WO2005059130A1 - アラキドン酸を含有する植物体およびその利用 - Google Patents

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arachidonic acid
acid
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plant
desaturase
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Keisuke Matsui
Ren Chen
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Suntory Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a plant containing arachidonic acid (eg, soybean (soybean, Glycine max)) and its use, and particularly introduces a gene of an enzyme involved in the arachidonic acid synthesis system.
  • the present invention relates to a plant obtained by using a method for producing a plant containing arachidonic acid, and a use thereof.
  • Fatty acids are the main component of lipids, one of the three major nutrients for living organisms, and often refer to aliphatic monocarboxylic acids, which are usually hydrolysates of natural lipids. Generally, when the aliphatic chain is saturated, it is called a saturated fatty acid, and when it contains a double bond or triple bond, it is called an unsaturated fatty acid. The chain length is classified into short chain (2-4 carbon atoms), medium chain (5-14 carbon atoms), long chain (16-18 carbon atoms), and very long chain (20 or more carbon atoms). When the number of double bonds is m, it is often described as Cn: m.
  • Such fatty acids are the main components of cell membranes in plants, and are also important components that are accumulated in seeds and fruits mainly as triglycerides as an energy source.
  • the amount of lipids and fatty acid composition accumulated in plants differ depending on the type of plant.
  • Fatty acids accumulated in such plants include, for example, palmitic acid (C16: 0), a saturated fatty acid having 16 carbon atoms (C16), and stearic acid (C18: 0, a saturated fatty acid having 18 carbon atoms (C18)).
  • these unsaturated fatty acids are used as substrates, and further desaturation and carbon chain elongation are repeated, resulting in dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid (C20: 4n_6), eicosapentaentanoic acid ( EPA) (C20: 5n_3), docosahexaenoic acid (DHA) (C22: 6n_3), etc. are synthesized.
  • PUFAs are known to exhibit various functions in metabolism in the body of higher animals, and also play an important role as direct precursors of prostaglandins.
  • elderly people, infants, and the like need to ingest from food because of their reduced biosynthesis ability of dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, EPA, DHA, and the like.
  • arachidonic acid is known to also have an effect of ameliorating senile dementia. Healthy foods containing arachidonic acid as a main component are also commercially available, and demand for arachidonic acid is expanding.
  • This arachidonic acid is contained in fish oil in a relatively large amount, and a part thereof is still supplied by extraction from fish oil.
  • problems such as depletion of fish resources, fluctuations in supply, and contamination of oil and fat resources due to environmental pollution, in recent years, it is superior in terms of productivity control, long-term stable supply, cleanliness, etc.
  • the production of arachidonic acid is carried out by fermentation of microorganisms such as Mortierella, which is easy to achieve (for example, see Reference 1: Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, pll (1987)).
  • problems have been pointed out, such as high production costs, capital investment required for scale-up, and difficulty in scale-up.
  • Examples of actually modifying the composition of oils and fats contained in plants by genetic recombination include: (i) lauric acid-producing rape (from laurel containing a relatively large amount of lauric acid, C12: 0-ACP (acyl Medium-chain acyl-ACP, which acts specifically on carrier protein) and releases lauric acid O esterase gene what was introduced into ligated to promoter one coater napin gene is a seed storage protein of oilseed rape rapeseed: Document 2: Science, 257, P 72 (1992) refer), (ii) high stearic acid content rapeseeds ( C18: 0—Recombinant oilseed rape whose expression of ACP desaturase gene was suppressed by introducing an antisense gene and stearic acid content was increased to 40%: Reference 3: Pro Natl.
  • the transcript when a heterologous organism, particularly a non-plant gene, is expressed in a plant, the transcript may be processed. In such a case, for example, a treatment such as codon modification is performed. (For example, see Reference 9: Bio / Technology 11 pl94, 1993).
  • the above document 6 does not describe these problems at all, and it cannot be said that the disclosure thereof is insufficient.
  • the fatty acid biosynthesis is unknown in many other organisms.For example, whether the transcription and translation of the fatty acid biosynthesis gene of Mortierella occurs efficiently in plants or not is determined by the enzymes encoded by these genes. Whether they function well in plants, whether these enzymes can work in tandem with plant lipogenic enzymes in cells, and the accumulation of fatty acids must form an oil body in the form of triglycerides
  • arachidonic acid is accumulated even if it is synthesized. In other words, it requires considerable trial and error to introduce alien genes into plants and produce arachidonic acid.
  • soybeans have been pointed out to have difficulty in transformation by gene transfer, and the amount of information on soybean transformation is small. According to several reports, the transformation efficiency and regeneration efficiency in soybean are extremely low, and the number of transformable varieties is limited. (Eg, Reference 13: Santarem ER and Finer JJ (1999), In Vitro Cell. Dev.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a plant containing arachidonic acid and a method for using the same.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and as a result, found that three genes of Mortierella-derived ⁇ 6 desaturase, fatty acid chain elongase, and ⁇ 5 desaturase were soybean seed-specific.
  • a transgenic soybean was prepared by preparing a recombinant expression vector placed on a soybean embryo and introducing it into a soybean embryo.For the first time, a gene product derived from a heterologous organism was expressed at the protein level in soybean.
  • arachidonic acid is produced by also exerting the function of an enzyme, and independently found that the transformed soybean contains arachidonic acid, thereby completing the present invention.
  • the arachidonic acid-containing plant according to the present invention is characterized in that arachidonic acid is produced by introducing a fatty acid synthase gene involved in arachidonic acid biosynthesis into a plant to produce arachidonic acid in order to solve the above problems. It is characterized by being obtained by a plant production method including a production process.
  • the arachidonic acid production step preferably includes a transformation step of introducing a recombinant expression vector containing a gene encoding a fatty acid synthase involved in arachidonic acid biosynthesis into a plant cell. Les ,.
  • the arachidonic acid production step preferably includes a recombinant expression vector construction step of constructing the recombinant expression vector.
  • the step of constructing the recombinant expression vector preferably includes a step of linking a gene encoding a fatty acid synthase involved in arachidonic acid biosynthesis to a downstream region of the soybean seed-specific promoter.
  • the fatty acid synthase involved in arachidonic acid biosynthesis is preferably a ⁇ 6 desaturase, a fatty acid chain elongase, or a ⁇ 5 desaturase.
  • the ⁇ 6 desaturase is preferably a protein described in the following (a) or (b).
  • (d) hybridizes with a gene consisting of a nucleotide sequence complementary to the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions, and introduces an unsaturated bond at the ⁇ 6 position of the aliphatic monocarboxylic acid.
  • the fatty acid chain elongation enzyme is a protein described in the following (e) or (f).
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 one or several amino acids consist of an amino acid sequence in which substitution, deletion, insertion, and Z or addition are performed, and the amino acid sequence of the carbon chain of the aliphatic monocarboxylic acid is A protein having a function of catalyzing an elongation reaction.
  • a gene described in the following (g) or (h) is preferably used.
  • the ⁇ 5 desaturase is preferably a protein described in the following (i) or (j).
  • one or several amino acids consist of an amino acid sequence in which substitution, deletion, insertion, and Z or addition are performed, and are located at the ⁇ 5 position of the aliphatic monocarboxylic acid.
  • the gene described in the following (k) or (1) be used as the gene encoding the ⁇ 5 desaturase.
  • (k) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 as an open reading frame region; (1) It hybridizes with a gene consisting of a nucleotide sequence complementary to the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 under stringent conditions, and introduces an unsaturated bond at the ⁇ 5 position of the aliphatic monocarboxylic acid.
  • the fatty acid synthase involved in arachidonic acid biosynthesis or the gene encoding the enzyme is preferably derived from the genus Mortierella.
  • the fatty acid synthase involved in arachidonic acid biosynthesis or the gene encoding the enzyme is preferably derived from Mortierella alpina.
  • the arachidonic acid production step preferably includes an expression suppression step of suppressing expression of the ⁇ 15 desaturase in the host.
  • the expression suppressing step is more preferably a step of suppressing the expression of ⁇ 15 desaturase by the RNAi method.
  • the present invention also includes plant matter containing arachidonic acid produced from any of the above-mentioned oil-and-fat raw material plants.
  • the plant preferably contains plant cells, plant tissues, calli, seeds, grown plant individuals, or progeny of plant individuals having the same properties as the plant individuals. It is particularly preferable that the plant is soybean.
  • arachidonic acid obtained from the above-mentioned arachidonic acid-containing plant is included in the present invention.
  • a composition containing the above arachidonic acid is also included in the present invention.
  • Foods containing the above composition are also included in the present invention.
  • a kit for producing any of the above-mentioned arachidonic acid-containing plants comprising at least a recombinant expression vector comprising a gene encoding a fatty acid synthase involved in arachidonic acid biosynthesis and a promoter. It is characterized by: Further, it preferably contains a group of reagents for introducing the above-mentioned recombinant expression vector into plant cells.
  • the present inventors repeated trial and error to actually introduce a gene derived from a heterologous organism into a plant, and obtained a arachidonic acid-containing oil / fat raw material plant, particularly Has been successfully produced. This is not something that can be easily achieved from conventional knowledge.
  • the arachidonic acid-containing plant of the present invention is involved in arachidonic acid biosynthesis. Since the plant is provided with a configuration for introducing the given fatty acid synthase gene into a plant, arachidonic acid can be produced in the plant. Therefore, there is an effect that a plant containing arachidonic acid can be easily obtained. That is, according to the present invention, arachidonic acid can be produced in a plant body, so that the efficiency of the production process can be greatly increased and the cost can be reduced as compared with the case where arachidonic acid is obtained from fish oil or microorganisms. This has the effect of enabling large-scale production and acquisition of renara arachidonic acid.
  • the arachidonic acid-containing plant according to the present invention has a very remarkable effect that the form for producing polyunsaturated fatty acids is passed on to the next generation. For this reason, the trait of the modified fatty acid is transmitted to the next-generation plant of the arachidonic acid-containing plant according to the present invention. Therefore, by cultivating the arachidonic acid-containing plant, a large amount of seeds of the arachidonic acid-containing plant having the modified fatty acid composition can be obtained, and a large amount of arachidonic acid can be continuously obtained. This has the effect.
  • the present invention includes soybeans containing arachidonic acid, and the above-described effects can be obtained even in soybeans containing arachidonic acid that are powerful.
  • Arachidonic acid is an essential fatty acid for higher animals, including humans, and its application to health foods and pharmaceuticals has been promoted, and its demand has been increasing. It is possible to meet such a demand for increasing the demand of arachidonic acid.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a biosynthetic pathway of a polyunsaturated fatty acid.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a step of preparing a plasmid vector pSPB1877 according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing the entire plasmid vector P SPB1877 according to the present embodiment.
  • the present invention relates to a arachidonic acid plant containing arachidonic acid, which is one of PUFAs of essential fatty acids for higher animals, and a plant obtained by a production method for producing soybean. It is about the body and soybeans and their use. For this reason, before going into a detailed description of the present invention, a brief description of basic findings on lipid biosynthesis in higher plants will be given.
  • the major lipids of higher plants are mainly C16 or C18 and have a structure having an unsaturated bond at 13 positions.
  • Most of these fatty acids are synthesized in plastids such as chloroplasts using acetyl-CoA as the first substrate.
  • the first reaction is to synthesize malonyl-CoA from acetyl-CoA and carbon dioxide, and is performed by acetyl-CoA carboxylase (ACCase).
  • ACCase acetyl-CoA carboxylase
  • This reaction is one of the rate-limiting reactions of oil biosynthesis in higher plants, and is thought to have an effect on oil production.Overexpression of the ACCase gene increased the total oil content of rapeseed by 5%. (Plant Physiol, 113, P75-81 (1997))
  • the malonyl group of malonyl-CoA is subsequently transferred to ACP, and after being converted to malonyl-ACP, a series of reactions of condensation, reduction, dehydration, and reduction are repeated by the enzyme of the fatty acid synthase complex.
  • the carbon chains extend two by two, and eventually C16: 0-ACP and C18: 0-ACP are formed. Most of this C18: 0—ACP is localized in plastids.
  • the C18: 0—ACP desaturase causes the first unsaturated bond at position ⁇ 9 (the ninth carbon, counting from the carboxy-terminal carbon). be introduced.
  • a portion of the C18: l-ACP thus generated is removed from the ACP by the action of thioesterase, and the remainder is converted into a CoA ester by the action of thioesterase in the synthesis of glycerol lipids in plastids. After exiting plastids, it is used for glycerol lipid biosynthesis in the endoplasmic reticulum. Glycetolipid biosynthesis occurs in parallel in the chloroplast and extrachloroplast (mainly the endoplasmic reticulum).
  • the chloroplast system is a prokaryotic pathway, and the extrachloroplast pathway is a eukaryotic pathway. Called.
  • the acyl group is sequentially transferred to the sn-1 position and the sn-2 position of glycerol triphosphate (G3P) by the acyltransferase, and the polar head is converted. It becomes various glycemic lipids such as phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylglycerol (PG). Lipids such as PC synthesized by the eukaryotic pathway are the main components of the membrane, and a third asinole group is transferred to the sn-3 position, and triacylglycerol ( TAG).
  • PC phosphatidylcholine
  • PG phosphatidylglycerol
  • Biological membranes of plants such as soybean generally contain linoleic acid and ⁇ -linolenic acid at a high ratio. Higher plants commonly have 18: 0-ACP desaturase, ⁇ 12 desaturase, and ⁇ 3 desaturase. 18: 0-ACP desaturase is localized in plastids, whereas ⁇ 12 desaturase and ⁇ 3 desaturase are at least two plastid-localized and ER-localized isozymes, respectively. Is known to exist. More limited types of plants have special desaturase genes.
  • ⁇ 6 desaturases from evening primrose and Norrichicha produce ⁇ -linolenic acid from linoleic acid
  • ⁇ 5 desaturase from limnanthes is involved in the synthesis of C20: 1 ( ⁇ 5). I do.
  • fatty acids contained in plants are C16 or C18, but plants contain C20 as a main component of wax covering the body surface and as a component of sphingolipids often contained in the cell membrane / vacuolar membrane.
  • the above ultra-long chain fatty acids are required.
  • Some plants also contain a significant proportion of C20 and C22 very long chain fatty acids as storage lipids.
  • the synthesis pathway of this very long chain fatty acid is similar to the synthesis of a new fatty acid by the fatty acid synthase complex, and the chain length of each C2 unit is extended in one cycle of condensation, reduction, dehydration and reducing power. For this reason, as described above, also in the synthesis route of the very long chain fatty acid, the condensation reaction between the existing acyl group and malonyl-CoA is considered to be the rate-limiting reaction for elongation of the chain length.
  • TAG Most of the storage lipid is TAG. This TAG is generated by sequentially acylating G3P supplied from the cytoplasm. Three Ashiru groups in this TAG is the force are respectively transferred to the glycerol backbone by another Ashiru sulfotransferase S, to these sn _2 of Lysophosphatidic acid acyltransferase (LPAAT), which translocates lysine, generally has high substrate specificity, which is one factor in determining the fatty acid composition of stored lipids. Is believed to be
  • TAG is also generated by a pathway based on PC, which is a major lipid synthesized by the eukaryotic pathway described in the preceding section.
  • This TAG is synthesized on the membrane of the smooth endoplasmic reticulum and accumulates between the lipid bilayers.
  • the swelling portion that accumulates TAG eventually releases the ER force as a sphere surrounded by a lipid monolayer called an oil body.
  • Some plants produce medium or very long chain fatty acids that are shorter or longer than C16 or C18, or produce large amounts of special hydroxylated or epoxidized fatty acids. Most exist in the form of TAGs.
  • the present invention relates to an oil / fat raw material plant containing arachidonic acid and its use. Since arachidonic acid is produced in the oil / fat raw material obtained by the present invention, an oil / fat raw material containing arachidonic acid can be produced.
  • a method for producing an arachidonic acid-containing plant according to the present invention (sometimes referred to as an arachidonic acid-containing plant for convenience of explanation) will be described. Plants and their use will be described in order.
  • the method for producing an arachidonic acid plant or soybean according to the present invention includes an arachidonic acid production step of producing arachidonic acid by introducing a fatty acid synthase gene involved in arachidonic acid biosynthesis into a plant.
  • Other specific steps, conditions, materials, etc., as far as possible, are not particularly limited.
  • Enzymes involved in fatty acid synthesis will be described.
  • Fatty acid synthases used in the present invention include, for example, those involved in arachidonic acid biosynthesis. Among the available fatty acid synthases, those that are not present in the host plant can be mentioned. Since higher plants generally have a group of enzymes that biosynthesize linoleic acid or linolenic acid from stearic acid, such fatty acid synthases are more specifically described from linoleic acid or linolenic acid to arachidone. It is an enzyme necessary for the biosynthesis of acids. Specific examples of these enzymes include three types of enzymes, ⁇ 6 desaturase, fatty acid chain elongase (hereinafter sometimes simply referred to as chain elongase), and ⁇ 5 desaturase. You can raise S.
  • the “ ⁇ 6 desaturase” catalyzes a reaction for introducing an unsaturated bond at the ⁇ 6 position (sixth carbon counted from the carboxy terminal carbon) of an aliphatic monocarboxylic acid.
  • a protein that has a function refers to a protein having a function of catalyzing a reaction of extending a carbon chain of an aliphatic monocarboxylic acid.
  • the “ ⁇ 5 desaturase” refers to a protein having a function of catalyzing a reaction for introducing an unsaturated bond at the ⁇ 5 position (the fifth carbon counted from the carboxy-terminal carbon) of an aliphatic monocarboxylic acid. .
  • genes encoding the above three fatty acid synthases may be linked to a constitutive or seed-specific promoter and introduced.
  • the above three enzymes can be derived from higher animals or microorganisms such as Mortierella.
  • Mortierella filamentous fungi are used for fermentative production of polyunsaturated fatty acids, and research on their biosynthetic systems is ongoing.
  • Mortierella alpina has an n-6 biosynthetic pathway that accumulates arachidonic acid via linoleic acid and hyalinolenic acid as the main pathway.
  • Mortiera Alpina In the arachidonic acid biosynthesis pathway, the biosynthesis pathway of linoleic acid and ⁇ -linolenic acid is the same as in higher plants.
  • the pathway where arachidonic acid is synthesized from linoleic acid first, linoleic acid is converted into ⁇ -linolenic acid by ⁇ 6 desaturase, and then di-homogeneous by fatty acid chain elongase (GLELO). Linolenic acid is produced and subsequently converted to arachidonic acid by a ⁇ 5 unsaturating enzyme.
  • the ⁇ 6 desaturase derived from Mortierella alpina is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and performs a reaction for introducing an unsaturated bond at the ⁇ 6 position of an aliphatic monocarboxylic acid. It is known to catalyze. Further, the ⁇ 6 desaturase used in the present invention is not limited to the ⁇ 6 desaturase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, but is not limited to the ⁇ 6 position of the aliphatic monocarboxylic acid. Any protein may be used as long as it has a function of catalyzing a reaction for introducing an unsaturated bond.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 even if the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added, If it has, it can be used in the present invention.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence 1”.
  • the range of ⁇ or several '' is not particularly limited, but, for example, one by one, preferably one by one, more preferably one by one, even more preferably one by one, Particularly preferably, one by one is meant.
  • the deletion, substitution or addition of the amino acid can be performed by modifying the nucleotide sequence encoding the peptide by a method known in the art.
  • a known method such as the Kunkel method or the Gaed duplex method or for example, using a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K or Mutant-G (both trade names, manufactured by TAKARA)) or the like, or Mutations are introduced using LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (trade name, manufactured by TAKAR A).
  • the fatty acid chain elongation enzyme derived from Mortierella alpina is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and can catalyze the reaction of extending the fatty acid chain length of aliphatic monocarboxylic acid.
  • the fatty acid chain lengthening enzyme used in the present invention is not limited to the fatty acid chain lengthening enzyme having the amino acid sequence 1J shown in SEQ ID NO: 3, but extends the fatty acid chain length of the aliphatic monocarboxylic acid. Any protein may be used as long as it has a function of catalyzing the reaction to be performed.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added, If it has a function, it can be used in the present invention.
  • the ⁇ 5 desaturase derived from Mortierella alpina is a protein having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and is a reaction for introducing an unsaturated bond at the ⁇ 5 position of an aliphatic monocarboxylic acid. It is known to catalyze Further, the ⁇ 5 desaturase used in the present invention is not limited to the ⁇ 5 desaturase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, but is not limited to the ⁇ 5 position of the aliphatic monocarboxylic acid. Any protein having a function of catalyzing a reaction for introducing an unsaturated bond may be used.
  • the protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added, the above function can be obtained. If it has, it can be used in the present invention.
  • the above-mentioned ⁇ 6 desaturase, fatty acid chain elongase, ⁇ 5 A gene encoding a saturating enzyme can be suitably used.
  • the gene encoding the ⁇ 6 desaturase (referred to as ⁇ 6 desaturase gene for convenience of description) is not particularly limited, but specific examples include, for example, Mortierella When a ⁇ 6 desaturase derived from alpina is used, the gene encoding the ⁇ 6 desaturase is used. Can be mentioned.
  • a specific example of the ⁇ 6 desaturase gene there can be mentioned, for example, a polynuclease containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 as an open reading frame (ORF).
  • the ⁇ 6 desaturase gene used in the present invention is not limited to the above examples, and may be a gene having homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Specifically, for example, it hybridizes with a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a gene consisting of a complementary nucleotide sequence under stringent conditions, and at the ⁇ 6 position of the aliphatic monocarboxylic acid. And a gene encoding a protein having a function of catalyzing a reaction for introducing an unsaturated bond into the protein.
  • stringent conditions means at least 90% identity, preferably at least 95% identity, and more preferably at least 97. Hybridization only occurs when / 0 identity exists between the sequences.
  • the method can be carried out by a conventionally known method such as a method described in the Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Generally, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (the less likely it is to hybridize).
  • the gene encoding the fatty acid chain elongase (for convenience of description, referred to as the fatty acid chain elongase gene) is not particularly limited, but as a specific example, For example, when a fatty acid chain elongase derived from Mortierella alpina is used, a gene encoding the fatty acid chain elongase can be mentioned.
  • a specific example of the fatty acid chain elongation enzyme gene includes, for example, a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 as an open reading frame (ORF).
  • the ORF in the present invention refers to a range from a start codon to immediately before a stop codon.
  • the fatty acid chain elongation enzyme gene used in the present invention is not limited to the above examples, but may be a gene having homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. Good. Specifically, for example, it hybridizes with a gene consisting of a nucleotide sequence complementary to the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, and Examples include a gene encoding a protein having a function of catalyzing a reaction for elongating the chain length of an aliphatic monocarboxylic acid.
  • the gene encoding the ⁇ 5 desaturase (referred to as ⁇ 5 desaturase gene for convenience of explanation) is not particularly limited, but specific examples include: For example, when a ⁇ 5 desaturase derived from Mortierella alpina is used, a gene encoding this ⁇ 5 desaturase can be mentioned.
  • a specific example of the ⁇ 5 desaturase gene includes, for example, a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 as an open reading frame ( ⁇ RF).
  • the ⁇ 5 desaturase gene used in the present invention is not limited to the above examples, and may be a gene having homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. Specifically, for example, it hybridizes under stringent conditions with a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a gene consisting of a complementary nucleotide sequence, and at the ⁇ 5 position of the aliphatic monocarboxylic acid. And a gene encoding a protein having a function of catalyzing a reaction for introducing an unsaturated bond into the protein.
  • the method for obtaining the gene is not particularly limited, and can be isolated from many animals, microorganisms, or plants by a conventionally known method.
  • a primer pair prepared based on the base sequence of a known enzyme can be used.
  • the above gene can be obtained by performing PCR using this pair of primers with a plant cDNA or genomic DNA as a type II. Further, the above gene can be obtained by chemically synthesizing according to a conventionally known method.
  • the method for producing arachidonic acid soybean according to the present invention is not particularly limited as long as it includes the step of introducing the fatty acid synthase gene described in the above section [1-1] into a plant to produce arachidonic acid.
  • the method for producing a plant according to the present invention may be mentioned as a production method including steps such as a recombinant expression vector construction step, a transformation step, and a selection step. Can be. Among them, in the present invention, it is sufficient that at least the transformation step is included.
  • each step will be specifically described.
  • Step of constructing a recombinant expression vector may be a step of constructing a recombinant expression vector containing the gene encoding the fatty acid synthase described in the above section [11] and a promoter (sequence). It is not particularly limited.
  • a vector serving as a parent of the above-mentioned recombinant expression vector conventionally known various vectors can be used.
  • a plasmid, a phage, a cosmid, or the like can be used, and can be appropriately selected depending on a plant cell to be introduced or an introduction method.
  • Specific examples include pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, pBluescript, pBluescriptSK, pBI-based vectors, and the like.
  • pBI-based binary vector when the method of introducing a vector into a plant is a method using agrobacterium, it is preferable to use a pBI-based binary vector.
  • pBI binary vectors include pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, and pBI221.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter capable of expressing a gene in a plant, and a known promoter can be suitably used.
  • promoters include cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), actin promoter, promoter of nopaline synthase (nopaline synthase), PRla gene promoter of tobacco, and ribulose 1,5-diphosphate carboxylase of tomato. Oxidase small subunit promoter and the like.
  • the cauliflower mosaic virus 35S promoter or actin promoter can be more preferably used.
  • a promoter of the soybean seed storage protein conglycinin can be suitably used.
  • the promoter may be a constitutive promoter or a tissue-specific promoter.
  • the use of each of the above promoters enables the resulting recombinant expression vector to strongly express any gene when introduced into a plant cell.
  • a seed-specific promoter is preferable. That is, it is preferable to link a gene encoding a fatty acid synthase involved in arachidonic acid biosynthesis to the downstream region of the seed-specific promoter. More specifically, a case where three kinds of enzymes, ⁇ 6 desaturase, fatty acid chain elongase and ⁇ 5 desaturase, are respectively linked to the downstream region of the seed-specific promoter can be mentioned.
  • soybean seed Examples of the specific promoter include a conglycinin promoter and the like as shown in Examples described later.
  • an enzyme involved in arachidonic acid biosynthesis can be efficiently and stably expressed, and arachidonic acid can be stably produced.
  • the above-mentioned promoter is ligated so as to be able to express the gene encoding the fatty acid synthase described in the above section [11], and is a recombinant expression vector that has only been introduced into a vector.
  • the specific structure as is not particularly limited.
  • fatty acid synthase examples include ⁇ 6 desaturase, fatty acid chain elongase,
  • ⁇ 5 desaturase When expressing three enzymes of ⁇ 5 desaturase in a host plant, use a recombinant expression vector in which these three enzymes are arranged on the same vector so that each enzyme is expressed. Transformation may be performed, or three types of enzymes, ⁇ 6 desaturase, fatty acid chain elongase, and ⁇ 5 desaturase, may be arranged on three vectors, respectively. Two vectors can be simultaneously transformed and the three different enzymes can be expressed separately in host plant cells.However, in particular, a recombinant method in which three different enzymes are placed on the same vector More preferably, an expression vector is used.
  • the recombinant expression vector may further include another DNA segment in addition to the promoter and the fatty acid synthase gene.
  • the other DNA segment is not particularly limited, but examples thereof include a terminator, a selection marker, an enhancer, a base sequence for improving translation efficiency, and the like.
  • the recombinant expression vector may further have a T-1 DNA region. The T-DNA region can enhance the efficiency of gene transfer particularly when the above-mentioned recombinant expression vector is introduced into a plant using Agrobacterium.
  • the terminator has a function as a transcription termination site, and is not particularly limited as long as it is a known terminator.
  • the nopaline synthase gene A transcription termination region (Nos terminator 1)
  • a cauliflower mosaic virus 35S transcription termination region (CaMV35S terminator 1)
  • a transcription termination region of a manopin synthase gene (Mas terminator 1)
  • Nos terminator or Mas terminator can be more preferably used.
  • an unnecessarily long transcript may be synthesized after introduction into a plant cell, or a strong promoter may be used to copy the plasmid. It is possible to prevent a phenomenon that the number is reduced.
  • a drug resistance gene can be used as the selection marker.
  • drug resistance genes include, for example, drug resistance genes for hygromycin, bleomycin, kanamycin, gentamicin, chloramphenicol, and the like.
  • the transformed plants can be easily selected by selecting the plants that grow in the medium containing the antibiotic.
  • Examples of the base sequence for enhancing the translation efficiency include an omega sequence derived from tobacco mosaic virus. By arranging this omega sequence in the untranslated region (5 ′ UTR) of the promoter, the translation efficiency of the chimeric gene can be increased. As described above, the recombinant expression vector can contain various DNA segments according to the purpose.
  • the method for constructing the recombinant expression vector is not particularly limited, either.
  • the promoter, the gene encoding the fatty acid synthase, and, if necessary, the other DNA may be added to an appropriately selected parent vector.
  • the segments may be introduced in a predetermined order.
  • these three types of enzyme genes are expressed so that a gene encoding ⁇ 6 desaturase, a gene encoding fatty acid chain elongation enzyme, and a gene encoding ⁇ 5 desaturase are expressed.
  • these fatty acid synthase genes are linked to a promoter (and a terminator if necessary) to construct an expression cassette, which is then introduced into a vector.
  • the cleavage sites of each DNA segment are set as protruding ends complementary to each other, and the DNA segments are sequenced by reacting with the ligation enzyme. Can be defined.
  • a terminator is included in the expression cassette, it is sufficient that the promoter, the fatty acid synthase gene, and the terminator are arranged in this order from the upstream.
  • the types of reagents for constructing the recombinant expression vector that is, restriction enzymes and ligation enzymes, are not particularly limited, and commercially available ones may be appropriately selected and used.
  • the method of propagation (production method) of the recombinant expression vector is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. In general, it may be grown in E. coli using E. coli as a host. At this time, a preferred type of Escherichia coli may be selected depending on the type of the vector.
  • the recombinant expression vector described in the above section [1-12-1] is introduced into a plant cell, and the fatty acid described in the above section [11-1] is introduced. Now that they are producing synthases.
  • the method for introducing the recombinant expression vector into plant cells is not particularly limited, and any conventionally known method suitable for plant cells can be used. Specifically, for example, a method using agrobacterium or a method of directly introducing into plant cells can be used. As a method using an agglom battery, for example,
  • Methods for directly introducing the recombinant expression vector into plant cells include, for example, a microinjection method, an electoral poration method (electroporation method), a polyethylene glycol method, a particle gun method, a protoplast fusion method, a calcium phosphate method and the like. Can be used.
  • Examples of plant cells into which the above-mentioned recombinant expression vector is introduced include cells of various tissues, callus, suspension culture cells, and the like in plant organs such as flowers, leaves, and roots.
  • the recombinant expression vector may be appropriately constructed appropriately in accordance with the type of plant to be produced.
  • Such a recombinant expression vector may be constructed in advance and introduced into a plant cell. That is, the plant production method according to the present invention may or may not include the recombinant expression vector construction step described in [1-2-1]. Les ,.
  • ⁇ 15 desaturase When the host plant contains ⁇ 15 desaturase, it is preferable to suppress the expression of this ⁇ 15 desaturase. This is because, as shown in FIG. 1, linoleic acid produced in soybean is converted to hylinolenic acid by ⁇ 15 desaturase. Therefore, in order to convert all linoleic acid produced in soybean to ⁇ -linolenic acid, a precursor of arachidonic acid, it is preferable to suppress the expression of this ⁇ 15 desaturase. is there.
  • methods for suppressing the expression of this ⁇ 15 desaturase there are known genetic engineering techniques such as antisense method, sense (cosuppression) method, and RNAi method for transcribing double-stranded RNA.
  • the expression of the ⁇ 15 desaturase gene can be easily and reliably suppressed. That is, the arachidonic acid production step of the present invention preferably includes an expression suppression step for suppressing the expression of the ⁇ 15 desaturase in the host. Further, the expression suppression step preferably comprises the ⁇ 15 It can be said that the step of suppressing the expression of the desaturase is more preferable.
  • the method for producing a plant according to the present invention may further include the step of constructing a recombinant expression vector as long as the step of transformation is included, but may further include other steps. Is also good. Specific examples include a selection step of selecting an appropriate transformant from the transformed plant.
  • the method of selection is not particularly limited.
  • the selection may be carried out on the basis of drug resistance such as hygromycin resistance, or after growing a transformant, the plant itself or any organ may be selected. Or from the arachidonic acid content of the tissue.
  • a fluorescent protein such as GFP can be simultaneously transduced and visually selected.
  • the method for producing a plant according to the present invention in order to introduce the fatty acid synthase gene into a plant, a progeny containing arachidonic acid is simply obtained from the plant by sexual or asexual reproduction. Becomes possible. It is also possible to obtain plant cells, seeds, fruits, strains, callus, tubers, cuttings, clumps, and other propagation materials from the plant and its progeny, and mass-produce the plant based on these. Become. Therefore, the method for producing a plant according to the present invention may include a breeding step (mass production step) of breeding the selected plant.
  • the plant in the present invention includes at least one of a grown plant individual, a plant cell, a plant tissue, a callus, and a seed. Further, the progeny of the plant bred in this breeding step is also included in the present invention. In other words, in the present invention, any plant that can finally grow into a plant individual is regarded as a plant.
  • the above-mentioned plant cells include various forms of plant cells.
  • the powerful plant cells include, for example, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and the like. Proliferation and differentiation of these plant cells can provide the power to obtain plants.
  • the regeneration of a plant from a plant cell can be performed using a conventionally known method depending on the type of the plant cell. Therefore, the method for producing a plant according to the present invention may include a regeneration step of regenerating the plant from the plant cells.
  • the method for producing a plant according to the present invention is not limited to the method of transformation with a recombinant expression vector, and other methods may be used.
  • the above fatty acid synthase itself may be administered to a plant.
  • a fatty acid synthase may be administered to a young plant so that arachidonic acid can be contained in a part of the plant finally used.
  • the method of administering the fatty acid synthase is not particularly limited, and various known methods may be used.
  • a fatty acid synthase gene involved in arachidonic acid biosynthesis is introduced into a plant or soybean.
  • Araki Fatty acid synthase involved in the synthesis system of donic acid is expressed, and the fatty acid synthase produces arachidonic acid by an arachidonic acid biosynthetic pathway which does not exist in higher plants.
  • the resulting plant will contain arachidonic acid. Therefore, the present invention includes arachidonic acid-containing plant matter and soybean obtained by the above-described method for producing a plant.
  • the ability of the plant to produce arachidonic acid is not particularly limited.
  • a plant containing arachidonic acid can be distributed as it is as a crop or food.
  • arachidonic acid can be utilized by extracting arachidonic acid from the plant. That is, the present invention also includes arachidonic acid obtained from a plant produced by the method for producing a plant.
  • the method for obtaining arachidonic acid from the above-mentioned arachidonic acid-containing oil-and-fat raw material plant is not particularly limited, and a conventionally known extraction and purification method can be used.
  • a conventionally known extraction and purification method can be used.
  • arachidonic acid is known to play an important role as a direct precursor of caprostaglandins that exhibit various functions in the body of animals.
  • arachidonic acid has also been shown to have an improving effect on senile dementia.
  • arachidonic acid-containing plants or arachidonic acid obtained from such plants can be used in compositions (eg, oil and fat compositions), foods (health foods, etc.), pharmaceuticals, etc. declaring an effect of improving senile dementia.
  • the “composition” is not particularly limited as long as it contains any component other than arachidonic acid.
  • PCFA, DHA, EPA, and other PUFAs may be included as fat components other than arachidonic acid.
  • food as used herein is not limited to tablets, liquids, powders, and other dosage forms as long as it can be taken into the body by oral ingestion.
  • a health food can be obtained by incorporating a fat or oil composition containing arachidonic acid into a capsule soluble in the body.
  • kits for performing the method for producing a plant according to the present invention that is, a arachidonic acid-containing plant producing kit can be mentioned. .
  • the above-mentioned recombinant expression vector which contains at least a recombinant expression vector containing a gene encoding the above-mentioned fatty acid synthase is introduced into plant cells. It is more preferable to include a group of reagents. Examples of the reagent group include an enzyme and a buffer corresponding to the type of transformation. In addition, laboratory materials such as microcentrifuge tubes may be attached as necessary.
  • the above-described method for producing a plant can be easily carried out, and the ability to reliably and easily produce a arachidonic acid-containing plant can be obtained. S can.
  • the lipid extraction 'analysis was performed according to a known method (Yasuhiko Fujino (1978) Biochemistry Experimental Method 9 Society Press Center, Akihiro Yamada (1989) Biochemical Experimental Method 24 Society Press Center).
  • a known method Yamahiko Fujino (1978) Biochemistry Experimental Method 9 Society Press Center, Akihiro Yamada (1989) Biochemical Experimental Method 24 Society Press Center.
  • the black-mouthed form layer was roughly weighed and transferred to a screw-threaded test tube ( ⁇ 16 mm ⁇ 125 mm), and the solvent was removed by evaporation with a speed bag (SC210, SC210). The weight of the screw-mouth test tube was measured, and the amount of recovered lipid was determined from the difference from the weight of the test tube.
  • Each peak in the chromatogram is a methylated standard fatty acid
  • pE21 13 Plant Cell Physiol. 37, P 45 (1996) is a plasmid vector having a forceflower mosaic virus 35S (E1235S) promoter and a nopaline synthase (nos) promoter, which repeat an enhancer sequence. is there.
  • This pE2113 was digested with SnaBI, and the plasmid obtained by inserting X hoi linker (TAKARA) was further digested with Sacl. • After blunt-ending, BamHI linker (TAKARA) was inserted and pUE7 was inserted. Obtained.
  • the Mortierella ⁇ 6 desaturase gene is under the control of the E1235S promoter and a nos terminator.
  • pSPB559 was introduced into agrobacterium, and this recombinant agrobacterium was used to introduce into tobacco.
  • the RNA of the obtained recombinant tobacco leaf was extracted, and the ⁇ 6 desaturase derived from Mortierella was extracted by Northern hybridization. Lines expressing the gene were selected.
  • pUCAP Transgenic research 4, p288, (1995) was digested with Ascl, blunt-ended, and introduced with a Pacl linker to obtain pUCAPP.
  • pE2113 was digested with SnaBI, and BamHI linker (TAKARA) was introduced to obtain pUE6.
  • This pUE6 was digested with Sacl, blunt-ended, and Sail linker (TAKARA) was inserted to obtain pUE8.
  • PSPB599 was digested with Pacl, blunt-ended, and an Ascl linker was inserted to give pSPB599A.
  • This binary plasmid pSPB1157 was introduced into tobacco as described above to obtain a transformed tobacco.
  • production of dihomo_ ⁇ -linolenic acid was confirmed in 0.15% of the total fatty acids in tobacco leaves expressing the fatty acid chain elongase and ⁇ 6 desaturase genes.
  • leaves of untransformed host tobacco have dihomo_ ⁇ _lino. Lenoic acid was unrecognizable.
  • This pSPB1519A was digested with Ascl and inserted into the Ascl site of pSPB1157 to obtain pSPB1519.
  • ptll, ⁇ 5 desaturase gene, chain elongation enzyme gene and ⁇ 6 desaturase gene are transcribed in the same direction, and ⁇ 5 desaturase gene and chain elongation enzyme gene.
  • the ⁇ 6 desaturase gene is under the control of a constitutive promoter.
  • ⁇ 5 desaturase gene is transcribed in the leaves of transformed tobacco. Arachidonic acid was not produced. The possible reasons are that the amount of dihomo_ ⁇ _linolenic acid, which is the substrate of the ⁇ 5 desaturase, is insufficient, and that the ⁇ 5 desaturase functions, Was done.
  • soybean The culture of soybean (Glycine max) is basically performed according to the method of Finer et al. (In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35: 451 (1999)). Somatic embryos were induced with 30 g / l sucrose, 40 mg / l 2, 4_D, MS medium supplemented with B5 vitamins, ⁇ 70).
  • Induced somatic cells 3Pi was grown in a liquid growth medium (10 g / l sucrose, lg / 1 asparagine, 5 mg / l 2, 4_D, FNLite medium, pH 5.8), and then the particle gun method ( The gene was introduced using gold particles with a diameter of 1 ⁇ ⁇ ⁇ m and a rupture disk (1350 dpi). After somatic embryos transfected with this gene are cultured in a growth medium for one week, they are selected for one month each in a growth medium supplemented with 15 mg / l, 30 mg Zl, and 45 mg / l hygromycin, and then subjected to liquid differentiation and maturation.
  • a liquid growth medium 10 g / l sucrose, lg / 1 asparagine, 5 mg / l 2, 4_D, FNLite medium, pH 5.8
  • the gene was introduced using gold particles with a diameter of 1 ⁇ ⁇ ⁇ m and a rupture disk (1350 dpi).
  • somatic embryos are transferred to a differentiation / maturation medium, they gradually increase in size (this stage corresponds to immature embryos), and as they develop, they differentiate into well-defined cotyledons and hypocotyls and mature. (This stage is completed Corresponding to a mature embryo). Mature somatic embryos were dried and then germinated in a germination medium to obtain complete plants. The liquid shaking culture was performed using a rotary shaker, and the shaking speed was 100 rpm.
  • pUCAP which has two 8-base recognition sites, is digested with Ascl and Sgfl linker is inserted, and further digested with Pacl and Fsel linker is inserted, and four 8-base recognition restriction enzyme recognition sites are possessed.
  • a plasmid pUCSAPF was prepared. For subcloning, pUC19 was digested with Hindlll, Sgfl linker was inserted, and plasmid pUCSA digested with EcoRI and Ascl linker was inserted, pUC19 was digested with Hindlll, Pacl linker was inserted, and EcoRI was further inserted.
  • ⁇ 6 desaturase from Mortierella As vectors for arachidonic acid production, expression cassettes for ⁇ 6 desaturase from Mortierella, fatty acid chain elongase (GLELO), ⁇ 5 desaturase, and RNAi cassette for ⁇ 15 desaturase from soybean were used.
  • GLELO fatty acid chain elongase
  • RNAi cassette for ⁇ 15 desaturase from soybean In combination with a seed-specific promoter, a fatty acid synthase gene plant expression vector was prepared.
  • a soybean-derived conglycinin alpha 'subunit promoter Pro Nat. Acad. Sci. USA, 83 p8560 (1986) was used as a seed-specific promoter. Specifically, the procedure was performed as follows.
  • a conglycinin promoter amplified by PCR between Hindlll and Xbal of the pUC19 multicloning site, treated with restriction enzymes, and purified was inserted between Sacl and EcoRI by a PC.
  • the manopin synthase gene terminator amplified with R, treated with restriction enzymes and purified was inserted (pSPB1904).
  • a plasmid in which the target sequence was subcloned was subjected to type III.
  • the primers used for the PCR reaction were the conglycinin promoter, and the primers HinCprof (5, -AGTCAAGCTTAATTCAAACAAAAACG-3 ') (SEQ ID NO: 7) and XbaCpror (5, -CAGTTCTAGAAAATTCTTTAATACGG_3,) (SEQ ID NO: 8) And were used.
  • HinCprof 5, -AGTCAAGCTTAATTCAAACAAAAACG-3 '
  • XbaCpror 5, -CAGTTCTAGAAAATTCTTTAATACGG_3,
  • SEQ ID NO: 8 primers Sacmasf (5'-AGTCGAGCTCCAGCTTCCCTGAAACC-3 ') (SEQ ID NO: 9) and Ecomasr (5, -CATCATCTCGAGGGTGGTGACCATGGTGATCGC-3,) (SEQ ID NO: 10) were used.
  • a ⁇ 5 desaturase cassette obtained by digesting pSPB1919 with Pacl and Fsel a fatty acid chain elongation enzyme cassette obtained by digesting pSPB1920 with Sgfl and Ascl
  • pSPB1910 with Hindlll and EcoRI The ⁇ 6 desaturase cassette obtained by digestion was inserted into pUCSAPF to prepare a plasmid pSPB1944 in which the three cassettes were ligated.
  • the HPT cassette consisting of the 35S promoter ⁇ "-hygromycin resistance gene-nos terminator is located in the Hindlll site of pUCFF
  • the GFP cassette consisting of the 35S promoter" ⁇ _green fluorescent protein gene-nos terminator is Subcloning was performed between Sphl and EcoRI of pUCSS to prepare pSPB1918 and pSPB1935, respectively.
  • the HPT cassette cut out from pSPB1918 was inserted into the Fsel site of pPSB1944, and the GFP cassette cut out from pSPB1935 was inserted into the Sgfl site to prepare pSPB1852.
  • RT-PCR was performed using total RNA extracted from immature soybean seeds. Specifically, the procedure was as follows.
  • the reverse transcription reaction was performed using a Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen Co., Ltd.) with ⁇ ligo (dT) 1218 primer.
  • the reverse transcription product was designated as type I, and primers detl5—2—Fl (5 '
  • PCR reaction was carried out using -ATGGTTAAAGACACAAAGCCTTTAGCC-3 ') (SEQ ID NO: 11) and detl 5_2_Rl (5, -TCAGTCTCGTTGCGAGTGGAGG-3,) (SEQ ID NO: 12).
  • the PCR reaction was held at 94 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles of 1 minute at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, followed by a further 72 cycles. Hold at ° C for 1 minute.
  • the amplified DNA fragment was subcloned into a pCRII vector using a TOPO cloning kit (Invitrogen Corporation), and the sequence was confirmed. BamHI and Xhol recognition sequences were added to the DNA fragment 5 bases down to 591 bp downstream of the start codon of the subcloned ⁇ 15 desaturation enzyme gene, and S acl was added to the DNA fragment up to 791 bp 5 bases downstream.
  • the fragment to which the Xhol recognition sequence was added was amplified and purified by PCR.
  • the primer used at this time was the primer SOYF1-
  • SOYR1-X (5,-GCACATCTCGAGGGATTGAAGTGAGAGCCTTC-3,) (SEQ ID NO: 14) was used.
  • primers SOYF2-S (5, -GTCTGCGAGCTCTTAAAGACACAAAGCCTTTA-3,) (SEQ ID NO: 15) and SO UR2-X (5, -CATCATCTCGAGGGTGGTGACCATGGTGATGC-3,) (SEQ ID NO: 16) was used.
  • RNAi cassette (pSPB1876 ).
  • the ⁇ 15R NAi cassette was cut out from this pSPB1876, and inserted into the Ascl site of pSPB1852 to prepare pSPB1877.
  • pSPB1877 can also be produced by the procedure shown in FIG.
  • a GLELO gene fragment was linked to the Sgfl-Ascl site of pUCSAPF2.7 kbp between the conglycinin promoter shown by Con in the figure and the manopin synthase gene terminator shown by mas in the figure.
  • Fragment a ⁇ 6 desaturase gene fragment (a fragment in which a ⁇ 6 desaturase cDNA is linked between Con and mas) at the AscI_PacI site, and a ⁇ 5 desaturase fragment at the PacI_FseI site.
  • a saturase (a fragment having a ⁇ 5 desaturase cDNA linked between Con and mas) was introduced to prepare pSPB1944.
  • pSPB1944 was treated with Sgfl and Fsel, and a 35S promoter was placed at the Sgfl site.
  • a green GFP cassette consisting of a fluorescent protein gene and a nos terminator was placed at the Fsel site, and a 35S promoter at the Fsel site.
  • An HPT cassette consisting of a nos terminator was introduced to produce PSB1852.
  • the ⁇ 15 RNAi cassette was inserted into the Ascl site of pSPB1852 to generate pSPB1877.
  • FIG. 3 shows an overall view of pSB1877 thus produced.
  • pSB1877 is linked to the GFP cassette, GLEL ⁇ , A15 RNAi cassette, ⁇ 6 desaturase, ⁇ 5 desaturase, and HPT cassette, and is a vector for expressing multiple genes. .
  • Soybean somatic embryos transfected with PSPB1877 were sampled at two stages, immaturity and maturity, and multiple gene transfer 'expression analysis was performed. Specifically, the procedure was performed as follows.
  • Genomic DNA and RNA were transferred to DNeasy Plant Mini Kit and RNeasy Plant Mini Kit, respectively.
  • RT PCR uses reverse transcripts as type I, primers det6f3 (SEQ ID NO: 17) and det6r2 (SEQ ID NO: 18), primers det5f4 and det5r 3, primer GLEf (5, -GTGCTCGCTTATTTGGTCAC-3 ') (SEQ ID NO: 27) And GLE r (5′-CGACATCATGCAGAACTGTG-3 ′) (SEQ ID NO: 28) were used. PCR was performed in the same cycle as genomic DNA to analyze gene expression. As a result, in the PSPB1877 transformed soybean, expression of ⁇ 6 desaturase, ⁇ 5 desaturase, and fatty acid chain elongase was confirmed.
  • Lipids were extracted from mature embryos lg of PSPB1877 transformed soybeans according to the method described in the above section [I], and fatty acids were analyzed by gas chromatography and mass spectrometry. The results are shown in Table 2 below.
  • arachidonic acid can be produced in soybean.
  • ⁇ -linolenic acid, dihomo_ ⁇ _linolenic acid, and arachidonic acid which are not biosynthesized by wild-type soybean, are each 2.49 %, 1.05% and 0.83%.
  • the amount of ⁇ -linolenic acid in the transformants decreased to about 20% of the expression level of wild-type soybean, suggesting that RNAi suppressed the expression of ⁇ 15 desaturase.
  • T1 seeds of pSPBl877-transformed soybean that had accumulated arachidonic acid were sown, and T2 seeds for the next generation were collected.
  • the DNA extracted from the leaves of the T1 plants was subjected to ⁇ -type DNA and genomic PCR of ⁇ 6 desaturase, chain length elongase, and ⁇ 5 desaturase was performed according to the method described in the above section (VI). Confirmed that these three genes were inherited.
  • DNA of the leaves of T1 plants was prepared using Nucleon Phytopure (Amersham), and ⁇ 6 desaturation was performed using the DIG DNA labeling kit (Roche's diagnostics) and the primers described in the above section [VI].
  • Probes for the enzyme, chain elongase, and ⁇ 5 desaturase were prepared, and Southern blot analysis was performed. It was confirmed that at least two copies of the construct had been introduced into the T1 plant.
  • ⁇ -linolenic acid, dihomo_ ⁇ -linolenic acid, and arachidonic acid which are not originally biosynthesized in wild-type soybean, are 1. It was synthesized at 71%, 0.55%, and 0.53%.
  • the expression of ⁇ 6 desaturase, chain elongase, and ⁇ 5 desaturase was confirmed by RT-PCR of seeds. Therefore, it was confirmed that the transgene was stably inherited in the next generation, and that the trait of altering the fatty acid composition was also inherited.
  • the method for producing an oil / fat raw material plant of the present invention it is possible to obtain a plant containing arachidonic acid that was not originally produced in higher plants. Since arachidonic acid can be obtained in large quantities and easily from this plant, it is possible to manufacture and sell health foods and pharmaceuticals using this arachidonic acid. That is, the present invention can be used in the food industry, the pharmaceutical industry, and related industries. Further, since the present invention provides a new added value to a plant, it can be used in the agricultural field.

Abstract

　アラキドン酸を含有するアラキドン酸植物体やダイズおよびその利用法を提供する。アラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を植物体に導入し、アラキドン酸を生産させるアラキドン酸生産工程を含む植物体の生産方法を用いて得られる油脂原料植物体によれば、簡便にアラキドン酸を含有する植物体やダイズを取得することができる。それゆえ、アラキドン酸を大量かつ安価に取得することができる。

Description

明 細 書
ァラキドン酸を含有する植物体およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、ァラキドン酸を含有する植物体 (例えば、ダイズ (大豆、 Glycine max) )お よびその利用に関するものであり、特にァラキドン酸の合成系に関与する酵素の遺伝 子を導入するァラキドン酸を含有する植物体の生産方法を用いて得られる植物体お よびその利用に関するものである。
^景技術
[0002] 脂肪酸は、生物にとっての三大栄養素の一つである脂質の主成分で、通常は天然 の脂質の加水分解物である脂肪族モノカルボン酸を指すことが多い。一般的に、脂 肪族鎖が飽和の場合は飽和脂肪酸と称し、二重結合または三重結合を含む場合は 不飽和脂肪酸と称する。鎖長によって短鎖 (炭素数 2— 4)、中鎖 (炭素数 5— 14)、 長鎖 (炭素数 16— 18)、超長鎖 (炭素数 20以上)と分類され、炭素数を n、二重結合 の数を mとした場合、 Cn : mと記述されることが多い。
[0003] このような脂肪酸は、植物においても細胞膜の主成分であるとともに、エネルギー源 として、主にトリグリセリドの形で種子や果実に蓄積される重要な成分である。また、植 物に蓄積される脂質の量や脂肪酸組成は、植物の種類によって異なる。このような植 物に蓄積される脂肪酸としては、例えば、炭素数 16 (C16)の飽和脂肪酸のパルミチ ン酸 (C16 : 0)、炭素数 18 (C18)の飽和脂肪酸のステアリン酸 (C18 : 0)や、炭素数 1 8 (C18)の不飽和脂肪酸として、以下順に 1、 2、 3個の二重結合 (不飽和結合)を有 するォレイン酸（C18： 1)、リノール酸（C18： 2)、 α—リノレン酸（C18： 3ひ）が主なも のとして知られており、これら脂肪酸を比較的多く含む、ダイズ、ァブラヤシ、ヒマヮリ、 ナタネ、ココヤシなどが油脂原料植物（油糧植物とも称される）として栽培されている。 なお、炭素数が 18以上で不飽和結合 (二重結合または三重結合)を 2個所以上もつ 脂肪酸を総称して高度不飽和脂肪酸 (ポリアンサチユレーテイドフアツティーァシド（Ρ UFA : Poly Unsaturated Fatty Acid) )と呼ばれてレ、る。
[0004] ところで、高等動物は、一般にリノール酸や α _リノレン酸合成に関与する不飽和化 酵素を有しなレ、ため、必ず植物 (植物性食品）から上記 PUFAを摂取する必要があり 、それゆえ、リノール酸や α -リノレン酸は必須脂肪酸と呼ばれる。高等動物の体内 では、これらの不飽和脂肪酸を基質として、さらに不飽和化と炭素鎖の伸長が繰り返 され、ジホモ— γ—リノレン酸、ァラキドン酸（C20 : 4n_6)、エイコサペンタエンタエン 酸（EPA) (C20 : 5n_3)、ドコサへキサェン酸（DHA) (C22： 6n_3)などが合成され る。
[0005] これら PUFAは、高等動物の体内での代謝にぉレ、て様々な機能を示すほか、プロ スタグランジン類の直接の前駆体としても重要な役割を果たすことが知られている。 特に、老人や乳児などでは、ジホモ— γ—リノレン酸、ァラキドン酸、 EPA、 DHA等の 生合成能が低下しているため、食物からの摂取が必要とされる。特にァラキドン酸は 、老人性痴呆症の改善効果もあることが知られており、ァラキドン酸を主成分とする健 康食品も市販されており、ァラキドン酸に対する需要が拡大している。
[0006] このァラキドン酸は、魚油に比較的多く含まれ、現在も一部は魚油からの抽出によ つて供給されている。しかし、魚資源の枯渴、供給量の変動や環境汚染による油脂 資源の汚染なども問題になっているため、近年では生産性の制御、長期の安定供給 、清浄性などに優れ、精製が比較的容易なモルティエラ（Mortierella)などの微生物 発酵により、ァラキドン酸の生産が行われている（例えば、文献 l :Appl. Microbiol. Biotechnol., 31， pll (1987)参照）。しかしながら現状では生産コストが高レ、、スケー ルアップに設備投資が必要である、スケールアップが容易ではないといった多くの問 題点が指摘されている。
[0007] このため、これらの PUFA、とりわけァラキドン酸を油糧植物で作ることができれば、 生産過程の大幅な効率化とコストダウンが期待できる。近年、 PUFA生合成に必須 の不飽和化酵素や鎖長延長酵素遺伝子が動植物、カビゃ酵母から相次いで単離さ れ、これらの遺伝子を高等植物へ導入することによって高等植物での PUFA生産が 可能と考えられている。
[0008] 実際に遺伝子組換えによって、植物に含まれる油脂の組成を改変した例として、 (i) ラウリン酸生産ナタネ（ラウリン酸を比較的多く含む月桂樹から、 C12： 0-ACP (ァシ ルキャリアプロテイン）に特異的に作用し、ラウリン酸を遊離する中鎖ァシル -ACPチ ォエステラーゼ遺伝子をナタネの種子貯蔵タンパク質であるナピン遺伝子のプロモ 一ターに連結しナタネに導入したもの：文献 2 : Science, 257, P72 (1992)参照）、（ii)高 ステアリン酸含有ナタネ（C18： 0— ACP不飽和化酵素遺伝子の発現をアンチセンス 遺伝子の導入により抑制し、ステアリン酸含有量を 40%に高めた組換え体ナタネ：文 献 3 : Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89, p2624(1992)参照）、（iii)高工ルカ酸（C22 : 1 )ナタネ (酵母の LPAAT遺伝子を導入することにより、エル力酸含有量を 90%にま で高めたナタネ：文献 4 : Plant Cell, 9, p909 (1997)参照）、（iv)高ォレイン酸生産ダイ ズ (ダイズ種子で発現している Δ 12不飽和化酵素遺伝子 Fad2の発現を抑制するこ とにより、ォレイン酸からリノール酸への合成経路を抑制した結果、ォレイン酸含有量 が約 23%から 80%程度にまで高まったダイズ。なお、 Fad2を制御するプロモーター としては、ダイズ種子貯蔵タンパク質である /3 _コングリシニン遺伝子由来のものが用 レ、られた。）、（V) γ—リノレン酸生産ナタネ (ルリチシャから単離された Δ 6不飽和化酵 素遺伝子を導入したナタネ：文献 5 : Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 94, p4211 (1997)参照）などが作製されている。また、ケィ藻由来の Δ 6不飽和化酵素遺伝子と Δ 5不飽和化酵素遺伝子とヒメッリガネゴケ由来の鎖長延長酵素遺伝子とをアマで 発現させ、ァラキドン酸および EPAが生産された報告がある（文献 6 : J. Biol. Chem. 278， p35115, (2003)参照）。
[0009] また、高度不飽和脂肪酸を生産するダイズを生産すベぐ高度不飽和脂肪酸生産 菌モルティエラから単離した Δ 6不飽和化酵素、鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素 の cDNAを様々なプロモーターに連結し、遺伝子導入を行う試みも報告されている（ 例えば、文献 11：平成 14年度「植物利用エネルギー使用合理化生産技術の研究開 発成果報告書」、 12 :田中良和著、地球環境 ·食糧 ·資源のための植物バイオ第 160 委員会 第 8回研究会資料（日本学術振興会）、 P14 - 16、平成 15年 6月 13日開催 参照）。なお、ここで記述した内容は、特段に述べない限り、文献 7 :「植物代謝工学」 ェヌ'ティー'エス社 2002年（ISBN4_86043_004_2C3045) p574_586または文献 8： J. Plant Physiol. 160, p779 (2003)に依った。
[0010] し力、しながら、ァラキドン酸を植物体に生産させることを報告した上記文献 6の記載 は、明確ではなぐその開示は十分とはいえない。 [0011] より詳細には、植物体に異種生物の遺伝子を導入し、油脂の組成や質を改変する 場合は、炭素鎖長の決定に関与する酵素の遺伝子や、二重結合の数'位置を決定 する不飽和化酵素の遺伝子の発現制御を行う必要がある。また、本来その植物がも たない脂肪酸を生産する場合は、当該脂肪酸が宿主植物の生育に悪影響を及ぼす ことがないよう、脂肪酸合成の時期、部位、細胞内での存在形態などを考慮すること が必要となる。
[0012] さらに、植物において異種生物とくに植物以外の遺伝子を発現させる場合には、転 写産物がプロセシングされる場合があり、このような場合には、例えば、コドンの改変 を行うなどの処理を必要がある（例えば、文献 9： Bio/Technology 11 pl94， 1993参照
[0013] また、一連の生合成反応に関わる酵素は細胞内で複合体を形成しており、その代 謝物は分子チャネルを経て代謝される場合があるとされている（例えば、文献 10 : Proc Natl Acad Sci U S A. 96 pl2929(1999)参照）。このような場合、たとえ生合成に 関わる酵素の遺伝子が公知であって、遺伝子の導入方法が公知であっても、導入し た異種遺伝子由来の遺伝子によって生産された酵素が、宿主植物においてどの程 度うまく機能し、 目的の物質を生産できるか否かの予測は非常に困難である。
[0014] しかし、上記文献 6には、これらの問題点については全く記載されておらず、その開 示は不十分といわざるを得ない。以上のように、脂肪酸生合成については未知な部 分が多ぐさらに異種生物、例えばモルティエラの脂肪酸生合成遺伝子の転写 ·翻訳 が植物体において効率よく起こるかどうか、これらの遺伝子がコードする酵素が植物 体の中で良好に機能するかどうか、これらの酵素が植物体の脂質合成酵素群と細胞 内で協調して機能できるか、脂肪酸の蓄積にはトリグリセリドの形でオイルボディーと なることが必要であるがァラキドン酸が合成されてもそれが蓄積されるかどうか等は未 知数である。つまり、異種生物の遺伝子を植物に導入し、ァラキドン酸を生産させる ためには、相当な試行錯誤が必要であるとレ、える。
[0015] また、マメ科植物、とくにダイズは遺伝子導入による形質転換の困難性が指摘され ており、ダイズの形質転換についての情報量も少ない。数件の報告例によるとダイズ における形質転換効率、再生効率は極めて低ぐ形質転換可能な品種も限定されて いる（例えば、文献 13 : Santarem ER and Finer JJ (1999)、 In Vitro Cell. Dev.
Biol.-Plant 35: 451-455参照）。このため、（i)遺伝子導入の困難なダイズの形質転換 系の開発が必要であり、（ii)さらに、高度不飽和脂肪酸合成に必要な複数の遺伝子を 安定に発現させる多重遺伝子安定発現系の開発も必要となる。カロえて、（m)異種生 物由来の遺伝子産物 (脂肪酸合成に関与する酵素）が実際にダイズにおいてタンパ ク質レベルで発現し、酵素活性を有するか否か、つまり形質転換ダイズの脂質組成 が変化するか否かを確認する必要もある。
[0016] このように、ダイズにて高度不飽和脂肪酸を生産させることは極めて困難な技術で あり、多段階の技術の開発が必要とされる。それゆえ、上記文献 11、 12での報告に おいても、高度不飽和脂肪酸を生産する形質転換ダイズ (植物体）は未だ得られて いない。
[0017] さらに、上記文献 6、 11、 12においても、次世代まで高度不飽和脂肪酸 (例えば、 ァラキドン酸）を生産する形質が受けつがれる形質転換植物体が得られたとレ、う報告 は一切なされていない。つまり、高度不飽和脂肪酸を生産するように植物を形質転 換すること自体が、かなりの技術的な困難を伴うものであるため、その形質を受け継 いだ次世代の植物体を得ることはさらに著しく困難であるといえる。
[0018] したがって、上記種々の問題点を解決すべく試行錯誤を重ねて、実際に異種生物 由来の遺伝子を植物に導入し、 DNAレベルでの発現だけでなぐタンパク質レベル での酵素発現、および酵素の機能確認を行い、現実にァラキドン酸を含有する植物 体、特にダイズを生産することが強く求められている。さらにいえば、次世代まで高度 不飽和脂肪酸を生産する形質が受け継がれる形質転換植物体を得ることが強く求め られていた。
発明の開示
[0019] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ァラキドン酸を 含有する植物体およびその利用法を提供することにある。
[0020] 本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、モルティエラ由来の Δ 6不 飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素の 3種の遺伝子をダイズ種子 特異的プロモーターの下流に連結し、さらにターミネータ一を付加して、同一のベタ ター上に配置した組換え発現ベクターを作製し、これをダイズ胚に導入することにより 、形質転換ダイズを作製したところ、はじめて異種生物由来の遺伝子産物がダイズ内 にてタンパク質レベルで発現されるとともに、酵素の機能をも発揮し、ァラキドン酸が 生産されることを明らかにし、当該形質転換ダイズがァラキドン酸を含有することを独 自に見出し、本発明を完成させるに至った。
[0021] すなわち、本発明に係るァラキドン酸含有植物体は、上記課題を解決するために、 ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を植物体に導入し、ァラキド ン酸を生産させるァラキドン酸生産工程を含む植物体の生産方法により得られること を特徴としている。
[0022] また、上記ァラキドン酸生産工程は、上記ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合 成酵素をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質 転換工程を含むことが好ましレ、。
[0023] さらに、上記ァラキドン酸生産工程は、上記組換え発現ベクターを構築する組換え 発現ベクター構築工程を含んでレ、ることが好ましレ、。
[0024] また、上記組換え発現ベクター構築工程には、ダイズ種子特異的プロモーターの 下流領域に、ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子を 連結する工程が含まれることが好ましい。
[0025] また、上記ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素が、 Δ 6不飽和化酵素、 脂肪酸鎖長延長酵素、および Δ 5不飽和化酵素であることが好ましレ、。
[0026] また、上記 Δ 6不飽和化酵素が、以下の（a)または（b)記載のタンパク質であること が好ましい。
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、揷入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、脂肪族モノカルボン酸の Δ 6 位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質。
[0027] また、上記 Δ 6不飽和化酵素をコードする遺伝子として、以下の（c)または（d)記載 の遺伝子が用いられることが好ましレ、。
(c)配列番号 2に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有す る遺伝子。
(d)配列番号 2に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺 伝子とストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂肪族モノカルボン酸の Δ 6 位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする遺 伝子。
[0028] また、上記脂肪酸鎖長延長酵素が、以下の（e)または (f )記載のタンパク質であるこ とが好ましい。
(e)配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(f)配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、揷入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、脂肪族モノカルボン酸の炭 素鎖の延長反応を触媒する機能を有するタンパク質。
[0029] また、上記脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子として、以下の（g)又は (h)記 載の遺伝子が用いられることが好ましい。
(g)配列番号 4に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有す る遺 卞。
(h)配列番号 4に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺 伝子とストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂肪族モノカルボン酸の炭素 鎖の延長反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
[0030] また、上記 Δ 5不飽和化酵素が、以下の（i)または (j)記載のタンパク質であることが 好ましい。
(i)配列番号 5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(j)配列番号 5に示されるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、揷入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、脂肪族モノカルボン酸の Δ 5 位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質。
[0031] また、上記 Δ 5不飽和化酵素をコードする遺伝子として、以下の（k)または (1)記載 の遺伝子が用いられることが好ましレ、。
(k)配列番号 6に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有す ; eis子。 (1)配列番号 6に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝 子とストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂肪族モノカルボン酸の Δ 5位 に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする遺伝 子。
[0032] 上記ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素または該酵素をコードする遺 伝子は、モルティエラ（Mortierella)属由来であることが好ましい。特に、上記ァラキド ン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素または該酵素をコードする遺伝子は、モルテ ィエラ アルピナ（Mortierella alpina)由来であることが好ましレ、。
[0033] また、上記ァラキドン酸生産工程には、宿主の Δ 15不飽和化酵素の発現を抑制す る発現抑制工程が含まれることが好ましい。
[0034] さらに、上記発現抑制工程は、 RNAi法によって Δ 15不飽和化酵素の発現を抑制 する工程であることがより好ましい。
[0035] また、上記いずれかの油脂原料植物体により生産されるァラキドン酸を含有した植 物体も本発明に含まれる。なお、上記植物体には、植物細胞、植物組織、カルス、種 子、成育した植物個体、もしくは該植物個体と同じ性質を有する植物個体の子孫が 含まれることが好ましい。上記植物体としては、特にダイズであることが好ましい。
[0036] また、上記ァラキドン酸含有植物体から得られるァラキドン酸も本発明に含まれる。
また、上記ァラキドン酸を含んでいる組成物も本発明に含まれる。また、上記組成物 を含んでいる食品も本発明に含まれる。また、上記いずれかのァラキドン酸含有植物 体を作製するためのキットであって、ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素 をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含んで レ、ることを特徴としている。さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するた めの試薬群を含んでいることが好ましい。
[0037] 本発明を完成させるために、本発明者らは、試行錯誤を重ねて、実際に異種生物 由来の遺伝子を植物体に導入し、ァラキドン酸を含有する油脂原料植物体、特にダ ィズを生産することに成功している。これは従来の知見から容易になし得ることではな レ、。
[0038] 以上のように、本発明に係るァラキドン酸含有植物体は、ァラキドン酸生合成に関 与する脂肪酸合成酵素遺伝子を植物体に導入する構成を備えてレ、るので、植物体 にァラキドン酸を生産させることができる。それゆえ、ァラキドン酸を含有する植物体 を容易に取得することができるという効果を奏する。すなわち、本発明により、ァラキド ン酸を植物体で作製することができるため、ァラキドン酸を魚油や微生物から取得す る場合に比べて、生産過程の大幅な効率化とコストダウンが可能となるだけでなぐァ ラキドン酸の大量生産 ·取得が可能になるという効果を奏する。
[0039] さらに、本発明に係るァラキドン酸含有植物体は、高度不飽和脂肪酸を生産する形 質が次世代まで受け継がれるという非常に顕著な効果を奏する。このため、本発明 に係るァラキドン酸含有植物体の次世代の植物体にも改変された脂肪酸の形質が 伝わる。したがって、このァラキドン酸含有植物体を栽培することにより、改変された 脂肪酸組成を有するァラキドン酸含有植物体の種子を大量に得ることができ、ァラキ ドン酸を大量かつ継続的に取得することができるという効果を奏する。
[0040] なお、植物のなかでも形質転換が比較的難しいといわれているマメ科植物、例えば 、ダイズにおいても、上述と同様の効果が得られる。すなわち、本発明にはァラキドン 酸含有ダイズが含まれ、力かるァラキドン酸含有ダイズにおいても、上述の効果が得 られる。
[0041] ァラキドン酸はヒトをはじめとする高等動物にとって必須の脂肪酸であって、健康食 品や医薬品への応用が進められており、その需要が増加しているが、本発明によれ ば、このようなァラキドン酸の需要量の増加要求にも応えることができる。
図面の簡単な説明
[0042] [図 1]高度不飽和脂肪酸の生合成経路を模式的に示す図である。
[図 2]本実施の形態に係るプラスミドベクター pSPB1877の作製工程を模式的に示 す図である。
[図 3]本実施の形態に係るプラスミドベクター PSPB1877の全体を模式的に示す図 である。
発明を実施するための最良の形態
[0043] 本発明は、高等動物にとって必須脂肪酸の PUFAの 1つであるァラキドン酸を含有 するァラキドン酸植物体やダイズを生産するための生産方法によって得られる植物 体やダイズ、およびこれらの利用に関するものである。このため、本発明の詳細な説 明に入る前に、高等植物における脂質生合成についての基本的な知見について簡 単に説明する。
[0044] 高等植物の有する主要脂質は、主に C16または C18で、 1一 3個所に不飽和結合 を有する構造をしている。これらの脂肪酸の大部分は、葉緑体などのプラスチド内で 、ァセチルー CoAを最初の基質として合成される。最初の反応はァセチルー CoAと二 酸化炭素からマロ二ル- CoAを合成する反応で、ァセチル- CoAカルボキシラーゼ（ ACCase)によって行われる。本反応が、高等植物における油脂生合成の律速反応の 1つであり、油脂生産量に影響を及ぼすと考えられており、 ACCase遺伝子の過剰発 現によつてナタネの総油脂量が 5%増加したという報告もある（Plant Physiol, 113, P75-81 (1997))
[0045] マロニル— CoAのマロニル基は、この後 ACPに転移され、マロニル— ACPとなった 後、脂肪酸合成酵素複合体の酵素によって縮合、還元、脱水、還元という一連の反 応を繰り返すことで炭素鎖が 2つずつ伸長し、最終的には C16： 0— ACPや C18： 0- ACPが生成する。この C18： 0— ACPの大部分はプラスチドに局在する C18： 0— AC P不飽和化酵素によって、 Δ 9位 (カルボキシ末端の炭素から数えて 9番目の炭素）に 最初の不飽和結合が導入される。
[0046] このようにして生じた C18 : l— ACPの一部は、プラスチド内でのグリセ口脂質生合 成に使われる力 残りはチォエステラーゼの作用で ACPから外され、 CoAエステルと なってプラスチドから出たのち、小胞体でのグリセ口脂質生合成に用いられる。つまり グリセ口脂質の生合成は葉緑体と葉緑体外（おもに小胞体)で並行して行われ、葉緑 体での系は原核生物型経路、葉緑体外の経路は真核生物型経路と呼ばれる。
[0047] これらの両経路とも、ァシル基転移酵素によってァシル基がグリセロール 3リン酸 (G 3P)の sn— 1位、 sn— 2位に順次転移し、極性頭部が変換されることによって、ホスファ チジルコリン（PC)やホスファチジルグリセロール（PG)など種々のグリセ口脂質となる 。真核生物型経路で合成された PCなどの脂質は、膜の主要構成成分となる他、 sn - 3位に 3つめのアシノレ基が転移して、貯蔵脂質の主成分であるトリァシルグリセロール (TAG)となる。 [0048] ダイズをはじめとした植物の生体膜は、一般にリノール酸や α—リノレン酸を高い比 率で含んでいる。高等植物は、共通して 18 : 0 - ACP不飽和化酵素、 Δ 12不飽和化 酵素、 Δ 3不飽和化酵素を有する。 18 : 0 - ACP不飽和化酵素がプラスチドに局在 するのに対して、 Δ 12不飽和化酵素、 Δ 3不飽和化酵素は、それぞれプラスチド局 在型と ER局在型の少なくとも 2つのアイソザィムが存在することが知られている。さら に限られた種類の植物は、特殊な不飽和化酵素遺伝子を有する。例えば、月見草や ノレリチシャの Δ 6不飽和化酵素は、リノール酸から γ—リノレン酸を生成し、リムナンテ ス（Limnanthes douglasii)の Δ 5不飽和化酵素は C20： 1 ( Δ 5)の合成に関与する。
[0049] 植物に含まれる大部分の脂肪酸は C16または C18であるが、植物は体表面を覆う ワックスの主成分として、また細胞膜ゃ液胞膜に多く含まれるスフインゴ脂質の成分と して、 C20以上の超長鎖脂肪酸を必要する。また、一部の植物は、かなりの割合で C 20や C22の超長鎖脂肪酸を貯蔵脂質として含有する。この超長鎖脂肪酸の合成経 路は、脂肪酸合成酵素複合体による新規脂肪酸合成と類似しており、縮合、還元、 脱水、還元力 なる 1サイクルで C2ユニット毎の鎖長の伸長が行われる。このため、 上述したように、超長鎖脂肪酸の合成経路においても、既存のァシル基とマロ二ルー CoAとの縮合反応が鎖長延長の律速反応と考えられる。
[0050] また、新規脂肪酸合成では ACPに結合したァシル基に対して鎖長伸長が行われ たが、超長鎖脂肪酸合成経路では、鎖長延長には ACPを必要としない。近年、シロ ィヌナズナゃホホバ（Simmondsia chinensis)から鎖長延長反応の最初の縮合反応を になう酵素遺伝子、 FAE1 (Plant Cell, 7, p309 (1995))や KCS遺伝子（Plant Cell, 8， p281 (1996))が得られ、 C20以上の飽和脂肪酸合成に関与していることが示された 。なお、酵母や動物、カビなどで報告されている ELOファミリーの脂肪酸鎖長延長酵 素（J. Biol. Chem., 271, pl8413 (1996)、 J. Biol. Chem., 272, pl7376 (1997) )と植 物の FAE1/KCSファミリーの鎖長延長酵素は一次配列の上で全く類似性を持たな レ、。
[0051] また、貯蔵脂質の大部分は TAGである。この TAGは、細胞質から供給される G3P が順次ァシル化されて生成する。この TAGにおける 3つのァシル基は、それぞれ別 のァシル基転移酵素によってグリセロール骨格に転移される力 S、このうち sn_2位へ のァシル基転移をになうリゾフォスファチジン酸ァシル基転移酵素（LPAAT)には一 般に高い基質特異性があり、このことが貯蔵脂質の脂肪酸組成を決定する 1つの要 因となっていると考えられている。
[0052] また、 TAGは、前項で述べた真核生物型経路で合成される主要脂質である PCを もとにした経路でも生成される。この TAGは、滑面小胞体の膜上で合成され、脂質二 重膜の間に蓄積される。 TAGを蓄積して膨らんだ部分は、やがてオイルボディーとよ ばれる脂質一重膜に囲まれた球状体として小胞体力 遊離する。植物によっては、 C 16、 C18よりも短レ、、あるいは長い中鎖 ·超長鎖脂肪酸や、水酸化やエポキシ化され た特殊な脂肪酸を多量に生成するものがあるが、これらの特殊な脂肪酸はほとんど が TAGの形で存在する。どのような機構によって、このような制御が行われているか は現在のところ明確ではなレ、が、高い基質特異性を有するホスホリパーゼゃァシル 基転移酵素の存在などが示唆されている。このことは、本来その植物が持たない脂 肪酸を高レベルで生産させる場合に結果を予測できなくさせている要因の 1つである 。以上の知見を踏まえつつ、本発明について説明する。
[0053] 本発明は、ァラキドン酸を含有する油脂原料植物体およびその利用に関するもの である。本発明によって得られる油脂原料植物体では、ァラキドン酸が生産されるた め、ァラキドン酸を含有する油脂原料植物体を生産することができる。以下の説明で は、本発明にかかるァラキドン酸を含有した油脂原料植物体 (説明の便宜上、ァラキ ドン酸含有植物体と称する場合もある）の生産方法について説明し、これにより得ら れる油脂原料植物体、およびその利用について順に説明する。
[0054] 〔1〕ァラキドン酸含有植物体の生産方法
本発明に係るァラキドン酸植物体やダイズの生産方法は、ァラキドン酸生合成に関 与する脂肪酸合成酵素遺伝子を植物体に導入することにより、ァラキドン酸を生産さ せるァラキドン酸生産工程を含むものであればよぐその他の具体的な工程、条件、 材料などは特に限定されるものではない。まず、「脂肪酸合成に関与する酵素」につ いて説明する。
[0055] 〔1一 1〕脂肪酸合成に関与する酵素
本発明に用レ、られる脂肪酸合成酵素としては、例えば、ァラキドン酸生合成に関与 する脂肪酸合成酵素のうち、宿主となる植物体に存在しない脂肪酸合成酵素を挙げ ること力 Sできる。高等植物は、一般的にステアリン酸からリノール酸またはひ_リノレン 酸を生合成する酵素群を有しているため、かかる脂肪酸合成酵素は、より詳細には、 リノール酸またはひ—リノレン酸からァラキドン酸を生合成するために必要な酵素であ る。これらの酵素としては、具体的には、 Δ 6不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素（ 以下、単に鎖長延長酵素と称する場合もある）、 Δ 5不飽和化酵素の 3種類の酵素を 挙げ'ること力 Sできる。
[0056] ここで、 「 Δ 6不飽和化酵素」とは、脂肪族モノカルボン酸の Δ 6位（カルボキシ末端 の炭素から数えて 6番目の炭素）に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有 するタンパク質をいう。 「脂肪酸鎖長延長酵素」とは、脂肪族モノカルボン酸の炭素鎖 を延長する反応を触媒する機能を有するタンパク質をいう。 「 Δ 5不飽和化酵素」とは 、脂肪族モノカルボン酸の Δ 5位 (カルボキシ末端の炭素から数えて 5番目の炭素） に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質をいう。なお、ここ でいう「不飽和結合」とは炭素-炭素二重結合（C = C)のことである。例えば、高等植 物のダイズ（Glycine max)において、ァラキドン酸を生産させるためには、上記 3種類 の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子を構成的あるいは種子特異的プロモーターに 連結し導入すればよい。
[0057] また、高等動物ではステアリン酸からミード酸（C20： 3)に至る n— 9経路は存在する 1S リノール酸や α _リノレン酸は合成できないため、これらを植物油力 摂取する必 要がある。一方、モルティエラ属（Mortierella)などの一部の真菌類や線虫などの下 等動物は、高等植物と高等動物の両方の経路を併せもち、ァラキドン酸や EPAを生 産できる。
[0058] したがって、上記 Δ 6不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素の 3 種類の酵素は、高等動物またはモルティエラなどの微生物由来のものを利用すること ができる。なかでも、モルティエラ属の糸状菌は高度不飽和脂肪酸の発酵生産に利 用されており、その生合成系の研究も進んでいる。特に、モルティエラ アルピナ（ Mortierella alpina)は、リノール酸やひ—リノレン酸などを経由してァラキドン酸を蓄積 する n— 6系生合成経路を主要経路として有する。なお、モルティエラ アルピナにお けるァラキドン酸生合成経路において、リノール酸や α—リノレン酸の生合成経路は、 高等植物と同様である。一方、リノール酸からァラキドン酸が合成される経路では、ま ず、リノール酸が Δ 6不飽和化酵素により γ—リノレン酸が生成され、次いで、脂肪酸 鎖長延長酵素（GLELO)によりジホモ- y—リノレン酸が生成され、続いて Δ 5不飽 和化酵素によりァラキドン酸へと変換される。
[0059] また、モルティエラ アルピナから、ステアリン酸からァラキドン酸にいたる生合成経 路に関わるすべての酵素をコードする遺伝子が既に単離されている。 Δ 5不飽和化 酵素遺伝子（J Biol Chem. 273, pl9055(1998))および Δ 6不飽和化酵素による生成 物である Ί—リノレン酸ゃステアリドン酸（C 18： 4)に特異的に作用する脂肪酸鎖長延 長酵素の遺伝子（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97， p8284 (2000) )は、本菌から最 初に単離された。なお、脂肪酸の鎖長延長は縮合、水酸化、脱水、還元の 4つの反 応による力 基質特異性を示すのは最初の縮合反応であるといわれている。
[0060] このモルティエラ アルピナ由来の Δ 6不飽和化酵素は、配列番号 1に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質であり、脂肪族モノカルボン酸の Δ 6位に不飽和結合を 導入する反応を触媒することが知られている。また、本発明で用いられる Δ 6不飽和 化酵素としては、配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する Δ 6不飽和化酵素に限 定されるものではなぐ脂肪族モノカルボン酸の Δ 6位に不飽和結合を導入する反応 を触媒する機能を有するタンパク質であればよい。具体的には、配列番号 1に示され るアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は 付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有してレ、れば本 発明にて用いることができる。なお、本発明でいう「配列番号 1に示されるアミノ酸配 列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、揷入、及び/又は付加されたァ ミノ酸配歹 1 における「1個又は数個」の範囲は特に限定されなレ、が、例えば、 1個一 2 0個、好ましくは 1個一 10個、より好ましくは 1個一 7個、さらに好ましくは 1個一 5個、 特に好ましくは 1個一 3個を意味する。
[0061] 上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、 当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配 列に変異を導入するには、 Kunkel法または Ga卯 ed duplex法等の公知手法又はこれ に準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した 変異導入用キット（例えば Mutant-Kや Mutant-G (何れも商品名、 TAKARA社製）） 等を用いて、あるいは LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、 TAKAR A社製）を用いて異変が導入される。
[0062] また、モルティエラ アルピナ由来の脂肪酸鎖長延長酵素は、配列番号 3に示され るアミノ酸配列を有するタンパク質であり、脂肪族モノカルボン酸の脂肪酸鎖長を延 長する反応を触媒することが知られている。また、本発明で用いられる脂肪酸鎖長延 長酵素としては、配列番号 3に示されるアミノ酸配歹 1Jを有する脂肪酸鎖長延長酵素に 限定されるものではなぐ脂肪族モノカルボン酸の脂肪酸鎖長を延長する反応を触 媒する機能を有するタンパク質であればよい。具体的には、配列番号 3に示されるァ ミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、揷入、及び Z又は付加 されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明 にて用いることができる。
[0063] また、モルティエラ アルピナ由来の Δ 5不飽和化酵素は、配列番号 5に示されるァ ミノ酸配列を有するタンパク質であり、脂肪族モノカルボン酸の Δ 5位に不飽和結合 を導入する反応を触媒することが知られている。また、本発明で用いられる Δ 5不飽 和化酵素としては、配列番号 5に示されるアミノ酸配列を有する Δ 5不飽和化酵素に 限定されるものではなぐ脂肪族モノカルボン酸の Δ 5位に不飽和結合を導入する反 応を触媒する機能を有するタンパク質であればよい。具体的には、配列番号 5に示さ れるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又 は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば 本発明にて用いることができる。
[0064] また、本発明に係る植物体の生産方法には、後述するように、公知の遺伝子組み 替え技術を利用して、上記 Δ 6不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化 酵素をコードする遺伝子を好適に用いることができる。上記 Δ 6不飽和化酵素をコー ドする遺伝子 (説明の便宜上、 Δ 6不飽和化酵素遺伝子と称する）としては特に限定 されるものではなレ、が、具体的な一例としては、例えば、モルティエラ アルピナ由来 の Δ 6不飽和化酵素を用いる場合には、この Δ 6不飽和化酵素をコードする遺伝子 を挙げることができる。 Δ 6不飽和化酵素遺伝子の具体的な一例としては、例えば、 配列番号 2に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ORF)として含むポ リヌタレ才チドを挙げること力 Sできる。
[0065] もちろん、本発明で用いられる Δ 6不飽和化酵素遺伝子としては、上記の例に限定 されるものではなぐ配列番号 2に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であつ てもよい。具体的には、例えば、配列番号 2に示される塩基配列からなる遺伝子と相 補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジ工ントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂 肪族モノカルボン酸の Δ 6位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有する タンパク質をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、本発明でいう「ストリン ジェントな条件」とは、少なくとも 90%の同一性、好ましくは少なくとも 95%の同一性、 より好ましくは少なくとも 97。/0の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダィゼ ーシヨンが起こることを意味する。
[0066] 上記ハイブリダィゼーシヨンは、 J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に己載されてレヽ る方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低 いほどストリンジエンシーは高くなる（ハイブリダィズし難くなる）。
[0067] また、上記脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子 (説明の便宜上、脂肪酸鎖長 延長酵素遺伝子と称する）としては特に限定されるものではなレ、が、具体的な一例と しては、例えば、モルティエラ アルピナ由来の脂肪酸鎖長延長酵素を用いる場合に は、この脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。脂肪酸鎖長 延長酵素遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号 4に示される塩基配列 をオープンリーディングフレーム（ORF)として含むポリヌクレオチドを挙げることがで きる。なお、本発明でいう ORFとは、開始コドンから終止コドンの直前までの範囲をい う。
[0068] さらに、本発明で用レ、られる脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子としては、上記の例に限 定されるものではなぐ配列番号 4に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であ つてもよい。具体的には、例えば、配列番号 4に示される塩基配列からなる遺伝子と 相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジ工ントな条件でハイブリダィズし、かつ、 脂肪族モノカルボン酸の鎖長を延長する反応を触媒する機能を有するタンパク質を コードする遺伝子等を挙げることがでさる。
[0069] また、上記 Δ 5不飽和化酵素をコードする遺伝子 (説明の便宜上、 Δ 5不飽和化酵 素遺伝子と称する）としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、 例えば、モルティエラ アルピナ由来の Δ 5不飽和化酵素を用いる場合には、この Δ 5不飽和化酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。 Δ 5不飽和化酵素遺伝子 の具体的な一例としては、例えば、配列番号 6に示される塩基配列をオープンリーデ イングフレーム（〇RF)として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
[0070] もちろん、本発明で用いられる Δ 5不飽和化酵素遺伝子としては、上記の例に限定 されるものではなぐ配列番号 6に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であつ てもよい。具体的には、例えば、配列番号 6に示される塩基配列からなる遺伝子と相 補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジ工ントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂 肪族モノカルボン酸の Δ 5位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有する タンパク質をコードする遺伝子等を挙げることができる。
[0071] 上記遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなぐ従来公知の方法により 、多くの動物、微生物、または植物から単離することができる。例えば、既知の酵素の 塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を 用いて、植物の cDNA又はゲノミック DNAを铸型として PCRを行うこと等により上記 遺伝子を得ることができる。また、上記遺伝子は、従来公知の方法により化学合成し て得ることちできる。
[0072] 〔1一 2〕本発明に力かるァラキドン酸ダイズの生産方法の一例
本発明にかかるァラキドン酸ダイズの生産方法は、上記〔1—1〕欄で説明した脂肪 酸合成酵素遺伝子を植物体に導入し、ァラキドン酸を生産させる工程を含んでレ、れ ば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的なェ 程で示せば、例えば、組換え発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の 工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形 質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
[0073] 〔1一 2— 1〕組換え発現ベクター構築工程 本発明において行われる組換え発現ベクター構築工程は、上記〔1一 1〕欄で説明し た脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子と、プロモーター（配列）とを含む組換え発現 ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
[0074] 上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のべクタ 一を用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いること ができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的 には、例えば、 pBR322、 pBR325、 pUC19、 pUC119、 pBluescript, pBluescriptS K、 pBI系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法が ァグロバタテリゥムを用いる方法である場合には、 pBI系のバイナリーベクターを用い ることが好ましい。 pBI系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、 pBIG 、 pBIN19、 pBI101、 pBI121、 pBI221等を挙げ、ること力 Sできる。
[0075] 上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターで あれば特に限定されるものではなぐ公知のプロモーターを好適に用いることができ る。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモー ター（CaMV35S)、ァクチンプロモーター、ノパリン合成酵素（ノパリンシンターゼ）の プロモーター、タバコの PRla遺伝子プロモーター、トマトのリブロース 1, 5—二リン酸 カルボキシラーゼ'ォキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる 。この中でも、カリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーターまたはァクチンプロモー ターをより好ましく用いることができる。また、ダイズで機能するプロモーターとしては ダイズ種子の貯蔵タンパク質コングリシニンのプロモーターを好適に用いることができ る。さらに、上記プロモーターは、構成的プロモーターであってもよいし、あるいは組 織特異的なプロモーターであってもよレ、。上記各プロモーターを用いれば、得られる 組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現 させることが可能となる。なかでも、種子特異的プロモーターが好ましい。すなわち、 種子特異的プロモーターの下流領域に、ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成 酵素をコードする遺伝子を連結することが好ましい。より詳細には、 Δ 6不飽和化酵 素、脂肪酸鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素の 3種類の酵素をそれぞれ種子特異 的プロモーターの下流域に連結する場合を挙げることができる。例えば、ダイズ種子 特異的プロモーターとして、後述する実施例に示すようにコングリシニンプロモーター などが挙げられる。これにより、効率的かつ安定にァラキドン酸生合成に関与する酵 素を発現させることができ、ァラキドン酸を安定に生産させることができる。
[0076] 上記プロモーターは、上記〔1一 1〕欄で説明した脂肪酸合成酵素をコードする遺伝 子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよぐ組換え発現べク ターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
[0077] なお、脂肪酸合成酵素として、例えば、 Δ 6不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素、
Δ 5不飽和化酵素の 3種類の酵素を宿主植物にて発現させる場合、それぞれの酵素 が発現されるように、これら 3種類の酵素を同一のベクター上に配置した組換え発現 ベクターを用いて形質転換してもよいし、また、 3つのベクター上に、 Δ 6不飽和化酵 素、脂肪酸鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素の 3種類の酵素をそれぞれ配置し、こ れら 3つのベクターを同時に形質転換し、宿主植物細胞内にて、 3種類の酵素を別 々に発現させる方法を用いてもよいが、特に、 3種類の酵素を同一のベクター上に配 置した組換え発現ベクターを用いることがより好ましい。なお、 Δ 6不飽和化酵素、脂 肪酸鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素の 3種類の酵素を同一のベクター上に配置し た組換え発現ベクターを用いる場合は、これら 3種類の遺伝子が同じ向きに転写され るように配置されることが好ましいが、これに限られるものではなぐたとえ逆向きに転 写される場合でも、上記 3種類の酵素が宿主植物にて発現すれば本工程に用いるこ とができる。
[0078] 上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記脂肪酸合成酵素遺伝 子に加えて、さらに他の DNAセグメントを含んでいてもよい。当該他の DNAセグメン トは特に限定されるものではなレ、が、ターミネータ一、選別マーカー、ェンハンサー、 翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現べ クタ一は、さらに T一 DNA領域を有していてもよレ、。 T一 DNA領域は特にァグロバクテ リウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効 率を高めることができる。
[0079] ターミネータ一は転写終結部位としての機能を有してレ、れば特に限定されるもので はなぐ公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の 転写終結領域（Nosターミネータ一）、カリフラワーモザイクウィルス 35Sの転写終結 領域（CaMV35Sターミネータ一）、マノピン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Mas ターミネータ一）等を好ましく用いることができる。この中でも Nosターミネータ一ある いは Masターミネータ一をより好ましく用いることできる。
[0080] 上記組換え発現ベクターにおいては、ターミネータ一を適当な位置に配置すること により、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロ モーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止すること ができる。
[0081] 上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる 薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシ ン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフエ二コール等に対する薬剤耐性遺伝子 を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を 選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
[0082] 上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウィルス由 来の omega配列を挙げることができる。この omega配列をプロモーターの非翻訳領 域（5' UTR)に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることが できる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまな DN Aセグメントを含ませることができる。
[0083] 上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなぐ適宜 選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、脂肪酸合成酵素をコードする 遺伝子、および必要に応じて上記他の DNAセグメントを所定の順序となるように導 入すればよい。例えば、 Δ 6不飽和化酵素をコードする遺伝子、脂肪酸鎖長延長酵 素をコードする遺伝子、 Δ 5不飽和化酵素をコードする遺伝子が発現されるように、こ れら 3種類の酵素遺伝子を連結し、次に、これら脂肪酸合成酵素遺伝子とプロモータ 一と（必要に応じてターミネータ一等）とを連結して発現カセットを構築し、これをべク ターに導入すればよい。なお、上述したように、 3種類の遺伝子を同一ベクター上に 配置する必要は無ぐ例えば、 3つのベクターに別々に 3種類の遺伝子を配置しても よいことはいうまでもない。 [0084] 3種類の脂肪酸合成酵素遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、 各 DNAセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーシヨン 酵素で反応させることで、当該 DNAセグメントの順序を規定することが可能となる。な お、発現カセットにターミネータ一が含まれる場合には、上流から、プロモーター、上 記脂肪酸合成酵素遺伝子、ターミネータ一の順となっていればよい。また、組換え発 現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーシヨン酵素等の 種類についても特に限定されるものではなぐ市販のものを適宜選択して用いればよ レ、。
[0085] また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法)も特に限定されるものでは なぐ従来公知の方法を用レ、ることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大 腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の 種類を選択してもよい。
[0086] 〔1一 2 - 2〕形質転換工程
本発明におレ、て行われる形質転換工程は、上記〔 1一 2— 1〕欄で説明した組換え発 現ベクターを植物細胞に導入して、上記〔1一 1〕欄で説明した脂肪酸合成酵素を生 産させるようになってレ、ればよレ、。
[0087] 上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法 (形質転換方法）は特に限定 されるものではなぐ植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる 。具体的には、例えば、ァグロバタテリゥムを用いる方法や直接植物細胞に導入する 方法を用いることができる。ァグロバタテリゥムを用いる方法としては、例えば、
Transformation of Arabidopsis thahana by vacuum
infiltration(http://www. bch.msu.edu/ pamgreen/ protocol.htmを用レヽること力 Sできる。
[0088] 組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロイ ンジヱクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法 、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることがで きる。
[0089] 上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の 植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。 [0090] ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクター は、生産しょうとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、 汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよ レ、。すなわち、本発明に力、かる植物体の生産方法においては、上記〔1—2—1〕で説 明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよ レ、。
[0091] また、宿主植物に Δ 15不飽和化酵素が含まれている場合は、この Δ 15不飽和化 酵素の発現を抑制することが好ましい。これは、図 1に示すように、ダイズ内にて生産 されたリノール酸が Δ 15不飽和化酵素によってひ—リノレン酸に変換されてしまう。こ のため、ダイズ内で生産された全てのリノール酸をァラキドン酸の前駆物質である γ —リノレン酸に変換させるためには、この Δ 15不飽和化酵素の発現を抑制することが 好ましいためである。この Δ 15不飽和化酵素の発現を抑制する方法としては、従来 公知の遺伝子工学的手法である、アンチセンス法、センス（コサプレツシヨン）法、二 本鎖 RNAを転写させる RNAi法を利用することができ、特に限定されるものではない 力 例えば、後述する実施例に示すように RNAi法を用いることが好ましい。この方法 によれば、簡便かつ確実に Δ 15不飽和化酵素遺伝子の発現を抑制することができ る。つまり、本発明のァラキドン酸生産工程には、宿主の Δ 15不飽和化酵素の発現 を抑制する発現抑制工程が含まれることが好ましぐさらには、上記発現抑制工程は 、 RNAi法によって Δ 15不飽和化酵素の発現を抑制する工程であることがより好まし レ、といえる。
[0092] 〔1一 2— 3〕その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれてい ればよぐさらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに 他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質 転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
[0093] 選抜の方法は特に限定されるものではなぐ例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬 剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのもの 、または任意の器官や組織に含まれるァラキドン酸含有量から選抜してもよい。また、 例えば、 GFPなどの蛍光性タンパク質を同時に形質導入し、視覚的に選抜すること も可能である。
[0094] 本発明にかかる植物体の生産方法では、上記脂肪酸合成酵素遺伝子を植物体に 導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により単にァラキドン酸を含 有する子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種 子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体 を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、 選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
[0095] なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カル ス、種子の少なくとも何れかが含まれる。また、この繁殖工程にて繁殖した植物体の 子孫も本発明に含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させるこ とができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種 々の形態の植物細胞が含まれる。力かる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞 、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖 '分化させることに より植物体を得ること力 Sできる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の 種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にか かる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれ ていてもよい。
[0096] また、本発明にかかる植物体の生産方法は、組換え発現ベクターで形質転換する 方法に限定されるものではなぐ他の方法を用いてもよレ、。具体的には、例えば、上 記脂肪酸合成酵素そのものを植物体に投与してもよい。この場合、最終的に利用す る植物体の部位においてァラキドン酸を含有できるように、若年期の植物体に脂肪酸 合成酵素を投与すればよい。また脂肪酸合成酵素の投与方法も特に限定されるもの ではなぐ公知の各種方法を用いればよい。
[0097] 〔2〕本発明により得られるァラキドン酸植物体やダイズとその有用性、並びにその利 用
本発明にかかるァラキドン酸植物体やダイズの生産方法では、ァラキドン酸生合成 に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を植物体やダイズに導入する。これにより、ァラキ ドン酸の合成系に関与する脂肪酸合成酵素が発現され、当該脂肪酸合成酵素が本 来高等植物には存在しないァラキドン酸生合成経路により、ァラキドン酸を生産する ことになる。その結果、得られる植物体はァラキドン酸を含有することになる。したがつ て、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる、ァラキドン酸を含有する植 物体やダイズが含まれる。
[0098] 〔2— 1〕本発明の有用性
本発明では、植物体にァラキドン酸を生産させることができる力 本発明の有用性 は特に限定されるものではなぐァラキドン酸を含む植物体をそのまま農作物、食品 等として流通させることも可能であるし、さらに、該植物体からァラキドン酸を抽出して 、このァラキドン酸を利用することができる。すなわち、本発明には、上記植物体の生 産方法によって生産された植物体から得られるァラキドン酸も含まれる。
[0099] ここで、上記ァラキドン酸を含有する油脂原料植物体からァラキドン酸を取得する 方法は、特に限定されるものではなぐ従来公知の抽出 ·精製方法を利用することが できる。例えば、形質転換ダイズから大豆油を取得する要領で油を搾り取り、そこから ァラキドン酸を分離 ·精製する方法を挙げることができる。
[0100] また、後述の実施例に示すように、本発明に係る形質転換ダイズでは、その改変さ れた形質が次世代まで引き継がれることが実験的に確認されている。これは、本発明 に係る形質転換ダイズを栽培することにより、ァラキドン酸を含有するダイズを大量に 生産可能なことを意味している。したがって、非常に産業上有用な発明であるといえ る。
[0101] また、上述したように、ァラキドン酸は、動物の体内で様々な機能を示すほカ プロ スタグランジン類の直接の前駆体としても重要な役割を果たすことが知られている。さ らに、ァラキドン酸は老人性痴呆症に対する改善効果も認められている。このため、 ァラキドン酸含有植物体または該植物体から得られるァラキドン酸は、老人性痴呆症 に対する改善効果を謳った組成物 (例えば、油脂組成物）、食品 (健康食品など)や 医薬品などへの応用が可能である。ここで、「組成物」とは、ァラキドン酸以外にどの ような成分が含まれていてもよぐ特に限定されるものではない。例えば、ァラキドン酸 以外の油脂成分として PC、 DHA、 EPAなど PUFAなどが含まれていてもよレ、。また 、ここでいう「食品」とは、経口摂取により体内に取り込まれるものであればよぐ錠剤、 液体、粉末などの剤型などは限定されるものではない。例えば、体内にて可溶する力 プセルにァラキドン酸を含有する油脂組成物を包含させて健康食品とすることができ る。
[0102] 〔2— 2〕本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発 明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわちァラキドン酸含有植物体 作製キットを挙げることができる。
[0103] このァラキドン酸含有植物体作製キットの具体例としては、上記脂肪酸合成酵素を コードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよぐ上記組 換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましレヽ 。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファ一等を挙げることが できる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよ レ、。
[0104] 本発明に係るァラキドン酸含有植物体作製キットによれば、容易に上記植物体の 生産方法を実施することができ、確実かつ簡易にァラキドン酸を含有する植物体を生 産すること力 Sできる。
[0105] 以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん 、本発明は以下の実施例に限定されるものではなぐ細部については様々な態様が 可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるも のではなぐ請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された 技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲 に含まれる。
[0106] 〔実施例〕
〔I〕脂肪酸の分析
脂質の抽出'分析は、公知の方法 (藤野安彦編（1978)生物化学実験法 9学会出版 センター、山田晃弘編（1989)生物化学実験法 24学会出版センター）にしたがった。 まず、閉鎖系温室で栽培した形質転換タバコより葉を 1枚根元より切り取った。切り取 つた葉は秤量した後水洗し、ハサミを用いて 5mm角に切断した。切断した葉約 lgを ステンレス製の 50mlのカップに入れ、クロ口ホルム/メタノール（1 : 2)溶液 35ml、ガ ラスビーズ（直径 0· 4mm) 7. 5mlを入れ、ホモジナイザー（CELL MASTER CM_ 100、井内製作所）にて、 10, 000回転 X 10分間の処理を行った。
[0107] カップの内容物は、ろ紙にてろ過し、ろ液が 90mlになるまで残渣をクロ口ホルム/ メタノール（1 : 2)溶液で洗浄.ろ過を繰り返した。ろ液は 22. 5mlずつ 50ml容のガラ ス製遠心管に分注し、各遠心管にクロ口ホルム 7. 5ml、 1%KC1水溶液 13. 5mlを 添加した。遠心管は 10分間激しく撹拌した後、 3, OOOrpmで 20分間遠心した。溶液 は 2層に分かれ、そのうち下層のクロ口ホルム層を回収した。クロ口ホルム層は、あら 力、じめ秤量してレ、たねじ口試験管（ φ 16mm X 125mm)に移し、スピードバック（ SAVANT社 SC210)にて溶媒を蒸発除去した。ねじ口試験管の重さを量り試験管の 重さとの差より回収された脂質の量を求めた。
[0108] ねじ口試験管中の約 4mgの油脂に 10%塩酸メタノール 2ml、ジクロロメタン lmlを 添加し、フタをした後 50°C、 3時間の加熱処理を行い、脂質を脂肪酸メチルエステル とした。この反応後、蒸留水 lml、へキサン 4mlを添加し、 5分間激しく撹拌した後、 3 , 000回転 X 5分間の遠心処理を行った。上層のへキサン層を別の試験管に回収し 、スピードバックにてへキサンを蒸発除去した。この操作を 2回繰り返し、脂肪酸メチ ルエステルを回収した。脂肪酸メチルエステルは 50 μ ΐのァセトニトリルに溶解し、ガ スクロマトグラフィー（Hewlett Packard社 HP-6800)で分析した。分析条件は下記表 1 に示す。
[0109] [表 1]
ガスク ロマ トグ' ィー分析条件
Figure imgf000028_0001
クロマトグラム中の各ピークは標準脂肪酸のメチルェ；
C-MASS (Hewlett Packard社 HP- 5973)分析により決定し、またピーク面積より各脂 肪酸の割合を決定した。
[0110] 〔II〕タバコにおけるモルティエラ アルピナ（M.alpina)由来の遺伝子の発現
〔II - 1〕 Δ 6不飽和化酵素遺伝子の発現
pE21 13 (Plant Cell Physiol. 37, P45 (1996))は、ェンハンサー配列を繰り返した力 リフラワーモザイクウィルス 35S (E1235S)プロモーターとノパリンシンターゼ (nos)タ 一ミネ一ターとを有するプラスミドベクターである。この pE21 13を SnaBIで消ィ匕し、 X hoiリンカ一（TAKARA)を挿入することにより得られたプラスミドをさらに Saclで消化 •平滑末端化した後、 BamHIリンカ一（TAKARA)を挿入し pUE7を得た。
[0111] pUE7を Hindlllと EcoRIとで消化することによって得られる DNA断片のうち、 E12 35Sプロモーターを有する断片と、 Hindlllと EcoRIとで消化した植物形質転換用バ イナリーベクター pBINPLUS (Transgenic research 4, p288, (1995))とを連結するこ とにより、 pSPB505を得た。一方、モルティエラ由来の Δ 6不飽和化酵素遺伝子を 含むプラスミド PMLD 101を Xholにて消化後、 BamHIにて部分消化して得られる約 1. 6kbの DNA断片を回収した。この DNA断片と、 pSPB505を Xholと BamHIで消 化して得られるバイナリーベクター部分の DNA断片と連結し、 pSPB559を得た。こ のプラスミドにおいてモルティエラ Δ 6不飽和化酵素遺伝子は E1235Sプロモーター と nosターミネータ一の制御下にある。 [0112] 公知の方法（Plant J. 5， 81， (1994))に基づいて、 pSPB559をァグロバタテリゥムに 導入し、この組換えァグロバタテリゥムを用いてタバコに導入した。公知の方法（Plant J. 5, 81，（1994))に基づいて、得られた組換えタバコの葉力ら RNAを抽出し、ノザン ハイブリダィゼーシヨンによりモルティエラ由来の Δ 6不飽和化酵素遺伝子を発現し ている系統を選択した。上記〔I〕欄に記載の方法で、これらのタバコの葉の脂肪酸を 分析したところ、組換えタバコの葉では宿主のタバコにはない γ—リノレン酸が 1. 8 7. 3。/0含まれていた。この結果から、モルティエラ由来の Δ 6不飽和化酵素遺伝子が 植物で機能することがわかった。
[0113] 〔II - 2〕 Δ 6不飽和化酵素遺伝子および脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の共発現
pUCAP (Transgenic research 4, p288, (1995))を Asclで消化し、平滑末端化し、 P aclリンカーを揷入することにより、 pUCAPPとした。 pE2113を SnaBIで消ィ匕し、 Ba mHIリンカ一（TAKARA)を揷入することにより、 pUE6を得た。この pUE6を Saclで 消化し、平滑末端化し、 Sailリンカ一 (TAKARA)を挿入して pUE8を得た。
[0114] このプラスミド pUE8を Hindlllと EcoRIとで消化して得られる DNA断片のうち E123 5Sプロモーターを有する断片を pUCAPPの Hindlll— EcoRIサイトに挿入した。この プラスミドを BamHIおよび Sailで消化した DNA断片と、脂肪酸鎖延長酵素の cDN Aを BamHIおよび Xholで消化して得られる DNA断片とを連結し、 pSPB1130を得 た。このプラスミド pSPB1130を Paclで消化し、得られる約 2· 3kbの DNA断片を pB inPLUSの Paclサイトに挿入した。脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子と pBinPLUS上の n ptll遺伝子との転写方向が同じ向きになっているプラスミドを選択し、 pSPB1157Pと した。
[0115] また、 PSPB599を Paclで消化した後平滑末端化し、 Asclリンカーを揷入し、 pSP B599Aとした。この pSPB599Aを Asclで消化して得られる Δ 6不飽和化酵素遺伝 子を含む DNA断片を pSPB1157Pの Ascl部位に揷入し、 pSPB1157を得た。
[0116] このバイナリープラスミド pSPB1157を上述のようにタバコに導入し、形質転換タバ コを取得した。その結果、脂肪酸鎖長延長酵素と Δ 6不飽和化酵素の遺伝子が発現 しているタバコの葉では、全脂肪酸量の 0. 1 5%の割合でジホモ _ γ—リノレン酸の 生産が確認された。一方、形質転換していない宿主タバコの葉にはジホモ _ γ _リノ レン酸は認められな力つた。この結果から、モルティエラ由来の Δ 6脂肪酸不飽和化 酵素遺伝子および脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を同一ベクター上に配置したバイナ リープラスミドを用いて形質転換したタバコにおいて、 Δ 6脂肪酸不飽和化酵素と脂 肪酸鎖長延長酵素とが共発現するとともに、機能を発揮することがわかった。
[0117] 〔II一 3〕 Δ 6不飽和化酵素遺伝子と脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子と Δ 5不飽和化酵 素遺伝子との共発現
pCGPl 364 (Plant Cell Physiol. 36, pl023, (1995))を Hindlllと SacIIで消化して 得られる約 1. 3kbの DNA断片と、 pCGP1364を Pstlで消化し、平滑末端化した後 SacIIで消化して得られる約 2. 9kbの DNA断片と、 pUCAPAを Saclで消化し、平 滑末端化した後 Hindlllで消化して得られる約 2. 7kbの DNA断片とを連結すること により、 pSPB184を得た。これを Xbalと Kpnlで消化し、 pCR2にサブクローニングし てある Δ 5不飽和化酵素遺伝子断片を Xbalと Kpnlで消化して回収し、これらの DN A断片を連結し、 pSPB1519Aを得た。
[0118] この pSPB1519Aを Asclで消化し、 pSPB1157の Ascl部位に挿入し、 pSPB151 9を得た。このプラスミド pSPB1519上で ptll、 Δ 5不飽和化酵素遺伝子、鎖長延長 酵素遺伝子、 Δ 6不飽和化酵素遺伝子は同じ向きに転写され、 Δ 5不飽和化酵素遺 伝子、鎖長延長酵素遺伝子、 Δ 6不飽和化酵素遺伝子は構成的プロモーターの制 御下にある。
[0119] 上述と同様な方法で、 PSPB1519を用いて形質転換されたタバコを取得し、 Δ 5不 飽和化酵素遺伝子、鎖長延長酵素遺伝子、 Δ 6不飽和化酵素遺伝子が発現してい る形質転換タバコを同定した。この形質転換タバコの葉の脂肪酸を分析したところ、 ァラキドン酸の生産は認められなかった。この結果から、 Δ 5不飽和化酵素遺伝子、 鎖長延長酵素遺伝子、 Δ 6不飽和化酵素遺伝子が転写されているにもかかわらず、 ァラキドン酸が合成されなかったのは、この形質転換タバコにおいては、ァラキドン酸 の生産のためには Δ 5不飽和化酵素遺伝子、鎖長延長酵素遺伝子、 Δ 6不飽和化 酵素遺伝子が転写されるだけでは不十分であることを示している。
[0120] 〔II一 4〕 Δ 5不飽和化酵素の機能確認
前述のように、形質転換タバコの葉では Δ 5不飽和化酵素遺伝子が転写されてい たにもかかわらず、ァラキドン酸が生産されなかった。その原因として、 Δ 5不飽和化 酵素の基質となるジホモ _ γ _リノレン酸の量が不足している可能性と、 Δ 5不飽和化 酵素が機能してレ、なレ、可能性が考えられた。
[0121] そこで、 pSPB 1 51 9形質転換タバコに対して、外部からジホモ— γ—リノレン酸を与 えることによって、ァラキドン酸が生産されるかどうかを解析した。解析方法は Qiuら (J. Biol. Chem. 276, p31561 (2001))の方法に従った。すなわち、新鮮重 l gのタバコ葉 を力ミソリの刃を用いて小片に切り刻み、シャーレ中で 10mlの 0. 05 %ジホモ _ γ—リ ノレン酸ナトリウム水溶液と 24°C、 4時間緩やかに振盪培養した。培養後、水で 3回洗 浄し、脂肪酸分析をおこなった。
[0122] その結果、形質転換体 2系統を用いた解析から、ジホモ _ γ _リノレン酸と共培養し た場合にァラキドン酸の合成が確認され、 Δ 5不飽和化酵素がタバコの葉で機能して レ、ることが示唆された。このこと力 、 pSPB l 51 9形質転換タバコでァラキドン酸が生 産されなかった原因は、 Δ 5不飽和化酵素の基質となるジホモ _ γ _リノレン酸が十分 量存在しなかったためと考えられた。
[0123] 〔III〕ダイズの形質転換
ダイズ（Glycine max)の培養は、基本的に Finerらの方法に従い（In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35 :451 (1999))、品種 Jackの未成熟子葉（3— 5mm)を誘導培地（30g/l sucrose, 40mg/l 2 , 4_D、 B5 vitamins添加 MS培地、 ρΗ7 · 0)で体細胞胚を誘 導した。
[0124] 誘導した体細胞 )3丕を液体増殖培地（l Og/l sucrose, l g/1 asparagine, 5mg/l 2 , 4_D、 FNLite培地、 pH5. 8)で増殖させた後、パーティクルガン法（直径 1 · Ο μ mの金粒子と 1 350dpiのラプチヤーディスク）で遺伝子を導入した。この遺伝子を導 入した体細胞胚を 1週間増殖培地で培養した後、 1 5mg/l、 30mgZl、 45mg/lの hygromycinを添加した増殖培地でそれぞれ 1ヶ月選抜してから、液体分化'成熟培 地（30g/l sucrose, 30g/l D_Glucitol、 298. 4mg/l L_methionine、 4. 38g/l L-glutamin, FNLite培地、 pH5. 8)に移植して再分化させた。選抜された体細胞胚 は、分化'成熟培地へ移すと、次第に大きさを増し (この段階は未熟胚に相当する）、 発達するに従って明確な子葉と胚軸とに分化して、成熟するに至った（この段階は成 熟胚に相当する)。成熟した体細胞胚を乾燥させてから発芽培地で発芽させ、完全 な植物体を取得した。なお、液体振蘯培養は、回転シェーカーで行い、振蘯速度は lOOrpmとした。
[0125] 〔IV〕多重遺伝子発現用ベクターの改良
既存のベクターにおける制限酵素認識部位のほとんどは 6塩基であり、 目的遺伝子 をプロモーター、ターミネータ一と組み合わせた複数の発現カセットを 1つのベクター に揷入する際には、 目的遺伝子の中に認識部位が存在し、制限酵素認識部位を利 用できない場合が多い。この場合、 8塩基の制限酵素認識部位を用いることで、この 問題を解決できると考え、 8塩基の制限酵素認識部位を 4ケ所追カロしたベクターを作 製した。具体的には、以下のように行った。
[0126] まず、 8塩基認識部位を 2ケ所持つ pUCAPを Asclで消化し Sgflリンカーを揷入、 さらに、 Paclで消化し Fselリンカーを揷入し、 8塩基認識の制限酵素認識部位を 4ケ 所有するプラスミド pUCSAPFを作製した。他にサブクローニング用として pUC19を Hindlllで消化し Sgflリンカ一を挿入、さらに、 EcoRIで消化し Asclリンカ一を挿入し たプラスミド pUCSA、 pUC19を Hindlllで消化し Paclリンカ一を挿入、さらに、 Eco RIで消化し Fselリンカ一を挿入したプラスミド pUCPF、 pUC19を Hindlllで消化し S gflリンカ一を挿入、さらに、 EcoRIで消化し Sgflリンカ一を挿入したプラスミド pUCS S、 pUCl 9を Hindlllで消化し Fselリンカ一を挿入、さらに、 EcoRIで消化し Fselリ ンカーを挿入したプラスミド pUCFFを作製した。
[0127] 〔V〕脂肪酸合成酵素遺伝子植物発現用ベクターの構築
ァラキドン酸生産用ベクターとして、モルティエラ由来の Δ 6不飽和化酵素、脂肪酸 鎖長延長酵素（GLELO)、 Δ 5不飽和化酵素の発現カセット、およびダイズ由来の Δ 15不飽和化酵素の RNAiカセットを種子特異的プロモーターと組み合わせ、脂肪 酸合成酵素遺伝子植物発現用ベクターを作製した。種子特異的プロモーターには ダイズ由来コングリシニンアルファ'サブユニットプロモーター (Pro Nat. Acad. Sci. USA, 83 p8560 (1986) )を用いた。具体的には、以下のように行った。
[0128] まず、 pUC19マルチクローニングサイトの Hindlllと Xbalとの間に PCRにより増幅 、制限酵素処理、精製したコングリシニンプロモーターを、 Saclと EcoRIとの間に PC Rにより増幅、制限酵素処理、精製したマノピン合成酵素遺伝子ターミネータ一を挿 入した（pSPB1904)。 PCR反応は目的配列をサブクローニングしてあるプラスミドを 铸型に行った。なお、 PCR反応に用いたプライマーは、コングリシニンプロモーター につレ、ては、プライマー HinCprof (5， -AGTCAAGCTTAATTCAAACAAAAACG-3 ' ) (配列番号 7)、と XbaCpror (5，-CAGTTCTAGAAAATTCTTTAATACGG_3，） ( 配列番号 8)とを使用した。また、マノピン合成酵素遺伝子ターミネータ一については 、プライマー Sacmasf (5' - AGTCGAGCTCCAGCTTCCCTGAAACC- 3' ) (配列番 号 9)と、 Ecomasr (5，-CATCATCTCGAGGGTGGTGACCATGGTGATCGC-3，） ( 配列番号 10)とを用いた。
[0129] サブクローユングに使用する PCRで増幅した DNA断片は全て、高精度で DNAを 増幅できる KOD +ポリメラーゼ (東洋紡株式会社)を用レ、、 94°Cで 2分間保持した後 、 94。C ' 15秒、 68°C ' l 3分のサイクルを 25サイクルの PCR反応によって調製した 。 pSPB1904の Xbalと Saclとの間に、 PCRで調製した Δ 5不飽和化酵素、 Δ 6不飽 和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素の各 DNA断片をサブクローニングし、それぞれ pS PB1909、 pSPB1910、 pSPB1911と命名した。
[0130] pSPB1909を HindIII、 EcoRIで消化して得た Δ 5不飽和化酵素カセットを pUCS Aに挿入し、また pSPB1911を HindIII、 EcoRIで消化して得た鎖長延長酵素カセ ットを pUCPFに挿入した。これらをそれぞれ pSPB1919、 pSPB1920と称する。さら に、この pSPB1919を Pacl、 Fselで消化して得た Δ 5不飽和化酵素カセットと、 pSP B1920を Sgfl、 Asclで消化して得た脂肪酸鎖長延長酵素カセットと、 pSPB1910を Hindlll, EcoRIで消化して得た Δ 6不飽和化酵素カセットとを pUCSAPFに組み込 んで、 3カセットを連結したプラスミド pSPB 1944を作製した。
[0131] また、 35Sプロモータ^ "―ハイグロマイシン耐性遺伝子— nosターミネータ一からなる HPTカセットは pUCFFの Hindlllサイトに、また 35Sプロモータ" ~_緑色蛍光タンパ ク質遺伝子— nosターミネータ一からなる GFPカセットは pUCSSの Sphlと EcoRIとの 間にそれぞれサブクローユングし、 pSPB1918, pSPB1935を作製した。 pPSB19 44の Fselサイトに pSPB1918力ら切り出した HPTカセットを、また Sgflサイトに pSP B1935力、ら切り出した GFPカセットを揷入し pSPB1852を作製した。 [0132] また、 Δ 15不飽和化酵素遺伝子（Accession No. P48625)をサブクローニングする ために、ダイズ未熟種子から抽出した全 RNAを用いて RT— PCRを行った。具体的 には、以下のように行った。
[0133] 逆転写反応はスーパースクリプトファーストストランド合成システム RT—PCR用（イン ビトロジヱン株式会社）を用いて、〇ligo(dT)12 18プライマーで行った。逆転写産 物を錡型とし、プライマー detl5— 2— Fl (5'
-ATGGTTAAAGACACAAAGCCTTTAGCC-3' ) (配列番号 11)と、 detl 5_2_Rl ( 5， -TCAGTCTCGTTGCGAGTGGAGG-3， ) (配列番号 12)とを用レ、て PCR反応を 行った。
[0134] PCR反応は 94°Cで 2分間保持した後、 94°C ' 30秒、 55°C ' 30秒、 72°C ' 30秒一 1 分のサイクルを 30サイクル行レ、、さらに 72°Cで 1分間保持した。増幅された DNA断 片を TOPOクローニングキット（インビトロジェン株式会社）を用いて pCRIIベクターに サブクローユングし、シークェンスを確認した。サブクローニングした Δ 15不飽和化 酵素遺伝子の開始コドンより 5塩基下流一 591bpまでの DNA断片に対して BamHI 、 Xhol認識配列を付加した断片と、 5塩基下流一 791bpまでの DNA断片に対して S acl、 Xhol認識配列を付加した断片とを PCRにより増幅、精製した。
[0135] この際用いたプライマーは、上記の約 591bp断片についてはプライマー SOYF1-
SOYR1-X (5， - GCACATCTCGAGGGATTGAAGTGAGAGCCTTC- 3， ) (配列番 号 14)とを用いた。また、上記の約 791bp断片については、プライマー SOYF2-S ( 5，- GTCTGCGAGCTCTTAAAGACACAAAGCCTTTA- 3，）（配列番号 15)と、 SO UR2-X (5， -CATCATCTCGAGGGTGGTGACCATGGTGATGC-3， ) (配列番号 1 6)とを用いた。
[0136] これら 2種類の DNA断片力 ヘアピン構造を作るように逆位に BamHI_XhoI_Sa clで連結し、コングリシニンプロモーターと nosターミネータ一との間に BamHI、 Sad サイトに揷入し RNAiカセットを作製した（pSPB1876)。この pSPB1876力ら Δ 15R NAiカセットを切り出し、 pSPB1852の Asclサイトに揷入し、 pSPB1877を作製した [0137] また、 pSPB1877は、図 2に示す手順でも作製することができる。具体的には、まず 、 pUCSAPF 2. 7kbpの Sgfl— Asclサイトに GLELO遺伝子断片（図中 Conで示す コングリシニンのプロモーターと、図中 masで示すマノピン合成酵素遺伝子ターミネ 一ターとの間に GLELOcDNAが連結されている断片）を、また AscI_PacIサイトに Δ 6不飽和化酵素遺伝子断片（Conと masとの間に Δ 6不飽和化酵素 cDNAが連結 している断片）を、また PacI_FseIサイトに Δ 5不飽和化酵素（Conと masとの間に Δ 5不飽和化酵素 cDNAが連結している断片）を導入し、 pSPB1944を作製した。次 レヽで、 pSPB1944を Sgflと Fselとで処理して、 Sgflサイトに 35Sプロモータ" ~_緑色 蛍光タンパク質遺伝子一 nosターミネータ一からなる GFPカセットを、 Fselサイトに 35 Sプロモータ^ "―ハイグロマイシン耐性遺伝子— nosターミネータ一からなる HPTカセ ットを導入し、 PSB1852を作製した。最後に、 Δ 15RNAiカセットを、 pSPB1852の Asclサイトに揷入し、 pSPB1877を作製した。
[0138] このように作製した pSB1877の全体図を図 3に示す。このように、 pSB1877には、 GFPカセット、 GLEL〇、 A 15RNAiカセット、 Δ 6不飽和化酵素、 Δ 5不飽和化酵素 、 HPTカセットが連結されており、多重遺伝子を発現するベクターとなっている。
[0139] 〔VI〕ダイズの形質転換および発現解析
PSPB1877を導入したダイズ不定胚を未成熟と成熟との 2ステージでサンプリング し、多重遺伝子の導入'発現解析を行った。具体的には以下のように行った。
[0140] ゲノム DNAおよび RNAをそれぞれ DNeasy Plant Mini Kitと RNeasy Plant Mini Kit
(株式会社キアゲン）とを用いることにより調製した。抽出した DNA 200ngを铸型に 、 PCR反応を行った。この際使用したプライマーは、 det6f3 (5 '
-TGGTGGAAGGACAAGCACAA-3 ' ) (配列番号 17)と det6r2 (5，
-ACAGACCAGGGTGAACATCA-3 ' ) (配列番号 18)、プライマー det5f4 (5 ' -CTTTGGATCCTTGATCGCCT-3， ) (配列番号 19)と det5r3 (5，
-AGAACATGACGGTGTGCCAA-3 ' ) (配列番号 20)、プライマー XbaGLf (5 ' -CAGTTCTAGAGCCTTCTCACATTCCC-3 ' ) (配列番号 21)と SacGLr (5， -AGTCGAGCTCTTACTGCAACTTCCTT- 3 ' ) (配列番号 22)、プライマー HPTf 1 (5 ' -CCTGCGGGTAAATAGCTGCG-3 ' ) (配列番号 23)と HPTr 1 (5 ' -CGTCAACCAAGCTCTGATAG-3' ) (配列番号 24)、プライマー EGFP_F1 (5' - ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3' ) (配列番号 25)と EGFP—R1 (5，
-AATGAACATGTCGAGCAGGTA-3' ) (配列番号 26)を用いた。
[0141] PCR反応は、酵素に ExTaq (タカラバイオ株式会社)を用レ、、 94°Cで 2分間保持し た後、 94t> 30禾少、 55t> 30禾少、 72t> 30禾少ー 1分のサイクノレを 30サイクノレ行レヽ、さ らに 72°Cで 1分間保持した。これらの結果から、 pSPB1877を導入したダイズには Δ 6不飽和化酵素、 Δ 5不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素、 HPT遺伝子が導入さ れているが、 GFP遺伝子は導入されていないことが明らかになった。抽出した全 RN Aを用いて前述のように RT— PCRを行った。 RT— PCRは逆転写産物を錡型とし、プ ライマー det6f3 (配列番号 17)と det6r2 (配列番号 18)、プライマー det5f4と det5r 3、プライマー GLEf (5，-GTGCTCGCTTATTTGGTCAC- 3' ) (配列番号 27)と GLE r (5 ' -CGACATCATGCAGAACTGTG-3 ' ) (配列番号 28)を用いた。ゲノム DNAと 同じサイクルで PCRを行い、遺伝子発現を解析した。その結果、 PSPB1877形質転 換ダイズでは、 Δ 6不飽和化酵素、 Δ 5不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素の発現 が確認された。
[0142] 〔VII〕形質転換ダイズの脂質分析
PSPB1877形質転換ダイズの成熟胚 lgから上記〔I〕欄の方法に従って脂質を抽 出し、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析装置によって、脂肪酸の解析を行った。 その結果を下記表 2に示す。
[0143] [表 2]
Figure imgf000036_0001
表 2に示すように、 pSPB1877形質転換ダイズの成熟胚では本来ダイズでは生合 成されない γ—リノレン酸、ジホモ _ γ _リノレン酸、ァラキドン酸がそれぞれ全脂肪酸 に対して、 2. 77%、 1. 73%、 2. 10%の割合で合成されていた。なお、野生型ダイ ズの脂質には、 γ—リノレン酸、ジホモ _ γ—リノレン酸、ァラキドン酸は含まれていな かった。
[0144] 以上の結果より、本発明に係る植物体の生産方法によれば、ダイズでァラキドン酸 を生産することが可能になった。
[0145] 〔VIII〕
PSPB1877形質転換ダイズの種子 1粒力 上記〔I〕欄に記載の方法に従って脂質 を抽出し、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析装置によって、形質転換ダイズの種 子に含有される脂肪酸の解析を行った。その結果を下記表 3に示す。
[0146] [表 3]
Figure imgf000037_0001
表 3に示すように、 PSPB1877形質転換ダイズの種子では、本来野生型のダイズ では生合成されない γ—リノレン酸、ジホモ _ γ _リノレン酸、ァラキドン酸がそれぞれ 全脂肪酸量に対して、 2. 49%、 1. 05%、 0. 83%の割合で合成されていた。また、 形質転換体の α—リノレン酸量が野生型ダイズの発現量の約 20%に減少してレ、たこ とから、 RNAiによる Δ 15不飽和化酵素の発現抑制が起こっていると考えられた。
[0147] 以上のように、形質転換体の種子の脂肪酸組成が変化していたことから、形質転換 ダイズの次世代のダイズにも改変された脂肪酸の形質が伝わることが示された。した がって、この組換えダイズを栽培することにより、改変された脂肪酸組成を有するダイ ズ種子を大量に得ることができる。
[0148] 〔IX〕
ァラキドン酸を蓄積していた pSPBl 877形質転換ダイズの T1種子を播種し、次世 代となる T2種子を採種した。 T1植物の葉から抽出した DNAを铸型に、 Δ 6不飽和 化酵素、鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素のゲノミック PCRを上記〔VI〕欄の方法に 従って行レ、、 T1植物にはこれら 3つの遺伝子が受け継がれていることを確認した。ま た、 T1植物の葉の DNAを Nucleon Phytopure (アマシャム）により調製し、 DIG DNA labeling kit (ロシュ'ダイァグノスティックス）と上記〔VI〕欄記載のプライマーを用いて、 Δ 6不飽和化酵素、鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和化酵素のプローブを作製し、サザン ブロット解析を行った。 T1植物には少なくとも 2コピーのコンストラクトが導入されてい ることが確認できた。 T2種子の脂質分析を行った結果、表 4に示すように本来野生 型のダイズでは生合成されない γ—リノレン酸、ジホモ _ γ—リノレン酸、ァラキドン酸 がそれぞれ全脂肪酸量に対して、 1. 71%、 0. 55%、 0. 53%の割合で合成されて いた。また、種子の RT— PCRにより Δ 6不飽和化酵素、鎖長延長酵素、 Δ 5不飽和 化酵素の発現を確認した。よって、次世代にも安定に導入遺伝子が受け継がれ、脂 肪酸組成改変の形質も受け継がれていることが確かめられた。
[0149] また、 RT— PCRによって内在性 Δ 15不飽和化酵素（Accession No. L22964)の転 写物の量を調べたところ、転写物は検出できな力 た。このことから、 RNAiによって Δ 15不飽和化酵素の転写が効果的に抑制されており、そのために α _リノレン酸含 量が低下して！/、ると考えられた。
[0150] [表 4]
Control pSPB1877-l 種子 (％) T2種子 (％) リノール酸 57.86 53.27 ひリノレン酸 9.27 3.07 リノレン酸 0 1.71
ジホモ rリノレン酸 0 0.55 ァラキドン酸 0 0.53 産業上の利用の可能性
上述したように、本発明に係る油脂原料植物の生産方法によれば、本来、高等植 物で生産されなかったァラキドン酸を含有する植物体を得ることができる。この植物 体からァラキドン酸を大量かつ簡易に取得することができるため、このァラキドン酸を 用いて、健康食品や医薬品の製造'販売が可能となる。すなわち、本発明では、食 品産業、製薬産業およびその関連産業に利用可能である。また、本発明は、植物体 へ新たな付加価値を与えるものであるため、農業分野への利用も可能である。

Claims

請求の範囲
[1] ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素遺伝子を植物体に導入し、ァラキ ドン酸を生産させるァラキドン酸生産工程を含む植物体の生産方法により得られるこ とを特徴とするァラキドン酸含有植物体。
[2] 上記ァラキドン酸生産工程は、上記ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵 素をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換 工程を含むことを特徴とする請求項 1に記載のァラキドン酸含有植物体。
[3] さらに、上記ァラキドン酸生産工程は、上記組換え発現ベクターを構築する組換え 発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項 2に記載のァラキドン酸 含有植物体。
[4] 上記組換え発現ベクター構築工程には、ダイズ種子特異的プロモーターの下流領 域に、ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子を連結す る工程が含まれることを特徴とする請求項 3に記載のァラキドン酸含有植物体。
[5] 上記ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素が、 Δ 6不飽和化酵素、脂肪 酸鎖長延長酵素、および Δ 5不飽和化酵素であることを特徴とする請求項 1一 4のい ずれ力、 1項に記載のァラキドン酸含有植物体。
[6] 上記 Δ 6不飽和化酵素が、以下の（a)または (b)記載のタンパク質であることを特徴 とする請求項 5に記載のァラキドン酸含有植物体。
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、揷入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、脂肪族モノカルボン酸の Δ 6 位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質。
[7] 上記 Δ 6不飽和化酵素をコードする遺伝子として、以下の（c)または（d)記載の遺 伝子が用いられることを特徴とする請求項 5に記載のァラキドン酸含有植物体。
(c)配列番号 2に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有す る遺 卞。
(d)配列番号 2に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺 伝子とストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂肪族モノカルボン酸の Δ 6 位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする遺 伝子。
[8] 上記脂肪酸鎖長延長酵素が、以下の（e)または (f )記載のタンパク質であることを 特徴とする請求項 5に記載のァラキドン酸含有植物体。
(e)配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(f)配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、揷入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、脂肪族モノカルボン酸の炭 素鎖の延長反応を触媒する機能を有するタンパク質。
[9] 上記脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子として、以下の（g)又は (h)記載の遺 伝子が用いられることを特徴とする請求項 5に記載のァラキドン酸含有植物体。
(g)配列番号 4に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有す ; eis子。
(h)配列番号 4に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺 伝子とストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂肪族モノカルボン酸の炭素 鎖の延長反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
[10] 上記 Δ 5不飽和化酵素が、以下の（i)または (j)記載のタンパク質であることを特徴 とする請求項 5に記載のァラキドン酸含有植物体。
(i)配列番号 5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(j)配列番号 5に示されるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、脂肪族モノカルボン酸の Δ 5 位に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質。
[11] 上記 Δ 5不飽和化酵素をコードする遺伝子として、以下の（k)または (1)記載の遺伝 子が用いられることを特徴とする請求項 5に記載のァラキドン酸含有植物体。
(k)配列番号 6に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有す ; eis子。
(1)配列番号 6に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝 子とストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、かつ、脂肪族モノカルボン酸の Δ 5位 に不飽和結合を導入する反応を触媒する機能を有するタンパク質をコードする遺伝 子。
[12] 上記ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素または該酵素をコードする遺 伝子は、モルティエラ（Mortierella)属由来であることを特徴とする請求項 1一 11のい ずれ力、 1項に記載のァラキドン酸含有植物体。
[13] 上記ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素または該酵素をコードする遺 伝子は、モルティエラ アルピナ（Mortierella alpina)由来であることを特徴とする請求 項 1一 12のいずれ力 4項に記載のァラキドン酸含有植物体。
[14] 上記ァラキドン酸生産工程には、宿主の Δ 15不飽和化酵素の発現を抑制する発 現抑制工程が含まれることを特徴とする請求項 1一 13のいずれ力、 1項に記載のァラ キドン酸含有植物体。
[15] 上記発現抑制工程は、 RNAi法によって Δ 15不飽和化酵素の発現を抑制するェ 程であることを特徴とする請求項 1一 14のいずれ力 4項に記載のァラキドン酸含有植 物体。
[16] 上記植物体には、細胞、組織、カルス、種子、成育した植物個体、もしくは該植物 個体と同じ性質を有する植物個体の子孫が含まれることを特徴とする請求項 1一 15 のいずれ力 1項に記載のァラキドン酸含有植物体。
[17] 上記植物体は、ダイズであることを特徴とする請求項 1一 16のいずれか 1項に記載 のァラキドン酸含有植物体。
[18] 請求項 1一 17のいずれ力 1項に記載のァラキドン酸含有植物体から得られることを 特徴とするァラキドン酸。
[19] 請求項 18に記載のァラキドン酸を含んでいることを特徴とする組成物。
[20] 請求項 19に記載の組成物を含んでいることを特徴とする食品。
[21] 請求項 1一 17のいずれか 1項に記載のァラキドン酸を含有する植物体を作製する ためのキットであって、
ァラキドン酸生合成に関与する脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子と、プロモータ 一とを含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいることを特徴とするァラキドン酸 含有植物体作製キット。
[22] さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでい ることを特徴とする請求項 21に記載のァラキドン酸含有植物体作製キット。
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