WO2020032258A1 - 多価不飽和脂肪酸を生産する微生物及び多価不飽和脂肪酸の製造法 - Google Patents

多価不飽和脂肪酸を生産する微生物及び多価不飽和脂肪酸の製造法 Download PDF

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佐藤　康治
祥平 林
泰志 小笠原
哲朗 氏原
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Definitions

  • the present invention relates to a microorganism producing polyunsaturated fatty acid (PUFA) and a method for producing PUFA using the microorganism.
  • PUFA polyunsaturated fatty acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • PUFA is known to have various physiological functions such as prevention of arteriosclerosis and hyperlipidemia (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • PUFAs have ⁇ 3 fatty acids such as DHA and EPA, ⁇ 6 fatty acids such as DPA and ARA, and double bonds first introduced at the ninth carbon, depending on the position of the double bond from the methyl terminal in the molecule. They can be classified into ⁇ 9 fatty acids, ⁇ 11 fatty acids in which a double bond is first introduced into the eleventh carbon, and the like.
  • PUFA-PKS polyunsaturated fatty acid polyketide synthase
  • the anaerobic pathway by PUFA-PKS is a pathway for synthesizing PUFA from acetyl-CoA or malonyl-CoA, and some marine bacteria and eukaryotes of Labyrinthura may have a pathway for producing DHA and EPA. It is known (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • an ARA production system for example, an ARA production system of Aureispira @ marina is known (Non-Patent Document 6).
  • PUFA-PKS is a complex enzyme composed of a plurality of proteins (hereinafter, also referred to as a protein complex), and each protein has a plurality of functional domains related to the synthesis of PUFA.
  • Functional domains present in PUFA-PKS include ⁇ -ketoacyl-acyl carrier protein synthase domain (hereinafter referred to as KS domain) and phosphopantetheinyl group, which are considered to be involved in the condensation of malonyl-ACP and acyl-ACP.
  • KS domain ⁇ -ketoacyl-acyl carrier protein synthase domain
  • phosphopantetheinyl group which are considered to be involved in the condensation of malonyl-ACP and acyl-ACP.
  • An acyl carrier protein domain (hereinafter, referred to as an ACP domain) which is supposed to function as a site for fatty acid synthesis by bonding to an acyl group via a thioester bond, and a ketoreductase domain which is supposed to reduce a carbonyl group generated by condensation (
  • a KR domain a DH domain that is supposed to form a double bond by dehydrating a hydroxyl group generated by the KR domain, and a chain elongation factor domain that is involved in carbon chain elongation
  • ER domain Enoyl reductase domain
  • AT domain an acyltransferase domain
  • AT domain malonyl-CoA: acyltransferase domain (hereinafter, referred to as AT domain).
  • MAT domain MAT domain
  • PPT domain phosphopantethein transferase domain
  • Patent Document 1 As a method of industrially producing ARA, a method of isolating ARA from mold biomass (Patent Document 1) is known. However, there is a problem that there are many by-products of unsaturated fatty acids other than the objective, and efficient ARA is produced. There was a need for a production method.
  • PUFA-PKS produces different types of PUFA depending on the type. For example, Schizochyrium @ sp. Aurantiochytrium @ sp. And PUFA-PKS derived from Moritela @ marina, DHA, PUFA-PKS derived from Shewanella @ oneidensis and Photobacterium @ profundum, EPA, and Aureispira @ marina produced mostly as PU, and almost no ARA was produced as PU. Or, even if it is produced, it is small compared to the main product.
  • Non-Patent Documents 4 and 7 discuss cloning of the PUFA-PKS gene from bacteria of the genus Shewanella and eukaryotes of stramenopiles, expression in a heterologous organism, and production of PUFA.
  • Non-Patent Document 8 a study using the pfaB gene that is a constituent gene of PUFA-PKS derived from Moritella marina that produces DHA and a pfaB gene that constitutes PUFA-PKS derived from Shewanella pneumatophori that produces EPA have been conducted. It is disclosed that the pfaB gene encoding the domain is involved in the type of PUFA produced.
  • Non-Patent Document 9 discloses that introduction of the DH domain of PUFA-PKS derived from the genus Thraustochytrium into Escherichia coli increases the production of fatty acids and the proportion of unsaturated fatty acids.
  • PU As a conventional PUFA production system using PUFA-producing microorganisms, for example, there is an ARA production system using microorganisms described in Non-Patent Document 6, but the ARA productivity by the ARA production system is not sufficient at an industrial level. Further, the method of isolating ARA from mold biomass as in the method described in Patent Document 1 has a problem that there are many by-products of unsaturated fatty acids other than the target.
  • an object of the present invention is to provide a microorganism that efficiently produces PUFA and a method for producing PUFA using the microorganism.
  • a microorganism capable of producing PUFA into which a gene encoding a foreign PS-DH domain, which has a higher activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP than a native FabA-DH domain, has been introduced into a microorganism having a metabolic pathway called PUFA.
  • PUFA a microorganism having a metabolic pathway
  • the microorganism having a PUFA metabolic pathway is a microorganism having an ⁇ 3 PUFA metabolic pathway, and the PUFA that can be produced is ⁇ 6 PUFA.
  • microorganisms having a PUFA metabolic pathway include the genus Shewanella, the genus Photobacterium, the genus Moritella, the genus Colwellia, the genus Aurantiochytrium, the genus Thraustochytrium, and Thraustochytrium.
  • a microorganism capable of producing PUFA wherein a microorganism having no PUFA metabolic pathway is introduced with a gene encoding each domain described in the following (a) to (j) having PUFA-PKS activity, wherein PS- A microorganism in which the DH domain exhibits higher activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP than the FabA-DH domain.
  • KS domain b) MAT domain
  • ACP domain d
  • KR domain e
  • PS-DH domain f
  • CLF domain g) AT domain
  • FabA-DH domain i
  • ER domain j) PPT domain 6.
  • microorganism according to 5 above which has all the PUFA synthesis genes of the microorganism capable of producing the PUFA according to any one of 1 to 4 above. 7.
  • the microorganism according to 5 or 6, wherein the PUFA that can be produced is ⁇ 6 PUFA.
  • the microorganism according to any one of the above items 5 to 7, wherein the PUFA that can be produced is ARA or DPA.
  • Microorganisms that do not have a PUFA metabolic pathway include the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Corynebacterium, the genus Yarrowia, the genus Saccharomyces, or the genus Candida or Candida.
  • a microorganism capable of producing PUFA wherein a microorganism having no PUFA metabolic pathway is transfected with a gene encoding each of the following domains (a) to (j) having PUFA-PKS activity: , A microorganism in which the PS-DH domain exhibits higher activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP than the FabA-DH domain.
  • A) KS domain (b) MAT domain (c) ACP domain (d) KR domain (e) PS-DH domain (f) CLF domain (g) AT domain (h) FabA-DH domain (i) ER domain ( j) PPT domain
  • the microorganism of the present invention is characterized in that, in a microorganism capable of producing PUFA, a PS-DH domain gene having a higher activity for a fatty acid substrate, 3-hydroxyhexanoyl @ ACP, than a FabA-DH domain has been introduced,
  • the reactivity of PS-DH domain to 3-hydroxyhexanoyl @ ACP in the microorganism is relatively higher than that of FabA-DH domain, so that a target PUFA or a PUFA-containing composition can be efficiently produced.
  • PUFA can be produced at low cost and with high efficiency, and can be applied to production of PUFA at an industrial level.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a protein constituting PUFA-PKS and a domain structure thereof in various microorganisms.
  • polyunsaturated fatty acid refers to a long-chain fatty acid having a carbon chain length of 18 or more and an unsaturated bond number of 2 or more.
  • domain refers to a part consisting of a continuous amino acid sequence in a protein, and is a region having a specific biological activity or function in the protein.
  • PUFA-PKS has the same meaning as PUFA @ synthase.
  • PUFA @ synthase is a group of enzymes that synthesize specific long-chain unsaturated fatty acids using malonyl-CoA or the like as a carbon source, and includes KS, MAT, ACP, KR, PS-DH, CLF, AT, FabA-DH. , ER, and PPTase domains (ACOS Lipid Library: PUFA synthase; Science, 2001, 293, 290-293; PLoS One, 2011, 6, e20146, etc.).
  • KS domain is a domain of a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity, and refers to a domain involved in the condensation of malonyl ACP and acyl ACP.
  • the MAT domain and AT domain are domains of a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity, and refer to domains involved in acyl group transfer.
  • the ACP domain is a domain of a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity.
  • the ACP domain binds to an acyl group via a phosphopantetheinyl group via a thioester bond, and functions as a place of fatty acid synthesis. -Refers to domains essential for PKS activity.
  • KR domain is a domain of a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity, and refers to a domain involved in reduction of a ketone group generated by condensation.
  • PS-DH domain and FabA-DH domain which are DH domains, are domains of a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity, and are domains involved in dehydration of a hydroxyl group generated by reducing a ketone group.
  • the CLF domain is a domain of a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity, and refers to a domain involved in carbon chain elongation.
  • the ER domain is an acyltransferase domain
  • the malonyl-CoA: ACP acyltransferase domain is a domain of a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity and is a domain involved in acyl group transfer.
  • PPTase is an enzyme that constitutes a protein complex having PUFA-PKS activity, and refers to an enzyme involved in activation of the ACP domain.
  • cognate means that when a certain protein is allowed to coexist with another protein, a specific reaction is integrally performed.
  • the term “cooperate” is necessary for PUFA-PKS activity. This means that when a plurality of domains coexist, they exhibit PUFA-PKS activity together with other domains.
  • the term “foreign” refers to a substance that is not endogenous but derived from a heterologous substance. If the host organism before transformation does not have the gene to be introduced according to the present invention, it is encoded by the gene. When the protein according to the present invention is substantially not expressed, or when the amino acid sequence of the protein is encoded by a different gene but the activity of the endogenous protein is not expressed after the transformation, the gene according to the present invention is introduced into the host organism. Used to mean to do.
  • the term “host organism” refers to an original organism to be subjected to genetic modification, transformation, and the like.
  • the original organism to be transformed by gene transfer is a microorganism, it is also referred to as a parent strain or a host strain.
  • microorganisms examples include the following microorganisms (1) and (2).
  • (2) Genes encoding KS, MAT, ACP, KR, PS-DH, CLF, AT, FabA-DH, ER, and PPTase domains having PUFA-PKS activity are added to microorganisms having no PUFA metabolic pathway.
  • a microorganism having a PUFA metabolic pathway refers to a microorganism having a PUFA-producing ability by nature.
  • Examples of microorganisms having the PUFA metabolic pathway include the genus Shewanella, the genus Photobacterium, the genus Moritela, the genus Colwellia, the genus Aurantiochytrium, and the Thraustochytrium.
  • a microorganism having an ⁇ 3 PUFA metabolic pathway is preferable, and examples thereof include a microorganism having a DHA metabolic pathway and a microorganism having an EPA metabolic pathway.
  • microorganisms having a DHA metabolic pathway include microorganisms of the genus Moritela, Colwellia, Aurantiochytrium, Thraustochytrium, and Schizochytrium. .
  • Moritela Marina Preferably, Moritela Marina, Colwellia cyclerythraea, Aurantiochytrium limacinum, Thraustochyura aureum such as Thraustochyura aureum such as Thraustochytrium aureum such as Aurantiochytrium limacinum
  • the present invention is not limited thereto.
  • microorganism having the DHA metabolic pathway a microorganism belonging to the genus Aurantiochytrium is preferable, and examples thereof include Aurathiochitrium @ SP @ OH4 strain (accession number FERM @ BP-11524) and the like, and mutants thereof. Microorganisms having the ability to produce DHA may be used.
  • the Aurantiochytrium sp. OH4 strain was deposited under the Patent Microorganisms Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), located at 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan, postcode 305-8566. Deposited at the center.
  • the date of receipt (deposit date) is January 11, 2013 (AD 2013), and the deposit number is FERM @ BP-11524.
  • microorganisms having an EPA metabolic pathway include microorganisms of the genus Shewanella, the genus Photobacterium, and the genus Vibrio.
  • Shewanella oneidenissis, Shewanella livingstonensis, Shewanella baltica, Shewanella photobala, Shewanella pearanab, etc. are not limited as long as they have an EPA metabolic pathway.
  • a microorganism that does not have a PUFA metabolic pathway refers to a microorganism that does not naturally have a PUFA-producing ability.
  • Microorganisms that do not have a PUFA metabolic pathway include, for example, bacteria, microalgae, fungi, protists, and protozoa.
  • bacteria examples include, for example, genus Escherichia, genus Serratia, genus Bacillus, genus Brevibacterium, genus Corynebacterium, genus Microbacterium, and genus Microbacterium. Pseudomonas) and microorganisms belonging to the genus selected from the group consisting of Aureispira.
  • Escherichia coli XL1-Blue Escherichia coli XL2-Blue
  • Escherichia coli DH1 Escherichia coli MC1000
  • Escherichia coli KY3276 Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101
  • microalgae examples include, for example, Euglenophyceae (Euglena genus [and Peranema genus), green algae (Chrysophyceae) [eg, Ochromonas genus (Chrysaceae), Dacenaea (Yasaunab)
  • Euglenophyceae Euglena genus [and Peranema genus
  • green algae Chrysophyceae
  • Dacenaea Yasaunab
  • the genus Dinobryon, the genus Platychrysis and the genus Chrysochromulina the Dinophyceae (eg, the genus Crypthecodinium, gym, gymium, gym, gym, and gym)
  • Genus Peridinium genus Ceratium, Giroji Genus Gyrodinium and Oxyrrhis
  • Genus [and flagellate lysochlorides (Rhizochloridaceae) and Afanocaete pascheri (Aphanochaete @ pascheri), Bumileria stigeoclonium (Bumilliaria stigeoclonium) and Baukeria Geminata (A. auger germia germophile) in the spores of A. Algae that produce an amoebic phase such as Species], Euthygmatophyceae, and Pymnesiopyceae (including, for example, the genus Prymnesium and Diacronema).
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Preferred species within these genera are not particularly limited, but include Nannochloropsis oculata, Crypthecodinium cohniii, and Euglena gracilis.
  • fungi examples include yeasts of the genus Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ⁇ ⁇ cerevisiae, Saccharomyces ⁇ karsbergensis, Saccharomyces karsbergensis), and genus of the genus Circa wiardia or Yardia darica (Y.
  • yeasts such as the genus (Pichia), the genus Kluyveromyces, or other fungi, for example, filamentous fungi such as the genus Aspergillus, the genus Neurospora, the genus Penicillium. And the like.
  • the microorganism (2) is preferably a microorganism into which all of the PUFA synthesis genes of the microorganism (1) have been introduced, that is, a microorganism having all of the PUFA synthesis genes of the microorganism (1).
  • “activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP” is an activity that acts preferentially on 3-hydroxyhexanoyl ACP, and more specifically, reactivity (affinity) with 3-hydroxyhexanoyl ACP.
  • the activity against 3-hydroxyhexanoyl @ ACP can be measured by a method for evaluating the reverse reaction (hydroxylation reaction) of dehydratase.
  • a product obtained by adding a protein containing a FabA-DH domain or a PS-DH domain is subjected to HPLC.
  • the amount of the product (the product when using crotonyl @ ACP as a substrate: 3-hydroxy-butyryl-ACP, the product when using 2-trans-hexenoyl @ ACP as a substrate: 3 -Hydroxy-hexanoyl-ACP).
  • the activity of the PS-DH domain for 3-hydroxyhexanoyl @ ACP is FabA-DH. It is judged that the activity is higher than that of the domain.
  • the PS-DH domain exhibits a higher activity for 3-hydroxyhexanoyl ACP than the FabA-DH domain specifically means, for example, that the peak of the HPLC reacted under the following reaction conditions is 2 It is preferable that the height of the HPLC peak for the product using -trans-hexenoyl @ ACP as a substrate is 1.5 times or more, and more preferably, the height of the HPLC peak for the product using Crotonyl @ ACP as a substrate. Is 2 times or more, more preferably 5 times or more.
  • reaction conditions A mixture of 80 mM Tris-HCl, 80 mM NaCl, 25 mM MgCl 2 , 100 ⁇ M ACP serving as a substrate, 20 ⁇ M Sfp, and 300 ⁇ M acyl-CoA, and reacted at 20 ° C. for 10 minutes was mixed with a PS-DH domain and a FabA-DH domain. Is added at 1 ⁇ M or 5 ⁇ M, and reacted at 20 ° C. Samples are collected at 1, 5, 10, 30, and 60 minutes after the start of the reaction, and subjected to LC / MS analysis to analyze the height of the HPLC peak.
  • the term “Sfp” means 4′-phosphopantheinyl transferase derived from Bacillus subtilis.
  • the activity of the endogenous PS-DH domain on 3-hydroxyhexanoyl @ ACP in the microorganism having the PUFA metabolic pathway is equal to or less than that of the endogenous FabA-DH domain.
  • the PS-DH domain 3-hydroxyhexanoyl @ ACP in the microorganism is introduced. Is a microorganism having a relatively high reactivity as compared with the FabA-DH domain.
  • the PS-DH domain is a FabA-DH domain.
  • FabA-DH domain By having a higher activity against 3-hydroxyhexanoyl @ ACP, a microorganism having a higher reactivity of PS-DH domain to 3-hydroxyhexanoyl @ ACP in the microorganism as compared to the FabA-DH domain is obtained.
  • the relatively high reactivity of the PS-DH domain to 3-hydroxyhexanoyl @ ACP in the microorganism compared to the FabA-DH domain makes the PS-DH domain more susceptible to the PUFA metabolic pathway of the microorganism than the FabA-DH domain.
  • PUFA is produced through a PUFA biosynthetic pathway in which the PS-DH domain functions.
  • the ⁇ 3 PUFA biosynthesis pathway in which the FabA-DH domain functions and the ⁇ 6 PUFA biosynthesis pathway in which the PS-DH domain functions Is mentioned.
  • the PS-DH domain functions When the position of the double bond counted from the terminal carbon atom in the PUFA obtained in the PUFA biosynthetic pathway in which the FabA-DH domain functions is the ⁇ ( ⁇ ) position (eg, ⁇ 3 position), the PS-DH domain functions In the PUFA obtained by the PUFA biosynthesis pathway, the position of the double bond counted from the terminal carbon atom is the ⁇ ( ⁇ + 3) position (for example, the ⁇ 6 position).
  • a 3-hydroxyhexanoyl ACP higher than the endogenous FabA-DH domain By introducing a gene encoding an exogenous PS-DH domain having an activity against E. coli, the reactivity of PS-DH domain to 3-hydroxyhexanoyl @ ACP in the microorganism is relatively higher as compared to FabA-DH domain. Become. As a result, the PS-DH domain acts preferentially on the 3-hydroxyhexanoyl @ ACP over the FabA-DH domain, resulting in a microorganism capable of producing ⁇ 6 PUFA as an end product.
  • PS-DH domain a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 136) on AraB derived from Aureispira marina Or a PS-DH domain on pfaB derived from Psychroflexus @ torquis [a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137 (encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 139)], and derived from Aureispira @ marina
  • SEQ ID NO: 137 encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 139
  • the PS-DH domain on araB is preferred.
  • sequences are known and can be used as appropriate.
  • the PS-DH domain used in the present invention preferably includes the following.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 137 [2] In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 137, 1 to 20, preferably 1 to 10, most preferably A mutant protein preferably comprising an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted or added, and having an activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP [3] The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 137 And a homologous protein having an identity of at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more, and having activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP.
  • the gene encoding a PS-DH domain may be introduced into a microorganism by introducing a gene encoding a protein having a PS-DH domain into the microorganism.
  • the protein having the PS-DH domain include AraB derived from Aureispira @ marina [protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58 (encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57)], and PfaB derived from Psychroflexus @ torquis [Protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 (encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 140)].
  • the protein having a PS-DH domain used in the present invention preferably includes the following.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58 or 138 [5] In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58 or 138, 1 to 20, preferably 1 to 10, most preferably Preferably, the mutant protein comprises an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted or added, and has an activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP [6]
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58 or 138 And at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more, and a homologous protein having activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58 is a protein consisting of 801 amino acid residues, and has a PS-DH domain at 531-790 residues from the N-terminal side.
  • a mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein or adding amino acid residues to the protein.
  • deletion, substitution, insertion or addition of an amino acid refers to 1 to 20, preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 5 amino acids at any position in the same sequence. May be deleted, substituted or added.
  • the amino acid to be deleted, substituted or added may be of natural type or non-natural type.
  • natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L-arginine, -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and L-cysteine.
  • amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • B group aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine, glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homos
  • a homologous protein is a protein in which the gene encoding the protein is considered to have the same evolutionary origin as the gene encoding the original protein because of similarity in structure and function to the original protein. Means a protein of an organism present in
  • the gene encoding the PS-DH domain used in the present invention is not particularly limited as long as it encodes a protein having an activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP, but is preferably a gene having any one of the following DNAs: No. [7] DNA encoding the protein of any one of the above [1] to [3] [8] DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 136 or SEQ ID NO: 139 [9] A DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA according to the above [7] or [8] under stringent conditions and encodes a homologous protein having an activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP.
  • [10] has at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the DNA sequence of the above-mentioned [7] or [8], DNA encoding a homologous protein having activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP
  • a gene encoding a protein having a PS-DH domain preferably, a gene having any one of the following DNAs is exemplified.
  • DNA encoding the protein of any one of [4] to [6] above [12] DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 140
  • a homologous protein which hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA according to the above [11] or [12] under stringent conditions and has an activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP.
  • DNA encoding [14] It has at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more identity with the DNA sequence of the above-mentioned [11] or [12], and Encoding a homologous protein having activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP
  • hybridize means that a DNA having a specific base sequence or a part of the DNA forms a complex complementarily with another DNA. Therefore, the DNA having the specific nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis or a DNA having a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. You may. Examples of DNA used as a probe include DNA having at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, and more preferably 500 bases or more. DNA used as a primer includes at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more. DNA can be mentioned.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can be obtained by following the instructions attached to a commercially available hybridization kit.
  • commercially available hybridization kits include, for example, a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics) that prepares a probe by a random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • Stringent conditions include, for example, a filter on which DNA is immobilized and a probe DNA are combined with 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), After incubating overnight at 42 ° C. in a solution containing 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate and 20 ⁇ g / l of denatured salmon sperm DNA, for example in a 0.2 ⁇ SSC solution at about 65 ° C. Can be used to wash the filter.
  • 5 ⁇ SSC 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate
  • 50 mM sodium phosphate pH 7.6
  • the above various conditions can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagents described above may involve changing the hybridization conditions to adapt the conditions.
  • Examples of the DNA that can be hybridized under the above-mentioned stringent conditions include, for example, a base sequence of the target DNA of at least 95% when calculated based on the above parameters using the above-mentioned programs such as BLAST and FASTA.
  • a DNA comprising a nucleotide sequence having an identity of preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more can be mentioned.
  • the domains having PUFA-PKS activity to be introduced into microorganism (2) include KS domain, MAT domain, ACP domain, KR domain, CLF domain, AT domain, DH domain FabA-DH domain, ER domain and PPT. Domain.
  • the respective domains are not limited as long as they cooperate to produce PUFA using acetyl-CoA as a starting substrate, and include, for example, each domain of known PUFA-PKS.
  • the PUFA-PKS activity exhibited by the domains having PUFA-PKS activity introduced into the microorganism (2) cooperates to construct a microorganism transformed with a gene encoding each domain of PUFA-PKS, and It can be confirmed by culturing in a medium, producing and accumulating PUFA in the culture, and measuring the PUFA accumulated in the culture by gas chromatography.
  • the “known PUFA-PKS” preferably refers to a genus Shewanella, a genus Colwellia, a genus Desulfatibacillum, a genus Psychroflexus, and a genus Psychroxium schichytrium.
  • PKS more preferably Shewane la pealeana ATCC 700345, Shewanella oneidensis MR-1, Colwellia psychrerythraea 34H, Desulfatibacillum alkenivoransAK-01, Psychroflexus torquisATCC 700755, Schizochytrium sp.
  • ATCC 20888 Nostoc punctiformePCC 73102, Microcystis aeruginosaNIES-843, Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338, Geobacter bemidjiensis Bem, Planctomyces limnophilus DSM3776, Desulfococcus oleovorans Hxd3, Sorangium cellulosum 'Soce 56', Renibacterium salmoninarum ATCC 33209, Chitinophaga pinensisDSM 2588, Gloeobacter violaceusPCC 7421, Azot bacter vinelandiiDJ, Rhodococcus erythropolisPR4, Candidatus Solibacter usitatusEllin6076, Desulfobacterium autotrophicumHRM2, Clostridium thermocellumATCC 27405, Schizochytrium minutum, Schizochytrium sp.
  • the microorganism selected from the group consisting of L1 @ ATCC @ 28207 originally contains PUFA-PKS, most preferably Shewanella @ pealeana @ ATCC $ 700345, Shewanella @ oneidensis @ MR-1, Colwellia @ psychrary @ rhya. .
  • a microorganism selected from the group consisting of ATCC # 20888 can include PUFA-PKS which is originally possessed [FEMS @ Microbiol. Lett. (2009), Vol. 295, p170-176; PLoS @ ONE (2011), Vol. 6 (5), art. no. e20146].
  • Table 1 shows examples of the amino acid sequence of each domain of the protein constituting PUFA-PKS and the amino acid sequence of each domain of the protein constituting the known PUFA-PKS used in Examples described later.
  • the protein complex having PUFA-PKS activity and the proteins constituting the protein complex may be physically bound to each other or separated from each other as long as the protein complex has PUFA-PKS activity. Is also good.
  • the protein constituting the protein complex having PUFA-PKS activity may be any of a wild-type protein, a homologous protein and a mutant protein as long as it is a protein having PUFA-PKS activity in cooperation with other proteins. .
  • FIG. 1 shows proteins constituting PUFA-PKS derived from various microorganisms and their domain structures.
  • Table 2 shows examples of amino acid sequences and base sequences of proteins constituting PUFA-PKS in various microorganisms.
  • the nucleotide sequence encoding a protein constituting a protein complex having PUFA-PKS activity is not particularly limited as long as it is a nucleotide sequence encoding a protein having PUFA-PKS activity in cooperation with another protein.
  • a 3-hydroxyhexanoyl in which the protein complex has the PUFA-PKS activity and the PS-DH domain is higher than the FabA-DH domain It is not particularly limited as long as it shows activity against ACP, and examples thereof include the following combinations.
  • the amino acid sequence of each protein is as shown in Table 2.
  • the microorganism (1) uses a microorganism having a PUFA metabolic pathway as a host organism, and has a higher activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP than an endogenous FabA-DH domain, or a gene encoding an exogenous PS-DH domain or the PS-DH domain. It can be obtained by introducing and transfecting a gene encoding a protein having a DH domain.
  • the microorganism (2) is prepared by introducing a gene encoding a domain having PUFA-PKS activity or a gene encoding a protein constituting PUFA-PKS, using a microorganism having no PUFA metabolic pathway as a host organism, Of the PS-DH domain among the domains having PUFA-PKS activity that is expressed in the host organism by the introduction of, the PS-DH domain is a domain showing higher activity against 3-hydroxyhexanoyl ACP than the FabA-DH domain.
  • the gene encoding the PS-DH domain may be introduced into the host cell as a plasmid capable of autonomous replication, when the gene to be replaced in the host cell is replaced with a corresponding foreign gene, when the foreign PS gene is introduced. -Includes the case where the gene encoding the DH domain is incorporated into a region different from the gene encoding PUFA-PKS in the chromosomal DNA in the host cell.
  • each domain constituting PUFA-PKS or the gene encoding the protein constituting PUFA-PKS may be introduced alone or in combination of two or more. It is only necessary to obtain a microorganism having a PS-DH domain that expresses a protein complex having PUFA-PKS activity and exhibits a higher activity for 3-hydroxyhexanoyl @ ACP than the FabA-DH domain.
  • the term “gene” refers to a DNA that may contain a transcription control region, a promoter region, a terminator region, and the like in addition to a protein coding region.
  • the DNA should be a suitable distance (eg, 6 to 18 bases) between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding region, and the initiation codon. It is preferable to use a plasmid adjusted to the above.
  • a transcription termination factor is not always necessary for expression of the DNA, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the gene to be introduced into the host organism can be introduced into the host cell by, for example, using a recombinant gene inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the expression vector includes a promoter, a transcription termination signal, a selection marker gene for selecting a transformant (for example, kanamycin resistance gene, streptomycin resistance gene, carboxin resistance gene, zeocin resistance gene, drug resistance such as hygromycin resistance gene, etc.).
  • Gene which complements an amino acid-required mutation such as leucine, histidine, methionine, arginine, tryptophan, lysine, etc., and a gene which complements a nucleobase-required mutation such as uracil, adenine, etc.).
  • an orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene ura3 gene
  • an orotidylate pyrophosphorylase gene ura5 gene
  • a promoter is defined as a DNA base sequence that initiates RNA synthesis by binding RNA polymerase to DNA, regardless of whether it is a constitutive promoter or a regulated promoter.
  • a strong promoter is a promoter that initiates mRNA synthesis at a high frequency and is preferably used.
  • lac system, trp system, TAC or TRC system, major operator and promoter regions of ⁇ phage, control region of fd coat protein, glycolytic enzymes (eg, 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydration) Promoters, glutamate decarboxylase A, and serine hydroxymethyltransferase can be used depending on the properties of the host cell.
  • regulatory elements include, for example, selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like.
  • Preferred regulatory sequences include, for example, the sequences described in “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185” and Academic Press (1990).
  • the vector there is no particular limitation on the vector as long as the gene of interest can be expressed. No particular limitation is imposed on the type of reagents for constructing the vector, for example, restriction enzymes or ligation enzymes, and commercially available products can be used as appropriate.
  • the promoter in the case of using a Labyrinthura microorganism as a host organism is not particularly limited as long as it is a promoter that functions in the cells of the Labyrinthura microorganism, and examples thereof include an actin promoter, a tubulin promoter, an Elongation factor Tu promoter, and a promoter.
  • An example is a sugar gene expression promoter.
  • pColdI manufactured by Takara Bio Inc.
  • pET21a pCOLADuet-1
  • pACYCDuet-1 pCDF-1b
  • pRSF-1b manufactured by Novagen
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]
  • pBluescript II SK (+), pBluescript II KS (-) manufactured by Stratagene
  • pTrS30 Escherichia coli JM109 / pTrS30 (adjusted from Ferm BP-5407), pTrS32] ⁇ Adjusted from Colli JM109 / pTrS32 (Ferm BP-5408)]
  • pTK31 [APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2007, Vol. 73, no.
  • pPAC31 (WO 98/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Bio Inc.), pUC118 (Takara Bio Inc.), pPA1 (Japan JP-A-63-233798), pHSG298 (manufactured by Takara Bio Inc.), and pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter that functions in cells of a microorganism belonging to the genus Escherichia.
  • a trp promoter Ptrp
  • lac lac promoter
  • PL PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • promoters derived from Escherichia coli, phage, etc. such as PSE promoter, T7 promoter and the like.
  • artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two Ptrps are connected in series, a tac promoter, a trc promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter can also be used.
  • examples of expression vectors include pCG1 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-134500), pCG2 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-35197), and pCG4 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-35197). JP-A-57-183799), pCG11 (JP-A-57-134500), pCG116, pCE54, and pCB101 (all of which are JP-A-58-105999), pCE51, pCE52, and pCE53 [any of them] Molecular and General, Genetics, 196, 175 (1984)].
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in a coryneform bacterium cell.
  • a P54-6 promoter Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, 674-679 (2000).
  • examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp51 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • the promoter in the case of using the expression vector is not particularly limited as long as it is a promoter that functions in cells of a yeast strain.
  • a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, a gal @ 1 promoter, a gal @ 10 promoter, Promoters such as a heat shock polypeptide promoter, an MF ⁇ 1 promoter, and a CUP1 promoter are exemplified.
  • a homologous recombination method As a method for integrating the gene to be introduced into the chromosome of the host organism, a homologous recombination method can be used.
  • the homologous recombination method include a method of introducing a recombinant gene using a homologous recombination system that can be produced by ligating a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot be autonomously replicated in a parent strain to be introduced. it can.
  • a method using homologous recombination frequently used in Escherichia coli a method of introducing a recombinant gene using a homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • a selection method utilizing the fact that Escherichia coli becomes sucrose-sensitive by the Bacillus subtilis levan sucrose integrated on the chromosome together with the gene to be introduced, and a method of transferring a wild-type rpsL gene into Escherichia coli having a streptomycin-resistant mutant rpsL gene
  • a selection method utilizing the fact that E. coli becomes streptomycin sensitive by integration [Mol. Microbiol. , 55, 137 (2005); Biosci. Biotechnol. Biochem. , 71, 905 (2007)] can be used to obtain a microorganism in which the target region on the chromosomal DNA of the parent strain has been replaced with the recombinant DNA.
  • the present invention includes, but is not limited to, an improved method of the ATMT method.
  • a method for introducing a gene to be introduced as a plasmid autonomously replicable in a host organism for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-248394), and the electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • the fact that the microorganism obtained by the above method is the target microorganism means that the microorganism is cultured, PUFA accumulated in the culture is detected by gas chromatography, and the PS-DH domain is converted to FabA-DH by the above method. It can be confirmed by evaluating whether or not it shows activity against 3-hydroxyhexanoyl @ ACP higher than that of the domain.
  • the present invention is characterized in that the microorganism thus formed is cultured in a medium, a PUFA or a PUFA-containing composition is produced and accumulated in the culture, and the PUFA or the PUFA-containing composition is collected from the culture. Includes methods for producing PUFAs or PUFA-containing compositions.
  • PUFA or PUFA contained in the PUFA-containing composition is preferably ⁇ 6 PUFA, for example, DPA or ARA.
  • the PUFA-containing composition includes, for example, PUFA-containing fats and oils or PUFA-containing phospholipids, preferably PUFA-containing fats and oils.
  • a culture of the microorganism can be obtained by inoculating the microorganism into an appropriate medium and culturing the culture according to a conventional method.
  • any known medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt and the like can be used.
  • the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, and galactose, oils and fats such as oleic acid and soybean oil, glycerol, and sodium acetate. These carbon sources can be used, for example, at a concentration of 20 to 300 g per liter of medium.
  • the culture can be continued by feeding the carbon source. By culturing under such conditions, the amount of carbon source to be consumed can be increased, and the production of the PUFA-containing composition can be improved.
  • the nitrogen source examples include organic nitrogen such as yeast extract, corn steep liquor, polypeptone, sodium glutamate, and urea, and inorganic nitrogen such as ammonium acetate, ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium nitrate, ammonium nitrate, and ammonia.
  • organic nitrogen such as yeast extract, corn steep liquor, polypeptone, sodium glutamate, and urea
  • inorganic nitrogen such as ammonium acetate, ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium nitrate, ammonium nitrate, and ammonia.
  • potassium phosphate or the like can be appropriately used in combination.
  • the medium containing each of the above components is preferably used after adjusting the pH to a range of 4.0 to 9.5 by adding an appropriate acid or base, followed by sterilization by an autoclave.
  • the culture temperature is generally from 10 to 45 ° C, preferably from 20 to 37 ° C.
  • the culture temperature is preferably controlled to a culture temperature at which a PUFA-containing composition can be produced.
  • the pH at the time of culturing is generally 3.5 to 9.5, preferably 4.5 to 9.5.
  • the particularly preferred pH varies depending on the purpose, and is from 5.0 to 8.0 in order to produce a large amount of fats and oils.
  • the culturing time can be, for example, 2 to 7 days, and the culturing can be performed by aeration and stirring cultivation.
  • the method of separating the culture solution and the microorganism from the culture can be performed by a conventional method known to those skilled in the art, for example, by centrifugation or filtration. After crushing the microorganisms separated from the above culture using, for example, ultrasonic waves or a dyno mill, the PUFA-containing composition can be obtained by performing solvent extraction with, for example, chloroform, hexane, or butanol.
  • the PUFA-containing composition produced by the above-mentioned production method may be, for example, a low-temperature solvent fractionation method [Shotataro Takahashi, Oil Chemistry, 40: 931-941 (1991)], or a short-chain fatty acid with a hydrolase such as lipase.
  • a PUFA-containing composition having a high PUFA content can be obtained by concentrating a PUFA-containing composition by a method such as a method of removing elimination [Kotaro Takahashi, Yuyu Kagaku, 40: 931-941 (1991)] or the like.
  • PU PUFA can be produced by separating and collecting PUFA from the PUFA-containing composition. For example, after preparing a mixed fatty acid containing PUFA from a PUFA-containing composition by a hydrolysis method, for example, the PUFA is separated by a urea addition method, a cooling separation method, a high performance liquid chromatography method, a supercritical chromatography method, or the like. PUFA can be produced by collecting the urea.
  • PUFA alkyl esters can be produced by separating and collecting PUFA alkyl esters from the PUFA-containing composition.
  • the PUFA alkyl ester is not particularly limited as long as it is a PUFA alkyl ester, and is preferably a PUFA ethyl ester.
  • a mixed fatty acid alkyl ester containing a PUFA alkyl ester is prepared from the PUFA-containing composition by an alcoholysis method, and then, for example, a urea addition method, cooling separation
  • the method can be carried out by separating and collecting the PUFA alkyl ester by a method, high performance liquid chromatography or supercritical chromatography.
  • ARA manufacturing method-1 Construction of each expression plasmid [construction of pET-phoA] PCR was performed using the genomic DNA of Photobacterium profundum SS99 (ATCC BAA-1252) strain extracted by a conventional method as a template using the primers represented by SEQ ID NOS: 107 and 108, and the DNA encoding the PhoA protein (represented by SEQ ID NO: 65). The 3 ′ end region (from the 633rd base to the stop codon) was amplified.
  • the obtained DNA fragment was treated with restriction enzymes BamHI and EagI, and ligated with the same restriction enzyme-treated Escherichia coli vector pBluescript ⁇ II ⁇ SK (+) (manufactured by Agilent Technologies) to obtain pBlue-PhoA-C-. Terminal was obtained.
  • PCR was carried out using the genomic DNA of Photobacterium ⁇ profundum ⁇ SS99 strain extracted by a conventional method as a template and the primers represented by SEQ ID NOS: 109 and 110, and the 5 'end region of the DNA encoding the PhoA protein (from the start codon to the Up to the 633rd base).
  • the obtained DNA fragment and Escherichia coli vector pET21a (manufactured by Merck Millipore) were treated with restriction enzymes NdeI and EagI, respectively, and the obtained restriction enzyme-treated fragments were ligated to obtain pET-phoA-N-terminal.
  • pBlue-PhoA-C-terminal and pET-phoA-N-terminal were treated with restriction enzymes EagI and XhoI, respectively, and the obtained restriction enzyme-treated fragments were ligated to obtain pET-phoA.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Photobacterium profundum SS99 strain extracted by a conventional method as a template and the primers represented by SEQ ID NOS: 111 and 112, and the DNA encoding the PhoD protein (DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 71) ) was amplified.
  • the obtained DNA fragment was treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, and ligated with E. coli vector pCOLADuet-1 (manufactured by Merck Millipore) which had been treated with NdeI and BglII to obtain pCOLA-phoD.
  • PCR was carried out using the genomic DNA of Photobacterium ⁇ profundum ⁇ SS99 strain extracted by a conventional method as a template using the primers represented by SEQ ID NOS: 113 and 114, and the DNA encoding the PhoB protein (a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 67) ) was amplified.
  • the obtained DNA fragment was treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, and ligated with pACYC-SoppaE which had been treated with NdeI and BglII to obtain pACYC-epaE-phoB.
  • PCR PCR was performed using pACYC-epaE-phoB as a template and primers represented by SEQ ID NOS: 114 and 115 to obtain a DNA fragment having a DNA encoding the PhoB protein.
  • PCR was carried out using the E. coli vector pCOLADuet-1 (manufactured by Merck Millipore) as a template and primers represented by SEQ ID NOS: 116 and 117 to amplify a DNA fragment of the T7 promoter region.
  • the obtained two DNA fragments were assembled by overlap extension PCR.
  • the obtained DNA fragment and pCOLA-phoD were treated with restriction enzymes ApaI and BamHI, respectively, and the obtained restriction enzyme-treated fragment was ligated to obtain pCOLA-phoD-phoB.
  • [Construction of pCDF-phoC] PCR was performed using the genomic DNA of Photobacterium profundum SS99 strain extracted by a conventional method as a template using the primers represented by SEQ ID NOS: 118 and 119, and a DNA encoding the PhoC protein (a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 69) ) was amplified from the start codon to the 993th base.
  • PCR was carried out using the genomic DNA of Photobacterium ro profundum SS99 strain extracted by a conventional method as a template and the primers represented by SEQ ID NOS: 120 and 121, and the 3'-terminal region of the DNA encoding the PhoC protein (933rd From the base to the stop codon).
  • the obtained DNA fragment and pCDF-phoC-N-terminal were treated with restriction enzymes NcoI and BamHI, and the obtained restriction enzyme-treated fragment was ligated to obtain pCDF-phoC.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Shewanella oneidensis MR-1 (ATCC BAA-1096) strain extracted by a conventional method as a template and primers represented by SEQ ID NOS: 122 and 123, and a DNA encoding the EpaA protein (SEQ ID NO: 73) A DNA fragment having a base sequence represented by the following formula: was amplified.
  • the obtained DNA fragment and Escherichia coli vector pET21a (manufactured by Merck Millipore) were treated with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and the obtained restriction enzyme-treated fragment was ligated to obtain pET-epaA ′.
  • overlap extension PCR was performed using pET-epaA 'as a template and primers represented by SEQ ID NOS: 124, 125, 126 and 127 to amplify the EpaA gene excluding the 5'-terminal His-tag gene. .
  • the obtained DNA fragment and pET-epaA ' were treated with restriction enzymes ApaI and SalI, and the obtained restriction enzyme-treated fragment was ligated to obtain pET-epaA.
  • the obtained DNA fragment and Escherichia coli vector pET21a (manufactured by Merck Millipore) were treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the obtained restriction enzyme-treated fragment was ligated to obtain pET-araA.
  • PCR was performed using pSTV29-Plac-pfaAB (FEBS Lett., 2014, 588 (21), 4032-4036) as a template and primers represented by SEQ ID NOS: 130 and 131, and DNA encoding AraB protein (SEQ ID NO: A DNA fragment having a base sequence represented by SEQ ID NO: 57) was amplified.
  • the obtained DNA fragment was treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, and ligated with pACYC-SoppaE treated with NdeI and BglII to obtain pACYC-epaE-araB.
  • the obtained DNA fragment and pCDF-orfB (Sci. Rep., 2016, 6, 35441) were treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the obtained restriction enzyme-treated fragment was ligated to obtain pCDF-araC. .
  • the obtained DNA fragment was treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, and ligated with E. coli vector pCOLADuet-1 (manufactured by Merck Millipore) treated with NdeI and BglII to obtain pCOLA-araD.
  • the obtained Escherichia coli was inoculated into 2 mL of a Terrific Broth medium (manufactured by Becton, Dickinson and Company) containing 100 mg / L of ampicillin, 20 mg / L of kanamycin, 30 mg / L of chloramphenicol, and 20 mg / L of streptomycin. Shaking culture was performed at 16 ° C. for 16 hours.
  • 1 mL of the obtained culture solution was newly prepared in a Terrific Broth medium (Becton Dickinson & Company) containing 100 mg / L ampicillin, 20 mg / L kanamycin, 30 mg / L chloramphenicol, 20 mg / L streptomycin, and 1 mM IPTG. (Manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) into a 200 mL-winged flask containing 20 mL, and cultured at 230 rpm at 20 ° C. for 48 hours.
  • a Terrific Broth medium Becton Dickinson & Company
  • a culture solution is collected and subjected to the Blight-Dyer method [Bright, e. G. FIG. and @Dyer, W.C. J. (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917], the fatty acid was methylated with a boron trifluoride / methanol solution, and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry.
  • Table 3 shows the results of measurement of ARA, EPA, dihomo- ⁇ -linolenic acid (hereinafter referred to as DGLA) and eicosatetraenoic acid (hereinafter referred to as ETA) in the culture solution.
  • DGLA dihomo- ⁇ -linolenic acid
  • ETA eicosatetraenoic acid
  • Escherichia coli producing PhoA protein, PhoB protein, PhoC protein, PhoD protein and EpaE protein mainly produced EPA and did not produce ARA, whereas PhoA protein, PhoB protein, PhoC protein, Escherichia coli, which also produces AraB protein in addition to PhoD and EpaE proteins, produced ARA in the same amount as EPA.
  • the obtained Escherichia coli was inoculated into 2 mL of a Terrific Broth medium (manufactured by Becton, Dickinson and Company) containing 100 mg / L of ampicillin, 20 mg / L of kanamycin, 30 mg / L of chloramphenicol, and 20 mg / L of streptomycin. Shaking culture was performed at 16 ° C. for 16 hours.
  • 1 mL of the obtained culture solution was newly prepared in a Terrific Broth medium (Becton Dickinson & Company) containing 100 mg / L ampicillin, 20 mg / L kanamycin, 30 mg / L chloramphenicol, 20 mg / L streptomycin, and 1 mM IPTG. (Manufactured by K.K.) in a 200-mL winged flask containing 20 mL, and cultured at 230 rpm and 20 ° C. for 48 hours.
  • a Terrific Broth medium Becton Dickinson & Company
  • Table 4 shows the results of measuring ARA, EPA, DGLA and ETA in the culture solution.
  • EpaA protein, PhoB protein, PhoC protein, Escherichia coli producing PhoD protein and EpaE protein mainly produced EPA and did not produce ARA
  • the obtained Escherichia coli was inoculated into 2 mL of a Terrific Broth medium (manufactured by Becton, Dickinson and Company) containing 100 mg / L of ampicillin, 20 mg / L of kanamycin, 30 mg / L of chloramphenicol, and 20 mg / L of streptomycin. Shaking culture was performed at 16 ° C. for 16 hours.
  • 1 mL of the obtained culture solution was newly prepared in a Terrific Broth medium (Becton Dickinson & Company) containing 100 mg / L ampicillin, 20 mg / L kanamycin, 30 mg / L chloramphenicol, 20 mg / L streptomycin, and 1 mM IPTG. (Manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) into a 200 mL-winged flask containing 20 mL, and cultured at 230 rpm at 20 ° C. for 48 hours.
  • a Terrific Broth medium Becton Dickinson & Company
  • Table 5 shows the results of measuring ARA, EPA, DGLA and ETA in the culture solution.
  • Escherichia coli producing AraA protein, AraB protein, AraC protein, AraD protein and EpaE protein had all PUFAs below the detection limit, whereas EpaA protein, AraB protein, AraC protein and AraD protein.
  • E. coli producing E. coli and EpaE proteins and E. coli producing PhoA, AraB, AraC, AraD and EpaE proteins produced significant amounts of ARA.
  • Example 2 Manufacturing method of DPA Construction of each expression plasmid [pET-orfA] According to a method similar to that of Hayashi et al. (Sci. Rep., 2016, 6, 35441), Shizochytrium sp. An expression plasmid pET-orfA having DNA encoding the OrfA protein (DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 83) derived from the (ATCC20888) strain was obtained.
  • PCDF-orfB According to a method similar to that of Hayashi et al. (Sci. Rep., 2016, 6, 35441), Shizochytrium sp.
  • the obtained Escherichia coli was inoculated into 2 mL of a Terrific Broth medium (manufactured by Becton, Dickinson and Company) containing 100 mg / L of ampicillin, 20 mg / L of kanamycin, 30 mg / L of chloramphenicol, and 20 mg / L of streptomycin. Shaking culture was performed at 16 ° C. for 16 hours.
  • 1 mL of the obtained culture solution was newly prepared in a Terrific Broth medium (Becton Dickinson & Company) containing 100 mg / L ampicillin, 20 mg / L kanamycin, 30 mg / L chloramphenicol, 20 mg / L streptomycin, and 1 mM IPTG. (Manufactured by K.K.) in a 200-mL winged flask containing 20 mL, and cultured at 230 rpm and 20 ° C. for 48 hours.
  • a Terrific Broth medium Becton Dickinson & Company
  • Table 6 shows the results of measuring DPA, DHA, EPA and ETA in the culture solution.
  • Escherichia coli producing OrfA protein, OrfB protein, OrfC protein and EpaE protein mainly produced DHA
  • E. coli producing AraB protein in addition to OrfA protein, OrfB protein, OrfC protein and EpaE protein E. coli produced DPA equal to or greater than DHA.

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Abstract

本発明は、効率的にＰＵＦＡを生産する微生物及び該微生物を用いたＰＵＦＡの製造法を提供することを目的とする。本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）代謝経路を有する微生物に、３－ヒドロキシヘキサノイル　アシルキャリアー蛋白質（３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰ）に対する活性が、内在のＦａｂＡ様β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラターゼ（ＦａｂＡ－ＤＨ）ドメインよりも高い、外来のポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（ＰＳ－ＤＨ）ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物等に関する。

Description

多価不飽和脂肪酸を生産する微生物及び多価不飽和脂肪酸の製造法
　本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生産する微生物及び該微生物を用いてＰＵＦＡを製造する方法に関する。
　ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）、エイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）、アラキドン酸（以下、ＡＲＡという。）、ドコサペンタエン酸（以下、ＤＰＡという。）等、分子内に不飽和結合を複数有する長鎖脂肪酸のことを多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという。）という。ＰＵＦＡは、動脈硬化や高脂血症の予防等様々な生理機能を有することが知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。
　ＰＵＦＡは、分子中のメチル末端からの二重結合の位置により、ＤＨＡやＥＰＡのようなω３脂肪酸、ＤＰＡやＡＲＡのようなω６脂肪酸、９番目の炭素に最初に二重結合が導入されているω９脂肪酸、１１番目の炭素に最初に二重結合が導入されているω１１脂肪酸等に分類することができる。
　ＰＵＦＡの生合成経路としては、好気経路と多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼ（以下、ＰＵＦＡ－ＰＫＳという。）による嫌気経路の二種類が知られている。好気経路は、脂肪酸合成酵素によって合成されたパルミチン酸等の長鎖脂肪酸に、複数の不飽和化酵素による二重結合の導入や鎖伸長酵素による炭素鎖の伸長がなされることによりＰＵＦＡが合成される経路で、多くの生物が有する古くから知られている合成経路である（非特許文献３）。一方、ＰＵＦＡ－ＰＫＳによる嫌気経路は、アセチル－ＣｏＡやマロニル－ＣｏＡからＰＵＦＡを合成する経路で、一部の海洋性細菌やラビリンチュラ類真核生物がＤＨＡやＥＰＡを生産する経路として有することが知られている（非特許文献４及び非特許文献５）。また、ＡＲＡ生産系としては、例えばＡｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａのＡＲＡ生産系が知られている（非特許文献６）。
　ＰＵＦＡ－ＰＫＳは、複数の蛋白質から構成される複合酵素（以下、蛋白質複合体ともいう。）であり、各蛋白質にはＰＵＦＡの合成に関わる複数の機能ドメインが存在している。
　ＰＵＦＡ－ＰＫＳに存在する機能ドメインとしては、マロニル－ＡＣＰとアシル－ＡＣＰの縮合に関わるとされているβ－ケトアシル－アシルキャリアー蛋白質シンターゼドメイン（以下、ＫＳドメインという。）、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能するとされているアシルキャリアー蛋白質ドメイン（以下、ＡＣＰドメインという。）、縮合により生成するカルボニル基を還元するとされているケトレダクターゼドメイン（以下、ＫＲドメインという。）、ＫＲドメインにより生成した水酸基を脱水して二重結合を形成するとされているＤＨドメイン、炭素鎖の伸長に関わるとされている鎖伸長因子ドメイン（以下、ＣＬＦドメインという。）、得られた二重結合を還元するとされているエノイルレダクターゼドメイン（以下、ＥＲドメインという。）、アシル基の転移に関わるとされているアシルトランスフェラーゼドメイン（以下、ＡＴドメインという。）及びマロニル－ＣｏＡ：アシルトランスフェラーゼドメイン（以下、ＭＡＴドメインという。）、並びにＡＣＰドメインを活性化するとされているホスホパンテテイントランスフェラーゼドメイン（以下、ＰＰＴドメインという。）があり、これら複数のドメインが協働して働くことで脂肪酸の炭素鎖が伸長すると考えられている。
　ＡＲＡの工業的な生産方法としては、カビのバイオマスから単離する方法（特許文献１）が知られているが、目的以外の不飽和脂肪酸の副生が多いという課題があり、効率的なＡＲＡの生産方法が求められていた。
　ＰＵＦＡ－ＰＫＳは、その種類によって生産するＰＵＦＡの種類が異なることが知られている。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．及びＭｏｒｉｔｅｌｌａ　ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳではＤＨＡが、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ及びＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳではＥＰＡが、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳではＡＲＡが主要な産物として生産され、他のＰＵＦＡはほとんど生産されないか、生産されるとしても主生産物に比べると少量である。
　このように、ＰＵＦＡ－ＰＫＳは高い生産物特異性を有するが、これまでにＰＵＦＡ－ＰＫＳの機能解析を目的とした多くの研究がなされている。
　非特許文献４及び７では、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌やストラメノパイル類真核生物からＰＵＦＡ－ＰＫＳ遺伝子をクローニングして異種生物中で発現させ、ＰＵＦＡを生産させる検討がなされている。
　非特許文献８では、ＤＨＡを生産するＭｏｒｉｔｅｌｌａ　ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳの構成遺伝子であるｐｆａＢ遺伝子と、ＥＰＡを生産するＳｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍａｔｏｐｈｏｒｉ由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成するｐｆａＢ遺伝子とを用いた研究により、ＡＴドメインをコードするｐｆａＢ遺伝子が生産されるＰＵＦＡの種類に関与することが開示されている。
　非特許文献９では、大腸菌にＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳのＤＨドメインを導入すると、脂肪酸の生産量が増加し、かつ不飽和脂肪酸の割合が増加することが開示されている。
日本国特開２００６－２１９５２８号公報 国際公開第２００８／１４４４７３号
Ａｎｎｕ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，１９９１，３５，１２８－１３１ Ｊ．Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，１９９４，１３，６５８－６６４ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８３，５２，５３７－５７９ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３，２９０－２９３ ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１１，６，ｅ２０１４６ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｖｏｌｕｍｅ　６，　Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：３５４４１（２０１６）、Ｆｉｇ．５ Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００９，４７，４７２－４７８ ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００９，２９５，１７０－１７６ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１８，８４７－８５６
　従来のＰＵＦＡ生産性微生物によるＰＵＦＡ生産系として、例えば非特許文献６に記載の微生物によるＡＲＡ生産系があるが、該ＡＲＡ生産系によるＡＲＡの生産性は工業的レベルにおいては十分ではない。また、特許文献１に記載の方法のようにカビのバイオマスからＡＲＡを単離する方法では、目的以外の不飽和脂肪酸の副生が多いという課題がある。
　したがって、本発明は、効率的にＰＵＦＡを生産する微生物及び該微生物を用いたＰＵＦＡの製造法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ω３ＰＵＦＡを生産し得る微生物において、ＰＵＦＡ生産系における脂肪酸基質である３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性の強さがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高いＰＳ－ＤＨドメインの遺伝子を導入することにより、本来の産物であるω３ＰＵＦＡではなく、ＰＵＦＡにおける末端の炭素原子から数えてω６位の位置に最初の二重結合が形成されたω６ＰＵＦＡを効率良く生産できることを見出し、本発明を完成させた。
１．ＰＵＦＡという代謝経路を有する微生物に、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性が、内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い、外来のＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
２．ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がω３ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである、前記１に記載の微生物。
３．ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がＥＰＡ又はＤＨＡ代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがＡＲＡ又はＤＰＡである、前記１又は２に記載の微生物。
４．ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に由来する前記１～３のいずれか１に記載の微生物。
５．ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する下記（ａ）～（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
（ａ）ＫＳドメイン
（ｂ）ＭＡＴドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ＫＲドメイン
（ｅ）ＰＳ－ＤＨドメイン
（ｆ）ＣＬＦドメイン
（ｇ）ＡＴドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ－ＤＨドメイン
（ｉ）ＥＲドメイン
（ｊ）ＰＰＴドメイン
６．前記１～４のいずれか１に記載のＰＵＦＡを生産し得る微生物が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子を全て有する前記５に記載の微生物。
７．生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである前記５又は６に記載の微生物。
８．生産し得るＰＵＦＡがＡＲＡ又はＤＰＡである前記５～７のいずれか１に記載の微生物。
９．ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物である前記５～８のいずれか１に記載の微生物。
１０．ＰＳ－ＤＨドメインが、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢのＰＳ－ＤＨドメインである、前記１～９のいずれか１に記載の微生物。
１１．前記１～１０のいずれか１に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を採取する、ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
１２．下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＰＵＦＡを生産し得る微生物を用いるＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
（Ｉ）ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物に、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性が内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高いＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
（ＩＩ）ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する下記（ａ）～（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
（ａ）ＫＳドメイン
（ｂ）ＭＡＴドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ＫＲドメイン
（ｅ）ＰＳ－ＤＨドメイン
（ｆ）ＣＬＦドメイン
（ｇ）ＡＴドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ－ＤＨドメイン
（ｉ）ＥＲドメイン
（ｊ）ＰＰＴドメイン
　本発明の微生物は、ＰＵＦＡを生産し得る微生物において、脂肪酸基質である３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性の強さが、ＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高いＰＳ－ＤＨドメインの遺伝子が導入されていることにより、該微生物内におけるＰＳ－ＤＨドメインの３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する反応性がＦａｂＡ－ＤＨドメインと比較して相対的に高く、目的とするＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を効率良く製造することができる。本発明の製造法によれば、低コスト且つ高効率でＰＵＦＡを生産することができ、ＰＵＦＡの工業的レベルでの生産に適用し得る。
図１は、各種微生物におけるＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質及びそのドメイン構造の模式図を示す。
　本発明において、「多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）」とは、炭素鎖長が１８以上で不飽和結合数が２以上の長鎖脂肪酸をいう。また、本明細書において「ドメイン」とは、蛋白質中の連続するアミノ酸配列からなる一部分であって、当該蛋白質において、特定の生物学的活性又は機能を有する領域である。
　本発明において、「ＰＵＦＡ－ＰＫＳ」とはＰＵＦＡ　ｓｙｎｔｈａｓｅと同義である。ＰＵＦＡ　ｓｙｎｔｈａｓｅは、マロニル－ＣｏＡ等を炭素源として用いて特異的な長鎖の不飽和脂肪酸を合成する酵素群であり、ＫＳ、ＭＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲ、ＰＳ－ＤＨ、ＣＬＦ、ＡＴ、ＦａｂＡ－ＤＨ、ＥＲ、ＰＰＴａｓｅの各ドメインを含有するものをいう（ＡＣＯＳ　Ｌｉｐｉｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ：ＰＵＦＡ　ｓｙｎｔｈａｓｅ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３，２９０－２９３；ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１１，６，ｅ２０１４６等）。
　ＫＳドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、マロニルＡＣＰとアシルＡＣＰの縮合に関わるドメインをいう。
　ＭＡＴドメイン、ＡＴドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、アシル基の転移に関わるドメインのことをいう。
　ＡＣＰドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能する、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性に必須のドメインをいう。
　ＫＲドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、縮合により生成するケトン基の還元に関わるドメインをいう。
　ＤＨドメインである、ＰＳ－ＤＨドメイン及びＦａｂＡ－ＤＨドメインは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ケトン基を還元することによって生じた水酸基の脱水に関わるドメインのことをいう。
　ＣＬＦドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、炭素鎖の伸長に関わるドメインのことをいう。
　ＥＲドメインとは、アシル転移酵素ドメイン、マロニル－ＣｏＡ：ＡＣＰアシル転移酵素ドメインとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、アシル基の転移に関わるドメインのことをいう。
　ＰＰＴａｓｅとは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する酵素であり、ＡＣＰドメインの活性化に関わる酵素のことをいう。
　本明細書において「協働する」とは、ある蛋白質を他の蛋白質と共存させたとき、一体となって特定の反応を行うことであり、特に本明細書では、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性に必要な複数のドメインを共存させたとき、他のドメインと一体となってＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を示すことをいう。
　本明細書において「外来の」とは内在性ではなく、異種由来のものをいい、形質転換前の宿主生物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、該遺伝子によりコードされる蛋白質が実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該蛋白質のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に内因性蛋白質の活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子を宿主生物に導入することを意味するために用いられる。
　本明細書において、「宿主生物」とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元の生物のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元の生物が微生物の場合は、親株、宿主株ともいう。
〔微生物〕
　本発明の微生物としては、下記（１）又は（２）の微生物が挙げられる。
（１）ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物に、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性が、ＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い、外来のＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
（２）ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有するＫＳ、ＭＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲ、ＰＳ－ＤＨ、ＣＬＦ、ＡＴ、ＦａｂＡ－ＤＨ、ＥＲ、ＰＰＴａｓｅの各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
　ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物とは、生来的にＰＵＦＡ生産能を有する微生物をいう。ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物としては、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属が挙げられる。
　ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物としては、ω３ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物が好ましく、例えば、ＤＨＡ代謝経路を有する微生物、ＥＰＡ代謝経路を有する微生物が挙げられる。
　ＤＨＡ代謝経路を有する微生物としては、例えば、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の微生物が挙げられる。好ましくはモリテラ・マリナ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ　ｍａｒｉｎａ）、コルウェリア・サイクレリスラエア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、オーランチオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ・ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ａｕｒｅｕｍ）等が挙げられるがＤＨＡ代謝経路を有する限り、これらに限定されない。
　ＤＨＡ代謝経路を有する微生物としては、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物が好ましく、例えばオーランチオキトリウム　エスピー　ＯＨ４株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２４）などが挙げられ、さらにその変異株であってＤＨＡ生産能を有する微生物を用いてもよい。
　前記のオーランチオキトリウム　エスピー　ＯＨ４株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６（郵便番号３０５－８５６６）に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センターに寄託された。受領日（寄託日）は平成２５年（西暦２０１３年）１月１１日であり、受託番号はＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２４である。
　ＥＰＡ代謝経路を有する微生物としては、例えば、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の微生物が挙げられる。好ましくはシュワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、シュワネラ・リビングストネンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅｎｓｉｓ）、シュワネラ・バルティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｂａｌｔｉｃａ）、シュワネラ・ペアレアナ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｐｅａｌｅａｎａ）、フォトバクテリウム・プロフンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）等が挙げられるがＥＰＡ代謝経路を有する限り、これらに限定されない。
　ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物とは、生来的にＰＵＦＡ生産能を有さない微生物をいう。ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物としては、例えば、細菌、微細藻類、真菌、原生生物、原生動物が挙げられる。
　細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、及びオーレオスピラ（Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ）属からなる群より選ばれる属に属する微生物が挙げられる。これらの中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ－０１１０及びＡｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａ　ＪＣＭ２３２０１からなる群より選ばれる微生物が好ましい。
　微細藻類としては、例えば、ユーグレナ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属 およびペラネマ（Ｐｅｒａｎｅｍａ）属］、緑藻綱（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属］、サヤツナギ綱（Ｄｉｎｏｂｒｙａｃｅａｅ）［例えば、サヤツナギ（Ｄｉｎｏｂｒｙｏｎ）属、プラチクリシス（Ｐｌａｔｙｃｈｒｙｓｉｓ）属およびクリソクロムリナ（Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）属］、渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、クリプセコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、ギムノジニウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）属、ペリジリウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）属、セラチウム（Ｃｅｒａｔｉｕｍ）属、ギロジニウム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）属およびオキシルリス（Ｏｘｙｒｒｈｉｓ）属］、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属およびロドモナス（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）属］、黄緑藻綱（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）［例として、オリストディスカス（Ｏｌｉｓｔｈｏｄｉｓｃｕｓ）属］［かつ、鞭毛虫リゾクロリス類（Ｒｈｉｚｏｃｈｌｏｒｉｄａｃｅａｅ）ならびにアファノカエテパシェリ（Ａｐｈａｎｏｃｈａｅｔｅ　ｐａｓｃｈｅｒｉ）、ブミレリアスティゲオクロニウム（Ｂｕｍｉｌｌｅｒｉａ　ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ）およびバウケリアゲミナタ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ　ｇｅｍｉｎａｔａ）の遊走子／配偶子においてのようなアメーバ状期を生じる藻類の品種を含む］、真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）およびプリムネシウム藻綱（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｙｃｅａｅ）［例えば、プリムネシウム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ）属およびディアクロネマ（Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ）属を含む］が挙げられる。
　これらの属内の好ましい種は、特に限定されないが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ　ｏｃｕｌａｔａ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ　ｃｏｈｎｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓが挙げられる。
　真菌としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属［例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）］を含む酵母、もしくはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のような他の酵母、又は他の真菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属のような繊維状真菌などが挙げられる。
　微生物（２）としては、上記した微生物（１）が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子が全て導入された微生物、すなわち上記した微生物（１）が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子を全て有する微生物であることが好ましい。
　本発明において「３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性」とは、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対して優先的に作用する活性であり、より詳しくは３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する反応性（親和性）をいう。３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性はデヒドラターゼの逆反応（水酸化反応）を評価する手法により測定できる。
　前記手法としては、例えば、基質となるｃｒｏｔｏｎｙｌ　ＡＣＰ又は２－ｔｒａｎｓ－ｈｅｘｅｎｏｙｌ　ＡＣＰが調製される条件において、ＦａｂＡ－ＤＨドメイン又はＰＳ－ＤＨドメインを含む蛋白質を添加して得られた生産物をＨＰＬＣで分析し、ピークの高さを比較することにより生成物の量（ｃｒｏｔｏｎｙｌ　ＡＣＰを基質とした場合の産物：３－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｂｕｔｙｒｙｌ－ＡＣＰ、２－ｔｒａｎｓ－ｈｅｘｅｎｏｙｌ　ＡＣＰを基質とした場合の産物：３－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｈｅｘａｎｏｙｌ－ＡＣＰ）を比較する。そして、ｃｒｏｔｏｎｙｌ　ＡＣＰを基質とした場合の産物の量が２－ｔｒａｎｓ－ｈｅｘｅｎｏｙｌ　ＡＣＰを基質とした場合の産物の量よりも少ない場合に、ＰＳ－ＤＨドメインの３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性がＦａｂＡ－ＤＨドメインの該活性より高い、と判断する。
　本発明において、「ＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示す」とは、具体的には例えば、下記反応条件により反応させたＨＰＬＣピークの高さについて、２－ｔｒａｎｓ－ｈｅｘｅｎｏｙｌ　ＡＣＰを基質とした場合の産物についてのＨＰＬＣピークの高さがｃｒｏｔｏｎｙｌ　ＡＣＰを基質とした場合の産物についてのＨＰＬＣピークの高さの１．５倍以上であることが好ましく、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上である。
（反応条件）
　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　８０ｍＭ、ＮａＣｌ　８０ｍＭ、ＭｇＣｌ２　２５ｍＭ、基質となるＡＣＰ　１００μＭ、Ｓｆｐ　２０μＭ、アシル－ＣｏＡ　３００μＭを混合し、２０℃にて１０分間反応させた系に、ＰＳ－ＤＨドメイン及びＦａｂＡ－ＤＨドメインを含む蛋白質を１μＭまたは５μＭ添加して、２０℃にて反応させる。反応開始から１、５、１０、３０、６０分後にサンプルを回収し、ＬＣ／ＭＳ分析を行い、ＨＰＬＣピークの高さを解析する。前記Ｓｆｐとは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の４’－ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを意味する。
　具体的には、例えば、上記した微生物（１）の場合、ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物における内在のＰＳ－ＤＨドメインの３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性が内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインと比較して同程度以下であるところ、内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも該活性が高い、ＰＳ－ＤＨドメインをコードする外来の遺伝子を該微生物に導入することにより、該微生物内におけるＰＳ－ＤＨドメインの３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ－ＤＨドメインと比較して相対的に高い微生物となる。
　また、例えば、上記した微生物（２）の場合、ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に遺伝子を導入して発現させたＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する各ドメインのうち、ＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有することにより、該微生物内におけるＰＳ－ＤＨドメインの３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ－ＤＨドメインと比較して相対的に高い微生物となる。
　微生物内におけるＰＳ－ＤＨドメインの３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ－ＤＨドメインと比較して相対的に高いことにより、該微生物のＰＵＦＡ代謝経路においてＦａｂＡ－ＤＨドメインよりもＰＳ－ＤＨドメインが優先的に３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに反応し、ＰＳ－ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡの生合成経路によりＰＵＦＡが生産される。
　ＦａｂＡ－ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡ生合成経路及びＰＳ－ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡ生合成経路として、ＦａｂＡ－ＤＨドメインが機能するω３ＰＵＦＡの生合成経路とＰＳ－ＤＨドメインが機能するω６ＰＵＦＡの生合成経路が挙げられる。
　ＦａｂＡ－ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡ生合成経路で得られるＰＵＦＡにおける、末端の炭素原子から数えた二重結合の位置をω（α）位（例えば、ω３位）とすると、ＰＳ－ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡの生合成経路で得られるＰＵＦＡは、該末端の炭素原子から数えた二重結合の位置がω（α＋３）位（例えば、ω６位）となる。
　したがって、例えば、内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインがＰＳ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有するω３ＰＵＦＡの代謝経路を有する微生物に対し、該内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する外来のＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子を導入することにより、該微生物内におけるＰＳ－ＤＨドメインの３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ－ＤＨドメインと比較して相対的に高くなる。その結果、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対し、ＦａｂＡ－ＤＨドメインよりもＰＳ－ＤＨドメインが優先的に作用し、ω６ＰＵＦＡを最終産物として生産し得る微生物となる。
　本発明において、ＰＳ－ＤＨドメインとしては、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢ上のＰＳ－ＤＨドメイン［配列番号２で表されるアミノ酸配列（配列番号１３６で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］、又はＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ　ｔｏｒｑｕｉｓ由来のｐｆａＢ上のＰＳ－ＤＨドメイン［配列番号１３７で表されるアミノ酸配列（配列番号１３９で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］が挙げられ、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａ由来のａｒａＢ上のＰＳ－ＤＨドメインが好ましい。これらの配列は公知であり、適宜使用することができる。また、公知の配列を利用して、内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有するＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子を得ることができる。
　より具体的には、本発明で使用するＰＳ－ＤＨドメインとしては、好ましくは、以下が挙げられる。
［１］配列番号２又は配列番号１３７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２又は配列番号１３７で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２又は配列番号１３７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質
　ＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子は、ＰＳ－ＤＨドメインを有する蛋白質をコードする遺伝子を微生物に導入することにより微生物に導入してもよい。ＰＳ－ＤＨドメインを有する蛋白質としては、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢ［配列番号５８で表されるアミノ酸配列（配列番号５７で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ　ｔｏｒｑｕｉｓ由来のＰｆａＢ［配列番号１３８で表されるアミノ酸配列（配列番号１４０で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］が挙げられる。
　より具体的には、本発明で使用するＰＳ－ＤＨドメインを有する蛋白質としては、好ましくは、以下が挙げられる。
［４］配列番号５８又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［５］配列番号５８又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する変異蛋白質
［６］配列番号５８又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質
　配列番号５８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は８０１アミノ酸残基からなる蛋白質であり、Ｎ末端側から、５３１～７９０残基にＰＳ－ＤＨドメインを有する。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失、置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を付加して得られる蛋白質をいう。上記の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
　欠失、置換又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造及び機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．ＮＡＴドメインｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本発明で使用するＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子とは、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であれば限定されないが、好ましくは、以下のいずれか１のＤＮＡを有する遺伝子が挙げられる。
［７］上記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質をコードするＤＮＡ
［８］配列番号１３６又は配列番号１３９で表される塩基配列を含むＤＮＡ
［９］前記［７］又は［８］に記載のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１０］前記［７］又は［８］に記載のＤＮＡの塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　また、ＰＳ－ＤＨドメインを有する蛋白質をコードする遺伝子としては、好ましくは、以下のいずれか１のＤＮＡを有する遺伝子が挙げられる。
［１１］上記［４］～［６］のいずれか１の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１２］配列番号５７又は配列番号１４０で表される塩基配列を含むＤＮＡ
［１３］前記［１１］又は［１２］に記載のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１４］前記［１１］又は［１２］記載のＤＮＡの塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部が他のＤＮＡと相補的に複合体を形成することをいう。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ＧｅｎＥＲドメインａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢａｃｔＥｒｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。
　ストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、対象となるＤＮＡの塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
　微生物（２）に導入されるＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する各ドメインとしては、ＫＳドメイン、ＭＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＣＬＦドメイン、ＡＴドメイン、ＤＨドメインであるＦａｂＡ－ＤＨドメイン、ＥＲドメイン及びＰＰＴドメインが挙げられる。各ドメインは、協働してアセチルＣｏＡを出発基質としてＰＵＦＡを生産する限りにおいて限定されないが、例えば、既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳが有する各ドメインを挙げることができる。
　微生物（２）に導入されたＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する各ドメインが協働して示すＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性は、ＰＵＦＡ－ＰＫＳの各ドメインをコードする遺伝子で形質転換した微生物を造成し、該微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡを生成、蓄積させ、該培養物中に蓄積したＰＵＦＡをガスクロマトグラフィーで測定することにより、確認することができる。
　本明細書において「既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳ」とは、好ましくは、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、コルウェリア属（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）、デサルファチバチルム属（Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ）、サイクロフレクサス属（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、ミクロシスティス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、プランクトマイセス属（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ）、デサルフォコッカス属（Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ）、ソランギウム属（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ）、レニバクテリウム属（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、チチノファガ属（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ）、グレオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ソリバクター属（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）、デサルフォバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、ジャポノチトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属からなる群より選ばれる属に属する微生物が元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳを、より好ましくは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｐｅａｌｅａｎａ　ＡＴＣＣ　７００３４５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ　ＭＲ－１、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ　ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓＡＫ－０１、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ　ｔｏｒｑｕｉｓＡＴＣＣ　７００７５５、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＡＴＣＣ　２０８８８、Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＰＣＣ　７３１０２、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＮＩＥＳ－８４３、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ　ＮＲＲＬ　２３３８、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ　Ｂｅｍ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＳＭ３７７６、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　Ｈｘｄ３、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ　‘Ｓｏｃｅ　５６’、　Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ　ＡＴＣＣ　３３２０９、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ　ｐｉｎｅｎｓｉｓＤＳＭ　２５８８、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓＰＣＣ　７４２１、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉＤＪ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓＰＲ４、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ　ｕｓｉｔａｔｕｓＥｌｌｉｎ６０７６、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍＨＲＭ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍＡＴＣＣ　２７４０５、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．　Ｓ３１　ＡＴＣＣ　２０８８８、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．　Ｓ８　ＡＴＣＣ　２０８８９、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＬＣ－ＲＭ　ＡＴＣＣ　１８９１５、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＳＲ２１、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ　ＡＴＣＣ　２８２０９、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｌｉｍａｃｉｎｕｍ　ＩＦＯ　３２６９３、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．２３Ｂ　ＡＴＣＣ　２０８９１、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｔｒｉａｔｕｍ　ＡＴＣＣ　２４４７３、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ａｕｒｅｕｍ　ＡＴＣＣ　３４３０４、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ　ＡＴＣＣ　２８２１０、Ｕｌｋｅｎｉａ　ｓｐ．ＢＰ－５６０１、及びＪａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．Ｌ１　ＡＴＣＣ　２８２０７からなる群より選ばれる微生物が、元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳを、最も好ましくは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｐｅａｌｅａｎａ　ＡＴＣＣ　７００３４５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ　ＭＲ－１、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ　ｍａｒｉｎａ　ＭＰ－１、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｓｐ．ＡＴＣＣ　２０８８８からなる群より選ばれる微生物が、元来有しているＰＵＦＡ－ＰＫＳを挙げることができる［ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００９），Ｖｏｌ．２９５，ｐ１７０－１７６；ＰＬｏＳ　ＯＮＥ（２０１１），Ｖｏｌ．６（５），ａｒｔ．ｎｏ．ｅ２０１４６］。
　表１に、後述する実施例で用いたＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質が有する各ドメインのアミノ酸配列、および既知のＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質が有する各ドメインのアミノ酸配列の例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体及び該蛋白質複合体を構成する蛋白質は、当該蛋白質複合体がＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する限りにおいて、相互に物理的に結合していてもよく、分離していてもよい。
　ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質としては、他の蛋白質と協働してＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質であれば野生型蛋白質、相同蛋白質及び変異蛋白質のいずれであってもよい。
　図１に各種微生物由来のＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質及びそのドメイン構造を示す。また、表２に各種微生物におけるＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列の例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質をコードする塩基配列としては、他の蛋白質と協働してＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列であれは特に制限されず、例えば表２に示す塩基配列、該塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、該塩基配列によりコードされる蛋白質が他の蛋白質と協働してＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列が挙げられる。
　協働してＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質の組合せとしては、蛋白質複合体がＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有し、且つＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示す限り特に制限されず、例えば下記組合せが挙げられる。下記（ｉ）～（ｉｖ）において、各蛋白質のアミノ酸配列は表２に示す通りである。
（ｉ）ＰｈｏＡ、ＰｈｏＢ、ＰｈｏＣ、ＰｈｏＤ、ＥｐａＥ、ＡｒａＢ
（ｉｉ）ＥｐａＡ、ＰｈｏＢ、ＰｈｏＣ、ＰｈｏＤ、ＥｐａＥ、ＡｒａＢ
（ｉｉｉ）ＥｐａＡ、ＡｒａＢ、ＡｒａＣ、ＡｒａＤ、ＥｐａＥ
（ｉｖ）ＰｈｏＡ、ＡｒａＢ、ＡｒａＣ、ＡｒａＤ、ＥｐａＥ
〔微生物の造成方法〕
　微生物（１）は、ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物を宿主生物として、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性が、内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い、外来のＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子、又は該ＰＳ－ＤＨドメインを有する蛋白質をコードする遺伝子を導入して形質転換することにより得られる。
　微生物（２）は、ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物を宿主生物として、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する各ドメインをコードする遺伝子、又はＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質をコードする遺伝子を導入し、該遺伝子の導入によって宿主生物において発現するＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する各ドメインのうち、ＰＳ－ＤＨドメインをＦａｂＡ－ＤＨドメインと比較して高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示すドメインとすることにより得られる。
　ＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子の導入としては、自律複製可能なプラスミドとして当該宿主細胞中に存在する場合、宿主細胞中の置換対象の遺伝子を対応する外来の遺伝子に置換する場合、外来のＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子を当該宿主細胞中の染色体ＤＮＡ中のＰＵＦＡ－ＰＫＳをコードする遺伝子とは別の領域に組み込む場合を含む。本発明において遺伝子を導入する際には、宿主となる微生物のコドン使用頻度を参考に、配列の至適化を行うことが好ましい。
　また、ＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する各ドメインをコードする遺伝子、又はＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質をコードする遺伝子は、それぞれ単独で導入してもよいし、複数を組み合わせて導入してもよく、最終的にＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を発現し、且つＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示すＰＳ－ＤＨドメインを有する微生物が得られればよい。
　本明細書において、「遺伝子」とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域、プロモーター領域及びターミネーター領域などを含んでもよいＤＮＡをいう。宿主生物に細菌などの原核生物を親株として用いる場合は、該ＤＮＡとしては、リボソーム結合領域であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現に転写終結因子は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　宿主生物に導入する遺伝子は、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え遺伝子とすることにより、宿主細胞に導入することができる。発現ベクターには、プロモーター、転写終結シグナル、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求変異を相補する遺伝子等、ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性変異を相補する遺伝子等）も含むことができる。ウラシル要求株の場合、マーカー遺伝子として、オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ３遺伝子）、又はオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子（ｕｒａ５遺伝子）を使用することができる。
　プロモーターとして、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡの塩基配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、好適に使用される。ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３－ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。
　プロモーター及びターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントとして、例えば、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられる。好ましい調節配列としては、例えば、”Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に記載されている配列が挙げられる。
　ベクターとして、目的とする遺伝子を発現させることができれば、特に限定されない。ベクターを構築するための試薬類、例えば制限酵素又はライゲーション酵素等の種類についても特に限定されず、市販品を適宜用いることができる。
　宿主生物として、ラビリンチュラ類微生物を用いる場合のプロモーターとしては、ラビリンチュラ類微生物の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されず、例えば、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｔｕプロモーター、解糖系遺伝子の発現プロモーターが挙げられる。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ－３（ノバジェン社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（Ｆｅｒｍ　ＢＰ－５４０７）より調整］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（Ｆｅｒｍ　ＢＰ－５４０８）より調整］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、２００７、Ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．２０、ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）、ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）が挙げられる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されないが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることができる。
　親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることができる。
　前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されないが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５１（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
　前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されないが、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ　１プロモーター、ｇａｌ　１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
　導入する遺伝子を宿主生物の染色体に組み込む方法としては、相同組換え法を用いることができる。相同組換え法としては、例えば、導入したい親株内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え系を利用して、組換え遺伝子を導入する方法を挙げることができる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え遺伝子を導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］を挙げることができる。
　さらに、導入する遺伝子と共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラ―ゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
　また、相同組換え法としては、例えば、アグロバクテリウムを介したＡＴＭＴ法［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２００９），ｖｏｌ．７５，ｐ．５５２９－５５３５］が挙げられる。さらに、目的の形質を安定して保持する形質転換体を得ることができれば、ＡＴＭＴ法の改良法等を含み、これらに限定されない。
　導入する遺伝子を宿主生物において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等の方法を挙げることができる。
　上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、該微生物を培養し、その培養物に蓄積されたＰＵＦＡをガスクロマトグラフィーで検出するとともに、上記した方法によりＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示すか否かを評価することにより、確認することができる。
〔ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法〕
　本発明は、上記造成された微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法を含む。
　ＰＵＦＡ、又はＰＵＦＡ含有組成物に含有されるＰＵＦＡは、ω６ＰＵＦＡが好ましく、例えばＤＰＡ又はＡＲＡを挙げることができる。ＰＵＦＡ含有組成物は、例えば、ＰＵＦＡ含有油脂又はＰＵＦＡ含有リン脂質を、好ましくはＰＵＦＡ含有油脂を挙げることができる。該微生物の培養物は、該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより得ることができる。
　培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む公知の培地をいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトース等の炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０～３００ｇの濃度で使用できる。特に好ましい態様によれば、初発の炭素源を消費した後に、炭素源をフィードすることにより引き続き培養できる。このような条件で培養することにより、消費させる炭素源の量を増大させて、ＰＵＦＡ含有組成物の生産量を向上できる。
　また、窒素源としては、例えば、酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素が挙げられる。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
　上記の各成分を含有する培地は、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０～９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。培養温度は、一般的には１０～４５℃であり、好ましくは２０～３７℃である。培養温度は、ＰＵＦＡ含有組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のｐＨは、一般的には３．５～９．５であり、好ましくは４．５～９．５である。特に好ましいｐＨは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには、ｐＨ５．０～８．０である。
　培養時間は、例えば２～７日間とすることができ、通気攪拌培養等で培養を行うことができる。培養物から培養液と微生物とを分離する方法は、当業者により公知の常法により行うことができ、例えば、遠心分離法や濾過等により行うことができる。上記の培養物から分離した微生物を、例えば超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、ＰＵＦＡ含有組成物を得ることができる。
　上記の製造法で製造されるＰＵＦＡ含有組成物は、例えば、低温溶媒分別法［高橋是太郎，油化学，４０：９３１－９４１（１９９１）］、又はリパーゼ等の加水分解酵素で短鎖の脂肪酸を遊離除去する方法［高橋是太郎，油化学，４０：９３１－９４１（１９９１）］等の方法により、ＰＵＦＡ含有組成物を濃縮して、ＰＵＦＡ含量が高いＰＵＦＡ含有組成物を得ることができる。
　ＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡを分離して採取することにより、ＰＵＦＡを製造できる。例えば、加水分解法によりＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡを含有する混合脂肪酸を調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、ＰＵＦＡを分離して採取することにより、ＰＵＦＡを製造できる。
　また、ＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡアルキルエステルを分離して採取することにより、ＰＵＦＡアルキルエステルを製造できる。ＰＵＦＡアルキルエステルは、ＰＵＦＡアルキルエステルであれば特に限定されないが、好ましくは、ＰＵＦＡエチルエステルが挙げられる。
　ＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡアルキルエステルを分離して採取するには、例えばアルコーリシス法によりＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡアルキルエステルを含有する混合脂肪酸アルキルエステルを調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法等により、ＰＵＦＡアルキルエステルを分離して採取することにより行うことができる。
　以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
ＡＲＡの製造法－１
１．各発現プラスミドの造成
［ｐＥＴ－ｐｈｏＡの造成］
　常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ　ＳＳ９９（ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１２５２）株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１０７及び１０８で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）の３’末端領域（６３３番目の塩基から停止コドンまで）を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥａｇＩで処理し、同一の制限酵素処理を行った大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）（アジレント・テクノロジー社製）とライゲーションすることにより、ｐＢｌｕｅ－ＰｈｏＡ－Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌを得た。
　次に、常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ　ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１０９及び１１０で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＡ蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端領域（開始コドンから６３３番目の塩基まで）を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＥＴ２１ａ（メルクミリポア社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＥａｇＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ－ｐｈｏＡ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌを得た。
　続いて、ｐＢｌｕｅ－ＰｈｏＡ－Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ及びｐＥＴ－ｐｈｏＡ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌを制限酵素ＥａｇＩ及びＸｈｏＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ－ｐｈｏＡを得た。
［ｐＡＣＹＣ－ＳｏｐｆａＥの造成］
　林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ　ＭＲ－１（ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１０９６）株由来のＥｐａＥ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＡＣＹＣ－ＳｏｐｆａＥを得た。
［ｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤ－ｐｈｏＢの造成］
　常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ　ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１１１及び１１２で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＤ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号７１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで制限酵素処理を行った大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１（メルクミリポア社製）とライゲーションすることにより、ｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤを得た。
　常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ　ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１１３及び１１４で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＢ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで制限酵素処理を行ったｐＡＣＹＣ－ＳｏｐｆａＥとライゲーションすることにより、ｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ｐｈｏＢを得た。
　ｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ｐｈｏＢを鋳型に、配列番号１１４及び１１５で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＢ蛋白質をコードするＤＮＡを有するＤＮＡ断片を得た。また、大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１　（メルクミリポア社製）を鋳型に、配列番号１１６及び１１７で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター領域のＤＮＡ断片を増幅した。
　得られた２つのＤＮＡ断片をオーバーラップエクステンションＰＣＲにてアッセンブルした。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤを制限酵素ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤ－ｐｈｏＢを得た。
［ｐＣＤＦ－ｐｈｏＣの造成］
　常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ　ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１１８及び１１９で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）の５’末端領域（開始コドンから９９３番目の塩基まで）を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｂａＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションした。次に、得られたプラスミド及びｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ｐｈｏＣ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌを得た。
　続いて、常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ　ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１２０及び１２１で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＣ蛋白質をコードするＤＮＡの３’末端領域（９３３番目の塩基から停止コドンまで）を増幅した。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ｐｈｏＣ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ｐｈｏＣを得た。
［ｐＥＴ－ｅｐａＡの造成］
　常法により抽出したＳｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ　ＭＲ－１（ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１０９６）株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１２２及び１２３で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥｐａＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号７３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＥＴ２１ａ（メルクミリポア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ－ｅｐａＡ’を得た。
　次に、ｐＥＴ－ｅｐａＡ’を鋳型に、配列番号１２４、１２５、１２６及び１２７で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、５’末端のＨｉｓ－ｔａｇ遺伝子を除いたＥｐａＡ遺伝子を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片及びｐＥＴ－ｅｐａＡ’を制限酵素ＡｐａＩ及びＳａｌＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ－ｅｐａＡを得た。
［ｐＥＴ－ａｒａＡの造成］
　ｐＳＴＶ２９－Ｐｌａｃ－ｐｆａＡＢ［ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２－４０３６］を鋳型に、配列番号１２８及び１２９で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＥＴ２１ａ（メルクミリポア社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ－ａｒａＡを得た。
［ｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢの造成］
　ｐＳＴＶ２９－Ｐｌａｃ－ｐｆａＡＢ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２－４０３６）を鋳型に、配列番号１３０及び１３１で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＢ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで処理したｐＡＣＹＣ－ＳｏｐｆａＥとライゲーションすることにより、ｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢを得た。
［ｐＣＤＦ－ａｒａＣの造成］
　ｐＭＷ２１９－Ｐｌａｃ－ｐｆａＣＤ［ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２－４０３６］を鋳型に、配列番号１３２及び１３３で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ－ａｒａＣを得た。
［ｐＣＯＬＡ－ａｒａＤの造成］
　ｐＭＷ２１９－Ｐｌａｃ－ｐｆａＣＤ［ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２－４０３６］を鋳型に、配列番号１３４及び１３５で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＤ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。
　得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで制限酵素処理を行った大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１　（メルクミリポア社製）とライゲーションすることにより、ｐＣＯＬＡ－ａｒａＤを得た。
２．ＡＲＡの製造－１
　林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法で、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ（配列番号１０６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードする遺伝子が欠失した大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を造成した。
　〈１〉ｐＥＴ－ｐｈｏＡ、ｐＣＤＦ－ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤ－ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ－ＳｏｐｆａＥ、又は〈２〉ｐＥＴ－ｐｈｏＡ、ｐＣＤＦ－ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤ－ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
　得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。
　得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。
　培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法［Ｂｌｉｇｈ，ｅ．Ｇ．ａｎｄ　Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９５９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，９１１－９１７］にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
　培養液中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ジホモ－γ－リノレン酸（以下、ＤＧＬＡという。）及びエイコサテトラエン酸（以下、ＥＴＡという。）を測定した結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すとおり、ＰｈｏＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は主にＥＰＡを生産しＡＲＡを生産しなかったのに対し、ＰｈｏＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌はＥＰＡと同等量のＡＲＡを生産した。
　これより、ＥＰＡ生産型のＰＵＦＡ－ＰＫＳに由来するＰｈｏＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質及びＰｈｏＤ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質を生産する大腸菌を用いることにより、効率的にω６脂肪酸であるＡＲＡを製造できることがわかった。
３．ＡＲＡの製造－２
　〈３〉ｐＥＴ－ｅｐａＡ、ｐＣＤＦ－ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤ－ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ－ＳｏｐｆａＥ、又は〈４〉ｐＥＴ－ｅｐａＡ、ｐＣＤＦ－ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ－ｐｈｏＤ－ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
　得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。
　得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。
　培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
　培養液中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＧＬＡ及びＥＴＡを測定した結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すとおり、ＥｐａＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は主にＥＰＡを生産しＡＲＡを生産しなかったのに対し、ＥｐａＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌はＥＰＡと同等以上のＡＲＡを生産した。
　これより、ＥＰＡ生産型のＰＵＦＡ－ＰＫＳに由来するＥｐａＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質及びＰｈｏＤ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質を生産する大腸菌を用いることにより、効率的にω６脂肪酸であるＡＲＡを製造できることがわかった。
４．ＡＲＡの製造－３
　〈５〉ｐＥＴ－ａｒａＡ、ｐＣＤＦ－ａｒａＣ、ｐＣＯＬＡ－ａｒａＤ及びｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢ、〈６〉ｐＥＴ－ｅｐａＡ、ｐＣＤＦ－ａｒａＣ、ｐＣＯＬＡ－ａｒａＤ及びｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢ、又は〈７〉ｐＥＴ－ｐｈｏＡ、ｐＣＤＦ－ａｒａＣ、ｐＣＯＬＡ－ａｒａＤ及びｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
　得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。
　得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。
　培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
　培養液中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＧＬＡ及びＥＴＡを測定した結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すとおり、ＡｒａＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質、ＡｒａＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌はいずれのＰＵＦＡも検出限界以下であったのに対し、ＥｐａＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質、ＡｒａＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌、並びにＰｈｏＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質、ＡｒａＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は、著量のＡＲＡを生産した。
　これより、ＥｐａＡ蛋白質又はＰｈｏＡ蛋白質、並びにＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質及びＡｒａＤ蛋白質を生産する大腸菌を用いることにより、既知のＡＲＡ生産型のＰＵＦＡ－ＰＫＳを構成する蛋白質であるＡｒａＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質及びＡｒａＤ蛋白質を生産する大腸菌を用いた場合と比べ、効率的にω６脂肪酸であるＡＲＡを製造できることがわかった。
［実施例２］
ＤＰＡの製造法
１．各発現プラスミドの造成
［ｐＥＴ－ｏｒｆＡ］
　林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｉｚｏｃｈｙｔｏｒｉｕｍ　ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＥＴ－ｏｒｆＡを得た。
［ｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ］
　林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｉｚｏｃｈｙｔｏｒｉｕｍ　ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＢ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＣＤＦ－ｏｒｆＢを得た。
［ｐＣＯＬ９２］
　林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｉｚｏｃｈｙｔｏｒｉｕｍ　ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＥＴ－ｏｒｆＡを得た。
２．ＤＰＡの製造
　〈８〉ｐＥＴ－ｏｒｆＡ、ｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ、ｐＣＯＬ９２及びｐＡＣＹＣ－ＳｏｐｆａＥ、又は〈９〉ｐＥＴ－ｏｒｆＡ、ｐＣＤＦ－ｏｒｆＢ、ｐＣＯＬ９２及びｐＡＣＹＣ－ｅｐａＥ－ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。
　得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。
　得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。
　培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
　培養液中のＤＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ及びＥＴＡを測定した結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すとおり、ＯｒｆＡ蛋白質、ＯｒｆＢ蛋白質、ＯｒｆＣ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は主にＤＨＡを生産したのに対し、ＯｒｆＡ蛋白質、ＯｒｆＢ蛋白質、ＯｒｆＣ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌はＤＨＡと同等以上のＤＰＡを生産した。
　これより、ＤＨＡ生産型のＰＵＦＡ－ＰＫＳに由来するＯｒｆＡ蛋白質、ＯｒｆＢ蛋白質及びＯｒｆＣ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌を用いることにより、効率的にω６脂肪酸であるＤＰＡを製造できることがわかった。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年８月１０日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８－１５１２３３）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (12)

  1. 　多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという。）代謝経路を有する微生物に、３－ヒドロキシヘキサノイル　アシルキャリアー蛋白質（以下、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰという。）に対する活性が、内在のＦａｂＡ様β－ヒドロキシアシル－ＡＣＰデヒドラターゼ（以下、ＦａｂＡ－ＤＨという。）ドメインよりも高い、外来のポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（以下、ＰＳ－ＤＨという。）ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
  2. 　ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がω３ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである、請求項１に記載の微生物。
  3. 　ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）又はドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがアラキドン酸（以下、ＡＲＡという。）又はドコサペンタエン酸（以下、ＤＰＡという。）である、請求項１又は２に記載の微生物。
  4. 　ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に由来する請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物。
  5. 　ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡを合成する活性（以下、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性という。）を有する下記（ａ）～（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
    （ａ）β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼ（以下、ＫＳという。）ドメイン
    （ｂ）マロニル－ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（以下、ＭＡＴという。）ドメイン
    （ｃ）ＡＣＰドメイン
    （ｄ）ケトレダクターゼ（以下、ＫＲという。）ドメイン
    （ｅ）ＰＳ－ＤＨドメイン
    （ｆ）鎖伸長因子（以下、ＣＬＦという。）ドメイン
    （ｇ）アシルトランスフェラーゼ（以下、ＡＴという。）ドメイン
    （ｈ）ＦａｂＡ－ＤＨドメイン
    （ｉ）エノイルＡＣＰ－レダクターゼ（以下、ＥＲという。）ドメイン
    （ｊ）ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（以下、ＰＰＴという。）ドメイン
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のＰＵＦＡを生産し得る微生物が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子を全て有する請求項５に記載の微生物。
  7. 　生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである請求項５又は６に記載の微生物。
  8. 　生産し得るＰＵＦＡがＡＲＡ又はＤＰＡである請求項５～７のいずれか１項に記載の微生物。
  9. 　ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物である請求項５～８のいずれか１項に記載の微生物。
  10. 　ＰＳ－ＤＨドメインが、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ　ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢのＰＳ－ＤＨドメインである、請求項１～９のいずれか１項に記載の微生物。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を採取する、ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
  12. 　下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＰＵＦＡを生産し得る微生物を用いるＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
    （Ｉ）ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物に、３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性が内在のＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高いＰＳ－ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
    （ＩＩ）ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ活性を有する下記（ａ）～（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ－ＤＨドメインがＦａｂＡ－ＤＨドメインよりも高い３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ　ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
    （ａ）ＫＳドメイン
    （ｂ）ＭＡＴドメイン
    （ｃ）ＡＣＰドメイン
    （ｄ）ＫＲドメイン
    （ｅ）ＰＳ－ＤＨドメイン
    （ｆ）ＣＬＦドメイン
    （ｇ）ＡＴドメイン
    （ｈ）ＦａｂＡ－ＤＨドメイン
    （ｉ）ＥＲドメイン
    （ｊ）ＰＰＴドメイン
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