WO2015025920A1 - アラキドン酸生産ポリケチドシンターゼ及びその利用 - Google Patents

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WO2015025920A1
WO2015025920A1 PCT/JP2014/071882 JP2014071882W WO2015025920A1 WO 2015025920 A1 WO2015025920 A1 WO 2015025920A1 JP 2014071882 W JP2014071882 W JP 2014071882W WO 2015025920 A1 WO2015025920 A1 WO 2015025920A1
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protein
seq
amino acid
acid sequence
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哲朗 氏原
愛 永野
田畑　和彦
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協和発酵バイオ株式会社
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    • C12N9/1288—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone

Definitions

  • the polyketide synthase protein complex producing arachidonic acid hereinafter referred to as ARA
  • the DNA encoding the protein constituting the protein complex and the activity of the protein complex are enhanced from the host organism.
  • a method for producing ARA or an ARA-containing composition using the organism is also known as ARA.
  • ARA is cis-5,8,11,14 eicosatetraenoic acid (20: 4) and belongs to the (n-6) family of long-chain polyunsaturated fatty acids (hereinafter referred to as PUFA).
  • PUFA long-chain polyunsaturated fatty acids
  • ARA is the main precursor of eicosanoids, a group that includes prostaglandins, thromboxanes and leukotrienes. Humans lack ⁇ -5 desaturase action and cannot convert fatty acid 18: 2 (n-6) (linoleic acid) to ARA.
  • ARA is an essential fatty acid for humans.
  • Non-patent Documents 1 and 2 As a method for producing ARA, a fermentation method using a filamentous fungus Mortierella alpina is known (Non-patent Documents 1 and 2). In addition, a method for producing ARA using a chain elongation enzyme and a desaturase in a microorganism or plant that cannot originally produce ARA and starting from fatty acids biosynthesized by the microorganism or plant is known. (Patent Document 1, Non-Patent Document 3).
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • acetyl CoA is used as a starting material separately from the above-described pathway using fatty acid as a starting material.
  • PUFA-polyketide synthase polyketide synthase
  • Non-Patent Documents 4 to 7 it has been reported that Escherichia coli expressing EPA-PKS derived from a microorganism belonging to the genus Shewanella produced EPA (Non-Patent Documents 4 to 7). It has been reported that Escherichia coli expressing DHA-PKS derived from a microorganism belonging to the genus Moritella has produced DHA (Non-patent Document 8). Furthermore, a part of the domain of EPA-PKS derived from a microorganism belonging to the genus Shewanella is replaced with a corresponding domain of DHA-PKS derived from a microorganism belonging to the genus Moritella, and expressed in E. coli. It has been reported that EPA, which is a product, has been converted to DHA (Non-patent Document 9).
  • An object of the present invention is to provide a complex of ARA-PKS protein, a DNA encoding a protein constituting the complex of the protein, an organism in which the activity of the complex of the protein is enhanced from the host organism, and the organism
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing an ARA-containing composition containing no EPA or other PUFAs including EPA.
  • the present invention relates to the following (1) to (17).
  • a protein complex selected from the group consisting of the following [1] to [4].
  • KS ⁇ -ketoacyl-acyl carrier protein synthase
  • MAT acyl carrier protein acyltransferase
  • ACP acyl carrier protein
  • the protein having the KR domain comprises a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34; [1] of the above (1), which is a homologous protein having an activity of producing ARA using acetyl CoA as a starting substrate in cooperation with a protein having the amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 32, 36, 38 and 22. ] The protein complex described in the above.
  • the protein having the KS domain, CLF domain, AT domain and DH domain has at least 95% identity with the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36
  • a homologous protein having an activity of producing ARA using acetyl-CoA as a starting substrate in cooperation with a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 32, 34, 38 and 22 A protein complex according to [1] of (1) above.
  • a protein having an ER domain is a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 40, or an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 40
  • the protein having the PPT domain is a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 or 30, or any one represented by SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 or 30 Acetyl CoA as a starting substrate in cooperation with a protein comprising an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence and having the amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 32, 34, 36 and 38
  • the protein complex according to [1] of (1) which is a homologous protein having an activity of producing ARA.
  • DNA encoding a protein having a KS domain, a MAT domain, and an ACP domain is a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 31 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 31
  • a DNA encoding a protein having a KR domain is stringent with a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 33
  • a DNA encoding a protein having a KS domain, a CLF domain, an AT domain, and a DH domain is complementary to the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 Hybridizes with DNA consisting of a base sequence under stringent conditions, and cooperates with a protein having the amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 32, 34, 38 and 22 to produce ARA using acetyl CoA as a starting substrate.
  • DNA encoding a protein having a PPT domain is represented by DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27 or 29, or SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27 or 29 In cooperation with a protein having an amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 32, 34, 36 and 38.
  • the DNA according to (8) above which is a DNA encoding a homologous protein having an activity of producing ARA using acetyl CoA as a starting substrate.
  • An organism in which the activity of the protein complex according to any one of (1) to (7) above is enhanced from the host organism.
  • the organism can produce ARA using acetyl-CoA in the cell as a starting substrate obtained by transforming the host organism with the DNA according to any one of (8) to (13) above The organism according to (14) above, which is an organism.
  • the organism according to any one of (14) to (16) above is cultured or cultivated in a medium, and an ARA-containing composition is produced and accumulated in the culture or cultivated, and the culture or cultivation
  • a method for producing an ARA or ARA-containing composition which comprises collecting an ARA or an ARA-containing composition from a product.
  • an ARA or ARA-containing composition which conventionally had to be produced via many intermediates in a reaction involving two types of chain elongation enzyme and unsaturated valency enzyme, was obtained from acetyl CoA. It becomes possible to produce ARA-PKS, which is a single complex enzyme, and to establish a production method of ARA or an ARA-containing composition with fewer by-products.
  • FIG. 6 is a diagram showing six open reading frames (hereinafter also referred to as Orf) of the ARA-PKS system derived from Aureospila marina and the domain structure of the PKS system.
  • transduced ARA-PKS is shown.
  • the complex of the protein of the present invention includes the following [1] a protein having a KS domain, a MAT domain and an ACP domain, a protein having a KR domain, a KS domain, a CLF domain, an AT domain, and A protein complex comprising a protein having a DH domain, a protein having an ER domain, and a protein having a PPT domain, and having an activity of producing ARA using acetyl CoA as a starting substrate, [2] From proteins having KS domain, MAT domain, ACP domain and KR domain, proteins having AT domain, proteins having KS domain, CLF domain and DH domain, proteins having ER domain, and proteins having PPT domain And a complex of a protein having an activity of producing ARA using acetyl CoA as a starting substrate, [3] A protein having a KS domain, a MAT domain, an ACP domain, and a KR domain, a protein having
  • a “domain” is a portion consisting of a continuous amino acid sequence in a protein, and is a region having a specific biological activity or function in the protein.
  • the proteins constituting the protein complex of the present invention are physically May be bonded to each other or may be separated.
  • each domain is not limited, For example, the following examples can be given.
  • the KS domain include the KS domains possessed by known PUFA-PKS and the KS domains in Table 1, and preferably the KS domains in Table 1.
  • the term "known PUFA-PKS” preferably, Shewanella sp (Shewanella), Koruweria genus (Colwellia), Desaru phosphatidyl drumstick Lum genus (Desulfatibacillum), Cyclo off Lexus genus (Psychroflexus), Schizochytrium (Schizochytrium ), Nostoc sp (Nostoc), micro-cis infantis species (Microcystis), Saccharopolyspora genus (Saccharopolyspora), Jiobakuta genus (Geobacter), plan ECTS My genus (Planctomyces), Desaru follower genus (Desulfococcus), the genus Sorangium (Sorangium), Renibakuteriumu genus (Renibacterium), Chichinofaga genus (Chitinophaga), Gureobakuta genus (Gloeobacter), Azoto
  • L1 ATCC 28207 A microorganism selected from the group consisting of PUFA-PKS originally possessed by Shewanella pealeana ATCC 700345, Shewanella oneidensis MR-1, Colwellia psychrerythraea 34H, Moritella marina MP-1, Schizochytrium sp. ATCC 20888 PUFA-PKS originally possessed by a microorganism selected from the group (Non-Patent Documents 9 and 10).
  • Examples of the MAT domain include the MAT domain of known PUFA-PKS and the MAT domain of Table 1, preferably the MAT domain of Table 1.
  • Examples of ACP domains include the ACP domains of known PUFA-PKS and the ACP domains in Table 1, preferably the ACP domains in Table 1.
  • Examples of the KR domain include the KR domain of known PUFA-PKS and the KR domain of Table 1, preferably the KR domain of Table 1.
  • Examples of the CLF domain include the CLF domain of known PUFA-PKS and the CLF domain of Table 1, preferably the CLF domain of Table 1.
  • Examples of the AT domain include the AT domains possessed by known PUFA-PKS and the AT domains in Table 1, preferably the AT domains in Table 1.
  • Examples of the DH domain include the DH domains possessed by known PUFA-PKS and the DH domains in Table 1, preferably the DH domains in Table 1.
  • ER domains As examples of ER domains, the ER domains of known PUFA-PKS and the ER domains of Table 1 are preferred, and the ER domains of PUFA-PKS derived from microorganisms belonging to the genus Schwannella and the ER domains of Table 1 are most preferred. Can include the ER domains of PUFA-PKS derived from Shewanella oneidensis MR-1 and the ER domains shown in Table 1.
  • Examples of the PPT domain include a PPT domain possessed by a known PUFA-PKS, a PPT domain possessed by a microorganism belonging to a group selected from the group consisting of Bacillus genus, Schwanella genus, Escherichia genus, Corynebacterium genus, and the PPT domain in Table 1
  • a PPT domain derived from a microorganism selected from the group consisting of Bacillus subtilis 168, Shewanella oneidensis MR-1, Escherichia coli W3110, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and the PPT domain of Table 1 can be mentioned.
  • one or more domains selected from the group consisting of KS domain, MAT domain, ACP domain, KR domain, CLF domain, AT domain, DH domain, ER domain, and PPT domain are represented by It is preferably a domain selected from one domain.
  • PUFA-PKS it is possible to convert PUFA as a product by exchanging a part of the domain (Non-patent Document 9).
  • Non-Patent Document 9 a group consisting of KS domain, MAT domain, ACP domain, KR domain, CLF domain, AT domain, DH domain, ER domain, and PPT domain possessed by known PUFA-PKS
  • a PKS capable of producing ARA can be produced by substituting one or more of the selected domains with the domains shown in Table 1.
  • a “homology domain” is a domain that is considered to have the same evolutionary origin as the original domain due to similarity in structure and function to the original domain, It refers to the domain of an existing organism.
  • Examples of such homologous domains have at least 95%, preferably 97%, more preferably 98%, most preferably 99% or more identity with each domain listed in Table 1.
  • the homologous domain which consists of an amino acid sequence and can produce ARA by using acetyl CoA as a starting substrate by cooperating with each domain described in Table 1 can be mentioned.
  • cooperating means that when a certain protein coexists with other proteins, a specific reaction is performed as one body, and in this specification, in particular, a KS domain, a MAT domain, an ACP domain, and a KR domain.
  • KS domain, CLF domain, AT domain, DH domain, ER domain, and PPT domain are divided into several proteins, and when these proteins coexist, It means that ARA is produced as a starting material, and that when a certain domain coexists with another domain, ARA is produced using acetyl-CoA as a starting material together with the other domain.
  • coexistence includes both the case where the protein is contained in the same protein as the other domain, and the case where the protein coexists when the other domain is contained in the other protein.
  • the identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is determined by the algorithm BLAST [Pro. NAT domain l. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] and FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)] by Karlin and Altschul. Can be determined. Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)].
  • the homologous domain of each domain can produce ARA using acetyl-CoA as a starting material in cooperation with other domains, for example, a protein complex consisting of the proteins represented by SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 and 22
  • a complex of the protein in which the original domain corresponding to the homologous domain is substituted with the homologous domain is prepared, and this can be confirmed by producing ARA using acetyl CoA as a starting material.
  • a recombinant DNA having a DNA encoding a protein complex substituted with the homologous domain described above is prepared by a method described later, and a microorganism that does not produce ARA with the recombinant DNA, for example, an acyl CoA described later
  • a microorganism that does not produce ARA with the recombinant DNA for example, an acyl CoA described later
  • This can be confirmed by culturing a microorganism obtained by transforming Escherichia coli BW25113 strain in which fadE encoding dehydrogenase is disrupted in a medium and detecting ARA accumulated in the culture by gas chromatography.
  • proteins constituting the protein complex of the present invention examples include the proteins constituting the protein complex of [1] to [4] above.
  • the protein constituting the protein complex of [1] above can be mentioned.
  • 1.2.1 Protein having KS domain, MAT domain and ACP domain
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 is Protein (hereinafter also referred to as OrfA protein), (b) at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32.
  • a homologous protein is a protein whose structure and function are similar to the original protein, so that the gene encoding the protein has the same evolutionary origin as the gene encoding the original protein. It refers to the protein of living organisms.
  • a mutated protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • an amino acid is deleted, substituted, inserted or added means that it is 1 to 20, preferably 1 to 10, most preferably 1 to 5 amino acids at any position in the same sequence. May be deleted, substituted, inserted or added.
  • the amino acid to be deleted, substituted, inserted or added may be a natural type or a non-natural type.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine, glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenyl, threonine
  • OrfA Within the OrfA protein, there is one KS domain, one MAT domain, and four ACP domains. OrfA was compared with known sequences in a BLAST search. At the nucleic acid level, OrfA has no significant homology with any known base sequence. At the amino acid level, the sequence with the highest degree of homology with the OrfA protein was: 54 for the 1574 amino acid residues of unidentified eubacterium SCB49 polyunsaturated fatty acid synthase pfaA (accession number EDM45380). And was 54% identical for 1557 amino acid residues of the Psychroflexus torquis ATCC 700755 multidomain ⁇ -ketoacyl synthase (Accession No. EAS69828).
  • the first domain in the OrfA protein is a KS domain, also referred to herein as an OrfA-KS domain.
  • This domain extends from the origin between about position 1 and about position 40 of SEQ ID NO: 31 (OrfA) to the end point between about position 1400 and position 1500 of SEQ ID NO: 31.
  • the DNA encoding the OrfA-KS domain has a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (positions 1 to 1500 of SEQ ID NO: 31).
  • the amino acid sequence containing the KS domain extends from an origin between about positions 1 and 14 of SEQ ID NO: 32 to an end point between positions 466 and 500 of SEQ ID NO: 32.
  • the OrfA-KS domain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (positions 1 to 500 of SEQ ID NO: 32). It is noted that the OrfA-KS domain contains an active site motif: DXAC * (* acyl binding site C 215 ).
  • the second domain in the OrfA protein is the MAT domain, also referred to herein as the OrfA-MAT domain.
  • the domain extends from an origin between about positions 1700 and 1800 of SEQ ID NO: 31 (OrfA) to an end point between about positions 2500 and 2600 of SEQ ID NO: 31.
  • the DNA encoding the OrfA-MAT domain has a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 (positions 1700 to 2700 of SEQ ID NO: 31).
  • the amino acid sequence containing the MAT domain extends from the origin between about position 565 and about position 600 of SEQ ID NO: 32 (OrfA protein) to the end point between position 865 and about position 900 of SEQ ID NO: 32.
  • the OrfA-MAT domain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (positions 565 to 900 of SEQ ID NO: 32). It is noted that the OrfA-MAT domain contains an active site motif: GHS * XG (* acyl binding site S 683 ). The active motif has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • OrfA-ACP the first domain of the sequence is OrfA-ACP1, the second domain is OrfA-ACP2, the third domain is OrfA-ACP3 and the fourth domain are also called OrfA-ACP4.
  • the first OrfA-ACP1 extends from about position 3381 to about position 3612 of SEQ ID NO: 31 (OrfA).
  • the DNA encoding OrfA-ACP1 has a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 (positions 3381 to 3612 of SEQ ID NO: 31).
  • OrfA-ACP1 extends from about position 1127 to about position 1204 of SEQ ID NO: 32.
  • OrfA-ACP1 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (positions 1127 to 1204 of SEQ ID NO: 32). It is noted that OrfA-ACP1 contains an active site motif: LGIDS * (* pantethein binding motif S 1166 ). The active motif has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42.
  • All four ACP domains together span the region of OrfA from SEQ ID NO: 31 to about position 3621 to about 4632 and correspond to amino acids from about position 1127 to about position 1544 of SEQ ID NO: 32.
  • DNA encoding the entire ACP region including all four domains has the base sequence represented by SEQ ID NO: 43.
  • the region represented by SEQ ID NO: 43 includes linker segments between individual domains.
  • the repeat interval for the four domains is approximately every 340 bases of SEQ ID NO: 43 (the actual number of amino acids measured between adjacent active site serines ranges from 112 to 114 amino acids. Is).
  • Each of the four ACP domains contains a pantethein binding motif LGIDS * (having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42), and S * is a pantethein binding site serine (S).
  • S * is a pantethein binding site serine (S).
  • S is located near the center of each domain sequence.
  • ACP1 S 1166
  • ACP2 S 1280
  • ACP3 S 1392
  • ACP4 S 1506 .
  • the average size of each domain is about 85 amino acids excluding the linker, about 110 amino acids including the linker, and that the active site serine is approximately in the middle of the domain, those skilled in the art
  • the position of each of the four ACP domains can be easily determined.
  • Protein having KR domain of [1] above examples include (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 (hereinafter also referred to as OrfB protein), (b). ) Consisting of an amino acid sequence having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 32, A homologous protein having an activity of producing ARA using acetyl-CoA as a starting substrate in cooperation with a protein having the amino acid sequence represented by each of 36, 38 and 22, or (c) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 1 to 20, preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 5 amino acid sequences, wherein the amino acid sequence is deleted, substituted, inserted or added. It can be exemplified mutation protein having an activity to produce ARA acetyl CoA as the starting substrate in cooperation with the protein having the amino acid
  • DNA encoding the OrfB protein (hereinafter referred to as OrfB) is a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33. There is one KR domain within the OrfB protein. OrfB was compared with known sequences in a BLAST search. At the nucleic acid level, OrfB has no significant homology with any known base sequence.
  • sequence with the highest degree of homology with the OrfB protein was: 51 for the 802 amino acid residues of unidentified eubacterium SCB49 polyunsaturated fatty acid synthase pfaA (accession number EDM45379) And 50% identical for the 802 amino acid residues of Psychroflexus torquis ATCC 700755 hypothetical protein (accession number EAS69829).
  • the KR domain in the OrfB protein is also referred to herein as the OrfB-KR domain.
  • This domain extends from the origin at about position 550 of SEQ ID NO: 33 to the end point at about position 1630 of SEQ ID NO: 33.
  • the DNA encoding the OrfB-KR domain has a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (positions 550 to 1630 of SEQ ID NO: 33).
  • the amino acid sequence containing the KR domain extends from the origin at about position 184 of SEQ ID NO: 34 (OrfB protein) to the end point at about position 543 of SEQ ID NO: 34.
  • the OrfB-KR domain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (positions 184 to 543 of SEQ ID NO: 34) herein.
  • SEQ ID NO: 10 positions 184 to 543 of SEQ ID NO: 34
  • the protein having KS domain, CLF domain, AT domain and DH domain of [1] above is, for example, (a) represented by SEQ ID NO: 36.
  • Acetyl CoA is started in cooperation with a protein comprising an amino acid sequence in which one amino acid is deleted, substituted, inserted or added, and having the amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 32, 34, 38 and 22.
  • the substrate include mutant proteins having an activity of producing ARA.
  • the DNA encoding the OrfC protein (hereinafter also referred to as OrfC) is a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 35.
  • OrfC protein there is one KS domain, one CLF domain, one AT domain, and two DH domains.
  • OrfC was compared with a known sequence in a BLAST search. At the nucleic acid level, OrfC has no significant homology with any known base sequence. At the amino acid level, the sequence with the highest degree of homology to the OrfC protein was: 58% identical for 2249 amino acid residues of unidentified eubacterium SCB49 hypothetical protein (accession number EDM45378); And Psychroflexus torquis ATCC 700755 hypothetical protein (accession number EAS69830) were 57% identical.
  • the first domain in the OrfC protein is a KS domain, also referred to herein as an OrfC-KS domain.
  • This domain extends from an origin between about position 1 to about position 43 of SEQ ID NO: 35 (OrfC) to an end point between about position 1332 to about 1350 of SEQ ID NO: 35.
  • the DNA encoding the OrfC-KS domain has a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (positions 1 to 1350 of SEQ ID NO: 35).
  • the amino acid sequence containing the KS domain extends from the origin between about positions 1 and 15 of SEQ ID NO: 36 (OrfC protein) to the end point between positions 444 and 450 of SEQ ID NO: 36.
  • the OrfC-KS domain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (positions 1 to 450 of SEQ ID NO: 36). It is noted that the OrfC-KS domain contains an active site motif: DXAC * (* acyl binding site C 195 ).
  • the second domain in the OrfC protein is a CLF domain and is also referred to herein as an OrfC-CLF domain.
  • This domain extends from the origin between about position 1354 to about 1366 of SEQ ID NO: 35 (OrfC) to the end point between about 2400 to about 2460 of SEQ ID NO: 35.
  • the DNA encoding the OrfC-CLF domain has a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (positions 1354 to 2460 of SEQ ID NO: 35).
  • the amino acid sequence containing the CLF domain extends from the origin between about position 452 to about 456 of SEQ ID NO: 36 (OrfC protein) to the end point between about position 800 and about 820 of SEQ ID NO: 36.
  • the OrfC-CLF domain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (positions 452 to 820 of SEQ ID NO: 36). It is noted that the OrfC-CLF domain contains a KS domain active site motif that does not contain an acyl-linked cysteine.
  • the third domain in the OrfC protein is an AT domain, also referred to herein as an OrfC-AT domain.
  • This domain extends from an origin between about position 2488 to about position 2938 of SEQ ID NO: 35 (OrfC) to an end point between about position 3990 to about 4050 of SEQ ID NO: 35.
  • the DNA encoding the OrfC-AT domain has a base sequence represented by SEQ ID NO: 13 (positions 2488 to 4050 of SEQ ID NO: 35) in the present specification.
  • the amino acid sequence containing the AT domain extends from the origin between about position 830 to about 980 of SEQ ID NO: 36 (OrfC protein) to the end point between about 1330 to about 1350 of SEQ ID NO: 36.
  • the OrfC-AT domain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (positions 830 to 1350 of SEQ ID NO: 36). It is noted that the OrfC-AT domain contains an active site motif of GxS * xG (* acyl binding site S 1094 ) that exhibits the properties of acyltransferases.
  • the fourth domain in the OrfC protein is a DH domain and is also referred to as OrfC-DH domain 1 in this specification.
  • This is one of the two DH domain domains in the OrfC protein and is therefore named DH domain 1.
  • This domain extends from an origin between about positions 5008 to about 5068 of SEQ ID NO: 35 (OrfC) to an end point between about positions 5490 to about 5550 of SEQ ID NO: 35.
  • the DNA encoding ORFC-DH domain 1 has a base sequence represented by SEQ ID NO: 15 (positions 5008 to 5550 of SEQ ID NO: 35).
  • DH domain 1 extends from the origin between about positions 1670 and 1690 of SEQ ID NO: 36 (OrfC protein) to the end point between about positions 1830 and 1850 of SEQ ID NO: 36.
  • OrfC-DH domain 1 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (positions 1670 to 1850 of SEQ ID NO: 36).
  • the second domain in the OrfC protein is a DH domain, also referred to herein as OrfC-DH domain 2.
  • This domain extends from the origin between about position 6328 to about position 6418 of SEQ ID NO: 35 (OrfC) to the end of SEQ ID NO: 35.
  • the DNA encoding OrfC-DH domain 2 has a base sequence represented by SEQ ID NO: 17 (positions 6328 to 6726 of SEQ ID NO: 35).
  • DH domain 2 extends from the origin between about position 2110 to about position 2140 of SEQ ID NO: 36 (OrfC protein) to the end of SEQ ID NO: 36.
  • OrfC-DH domain 2 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (positions 2110 to 2241 of SEQ ID NO: 36).
  • SEQ ID NO: 18 positions 2110 to 2241 of SEQ ID NO: 36.
  • SEQ ID NO: 38 an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38
  • B the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 40 and at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably ARA is produced using acetyl-CoA as a starting substrate in cooperation with a protein having an amino acid sequence having an identity of 99% or more and having an amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 32, 34, 36 and 22.
  • a homologous protein having activity or (c) 1-20, preferably 1-10, most preferably in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 40 Acetyl in cooperation with a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having an amino acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 32, 34, 36 and 22 Mention may be made of mutant proteins having the activity of producing ARA using CoA as a starting substrate.
  • the DNA encoding the OrfD protein (hereinafter also referred to as OrfD) is a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 37. There is one ER domain within the OrfD protein. OrfD was compared with known sequences in a BLAST search. At the nucleic acid level, OrfD has no significant homology with any known base sequence.
  • sequence with the highest degree of homology with the OrfD protein is as follows: unidentified eubacterium SCB49 2-nitropropane dioxygenase (accession number EDM45377), 65% identical for 515 amino acid residues And 66% identical for the 515 amino acid residues of the Psychroflexus torquis ATCC 700755 hypothetical protein (accession number EAS69831).
  • the ER domain in the OrfD protein is also referred to herein as the OrfD-ER domain.
  • the DNA encoding this domain extends from the origin between about position 208 and about position 238 of SEQ ID NO: 37 (OrfD) to the end point between position 1455 and about position 1485 of SEQ ID NO: 37.
  • the DNA encoding the OrfD-ER domain has a base sequence represented by SEQ ID NO: 19 (positions 208 to 1485 of SEQ ID NO: 37).
  • the ER domain extends from the origin between about position 70 and about position 80 of SEQ ID NO: 38 (OrfD protein) to the end point between position 485 and position 495 of SEQ ID NO: 38.
  • the OrfD-ER domain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 (positions 70 to 495 of SEQ ID NO: 38).
  • SEQ ID NO: 20 positions 70 to 495 of SEQ ID NO: 38.
  • SEQ ID NO: 22 (Hereinafter also referred to as OrfE protein)
  • SEQ ID NO: 22 (Hereinafter also referred to as OrfE protein)
  • DNA encoding the OrfE protein (hereinafter referred to as OrfE) is DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • OrfE protein functions as a PPT of the ARA-producing PKS system. OrfE was compared to known sequences in a standard BLAST search. At the nucleic acid level, OrfE has no significant homology with any known base sequence.
  • DNA of the present invention is a DNA encoding a protein constituting the complex of the protein of the present invention.
  • DNA of the present invention 2.1.1 DNA encoding proteins with KS domain, MAT domain and ACP domain
  • DNA encoding a protein having a KS domain, a MAT domain, and an ACP domain include (a) a DNA encoding the protein described in 1.2.1 above, and (b) a base sequence represented by SEQ ID NO: 31 DNA, (c) hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 and represented by SEQ ID NOs: 34, 36, 38 and 22, respectively DNA encoding a homologous protein having an activity of producing ARA using acetyl CoA as a starting substrate in cooperation with a protein having an amino acid sequence, or (d) at least 95% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 31, preferably Consists of nucleotide sequences having 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more identity, and SEQ ID NOs: 34, 36, 38 and 22 DNA
  • hybridization refers to a step in which DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Accordingly, the DNA having the specific base sequence or a part of the base sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or DNA of a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. May be.
  • Examples of DNA used as a probe include at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • DNA used as a primer is at least 10 bases, preferably 15 bases or more. Can give you DNA.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can be obtained by following the instructions attached to the commercially available hybridization kit.
  • commercially available hybridization kits include a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics) that prepares a probe by a random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • the above stringent conditions include, for example, a filter on which DNA is immobilized and a probe DNA, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 ⁇ mM sodium chloride, 75 ⁇ mM sodium citrate), 50 ⁇ mM sodium phosphate ( After incubation overnight at 42 ° C. in a solution containing pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, for example 0.2 ⁇ SSC at about 65 ° C. Conditions for washing the filter in a solution can be given.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of hybridization experiments.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, at least the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA described above. Examples thereof include DNA having a base sequence having an identity of 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • DNA encoding a protein with a KR domain examples include: (a) DNA encoding the protein described in 1.2.2 above, (b) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33, (c) sequence A protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by No. 33 and has an amino acid sequence represented by each of SEQ ID Nos.
  • the amino acid comprises a nucleotide sequence having 98% or more, most preferably 99% or more identity, and represented by each of SEQ ID NOs: 32, 36, 38 and 22 DNA encoding the homologous protein having an activity to produce ARA acetyl CoA as the starting substrate in cooperation with the protein having the sequence, and the like.
  • the description about hybridization and stringent conditions is the same as 2.1.1 above.
  • the DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA described above. Examples thereof include DNA having a base sequence having an identity of 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • DNA encoding a protein having KS domain, CLF domain, AT domain and DH domain examples include: (a) DNA encoding the protein described in 1.2.3 above, (b) a base represented by SEQ ID NO: 35 A DNA having a sequence, (c) hybridizing under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 35, and each of SEQ ID NOS: 32, 34, 38 and 22 A DNA encoding a homologous protein having an activity of producing ARA using acetyl CoA as a starting substrate in cooperation with a protein having the amino acid sequence represented by (d), or at least 95% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 Consisting of a base sequence having an identity of preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more, and SEQ ID NOs: 32, 34,
  • the description about hybridization and stringent conditions is the same as 2.1.1 above.
  • the DNA that can hybridize under the above stringent conditions includes, for example, at least the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA described above. Examples thereof include DNA having a base sequence having an identity of 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • DNA encoding a protein having an ER domain examples include (a) DNA encoding the protein described in 1.2.4 above, (b) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 or 39, (c ) Amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 32, 34, 36 and 22 that hybridize with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 or 39 under stringent conditions.
  • the description about hybridization and stringent conditions is the same as 2.1.1 above.
  • the DNA that can hybridize under the stringent conditions described above includes, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 or 39 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA described above. And DNA having a nucleotide sequence having at least 95%, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • DNA encoding a protein having a PPT domain examples include (a) DNA encoding the protein described in 1.2.5 above, (b) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27 or 29 (C) hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to any base sequence represented by SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27 or 29, and SEQ ID NO: DNA encoding a homologous protein having an activity of producing ARA using acetyl CoA as a starting substrate in cooperation with a protein having an amino acid sequence represented by each of 32, 34, 36 and 38, or (d) SEQ ID NO: 21 , 23, 25, 27 or 29 and at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably ARA is produced using acetyl-CoA as a starting substrate in cooperation with a protein consisting of a base sequence having an identity of 99% or more and having an amino acid sequence
  • hybridization and stringent conditions is the same as 2.1.1 above.
  • DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions for example, when calculated based on the above parameters using a program such as the above-mentioned BLAST and FASTA, SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, or 29 DNA having a nucleotide sequence having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with any one of the nucleotide sequences represented by 2.2
  • Recombinant DNA having the DNA of the present invention includes a recombinant DNA having the DNA of the present invention described in 2.1 above.
  • the recombinant DNA is incorporated into an expression vector containing the promoter at a position where the DNA of the present invention can autonomously replicate in a host organism or can be integrated into a chromosome and can transcribe the DNA.
  • Recombinant DNA The host organism will be described later in 3.
  • the recombinant DNA is a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention described in 2 above, and a transcription termination sequence. It is preferable.
  • a gene that controls the promoter may also be included.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA, but a transcription termination sequence is preferably arranged immediately below the structural gene.
  • examples of expression vectors include pColdI (Takara Bio), pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Novagen), pMAL-c2x (New England Biolabs) PGEX-4T-1 (manufactured by GE Healthcare Bioscience), pTrcHis (manufactured by Invitrogen), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by Qiagen) , PET-3 (manufactured by Novagen), pKYP10 (JP 58-110600), pKYP200 [Agric.
  • pPAC31 (WO98 / 12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC118 (Takara Bio Inc.) And pPA1 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-233798).
  • any promoter can be used as long as it functions in cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • trp promoter P trp
  • lac promoter P lac
  • P L promoter P L promoter
  • P R promoter P SE promoter
  • an artificially designed and modified promoter such as a promoter in which two Ptrps are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can also be used.
  • examples of expression vectors include pCG1 (JP 57-134500), pCG2 (JP 58-35197), pCG4 (JP 57-183799), pCG11 (special). Kaisho 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all of which is JP-A-58-105999), pCE51, pCE52, pCE53 [all of which are Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
  • any promoter can be used as long as it functions in cells of coryneform bacteria.
  • P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 ( 2000)] can be used.
  • examples of the expression vector include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • the promoter in the case of using the above expression vector may be any promoter as long as it functions in cells of yeast strains.
  • promoters such as heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, CUP 1 promoter, and the like.
  • the recombinant DNA is a recombinant DNA composed of a promoter, a 5 ′ untranslated region (translation enhancer), the DNA of the present invention described in 2 above, and a transcription termination sequence. It is preferable. A gene that controls the promoter may also be included.
  • Such an expression vector may be any expression vector that functions in plant cells. For example, pRI 201-AN, pRI 201-ON, pRI 201-AN-GUS, and pRI 201-ON- GUS etc. (all manufactured by Takara Bio Inc.) can be mentioned.
  • the organism of the present invention is an organism in which the activity of the complex of the protein of the present invention 1 is enhanced from the host organism.
  • the host organism refers to the original organism that is the subject of genetic modification and transformation.
  • the original organism to be transformed by gene transfer is a microorganism, it is also called a parent strain or a host strain.
  • the host organism may be any organism, but examples include microorganisms or plants.
  • Microorganisms can include any bacteria, protozoa, microalgae, fungi, protozoa.
  • examples of microalgae include microorganisms of the order of the genus Clevis.
  • examples of the microorganism of the order of the genus Ceratomycetes include microorganisms selected from the group consisting of the genus Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonotitrium, Schizochytrium, and Aurantiochytrium.
  • Preferred species within these genera include, but are not limited to, Schizochytrium Minutsumu (Schizochytriumminutum), Schizochytrium sp (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp ( (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp (SR21), Schizochytrium agregatum (Goldstein and Belsky) (ATCC 28209), Schizochytrium remacinum (Honda and Yokochi) (IFO 32693), Thraustochytrium sp (23B) (ATCC 20891), Thraustochytrium / Schneider (ATCC 24473), Thraustochytrium / Aureum (ATCC 34304), Thraustochytrium / Roseum (ATCC 28210), Urkenia SP BP-5601 , Japonochytrium sp (L1) (ATCC 28207
  • fungi include yeasts including Saccharomyces e cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, or other yeasts such as Candida, Kluyveromyces, or other fungi Examples thereof include filamentous fungi such as Aspergillus, Neurospora, and Penicillium.
  • a bacterium preferably, a microorganism belonging to the genus selected from the group consisting of Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and Aureospila, most preferably, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21 codon plus ( Stratagene), Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens,
  • Plants used as host organisms include, but are not limited to, any higher plant and in particular consumable plants including crop plants and especially plants using their oils.
  • Such plants can include, for example, canola, soybeans, rapeseed, flaxseed, corn, safflower, sunflower, and tobacco.
  • Other useful plants are those plants known to produce compounds used as pharmaceuticals, seasonings, nutrients, functional food ingredients or cosmetic active agents, or these compounds / drugs Plants that have been genetically engineered to produce
  • the activity of the protein complex of the above 1 of the present invention is the host
  • the organism enhanced from the organism is obtained by modifying (a) a gene encoding a protein constituting the complex of the protein of the present invention of 1 above, which is present on the chromosomal DNA of the host organism, i) a host An organism having an increased specific activity of the protein compared to the organism, and ii) an organism having an increased amount of transcription of the gene or production of the protein complex compared to the host organism, and (b) the recombination of 2.2 above
  • a host organism with body DNA an organism having an increased copy number of the gene than the host organism can be mentioned.
  • the organism of the above (a) i) is an organism in which the specific activity of the protein complex is enhanced.
  • the organism is cultured or cultivated by the following method 6 and accumulated in the culture or the cultivated product.
  • ARA can be confirmed by comparison with that of the host organism.
  • the organism of the above (a) ii) is an organism in which the transcription amount of the gene or the production amount of the protein complex is increased compared to the host organism, and the organism of the above (b) is more than the host organism.
  • an organism having an increased copy number of the gene can be expressed by, for example, the amount of transcription of the DNA of the present invention by Northern blotting or the production of the complex of the protein of the present invention by Western blotting. It can be confirmed by comparing with it.
  • the organism of the present invention (c) It is an organism capable of producing ARA using acetyl-CoA in cells obtained by transformation as a starting substrate.
  • the recombinant DNA is introduced as a plasmid capable of autonomous replication in the parent strain or integrated into the chromosomal DNA of the parent strain.
  • the host cell when the host cell has a gene encoding a known PUFA-PKS, a protein or domain that determines the carbon chain length of the known PUFA-PKS in the known PUFA-PKS, A DNA encoding a protein or domain selected from the group consisting of a protein or domain that determines the number and arrangement of double bonds, and a protein or domain that reduces trans double bonds, and the corresponding domains described in Table 1 above Alternatively, it includes organisms in which the activity of the known PUFA-PKS is converted to the activity of producing ARA using acetyl-CoA as a starting substrate by substituting with a DNA encoding a protein having the domain.
  • the replacement of the DNA encoding the protein or domain described above is a combination in which the DNA to be replaced in the host cell is replaced with a part of the corresponding DNA of the present invention and also has a part of the corresponding DNA of the present invention.
  • the case where the recombinant DNA is incorporated into a region different from the gene encoding the known PUFA-PKS in the chromosomal DNA of the host cell or the case where the recombinant DNA exists in the host cell as a self-replicating plasmid is included.
  • the organism As a method for confirming that the organism (c) has acquired the ability to produce ARA using acetyl-CoA in the cells of the host organism as a starting substrate, for example, the organism is cultured or cultivated by the following method 5. It can be confirmed by detecting ARA accumulated in the culture or cultivation by gas chromatography. A method for transforming a host organism with recombinant DNA will be described later in 5. 4 Method for Acquiring DNA of the Present Invention
  • the DNA of the present invention comprises, for example, a microorganism using a probe DNA that can be designed based on a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37 and 21.
  • Southern hybridization to a microorganism belonging to the genus Aureispira more preferably, a chromosomal DNA library of Aureispira marina JCM23201, or a primer DNA that can be designed based on the nucleotide sequence is used. It can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using the chromosomal DNA of the microorganism as a template.
  • Aureospila Marina JCM23201 can be obtained from RIKEN BioResource Center, Japan.
  • the DNA encoding the homologous protein described in 1 above is, for example, a sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37 and 21 with respect to various gene sequence databases.
  • Probe DNA that can search for amino acid sequences having identity and can be designed based on the base sequence or amino acid sequence obtained by the search Or it can acquire by the method similar to the method of acquiring said DNA using primer DNA and the microorganisms which have the said DNA.
  • the DNA encoding the mutant protein described in the above 1 is represented by, for example, a base sequence represented by a sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37 and 21.
  • PCR [Gene, 77, 51 (1989) using a pair of PCR primers each having a base sequence designed to introduce a target mutation (deletion, substitution, insertion or addition) at the 5 ′ end thereof. )] Can also obtain the DNA of [2] above.
  • a sense primer corresponding to the 5 ′ end of the DNA and an antisense primer corresponding to the sequence immediately before the mutation introduction site (5 ′ side) having a sequence complementary to the mutation sequence at the 5 ′ end PCR is performed using the DNA as a template, and a fragment A (mutation is introduced at the 3 ′ end) from the 5 ′ end to the mutation introduction site of the DNA is amplified.
  • the obtained DNA is cut as it is or cut with an appropriate restriction enzyme, and incorporated into a vector by a conventional method.
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method such as By analyzing using the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or a base sequence analyzer such as 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems) The sequence can be determined.
  • Examples of the host cell e.g., Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49 Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522 and the like.
  • Escherichia coli XL1-Blue Escherichia coli XL2-Blue
  • Escherichia coli DH1 Escherichia coli MC1000
  • Escherichia coli KY3276 Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101
  • the above vectors include pBluescriptII KS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene), pT7Blue ( Novagen), pCR II (Invitrogen) and pCR-TRAP (Gen Hunter).
  • a method for introducing recombinant DNA any method for introducing DNA into a host cell can be used. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • the full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or the like for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using a 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • DNAs of the present invention in DNA encoding a known PUFA-PKS, a protein or domain that determines the carbon chain length of the PUFA-PKS, a protein or domain that determines the number and arrangement of cis double bonds, And a DNA encoding a protein or domain selected from the group consisting of a protein or domain that reduces a trans double bond, and a DNA encoding a corresponding domain or a protein having the domain described in Table 1 above.
  • DNA encoding a protein that has acquired the activity of producing ARA using acetyl-CoA as a starting substrate can be obtained using the following overlap extension PCR method (Gene 77: 61-68, 1989).
  • Examples of known PUFA-PKS include PUFA-PKS possessed by Shewanella oneidensis MR-1.
  • Shewanella oneidensis MR-1 is available as ATCC BAA1096 strain from the American Tissue Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • the DNA encoding the PUFA-PKS can be obtained by a method similar to the method for obtaining the DNA of the present invention described above.
  • DNA encoding known PUFA-PKS two DNA fragments located at both ends of the DNA to be replaced are amplified by PCR.
  • a DNA encoding a corresponding domain described in Table 1 or a protein having the domain is amplified by PCR.
  • a primer for amplifying each fragment is designed so that the base sequence of the linking portion of each fragment is complementary.
  • these three fragments are mixed at an equimolar ratio and used as a PCR template, and when the three fragments are ligated, PCR amplification is performed using a primer that can amplify the whole fragment.
  • the bound target DNA can be obtained.
  • DNA substituted with a plurality of DNA fragments it is also possible to obtain DNA substituted with a plurality of DNA fragments.
  • a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, a DNA encoding the homologous protein, and a DNA encoding the mutant protein can be obtained by the same method as described above using the genomic DNA of Bacillus subtilis 168. Can be acquired.
  • a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, a DNA encoding the homologous protein, and a DNA encoding the mutant protein were prepared by the same method as described above using the genomic DNA of Shewanella oneidensis MR-1. Can be acquired.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27, DNA encoding the homologous protein, and DNA encoding the mutant protein are obtained by the same method as described above using Escherichia coli W3110 genomic DNA. be able to.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 29, DNA encoding the homologous protein, and DNA encoding the mutant protein were prepared in the same manner as described above using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Can be acquired.
  • the recombinant DNA having the DNA of the present invention can be prepared by inserting the DNA of the present invention obtained above, for example, downstream of the promoter of the appropriate expression vector described in 2.2 above.
  • Examples of such recombinant DNA include pSTV29-OrfA-OrfB, pMW219-OrfD-OrfC, pUC19-OrfE, pUC19-sfp, pUC19-SO1604, pUC19-entD, pUC19-cgl1980, which will be described later. it can.
  • Method for constructing organism of the present invention the organism of (3) (a) i) described above is obtained by, for example, comparing the specific activity of the complex of the protein of the present invention with an ordinary mutation treatment method or It can be constructed by enhancing using a gene replacement method using a replacement DNA technique.
  • Examples of the mutation treatment method include a method using N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) (Microbial Experiment Manual, 1986, p. 131, Kodansha Scientific), ultraviolet irradiation method, etc. Can give.
  • NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine
  • UV irradiation method etc.
  • DNA encoding the mutant protein of the present invention that can be obtained by the above method 4 is homologous to the gene encoding the protein present on the chromosomal DNA of the host organism.
  • Examples of the replacement method include a recombinant method.
  • the host organism for example, microorganisms belonging to the genus Aureospila as described above, preferably Aureispira marina JCM23201 can be mentioned.
  • the homologous recombination method include a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligation with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host organism to be introduced, and is frequently used in Escherichia coli.
  • a method using homologous recombination a method of introducing recombinant DNA using a lambda phage homologous recombination system [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000) ] Can be given.
  • a selection method that makes Escherichia coli susceptible to sucrose by Bacillus subtilis levansucklease integrated on the chromosome together with the recombinant DNA, or the wild-type rpsL gene is incorporated into Escherichia coli having a mutant rpsL gene resistant to streptomycin.
  • Using the selection method using the fact that Escherichia coli becomes streptomycin sensitive [Mol. Microbiol., 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)], etc. Microorganisms in which the above target region has been replaced with recombinant DNA can be obtained.
  • the organism of the above (3) (a) ii) is, for example, the amount of transcription of the gene encoding the protein constituting the protein complex of the present invention or the production amount of the protein, It can be constructed by enhancing using a mutation treatment method or a gene replacement method using a recombinant DNA technique.
  • the mutation treatment method include the above-described methods.
  • the gene replacement method by the recombinant DNA technique comprises a transcription regulatory region and a promoter region of a gene encoding a protein constituting the protein complex of the present invention, for example, a base sequence of 200 bp upstream, preferably 100 bp upstream of the start codon of the protein.
  • a method of substitution using the method can be mentioned.
  • the transcription amount of the gene encoding the protein constituting the protein complex of the present invention or the production amount of the protein can be increased.
  • An enhanced organism can be obtained.
  • the host organism for example, microorganisms belonging to the genus Aureospila as described above, preferably Aureispira marina JCM23201 can be mentioned.
  • the organisms (b) and (c) in 3 above can be created by the following method.
  • the host organism is transformed with the recombinant DNA that can be obtained by the above method 4.
  • the host organism in the case of constructing the organism of (b) above, the microorganism belonging to the genus Aureospira of 3 above, preferably Aureispira marina JCM23201 can be mentioned.
  • host organisms other than the microorganism belonging to the genus Aureospira of 3 above can be mentioned.
  • a method for introducing the recombinant DNA as a plasmid capable of autonomous replication in the parent strain is, for example, a method using calcium ions [Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 69, 2110]. (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • the homologous recombination method described above can be used as a method for incorporating the recombinant DNA into the chromosomal DNA of the parent strain.
  • the method for introducing the recombinant DNA as a plasmid capable of autonomous replication in the parent strain include a particle gun method and an electroporation method.
  • examples of a method for incorporating the recombinant DNA into the chromosomal DNA of the parent strain include a method using Agrobacterium. It can be confirmed using the method 3 above that the organism obtained by the above method is the target microorganism.
  • 6 Method for Producing ARA or ARA-Containing Composition of the Present Invention The method for producing the ARA-containing composition of the present invention is carried out by culturing the microorganism in a culture medium when the microorganism constructed by the above method 5 is used. ARA or an ARA-containing composition can be produced and accumulated, and an ARA or ARA-containing composition can be collected from the culture.
  • the ARA-containing composition examples include ARA-containing fats and oils or ARA-containing phospholipids, and preferably ARA-containing fats and oils.
  • the culture of the microorganism can be obtained by inoculating the microorganism in an appropriate medium and culturing according to a conventional method.
  • the medium any known medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and the like can be used.
  • the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose and galactose, fats and oils such as oleic acid and soybean oil, glycerol and sodium acetate. These carbon sources can be used, for example, at a concentration of 20 to 300 g per liter of medium.
  • the culture can be continued by feeding the carbon source.
  • the amount of the carbon source to be consumed can be increased, and the production amount of the ARA-containing composition can be increased.
  • organic nitrogen such as yeast extract, corn steep liquor, polypeptone, sodium glutamate and urea
  • inorganic nitrogen such as ammonium acetate, ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium nitrate, ammonium nitrate and ammonia
  • inorganic salt potassium phosphate or the like can be used in appropriate combination.
  • the medium containing the above components is preferably used after sterilization by an autoclave after adjusting the pH within the range of 4.0 to 9.5 by adding an appropriate acid or base.
  • the culture temperature is generally 10 to 45 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the culture temperature is preferably controlled to a culture temperature at which the ARA-containing composition can be produced.
  • the pH during the cultivation is generally 3.5 to 9.5, preferably 4.5 to 9.5.
  • the particularly preferred pH varies depending on the purpose, and is 5.0 to 8.0 for producing a large amount of fats and oils.
  • the culture period can be, for example, 2 to 7 days, and the culture can be performed by aeration stirring culture or the like.
  • a method for separating a culture solution and a microorganism from a culture can be performed by a conventional method known to those skilled in the art, and for example, can be performed by a centrifugal separation method, filtration, or the like.
  • the ARA-containing composition can be obtained by crushing the microorganisms separated from the above culture with, for example, ultrasonic waves, dynomill, etc., and then performing solvent extraction with, for example, chloroform, hexane, butanol or the like.
  • the ARA-containing composition produced by the above production method can be obtained by, for example, converting a short-chain fatty acid using a low-temperature solvent fractionation method [Zentaro Takahashi, Yukagaku, 40: 931-941 (1991)] or a hydrolase such as lipase.
  • the ARA-containing composition having a high ARA content can be obtained by concentrating the ARA-containing composition by a method such as a method of free removal [Takahashi Kotaro, Yukagaku, 40: 931-941 (1991)].
  • ARA can be produced by separating and collecting ARA from the ARA-containing composition.
  • ARA is separated by, for example, a urea addition method, a cooling separation method, a high performance liquid chromatography method, or a supercritical chromatography method.
  • a hydrolysis method For example, a urea addition method, a cooling separation method, a high performance liquid chromatography method, or a supercritical chromatography method.
  • the ARA alkyl ester can be produced by separating and collecting the ARA alkyl ester from the ARA-containing composition.
  • the ARA alkyl ester is not particularly limited as long as it is an ARA alkyl ester, but preferably, an ARA methyl ester or an ARA ethyl ester, more preferably an ARA ethyl ester.
  • an ARA alkyl ester In order to separate and collect an ARA alkyl ester from an ARA-containing composition, for example, after preparing a mixed fatty acid alkyl ester containing an ARA alkyl ester from an ARA-containing composition by an alcoholysis method, for example, urea addition method, cooling separation
  • the ARA alkyl ester can be separated and collected by a method, a high performance liquid chromatography method or a supercritical chromatography method.
  • the plant when using the plant constructed by the above method 5, the plant is cultivated in a medium, and the ARA-containing composition is generated and accumulated in the cultivated product.
  • collecting an ARA containing composition from this cultivation can be mentioned.
  • the plant is cultivated in a medium suitable for the growth of the plant.
  • the medium can be, for example, soil, sand, a granular medium that supports the growth of any other root (e.g. vermiculite, perlite, etc.), or hydroponics, and the growth of suitable light, water and higher plants Any growth medium for the plant containing the nutritional supplement is included.
  • the period for cultivating the plant is, for example, 1 week to 12 months, preferably 2 weeks to 6 months.
  • light, water, nutritional supplements and the like used for normal plant growth are provided.
  • the cultivated product is extracted with water to obtain a crude oil.
  • An ARA-containing composition, ARA, or ARA alkyl ester can be produced from the crude oil by the same method as described above.
  • Chromosomal DNA of Aureispira marina JCM23201 strain was prepared by a conventional method, and genome base sequence was determined using Genome Sequencer FLX system (GS FLX +) (Roche Diagnostics). . As a result, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 44 was obtained, including DNA encoding the protein constituting the protein complex of the present invention.
  • OrfA, OrfB, OrfC, OrfD, OrfE, OrfR Table 2 shows the base sequence number, the base sequence length (including the stop codon), the amino acid sequence number, the amino acid sequence length, and the position in SEQ ID NO: 44 in each Orf.
  • OrfR was considered to encode a transcription factor and was not considered to belong to the ARA-PKS system.
  • each Orf has a lac promoter using overlap extension PCR (Gene 77: 61-68, 1989) in a later step.
  • a sequence complementary to a primer that amplifies the 3 ′ portion of the lac promoter is added.
  • a BamHI recognition site represented by GGATCC is added to the 3 ′ primer (SEQ ID NOs: 48, 50, 52, 54 and 56) of each Orf for cloning into a vector.
  • the Sse8387I site represented by CCTGCAGG is added to the 3 ′ primer (SEQ ID NOS: 48 and 54) of OrfA and OrfD in addition to the BamHI site.
  • the lac promoter to be linked to each Orf was amplified by PCR using the “Lac promoter amplification primer” shown in Table 3 using the genomic DNA of E. coli W3110 as a template.
  • 3 ′ primers (SEQ ID NOs: 59, 60, 61, 62, and 63) are linked to each Orf using overlap extension PCR in the subsequent step, so that the 5 ′ portion of each Orf is used. A sequence complementary to the primer to be amplified is added. In addition, these 5′-side primers are added with an EcoT22I recognition site represented by ATGCAT in SEQ ID NO: 57 and an Sse8387I recognition site represented by CCTGCAGG in SEQ ID NO: 58 for cloning into a vector. Yes.
  • OrfE is a multi-copy vector pUC19 (Gene, 33, 103 (1985), Genbank accession number: L09137), OrfA and OrfB are medium-copy vectors pSTV29 (manufactured by Takara Bio, http: //catalog.takara-bio. asp?
  • OrfC and OrfD were cloned into a low copy vector pMW219 (Nippon Gene, http://nippongene.com/pages/products/clomod/dna_vec/). Details are shown below.
  • OrfE and lac promoter-ligated DNA were subjected to restriction enzyme treatment with BamHI and EcoT22I, and BamHI and pUC19 treated with Sse8387I were mixed and ligated to obtain an OrfE expression vector pUC19-OrfE (Table 3).
  • the DNA in which OrfA and the lac promoter were linked was treated with restriction enzymes with BamHI and EcoT22I, mixed with pSTV29 treated with BamHI and Sse8387I, and ligated to obtain an OrfA expression vector pSTV29-OrfA.
  • OrfB and lac promoter-ligated DNA were subjected to restriction enzyme treatment with BamHI and EcoT22I, mixed with pSTV29-OrfA treated with BamHI and Sse8387I, and ligated to obtain the OrfA and OrfB co-expression vector pSTV29-OrfA-OrfB (Table) 3).
  • OrfD and lac promoter-linked DNA were subjected to restriction enzyme treatment with BamHI and EcoT22I, mixed with pMW219 treated with BamHI and Sse8387I, and ligated to obtain an OrfD co-expression vector pMW219-OrfD.
  • OrfC and lac promoter-ligated DNA were subjected to restriction enzyme treatment with BamHI and Sse8387I, mixed with pMW219-OrfD treated with BamHI and Sse8387I, and ligated to obtain OrfC and OrfD co-expression vector pMW219-OrfD-OrfC (Table) 3).
  • E. coli which is a host, was confirmed for ARA production in E. coli.
  • E. coli in which the fatty acid degradation pathway of the host was blocked was used. It is known that Escherichia coli in which fadE encoding acyl-CoA dehydrogenase is destroyed exhibits a phenotype that cannot assimilate fatty acids (J BactEriol. 2002 184 (13): 3759-64.).
  • Escherichia coli in which fadE was disrupted was obtained from the E. coli 1 gene disruption library (Mol. Syst. Biol., 2: article number: 2006.0008) (BW25113 ⁇ fadE :: FRT). According to a conventional method, the E.
  • coli was transformed with pUC19-OrfE, pST29-OrfA-OrfB and pMW219-OrfD-OrfC, and LB agar medium (Bactotrypton (Becton Dickinson) 10 g / L, Yeast extract (Becton Dickinson) 5 g / L, sodium chloride 5 g / L (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), agarose for microbial culture (manufactured by Nacalai Tesque), ampicillin sodium 50 mg / L, kanamycin sulfate 10 mg / L, Selected in a medium (LB agar medium + Amp, Km, Cm) supplemented with chloramphenicol 20 mg / L (all manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • LB agar medium Bacillus subtilis
  • the strain thus obtained was named ⁇ fadE-EABDC strain.
  • the control strain created at the same time was named ⁇ fadE-NNNNN strain.
  • ⁇ fadE-EABDC strain and ⁇ fadE-NNNNN strain were applied to LB agar medium (Amp, Km, and Cm were added) and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. Thereafter, the cells were inoculated into a large test tube containing 5 ml of LB liquid medium (Amp, Km, and Cm added) and cultured at 25 ° C. for 24 hours.
  • the cultured broth was further inoculated with 500 ul in a large test tube containing 5 ml of LB liquid medium (Amp, Km, and Cm added), and 100 mM IPTG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. Incubated at 40 ° C. for 40 hours.
  • GC analysis Equipment used: GC2010 manufactured by Shimadzu Corporation, column: HR-SS-10 (0.25 mm x 25 m) manufactured by Shinwa Chemical, carrier gas: helium (39.9 cm / sec), column temperature: 190 ° C, vaporization chamber temperature 250 ° C, Split injection (split ratio 60)
  • GCMS analysis Equipment used: GCMS-QP2010, manufactured by Shimadzu Corporation, column: HR-SS-10 (0.25 mm x 25 m), manufactured by Shinwa Chemical Co., Ltd., carrier gas: helium (39.9 cm / sec), column temperature: 190 ° C, vaporization chamber temperature 250 C, split injection (split ratio 60).
  • the obtained fatty acid methyl ester was injected into 2 ul GC and GCMS.
  • a mixed sample for qualitative fatty acid methyl ester (catalog code 1021-58209) manufactured by GL Sciences Inc. was used. This mixed sample contains arachidic acid, eicosenoic acid, ARA, EPA, and DHA.
  • the obtained gas chromatogram is shown in FIG. Only when the ARA-PKS system was introduced, a peak corresponding to ARA of the mixed sample was detected.
  • OrfE is a gene that encodes PPT, as detailed above.
  • PPT functions in the PUFA PKS system include catalyzing the attachment of phosphopantethein cofactors to the ACP domain. It is known that phosphopantethein cofactor adheres to apo-ACP to become holo-ACP and is activated (Lambalot RH et al., Chemistry and Biology, 3, 923 (1996)).
  • PCR was performed using the genomic DNA of the microorganism described in “Source of gene” in Table 4 as a template and “Gene amplification primer” as a primer.
  • Each plasmid described in Table 4 was prepared by the following method.
  • pUC19-sfp an overlap extension was obtained by (a) DNA containing the sfp gene amplified above and (b) a lac promoter amplified by PCR using the primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 72 and 73.
  • PUC19-sfp was obtained by ligation by PCR, treating the ligated DNA fragment with restriction enzymes SpeI and KpnI, and ligating to pUC19 treated with XbaI and KpnI.
  • pUC19-SO1604 For pUC19-SO1604, (a) a DNA containing the SO1604 gene amplified above and (b) a lac promoter amplified by PCR using the primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 72 and 74 were overlap extension. PUC19-SO1604 was obtained by ligation by PCR, treating the ligated DNA fragment with restriction enzymes SpeI and KpnI, and ligating to pUC19 treated with XbaI and KpnI.
  • pUC19-entD For pUC19-entD, (a) a DNA containing the entD gene amplified above and (b) a lac promoter amplified by PCR using the primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 72 and 75 were overlap extension. PUC19-entD was obtained by ligation by PCR, treating the ligated DNA fragment with restriction enzymes SpeI and KpnI, and ligating to pUC19 treated with XbaI and KpnI.
  • pUC19-cgl1980 For pUC19-cgl1980, (a) a DNA containing the cgl1980 gene amplified above and (b) a lac promoter amplified by PCR using the primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 72 and 76 were overlap extension. PUC19-cgl1980 was obtained by ligating with PCR and treating the ligated DNA fragment with restriction enzymes SpeI and KpnI and ligating to pUC19 treated with XbaI and KpnI.
  • the obtained strain was cultured and analyzed in the same manner as in Example 4 to examine whether ARA was produced. The results are shown in Table 5.
  • OrfD is a gene encoding a protein having an ER domain.
  • genes having homology to OrfD include the SO1597 gene derived from Shiwanella oneidensis MR-1. This SO1597 gene and OrfD of arachidonic acid PKS of the present invention were exchanged.
  • PCR was carried out using the synthetic DNA represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 77 and 78 as a template using the genomic DNA of Shiwanella oneidensis MR-1 as a template to prepare a DNA fragment containing the SO1597 gene.
  • PCR was carried out using E. coli genomic DNA as a template and the synthetic DNAs represented by SEQ ID NOs: 72 and 79 as primers to prepare a DNA fragment containing the lac promoter.
  • overlap extension PCR by mixing these two fragments of DNA, a DNA fragment in which the SO1597 gene derived from the Shiwanella oneidensis MR-1 strain was linked to the lac promoter was prepared. This DNA fragment was treated with restriction enzymes SpeI and KpnI and ligated to pUC19-SO1604 treated with XbaI and KpnI to obtain pUC19-SO1604-SO1597.
  • the DNA ligated with OrfC and lac promoter constructed in Example 2 was treated with restriction enzymes with BamHI and Sse8387I, and pMW219 treated with BamHI and Sse8387I was used as Takara Bio. Ligation was performed using a ligation kit LONG manufactured by KK to obtain an expression vector pMW219-OrfC containing only OrfC.
  • a strain from which pUC19-OrfE and pMW-OrfD-OrfC were removed from ⁇ fadE-EABDC (BW25113 ⁇ fadE :: FRT / pSTV29-OrfA-OrfB strain) was simultaneously transformed with the above two types of expression vectors.
  • the obtained strains BW25113 ⁇ fadE :: FRT / pUC19-SO1604-SO1597, pSTV29-OrfA-OrfB, and pMW219-OrfC were cultured in the same manner as in Example 4, and fatty acids were analyzed.
  • OrfD can be replaced with the Shiwanella Oneidensis MR-1 strain SO1597.
  • ARA-PKS DNA encoding ARA-PKS constituent proteins, organisms in which the activity of ARA-PKS is enhanced from the host organism, and other PUFAs including EPA or EPA using the organism It is possible to provide a method for efficiently producing an ARA-containing composition containing no ARA.
  • SEQ ID NO: 47 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 48—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 49—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 50—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 51—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 52—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 53—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 54—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 55—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 56—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 57—Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID NO: 58—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 59—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 60—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 61—Description of Artificial Sequence: Syn

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Abstract

　本発明によれば、β-ケトアシル-アシルキャリヤー蛋白質シンターゼドメイン、マロニル-CoA: アシルキャリヤー蛋白質アシルトランスフェラーゼドメイン及びアシルキャリヤー蛋白質（以下、ACPという。）ドメインを有する蛋白質、ケトレダクターゼドメインを有する蛋白質、β-ケトアシル-ACPシンターゼドメイン、鎖伸長因子ドメイン、アシルトランスフェラーゼドメイン及びFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼドメインを有する蛋白質、エノイルACP-レダクターゼドメインを有する蛋白質、並びにホスホパンテテイントランスフェラーゼドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体を提供することができる。　さらに、該蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質の複合体の活性が宿主生物より増強された生物、及び該生物を用いたＥＰＡ又はＥＰＡを初めとする他のＰＵＦＡを含まないＡＲＡ含有組成物を効率よく製造する方法を提供することができる。

Description

アラキドン酸生産ポリケチドシンターゼ及びその利用
　本発明は、アラキドン酸（以下、ＡＲＡという。）を生産するポリケチドシンターゼ蛋白質の複合体、該蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質の複合体の活性が宿主生物より増強された生物、及び該生物を用いたＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物の製造法に関する。
　ＡＲＡは、シス－５，８，１１，１４エイコサテトラエン酸（２０：４）であり、長鎖多価不飽和脂肪酸類（以下、ＰＵＦＡという。）の（ｎ－６）ファミリーに属する。ＡＲＡは、プロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類を含む群であるエイコサノイド類の主な前駆体である。ヒトはΔ－５デサチュラーゼ作用を欠き、脂肪酸１８：２（ｎ－６）（リノール酸）をＡＲＡに変換することができない。ＡＲＡは、ヒトにとっては必須脂肪酸である。
　ＡＲＡを製造する方法としては、糸状菌 Mortierella alpinaを用いた発酵法が知られている（非特許文献１及び２）。また、鎖伸長酵素及び不飽和化酵素を、本来ＡＲＡを生産することができない微生物又は植物に発現させて、該微生物又は植物によって生合成される脂肪酸を出発物質として、ＡＲＡを生産する方法が知られている（特許文献１、非特許文献３）。
　一方で、ＡＲＡ以外のＰＵＦＡに属するドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）やエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）には、前述の脂肪酸を出発物質とする経路とは別に、アセチルＣｏＡを出発物質として、ＰＵＦＡ－ポリケチドシンターゼ（以下、ポリケチドシンターゼをＰＫＳという。）と呼ばれる単一の複合酵素によって生成される経路が知られており(特許文献２、非特許文献４)、ＰＵＦＡ－ＰＫＳを発現させた微生物がＤＨＡ又はＥＰＡを生産した報告例がある。
　例えば、シーワネラ（Shewanella）属に属する微生物由来のＥＰＡ－ＰＫＳを発現させた大腸菌が、ＥＰＡを生産したことが報告されている（非特許文献４～７）。モリテラ（Moritella）属に属する微生物由来のＤＨＡ－ＰＫＳを発現させた大腸菌が、ＤＨＡを生産したことが報告されている（非特許文献８）。さらに、シーワネラ（Shewanella）属に属する微生物由来のＥＰＡ－ＰＫＳのドメインの一部分を、モリテラ（Moritella）属に属する微生物由来のＤＨＡ－ＰＫＳの対応するドメインに置換して大腸菌に発現させることで、生産物であるＥＰＡがＤＨＡに変換したことが報告されている (非特許文献９)。
　このように、ＰＵＦＡ－ＰＫＳを発現させた組換え生物によるＤＨＡ又はＥＰＡの生産については報告があるが、ＡＲＡ－ＰＫＳを発現させた組換え生物によるＡＲＡの生産については報告がない。
　そもそも、ＡＲＡ－ＰＫＳについては、サイクロフレクサス・トルキス (Psychloflexustorquis) のゲノム塩基配列中に、ＡＲＡ及びＥＰＡの生産に関与するＰＫＳをコードする遺伝子が推定されているのみである（非特許文献１０）。当該ＰＫＳが、実際にＡＲＡ及びＥＰＡの生産に関与するＰＫＳか否かは特定されていない（非特許文献１０）。すなわち、ＡＲＡ－ＰＫＳについては、その機能が調べられているものについては報告がない。
特表２００８－５１８６２８号 米国特許第６１４０４８６号
Biotechnol. Lett. (2005), Vol.27, p731-735 Biopro. Biosyst. Eng. (2009), Vol.32, p117-122 Transgenic Res. (2011), 1-9 Science (2001), Vol.293, p290-293 Biotechnol. Bioprocess Eng. (2006), Vol.11, p510-515 Methods in Enzymology (2009), Vol.459, p79-96 J. AM. CHEM. SOC. (2008), Vol.130, p6336-6337 FEBS Lett. (2006), Vol.580, p4423-4429. FEMS Microbiol. Lett. (2009), Vol.295, p170-176 PLoS ONE (2011), Vol.6(5), art. no. e20146
　本発明の課題は、ＡＲＡ－ＰＫＳ蛋白質の複合体、該蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質の複合体の活性が宿主生物より増強された生物、及び該生物を用いたＥＰＡ又はＥＰＡを初めとする他のＰＵＦＡを含まないＡＲＡ含有組成物を効率よく製造する方法を提供することにある。
　本発明は、以下の（１）～（１７）に関する。
（１）以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる、蛋白質の複合体。
［１］β-ケトアシル-アシルキャリヤー蛋白質シンターゼ（以下、KSという。）ドメイン、マロニル-CoA: アシルキャリヤー蛋白質アシルトランスフェラーゼ（以下、MATという。）ドメイン及びアシルキャリヤー蛋白質（以下、ACPという。）ドメインを有する蛋白質、ケトレダクターゼ(以下、KRという。)ドメインを有する蛋白質、KSドメイン、鎖伸長因子（以下、CLFという。）ドメイン、アシルトランスフェラーゼ（以下、ATという。）ドメイン及びFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ（以下、DHという。）ドメインを有する蛋白質、エノイルACP-レダクターゼ（以下、ERという。）ドメインを有する蛋白質、並びにホスホパンテテイントランスフェラーゼ（以下、PPTという。）ドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体
［２］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、ATドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、及びDHドメインを有する蛋白質、ERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体
［３］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、KSドメイン及びATドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、及びDHドメインを有する蛋白質、ERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体
［４］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びERドメインを有する蛋白質、DHドメイン及びERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体
（２）上記（１）に記載のドメインの１つ以上が、以下の［１］～［９］からなる群より選ばれるドメインである、上記（１）に記載の蛋白質の複合体。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するKSドメイン、又は配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、KS活性を有する相同ドメイン
［２］配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するMATドメイン、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、MAT活性を有する相同ドメイン
［３］配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するACPドメイン、又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ACPとしての機能を有する相同ドメイン
［４］配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するKRドメイン、又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、KR活性を有する相同ドメイン
［５］配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するCLFドメイン、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、CLFとしての機能を有する相同ドメイン
［６］配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するATドメイン、又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、AT活性を有する相同ドメイン
［７］配列番号１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列を有するDHドメイン、又は配列番号１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、DH活性を有する相同ドメイン
［８］配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するERドメイン、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ER活性を有する相同ドメイン
［９］配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるアミノ酸配列を有するPPTドメイン、又は配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、PPT活性を有する相同ドメイン
（３）KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質が、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、上記（１）の［１］に記載の蛋白質の複合体。
（４）KRドメインを有する蛋白質が、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、上記（１）の［１］に記載の蛋白質の複合体。
（５）KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質が、配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、上記（１）の［１］に記載の蛋白質の複合体。
（６）ERドメインを有する蛋白質が、配列番号３８又は４０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３８又は４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、上記（１）の［１］に記載の蛋白質の複合体。
（７）PPTドメインを有する蛋白質が、配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、（１）の［１］に記載の蛋白質の複合体。
（８）上記（１）～（７）のいずれか１つに記載の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（９）KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、上記（８）に記載のＤＮＡ。
（１０）KRドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、上記（８）に記載のＤＮＡ。
（１１）KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３５で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、上記（８）に記載のＤＮＡ。
（１２）ERドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３７又は３９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３７又は３９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、上記（８）に記載のＤＮＡ。
（１３）PPTドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表されるいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、上記（８）に記載のＤＮＡ。
（１４）上記（１）～（７）のいずれか１つに記載の蛋白質の複合体の活性が宿主生物より増強された生物。
（１５）生物が、上記（８）～（１３）のいずれか１つに記載のＤＮＡで宿主生物を形質転換して得られる、細胞中のアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産することができる生物である、上記（１４）に記載の生物。
（１６）宿主生物が、微生物又は植物である、上記（１４）又は（１５）に記載の生物。
（１７）上記（１４）～（１６）のいずれか１つに記載の生物を培地に培養又は栽培し、培養物又は栽培物中にＡＲＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物又は栽培物からＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物の製造法。
　本発明のＡＲＡ－ＰＫＳの利用により、従来は鎖伸長酵素、不飽和価酵素の２種が関わる反応で、多くの中間体を経て生産する必要があったＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物をアセチルＣｏＡから単一の複合酵素であるＡＲＡ－ＰＫＳで生産することが可能になり、より副生の少ないＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物の生産法を確立することが可能となる。
オーレオスピラ・マリーナ由来のＡＲＡ－ＰＫＳ系の６つのオープンリーディングフレーム（以下、Orfともいう。）、及びこのＰＫＳ系のドメイン構造を示す図である。 ＡＲＡ－ＰＫＳを導入した大腸菌から抽出した脂肪酸のガスクロマトグラムを示す。
1 本発明の蛋白質の複合体
1.1 本発明の蛋白質の複合体について
　本発明の蛋白質の複合体は、以下の
［１］KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質、KRドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質、ERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体、
［２］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、ATドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、及びDHドメインを有する蛋白質、ERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体、
［３］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、KSドメイン及びATドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、及びDHドメインを有する蛋白質、ERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体、及び
［４］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びERドメインを有する蛋白質、DHドメイン及びERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体、
からなる群より選ばれる蛋白質の複合体である。
　本明細書において「ドメイン」とは、蛋白質中の連続するアミノ酸配列からなる一部分であって、当該蛋白質において、特定の生物学的活性又は機能を有する領域である。
　本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質は、上記［１］～［４］のいずれかの蛋白質の複合体が、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する限りにおいて、相互に物理的に結合していてもよく、分離していてもよい。
　KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン、KRドメイン、CLFドメイン、ATドメイン、DHドメイン、ERドメイン、及びPPTドメインは、該ドメインを有する１以上の蛋白質が協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産するかぎりにおいて、各ドメインは限定されないが、例えば、以下の例を挙げることができる。
　KSドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するKSドメイン及び表１のKSドメインを、好ましくは表１のKSドメインを挙げることができる。
　本明細書において「既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳ」とは、好ましくは、シュワネラ属（Shewanella）、コルウェリア属（Colwellia）、デサルファチバチルム属（Desulfatibacillum）、サイクロフレクサス属（Psychroflexus）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、ノストック属（Nostoc）、ミクロシスティス属（Microcystis）、サッカロポリスポラ属（Saccharopolyspora）、ジオバクター属（Geobacter）、プランクトマイセス属（Planctomyces）、デサルフォコッカス属（Desulfococcus）、ソランギウム属（Sorangium）、レニバクテリウム属（Renibacterium）、チチノファガ属（Chitinophaga）、グレオバクター属（Gloeobacter）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ソリバクター属（Solibacter）、デサルフォバクテリウム属（Desulfobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、ウルケニア（Ulkenia）属、ジャポノチトリウム（Japonochytrium）属、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属、モリテラ（Moritella）属からなる群より選ばれる属に属する微生物が元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳを、より好ましくは、Shewanella pealeana ATCC 700345、Shewanella oneidensis MR-1、Colwellia psychrerythraea 34H、Desulfatibacillum alkenivoransAK-01、Psychroflexus torquisATCC 700755、Schizochytrium sp. ATCC 20888、Nostoc punctiformePCC 73102、Microcystis aeruginosaNIES-843、Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338、Geobacter bemidjiensis Bem、Planctomyces limnophilus DSM3776、Desulfococcus oleovorans Hxd3、Sorangium cellulosum ‘So ce 56’、 Renibacterium salmoninarum ATCC 33209、Chitinophaga pinensisDSM 2588、Gloeobacter violaceusPCC 7421、Azotobacter vinelandiiDJ、Rhodococcus erythropolisPR4、Candidatus Solibacter usitatusEllin6076、Desulfobacterium autotrophicumHRM2、及びClostridium thermocellumATCC 27405、Schizochytrium minutum、Schizochytrium sp. S31 ATCC 20888、Schizochytrium sp. S8 ATCC 20889、Schizochytrium sp. LC-RM ATCC 18915、Schizochytrium sp. SR21、Schizochytrium aggregatum ATCC 28209、Schizochytrium limacinum IFO 32693、Thraustochytrium sp. 23B ATCC 20891、Thraustochytrium striatum ATCC 24473、Thraustochytrium aureum ATCC 34304、Thraustochytrium roseum ATCC 28210、Ulkenia sp. BP-5601、及びJaponochytrium sp. L1 ATCC 28207 からなる群より選ばれる微生物が、元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳを、最も好ましくは、Shewanella pealeana ATCC 700345、Shewanella oneidensis MR-1、Colwellia psychrerythraea 34H、Moritella marina MP-1、Schizochytrium sp. ATCC 20888からなる群より選ばれる微生物が、元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳを挙げることができる（非特許文献９及び１０）。
　MATドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するMATドメイン及び表１のMATドメインを、好ましくは表１のMATドメインを挙げることができる。
　ACPドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するACPドメイン及び表１のACPドメインを、好ましくは表１のACPドメインを挙げることができる。
　KRドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するKRドメイン及び表１のKRドメインを、好ましくは表１のKRドメインを挙げることができる。
　CLFドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するCLFドメイン及び表１のCLFドメインを、好ましくは表１のCLFドメインを挙げることができる。
　ATドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するATドメイン及び表１のATドメインを、好ましくは表１のATドメインを挙げることができる。
　DHドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するDHドメイン及び表１のDHドメインを、好ましくは表１のDHドメインを挙げることができる。
　ERドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するERドメイン及び表１のERドメインを、好ましくはシュワネラ属に属する微生物由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するERドメイン及び表１のERドメインを、最も好ましくは、Shewanella oneidensis MR-1由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するERドメイン及び表１のERドメインを挙げることができる。
　PPTドメインの例としては、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するPPTドメイン、バチルス属、シュワネラ属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属からなる群より選ばれるに属する微生物由来が有するPPTドメイン及び表１のPPTドメインを、好ましくは、Bacillus subtilis 168、Shewanella oneidensis MR-1、Escherichia coli W3110、Corynebacterium glutamicumATCC13032からなる群より選ばれる微生物由来のPPTドメイン及び表１のPPTドメインを挙げることができる。
　本発明の蛋白質の複合体は、KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン、KRドメイン、CLFドメイン、ATドメイン、DHドメイン、ERドメイン、及びPPTドメインからなる群より選ばれるドメインの１つ以上が、表１のドメインから選ばれるドメインであることが好ましい。
　ＰＵＦＡ－ＰＫＳにおいては、ドメインの一部を交換することにより、生産物であるＰＵＦＡを変換することが可能である（非特許文献９）。したがって、非特許文献９に記載された方法に従い、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有するKSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン、KRドメイン、CLFドメイン、ATドメイン、DHドメイン、ERドメイン、及びPPTドメインからなる群より選ばれるドメインの１つ以上を表１のドメインに置換することにより、ＡＲＡを生産することができるＰＫＳを作製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本明細書において「相同ドメイン」とは、元となるドメインと構造および機能が類似することにより、そのドメインが、進化上の起源を元のドメインと同一にすると考えられるドメインであって、自然界に存在する生物が有するドメインをいう。
　そのような相同ドメインの例としては、表1に記載されている各ドメインと、少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、表１に記載されている各ドメインと協働することにより、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産することができる相同ドメインを挙げることができる。
　本明細書において協働するとは、ある蛋白質を他の蛋白質と共存させたとき、一体となって特定の反応を行うことであり、特に本明細書ではKSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン、KRドメイン、KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン、DHドメイン、ERドメイン及びPPTドメインが、いくつかの蛋白質に分かれて含まれている状態において、それらの蛋白質を共存させたとき、一体となってアセチルCoAを出発物質としてＡＲＡを生産すること、及び、あるドメインを他のドメインと共存させたとき、他のドメインと一体となってアセチルCoAを出発物質としてＡＲＡを生産することをいう。
　上記において共存とは、他のドメインと同じ蛋白質に含まれる場合と、他のドメインが他の蛋白質に含まれる場合に、蛋白質同士を共存させる場合の両方を含む。
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. NATドメインl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　各ドメインの相同ドメインが、他のドメインと協働してアセチルCoAを出発物質としてＡＲＡを生産できることは、例えば配列番号３２、３４、３６、３８及び２２で表される蛋白質からなる蛋白質の複合体において該相同ドメインに対応するオリジナルのドメインを該相同ドメインに置換した該蛋白質の複合体を作製し、それがアセチルCoAを出発物質としてＡＲＡを生産することをもって確認することができる。
　具体的には、後述する方法により上記した相同ドメインに置換した蛋白質複合体をコードするDNAを有する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAでＡＲＡを生産しない微生物、例えば後述するアシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするfadEを破壊したエシェリヒア・コリ BW25113株を形質転換して得られる微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したＡＲＡをガスクロマトグラフィーによって検出することで確認することができる。
1.2 本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質の例
　本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質としては、上記［１］～［４］の蛋白質の複合体を構成する蛋白質を挙げることができ、好ましくは、上記［１］の蛋白質の複合体を構成する蛋白質を挙げることができる。
1.2.1 KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質
　上記［１］のKSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質の例としては、例えば、(a)配列番号３２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、OrfA蛋白質ともいう。）、(b)配列番号３２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質、又は(c)配列番号３２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する変異蛋白質を挙げることができる。
　相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　上記の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。
　欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどがあげられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　OrfA蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、OrfAという。）は、配列番号３１で表される塩基配列を有するＤＮＡである。
　OrfA蛋白質内には、1個のKSドメイン、1個のMATドメイン、及び４個のACPドメインがある。
　OrfAは、BLAST検索において既知の配列と比較された。核酸レベルにおいて、OrfAはいずれの既知の塩基配列とも有意な相同性をもたない。アミノ酸レベルにおいては、OrfA蛋白質と最高度の相同性をもつ配列は以下のとおりであった：unidentified eubacterium SCB49多価不飽和脂肪酸合成酵素pfaA (アクセッション番号EDM45380)の1574個のアミノ酸残基に関して54％同一であった；およびPsychroflexus torquis ATCC 700755　マルチドメインβケトアシルシンターゼ(アクセッション番号EAS69828)の1557個のアミノ酸残基に関して54％同一であった。
　OrfA蛋白質における第一のドメインはKSドメインであり、本明細書ではOrfA-KSドメインともいう。このドメインは、配列番号３１(OrfA)の約1位から約40位の間の起点から、配列番号３１の約1400位から約1500位の間の終点まで及ぶ。OrfA-KSドメインをコードするＤＮＡは、配列番号１(配列番号３１の1位～1500位)で表される塩基配列を有している。KSドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号３２の約1位から約14位の間の起点から、配列番号３２の約466位から約500位の間の終点まで及ぶ。OrfA-KSドメインは、配列番号２(配列番号３２の1位～500位) で表されるアミノ酸配列を有している。OrfA-KSドメインが、活性部位モチーフ：DXAC*(*アシル結合部位C215)を含むことは注目される。
　OrfA蛋白質における第二のドメインは、MATドメインであり、本明細書ではOrfA-MATドメインとも呼ばれる。該ドメインは、配列番号３１(OrfA)の約1700位から約1800位の間の起点から、配列番号３１の約2500位から約2600位の間の終点まで及ぶ。OrfA-MATドメインをコードするＤＮＡは、配列番号５（配列番号３１の1700位～2700位) で表される塩基配列を有している。MATドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号３２(OrfA蛋白質)の約565位から約600位の間の起点から、配列番号３２の約865位から約900位の間の終点まで及ぶ。OrfA-MATドメインは、配列番号６(配列番号３２の565位～900位) で表されるアミノ酸配列を有している。OrfA-MATドメインが、活性部位モチーフ：GHS*XG(*アシル結合部位S683)を含むことは注目される。当該活性モチーフは、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を有している。
　OrfA蛋白質のドメイン3～6は、4個の直列型ACPドメインであり、本明細書ではOrfA-ACP(その配列の第一ドメインはOrfA-ACP1、第二ドメインはOrfA-ACP2、第三ドメインはOrfA-ACP3及び第四ドメインはOrfA-ACP4)とも呼ばれる。第一のOrfA-ACP1は、配列番号３１(OrfA)の約3381位から約3612位まで及ぶ。OrfA-ACP1をコードするＤＮＡは、配列番号７(配列番号３１の3381位～3612位) で表される塩基配列を有している。OrfA-ACP1は、配列番号３２の約1127位から約1204位まで及ぶ。OrfA-ACP1は、配列番号８(配列番号３２の1127位～1204位) で表されるアミノ酸配列を有している。OrfA-ACP1が活性部位モチーフ：LGIDS*(*パンテテイン結合モチーフS1166)を含むことは注目される。当該活性モチーフは、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を有している。
　すべての4個のACPドメインの塩基およびアミノ酸配列は、高度に保存されており、それゆえ、各ドメインについての配列は、本明細書には個々の配列識別名により表されていない。しかしながら、本明細書に開示されている情報に基づいて、当業者は、他の3個のACPドメインのそれぞれを含む配列を容易に決定することができる。
　すべての4個のACPドメインは合わせて、配列番号３１の約3381位から約4632位までのOrfAの領域に及び、配列番号３２の約1127位から約1544位までのアミノ酸に対応している。すべての4個のドメインを含む全ACP領域をコードするＤＮＡは、配列番号４３で表される塩基配列を有している。配列番号４３で表される領域は、個々のドメイン間のリンカーセグメントを含む。その4個のドメインについての繰り返し間隔は、配列番号４３のおよそ340個の塩基ごとである(隣接した活性部位セリン間を測定されたアミノ酸の実際の数は112個から114個までのアミノ酸の範囲である)。4個のACPドメインのそれぞれは、パンテテイン結合モチーフLGIDS*(配列番号４２で表されるアミノ酸配列を有している)を含み、S*はパンテテイン結合部位セリン(S)である。パンテテイン結合部位セリン(S)は、各ドメイン配列の中央近くに位置する。配列番号３２で表されるアミノ酸配列に対して、4個のドメインのそれぞれについての活性部位セリン残基(すなわち、パンテテイン結合部位)の位置は以下の通りである：ACP1 = S1166; ACP2 = S1280; ACP3 = S1392; およびACP4 = S1506。各ドメインの平均サイズが、リンカーを除いて約85個のアミノ酸、リンカーを含めて約110個のアミノ酸であり、活性部位セリンがほぼドメインの中央にあるとすれば、当業者は、OrfA蛋白質における４個のACPドメインのそれぞれの位置を容易に決定することができる。
1.2.2 KRドメインを有する蛋白質
　上記［１］のKRドメインを有する蛋白質としては、例えば、(a)配列番号３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、OrfB蛋白質ともいう。）、(b)配列番号３４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質、又は(c)配列番号３４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する変異蛋白質を挙げることができる。
　相同蛋白質及び変異蛋白質に関する記載は、上記1.2.1と同じである。
　OrfB蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、OrfBという。）は、配列番号３３で表される塩基配列を有するＤＮＡである。
　OrfB蛋白質内には、1個のKRドメインがある。
　OrfBは、BLAST検索において既知の配列と比較された。核酸レベルにおいて、OrfＢはいずれの既知の塩基配列とも有意な相同性をもたない。アミノ酸レベルにおいては、OrfB蛋白質と最高度の相同性をもつ配列は以下のとおりであった：unidentified eubacterium SCB49多価不飽和脂肪酸合成酵素pfaA (アクセッション番号EDM45379)の802個のアミノ酸残基に関して51％同一であった；およびPsychroflexus torquis ATCC 700755　hypothetical protein (アクセッション番号EAS69829)の802個のアミノ酸残基に関して50％同一であった。
　OrfB蛋白質におけるKRドメインは、本明細書ではOrfB-KRドメインとも呼ばれる。このドメインは、配列番号３３の約550位の起点から、配列番号３３の約1630位の終点まで及ぶ。OrfB-KRドメインをコードするＤＮＡは、配列番号９(配列番号３３の550位～1630位)で表される塩基配列を有している。KRドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号３４(OrfB蛋白質)の約184位の起点から、配列番号３４の約543位の終点まで及ぶ。OrfB-KRドメインは、本明細書に配列番号１０(配列番号３４の184位～543位) で表されるアミノ酸配列を有している。
1.2.3 KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質
　上記［１］のKSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質としては、例えば、(a)配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質(以下、OrfC蛋白質ともいう。)、(b)配列番号３６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質、又は(c)配列番号３６で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する変異蛋白質を挙げることができる。
　相同蛋白質及び変異蛋白質に関する記載は、上記1.2.1と同じである。
　OrfC蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、OrfCともいう。）は、配列番号３５で表される塩基配列を有するＤＮＡである。
　OrfC蛋白質内には、1個のKSドメイン、1個のCLFドメイン、1個のATドメイン、及び２個のDHドメインがある。
　OrfCは、BLAST検索において既知の配列と比較された。核酸レベルにおいて、OrfCはいずれの既知の塩基配列とも有意な相同性をもたない。アミノ酸レベルにおいては、OrfC蛋白質と最高度の相同性をもつ配列は以下のとおりであった：unidentified eubacterium SCB49　hypothetical protein (アクセッション番号EDM45378)の2249個のアミノ酸残基に関して58％同一であった；およびPsychroflexus torquis ATCC 700755　hypothetical protein (アクセッション番号EAS69830)の2250個のアミノ酸残基に関して57％同一であった。
　OrfC蛋白質における第一ドメインはKSドメインであり、本明細書ではOrfC-KSドメインとも呼ばれる。このドメインは、配列番号３５(OrfC)の約1位から約43位の間の起点から、配列番号３５の約1332位から約1350位の間の終点まで及ぶ。OrfC-KSドメインをコードするＤＮＡは、配列番号３(配列番号３５の1位～1350位) で表される塩基配列を有している。KSドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号３６(OrfC蛋白質)の約1位から約15位の間の起点から、配列番号３６の約444位から約450位の間の終点まで及ぶ。OrfC-KSドメインは、配列番号４(配列番号３６の1位～450位) で表されるアミノ酸配列を有している。OrfC-KSドメインが、活性部位モチーフ：DXAC*(*アシル結合部位C19５)を含むことは注目される。
　OrfC蛋白質における第二ドメインはCLFドメインであり、本明細書ではOrfC-CLFドメインとも呼ばれる。このドメインは、配列番号３５(OrfC)の約1354位から約1366位の間の起点から、配列番号３５の約2400位から約2460位の間の終点まで及ぶ。OrfC-CLFドメインをコードするＤＮＡは、配列番号１１(配列番号３５の1354位～2460位) で表される塩基配列を有している。CLFドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号３６(OrfC蛋白質)の約452位から約456位の間の起点から、配列番号３６の約800位から約820位の間の終点まで及ぶ。OrfC-CLFドメインは、配列番号１２(配列番号３６の452位～820位) で表されるアミノ酸配列を有している。OrfC-CLFドメインがアシル結合システインを含まないKSドメイン活性部位モチーフを含むことは注目される。
　OrfC蛋白質における第三ドメインはATドメインであり、本明細書ではOrfC-ATドメインとも呼ばれる。このドメインは、配列番号３５(OrfC)の約2488位から約2938位の間の起点から、配列番号３５の約3990位から約4050位の間の終点まで及ぶ。OrfC-ATドメインをコードするＤＮＡは、本明細書に配列番号１３(配列番号３５の2488位～4050位) で表される塩基配列を有している。ATドメインを含むアミノ酸配列は、配列番号３６(OrfC蛋白質)の約830位から約980位の間の起点から、配列番号３６の約1330位から約1350位の間の終点まで及ぶ。OrfC-ATドメインは、配列番号１４(配列番号３６の830位～1350位) で表されるアミノ酸配列を有している。OrfC-ATドメインが、アシルトランスフェラーゼの特性を示すGxS*xG(*アシル結合部位S1094)の活性部位モチーフを含むことは注目される。
　OrfC蛋白質における第四ドメインはDHドメインであり、本明細書ではOrfC-DHドメイン1とも呼ばれる。これは、OrfC蛋白質における2個のDHドメインドメインのうちの1個であり、それゆえ、DHドメイン1と名付けられる。このドメインは、配列番号３５(OrfC)の約5008位から約5068位の間の起点から、配列番号３５の約5490位から約5550位の間の終点まで及ぶ。ORFC-DHドメイン1をコードするＤＮＡは、配列番号１５(配列番号３５の5008位～5550位) で表される塩基配列を有している。DHドメイン1は、配列番号３６(OrfC蛋白質)の約1670位から約1690位の間の起点から、配列番号３６の約1830位から約1850位の間の終点まで及ぶ。OrfC-DHドメイン1は、配列番号１６(配列番号３６の1670位～1850位) で表されるアミノ酸配列を有している。
　OrfC蛋白質における第二ドメインはDHドメインであり、本明細書ではOrfC-DHドメイン2とも呼ばれる。これは、OrfC蛋白質における2個のDHドメインのうちの二番目であり、それゆえ、DHドメイン2と名付けられる。このドメインは、配列番号３５(OrfC)の約6328位から約6418位の間の起点から、配列番号３５の末尾まで及ぶ。OrfC-DHドメイン2をコードするＤＮＡは、配列番号１７(配列番号３５の6328位～6726位) で表される塩基配列を有している。DHドメイン2は、配列番号３６(OrfC蛋白質)の約2110位から約2140位の間の起点から、配列番号３６の末尾まで及ぶ。OrfC-DHドメイン2は、配列番号１８(配列番号３６の2110位～2241位) で表されるアミノ酸配列を有している。
1.2.4 ERドメインを有する蛋白質
　上記［１］のERドメインを有する蛋白質としては、例えば、(a)配列番号３８又は４０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（配列番号３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を、以下、OrfD蛋白質ともいう。）、(b)配列番号３８又は４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質、又は(c) 配列番号３８又は４０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する変異蛋白質を挙げることができる。
　相同蛋白質及び変異蛋白質に関する記載は、上記1.2.1と同じである。
　OrfD蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、OrfDともいう。）は、配列番号３７で表される塩基配列を有するＤＮＡである。
　OrfD蛋白質内には、1個のERドメインがある。
　OrfDは、BLAST検索において既知の配列と比較された。核酸レベルにおいて、OrfDはいずれの既知の塩基配列とも有意な相同性をもたない。アミノ酸レベルにおいて、OrfD蛋白質と最高度の相同性をもつ配列は、以下の通りである：unidentified eubacterium SCB49　２－ニトロプロパンジオキシゲナーゼ (アクセッション番号EDM45377)、515個のアミノ酸残基に関して65％同一であった；およびPsychroflexus torquis ATCC 700755　hypothetical protein (アクセッション番号EAS69831)の515個のアミノ酸残基に関して66％同一であった。 
　OrfD蛋白質におけるERドメインは、本明細書ではOrfD-ERドメインとも呼ばれる。このドメインをコードするＤＮＡは、配列番号３７(OrfD)の約208位から約238位の間の起点から、配列番号３７の約1455位から約1485位の間の終点まで及ぶ。OrfD-ERドメインをコードするＤＮＡは、配列番号１９(配列番号３７の208位～1485位) で表される塩基配列を有している。ERドメインは、配列番号３８(OrfD蛋白質)の約70位から約80位の間の起点から、配列番号３８の約485位から約495位の間の終点まで及ぶ。OrfD-ERドメインは、配列番号２０(配列番号３８の70位～495位) で表されるアミノ酸配列を有している。
1.2.5 PPTドメインを有する蛋白質
　上記［１］のPPTドメインを有する蛋白質としては、例えば、(a) 配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を、以下、OrfE蛋白質ともいう。）、(b) 配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質、又は(c) 配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるいずれかのアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する変異蛋白質を挙げることができる。
　相同蛋白質及び変異蛋白質に関する記載は、上記1.2.1と同じである。
　OrfE蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、OrfEという。）は、配列番号２１で表される塩基配列を有するＤＮＡである。
　OrfE蛋白質はＡＲＡ生産ＰＫＳ系のPPTとして機能する。
　OrfEは、標準BLAST検索において既知の配列と比較された。核酸レベルにおいて、OrfEはいずれの既知の塩基配列とも有意な相同性をもたない。アミノ酸レベルにおいて、OrfE蛋白質と最高度の相同性をもつ配列は、以下の通りである：Microscilla marina ATCC 23134の4’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ (アクセッション番号EAY28494)の203個のアミノ酸残基に関して37％同一であった；およびKordia algicida OT-1のputative phosphopanthetteinyl transferaseアクセッション番号EDP94250)の171個のアミノ酸残基に関して58％同一であった。 
2 本発明のＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡである。
2.1 本発明のＤＮＡの例
2.1.1 KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡ
　KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡの例としては、(a)上記1.2.1に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、(b) 配列番号３１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列番号３１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、又は(d) 配列番号３１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、を挙げることができる。
　上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。
　DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第2版、第3版（2001年）、Methods for GenERドメインal and Molecular BactEriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドDNAラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750 ｍMの塩化ナトリウム、75 mMのクエン酸ナトリウム）、50 mMのリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20 μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42 ℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65 ℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３１で表される塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
2.1.2 KRドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡ
　KRドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡの例としては、(a) 上記1.2.2に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、(b)配列番号３３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列番号３３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、又は(d) 配列番号３３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、を挙げることができる。
　ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、上記2.1.1と同じである。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３３で表される塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
2.1.3 KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡ
　KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡの例としては、(a)上記1.2.3に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、(b) 配列番号３５で表される塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列番号３５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、又は(d) 配列番号３５で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、を挙げることができる。
　ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、上記2.1.1と同じである。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３５で表される塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
2.1.4 ERドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡ
　ERドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡの例としては、(a)上記1.2.4に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、(b) 配列番号３７又は３９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列番号３７又は３９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、(d) 配列番号３７又は３９で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、を挙げることができる。
　ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、上記2.1.1と同じである。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３７又は３９で表される塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
2.1.5 PPTドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡ
　PPTドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡの例としては、(a)上記1.2.5に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、(b) 配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、(c) 配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表されるいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、又は(d) 配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表されるいずれかの塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
　ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、上記2.1.1と同じである。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表されるいずれかの塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
2.2 本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡ
　本発明のＤＮＡには、上記2.1の本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを含む。
　該組換え体ＤＮＡは、本発明のＤＮＡが、宿主生物において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡである。
　宿主生物については、下記3に後述する。
　宿主生物に細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記2の本発明のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(Ferm BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(Ferm BP-5408)より調製]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385] pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ｐtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
　親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等を挙げることがきる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、P54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
　宿主生物に植物を用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、5’非翻訳領域（翻訳エンハンサー）、上記2の本発明のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。　そのような発現ベクターとしては、植物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、pRI 201-AN、pRI 201-ON、pRI 201-AN-GUS、及びpRI 201-ON-GUS等（いずれもタカラバイオ社製）を挙げることができる。
3 本発明の生物
　本発明の生物は、上記1の本発明の蛋白質の複合体の活性が宿主生物より増強された生物である。
　宿主生物とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元の生物のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元の生物が微生物の場合は、親株、宿主株ともいう。
　宿主生物はいずれの生物であってもよいが、例えば、微生物又は植物を挙げることができる。
　微生物としては、任意の細菌、原生生物、微小藻類、真菌、原生動物、を挙げることができる。
　特に微細藻類としては、ヤブレツボカビ目の微生物を挙げることができる。ヤブレツボカビ目の微生物としては、スラウストキトリウム属、ラビリンチュロイデス属、ジャポノチトリウム属、シゾキトリウム属、オーランチオキトリウム属からなる群より選ばれる微生物を挙げることができる。
　これらの属内の好ましい種は、限定されるものではないが、シゾキトリウム・ミヌツム(Schizochytriumminutum)、 シゾキトリウム・エスピー (S31)(ATCC 20888)、シゾキトリウム・エスピー(S8)(ATCC 20889)、シゾキトリウム・エスピー(LC-RM)(ATCC 18915)、シゾキトリウム・エスピー(SR21)、シゾキトリウム・アグレガツム(GoldsteinおよびBelsky)(ATCC 28209)、シゾキトリウム・リマシナム(HondaおよびYokochi)(IFO 32693)、スラウストキトリウム・エスピー(23B)(ATCC 20891)、スラウストキトリウム・ストリアツム(Schneider)(ATCC 24473)、スラウストキトリウム・オーレウム(Goldstein)(ATCC 34304)、スラウストキトリウム・ローゼウム(Goldstein)(ATCC 28210)、ウルケニア・エスピー BP-5601、ジャポノチトリウム・エスピー(L1)(ATCC 28207) 、及びオーランチオキトリウム・エスピー（Aurantiochytrium sp.）OH4（FERM BP-11524）を挙げることができる。
　特に真菌としては、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)を含む酵母、もしくはカンジダ(Candida)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)のような他の酵母、または他の真菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)、ノイロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)のような繊維状真菌などを挙げることができる。
　特に細菌としては、好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属、及びオーレオスピラ属からなる群より選ばれる属に属する微生物を、最も好ましくは、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21 codon plus（ストラタジーン社製）、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110、及びAureispira marina JCM23201からなる群より選ばれる微生物を挙げることができる。
　宿主生物として用いる植物としては、限定されるものではないが、いずれの高等植物も、そして特に、作物植物およびとりわけそれらの油を使用される植物を含む消費可能な植物を含む。そのような植物は、例えば、キャノーラ、大豆、菜種、亜麻仁、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリ、およびタバコを含みうる。他の有用な植物は、薬学的薬品、調味料、栄養剤、機能性食品成分もしくは美容的活性剤として使用される化合物を産生することが知られているそれらの植物、またはこれらの化合物/薬剤を産生するように遺伝的に操作されている植物を含む。
　宿主生物が、上記1の本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡを元来有している場合は、本発明の、上記1の本発明の蛋白質の複合体の活性が宿主生物より増強された生物は、(a)宿主生物の染色体ＤＮＡ上に存在する、上記1の本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)宿主生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した生物、及びii)宿主生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の複合体の生産量が増大した生物、並びに(b)上記2.2の組換え体ＤＮＡで宿主生物を形質転換することにより、該宿主生物よりも該遺伝子のコピー数が増大した生物を挙げることができる。
　上記(a)i)の生物が、該蛋白質の複合体の比活性が増強した生物であることは、下記６の方法で該生物を培養又は栽培し、その培養物又は栽培物に蓄積されたＡＲＡを、宿主生物のそれと比較することにより確認することができる。
　上記(a)ii)の生物が、宿主生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の複合体の生産量が増大した生物であること、及び上記(b)の生物が、該宿主生物よりも該遺伝子のコピー数が増大した生物であることは、例えば、本発明のＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は本発明の蛋白質の複合体の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、宿主生物のそれと比較することにより確認することができる。
　宿主生物が、上記1の本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡを有していない場合は、本発明の生物は、(c)上記2.2の組換え体ＤＮＡで宿主生物を形質転換して得られる、細胞中のアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産することができる生物である。
　該組換え体ＤＮＡは、親株において自立複製可能なプラスミドとして導入されるか、又は親株の染色体ＤＮＡに組み込まれる。
　当該生物には、宿主細胞が既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳをコードする遺伝子を有する場合には、当該既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳにおいて、当該既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳの炭素鎖長を決定する蛋白質又はドメイン、シス二重結合の数及び配置を決定する蛋白質又はドメイン、並びにトランス二重結合を還元する蛋白質又はドメイン、からなる群より選ばれる蛋白質又はドメインをコードするＤＮＡを、上記の表１に記載の対応するドメイン又は該ドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡに置換することにより、当該既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳの活性が、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性に変換された生物を含む。
　上記の蛋白質又はドメインをコードするＤＮＡの置換は、宿主細胞中の置換対象のＤＮＡが、対応する本発明のＤＮＡの一部に置換されるほか、対応する本発明のＤＮＡの一部を有する組換え体ＤＮＡが、当該宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳをコードする遺伝子とは別の領域に組み込まれる場合や、自立複製可能なプラスミドとして当該宿主細胞中に存在する場合を含む。
　上記(c)の生物が、宿主生物の細胞中のアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する能力を獲得したことを確認する方法としては、例えば、下記5の方法で該生物を培養又は栽培し、その培養物又は栽培物に蓄積されたＡＲＡをガスクロマトグラフィーで検出することにより、確認することができる。
　組換え体ＤＮＡで宿主生物を形質転換する方法については、下記5に後述する。
4 本発明のＤＮＡの取得方法
　本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号３１、３３、３５、３７及び２１からなる群より選ばれる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、オーレオスピラ（Aureispira）属に属する微生物、より好ましくは、オーレオスピラ・マリーナ（Aureispira marina）JCM23201株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ [PCR Protocols, Academic Press (1990)] により取得することができる。
　オーレオスピラ・マリーナ JCM23201株は、理研バイオリソースセンター（RIKEN BioResource Center, Japan）から入手することができる。
　本発明のＤＮＡのうち、上記1に記載の相同蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号３１、３３、３５、３７及び２１からなる群より選ばれる配列番号で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号３２、３４、３６、３８及び２２からなる群より選ばれる配列番号で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
　本発明のＤＮＡのうち、上記1に記載の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号３１、３３、３５、３７及び２１からなる群より選ばれる配列番号で表される塩基配列で表されるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの5'端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Gene, 77, 51 (1989)］によっても、上記の［２］のＤＮＡを取得することができる。すなわち、まず該ＤＮＡの5'端に対応するセンスプライマーと、5'端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（5'側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの5'端から変異導入部位までの断片Ａ（3'端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、5'端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（3'側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの3'端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、5'端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から3'端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。
　取得した上記のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。上記の宿主細胞としては、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522等を挙げることができる。
　上記のベクターとしては、pBluescriptII KS (+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT　[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　また、本発明のＤＮＡのうち、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳをコードするＤＮＡにおいて、当該ＰＵＦＡ－ＰＫＳの炭素鎖長を決定する蛋白質又はドメイン、シス二重結合の数及び配置を決定する蛋白質又はドメイン、並びにトランス二重結合を還元する蛋白質又はドメイン、からなる群より選ばれる蛋白質又はドメインをコードするＤＮＡを、上記の表１に記載の対応するドメイン又は該ドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡに置換することにより、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を獲得した蛋白質をコードするＤＮＡは、以下のオーバーラップエクステンションPCR法(Gene 77: 61-68, 1989)を用いて取得することができる。
　既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳとしては、例えば、Shewanella oneidensis MR-1が有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを挙げることができる。Shewanella oneidensis MR-1はアメリカン・ティシュー・カルチャー・コレクション（ATCC）からATCC BAA1096株として入手することができる。当該ＰＵＦＡ－ＰＫＳをコードするＤＮＡは、上記の本発明のＤＮＡを取得する方法と同様の方法により取得することができる。
　既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳをコードするＤＮＡのうち、置換対象のＤＮＡの両末端に位置する２つのＤＮＡ断片をＰＣＲでそれぞれ増幅する。次に、上記の表１に記載の対応するドメイン又は該ドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅する。なお、各断片の連結部分の塩基配列が相補的となるよう、各断片を増幅するプライマーを設計する。さらに、これら３断片を等モル比で混合してＰＣＲの鋳型として、当該３断片が連結されたときにその全体を増幅することができるプライマーを用いてＰＣＲで増幅することにより、当該３断片が結合した目的のＤＮＡを取得することができる。
　また、上記の工程を繰り返すことにより、複数のＤＮＡ断片が置換したＤＮＡを取得することもできる。
　さらに、配列番号２３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、その相同蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、その変異蛋白質をコードするＤＮＡは、Bacillus subtilis168のゲノムＤＮＡを用いて、上記と同様の方法により取得することができる。
　配列番号２５で表される塩基配列を有するＤＮＡ、その相同蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、その変異蛋白質をコードするＤＮＡは、Shewanella oneidensis MR-1のゲノムＤＮＡを用いて、上記と同様の方法により取得することができる。
　配列番号２７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、その相同蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、その変異蛋白質をコードするＤＮＡは、Escherichia coliW3110のゲノムＤＮＡを用いて、上記と同様の方法により取得することができる。
　また、配列番号２９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、その相同蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、その変異蛋白質をコードするＤＮＡは、Corynebacterium glutamicumATCC13032のゲノムＤＮＡを用いて、上記と同様の方法により取得することができる。
　上記で取得した本発明のＤＮＡを、例えば、上記2.2に記載の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製することができる。
　このような組換え体ＤＮＡの例としては、後述するpSTV29-OrfA-OrfB 、pMW219-OrfD-OrfC、pUC19-OrfE、pUC19-sfp、pUC19-SO1604、pUC19-entD、pUC19-cgl1980等を挙げることができる。
5 本発明の生物の造成方法
　本発明の生物のうち、上記3の(a)i)の生物は、例えば、本発明の蛋白質の複合体の比活性を、通常の突然変異処理法、又は組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより造成することができる。
　突然変異処理法としては、例えば、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、上記4の方法で取得することができる本発明の変異蛋白質をコードするＤＮＡを、宿主生物の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子と、相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。
　宿主生物としては、例えば、上記3のオーレオスピラ属に属する微生物を、好ましくは、Aureispira marina JCM23201を挙げることができる。
　相同組換え法は、例えば、導入したい宿主生物内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができ、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
　本発明の生物のうち、上記3の(a)ii)の生物は、例えば、本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、又は組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより造成することができる。
　突然変異処理法は、上記の方法をあげることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、宿主生物の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子と、上記の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。
　また、該蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増強した生物を取得することができる。
　宿主生物としては、例えば、上記3のオーレオスピラ属に属する微生物を、好ましくは、Aureispira marina JCM23201を挙げることができる。
　上記3の(b)及び(c)の生物は、以下の方法によって造成することができる。
　上記4の方法で取得することができる組換え体ＤＮＡで宿主生物を形質転換する。
　宿主生物としては、上記3の(b)の生物を造成する場合は、上記3のオーレオスピラ属に属する微生物を、好ましくは、Aureispira marina JCM23201を挙げることができる。上記3の(c)の生物を造成する場合は、例えば、上記3のオーレオスピラ属に属する微生物以外の宿主生物を挙げることができる。
　宿主生物が微生物の場合は、該組換え体ＤＮＡを親株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等の方法を挙げることができる。
　宿主生物が微生物の場合は、該組換え体ＤＮＡを親株の染色体ＤＮＡに組み込む方法としては、上記の相同組換え法を用いることができる。
　宿主生物が植物の場合は、該組換え体ＤＮＡを親株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、パーティクルガン法やエレクトロポーレーション法を挙げることができる。
　宿主生物が微生物の場合は、該組換え体ＤＮＡを親株の染色体ＤＮＡに組み込む方法としては、アグロバクテリウムを用いた方法を挙げることができる。
　上記方法により取得した生物が目的の微生物であることは、上記3の方法を用いて確認することができる。
6 本発明のＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物の製造法
　本発明のＡＲＡ含有組成物の製造法は、上記5の方法で造成された微生物を用いる場合は、該微生物を培地に培養し、培養物中にＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物の製造法を挙げることができる。
　ＡＲＡ含有組成物は、例えば、ＡＲＡ含有油脂又はＡＲＡ含有リン脂質を、好ましくはＡＲＡ含有油脂を挙げることができる。
　該微生物の培養物は、該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより得ることができる。
　培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む公知のものをいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトースなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０～３００ｇの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、初発の炭素源を消費しつくしたのちに、炭素源をフィードすることにより引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、消費させる炭素源の量を増大させることが可能になり、ＡＲＡ含有組成物の生産量を増大させることができる。
　また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素を使用することができる。
　無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
　上記した各成分を含有する培地は、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０～９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
　培養温度は、一般的には１０～４５℃であり、好ましくは２０～３７℃である。培養温度は、ＡＲＡ含有組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のｐＨは、一般的には３．５～９．５であり、好ましくはｐＨ４．５～９．５である。特に好ましいｐＨは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには５．０～８．０である。
　培養期間は、例えば２～７日間とすることができ、通気攪拌培養などで培養を行なうことができる。
　培養物から培養液と微生物とを分離する方法は、当業者に公知の常法により行なうことができ、例えば、遠心分離法や濾過などにより行なうことができる。
　上記の培養物から分離した微生物を、例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、ＡＲＡ含有組成物を得ることができる。
　上記の製造法で製造されるＡＲＡ含有組成物は、例えば、低温溶媒分別法〔高橋是太郎，油化学，40：931-941(1991)〕又はリパーゼ等の加水分解酵素で短鎖の脂肪酸を遊離除去する方法〔高橋是太郎，油化学，40：931-941(1991)〕等の方法により、ＡＲＡ含有組成物を濃縮して、ＡＲＡ含量が高いＡＲＡ含有組成物を得ることができる。
　ＡＲＡ含有組成物からＡＲＡを分離して採取することにより、ＡＲＡを製造することができる。例えば、加水分解法によりＡＲＡ含有組成物からＡＲＡを含有する混合脂肪酸を調製した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、ＡＲＡを分離して採取することにより、ＡＲＡを製造することができる。
　また、ＡＲＡ含有組成物からＡＲＡアルキルエステルを分離して採取することにより、ＡＲＡアルキルエステルを製造することができる。
　ＡＲＡアルキルエステルは、ＡＲＡアルキルエステルであれば特に限定されないが、好ましくは、ＡＲＡメチルエステル又はＡＲＡエチルエステルを、より好ましくは、ＡＲＡエチルエステルを挙げることができる。
　ＡＲＡ含有組成物からＡＲＡアルキルエステルを分離して採取するには、例えばアルコーリシス法によりＡＲＡ含有組成物からＡＲＡアルキルエステルを含有する混合脂肪酸アルキルエステルを調製した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、ＡＲＡアルキルエステルを分離して採取することにより行うことができる。
　また、本発明のＡＲＡ含有組成物の製造法は、上記5の方法で造成された植物を用いる場合は、該植物を培地に栽培し、栽培物中にＡＲＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該栽培物中からＡＲＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＡＲＡ含有組成物の製造法を挙げることができる。
　該植物は、該植物の生長に適した培地において栽培される。該培地としては、例えば、土壌、砂、他のいずれもの根の成長を支える粒状培地(例えば、バーミキュライト、パーライトなど)、または水耕栽培、ならびに、適する光、水および高等植物の生長を最適化する栄養補給剤を含む植物のためのいずれの生長培地も含む。
　該植物を栽培する期間は、例えば、１週間～１２月、好ましくは、２週間から６月を挙げることができる。該植物の生長に応じて、通常の植物の生長に用いられる光、水、栄養補給剤等が与えられる。
　生長した栽培物を収穫し、該栽培物を圧搾した後、水などで抽出して粗油を得る。上記と同様の方法により、該粗油から、ＡＲＡ含有組成物、ＡＲＡ、又はＡＲＡアルキルエステルを製造することができる。
　以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。　
本発明のＤＮＡの取得
　オーレオスピラ・マリーナ（Aureispira marina）JCM23201株の染色体ＤＮＡを定法により調製し、Genome Sequencer FLXシステム（GS FLX+）（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてゲノム塩基配列を決定した。
　その結果、本発明の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡを含む、配列番号４４で表される塩基配列を含むＤＮＡを得た。
　図１に示すように、当該ＤＮＡの塩基配列中に6個のOrfを特定することができ、OrfA, OrfB, OrfC, OrfD, OrfE, OrfRと命名した。各Orfにおける塩基配列番号、当該塩基配列長（終止コドンを含む）、アミノ酸配列番号、アミノ酸配列長、及び配列番号４４における位置を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記のOrfのうち、OrfRは転写因子をコードすると考えられ、ＡＲＡ－ＰＫＳ系には属さないと考えられた。
本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡの作製
　実施例１で同定された本発明の蛋白質の複合体を大腸菌で発現させるために、３つのプラスミド上に、OrfA, OrfB, OrfC, OrfD及びOrfEをそれぞれクローニングした。　まず、実施例１で得られたオーレオスピラ・マリーナ(JCM23201)のゲノムDNAを鋳型として、表３に記載の「Orf増幅プライマー」を用いて、各OrfをPCRで増幅した。増幅酵素としてはタカラバイオ社製のDNAポリメラーゼ、Primestar GXLを用いた。OrfB及びOrfEの開始コドンはそれぞれTTG及びGTGであったが、発現量を向上させるために、それぞれATGに置き換えた。
　なお、各Orfの5’側のプライマー (配列番号４７、４９、５１、５３及び５５)には、後の工程でオーバーラップエクステンションPCR (Gene 77: 61-68, 1989)を用いてlacプロモーターを連結するため、lacプロモーターの3’部分を増幅するプライマーと相補的な配列が付加されている。
　また、各Orfの3’側のプライマー(配列番号４８、５０、５２、５４及び５６)には、ベクターにクローニングするため、GGATCCで表されるBamHI認識サイトが付加されている。
　さらに、OrfA及びOrfDの3’側のプライマー(配列番号４８及び５４)には、BamHIサイトに加えてCCTGCAGGで表されるSse8387Iサイトが付加されている。
　次に、各Orfに連結するためのlacプロモーターを、大腸菌W3110株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３に記載の「Lacプロモーター増幅プライマー」を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。
　なお、これらの3’側のプライマー (配列番号５９、６０、６１、６２及び６３)には、後の工程でオーバーラップエクステンションPCR を用いて各Orfを連結するため、各Orfの5’部分を増幅するプライマーと相補的な配列が付加されている。
　また、これらの5’側のプライマーには、ベクターにクローニングするため、配列番号５７にはATGCATで表されるEcoT22I認識サイトが、配列番号５８にはCCTGCAGGで表されるSse8387I認識サイトが付加されている。
　次に、上記で得られたlacプロモーターを含むDNA断片と、OrfA～OrfEを含むDNA断片をそれぞれ連結させるため、オーバーラップエクステンションPCRを実施した。
　得られた各Orfにlacプロモーターが連結された配列を３つのベクターに分けてクローニングした。すなわち、OrfEは多コピーベクターpUC19(Gene, 33, 103 (1985), Genbank accession number: L09137)に、OrfAとOrfBは中コピーベクターpSTV29(タカラバイオ社製、http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info. asp?unitid=U100003450)に、OrfCとOrfDは低コピーベクターpMW219(ニッポンジーン社製、http://nippongene.com/pages/products/clomod/dna_vec/)にクローニングした。その詳細を以下に示す。
　OrfEとlacプロモーターが連結したＤＮＡをBamHIとEcoT22Iで制限酵素処理し、BamHIとSse8387Iで処理したpUC19とを混合してライゲーションし、OrfE発現ベクターpUC19-OrfEを得た（表３）。
　OrfAとlacプロモーターが連結したＤＮＡをBamHIとEcoT22Iで制限酵素処理し、BamHIとSse8387Iで処理したpSTV29と混合してライゲーションし、OrfA発現ベクターpSTV29-OrfAを得た。
　OrfBとlacプロモーターが連結したＤＮＡをBamHIとEcoT22Iで制限酵素処理し、BamHIとSse8387Iで処理したpSTV29-OrfAと混合してライゲーションし、OrfA、OrfB共発現ベクターpSTV29-OrfA-OrfBを得た（表３）。
　OrfDとlacプロモーターが連結したＤＮＡをBamHIとEcoT22Iで制限酵素処理し、BamHIとSse8387Iで処理したpMW219と混合してライゲーションし、OrfD共発現ベクターpMW219-OrfDを得た。
　OrfCとlacプロモーターが連結したＤＮＡをBamHIとSse8387Iで制限酵素処理し、BamHIとSse8387Iで処理したpMW219-OrfDと混合してライゲーションし、OrfC、OrfD共発現ベクターpMW219-OrfD-OrfCを得た（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
本発明のＤＮＡを発現する大腸菌株の造成
　実施例２で取得したpUC19-OrfE、pST29-OrfA-OrfB、pMW219-OrfD-OrfCを用いて、大腸菌でのＡＲＡ生産を確認するにあたり、宿主である大腸菌によるＡＲＡの分解を抑えるために、宿主の脂肪酸分解経路が遮断された大腸菌を用いた。アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするfadEを破壊した大腸菌は脂肪酸を資化できない表現型を示すことが知られている（J BactEriol. 2002 184(13):3759-64.）。
　そこで、fadEを破壊した大腸菌を大腸菌の１遺伝子破壊ライブラリー(Mol. Syst. Biol.,2: article number: 2006.0008)より入手した(BW25113ΔfadE::FRT)。
　定法に従い、pUC19-OrfE、pST29-OrfA-OrfB及びpMW219-OrfD-OrfCで、該大腸菌を形質転換し、LB寒天培地 (Bactotrypton (べクトンディッキンソン社製) 10 g/L、Yeast extract (べクトンディッキンソン社製) 5 g/L、塩化ナトリウム 5 g/L(和光純薬製)、微生物培養用アガロース (ナカライテスク社製)に抗生物質としてアンピシリンナトリウム 50 mg/L、カナマイシン硫酸塩 10 mg/L、クロラムフェニコール 20 mg/L (いずれも和光純薬製)を添加した培地(LB寒天培地+Amp, Km, Cm)で選抜した。なお、コントロールとして各Orfがクローニングされていない空ベクター、pUC19、pSTV29及びpMW219を形質転換した株も同様の方法でコントロールとして造成した。
　こうして得られた株をΔfadE-EABDC株と命名した。また、同時に造成したコントロール株をΔfadE-NNNNN株と命名した。
本発明のＡＲＡ含有組成物の製造法
　ΔfadE-EABDC株とΔfadE-NNNNN株をLB寒天培地（Amp,Km,及びCmを添加した。）に塗布し、３０℃で２４時間前培養した。その後に、5mlのLB液体培地（Amp,Km,及びCmを添加した。）が入った大型試験管に植菌し、25℃で24時間培養した。培養した培養液をさらに、5mlのLB液体培地（Amp,Km,及びCmを添加した。）が入った大型試験管に500ul植菌し、100mMのIPTG (和光純薬社製)を加えて20℃で40時間培養した。
　培養終了後、4mlの培養液を9000rpmで15分間遠心し、菌体を回収した。菌体からBligh-Dyer法に従って脂質を抽出し、減圧乾燥にて乾燥した後、脂肪酸メチル化キット(ナカライテスク社製)を用いて脂肪酸のメチル化を行った。メチル化した脂肪酸は最終的に500ulのヘキサンに溶解させた。　得られたメチル化脂肪酸はガスクロマトグラフィー(GC)及びガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー (GCMS)を用いて解析を行った。解析の条件は以下のとおりである。
ＧＣ分析：
使用機器:島津製作所社製GC2010、カラム：信和化工社製 HR-SS-10　(0.25mm×25m)、キャリアガス：ヘリウム(39.9 cm/sec)、カラム温度：190℃、気化室温度 250℃、スプリット注入 (スプリット比 60)
GCMS分析：
使用機器:島津製作所社製GCMS-QP2010、カラム：信和化工社製 HR-SS-10　(0.25mm×25m)、キャリアガス：ヘリウム(39.9 cm/sec)、カラム温度：190℃、気化室温度 250℃、スプリット注入 (スプリット比 60)。
　分析に当たっては、得られた脂肪酸メチルエステルを2ulGC及びGCMSに注入した。スタンダードとしてはGLサイエンス社製の脂肪酸メチルエステル定性用混合試料 (カタログコード1021-58209)を用いた。この混合試料にはアラキジン酸、エイコセン酸、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡが含まれている。
　得られたガスクロマトグラムを図２に示す。ＡＲＡ－ＰＫＳ系を導入した時にのみ、混合試料のＡＲＡに相当するピークが検出された。
　次に、GCMSを用いてこのピークを解析した結果、得られたピークが実際にＡＲＡと同じフラグメントパターンを示すことが確認された。以上の結果から、本発明で見出されたＡＲＡ－ＰＫＳ系を導入することで、元来ＡＲＡの生産能をもたない大腸菌でＡＲＡを生産できることが確認された。
他種のPPTの利用
　本発明で得られたＡＲＡ－ＰＫＳ系の各Orfのうち、ＡＲＡに必須なものを同定するため、他のPUFA-ＰＫＳの相同Orfとの入れ替え実験を行った。
　まず初めに、OrfEに対する相同遺伝子を導入する実験を行った。OrfEは既に詳細に記したように、PPTをコードする遺伝子である。PUFA ＰＫＳ系におけるPPTの機能としては、ACPドメインへのホスホパンテテイン補因子の付着を触媒することがあげられる。アポ-ＡＣＰにホスホパンテテイン補因子が付着することでホロ-ＡＣＰとなり、活性化されることが知られている(Lambalot R.H.ら、Chemistry and Biology, 3, 923(1996))。
　表４に記載の各遺伝子を増幅するため、表４の「遺伝子の由来」に記載された微生物のゲノムＤＮＡを鋳型として、「遺伝子増幅プライマー」をプライマーとして、ＰＣＲを行った。
　表４に記載の各プラスミドは、以下の方法にて作成した。
　pUC19-sfpについては、(a)上記で増幅したsfp遺伝子を含むＤＮＡと、(b)配列番号72及び73の塩基配列で表されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅したlacプロモーターを、オーバーラップエクステンションＰＣＲで連結し、連結したＤＮＡ断片を制限酵素SpeIとKpnIで処理し、XbaIとKpnIで処理したpUC19にライゲーションすることで、pUC19-sfpを得た。
　pUC19-SO1604については、(a)上記で増幅したSO1604遺伝子を含むＤＮＡと、(b)配列番号72及び74の塩基配列で表されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅したlacプロモーターを、オーバーラップエクステンションＰＣＲで連結し、連結したＤＮＡ断片を制限酵素SpeIとKpnIで処理し、XbaIとKpnIで処理したpUC19にライゲーションすることで、pUC19-SO1604を得た。
　pUC19-entDについては、(a)上記で増幅したentD遺伝子を含むＤＮＡと、(b)配列番号72及び75の塩基配列で表されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅したlacプロモーターを、オーバーラップエクステンションＰＣＲで連結し、連結したＤＮＡ断片を制限酵素SpeIとKpnIで処理し、XbaIとKpnIで処理したpUC19にライゲーションすることで、pUC19-entDを得た。
　pUC19-cgl1980については、(a)上記で増幅したcgl1980遺伝子を含むＤＮＡと、(b)配列番号72及び76の塩基配列で表されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅したlacプロモーターを、オーバーラップエクステンションＰＣＲで連結し、連結したＤＮＡ断片を制限酵素SpeIとKpnIで処理し、XbaIとKpnIで処理したpUC19にライゲーションすることで、pUC19-cgl1980を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上のようにして得られた、pUC19-sfp、pUC19-SO1604、pUC19-entD、又はpUC19-cgl1980で、ΔfadE-EABDCからpUC19-OrfEのみを除去した株（BW25113ΔfadE::FRT/ pSTV29-OrfA-OrfB, pMW219-OrfD-OrfC株）を形質転換した。
　得られた株を実施例４と同様に培養、分析し、ＡＲＡの生成の有無を調べた。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の結果に示すように、多様なホスホパンテテイニルトランスフェラーゼがＡＲＡ－ＰＫＳ系を活性化できることが明らかとなった。
　他種のエノイルレダクターゼの利用　OrfEに引き続き、OrfDに対する相同遺伝子を導入する実験を行った。OrfDはERドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子である。このOrfDに相同性を有する遺伝子として、シーワネラ・オネイデンシス MR-1由来のSO1597遺伝子が挙げられる。このSO1597遺伝子と本発明のアラキドン酸ＰＫＳのOrfDの入れ替え実験を行った。
　まず、シーワネラ・オネイデンシス MR-1株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号７７及び７８の塩基配列で表される合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、SO1597遺伝子を含むＤＮＡ断片を調整した。同時に大腸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートに、配列番号７２及び７９で表された合成ＤＮＡをプライマーにＰＣＲを行い、lacプロモーターを含むＤＮＡ断片を調整した。この２断片のＤＮＡを混合してオーバーラップエクステンションＰＣＲを行うことにより、lacプロモーターにシーワネラ・オネイデンシス MR-1株由来のSO1597遺伝子が連結されたＤＮＡ断片を調整した。このＤＮＡ断片を制限酵素SpeIとKpnIで処理し、XbaIとKpnIで処理したpUC19-SO1604にライゲーションすることで、pUC19-SO1604-SO1597を得た。
　次に、ＡＲＡ－ＰＫＳ系からOrfDのみを除くために、実施例２で造成したOrfCとlacプロモーターが連結したＤＮＡをBamHIとSse8387Iで制限酵素処理し、BamHIとSse8387Iで処理したpMW219とをタカラバイオ社製ライゲーションキットLONGを用いてライゲーションし、OrfCのみの発現ベクターpMW219-OrfCを得た。
　上記の２種類の発現ベクターで、ΔfadE-EABDCからpUC19-OrfEとpMW-OrfD-OrfCとを除去した株（BW25113ΔfadE::FRT/ pSTV29-OrfA-OrfB株）を同時に形質転換した。
　得られた株BW25113ΔfadE::FRT/pUC19-SO1604-SO1597, pSTV29-OrfA-OrfB, pMW219-OrfCを実施例４と同様に培養し、脂肪酸を分析した。
　その結果、ＡＲＡの生産を確認した。したがって、OrfDは、シーワネラ・オネイデンシス MR-1株のSO1597と置き換えが可能であることが示された。
　各Orf及びドメインの入れ替え実験については一例を示したが、同様の手法を用いることにより、ＡＲＡが生産できるOrf、ドメインの組み合わせは無数に想定でき、本発明によるＡＲＡ－ＰＫＳはそれらの利用に供することが出来る。
　本発明により、ＡＲＡ－ＰＫＳ、ＡＲＡ－ＰＫＳの構成蛋白質をコードするＤＮＡ、ＡＲＡ－ＰＫＳの活性が宿主生物より増強された生物、及び該生物を用いたＥＰＡ又はＥＰＡを初めとする他のＰＵＦＡを含まないＡＲＡ含有組成物を効率よく製造する方法を提供することができる。
配列番号４７－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５５－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５６－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５７－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６１－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６２－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６３－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６４－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６５－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６６－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６７－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６９－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７０－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７１－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７２－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７３－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７４－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７５－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７６－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７７－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７９－人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (17)

  1. 以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる、蛋白質の複合体。
    ［１］β-ケトアシル-アシルキャリヤー蛋白質シンターゼ（以下、KSという。）ドメイン、マロニル-CoA: アシルキャリヤー蛋白質アシルトランスフェラーゼ（以下、MATという。）ドメイン及びアシルキャリヤー蛋白質（以下、ACPという。）ドメインを有する蛋白質、ケトレダクターゼ(以下、KRという。)ドメインを有する蛋白質、KSドメイン、鎖伸長因子（以下、CLFという。）ドメイン、アシルトランスフェラーゼ（以下、ATという。）ドメイン及びFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ（以下、DHという。）ドメインを有する蛋白質、エノイルACP-レダクターゼ（以下、ERという。）ドメインを有する蛋白質、並びにホスホパンテテイントランスフェラーゼ（以下、PPTという。）ドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてアラキドン酸（以下、ＡＲＡという。）を生産する活性を有する蛋白質の複合体
    ［２］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、ATドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、及びDHドメインを有する蛋白質、ERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体
    ［３］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、KSドメイン及びATドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、及びDHドメインを有する蛋白質、ERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体
    ［４］KSドメイン、MATドメイン、ACPドメイン及びKRドメインを有する蛋白質、KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びERドメインを有する蛋白質、DHドメイン及びERドメインを有する蛋白質、並びにPPTドメインを有する蛋白質からなり、かつ、アセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する蛋白質の複合体
  2. 請求項１に記載のドメインの１つ以上が、以下の［１］～［９］からなる群より選ばれるドメインである、請求項１に記載の蛋白質の複合体。
    ［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するKSドメイン、又は配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、KS活性を有する相同ドメイン
    ［２］配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するMATドメイン、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、MAT活性を有する相同ドメイン
    ［３］配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するACPドメイン、又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ACPとしての機能を有する相同ドメイン
    ［４］配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するKRドメイン、又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、KR活性を有する相同ドメイン
    ［５］配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するCLFドメイン、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、CLFとしての機能を有する相同ドメイン
    ［６］配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するATドメイン、又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、AT活性を有する相同ドメイン
    ［７］配列番号１６又は１８で表されるアミノ酸配列を有するDHドメイン、又は配列番号１６又は１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、DH活性を有する相同ドメイン
    ［８］配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するERドメイン、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ER活性を有する相同ドメイン
    ［９］配列番号２２、２４、２６、２８又は３０で表されるアミノ酸配列を有するPPTドメイン、又は配列番号２２、２４、２６、２８又は３０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、PPT活性を有する相同ドメイン
  3. KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質が、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、請求項１の［１］に記載の蛋白質の複合体。
  4. KRドメインを有する蛋白質が、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、請求項１の［１］に記載の蛋白質の複合体。
  5. KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質が、配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、請求項１の［１］に記載の蛋白質の複合体。
  6. ERドメインを有する蛋白質が、配列番号３８又は４０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号３８又は４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、請求項１の［１］に記載の蛋白質の複合体。
  7. PPTドメインを有する蛋白質が、配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号２２、２４、２６、２８若しくは３０で表されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質である、請求項１の［１］に記載の蛋白質の複合体。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の蛋白質の複合体を構成する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  9. KSドメイン、MATドメイン及びACPドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３４、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、請求項８に記載のＤＮＡ。
  10. KRドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３６、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、請求項８に記載のＤＮＡ。
  11. KSドメイン、CLFドメイン、ATドメイン及びDHドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３５で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３８及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、請求項８に記載のＤＮＡ。
  12. ERドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３７又は３９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３７又は３９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３６及び２２のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、請求項８に記載のＤＮＡ。
  13. PPTドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号２１、２３、２５、２７若しくは２９で表されるいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３２、３４、３６及び３８のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡである、請求項８に記載のＤＮＡ。
  14. 請求項１～７のいずれか１項に記載の蛋白質の複合体の活性が宿主生物より増強された生物。
  15. 生物が、請求項８～１３のいずれか１項に記載のＤＮＡで宿主生物を形質転換して得られる、細胞中のアセチルCoAを出発基質としてＡＲＡを生産することができる生物である、請求項１４に記載の生物。
  16. 宿主生物が、微生物又は植物である、請求項１４又は１５に記載の生物。
  17. 請求項１４～１６のいずれか１項に記載の生物を培地に培養又は栽培し、培養物又は栽培物中にＡＲＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物又は栽培物からＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＡＲＡ又はＡＲＡ含有組成物の製造法。
     
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