의 DNA 단편을 연결한 다음, pUCAPA를 SacI로 소화하고 평활 말단화한 후 다시 HindIII로 소화하여 얻어지는 약 2.7kb의 DNA 단편을 연결함으로써, pSPB184를 얻었다.
한편, MaDES5 유전자가 서브 클로닝된 pCRII 벡터로부터, XbaI와 KpnI에 의한 소화에 의해 MaDES5 유전자를 포함하는 DNA 단편을 잘라냈다. 이 DNA 단편과 전술한 pSPB184를 XbaI와 KpnI로 소화하여 얻어진 DNA 단편을 연결함으로써, pSPB1519A를 제작하였다. pSPB1519A를 AscI로 소화하여 얻어진 DNA 단편을 pSPBl157의 AscI 사이트에 삽입하여 pSPB1519를 제작했다. 이 pSPB1519 상에서, MaDES6 유전자, MaDES5 유전자 및 MaELO 유전자는 같은 방향으로 전사되고, 같은 구성적 프로모터의 제어하에 있다.
(ⅱ) 우산이끼 유래 유전자의 벡터(pSPB2368)의 구축
pUCAP(van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995)를 AscI로 소화한 후 SgfI 링커와 연결하고, 다시, PacI로 소화한 다음 FseI 링커와 연결함으로써, pUCSAPF를 제작하였다. 또한, pBINPLUS에도 마찬가지의 처리를 실시하여, pBINSAPF를 제작하였다.
그 밖에 서브 클로닝용의 벡터로서, pUC19를 HindIII로 소화한 후 PacI 링커와 연결하고, 다시, EcoRI로 소화한 다음 FseI 링커와 연결함으로써, pUCPF를 제작하였다. 또한, pUC19를 HindIII로 소화한 후 SgfI 링커와 연결하고, 다시, EcoRI로 소화한 다음 AscI 링커와 연결함으로써, pUCSA를 제작하였다. pUCSAPF의 HindIII-XbaI 사이에 El235S를, SacI-EcoRI 사이에 마노핀(mannopin) 합성효소(mas) 유전자 터미네이터를 각각 삽입한 벡터를, XbaI 및 SacI로 소화한 후, 말단을 평활화함으로써 pSPB2353A를 얻었다. pSPB2353A의 평활 말단에, p35S-MpDES6으로부터 XbaI로 잘라내 말단을 평활화한 MpDES6 유전자를 포함하는 DNA 단편을 연결하여, pSPB2353을 제작하였다.
pUCSA의 HindIII-XbaI 사이에 El235S를, SacI-EcoRI 사이에 마노핀 합성효소(mas) 유전자 터미네이터를 각각 삽입한 벡터를, XbaI, SacI로 소화함으로써, pSPB2355A를 제작하였다.
한편, p35S-MpELO1을 주형으로 하여, 하기의 프라이머, XbaMpELOf 및 SacMpELOr를 이용하여 PCR를 행하였다.
XbaMpELOf: 5’-AGTCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACG-3′(서열 번호 43)
SacMpELOr: 5’-CAGTGAGCTCGGTGTCTTATTCTGCC-3′(서열 번호 44)
PCR에는, 효소로서 고정밀도 KOD+DNA 폴리머라아제(Toyobo)를 이용하여, 94℃에서 2분간 유지한 후, 94℃에서 15초, 68℃에서 1 내지 3분의 사이클을 25회 반복하였다. 이와 같이 하여 조제된 MpELO1 DNA 단편을 XbaI 및 SacI로 소화한 것을, 전술한 pSPB2355A에 연결하여 pSPB2355를 제작하였다. 또한, pSPB2355를 SgfI, AscI로 소화하여 얻어진 DNA 단편을 SgfI 및 AscI로 소화한 pSPB2353에 연결하여 pSPB2361을 제작하였다.
pUCPF의 HindIII-XbaI 사이트에 El235S를, SacI-EcoRI 사이트에 마노핀 합성효소(mas) 유전자 터미네이터를 각각 삽입한 벡터를, XbaI 및 SacI로 소화함으로써, pSPB2352A를 제작하였다.
한편, p35S-MpDES5를 주형으로, 하기의 프라이머, XbaMpD5f 및 SacMpD5r를 이용하여 PCR를 행하였다. PCR의 반응 조건은, 상기의 PCR 조건과 마찬가지이다.
XbaMpD5f: 5′-AGCTTCTAGAGCCATGCCGCCACACGCCC-3′(서열 번호 45)
SacMpD5r: 5′-CAGTGAGCTCTCAGCCATCCAGTCGT-3′(서열 번호 46)
PCR에 의해 조제된 MpD5 DNA 단편을 XbaI, SacI로 소화한 것을, pSPB2352A에 연결하여 pSPB2352를 제작하였다.
pBINSAPF를 PacI 및 FseI로 소화하여 얻어진 DNA 단편에, pSPB2352로부터 PacI 및 FseI로 잘라낸 MpDES5 유전자를 포함하는 DNA 단편을 연결하여, pSPB2368A를 제작하였다. 또한, pSPB2368A를 SgfI 및 PacI로 소화한 것에 pSPB2361로부터 SgfI 및 PacI로 잘라낸 MpDES6 유전자 및 MpELO1 유전자를 포함하는 DNA 단편을 연결함으로써, pSPB2368을 얻었다. 이 플라스미드 상에서, MpDES6 유전자, MpDES5 유전자 및 MpELO1 유전자는 같은 방향으로 전사되고, 같은 구성적 프로모터의 제어하에 있다.
(ⅲ) 담배로의 유전자 도입
계속하여, 공지의 방법(Plant J. 5, 81, 1994)에 기초하여, pSPB2368 또는 pSPB1519를 이용하여 Agrobacterium tumefaciens(균주: Agl0(Lazo et al. 1991, Biotechnology 9: 963-967))를 형질 전환하였다. 이 pSPB2368 또는 pSPB1519를 갖는 형질 전환체 아그로박테리움을 담배잎 디스크에 감염시켰다. 이와 같이 하여 얻어진 변형 담배의 잎으로부터 RNeasy Plant mini Kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하고, 정법에 따라 RT-PCR에 의해 도입한 유전자가 발현하고 있는 계통을 선택하였다.
이와 같이 하여 얻어진 사상균 유래의 효소 유전자로 이루어지는 pSPB1519를 도입한 담배(pSPB1519 형질 전환 담배), 우산이끼 유래의 효소 유전자로 이루어지는 pSPB2368을 도입한 담배(pSPB2368 형질 전환 담배)의 잎으로부터, 공지의 방법(후지노 야스히코 편(1978), 생물화학 실험법 9, 학회 출판 센터; 야마다 아키히로 편(1989), 생물화학 실험법 24, 학회 출판 센터)에 따라, 지질의 추출을 행하였다. 얻어진 지질을 가스크로마토그래피(Hewlett Packard사 HP-6800)로 분석하여, 그 결과를 표 1에 나타낸다.
또한, 컨트롤로서 유전자가 도입되어 있지 않은 담배의 잎을 이용하여, 같은 분석을 행하였다.
Control(%) Control
(mg/gFW)		 pSPB2368(%) pSPB2368
(mg/gFW)		 pSPB1519(%)
리놀레산 9.55 1.17 1.37 0.2 9.51
α리놀렌산 49.99 6.12 17.83 2.58 39.24
γ리놀렌산 0 0 4.06 0.59 3.37
디호모γ리놀렌산 0 0 10.85 1.57 3.09
아라키돈산 0 0 10.27 1.49 0
에이코사테트라엔산 0 0 4.89 0.71 0
에이코사펜타엔산 0 0 2.68 0.39 0
전체 지질량 - 12.25 - 14.48 -
본 실시예의 가스크로마토그래피에 의한 분석 조건을 이하에 기술한다.
(가스크로마트그래피 분석 조건)
컬럼: Supelco SP-2330, Fused Silica Capillary Column, 30m×O.32㎜ ID, O.2㎛
온도: Inj: 240℃, Det: 250℃, Oven: 180℃ 3분, 180℃→220℃(2℃/min)
컬럼 유량: 30㎝/sec, 압력 200kPa, 검출기 FID
크로마토그램 중의 각 피크는 표준 지방산의 메틸 에스테르의 리텐션 타임(Retention time)과 GC-MASS(Hewlett Packard사, HP-5973) 분석에 의해 결정하고, 또한 피크 면적으로부터 각 지방산의 비율을 결정하였다.
표 1에 있어서, Control은 컨트롤을, pSPB2368은 pSPB2368 형질 전환 담배를, pSPB1519는 pSPB1519 형질 전환 담배를 나타낸다.
표 1에 나타내는 결과로부터, 사상균 유래의 효소 유전자로 이루어지는 pSPB1519를 도입한 담배(pSPB1519 형질 전환 담배)에서는, 디호모-γ-리놀렌산의 축적은 확인할 수 있었지만, 아라키돈산의 축적은 인정되지 않았다. 한편, 우산이끼 유래의 효소 유전자로 이루어지는 pSPB2368을 도입한 담배(pSPB2368 형질 전환 담배)에서는 아라키돈산 뿐만이 아니라, 에이코사테트라엔산 및 에이코사펜타엔산의 축적도 확인할 수 있었다. 이것으로부터, 고등 식물에 있어서는 사상균 유래의 효소보다 우산이끼 유래의 효소가 기능적으로 우수하여, 리놀레산이나 α리놀렌산을 기질로 하여 아라키돈산을 비롯한 다중 불포화 지방산을 합성할 수 있다고 생각되었다.
Abbadi 등은, 규조(Phaeodactylum tricornutum)의 Δ6 불포화화 효소, Δ5 불포화화 효소 및 피스코미트렐라(Physcomitrella patens)의 쇄장 연장효소의 유전자를, 담배 및 아마(Linum usitatissimum)에 도입함으로써, 아라키돈산을 담배의 종자에 1.5%, 아마의 종자에 1.0% 축적시킨 것을 보고하고 있다(Amine Abbadi et al. Plant Cell 16, 2734-2748, 2004).
본 실시예에 있어서는, 우산이끼 유래의 Δ6 불포화화 효소, Δ5 불포화화 효소 및 쇄장 연장효소의 각 유전자를 담배에 도입함으로써, 담배의 잎에 아라키돈산을 10% 이상 축적시키고 있다. 이 결과로부터, 본 실시예의 pSPB2368 형질 전환 담배는, 전술한 보고와 비교하여도, 보다 효율적으로 다중 불포화 지방산을 합성할 수 있는 능력이 있다는 것이 시사되었다.
또한, 하프토조(Isochrysis galbana)의 Δ9 쇄장 연장효소, 연두벌레(Englena gracilis)의 Δ8 불포화화 효소, 사상균의 Δ5 불포화화 효소의 3 종류의 유전자를 이용하여, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 지질의 변형을 행한 보고에서는, 잎 내에서 아라키돈산이 총 지질에 대해 6.6mol%, C20 이상의 지질이 22.5mol%였다(Baoxiu Qi et al. Nature Biotechnology 22, 739-745, 2004). 이 보고에서는, Δ6 불포화화 효소, Δ5 불포화화 효소 및 쇄장 연장효소를 이용하는 경로와는 별개의 변형 경로에서 다중 불포화 지방산을 만들고 있어, 단순 비교는 할 수 없지만, 우산이끼의 효소를 이용하는 편이 보다 많은 다중 불포화 지방산을 축적하는 것을 알 수 있었다.
총 지질의 30% 이상이 변형 지방산으로 되어 있는 pSPB2368 형질 전환 담배에서는, 형태적인 이상은 볼 수 없었다. 또한, 임성에도 문제가 없고, 많은 종자를 맺기 때문에, 이소적(異所的)인 다중 불포화 지방산의 증가가 식물의 생육에 미치는 영향은 적다고 생각할 수 있었다.
지금까지 보고되고 있는 유전자 변형 식물에서의 C20 이상의 다중 불포화 지방산의 생산은 총 지질의 20% 전후, 아라키돈산에 한정하면 6% 전후가 한계이다. 그러나, 본 실시예와 같이, 우산이끼 유래의 지방산 합성효소를 이용함으로써, 이 한계를 넘어 보다 많은 다중 불포화 지방산을 식물에서 생산할 수 있다고 생각된다.
한편, 실시예에 있어서의 구체적인 실시 형태 또는 실시예는, 어디까지나, 본 발명의 기술 내용을 분명히 하는 것으로서, 그러한 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어야 할 것이 아니라, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 특허 청구 범위 내에서 여러 가지로 변경하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자는, 동일종의 우산이끼로부터 단리된 Δ5 불포화화 효소 유전자, Δ6 불포화화 효소 유전자 및 Δ6 쇄장 연장효소 유전자이다. 따라서, 이들 3 종류의 유전자를 식물 내에서 동시에 발현시켰을 경우에, 상이한 생물종 유래의 복수의 유전자를 발현시키는 것보다, 식물 내에서 양호하게 기능하는 효과를 나타낸다. 또한, 우산이끼는 고등 식물의 모델계로 생각되기 때문에, 이들 유전자는, 식물 이외의 생물종 유래의 유전자보다 식물 내에서 양호하게 기능할 수 있다는 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 형질 전환체는, 아라키돈산이나 에이코사펜타엔산(EPA) 등의 다중 불포화 지방산을 생산할 수 있다고 하는 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 형질 전환 식물은, 저비용이면서 친환경 생산 프로세스로 아라키돈산이나 EPA 등의 다중 불포화 지방산을 생산할 수 있는 효과를 나타낸다. 이렇게 하여 얻어진 아라키돈산이나 EPA는, 염가의 다목적 재료로서 활용할 수 있는 효과를 나타낸다. 또한, 상기 형질 전환 식물체를 식료로서 이용했을 경우, 아라키돈산이나 EPA의 함량이 높은 식료로서의 가치가 높아지는 효과를 나타낸다.
이상과 같이, 본 발명의 유전자?단백질은 아라키돈산이나 EPA의 생산에 유용하다. 또한, 본 발명의 유전자를 발현 가능하게 도입한 형질 전환체는, 제약 산업, 식품 산업, 각종 소재 산업 등에서, 아라키돈산이나 EPA를 생산하는데 있어서 매우 유용하다. 또한, 특히, 상기 형질 전환체가 식물체인 경우, 식물체 내의 아라키돈산이나 EPA의 함량이 증가하므로, 농업 분야 등에 있어서 매우 유용하다.
<110> Suntory Limited <120> UNSATURATED FATTY ACID SYNTHASE GENE ORIGINATING IN MARCHANTIALES PLANT AND UTILIZATION OF THE SAME <150> PCT/JP2003-425673 <151> 2003-12-22 <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2519 <212> DNA <213> Marchantia polymorpha <400> 1 atagatccaa tttcataagt cgacgagaaa ggcagaaggc gagaagcggc aggcagcgag 60 cgcgagcgcc agagctcttg ctcccctcgc tcatcgctcg cattgccgca ttttgtgagt 120 gtcggactga tcactcagtc cgtcactgca aacgcgagcg agcgagagtg cgagtgagcg 180 agcgagcgag cgagagccgc ggtgtgtctg tgagatccaa tcctttttct gctttgcgcg 240 ctgtggggcg cgatggcctc gtccaccacc accgccgtga agcaatcttc gggtgggctg 300 tggtcgaaat ggggcaccgg cagcaacttg agcttcgtgt cgcgcaagga gcagcagcag 360 cagcagcagc agagctctcc cgaggcgtcg actcccgcgg cgcagcagga gaaatccatc 420 agtagagaat ccatccccga gggcttcttg accgtggagg aggtgtcgaa gcacgacaat 480 ccgagcgact gctggatcgt catcaacgac aaggtgtacg acgtgagcgc attcgggaag 540 acgcatccgg gcggccctgt gatcttcacg caggccggcc gcgacgccac ggattctttc 600 aaggttttcc actccgccaa ggcgtggcag 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tgtttctgtc acagccaggc 2340 ggtgaatagt aaagccaatt caacacatac gggagaagat gggtcgatat ttgtatttgg 2400 cagggtgtcc agatttcacc catcagtctc tcacttgctt gtatgtccct gacgtgcttc 2460 aaaattttgc gcggggaatc atcaatatac ttaccatttg taaaaaaaaa aaaaaaaaa 2519 <210> 2 <211> 481 <212> PRT <213> Marchantia polymorpha <400> 2 Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Val Lys Gln Ser Ser Gly Gly Leu 1 5 10 15 Trp Ser Lys Trp Gly Thr Gly Ser Asn Leu Ser Phe Val Ser Arg Lys 20 25 30 Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Ser Pro Glu Ala Ser Thr Pro 35 40 45 Ala Ala Gln Gln Glu Lys Ser Ile Ser Arg Glu Ser Ile Pro Glu Gly 50 55 60 Phe Leu Thr Val Glu Glu Val Ser Lys His Asp Asn Pro Ser Asp Cys 65 70 75 80 Trp Ile Val Ile Asn Asp Lys Val Tyr Asp Val Ser Ala Phe Gly Lys 85 90 95 Thr His Pro Gly Gly Pro Val Ile Phe Thr Gln Ala Gly Arg Asp Ala 100 105 110 Thr Asp Ser Phe Lys Val Phe His Ser Ala Lys Ala Trp Gln Phe Leu 115 120 125 Gln Asp Leu Tyr Ile Gly Asp Leu Tyr Asn Ala Glu Pro Val Ser Glu 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Arg Asp Leu Arg Thr Ala Phe Met Arg Ser Gln 145 150 155 160 Leu Phe Lys Ser Ser Lys Met Tyr Tyr Val Thr Lys Cys Val Thr Asn 165 170 175 Phe Ala Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Val Ile Ala Trp Ser Gln Thr 180 185 190 Tyr Leu Ala Val Leu Cys Ser Ser Phe Leu Leu Ala Leu Phe Trp Gln 195 200 205 Gln Cys Gly Trp Leu Ser His Asp Phe Leu His His Gln Val Thr Glu 210 215 220 Asn Arg Ser Leu Asn Thr Tyr Phe Gly Gly Leu Phe Trp Gly Asn Phe 225 230 235 240 Ala Gln Gly Tyr Ser Val Gly Trp Trp Lys Thr Lys His Asn Val His 245 250 255 His Ala Ala Thr Asn Glu Cys Asp Asp Lys Tyr Gln Pro Ile Asp Pro 260 265 270 Asp Ile Asp Thr Val Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu Ile Leu Ala 275 280 285 Thr Val Asp Asp Gln Phe Phe Arg Ser Ile Ile Ser Val Gln His Leu 290 295 300 Leu Phe Phe Pro Leu Leu Phe Leu Ala Arg Phe Ser Trp Leu His Ser 305 310 315 320 Ser Trp Ala His Ala Ser Asn Phe Glu Met Pro Arg Tyr Met Arg Trp 325 330 335 Ala Glu Lys Ala Ser Leu Leu Gly His Tyr Gly Ala Ser Ile Gly Ala 340 345 350 Ala Phe Tyr Ile Leu Pro Ile Pro Gln Ala Ile Cys Trp Leu Phe Leu 355 360 365 Ser Gln Leu Phe Cys Gly Ala Leu Leu Ser Ile Val Phe Val Ile Ser 370 375 380 His Asn Gly Met Asp Val Tyr Asn Asp Pro Arg Asp Phe Val Thr Ala 385 390 395 400 Gln Val Thr Ser Thr Arg Asn Ile Glu Gly Asn Phe Phe Asn Asp Trp 405 410 415 Phe Thr Gly Gly Leu Asn Arg Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Ser 420 425 430 Leu Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Val Ala Pro His Val Lys Ala Leu 435 440 445 Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu Glu Leu Ser Leu Gly Thr Gly 450 455 460 Val Cys Arg Val Phe Asn Arg Leu Val Glu Val Ala Tyr Ala Ala Lys 465 470 475 480 Val <210> 3 <211> 1577 <212> DNA <213> Marchantia polymorpha <400> 3 ctcaacgctc tctctcgccc gccctctgtc ttccgctgcg ccttcttctc ggcgcctctt 60 tctgtcgaga ggagcggcag ctgcagctct cgagagaggg gagcaggacg agagcgaggg 120 cgaatccgcc gagagtcgat cgggattggg tagaaggagg agaaggagga gaagaggagg 180 aggaggagca gcgatggagg cgtacgagat ggtggatagt tttgtgtcga agacggtttt 240 cgaaacgctg cagagactga ggggcggagt cgtgttgacg gaatctgcga 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Marchantia polymorpha <400> 5 tcacattgct ggtcgtcgga gggaggtgca caatctgggg ggctgtcatc aatgcgacgg 60 tgtttcgaag agatcgctgc gagtggcgct gagtttcttg ccgctttcta cctgagctga 120 tgcctgctgc tgctgcctag agctgcttgg tgctgcttgg ggctgctata agagcgcgtc 180 gacagcgagt gtctctcgcg gtcctcattc gtggggtgct gtcgttccag tttagagccc 240 gctggacgta cagccggtgc tggaaattga ttttgtgaaa agcgagccta cctctatcca 300 tcatcgtcgc ccgtggtggc agatcttccg gattcctcat gcgcggatcg tggtcgcttt 360 gaaggtcgac agttatgccg ccacacgccc ctgactccac aggtcttggg cccgaagttt 420 tccgcctgcc tgatgacgcg atcccggccc aggatcgcag atctacacag aagaaatact 480 cgctttcaga cgtcagcaag cacaacactc cgaatgattg ctggctcgta atttggggga 540 aggtgtacga tgttacttcg tgggttaagg tccatccagg tggaagtctc atctttgtga 600 aggcgggaca ggattcaaca caactctttg attcttatca ccccctctat gtcagaaagc 660 tacttgcaca gttctgcatt ggtgaactcc aaacgagtgc gggagatgag aagttcaagt 720 cttcaacgtt ggagtatgct ggtgaagaac atgaagtatt ttaccacact ctcaagcagc 780 gcgtggaaac gtacttccgc aagcagaaga taaatcctcg ataccatccg caaatgcttg 840 tgaagtcagc cgtgatcatt ggaacccttc ttctctgtta ctattttggc ttcttctggt 900 ctcaaaatgt actcctctcg atgtttctgg caagcatcat ggggttctgc actgcggagg 960 tgggcatgtc catcatgcac gatggtaacc acggatcgta cacacaatct accttgcttg 1020 gttacgtcat gggcgccact cttgatctgg tgggagctag cagtttcatg tggaggcagc 1080 agcatgtggc cgggcaccac tcgttcacca acatcgacca ttacgatcca gacattcgtg 1140 tgaaggatcc tgatttacga cgggttactt ctcaacaacc ccgaagatgg tttcacgagt 1200 atcagcatat ctacttagga gtactctatg gcgttcttgc cttaaaaagt gtgttgattg 1260 atgatttcag cgccttcttc agtggtgcta tcggcccagt aaagatagct caaatgacac 1320 cactcgagat gggcgtcttc tggggaggga aggttgtgta cgcactgtac atgtttttgc 1380 tccctatgat gtatggtcaa tacaacattc ttactttcat tggtctctac attctctcac 1440 agttagttgc agggtggact cttgccctct tctttcaagt agcacacgtt gtcgacgatg 1500 cagtatttcc cgttgcggaa acagatggtg gaaaagcaaa gattccttct ggttgggcag 1560 aaatgcaggt cagaaccact accaatttca gctcacgatc aatgttctgg acacatatta 1620 gtggcggtct gaaccatcag atcgagcacc atcttttccc gggtgtctgt catgttcact 1680 acccaagcat acagccaatc gtgaaggcta cctgtgacga gttcaacgtg ccttatactt 1740 cctaccccac tttctgggcg gcccttaggg cacattttca acatctgaaa aacgtcggac 1800 tacaagatgg actacgactg gatggctgaa ctgtgacagc atgctttggg cctgcacttt 1860 cagatttcgg atcgaaggtg cgggcgatgg aaataatcag ataagagttg taagtaacgt 1920 tcaggaggag agcagaacgg attgatgagt gtccatttgt gaggcttcca cctttcagga 1980 acagaagttg attcgaatgc gaaacctcca atgagcattt cacagccgtc ttctccttgg 2040 ccatcatgtg ttcctcctag ggagcttcgg tttttggaag ttagtcagct tactttcgaa 2100 gatcgttcaa cgctcaaggc tagattttgt cgacactatt tagttaggtc cgatagatag 2160 gtgataagat tccggtgccc tcacacatgt ttcatcagtt gcgatgtaat tccagtaatc 2220 cacgtatgtg gctccagtgt ctgctgaaat cagcacaggc agctatatca tgctccttga 2280 tctctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2307 <210> 6 <211> 484 <212> PRT <213> Marchantia polymorpha <400> 6 Met Pro Pro His Ala Pro Asp Ser Thr Gly Leu Gly Pro Glu Val Phe 1 5 10 15 Arg Leu Pro Asp Asp Ala Ile Pro Ala Gln Asp Arg Arg Ser Thr Gln 20 25 30 Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Asp Val Ser Lys His Asn Thr Pro Asn Asp 35 40 45 Cys Trp Leu Val Ile Trp Gly Lys Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Val 50 55 60 Lys Val His Pro Gly Gly Ser Leu Ile Phe Val Lys Ala Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Thr Gln Leu Phe Asp Ser Tyr His Pro Leu Tyr Val Arg Lys Leu 85 90 95 Leu Ala Gln Phe Cys Ile Gly Glu Leu Gln Thr Ser Ala Gly Asp Glu 100 105 110 Lys Phe Lys Ser Ser Thr Leu Glu Tyr Ala Gly Glu Glu His Glu Val 115 120 125 Phe Tyr His Thr Leu Lys Gln Arg Val Glu Thr Tyr Phe Arg Lys Gln 130 135 140 Lys Ile Asn Pro Arg Tyr His Pro Gln Met Leu Val Lys Ser Ala Val 145 150 155 160 Ile Ile Gly Thr Leu Leu Leu Cys Tyr Tyr Phe Gly Phe Phe Trp Ser 165 170 175 Gln Asn Val Leu Leu Ser Met Phe Leu Ala Ser Ile Met Gly Phe Cys 180 185 190 Thr Ala Glu Val Gly Met Ser Ile Met His Asp Gly Asn His Gly Ser 195 200 205 Tyr Thr Gln Ser Thr Leu Leu Gly Tyr Val Met Gly Ala Thr Leu Asp 210 215 220 Leu Val Gly Ala Ser Ser Phe Met Trp Arg Gln Gln His Val Ala Gly 225 230 235 240 His His Ser Phe Thr Asn Ile Asp His Tyr Asp Pro Asp Ile Arg Val 245 250 255 Lys Asp Pro Asp Leu Arg Arg Val Thr Ser Gln Gln Pro Arg Arg Trp 260 265 270 Phe His Glu Tyr Gln His Ile Tyr Leu Gly Val Leu Tyr Gly Val Leu 275 280 285 Ala Leu Lys Ser Val Leu Ile Asp Asp Phe Ser Ala Phe Phe Ser Gly 290 295 300 Ala Ile Gly Pro Val Lys Ile Ala Gln Met Thr Pro Leu Glu Met Gly 305 310 315 320 Val Phe Trp Gly Gly Lys Val Val Tyr Ala Leu Tyr Met Phe Leu Leu 325 330 335 Pro Met Met Tyr Gly Gln Tyr Asn Ile Leu Thr Phe Ile Gly Leu Tyr 340 345 350 Ile Leu Ser Gln Leu Val Ala Gly Trp Thr Leu Ala Leu Phe Phe Gln 355 360 365 Val Ala His Val Val Asp Asp Ala Val Phe Pro Val Ala Glu Thr Asp 370 375 380 Gly Gly Lys Ala Lys Ile Pro Ser Gly Trp Ala Glu Met Gln Val Arg 385 390 395 400 Thr Thr Thr Asn Phe Ser Ser Arg Ser Met Phe Trp Thr His Ile Ser 405 410 415 Gly Gly Leu Asn His Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Gly Val Cys 420 425 430 His Val His Tyr Pro Ser Ile Gln Pro Ile Val Lys Ala Thr Cys Asp 435 440 445 Glu Phe Asn Val Pro Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr Phe Trp Ala Ala Leu 450 455 460 Arg Ala His Phe Gln His Leu Lys Asn Val Gly Leu Gln Asp Gly Leu 465 470 475 480 Arg Leu Asp Gly <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 7 tggtggaarg anaarcayaa 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 8 rttnarnccn ccngtraacc a 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 9 aagttgcctt cgatgtttct gg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 gctcgcctgg agcaaggaaa tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 11 gtngarttya tggayacngt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 12 cknccccara anarrtaytt 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 13 gcgagctttc tcgttctttc cc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 14 tatgattttg aagcgcaaca cg 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 15 athrangrna artntaygay gt 22 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 16 ggnaynkwnt sdatrtcngg rtc 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 17 gtgtgtacga tccgtggtta cc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 18 aaggcgggac aggattcaac ac 22 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 19 ggaattcgcg atggcctcgt ccaccaccac 30 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 20 ggaattctac tttcgcagcg tatgctacc 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 21 ggaattcgcg atggaggcgt acgagatgg 29 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 22 ggaattcttc tgcctttttg ctcttgatc 29 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 23 gttgaattcg acagttatgc cgccacacgc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 24 gttgaattca ggcccaaagc atgctgtcac 30 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 25 cgggatcctc tcctggcgca ccatcgtc 28 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 26 ggggtaccaa cgcgctttcc caccaacg 28 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 27 gctctagagc gatggcctcg tccaccacc 29 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 28 gctctagact atactttcgc agcgtatgc 29 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 29 gctctagagc gatggaggcg tacgagatgg 30 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 30 gctctagatt attctgcctt tttgctc 27 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 31 gctctagaga cagttatgcc gccacacgc 29 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 32 gctctagaag gcccaaagca tgctgtcac 29 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 33 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 34 aaactgcaga ttcccgatct agtaacatag 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 35 ccggaattcg catgcctgca ggtccccaga 30 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 36 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:conserved amino acid sequence <400> 37 Trp Trp Lys Xaa Lys His Asn 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:conserved amino acid sequence <400> 38 Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:conserved amino acid sequence <400> 39 Val Glu Phe Met Asp Thr Val 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:conserved amino acid sequence <400> 40 Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:conserved amino acid sequence <400> 41 Ile Xaa Xaa Lys Val Tyr Asp Val 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism:conserved amino acid sequence <400> 42 Asp Pro Asp Ile Xaa Xaa Xaa Pro 1 5 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer XbaMpELOf <400> 43 agtctctaga gcgatggagg cgtacg 26 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer SacMpELOr <400> 44 cagtgagctc ggtgtcttat tctgcc 26 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer XbaMpD5f <400> 45 agcttctaga gccatgccgc cacacgccc 29 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer SacMpD5r <400> 46 cagtgagctc tcagccatcc agtcgt 26

Claims (28)

  1. 삭제
  2. Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하고, 서열 번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자.
  3. Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하고, 서열 번호 1에 기재된 염기 서열 가운데, 253번부터 1698번까지의 염기 서열을 갖는 유전자.
  4. Δ6 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는 유전자로서, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자에 의해 코딩되는 단백질.
  14. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합(recombinant) 발현 벡터.
  19. ⅰ. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자; ⅱ. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 및 Δ6 지방산 체인 연장 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자; ⅲ. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 및 Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 ⅳ. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자, Δ6 지방산 체인 연장 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자, 및 Δ5 지방산 불포화화 활성을 갖는 우산이끼목 생물 유래의 단백질을 코딩하는 서열 번호 6에 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 만들어진 형질전환세포.
  20. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 발현 가능하게 도입하는 공정을 포함하는, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자가 발현 가능하게 도입된 식물체의 제조 방법.
  21. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 발현 가능하게 도입하는 공정을 포함하는, 아라키돈산 및 에이코사펜타엔산을 포함하는 불포화지방산의 함량이 증가된 식물체의 제조 방법.
  22. 삭제
  23. 제21항에 기재된 방법에 의해 얻어진 식물체를 이용하는 것을 특징으로 하는 지방산 생산 방법.
  24. 삭제
  25. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 발현 가능하게 도입하여 식물체, 세포 또는 효모의 아라키돈산 및 에이코사펜타엔산을 포함하는 불포화지방산의 함량을 증가시키는 방법.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3056110C (en) 2004-04-22 2020-07-14 Surinder Pal Singh Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
DK1756280T3 (en) 2004-04-22 2015-02-02 Commw Scient Ind Res Org SYNTHESIS OF CHAIN, polyunsaturated fatty acids BY RECOMBINANT CELLS
EP2059588A4 (en) 2006-08-29 2010-07-28 Commw Scient Ind Res Org FATTY ACID SYNTHESIS
JP2011519552A (ja) * 2008-04-25 2011-07-14 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー 植物種子油
ES2644883T3 (es) 2008-11-18 2017-11-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Enzimas y métodos para producir ácidos grasos omega-3
US20120100550A1 (en) * 2009-03-04 2012-04-26 University Of Miyazaki Method for determining fatty acid synthesis pathway of microorganism, and pcr primer set for use in the method
WO2011010485A1 (ja) * 2009-07-22 2011-01-27 石川県 エイコサノイド生産方法、並びにゼニゴケ由来のエイコサノイド生合成系遺伝子及びその利用
JP5374710B2 (ja) * 2009-08-24 2013-12-25 北陸電力株式会社 ゼニゴケの長鎖多不飽和脂肪酸の生産方法
CN104203288A (zh) * 2012-01-26 2014-12-10 康奈尔大学 Fads调节
US8816111B2 (en) 2012-06-15 2014-08-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising polyunsaturated fatty acids
WO2015025920A1 (ja) * 2013-08-22 2015-02-26 協和発酵バイオ株式会社 アラキドン酸生産ポリケチドシンターゼ及びその利用
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
CN111154724B (zh) 2013-12-18 2024-02-06 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003509050A (ja) 1999-09-10 2003-03-11 セラニーズ ベンチャーズ ゲー・エム・ベー・ハー テトラヒメナから得られるδ−６−デサチュラーゼをコードする核酸、その産生と使用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995018222A1 (fr) * 1993-12-28 1995-07-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Gene pour acide gras-desaturase, vecteur contenant ledit gene, vegetal contenant ledit gene lui ayant ete transfere, et procede pour creer ledit vegetal
US5695937A (en) 1995-09-12 1997-12-09 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method for serial analysis of gene expression
US7183458B1 (en) 1999-06-07 2007-02-27 Basf Plant Science Gmbh Δ6 acetylenase and Δ6-desaturase from ceratodon purpureus
KR20020073580A (ko) 2000-02-09 2002-09-27 바스프 악티엔게젤샤프트 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법
DE10102337A1 (de) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
EP1392278A4 (en) 2001-05-14 2005-05-04 Martek Biosciences Corp PRODUCTION AND USE OF A LIPID-RICH POLAR FRACTION CONTAINING STEARIDONIC ACID AND GAMMA-LINOLENIC ACID EXTRACTED FROM SEEDS AND MICROORGANISMS
EP1576166B1 (en) * 2002-12-19 2014-10-15 University Of Bristol Novel method for the production of polyunsaturated fatty acids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003509050A (ja) 1999-09-10 2003-03-11 セラニーズ ベンチャーズ ゲー・エム・ベー・ハー テトラヒメナから得られるδ−６−デサチュラーゼをコードする核酸、その産生と使用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003.08.31, Vol. 67, No. 8, pp. 1667-1674 *
Eur. J. Biochem. 2000, Vol.267, No. 12, pp. 3801-3811 *
Plant. J. 1998, Vol. 15, No. 1, pp. 39-48 *

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Publication number Publication date
KR101156092B1 (ko) 2012-06-21
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