TW200525030A - A gene of unsaturated fatty acid synthetic enzyme isolated from Marchantia polymorpha and its use - Google Patents

Description

200525030 t 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於來自地錢（Marchantia polymorpha)之不 飽和脂肪酸合成系基因，亦即Λ5脂肪酸不飽和化酵素、 △ 6脂肪酸不飽和化酵素及Λ6脂肪酸鏈長延長酵素之基 因以及其之利用。 【先前技術】 花生四烯酸及及二十碳五烯酸（以下，簡稱為EPA)等 高度不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid ·· PUFA)，在 人類中多被包含於以神經系統為主之細胞膜脂質中。此等 高度不飽和脂肪酸係所謂「前列腺素及白三烯」等生理活 性物質之前驅體，在藥理學方面非常重要。近年來，包含 才匕生四稀酸及EPA之健康食品已經上市。再者，脂肪酸由 於亦為洗劑及生物分解性塑膠之原料，所以在材料學方面 亦頗受注目。 目前，高度不飽和脂肪酸藉由從培養微生物或魚油萃 取而生產。因此，生產成本高、能源使用量及廢棄物量大， 尤其從魚油調製之方法，魚資源有限等，皆成為問題。 花生四烯酸及EPA，曾分別以亞油酸(linoleic acid)及 α-亞油烯酸（a-linolenic acid)為起點，藉由所謂γΛ6不 飽和化、脂肪酸鏈長延長及Λ5不飽和化」之三連續反應 而生合成。此等反應分別以Α6脂肪酸不飽和化酵素（以下 簡稱為「Λ6不飽和化酵素」）、Α6脂肪酸鏈長延長酵素（以 下簡稱為「Λ6鏈長延長酵素」）及八5脂肪酸不飽和化酵 200525030 素（以下簡稱為「Λ5不飽和化酵素」）做為觸媒。 △ 6不飽和化酵素之基因曾在數種植物中被選殖。例 •如曾從矽藻、立碗蘚(Physcomitrium)、角齒蘚（Ceratodon)、 . 琉璃苣（Borag〇)、紫草（mulasaki)、櫻草（primrose)及銀蓮花 (Anemone)選殖出Λ6不飽和化酵素之基因。再者，植物以 外，亦冒從絲狀菌、線蟲、藍藻、大鼠（rat)及人類中選殖 出△ 6不飽和化酵素基因（參照非專利文獻1 ··「Eur j Biochem· 269, P4105, 2002」、非專利文獻 2:「Plant J. 15, P39, 1998」、非專利文獻 3 :「Eiir. J. Biochem.，267. p3801， 2000」、非專利文獻 4:「Proc. Natl. Acad. Sci· USA 94, p4211， 1997」、非專利文獻5 :「Lipids 37，417，2002」、非專利文 獻 6:「FEBS Lett· 542, ρ100, 2003」、非專利文獻 7:「Whitney etal”PlantaEpub 2003」、非專利文獻 8 : rLipids34，p649, 1999」、非專利文獻9 :「Gene，238, p445, 1999」、非專利文 獻 10 ··「Biochem J. 330, p611 1998」、非專利文獻 η :「piant φ Mo1· 丨·，22, p293 1993」、非專利文獻 12 :「Biochem. Biophys. res. Comnuin· 255，p575，1999」、及非專利文獻 13 :「J.Biol.Chem.274，P471，1999」）。再者，除藍藻之△ 6不飽和化酵素之外，此等Λ6不飽和化酵素在任一 n終 端存在細胞色素b5功能域(domain)。

△ 6鍵長延長酵素之基因最初係從絲狀菌及線蟲中選 ’殖出（參照非專利文獻 14 :「Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97， w P8284, 2000」、及非專利文獻 15:「Proc· Natl· Acad. Sci. USA 97，p6421，2000」）。在植物中’則只有從風铃草（bluebell) 200525030 中選殖出（參照非專利文獻16:「Plant J. 31，p255, 2002」；）。 在酵母菌（SaCCharomyCescerevisiae)中，存在參與勒脂 質之長鏈飽和酿基鏈合成之EL02蛋白質及EL03蛋白質 (麥照非專利文獻 17 :「J· Biol. Chem.，272，ρΠ376, 1997」），Λ6鏈長延長酵素之胺基酸序列顯示與彼等具相 同性。另一方面，在植物中存在另一類型之脂肪酸鏈長延 長酵素，即酮基醯基CoA合成酵素(KCS)。該酵素能催 化長鏈飽和脂肪酸/一價不飽和脂肪酸之鏈長延長（參照非 專利文獻15以及非專利文獻18 :「Plant Cell 7，p309, 1995」）。但是，未見到Λ6鏈長延長酵素基因及酵母 EL02/EL03基因，與KCS基因在進化上有直接之關係（參 照非專利文獻15及16)。 △ 5不飽和化酵素之基因最初從絲狀菌選殖出（參照非 專利文獻 19 :「J· Biol· Chem· 273, p29360, 1998」、非專利 文獻 20 :「J· Biol· Chem. 273, pl9055」）。Λ5 不飽和化酵 素之構造與Λ6不飽和化酵素具共通性，在n末端具有細 胞色素b5功能域。Λ5不飽和化酵素基因可從矽藻、線蟲、 大鼠、人類、或立碗蘚等中選殖出（參照非專利文獻1、非 專利文獻21 :「FEBS Lett· 439, p215，1998」、非專利文獻 22 :「Arch. Biochem· Biophys. 391，p8, 2001」、非專利文獻 23 :「J· Biol· Chem. 274, p37 335, 1999」、及非專利文獻 24 : 「J. Biol. Chem. 278, 35115, 2003」）。 陸上植物由苔蘚植物（苔蘚植物門（Bryophyta)、蕨類植 物、裸子植物及被子植物構成。苔蘚植物為陸上植物中最 200525030 古老之分枝群，由蘚類（蘚綱（Bryosida))、苔類（苔綱 (Hepaticopsida)及角蘚類三類構成。地錢，在分類上最近似 ^ 上述生物中之立碗蘚，但立碗蘚屬於蘚類，而地錢則屬於 r 苔綱中之地錢亞綱（Marchantiidae)。上述3群在約4億3千 年前已經分歧乃為確定之事。因此，立碗蘚及地錢縱使同 屬台蘚植物’例如二億年前分化成之阿拉伯芬(arabidopsis) 及水稻沒有什麼差異，但在進化上大不相同。（參照非專 •利文獻 25 ·「http://www.nibbxajp厂mhasebe/ Phvscomitrella.html」）。 關於來自地錢之高度不飽和脂肪酸合成系酵素基因， 上述KCS樣鏈長延長酵素基因中之MpFAE2及MPFAE3 已 了取付（參照非專利文獻 26:「Bi〇sci. Biotechnol. Biochem. 67, p605, 2003」、及非專利文獻 27:「Biosci. Biotechnol.

Biochem· 67, pl667, 2003」）。但是，MpFAE2 及 MpFAE3 非為Λ6鏈長延長酵素基因。 如上迷’雖然多個高度不飽和脂肪酸合成系酵素基因 參已攸各式各樣生物種中選殖出，但是花生酸、£PA等C20 以上且不餘和度為4以上之高度不飽和脂肪酸在植物中生 產之例子尚少。關於此等例子雖有使來自石夕藻之不 飽和化酵素及Λ5不飽和化酵素以及來自立碗蘚之Α6鏈 長酵素在亞I中表現以生產花生四稀酸及ΕΡΑ之報 告’但其詳細情形不明（參考轉散獻24)。 士上，，化生四烯酸及EPA等高度不飽和脂肪酸之生 -產，由於藉由從培養微生物及魚油中萃取而生產，有生產 成本问月匕源使用量及廢棄物量多及魚資源有限等問題 200525030 點。花生四_及EPA “衫飽和絲酸由於呈有所袖 「分子内有複數個雙鍵」之㈣物性，亦可利•各式: 樣之工業用途(例如薄膜、生物分解性塑膠、機能性纖維°、 潤滑油及洗劑等材料）。藉由利用基因重組植物生產此 度不飽和脂肪酸，可以減低生產成本，同時^ ^ 更利於環境之生產製程。若使用基因重組技術，可以:油 考里植物中大里生產咼度不飽和脂肪酸，將在得到便宜 目的原料上非常有用。 夕 另一方面，在使異種生物之基因在植物中表現之情 況，關於該基因在植物内可發揮何種程度之良好機能，: 於要經過轉錄、轉譯、及其後之修飾等過程，因此=以預 測。尤其在表現複數個異種生物基因之情況，可以預測盥 上述非專敎獻24所述之表現來自不同生物種之複數個 基因相比’表現來自同—生物種之複數個基因者在植 將發揮較佳^機能。再者，為最早陸上植物之苔蘚類之地 錢，在做為高等植物之模型系上受到注目，可以期待其之 基因在植物内將具有良好的機能。因此，若能取得來自地 錢之高度不飽和脂肪酸合成酵素基因，亦即Δ5不飽和化 酵素基因、Λ6不飽和化酵素基因及Λ6鏈長延長酵素基 因，則藉由將此等基因導人植物中，可以期待花^四稀^ 及ΕΡΑ在植物内可以效率良好地蓄積。 再者’雖然已從與地錢同屬苔蘚植物之立碗蘇中選殖 出Λ5不飽和化酵素基因、Λ6残和化酵素基因及八6鍵 長延長酵素基因，但地錢與立碗蘚在進化上大不相同若 200525030 要依據立碗蘚之基因取得地錢之基因，則縱使具有現在之 技術水準亦非易事。

A 【發明内容】 本發明，鑑於上述之先前問題點，因而其目的為提供 可以在高等植物中生產花生四烯酸及EPA之來自地錢之不 飽和月曰肪酸合成酵素基因，亦即A5不飽和化酵素基因、 △ 6不餘和化酵素基因及A6鏈長延長酵素基因，以及其之 ®利用法。 本發明者為解決上述課題深入檢討，結果從來自地錢 (Marchantia polymorpha)之cDNA選殖株鑑定出編碼上述 △ 6不飽和化酵素、Λ5不餘和化酵素及A6鏈長延長酵素 之基因，再者，成功地將此等基因導入甲醇利用性酵母菌 (Pichia pastoris)及使其表現，並發現此等基因所表現之蛋 白質分別具有Λ6不飽和化、Λ5不飽和化及Δ6鏈長延長 鲁之酵素活性，於是完成本發明。亦即，本發明包含以下之 發明： (1) 一種來自地錢目生物之基因，其在嚴苛條件下會與序列 編號1所示之鹼基序列構成之DNA之全部或一部分、 或和該DNA互補之鹼基序列構成之DNA之全部或—部 分雜交，且編碼具有Λ6脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 -(2) —種編碼具有△ 6脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 . 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記載之基因： (a)具有序列編號1所示之鹼基序列之基因；或 200525030 Λ (b)在嚴苛條件下可與序列編號i所示之鹼基序列構成 之DNA、或和該DNA互補之鹼基序列構成之DNA雜 交之基因。 (3) —種編碼具有Λ6脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記载之基因·· (a) 具有序列編號1所示鹼基序列中之第253至1698號 之驗基序列之基因； (b) 在嚴苛條件下可與序列編號1所示鹼基序列中之帛 253至1698號之鹼基序列構成之DNA、或和該DNa 互補之驗基序列構成之DNA雜父之基因。 (4) 一種編碼具有A6脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基因： (a) 編碼序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質之 基因； (b) 編碼序列編號2所示之胺基酸序列之1個或以上之 胺基酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序 列構成之蛋白質之基因。 (5) —種來自地錢目生物之基因，其在嚴苛條件下會與序列 編號3所示之驗基序列構成之DN A之全部或一部分、 或和該DNA互補之鹼基序列構成2DNA之全部或一部 分雜交，且編碼具有Δ6脂肪酸鏈長延長活性之蛋白質。 (6) —種編碼具有Λ6脂肪酸鏈長延長活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記載之基因·· (a)具有序列編號3所示之鹼基序列之基因；或 200525030 (b)在嚴苛條件下可與序列編號3 所不之鹼基序列構成 之DNA、或和該DNA互補之鹼基庆 ^泰序列構成之DNA雜 交之基因。 ⑺-種編碼具有Λ6脂肪酸鏈長延長活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因4係下列(a)或(b)中記載之基因： (a)具有序列編號1所示鹼基序列中 J τ足弟194至1〇66號 之鹼基序列之基因； (b)在嚴苛條件下可與序列編號〗所示鹼基序列中之第 194至1066號之驗基序列構成之Dna、或和該DNa 互補之鹼基序列構成之DNA雜交之基因。 (8) —種編碼具有Λ6脂肪酸鏈長延長活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基因： (a) 編碼序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質之 基因； (b) 編碼序列編號4所不之胺基酸序列之1個或以上之 > 胺基酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序 列構成之蛋白質之基因。 (9) 一種來自地錢目生物之基因，其在嚴苛條件下會與序列 編號5所示之鹼基序列構成之DNA之全部或一部分、 或和該DNA互補之鹼基序列構成之DNA之全部或一部 分雜交，且編碼具有Δ5不飽和化活性之蛋白質。 • (10) —種編碼具有Λ5脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目 - 生物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基 因： 12 200525030 Λ (a) 具有序列編號5所示之驗基序列之基因；或 (b) 在嚴苛條件下可與序列編號5所示之鹼基序列構 成之DNA、或和該DNA互補之驗基序列構成之DNA 雜交之基因。 (11) 一種編碼具有A5脂肪酸不飽和化活性之來自地錢目 生物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基 因· (a) 具有序列編號5所示鹼基序列中之第375至1829 號之驗基序列之基因； (b) 在嚴苛條件下可與序列編號5所示鹼基序列中之 第375至1829號之鹼基序列構成之DNA、或和該DNA 互補之鹼基序列構成之DNA雜交之基因。 (12) —種編碼具有A5脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目 生物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基 因： (a) 編碼序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋白質 之基因； (b) 編碼序列編號6所示之胺基酸序列之1個或以上 之胺基酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸 序列構成之蛋白質之基因。 (13) —種蛋白質，係由上述（1)至（12)之任一者記載之基因 所編碼。 (14) 種如下列（a)或（b)之蛋白質： (a)序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質； 200525030 (b)由序列編號2所示之胺基酸序列中1個或以上之胺 基^、、二取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列 構成且具有Λ6脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 (15) 一種如下_或(b)之蛋白質·· ⑻序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質； (b)由序歹j編號4所示之胺基酸序列中】個或以上之胺 基feck取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列

構成 /、有A6脂肪酸鏈長延長活性之蛋白質。 (16) —種如下列（a)或（b)之蛋白質： (a) 序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋白質； (b) 由序列編號6所示之胺基酸序列中i個或以上之 胺基酸代、嶋、插人及/或附加所成之胺基酸序 列構成，且具有Λ5脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 (17) —種抗體，其能識別上述〇3)至（16)中任何一項之蛋白 質。 、

(18) —種重組表現載體 一項之基因。 其包含至少上述（丨）至（12)中任何 (19) 一種轉形體，其導入至少 基因。 上述（1)至（12)中任何一項之 (20) -種植物㈣“植物體之組織，其係以可 導入至少上述（1)至（12)中任何一 或與邊植物體具有相同性f之該植物體之子孫。 ⑼-種植物體或該植物體之級織，其係以現 導入至少上述⑴至⑽中任何-項之基因:以致: 14 200525030 酸組成被改變之植物體，或與該植物體具有相同性質 之該植物體之子孫。 (22) —種上述(20)或（21)之植物體之繁殖材料。 (23) —種脂肪酸之生產方法，其係使用上述（21)之植物體 或植物體之組織。

(24) —種材料，其包含選自藉由上述(23)之脂肪酸生產方 法所得到之r -亞麻烯酸、升二碳-7 -亞麻烯酸、花生 四稀酸、十八碳四烯酸（stearidonic acid)、二十碳四稀 酸及二十碳五浠酸中之至少一種。 (25) —種改變脂肪酸組戒之方法，其使用至少上述（1)至（12) 中任何一項之基因。 (26) —種基因檢測器具，其以上述（1)至（12)中任何一項之 基因之至少一部分之鹼基序列或其之互補序列做為探 針。

種調節上述（13)至（16)中任何一項之蛋白質之基因 或調節該蛋白質之物質之篩選方法，其係使用上述（13 至（16)中任何一項之蛋白質。 (28)—接-丄 種错由上述(27)之篩選方法得到之基因或物質。 表示臉#在本忒明書中，若無特別之限制，A、C、G及T :呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶等各鹼基。 可明ί發明之其他目的、特徵及優點，從以τ之記載中當 可明白又本發明之利证藉由參照附圖及以下之說明當 【實施方式】 15 200525030 [實施發明之最佳形態] 如以下所述。再者，本發明 本發明之實施之一形態 不受其所限。 以下依照花生四職及：十碳五_(epa)之合成路 徑、本發明之基因、本發明之蛋白f、本發明之蛋白質及 基因之取得方法以及本發明之基因及蛋白質之利用方法 (有用性）之順序，詳細地說明本發明。

(1)花生四烯酸及二十碳五烯酸(EPA)之合成路徑 咸認為花生四稀酸及二十碳五稀酸(EPA)分別以亞 麻酸及α-亞麻烯酸為起點，藉由所謂Δ6不飽和化、△ 6鏈長延長及Λ5不飽和化之3連續反應，而被生合成。 此等反應分別藉由Λ6顿和化酵素、Δ6鏈長延長酵 素及Λ5不飽和化酵素催化，且分別被稱為η 6路徑（花 生四烯酸合成路徑）及！路徑（ΕΡΑ合成路徑）。 至目前為止，被報告之Λ6不飽和化酵素、Λ6鍵 長延長酵素及Λ5不飽和化酵素之任一者皆參與η 6及 η-3路徑二者。亦即，不飽和化酵素在η 6路徑中 將亞麻酸（18: 2Λ9，12, 18表示碳數，2表示雙鍵之數目， 9、12表示雙鍵之位置，以下皆同）變換為了亞麻烯酸 (GLA H 3Λ6’9’12);在η_3路徑中將^亞麻稀酸 (ALA;18:3A9’ 15)變換為硬脂四烯酸（STA，i8 4 △ >△6鏈長延長酵素在n-6路徑中將gla變換為 升二碳-r -亞麻烯酸(DGLA ; 20 : 3Λ8，11，、，在n 3路 徑中將STA變換為二十碳四烯酸（ETA ; 2〇 : 200525030 °Λ5不飽和化酵夸太 备 开果在η*6路徑中將DGLA變換 為花生四烯酸20 ·· 4八5,8，】丨，14、 );在η-3路徑中將ETA變 換為二十碳五烯酸(EPA，2() : 5 Amw” (2)本發明之基因 [本發明之Λ6不飽和化酵素基因] 本發明之Δ6獨和化酵素基因係編碼具有Λ6脂 肪酸不飽和化活性之蛋白質之來自地錢目生物之基 因，即符合以下條件之基因：

1·具有序列編號1所示之鹼基序列之基因。 2·在嚴苛條件下可與序列編號}所示之驗基序列構成 之DNA、或和該DNA互補之鹼基序列構成之DNA雜 交之基因。 3·在嚴苛條件下可與序列編號丨所示之鹼基序列構成 之DNA之一部分、或和該DNA互補之鹼基序列構成之 DNA之一部分雜交之基因。

4·具有序列編號1所示鹼基序列中之第253至1698號 之檢基序列之基因。又，序列編號1所示鹼基序列中之 第253至1698號之驗基序列係轉譯成序列編號2所示 之胺基酸序列構成之蛋白質之領域。 5·在嚴苛條件下可與序列編號1所示鹼基序列中之第 253至1698號之鹼基序列構成之DNA、或和該DNA 互補之驗基序列構成之DNA雜交之基因。 6·編碼序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質之 基因。 17 200525030 7·編碼序列編號2所示之胺基酸序列之1個或以上之胺 基酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基 酸序列 構成之蛋白質之基因。 [本發明之Λ6鏈長延長酵素基因] 本發明之Λ6鏈長延長酵素基因係編碼具有鏈 長延長酵素活性之蛋白質之來自地錢目生物之基因，即 符合以下條件之基因： 1·具有序列編號3所示之鹼基序列之基因。 2.在嚴苛條件下可與序列編號3所示之鹼基序列構成 之DNA、或和該DNA互補之鹼基序列構成之DNA 雜交之基因。 3·在嚴苛條件下可與序列編號3所示之鹼基序列之構 成之DNA之一部分、或和該DNA互補之鹼基序列 構成之DNA之一部分雜交之基因。 4.具有序列編號3所示鹼基序列中之第194至1066號 之驗基序列之基因。又，序列編號3所示驗基序列 中之第194至1066號之鹼基序列係轉譯成序列編號 4所示之胺基酸序列構成之蛋白質之領域。 5·在嚴苛條件下可與序列編號3所示鹼基序列中之第 194至1066號之鹼基序列構成之〇ΝΑ、或和該DNA 互補之驗基序列構成之DNA雜交之基因。 6·編碼序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質之 基因。 7.編碼序列編號4所示之胺基酸序列之1個或以上之 200525030 胺基酸經取代、刪除、插 序列構成之蛋白質之基因。或附加所成之胺基酸 [本發明之Δ5不飽和化酵素基因] 本:明之Λ5不飽和化酵素基附系編碼具有△ 肪I不飽和化活性之蛋白皙 月日 、之來自地錢目生物之其 因，即符合以下條件之基因： 欠物之基 1. 具有相編號5所*之驗基相之基因。 2. 在嚴苛條件下可與序列編號5心之絲序列構成

之DNA、或和該臟互補之驗基序列構成之贿a 雜交之基因。 3.在嚴苛條件下可與序列編號5所示之驗基序列構成 之DNA之一部分、或和該DNA互補之鹼基序列構 成之DNA之一部分雜交之基因。

4·具有序列編號5所示鹼基序列中之第375至1829號 之鹼基序列之基因。又，序列編號5所示鹼基序列 中之第375至1829號之鹼基序列係轉譯成序列編號 6所示之胺基酸序列構成之蛋白質之領域。 5·在嚴苛條件下可與序列編號5所示鹼基序列中之第 375至1829號之鹼基序列構成之DNA、或和該DNA 互補之驗基序列構成之DNA雜父之基因。 6·編碼序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋白質之 基因。 7·編碼序列編號6所示之胺基酸序列之1個或以上之 胺基酸經取代、刪除、插入及或附加所成之胺基酸 19 200525030 序列構成之蛋白質之基因。 再者上述嚴苛條件」意指只有在至少同一性， •較佳至少95%同—性，最佳至彡97%同一性存在於序列間 ^ 時發生雜交。 上述雜父可藉由在j. Sambr〇〇k et ^ Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)中記載之方法等先前公知之方法進行。 通#溫度越南，鹽〉農度越低，嚴苛性越高（越不易雜交）， 可以取得相同性較高之基因。關於雜交之條件可以使用 先兩公知之條件，雖無特殊限定，可列舉例如421、6x SSPC、50% 甲酿胺、1%SDS、100// g/ml 鞋魚精子 DNA、5 x丹哈德（Denhalt)液（lxSSPE ; 0.18M 氯化鈉、10mM 磷酸 鈉、ρΗ7·7、ImM EDTA) 〇 上述所明 地錢目生物」未限於地錢（Marchantia polymorph)，包含屬於地錢亞綱之地錢目之生物。此等之 φ 中，已知在小孢綠苔（Monoclea forsteri)(綠苔目）、花地錢 (Corsinia coriandrina(地錢目）、古地錢（Oximitra paleacea)(地錢目）、浮苔（Ricciocarpos natans)(地錢目）、稀 枝錢苔（Ricca huebeneriana)(地錢目）、浮錢苔（Ricca fluitans)(地錢目）、雙錢苔（Ricca duplex)(地錢目）、溝紋錢 苔（Ricca canaliculata)(地錢目）、二裂錢苔（Ricca bifurca)(地 錢目）、齒毛錢苔（Ricca ciliifera)(地錢目）、青綠錢苔（Ricca glauca)(地錢目）、聚果錢苔（Ricca sorocarpa)(地錢目）、Ricca warnstorfii(地錢目）、米契林錢苔（Ricca michelii)(地錢目）、 20 200525030 乳突錢苔（Ricca pap⑴osa)(地錢目）及查氏錢苔⑻⑽ ZaChariae)(地錢目）中存在超長鏈長高度不飽和脂肪酸（參 ,¾ Prog. LlpidRes. 32，P281，1993)。要從此等生物取得Λ6 不飽和化酵素、△㈣長延長酵素及Δ5不飽和化酵素之基 因右具有現在之技術水準為容易之事。舉例言之，編碼 具有近緣生物之相同機能之酵素之基因，一般已知可藉由 進行交叉雜交而得。 抑立本發明之基因不僅包含雙股龜，亦包含構成其之所 。月思我股及反義股之各單股DNa及rna。反義股可被利 ^做為探針或反義化合物。DNa例如包含藉由選殖或化學 :成技術或彼等之組合所得到之CD·及染色體組dna 等再者，本發明之基因可以包含非轉譯領域(utr)之序列 及載體序列（包含表現載體序列）等序列。 (3)本發明之蛋白質 [本發明之Λ6不飽和化酵素蛋白質] 本發明之Λ6不飽和化酵素蛋白質，以來自地錢目生 物之蛋白質且具有Δ6脂肪酸不飽和化活性之蛋白質為 佳。更具體而言，以以下所示之蛋白質為佳。 藉由在上述(2)中兄載之本發明八6不飽和化酵素基因 編碼之蛋白質。 2.序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質。 3·序列編號2所示之胺基酸序列之丨個或以上之胺基酸 、、二取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構成 之蛋白質。 21 200525030 [本發明之Λ6鏈長延長酵素蛋白質] 本發明之Λ6鏈長延麵素蛋白質，^自地錢目生 .物之蛋白質且具有Λ6脂肪酸鏈長延長活性之蛋白質為 -佳。更具體而言，以以下所示之蛋白質為# !•藉由在上述(2)中記載之本發明Λ6鏈⑽長酵素基因 編碼之蛋白質。 2·序列編號4所不之胺基酸序列構成之蛋白質。 瘳3.序列編號4所示之胺基酸序列之】個或以上之胺基酸經 ，代、刪除、插人及/或附加所成之胺基駿序列構成之 [本發明之Α5不飽和化酵素蛋白質] 本發明之錢和化酵素蛋白質，以來自地錢目 之Α白貝且具有Λ5脂肪酸不飽和化活性之蛋白質 為4。更具體而言，以以下所示之蛋白質為佳。 ^由在上述(2)中記载之本發明Δ5不餘和化酵素基 因編碼之蛋白質。 2. 序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋白質。 3. 序列編號6所示之胺基酸序列之1個或以上之胺基 酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列 構成之蛋白質。 酸或=所$「Λ6脂㈣不飽和化活性」意指對於亞麻 麻料具有基f特異性，可分卿其變換為 亞麻烯酸或硬脂四烯酸之作用… 酸鍵長延長活性」意指對於7刪酸或硬脂丄= 22 200525030 基質特異性，可分別將其變換為升二碳-r-亞麻烯酸或二 十碳四烯酸之作用。再者，上述所謂「△〗脂肪酸不飽和 化活性」意指對於升二碳亞麻烯酸或二十碳四烯酸具 有基質特異性，可分別將其變換為花生四烯酸或二十碳五 烯酸(EPA)之作用。 上述所謂「1個或以上之胺基酸經取代、刪除、插入 及/或附加」意指藉由部位特異性突變誘發法等公知之突變 蛋白質製作法，將可取代、刪除、插入及/或附加數目（以 10個以下為佳，以7個以下為較佳，以5個以下為更佳） 之胺基酸予以取代、刪除、插入及/或附加。如此突變之蛋 白質，不限於具有藉由公知之突變蛋白質製作法人為導入 之突變之蛋白質，亦可藉由單離精製天然存在之同樣突變 蛋白質而得。 再者，本發明之蛋白質以胺基酸藉由肽鍵鍵結而成之 多肽為佳，但非限於此，可為含有多肽以外之構造之複合 蛋白質。其中，做為多肽以外之構造者，可列舉糖鏈及異 戊二烯類基等，但無特殊限定。 又，本發明之蛋白質可為包含附加之多狀者。在附加 有此等多肽之情況，例如可列舉本發明之蛋白質以His & Myc、Flag標識抗原決定部位之情況。 本發明之蛋白質可為將上述本發明之基因（編碼本發 明蛋白質之基因）導入宿主細胞並使該蛋白質在細胞内表 現之狀態，亦可為從細胞及組織等單離精製之狀態。又， 關於在上述宿主細胞中之表現條件，本發明之蛋白質可為 23 200525030 再者，本發明之蛋白質可 與其他蛋白質未融合之蛋白質 為化學合成者。 (4)本發明之蛋白質及基因之取得方法 PF -本::二:史白質及基因之取得方法(生產方法)無特殊 义疋 、之方法例如為以下所示之各方法。 [蛋白質之取得方法] 取得：發明蛋白質之方法(生產方法)，如上述無特殊 ^疋f可鄉從表現本發明之蛋自質之細胞及組織單 八及精衣之方去。對於精製之方法亦無特殊限定可藉由 a知之方法從細胞及組織中調製細胞萃取液然後使用公 知之方法（例如管柱等）精製該細胞萃取液。 ^ ’取得本發明蛋自質之方法，刊舉使用基因重組 技術等之方法。在該情況，例如可以採用「將本發明之基 因導入載體中後，藉由公知之方法導人可表現之宿主細胞 中，使其在細胞内轉譯，然後將上逑蛋白質精製」之方法 等。 再者，將外來基因導入此等宿主之情況，由於在供表 現外來基因用之插入宿主内機能性啟動子之表現載體及宿 主有各式各樣，因此宜視使用目的而選擇。精製所產生蛋 白質之方法，雖視所用宿主及蛋白質之性質而異，但藉由 利用標籤，可以比較容易地精製目的蛋白質。 關於製作突變蛋白質之方法，無特殊限定。例如可以 使用：利用部位特異性突變誘發法(Hashimoto-Gotoh，Gene 152, 271-275 (1995))或PCR法在鹼基序列中導入點突變而 24 200525030 % 製作突變蛋白質之方法；或者藉由插入轉位子（transp〇s〇ne) 之突變株製作法等周知之突變蛋白質製作法。突變蛋白質 之製作亦可以利用市售之套組。 本發明之蛋白質之取得方法，不受上述方法所限，例 如可藉由化學合成者。舉例言之，可利用無細胞系之蛋白 質合成液從本發明之基因合成本發明之蛋白質。 [基因之取得方法] 取得本發明之基因之方法（生產方法）雖無特殊限定， 例如可以利用差示篩選（減差選殖（subtracti〇n ⑽丨叩)）之 參 方法β在該方法中，依照公知之技術，重覆進行在試管内 之直接雜父，可以濃縮目的CDNA(本發明之基因）。 上述差示筛選之各步驟可在通常使用之條件下進行。 如此得到之選殖株，藉由限制酵素圖譜之作成及其之鹼基 序列決定（sequencing)，可以更詳細地解析。藉由此等解析 可以取得或容易地確認包含本發明基因序列之DNA片段。 再者，關於取得本發明基因之方法，可列舉藉由公知 籲 之技術單離及筛選包含本發明基因之DNA片段之方法。例 如，調製與本發明之基因之鹼基序列之一部分特異性雜交 ^探針，可以筛選染色體組DNA庫及£1^八庫。關於此等 才木針，右為與本發明基因之鹼基序列或其之互補序列之至 9 #刀#寸兴性雜父之探針，則可使用任一序列及長度。 又，若從在上述地錢間被良好保存之領域中選擇上述 - 4木針之序列’然後筛選其他地錢之染色體組(或- 庫，可以單離及選殖出編碼具有與上述蛋白質同樣之機能 25 200525030

之相同分子及類緣分子之基因Q

或者取得本發明基因之方法例如為使用pcr等增幅 -手段之方法。舉例言之，分別從本發明基因之·A序列 -中之5’側及3,側之序列（或其之互補序列）調製引子，使用 ^等引子做為染色體、组DNA(或cDNA)等之模板進行pcR 寻，糟由增幅兩引子間所挾持之DNA領域可以大量地取 得包含本發明基因之DNA片段。 φ (5)本發明之基因及蛋白質之利用方法（有用性） (5-1) 重組表現載體 本發明之重組表現載體，若為包含上述(2)中記載之本 發明基因者，將無特殊限定。例如可列舉插入cDNA之重 現載體。在重組表現載體之製作上，可以使用質體、 噬菌體或黏接質體（cosmid)，但無特殊限定又製作方法 亦可使用公知之方法進行。 載胆之具體種類然特殊限定，宜選擇在宿主細胞中可 •以表現之載體。亦即，為了確實地表現基因，視宿主細胞 之種類選擇適當之啟動子，並使用將該啟動子與本發明之 基因插入各種質體等中者做為表現載體。 為了確認本發明之基因是否被導入宿主細胞中，以及 在宿主細胞中是否確實表現，可以使用各種標記 。例如， 使用在宿主細胞中缺失之基因做為標記，將包含該標記及 本發明基因之質體等作為表現載體導入宿主細胞中。藉此 -可以從標記基因之表現確認本發明基因之導入。或者，本 發明之蛋白質可以融合蛋白質之形式表現。例如可使用來 26 200525030 自水母之綠色螢光蛋白質GFP(Green Flourescent Protein) 做為標記’而以GFP融合蛋白質之形式表現本發明蛋白質。 上述宿主細胞，無特殊限定，適合使用先前公知之各 種細胞。具體而言，例如可以列舉大腸菌（Escherichia c〇n) 寺細囷、酵母（出牙酵母（Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵 母（SChiZosaccharomyCes pombe))、線蟲（Caen〇rhabditis elegans)、非洲爪蟾（xenopuslaevis)之卵母細胞等，不過無 特殊限定。 '

f於上述表現載體導入宿主細胞之方法，亦即轉形^ 法無特殊限定，可以適當地使用電氣穿孔法、磷酸鈣法、 核糖體法、DEAE葡聚糖法等先前公知之方法4，例如 蟲中轉移表現之情況，_ (5 一 2) 轉形體 基因為r上述(2)記載之㈣

包含^ , &。其巾所謂「_體」不僅 胞、組織及器官’亦包含生物個體。 =重組表現载體導入窗主細跑之轉形方二 胞處例示之各频生物及動f 牛在“主細 明基:::::之:形體較佳為以可表現方式導入本發 物體之1 、或成為與該植物體具有同—性質之該植 孫之植物體、或此等植物體之組織。藉由此等轉 27 200525030 形植物，可用低成本且利於環境之生產製程生產花生 ^ 酸及EPA等高度不飽和脂肪酸。 其中，所謂「以可表現方式導入基因」意指藉由公知 之基因工程手法（基因操作技術），以可表現方式導入對象 細胞（宿主細胞）内。 植物體轉形所使用之重組表現載體，若可以在該植物 細胞内表現插入基因，將無特殊限定。舉例言之，可 J Μ使

用具有在植物細胞内能恆常地表現基因之啟動子（例如# 挪采化％病毒（Cauliflower mosaic virus)之35S啟動子）之栽 體’或者具有被外來刺激誘導而活性化之啟動子之裁體。 再者，在該植物細胞中，包含各種形態之植物細胞，例如 懸洋培養細胞、原生質體、葉之切片及癒合組織等。 將重組表現載體導入植物細胞可採用聚乙二醇法、電 穿孔法（electroporation 法）、經由土壤桿菌（Agr〇bacterium) 之方法、粒子搶（partic】egun)法等本技藝人士公知之方法。

轉形細胞從植物體之再生，視植物細胞之種類，可以本技 藝人士公知之方法進行。 舉例言之，關於製作菸草轉形體之方法，現已確立數 種技術，諸如使轉形之土壤桿菌感染煙草葉圓片之方法、 使用聚乙二醇將基因導人原生質並使植物體再生之方法、 猎由電脈衝將基因導人原生質並使植物體再生之方法藉 =粒子知法將基因直接導人細胞並使植物體再生之方法 等。在本發明中此等方法均適用。 又，於草，與阿拉伯芬同為使用遺傳工程手法進行植 28 200525030 物育種之模型植物。在該於草中，所謂「可以取得花生四 烯酸及EPA之含置增加之轉形體」，縱使稱之為「可取得 植物=體之轉形體」亦不為過。再者，在本說明書中，如 域所^4，不财以取得料之轉形體， 水稻之轉形體；證明依 丁 形植物體。 桃、、、本务明，可以取得所有種類之轉 舉例言之，_製造水稻轉形植物體之手法，現已確 立數種技術，諸如你用取7 一 ^ . 水乙—醇將基因導入原生質並使植 藉由電脈衝將基輯人原生質並使植物 物法、稭由粒子搶法將基因直接導人細胞並使植 物體再生之方法等。在切财此等方法均適用。 上述轉频為水稻之情況，由於水糊之花生四稀酸 Α之含I增加，從該轉職物體得狀種子，亦即藉 由食用稻米’可容易地將花生四稀酸及嫩等高度不飽和 脂肪酸攝取至體内。因此’水稻之轉形植物體做為食糧之 價值问在食DD產業及農業領域中桎為有用。再者，若在 現在不大被利用之米糠、稻殼、胚芽等中生產花生四烯酸 及EPA’則藉由從此等中萃取出脂肪酸，可有效地利用做 為健康食品之原料。又，亦可利用做為家畜之飼料。 -，得到在染色體組内導入本發明基因之轉形植物 體可藉由有f生生殖或無性生殖從該植物體得到子孫。再 者，從該植物體、或其之子孫或選殖株得到繁殖材料(例如 種子果貝切穗、塊呈、塊根、株、療合組織原生質 等）’基於此等可量產該植物體。在本發明中亦包含：以可 29 200525030 或成為具有與該植物體 或者該植物體之組織 表現方式導入本發明基因之植物體 同一性質之該植物體子孫之植物體 或該植物體之繁殖材料。 又，在植物體、成為具有與該植物 物體子孫之植物體及該植物體之組織中，亦包 殖之植物體。營養增殖亦漏衫養繁殖、選殖株=，曰 ^般係猎由插芽、純等來增殖，亦可在試 、

自莱、1、根㈣官之植物體之再分化絲合紐殖來^直 視植物之鋪’可練之先端做料殊之冬芽將膜 肉化、將花珠芽化及形成芋等。 夕 再者’本發㈣包含以可表財式導林發明基因且 脂肪酸組纽變之植物體，或成為具有與該植物體同一性 質之該植物體子孫之植物體，或者該植物體之_或該植 物體之繁殖材料。所謂「脂肪酸組成改變」意指在轉形前 植物體中之脂肪酸組成與轉形後植物體中之脂肪酸組成不 同。舉例言之’將原先脂肪酸組成t不包含花生四稀酸及 EPA之植物體藉由本發明基因_後轉形植物之脂肪酸 組成中包含花生四烯酸及EPA。 (5-3) 脂肪酸生產方法 本發明包含使用以本發明基因轉形且脂肪酸組成改變 之植物體或植物體之組織生產脂肪酸之方法。 例如，從如上述之花生四烯酸及EPA之含量增加之本 發明轉形植物製得之食用油，係花生四烯酸及Epa之含量 高而價值高者。上述轉形植物體之種子、果實、切穗、塊 30 200525030

塊根等作為含花生四稀酸及EPA之食物材料日寺 價值 (5-4) 材料 在本發明中，亦包含藉由上述脂肪酸生產方法得到之 物質，亦即含有r-亞麻烯酸、升二碳个亞麻烯酸、花生四 烯酸、硬脂四烯酸、二十碳四烯酸及二十碳五烯酸中之至 少一種之材料。所謂「材料」，除意指做為上述食物材料之

種子、果貫、切穗、塊莖或塊根之外，亦指可利用做為工 業原料用之所有材料。 關於上述材料，例如可列舉含花生四烯酸及epa之1 康食品、薄膜、生物分解性塑膠、機能性纖維、潤滑油 洗劑等材料。上述不飽和脂肪酸具有所謂「在分子内具 個雙鍵」之獨特物性。因此，例如藉由利用本發明: =形植^生產花生烤酸及EPA，可使生產成本降低。^ 者，稭由本發明，可以實制於環境之生產製程。 (5_5)脂肪酸組成之改變方法

方法=明:上？含使用本發明基因改變-— 可以改變宿主4二错由製作導入本發明基因之轉形體 對象無特殊限定，除植物變=酸組心 所有生物做為對象。 動物、細囷、酵母， (5-6)基因檢測器具 本發明之基因檢測器具 部分鹼基序κι ㈣切明基目之至少- ，、之互補序列做為探針者❹基 31 200525030 具，可利用於在各種條件下進行本發明基因之表現圖譜之 檢測及測定等。 關於本發明之基因檢測器具，例如可列舉將與本發明 基因可特異性雜交之上述探針固定於基盤（載體）上而成之 DNA晶片。其中所謂「DNA晶片」雖主要意指以合成寡核 苷酸做為探針之合成型DNA晶片，但亦包含將pcR產物 等cDNA用於探針之貼附型DNA微陣列。 用作探針之序列，可藉由特定化來自cDNA序列中之 斗寸徵序列之先兩公知方法決定。具體而言，例如sage.

Serial Analysis of Gene Expression 法（Science 276:1268, 1997，Cell 88 : 243，1997 ; Science 270:484，1995 ; Nature 389:300, 1997 ;美國專利第 5,695,937 號）。 再者，在DNA晶片之製造上，可採用公知之方法。例 如，使用合成寡核苷酸做為寡核苷酸之情況，藉由光微影 術(photolithography)與固相法DNA合成技術之組合，可以 在该基盤上合成該寡核苷酸。另一方面，在使用cDNA做 為寡核苷酸之情況，可使用陣列機將其貼附於基盤上。 又’與一般DNA晶片同樣，配置成完全正確配對之探 針（寡核苷酸）以及在該完全正確配對之探針中有一鹼基被 置換之錯配探針，基因之檢測精確度可更為提高。再者， 為了同時檢測出不同之基因，亦可將複數種寡核苷酸固定 於相同基盤上，構成DNA晶片。 本發明之基因檢測器具，對於上文例示之DNA晶片無 特殊限定，可用本發明基因之至少一部分之鹼基序列或其 32 200525030 之互補序列做為探針。 (5-7) 抗體 本發明之抗體，係以本發明之蛋白質或其部分蛋白質 及部分胜肽做為抗原，藉由公知方法以多株抗體或單株抗 體得到之抗體。關於公知之方法，例如為文獻(HaH〇w等人 之「Antibodies: A laboratory manual(Cold Spring Harbor

Laboratory，New Y〇rk(1988)，·岩崎等人之「單株抗體融合 瘤及ELISA，講談社（1991)」）記載之方法。如此得到之抗 體，可利用於本發明蛋白質之檢測及測定。 (5-8) 篩選方法 本發明之篩選方法，係使用本發明之蛋白質篩選調 節=白質之基因或調節該蛋白f之物f之方法。本發明 之筛選方法’可使用先前公知之各種調查物㈣是否結合 或是否解敎方法，心特殊限定。例如可㈣舉促進本 發明蛋白質之时⑽不飽和m Λ6鏈長延長活性 及/或Λ5不飽和化活性）之物質之篩選法。 再者，本發明包含藉由上述篩選方法得到之基因或物 以下，雖例示實施例以詳細說明本發明，但本發明當 然不叉以下實施朗限，細節部分不職當然亦可有各種 可月y再者，本發明不限於上述之實_態可在申請專 ::圍所示之範，中進行各種變更；將所揭示之技術手段 組合所得之實施形態亦包含於本發明之技術範嘴 200525030 [實施例] 在本實施例中，實驗手法若無特殊指定，將依照在 Molecular Cloning(Sambrook et. aL Cold Spring Harbour Laboratory Pess，1989)中記載之方法。 [實施例1 :來自地錢之Λ6不飽和化酵素基因之單離] 藉由比對至目前為止被選殖之A6不飽和化酵素之胺 基酸序列’可知胺基酸序列Trp - Trp - Lys - (Glu/Asp)-Lys — His - Asn(序列編號 37)及 Trp - Phe - Thr - Gly - Gly -

Leu - Asn(序列編號38)被保存。因此，為了單離來自地錢 之Λ6不飽和化酵素基因，使用編碼上述胺基酸序列之下 述簡併引子： dA6DES - F 55 - TGGTGGAA(A/G)GA(A/G/T/C)AA (A/G) CA(T/C)AA - 3’（序列編號 7) dA6DES - R 55 - (A/G)TTIA(A/G)ICCICCIGT(A/G)AACCA -3’（序列編號8) (I表示肌苷，（）内為複數個鹼基） 在試料方面，使用E系統地錢（參照Transgenic Res· 9， pl79, 2000)之葉狀體。從葉狀體單離聚(A)+RNA，係依照 文獻（Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p605，2003 ; Biosci· Biotechnol. Biochem. 67, pl667, 2003)中記載之方法。使用 Ready-To-Go T-primed First Strand 套組（Amersham 公司 製），將單離之聚(A)+RNA 1.5//1轉錄成cDNA。PCR，係 以上述cDNA約10 ng做為模板，使用上述引子（dA6DES-F 及 d △ 6DES-R)及酵素（Takara Ex Taq，Takara 公司 34 200525030 » 製）〇.5U，並以製造者推薦之方法進行。將反應液量調為20 // 1 ’ 使用 GeneAmp PCR 系統 9700 (PE Applied Biosystems 公司製），於94°C保持2分鐘後，反覆進行「94°C/1分鐘、 45°C/1.5分鐘及72°C/2分鐘」之反應35次，然後冷卻至4 〇C。 將所得PCR產物在l%(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳，使用 Prep-A Gene(Bio-rad公司製），從凝膠回收具有從先前Λ6 不飽和化酵素之胺基酸序列預測之尺寸之增幅片段。將回 收之增幅片段連結至pT7Blue Vector (Takara公司製），然 後用其轉形大腸菌Electro-max DH10B細胞(Invitrogen公 司製，Carlsbad，CA)。 使用BigDye終結子循環定序套組(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit)(Applied Biosystems 公司製）及自動化 定序機 ABI PRISM 377 (Applied Biosystems 公司製），決定 所得選殖株之全部鹼基序列，以探索具有目的cDNA序列 者。 再者，為了取得全長之cDNA序列，進行5’-RACE及 3，-RACE。其中，使用迅速增幅dDNA末端用之5，-RACE 系統 2·0 版(Invitrogen 公司製）、Ready-To-Go T-primed First Strand 套組（Amersham 公司製）及下述引子 (MpDES6-02R及MpDES6-01F)，並依照製造者推薦之方法 進行。

MpDES6-02R : 5，-AAGTTGCCTTCGATGTTTCTGG-3, (序列編號9) 200525030

MpDES6 - OIF . 5，-GCTCGCCTGGAGCAAGGAAATC。，（序列編號 10) . 結果單離出一種類似基因候選者，將該基因稱為

MpDES6基因。該被單離之MpDES6基因之cDNA之長度 (除去?κ A部分）為2,522 bp，其所編碼之推定胺基酸序列 為481殘基。將其之鹼基序列示於序列編號1中，將其之 胺基酸序列示於序列編號2中。 將MpDES6cDNA之推定胺基酸序列與立碗蘚之A6不 ⑩飽和化酵素之胺基酸序列比較，結果只顯示47·5%之同一 性。 [實施例2 :來自地錢之Λ6鏈長延長酵素基因之單離] 將至目前為止所選殖出之Λ6鏈長延長酵素之胺基酸 序列加以比對，可知胺基酸序列\^1-〇111-?}^-1^1-Asp — Thr - Val (序列編號 39)及 Lys - Tyr — Leu - Phe — Trp - Gly - Arg (序列編號40)被保存。因此，為了單離來自 馨地錢之A6鏈長延長酵素基因，使用編碼上述胺基酸序列 之下述簡併引子。 dA6ELO-F ： 5’ -GTIGA(A/G)TT(T/C)ATGGA(T/C)ACIGT- 3，（序列編號 11) dA6ELO-R : 5， • -C(G/T)ICCCCA(A/G)AAIA(A/G)(A/G)TA (T/C)TT-3 ’（序 - 列編號12)。 使用上述引子（dA6ELO-F及dA6ELO-R)進行PCR， 36 20Ό525030 將得到之dna片段分段選殖。決定得到之選殖株之鹼基序 列，對於具有目的CDNA序列之選殖株，使用下述引子 (MpELOl-02R 及 MpELOl-OlF)取得全長 cDNA。又，實驗 材料及方法與實施例1同樣。

MpELOl-02R : 5,一GCGAGCTTTCTCGTTCTTTCCC-3, (序列編號13)

MpELOl-OlF : 5，—TATGATTTTGAAGCGCAACACG-3, (序列編號14) 結果單離出一種類似基因候選者，將該基因稱為 MpELOl基因。該MpELOl基因之cDNA之長度（除去聚A 部分）為1，559 bp，推定之胺基酸序列為290殘基。將其之 驗基序列示於序列編號3中，其之胺基酸序列示於序列編 號4中。 將MpELOlcDNA之推定胺基酸序列與立碗蘚之八6鏈 長延長酵素之胺基酸序列比較，結果顯示62.7%之同一性。 [實施例3 :來自地錢之Λ5不飽和化酵素基因之單離] 其他物種之Λ5不飽和化酵素在其之N末端具有細胞 色素b5功能域(cytochrome b5 domain)。因此，推測來自地 錢之Λ5不飽和化酵素基因，與不飽和化酵素基因同 樣，隸屬於細胞色素b5功能域融合型不飽和化酵素基因家 族。但是，在矽藻及真菌中，不飽和化酵素及八6不飽 和化酵素於胺基酸序列層級之相同性非常低。再者，比較 絲狀菌（M. alpina)之△ 5不飽和化酵素與△ 6不飽和化酵素 間之胺基酸序列，發現局部地存在具有設計簡併引子所需 37 200525030 之最低限數目（即4至5個）連續殘基之保存序列。又，出 乎意料之外地發現此等保存序列，在同種内之Λ5不飽和 化酵素與Δ6不飽和化酵素之間，比在異種之不飽和化 酵素之胺基酸序列間被更良好地保存。因此認為在細胞色 素b5功能域融合型不飽和化酵素基因中，有時存在種特異 性之保存序列。再者，比較及深入檢討上述MpDES6與在 Genetics 159, p981，2001中記載之機能未知之MpDES之鹼 基序列，結果發現2個胺基酸序列（i(e/N)(G/D)KVYDV (序 列編號41)及DI>DI(Q/D)(Y/T)(M/V)P (序列編號42)之胺基 酸序列被保存。對應於各個胺基酸序列之簡併引子之序列 如下文所示： dA5DES-F ： 55-AT(AA>/C)(A/G)AIG(A/G)IAA(A/G)Tim (T C)GA(T/C)GT-3’（序列編號 15) dA5DES-R ： 5^GGIA(T/C)I(G/T)(A/T)IT(G/C)(A/G/T) AT(A/G)TCIGG(A/G)TC-3’（序列編號 16) 使用上述引子（dA5DES-F及dA5DES-R)進行PCR， 將得到之DNA片段分段選殖。決定得到之選殖株之脍基序 列，對於具有目的cDNA序列之選殖株，使用下述引子 (MpDES5-02R 及 MpDES5-01F)取得全長 cDNA。又，實驗 材料及方法與實施例1同樣®

MpDES5-02R ： 55-GTGTGTACGATCCGTGGTTACC-3, (序列編號17)

MpDES5-01F ： 5，-AAGGCGGGACAGGATTCAACAC-3’（序列編號 18)。 38 200525030 結果單離出兩種長度不同之選殖株d及c2 (cl · 2,427bp ’ c2 · 2,285bp)做為來自地錢之Λ5不飽和化酵素候 選者。若比較cl與C2之鹼基序列，可知在非轉譯領域發 生選擇性拼接（alternative spUcing)。未因選擇性拼接而發生 譯碼區變化，任一選殖株均編碼484個胺基酸（序列編號 6)。以下，將2427bp長之選殖株cl稱為MpDES5基因（序 列編號5)，並用於以下之實施例。 MPDES5cDNA之推定胺基酸序列與絲狀菌（M· alpina) 之Λ5不飽和化酵素之胺基酸序列相較，顯示314%之同— 性。至於來自與地錢為近緣之立碗蘚之△ 5不飽和化酵素， 由於其之序列資料尚未被發表，因此在此無法進行比較。 [實施例4:使用甲醇利用性巴氏畢赤酵母菌（pichia pastoris)之機能解析] 為 了調查 MpDES6，MpELOl 及 MpDES5 之 cDNA 機 能，首先製作將各個開放譯碼區（ORF)配置在甲醇誘導性啟 動子AOX1之下游之構築體。將此等構築體導入甲醇利用 性巴氏畢赤酵母菌中，並解析其之脂肪酸組成。將

MpDES6，MpELOl 及 MpDES5 之 cDNA 驗基序列之 0RF 部分，用下述引子藉由PCR增幅。 (MpDES6 ORF增幅用引子）

MpD6-17F ： 5,-GGAATTCGCGATGGCCTCGTCCACCACCAC -3,（序列 編號19)

MpD6-18F ： 39 200525030 5,一GGAATTCTACTTTCGCAGCGTATGCTACC- 3’ （序歹)】編 號20)

(MpELOlORF增幅用引子) MpD6ELO!-15F 5,-GGAATTCGCGATGGAGGCGTACGAG ATGG- 3’（序列 編號21)

MpD6EL01 - 16F ： 5，—GGAATTCTTCTGCCTTTTTGCTCTT G ATC-3’（序歹丨J 編 號22) (MpDES50RF增幅用引子)

MpD5—11F : 5，—GTTGAATTCGACAGTTATGCCGCCGCCA CACGC-3， (序列編號23)

MpD5-12R : 5’一GTTGAATTCAGGCCCAAAGCATGCTGTCA C-3,（序歹，J 編號24) 此等引子包含EcoRI識別序列，將此等引子利用於以 下之選殖。再者，在PCR中，使用Pyr〇best DNA聚合酶 (Takara公司製）0.5U，依照製造者推薦之方法，以20//1之 反應液量進行。反應條件為於94°C保持2分鐘後，反覆進 行「94°C/1分鐘、57°C/1分鐘及72°C/1分鐘」之反應25 次’然後冷卻至4°C。將得到之各orf片段用EcoRI消化 後，以在實施例1中記載之方法進行凝膠精製。然後，將 其以意義（sense)方向連結至甲醇利用性酵母之表現載體 200525030

I pPICZA(標記：吉新(geocin)耐性基因，Invitrogen公司製） 内之甲醇誘導性啟動子5’-ΑΟΧ1之下游之EcoRI部位。 將各個表現用構築體及做為對照之pPICZA載體用畢 赤酵母菌Easy Comp套組(Invitrogen公司製）導入甲醇利用 性酵母之PPY1系統中，取得以吉新(geocin)耐性做為標記 之轉形體。再者，甲醇利用性酵母雖可以合成Λ6不飽和 化酵素之基質，即亞麻酸及α-亞麻烯酸，但無法合成花生 四烯酸及ΕΡΑ之其他前驅體。 為了表現導入之基因，使用Easy Select畢赤酵母菌表 現套組（Invitrogen公司製），依照該套組製造者推薦之方 法，將各轉形體在以1.0%甘油為唯一碳源之最小培養基中 培養至OD(600 nm)成為0·5後，在以0 5%甲醇為唯一碳源 之最小培養基中，於30°C培養3日，直至培養成飽和狀態。 之後，使用GC-MS並依照公知之方法（Bi〇sci Bi〇techn〇1 Biochem· 67, p605, 2003)測定各個轉形體之脂肪酸組成。 在表現MPDES6基因之轉形體中，新檢測出Λ6不飽 和化酵素之反應產物，即亞麻稀酸及硬脂四稀酸分別為 全部脂肪酸之7.4%及〇·7%。於導人做為對照之ρρκ：ζΑ載 體之酵母中，則未檢測出此等酸。上述顯示專似6基因 編碼△ 6不飽和化酵素。 在表現MpELOl基因之轉形體中於添加丫亞麻稀酸 時，升二碳个亞麻烯酸佔全部脂肪酸之i4 i% ;於添加硬 脂四稀酸時’新檢測出之二十碳碳四稀酸佔15%。於導入 做為對照之PPICZA載體之酵母中，則未檢測出此等酸。 41 200525030 以上頒不MpEL01編碼△ 6鍵長延長酵素。 在表現MPDES5基因之轉形體中，於添加升二碳 • 亞麻烯酸時，花生四烯酸佔全部脂肪酸之1.1% ;於添加硬 脂四烯酸時，檢測出之二十碳五烯酸佔〇.1%。於導入做為 對照之pPICZA載體之酵母中，則未檢測出此等酸。上述 减不MpDES5基因編碼△ 5不餘和化酵素。 如上述，從地錢中取得分別編碼八6不飽和化酵素、 △ 6鏈長延長酵素及Λ5不餘和化酵素之基因，即 鲁 MpDES6、MpELOl 及 MpDES5。 [實施例5 :於甲醇利用性巴氏畢赤酵母菌（p past〇ris) 中地錢之高度不飽和脂肪酸生合成系統之再構成] 為了同時表現MpDES6、MpELOl及]vfpDES5，將在 上述實施例4中製作之經EcoRI消化之MpELO 1及 MpDES5之ORF增幅片段，分別以有意義方向連結至甲醇 利用性酵母菌表現載體pPIC3K(標記：HIS4基因， φ Invitr〇gen 公司製）及 pPIC6A(標記：保米黴素（blasticidin) 耐性基因，Invitrogen公司製）之5’ΑΟΧ1啟動子下游之 EcoRI部位。再者，關於MpDES6，使用在實施例4中製 作之表現載體。 以下各表現載體分別表記成pPICZA-MpDES6、 pPIC3K-MpEL01 及 pPIC6A-MpDES5。 首先用pPICZA-MpDES6或只用做為對照之pPICZA - 載體轉形曱醇利用性酵母PPY12系統(his4, arg4)，該酵母 PPY12系統具有與上述實施例4中所用之甲醇利用性酵母 42 20Ό525030 PPY1系統相同之脂肪酸組成，藉此取得以吉新（zeocin)耐 性為標記之轉形體。繼而將pPIC3K-MpEL01或只將做為 對照之PPIC3K載體導入染色體組中分別插有 pPICZA-MpDES6或pPICZA之轉形體中，取得以組胺酸合 成能力為標記之轉形體。最後，將pPIC6A-MpDES5或只 將做為對照之PPIC6A載體導入染色體組中分別插有 pPICZA-MpDES6 及 pPIC3K-MpEL01 或者 pHCZA 及 pPIC3K之轉形體中’取付以博來斯妥新(blastocin)耐性為 標記之轉形體。 使用所得之導入2種或3種基因之轉形體，進行地錢 之花生四烯酸/EPA生合成系統之再構成。首先導入上述2 種基因（MpDES6及MpELOl)。使用轉形體，以使MpDES6 蛋白質及MpELO 1蛋白質在甲醇利用性酵母内同時表現。 結果除生成為Λ6不飽和化反應產物之r-亞麻烯酸（佔全 脂肪酸之2.9%)及硬脂四烯酸（佔全脂肪酸之〇4%)之外， 尚生成此等之鏈長延長反應產物，即升二碳τ-亞麻烤酸 (佔全脂肪酸之2.8%)及二十碳四烯酸（佔全脂肪酸之 〇·2%)。在做為對照之轉形體中，則未檢測出上述脂肪酸。 於上述轉形體中再導入MPDES5所得之轉形體中，除 亞麻烯酸（佔全脂肪酸之2.8%)、硬脂四烯酸（佔全脂肪酸之 0.5%)、升二碳τ -亞麻烯酸（佔全脂肪酸之！ 5%)及二十碳 四烯酸（佔全脂肪酸之0·1%)之外，確認生成花生四稀酸（佔 全脂肪酸之0.1%)及二十碳五烯酸（ΕΡΑ，佔全脂肪酸之 0·03%)。在做為對照之轉形體中，則未檢測出上述脂肪酸。 43 200525030 5亥結果頒不藉由使來自地錢之△ 6不飽和化酵素、△ 6鍵長 延長酵素及Λ5不飽和化酵素之基因表現’縱使在地錢以 外之生物種中，亦可再構築成高度不飽和脂肪酸生合成系 統0 [實施例6 :導入水稻之載體之構築及該載體於水稻中 之導入] 為了使MpDES6、MpELOl及MpDES5基因在水稻中 表現，以下述⑴〜(iv)所示之步驟製作表現構築體，再者， ®製作步驟如第一圖所示。 ⑴藉由使用下述引子（被設計成黏接在 ρΒΙ221(ΤΟΥΟΒΟ公司製）之花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟 動子與NOS終結子之間）之PCR，製作除去葡萄糖醛酸 酶(GUS)基因部分之表現載體p35S-NOS。 MKO01(F) ： 5?-CGGGATCCTCTCCTGGCGCACCATCGTC-3’（序列編號25) φ MKO02(R)： 55^GGGGTACCAACGCGCTTTCCCACCAACG ^ 3’（序列編號26) 又，引子MKOOl(F)包含BamHI識別序列，且黏接於 GUS基因之3’末端；引子MKO02(R)黏接於GUS基因之5, 末端（於黏接部位之上游存在BamHI部位）。PCR，係使用 PyrobestDNA聚合酶(Takara公司製）0.5U，依照製造者推

薦之方法以50 " 1之反應液量進行。反應條件為：於96°C •保持5分鐘後，重覆「94°C/30秒，68°C/4分鐘」之反應 3〇次，然後冷卻至4°C。將得到之各ORF片段用BamHI 44 20Ό525030 ψ 消化後，用在實施例1中記載之方法進行凝膠精製後’自 行連結。 (ii)繼而將MpDES6基因、MpELOl基因及MpDES5 基因之ORF分別連結於p35S-NOS之Xbal部位。在〇RF 之增幅方面，使用包含Xbal識別序列之下述引子 (MpDES6 ORF增幅用引子）

MpD6-21F : 5，—GCTCTAGAGCGATGGCCTCGTCCACCACC -3,（序列編號 27) MpD6- 11R ·· 5，-GCTCTAGACTATACTTTCGCAGCGTATGC -3’（序列編號28) (MpELOl ORF增幅用引子）

MpD6ELOM8F ： 5^GCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACGA GATGG-3’(序列編號29)

MpD6ELOM3R ： 59-GCTCTAGATTATTCTGCCTTTTTGCT C-3’（序列編號30) (MpDES5 ORF增幅用引子）

MpD5 22F ： 5，- GCTCTAGAGACAGTTATGCCGCCACACGC -3’ (序歹編號 31) MpD5 23R ： 55-GCTCTAGAAGGCCCAAAGCATGCTGTCAC -3’（序列編號32) PCR，係使用Pyrobest DNA聚合酶（Takara公司 製）0.5U，依照製造者推薦之方法以20//1之反應液量進 行。反應條件為：於94°C保持2分鐘後，重覆「94°C/1分 鐘，57°C/1分鐘，72°C/1分鐘」之反應25次，然後冷卻至 45 200525030 4°C。將得到之各ORF片段用Xbal消化後，用在實施例1 中記載之方法進行凝膠精製，然後用於選殖。 . (iii) 得到之各基因之表現構築體（分別表記為 p35S-MpDES6、p35S-MpEL01 及 p35S-MpDES5)，均係利 用具有位於CaMV35S啟動子5’末端之PstI部位及位於 NOS終結子3’末端之EcoRI部位者，連結上述三基因之表 現匣（expression cassette)。首先，使用下文所示之引子並以 p35S-MpDES5為模板進行PCR，增幅MpDES5基因之表現 匣部分，然後選殖入在p35S-MpDES6之CaMV35S啟動子 5’末端之PstI部位（參照第一圖）。 (MpDES5基因表現匣增幅用引子） M13R : 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(序列編號 33) NOS-R4-PST ： 55-AAACTGCAGATTCCCGATCTAGTAACA TAG-3’（序列編號34) 再者’ M13R引子黏接於caMV35S啟動子上游之載體

Φ序列。再者，NOIRtPST引子包含PstI，且黏接於NOS 終結子-3’末端。同時不包含存在於nos終結子-3,末端之 EcoRI部位。 PCR ’係使用j>yr〇best dna聚合酶（Takara公司 製）o.5u ’依照製造者推薦之方法以2〇#ι之反應液量進 行。反應條件為··於94°C保持2分鐘後，重覆「94°C/1分 鐘’ 57C/1分鐘，72°C/1分鐘」之反應25次，然後冷卻至 ' 4C。將得到之各〇RF片段用PstI消化後，用在實施例1 中圮載之方法進行凝膠精製，然後選殖入包含MpDES6基 46 20Ό525030 因之表現匣之質體（p35S-MpDES6)之PstI部位。 (iv) 在上述得到之連結有MpDES5及MpDES6基因 之表現匣之構築體（表記成p35S-MpDES5/35S-MpDES6) 上，再連結MpELOl基因之表現匣。使用以下之引子並以 p35S-MpEL01做為模板進行PCR，增幅MpELOl基因之 表現匣部分，然後選殖入在MpDES6基因表現匣内之NOS 終結子3’末端之EcoRI部位。 (MpELOl基因表現匣增幅用引子） 35S-F3-EI: 5，-CCGGAATTCGCATGCCTGCAGGTCCCCAG A -3’（序列編號35) M13F : 5，-TGTAAAACGACGGCCAGT-3,（序列編號 36) 再者，35S-F3-EI引子包含EcoRI識別序列，且黏接於 CaMV35S啟動子之5’末端。再者，M13F引子黏接於NOS 終結子下游之載體序列。 PCR，係使用Pyrobest DNA聚合梅（Takara公司 製）〇.5U，依照製造者推薦之方法以20//1之反應液量進 行。反應條件為：於94°C保持2分鐘後，重覆「94°C/1分 鐘，57°C/1分鐘，72°C/1分鐘」之反應25次，然後冷卻至 4°C。將得到DNA片段用EcoRI消化後，用在實施例1中 記載之方法進行凝膠精製，然後選殖入連結有MpDES5及 MpDES6基因之表現E之構築體（p35S-MpDES5/35S-MpDES6)之 EcoRI 部位。 藉由以上之操作，製作3基因之表現匣以MpDES5、 MpDES6及MpELOl之順序連結而成之表現構築體（表記成 47 200525030 p35S-MpDES5/35S-MpDES6/p35S-MpEL01)。 將如此所得之上述構築體，藉由公知之方法（Genes

Genet· Syst· 73, p219, 1998)，導入以拜拉磷（bialaphos)為選 擇標記之質體，然後用粒子搶將該質體導入水稻中，取得 轉形水稻。 實施例7 :[在於草（N· tabacum SR-1)中地錢之高度不 飽和脂肪酸生合成系統之再構成] 在本實施例中，確認上述來自地錢之不飽和脂肪酸合 > 成酵素基因MpDES6基因、MpDES5基因及MpELOl基因 在植物中能良好地發揮機能:。 具體而言，確認將MpDES6基因、MpDES5基因及 MpELOl基因導人於草時，於該於草中可生產花生四烯酸 等。製作導入來自絲狀菌（M· alpina)之3種基因·· Λ6不飽 和化酵素基因（MaDES6)、不飽和化酵素基因（MaDES5) 及Λ6鏈長延長酵素基因（MaELO)之菸草，以做為對照組。 ^ (i) 包含來自絲狀菌之基因之載體(pSPBl519)之構 築 pE2113 (Mitsuhara et al· Plant Cell PhysioL37，45-59 1996)具有含反覆促進子（enhancer)序列之花椰菜花葉病毒 358(£12358)啟動子及胭脂胺酸（11(^3丨丨1^)合成酶（11〇5)終結 子0

將pE2113用SnaBI消化後，藉由與Xhol接頭（Takara 公司製）連結，製作質體。將該質體用SacI消化後，將末端 平滑化，再藉由與BamHI接頭(Takara公司製）連結，製作 ρϋΕ7。藉由將PUE7用Hindlll及EcoRI消化後得到之DNA 48 200525030 ι» 片段中具有E1235S啟動子之片段，與用Hindlll及EcoRI 消化得到之植物轉形用雙載體pBINPLUS(van Engelen et al· Transgenic research 4, p288，1995)連結，製作 pSPB505。 另一方面，藉由將係屬含MaDES6基因之質體之 pMLDlOl用Xhol消化後，再用BamHI部分消化，得到約 1 ·6 kb之DNA片段。將該片段，與用Xhol及BamHI部分 消化PSPB505所得之雙載體部分之DNA片段連結，製作 pSPB559 〇 藉由將 pUCAP(van Engelen et al. Transgenic research 4, p288，1995)用AscI消化後，將末端平滑化，然後與PacI 接頭連結，以製作pUCAPP。 將pE2113用SnaBI消化後，藉由與BamHI接頭（Takara 公司）連結，製作pUE6。將pUE6用SacI消化後，將末端 平滑化，藉由與Sail接頭（Takara公司）連結，製作pUE8。 藉由將pUE8用Hindlll及EcoRI消化所得之DNA片段中 具有E1235S啟動子之片段插在pUCAPP之Hindlll-EcoRI 間，製作質體。將該質體用BamHI及Sail消化所得之DNA 片段，與MaELO基因之cDNA用BamHI及Xhol消化所得 之DNA片段連結，製作pSPB1130。將pSPB1130用PacI 消化，然後將所得之約2·3 kbDNA片段插在pBINPLUS之 PacI部位。選擇MaELO基因之轉譯方向與pBINPLUS上 之nptll基因之轉譯方向為同向之質體，將該質體稱做 PSPB1157P 〇 再者，將上述之PSPB1157P用PacI消化後，將末端平 49 200525030

滑化，藉由與AscI接頭連結，製作psPB559A。然後藉由 將pSPB559A用AscI消化所得之含MaDES6基因之DNA • 片段插入pSPB1157P之AscI部位，製作pSPB1157。 藉由將 pCGP1364(Plant Cell Physiol· 36，1023，1995) 用Hindlll及SacII消化所得之約i.3kb之DNA片段， pCGP1364用PstI消化且將末端平滑後再用SacII消化所得 之約2.9kb之DNA片段，以及pUCAPA用SacI消化且將 末端平滑後再用Hindlll消化所得之約2.7kb之DNA片段 •連結，得到PSPB184。 另一方面，經Xbal及ΚρηΙ消化，從分段選殖有 MaDES5基因之pCRII載體切出含有MaDES基因之DNA 片段。藉由將該片段，與上述之pSPB184經由Xbal及ΚρηΙ 消化所得之DNA片段連結，製作psPB1519A。將 PSPB1519A用AscI消化，將得到之片段插入psPB1157之 AscI 部位，製作 PPSPB1519。在該 PPSPB15〗9 上，MpDES6 φ基因、MpDES5基因及MpELOl基因係以相同方向轉譯， 且由相同構成之啟動子控制。 (ii) 來自地錢之基因之載體(pSPB2368)之構築 將 pUCAP(van Engelen et al· Transgenic Research 4， 288-290，1995)用AscI消化後，與Sgfl接頭連結，然後藉 由與用PacI消化後之Fsel接頭連結，製作pUCSAPF。再 者，對於pBINPLUS施以同樣之處理，以製作pBINSAPF。 • 關於其他選殖用載體，藉由將pUC19用Hindlll消化 後，與PacI接頭連結，再用EcoRI消化後，與Fsel接頭連 50 200525030 結，製作pUCPF。再者，藉由將puC19用Hindin消化後， 與Sgfl接頭連結，再用EcoRI消化後，與AscI接頭連結，

製作 pUCSA。在 pUCSAPF 之 Hindlll-Xbal 間插入 e1235S 且在SacI-EcoRI間插入曼諾平（mann〇pin)合成酵素（mas) 基因終結子之載體，用Xbal及SacI消化後，將末端平滑 化，得到PSPB2353A。在pSPB2353A之平滑末端上，連結 用Xbal從p35S-MpDES6切出且將末端平滑化之含 MaDES6基因之DNA片段，以製作pSPB2353。 分別在pUCSA之Hindlll-Xbal間插入E1235S及在 SacI-EcoRI間插入曼諾平合成酵素（mas)基因終結子之載 體，用Xbal及SacI消化，以製作PSPB2355A。 另一方面，以p35S-MpEL01做為模板，使用下述引 子、XbaMpELOf 及 SacMpELOr 進行 PCR。

XbaMpELOf : 5，-AGTCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACG-3, (配列序號43)

SacMpELOr : 5、CAGTGAGCTCGGTGTCTTATTCTGCC-3, (配列序號44) PCR，係使用高精確度之KOD+DNA聚合酶（東洋紡織 公司製），於94°C保持2分鐘後，重覆「94°C/15秒及68°C /1至3分鐘」之循環25次。將如此調製之MpELO DNA片 段經Xbal及SacI消化者，連結至上述pSPB2355A上，以 製作PSPB2355。然後將pSPB2355經Sgfl及AscI消化所 得之DNA片段，連結至經Sgfl及AscI消化之pSPB2353 上，以製作PSPB2361。 51 200525030 分別在pUCPF之Hindlll-Xbal間插入E1235S及在 SacI-EcoRI間插入曼諾平合成酵素（mas)基因終結子之載 體，用Xbal及SacI消化，以製作pSPB2352A。 另一方面，以p35S-MpDES5為模板，使用下述引子、 XbaMpD5f及SacMpD5r進行PCR。PCR之反應條件與上 述PCR條件相同。

XbaMpD5f ： 55-AGCTTCTAGAGCCATGCCGCCACACGCCC -3’（序列編號45) _ SacMpD5r: 5'CAGTGAGCTCTCAGCCATCCAGTCGT-3’（序 列編號46) 將藉由PCR調製之MpD5 DNA片段用Xbal及SacI 消化，然後將所得片段連結於pSPB2352A上，以製作 PSPB2352 〇 將pBINSAPF經pacl及Fsel消化所得之DNA片段， 與用PacI及Fsel從pSPB2352切出之含有MpDES5基因之 鲁DNA片段連結，以製作pSPB2368A。然後藉由將 pSPB2368A經Sgfl及Pacl消化所得者，與用Sgfl及Pacl 從pSPB2361切出之含有MpDES6基因及MpELO基因之 DNA片段連結，以製作psPB2368。在該質體上，MpDES6 基因、MpDES5基因及MpELOl基因係以相同方向轉譯， 且由相同構成之啟動子控制。 (iii) 基因在於草中之導入 繼而，依據公知之方法（Plant J. 5，81，1994)，用 pSPB2368 或 pSPB 1519 將根瘤土 壤桿菌（Agrobacterium 52 200525030 tumefaciens)(菌株：Agl〇(Laz〇 et al 1991，Bi〇techn〇i〇w 9:963-967))轉形。使該具有pSpB2368或pSpB〗5i9之轉形 根瘤土壤桿菌感祕草葉圓片。帛RNeasypiammini套組 (Qiagen公司製）從如此所得之重組菸草之葉子萃取rna， 依照確立之方法，藉由Rt-pcr選擇出導入之基因能表現 之系統。 從如此所得之導入由來自絲狀菌之酵素基因構成之 PSPB1519之菸草（經pSpB1519轉形之菸草），及導入由來 自地錢之酵素基因構成之PSPB2368之菸草（經pSPB2368 轉形之菸草）之葉子，用公知之方法[藤野安彥編（1978)，生 物化學實驗法9，學會出版中心；山田晃弘編（1989)，生物 化學實驗法24，學會出版中心]，進行脂質之萃取。將得到 之月日貝以氣相層析術（Hewlett Packard公司，HP-6800)分 析’並將其之結果示於表1中。 再者，使用未導入基因之菸草葉做為對照組，進行同 樣的分析。【表1】

Control (%) Control (mg/gFW) pSPB2368 (%) PSPB2368 (mg/gFW) PSPB1519 (%) 亞麻酸 9.55 1.17 1.37 0.2 9.51 CI-亞麻稀酸 49.99 6.12 17.83 2.58 39.24 T-亞麻烯酸 0 0 4.06 0.59 3.37 弄二碳γ-亞麻烯酸 0 0 10.85 1.57 3.09 硬脂四烯酸 0 0 10.27 1.49 0 二十碳 四烯酸 0 0 4.89 0.71 0 53 200525030 二十石炭 五烯酸 0 全脂質量 12.25 ο 0.39 0 14.48 - 2.68 本實施例之氣相層析分析條件 (氣相層析分析條件） 乂卜所不 管柱：SUpelc〇SP_233〇,熔融石夕石毛細管㈣edsi⑽ Capillary Column), 3〇m x 〇.32mm ID, 0.2// m 溫度：注射：240°C，測定：25(rc，烘箱：18代 /3 分鐘，180°C —220°C(2°C/分鐘）

管柱流量·· 3〇cm/秒，壓力·· 2〇〇kpa，檢出器：fid。 層析圖中之各尖峰藉由標準脂肪酸之甲酯之滯留時間 及 GC-MASS(Hewlett Packard 公司，HP-5973)分析來決定， 再者，從尖峰面積決定各脂肪酸之比例。 在表1中，Control表示對照組，pSPB2368表示以 PSPB2368轉形之菸草，pSPB1519表示以pSI>B1519轉形 之於草。 從表1之結果，雖可確認在導入包含來自絲狀菌之酵 素基因之PSPB1519之菸草（經psPB〗519轉形之菸草）中， 升二碳7-亞麻烯酸蓄積，但未觀察到花生四烯酸蓄積。另 一方面，在導入包含來自地錢之酵素基因之pSpB2368之 菸草（經pSPB2368轉形之菸草）中，確認不僅花生四烯酸蓄 積，二十碳四烯酸及二十碳五烯酸亦蓄積^基於此，認定 在高等植物中，來自地錢之酵素比來自絲狀菌之酵素具有 更優異之機能，可以亞麻酸及α-亞麻烯酸做為基質，合成 以花生四烯酸為首之高度不飽和脂肪酸。 54 20Ό525030

Abbadi專人報告’藉由將三角褐指藻（phaeodactylum tncornutum)之Λ6不飽和化酵素及A5不飽和化酵素以及 小立碗蘚（Physcomitrella patens)之鏈長延長酵素之基 因導入於草及晋通亞麻（Linum usitatissimum)，可以使花生 四烯酸在菸草之種子中蓄積15%，在普通亞麻之種子中蓄 積 l.〇y〇(Amine Abbadi et al· Plant Cell 16，2734-2748, 2004) 〇 在本實施例中，藉由將來自地錢之Λ6不飽和化酵素、 △ 5不飽和化酵素及鏈長延長酵素導入菸草中，使花生四 烯酸在菸草之葉子中蓄積1〇%以上。該結果暗示本實施例 之經PSPB2368轉形之菸草，與上述之報告相比，可更有 效率地合成高度不飽和脂肪酸。 再者在使用對等鞭金藻（Isochrysis galbana)之Λ9 键長延長酵素、小眼蟲（Euglena gracilis)之Λ8不飽和化酵 素、絲狀菌之Λ5不飽和化酵素之3種基因，在阿拉伯芥 (Arabidopsisthaliana)中進行脂質之改變」之報告中，於葉 =中，花生四烯酸為總脂質之66莫耳％，c20以上之脂 貝為 莫耳乂（Baoxiu Qi et al· Nature Biotechnology 22， 739-745, 2GG4)。在該報告中，所謂使用Λ6不飽和化酵素、 △5不飽和化酵素及鏈長延㈣素之路徑，似另外的修 飾路徑製作高度顿和脂肪酸，雖無法單純地比較 ，但使 用來自地彡X之酵素者可蓄積更多的高度不飽和脂肪酸。 在〜、知貝之30%以上成為改變脂肪酸之經pSpB2368 轉形之於早巾，未見到形態的異f。再者，在成熟性上亦 55 200525030 沒有問題，由於產生多個種子，因此認定不同處所之高度 不飽和脂肪酸增加對於植物生育上之影響小。 至目前為止所報告之基因重組植物中之C2〇以上之高 度不飽和脂肪酸之生產為總脂質之約20%，花生四烯酸則 侷限於約6%。但是，如本實施例所示，藉由使用來自地錢 之脂肪酸合成酵素，打破該界限，在植物中可以生產更多 的高度不飽和脂肪酸。 再者，貫施發明之最佳形態乙節中之具體實施態樣或 實施例，畢竟為明確地施行本發明之技術内容者，不應被 狹義地解釋為僅只限定於此等實施例，而係可在本發明之 精祌及以下記載之申請專利範圍内進行各種變更而實施 者。 [產業上利用之可能性] 依知、本發明之基因，係從同一種地錢單離之△5不餘 和化酵素基因、不飽和化酵素基因及Λ6鏈長延長酵素 _基因。因此，使此3種基因在植物内同時表現時，藉由使 來自不同生物種之複數個基因表現，可以發揮所謂「在植 物内有良好機能」之效果。再者，地錢，由於被認為係屬 高等植物之模型系’因而此等基因可以發揮所謂「在植物 内具有比來自植物以外之生物種之基因更良好之機能」之 效果。 又，依照本發明之轉形體，可以發揮所謂「生產花生 四烯酸及二十碳五烯酸(ΕρΑ)等高度不飽和脂肪酸」之效 果。更特定而言，依照本發明之轉形體，可以發揮所謂「以 56 20Ό525030 低成本且有利環境之製程生產芤 (_等高度不飽和脂肪酸」之二十如希酸 酸及二十碳五稀酸(EPAmx發:件到之化生四稀 多目的材料」之效果。再者，能活用做為便宜的 食料時，可以發揮所神「在广用上述轉形植物體做為 土輝所明「在做為花生 之食料上之價值高」之效果。 ^及EPA 3置兩 如上述，本發明之基因及蛋 EPA上有用。又，以可声規太二白貝在生產化生四稀酸及 在制茲產章、冬 表見方式V人本發明基因之轉形體， 食品產業及各種材料產業等中可以生產花生 所以桎為有用。尤其在上述轉形體為植物 玲' 於植物體内之花生四烯酸及£PA之含量增

加’在辰業領域等中非常有用。 【圖式簡單說明J 第圖係·顯示實施例6中使用之MpDES6基因、 P 土因及MpDES基因之各基因之表現g (expression cassette)連結而成之構築體之構築次序之說明圖。 【主要元件符號說明】 57 200525030 序列表 <110> Suntory Limited • <12〇>衍生自地錢之不飽和脂肪酸合成酶基因及其之利用 _ <130> <150> JP 2003-425673 <151> 2003-12-22 <160〉46 _ <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211>2519 <212>DNA <213>地錢 <220>

<221〉CDS # <222> (253)..(1698) <400〉1 atagatccaa tttcataagt cgacgagaaa ggcagaaggc gagaagcggc aggcagcgag 60 cgcgagcgcc agagctcttg ctcccctcgc tcatcgctcg cattgccgca ttttgtgagt 120 gtcggactga tcactcagtc cgtcactgca aacgcgagcg agcgagagtg cgagtgagcg 180 58 200525030 agcgagcgag cgagagccgc ggtgtgtctg tgagatccaa tcctttttct gctttgcgcg 240 ctgtggggcg eg atg gee teg tee acc acc acc gee gtg aag caa tet teg 291

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Val Lys Gin Ser Ser 1 5 10 ggt ggg ctg tgg teg aaa tgg ggc acc ggc age aac ttg age ttc gtg 339

Gly Gly Leu Trp Ser Lys Trp Gly Thr Gly Ser Asn Leu Ser Phe Val 15 20 25 teg ege aag gag cag cag cag cag cag cag cag age tet ccc gag geg 387

Ser Arg Lys Glu Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Ser Ser Pro Glu Ala 30 35 40 45 teg act ccc geg geg cag cag gag aaa tee ate agt aga gaa tee ate 435

Ser Thr Pro Ala Ala Gin Gin Glu Lys Ser lie Ser Arg Glu Ser lie 50 55 60 ccc gag ggc ttc ttg acc gtg gag gag gtg teg aag cac gac aat ccg 483

Pro Glu Gly Phe Leu Thr Val Glu Glu Val Ser Lys His Asp Asn Pro 59 200525030 65 70 75 age gac tgc tgg ate gtc ate aac gac aag gtg tac gac gtg age gca 531

Ser Asp Cys Trp He Val He Asn Asp Lys Val Tyr Asp Val Ser Ala 80 85 90 ttc ggg aag aeg cat ccg ggc ggc cct gtg ate ttc aeg cag gee ggc 579 • Phe Gly Lys Thr His Pro Gly Gly Pro Val lie Phe Thr Gin Ala Gly 95 100 105 ege gac gee aeg gat tet ttc aag gtt ttc cac tee gee aag geg tgg 627

Arg Asp Ala Thr Asp Ser Phe Lys Val Phe His Ser Ala Lys Ala Trp 110 115 120 125 cag ttt etc cag gac ctg tac ate gga gat ctg tac aat gee gag cca • 675

Gin Phe Leu Gin Asp Leu Tyr He Gly Asp Leu Tyr Asn Ala Glu Pro 130 135 140 gtg teg gag ctg gtg aag gat tac ega gac ctg agg aeg geg ttc atg 723

Val Ser Glu Leu Val Lys Asp Tyr Arg Asp Leu Arg Thr Ala Phe Met 145 150 155 cgt tet cag eta ttc aag age agt aaa atg tac tac gtg acc aag tgc 60 200525030 771

Arg Ser Gin Leu Phe Lys Ser Ser Lys Met Tyr Tyr Val Thr Lys Cys 160 165 170 gtc aca aat ttt gca att ctt gcc gcc agt etc gca gtc ate geg tgg 819

Val Thr Asn Phe Ala lie Leu Ala Ala Ser Leu Ala Val He Ala Trp 175 180 185 age cag aeg tat ctg geg gtt ttg tgc tcc agt ttc ctg ttg get etc 867

Ser Gin Thr Tyr Leu Ala Val Leu Cys Ser Ser Phe Leu Leu Ala Leu 190 195 200 205 ttc tgg cag caa tgt gga tgg tta teg cac gat ttt etc cac cac cag 915

Phe Trp Gin Gin Cys Gly Trp Leu Ser His Asp Phe Leu His His Gin 210 215 220 gtg acc gag aac ega teg etc aac aeg tac ttc ggc ggc ctg ttc tgg 963

Val Thr Glu Asn Arg Ser Leu Asn Thr Tyr Phe Gly Gly Leu Phe Trp 225 230 235 ggt aac ttc gcc cag ggc tac age gtg gga tgg tgg aag acc aag cac 1011

Gly Asn Phe Ala Gin Gly Tyr Ser Val Gly Trp Trp Lys Thr Lys His 61 200525030 240 245 250 aat gtg cac cac gcg gcc acg aac gaa tgc gac gac aag tat cag ccc - 1059

Asn Val His His Ala Ala Thr Asn Glu Cys Asp Asp Lys Tyr Gin Pro 255 260 265 ate gat ccc gac ate gac acc gtg ccc ctg etc gcc tgg age aag gaa 1107 _ lie Asp Pro Asp He Asp Thr Val Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu 270 275 280 285 ate ttg gcc acc gtc gac gac caa ttc ttc ega teg ate ate age gtg 1155 lie Leu Ala Thr Val Asp Asp Gin Phe Phe Arg Ser He He Ser Val 290 295 300 cag cac ett ctg ttc ttc ccg etc etc ttc ttg gca aga ttc age tgg ⑩ 1203

Gin His Leu Leu Phe Phe Pro Leu Leu Phe Leu Ala Arg Phe Ser Trp 305 310 315 ctg cat teg agt tgg gcc cac gcc age aac ttc gag atg cct egg tac 1251

Leu His Ser Ser Trp Ala His Ala Ser Asn Phe Glu Met Pro Arg Tyr 320 325 330 atg aga tgg gcg gag aag gcc teg etc etc ggg cac tac ggc gcc tea 62 200525030 1299

Met Arg Trp Ala Glu Lys Ala Ser Leu Leu Gly His Tyr Gly Ala Ser 335 340 345 ate ggc gcc gcc ttc tac att ttg ccc ate ccc cag gcc ate tgc tgg 1347 lie Gly Ala Ala Phe Tyr lie Leu Pro He Pro Gin Ala He Cys Trp 350 355 360 365 etc ttc ttg teg caa ctg ttt tgc ggc get ctg etc age att gtc ttc 1395

Leu Phe Leu Ser Gin Leu Phe Cys Gly Ala Leu Leu Ser He Val Phe 370 375 380 gtg ate age cac aat ggc atg gat gtg tac aac gac ccc egg gac ttc 1443

Val lie Ser His Asn Gly Met Asp Val Tyr Asn Asp Pro Arg Asp Phe 385 390 395 gtg aeg gcc caa gtc acc teg acc aga aac ate gaa ggc aac ttc ttc 1491

Val Thr Ala Gin Val Thr Ser Thr Arg Asn lie Glu Gly Asn Phe Phe 400 405 410 aac gac tgg ttc acc gga ggc ctg aac agg cag att gag cac cat ctg 1539

Asn Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Arg Gin lie Glu His His Leu 200525030 415 420 425 ttt ccg tct ctt ccg agg cac aac etc gee aag gtc geg cca cac gtc 1587 • Phe Pro Ser Leu Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Val Ala Pro His Val 430 435 440 445 aag geg etc tgc gee aag cac ggt ttg cat tac gaa gaa ttg agt ctg 1635 φ Lys Ala Leu Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu Glu Leu Ser Leu 450 455 460 ggc aeg gga gtc tgt cgt gtc ttc aat egg eta gta gag gta gca tac 1683

Gly Thr Gly Val Cys Arg Val Phe Asn Arg Leu Val Glu Val Ala Tyr 465 470 475 get geg aaa gta tag ategaegaga gtttcccacc aacacagtta gaacaaggga • 1738

Ala Ala Lys Val 480 atagtaegag agaaggagac agcaacctgg actttttgtt cctgatgttg catactttct 1798 egaatataeg tctccacgcc ttcaagtttc agcttcaact gattgtette agtaaccatc 1858 gcttgctcca actgggcgac ctgcagaatt gaagatcagt tttactgagt ttgtaccgag 200525030 1918 agtttcccaa attttgttgt aggctgatga cccaatccta gcatacactt taggaataag 1978 cagtctcaac ataattaggt ccatcattca gcaatttcga tacagcgcct gggattcgac 2038 gagtttacac gatgagtatg gcttgtaact ggccttctca aggtagcctt ggatctcccc 2098 gggcctcttg ccatcccatt cacccaatcg agattctgca gtctccaacc ttttctggaa 2158 gttctcaatc tgtaacctct gttgtagaga tagcatacgc cacaagacaa ggtctttgtg 2218 aacacagtcg tctaacaaac agcaagttgt gtggattggc atctaaataa ccgcctctgg 2278 tcaagtaaca gcaggtgttc cgcagtttcc aggaacatac tttgtttctg tcacagccag 2338 gcggtgaata gtaaagccaa ttcaacacat acgggagaag atgggtcgat atttgtattt 2398 ggcagggtgt ccagatttca cccatcagtc tctcacttgc ttgtatgtcc ctgacgtgct 2458 tcaaaatttt gcgcggggaa tcatcaatat acttaccatt tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa 2518 200525030 2519 <210>2 <211>481 <212>蛋白質 <213>地錢 <400〉2

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Val Lys Gin Ser Ser Gly Gly Leu # 1 5 10 15

Trp Ser Lys Trp Gly Thr Gly Ser Asn Leu Ser Phe Val Ser Arg Lys 20 25 30

Glu Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Ser Ser Pro Glu Ala Ser Thr Pro 35 40 45

Ala Ala Gin Gin Glu Lys Ser He Ser Arg Glu Ser He Pro Glu Gly 50 55 60 Φ Phe Leu Thr Val Glu Glu Val Ser Lys His Asp Asn Pro Ser Asp Cys 65 70 75 80

Trp lie Val lie Asn Asp Lys Val Tyr Asp Val Ser Ala Phe Gly Lys 85 90 95

Thr His Pro Gly Gly Pro Val He Phe Thr Gin Ala Gly Arg Asp Ala 100 105 110

Thr Asp Ser Phe Lys Val Phe His Ser Ala Lys Ala Trp Gin Phe Leu 115 120 125 200525030

Gin Asp Leu Tyr lie Gly Asp Leu Tyr Asn Ala Glu Pro Val Ser Glu 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Arg Asp Leu Arg Thr Ala Phe Met Arg Ser Gin 145 150 155 160

Leu Phe Lys Ser Ser Lys Met Tyr Tyr Val Thr Lys Cys Val Thr Asn 165 170 175

Phe Ala lie Leu Ala Ala Ser Leu Ala Val lie Ala Trp Ser Gin Thr 180 185 190

Tyr Leu Ala Val Leu Cys Ser Ser Phe Leu Leu Ala Leu Phe Trp Gin 195 200 205

Gin Cys Gly Trp Leu Ser His Asp Phe Leu His His Gin Val Thr Glu 210 215 220

Asn Arg Ser Leu Asn Thr Tyr Phe Gly Gly Leu Phe Trp Gly Asn Phe 225 230 235 240

Ala Gin Gly Tyr Ser Val Gly Trp Trp Lys Thr Lys His Asn Val His 245 250 255

His Ala Ala Thr Asn Glu Cys Asp Asp Lys Tyr Gin Pro lie Asp Pro 260 265 270

Asp lie Asp Thr Val Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu lie Leu Ala 275 280 285

Thr Val Asp Asp Gin Phe Phe Arg Ser lie lie Ser Val Gin His Leu 290 295 300 67 200525030

Leu Phe Phe Pro Leu Leu Phe Leu Ala Arg Phe Ser Trp Leu His Ser 305 310 315 320

Ser Trp Ala His Ala Ser Asn Phe Glu Met Pro Arg Tyr Met Arg Trp - 325 330 335

Ala Glu Lys Ala Ser Leu Leu Gly His Tyr Gly Ala Ser He Gly Ala 340 345 350

Ala Phe Tyr lie Leu Pro He Pro Gin Ala He Cys Trp Leu Phe Leu # 355 360 365

Ser Gin Leu Phe Cys Gly Ala Leu Leu Ser He Val Phe Val He Ser 370 375 380

His Asn Gly Met Asp Val Tyr Asn Asp Pro Arg Asp Phe Val Thr Ala 385 390 395 400

Gin Val Thr Ser Thr Arg Asn lie Glu Gly Asn Phe Phe Asn Asp Trp 405 410 415 ® Phe Thr Gly Gly Leu Asn Arg Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Ser 420 425 430

Leu Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Val Ala Pro His Val Lys Ala Leu 435 440 445

Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu Glu Leu Ser Leu Gly Thr Gly 450 455 460 * Val Cys Arg Val Phe Asn Arg Leu Val Glu Val Ala Tyr Ala Ala Lys 465 470 475 480 68 200525030

Val <210>3 <211〉1577 · <212> DNA . <213>地錢 <220〉

<221〉CDS <222〉（194)..(1066) φ <400> 3 ctcaacgctc tctctcgccc gccctctgtc ttccgctgcg ccttcttctc ggcgcctctt 60 tctgtcgaga ggagcggcag ctgcagctct cgagagaggg gagcaggacg agagcgaggg 120 cgaatccgcc gagagtcgat cgggattggg tagaaggagg agaaggagga · gaagaggagg 180 aggaggagca gcg atg gag gcg tac gag atg gtg gat agt ttt gtg teg 229

Met Glu Ala Tyr Glu Met Val Asp Ser Phe Val Ser 1 5 10 - 69 200525030 aag acg gtt ttc gaa acg ctg cag aga ctg agg ggc gga gtc gtg ttg 277

Lys Thr Val Phe Glu Thr Leu Gin Arg Leu Arg Gly Gly Val Val Leu - 15 20 25 acg gaa tct gcg ate acc aaa ggt ttg cca tgc gtc gat age ccg acg 325

Thr Glu Ser Ala He Thr Lys Gly Leu Pro Cys Val Asp Ser Pro Thr • 30 35 40 ccg ate gtt ett ggg ttg teg tee tac ttg aca ttc gtg ttt etc ggg 373

Pro He Val Leu Gly Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Phe Val Phe Leu Gly 45 50 55 60 etc att gtc ate aag age ctg gat ett aag ccc ege tee aag gag ccc 421 • Leu lie Val lie Lys Ser Leu Asp Leu Lys Pro Arg Ser Lys Glu Pro 65 70 75 gee att ttg aac ctg ttt gtg ate ttc cac aac ttc gtc tgc ttc gca 469

Ala lie Leu Asn Leu Phe Val He Phe His Asn Phe Val Cys Phe Ala 80 85 90 - etc agt ctg tac atg tgc gtg gga att gtc cgt caa get ate etc aac 70 517 200525030

Leu Ser Leu Tyr Met Cys Val Gly lie Val Arg Gin Ala lie Leu Asn 95 100 105 agg tac tct ctg tgg ggc aat gcg tac aat ccc aaa gaa gtt caa atg " 565 ·

Arg Tyr Ser Leu Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys Glu Val Gin Met 110 115 120 ggc cac ctg etc tac att ttc tac atg tea aag tac ate gag ttt atg 613 ·

Gly His Leu Leu Tyr lie Phe Tyr Met Ser Lys Tyr lie Glu Phe Met 125 130 135 140 gac aeg gtc att atg att ttg aag ege aac aeg ege cag ate act gtg 661

Asp Thr Val lie Met lie Leu Lys Arg Asn Thr Arg Gin lie Thr Val 145 150 155 ttg cat gtg tac cac cac gca tcc ate tcc ttc ate tgg tgg ate ate 0 709

Leu His Val Tyr His His Ala Ser lie Ser Phe lie Trp Trp lie lie 160 165 170 gcc tac cat get cct ggc ggt gaa get tat ttc tct gcc gca ttg aac 757 ·

Ala Tyr His Ala Pro Gly Gly Glu Ala Tyr Phe Ser Ala Ala Leu Asn 175 180 185 200525030 tcc gga gta cat gtg etc atg tac etc tac tac ett ttg gca gca act 805

Ser Gly Val His Val Leu Met Tyr Leu Tyr Tyr Leu Leu Ala Ala Thr 190 195 200 ctg gga aag aac gag aaa get ege ege aag tac eta tgg tgg gga aaa 853

Leu Gly Lys Asn Glu Lys Ala Arg Arg Lys Tyr Leu Trp Trp Gly Lys φ 205 210 215 220 tac ttg aca cag ctg cag atg ttc cag ttt gtc ett aac atg att cag 901

Tyr Leu Thr Gin Leu Gin Met Phe Gin Phe Val Leu Asn Met lie Gin 225 230 235 get tac tac gat att aag aac aac teg cct tac cca caa ttt ttg ate 949 φ Ala Tyr Tyr Asp He Lys Asn Asn Ser Pro Tyr Pro Gin Phe Leu lie 240 245 250 cag att ttg ttc tac tac atg ate teg ett tta geg eta ttt gga aac 997

Gin lie Leu Phe Tyr Tyr Met lie Ser Leu Leu Ala Leu Phe Gly Asn 255 260 265 ttt tac gtt cac aaa tac gta tea geg ccc gca aaa cct geg aag ate 1045 72 200525030

Phe Tyr Val His Lys Tyr Val Ser Ala Pro Ala Lys Pro Ala Lys lie 270 275 280 aag age aaa aag gca gaa taa gacaccaccc tagtgacaag aagattttac 1096

Lys Ser Lys Lys Ala Glu 285 290 actaaactgt agttttagca cccatcgttg acacgaatac attctggttc tgcctgtctt 1156 ggaagagteg aagcattcag gagctctccc gttccatcga tcaaactcgg aacgaagtgc 1216 accttttagc tgegatgaga gtctttactt cctgagccgt cgttcttgat gtggtctgta 1276 gctcagccat acgtgtagca tagctggaac atctggcttt tcaggaaagt cggcaaggca 1336 agaattegae ccttgaacta gacaaggttc tgctgattca gcaaccatta gtgagtcact 1396 ggttaacaaa atcacagttt tgggccctta gttagtgaca accaacccta acactttgat 1456 acacgagtta tegttegega gtggaagtgt aaaaatgtgc tttcccaatc atettgagtt 1516 ggttcctttt gaagtaaagg aaaattctat gattgttgag tccaaaaaaa aaaaaaaaaa 1576 200525030 a 1577 -<210>4 .<211>290 <212>蛋白質 <213>地錢 <400〉 4 _ Met Glu Ala Tyr Glu Met Val Asp Ser Phe Val Ser Lys Thr Val Phe 15 10 15

Glu Thr Leu Gin Arg Leu Arg Gly Gly Val Val Leu Thr Glu Ser Ala 20 25 30 lie Thr Lys Gly Leu Pro Cys Val Asp Ser Pro Thr Pro lie Val Leu 35 40 45

Gly Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Phe Val Phe Leu Gly Leu He Val lie • 50 55 60

Lys Ser Leu Asp Leu Lys Pro Arg Ser Lys Glu Pro Ala lie Leu Asn 65 70 75 80

Leu Phe Val lie Phe His Asn Phe Val Cys Phe Ala Leu Ser Leu Tyr 85 90 95

Met Cys Val Gly lie Val Arg Gin Ala lie Leu Asn Arg Tyr Ser Leu 100 105 110 74 200525030

Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys Glu Val Gin Met Gly His Leu Leu 115 120 125

Tyr He Phe Tyr Met Ser Lys Tyr lie Glu Phe Met Asp Thr Val lie 130 135 140

Met lie Leu Lys Arg Asn Thr Arg Gin He Thr Val Leu His Val Tyr 145 150 155 160

His His Ala Ser lie Ser Phe He Trp Trp lie lie Ala Tyr His Ala 165 170 175

Pro Gly Gly Glu Ala Tyr Phe Ser Ala Ala Leu Asn Ser Gly Val His 180 185 190

Val Leu Met Tyr Leu Tyr Tyr Leu Leu Ala Ala Thr Leu Gly Lys Asn 195 200 205

Glu Lys Ala Arg Arg Lys Tyr Leu Trp Trp Gly Lys Tyr Leu Thr Gin 210 215 220

Leu Gin Met Phe Gin Phe Val Leu Asn Met He Gin Ala Tyr Tyr Asp 225 230 235 240 lie Lys Asn Asn Ser Pro Tyr Pro Gin Phe Leu lie Gin lie Leu Phe 245 250 255

Tyr Tyr Met lie Ser Leu Leu Ala Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Val His 260 265 270

Lys Tyr Val Ser Ala Pro Ala Lys Pro Ala Lys lie Lys Ser Lys Lys 275 280 285 75 200525030

Ala Glu 290 • <210>5 .<211> 2307 <212〉DNA <213〉地錢 <220〉

φ <221〉CDS <222> (375)..(1829) <400> 5 tcacattgct ggtcgtcgga gggaggtgca caatctgggg ggctgtcatc aatgcgacgg 60 tgtttcgaag agatcgctgc gagtggcgct gagtttcttg ccgctttcta cctgagctga 120 # tgcctgctgc tgctgcctag agctgcttgg tgctgcttgg ggctgctata agagcgcgtc 180 gacagcgagt gtctctcgcg gtcctcattc gtggggtgct gtcgttccag tttagagccc 240 gctggacgta cagccggtgc tggaaattga ttttgtgaaa agcgagccta cctctatcca 300 tcatcgtcgc ccgtggtggc agatcttccg gattcctcat gcgcggatcg tggtcgcttt 360 76 200525030 gaaggtcgac agtt atg ccg cca cac gcc cct gac tcc aca ggt ctt ggg 410

Met Pro Pro His Ala Pro Asp Ser Thr Gly Leu Gly 1 5 10 ccc gaa gtt ttc cgc ctg cct gat gac gcg ate ccg gcc cag gat ege 458

Pro Glu Val Phe Arg Leu Pro Asp Asp Ala lie Pro Ala Gin Asp Arg 15 20 25 aga tet aca cag aag aaa tac teg ctt tea gac gtc age aag cac aac 506

Arg Ser Thr Gin Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Asp Val Ser Lys His Asn 30 35 40 act ccg aat gat tgc tgg etc gta att tgg ggg aag gtg tac gat gtt 554

Thr Pro Asn Asp Cys Trp Leu Val lie Trp Gly Lys Val Tyr Asp Val 45 50 55 60 act teg tgg gtt aag gtc cat cca ggt gga agt etc ate ttt gtg aag 602

Thr Ser Trp Val Lys Val His Pro Gly Gly Ser Leu lie Phe Val Lys 65 70 75 gcg gga cag gat tea aca caa etc ttt gat tet tat cac ccc etc tat 77 650 200525030

Ala Gly Gin Asp Ser Thr Gin Leu Phe Asp Ser Tyr His Pro Leu Tyr 80 85 90 • gtc aga aag eta ett gca cag ttc tgc att ggt gaa etc caa aeg agt • 698

Val Arg Lys Leu Leu Ala Gin Phe Cys He Gly Glu Leu Gin Thr Ser 95 100 105 geg gga gat gag aag ttc aag tet tea aeg ttg gag tat get ggt gaa ⑩746

Ala Gly Asp Glu Lys Phe Lys Ser Ser Thr Leu Glu Tyr Ala Gly Glu 110 115 120 gaa cat gaa gta ttt tac cac act etc aag cag ege gtg gaa aeg tac 794

Glu His Glu Val Phe Tyr His Thr Leu Lys Gin Arg Val Glu Thr Tyr 125 130 135 140 ® ttc ege aag cag aag ata aat cct ega tac cat ccg caa atg ett gtg 842

Phe Arg Lys Gin Lys lie Asn Pro Arg Tyr His Pro Gin Met Leu Val 145 150 155 aag tea gee gtg ate att gga acc ett ett etc tgt tac tat ttt ggc

Lys Ser Ala Val lie lie Gly Thr Leu Leu Leu Cys Tyr Tyr Phe Gly 160 165 170 ' 890 78 200525030 ttc ttc tgg tct caa aat gta etc etc teg atg ttt ctg gca age ate 938

Phe Phe Trp Ser Gin Asn Val Leu Leu Ser Met Phe Leu Ala Ser lie 175 180 185 atg ggg ttc tgc act geg gag gtg ggc atg tee ate atg cac gat ggt 986

Met Gly Phe Cys Thr Ala Glu Val Gly Met Ser lie Met His Asp Gly 190 195 200 aac cac gga teg tac aca caa tct acc ttg ett ggt tac gtc atg ggc 1034

Asn His Gly Ser Tyr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Gly Tyr Val Met Gly 205 210 215 220 gcc act ett gat ctg gtg gga get age agt ttc atg tgg agg cag cag 1082

Ala Thr Leu Asp Leu Val Gly Ala Ser Ser Phe Met Trp Arg Gin Gin 225 230 235 cat gtg gcc ggg cac cac teg ttc acc aac ate gac cat tac gat cca 1130

His Val Ala Gly His His Ser Phe Thr Asn lie Asp His Tyr Asp Pro 240 245 250 gac att cgt gtg aag gat cct gat tta ega egg gtt act tct caa caa 1178 200525030

Asp lie Arg Val Lys Asp Pro Asp Leu Arg Arg Val Thr Ser Gin Gin 255 260 265 Λ ccc cga aga tgg ttt cac gag tat cag cat ate tac tta gga gta etc -1226

Pro Arg Arg Trp Phe His Glu Tyr Gin His He Tyr Leu Gly Val Leu 270 275 280 tat ggc gtt ett gcc tta aaa agt gtg ttg att gat gat ttc age gee • 1274

Tyr Gly Val Leu Ala Leu Lys Ser Val Leu He Asp Asp Phe Ser Ala 285 290 295 300 ttc ttc agt ggt get ate ggc cca gta aag ata get caa atg aca cca 1322

Phe Phe Ser Gly Ala He Gly Pro Val Lys He Ala Gin Met Thr Pro 305 310 315 # etc gag atg ggc gtc ttc tgg gga ggg aag gtt gtg tac gca ctg tac 1370

Leu Glu Met Gly Val Phe Trp Gly Gly Lys Val Val Tyr Ala Leu Tyr 320 325 330 atg ttt ttg etc cct atg atg tat ggt caa tac aac att ett act ttc 1418

Met Phe Leu Leu Pro Met Met Tyr Gly Gin Tyr Asn lie Leu Thr Phe 335 340 345 80 200525030 att ggt etc tac att etc tea cag tta gtt gca ggg tgg act ett gee 1466 lie Gly Leu Tyr lie Leu Ser Gin Leu Val Ala Gly Trp Thr Leu Ala 350 355 360 etc ttc ttt caa gta gca cac gtt gtc gac gat gca gta ttt ccc gtt 1514

Leu Phe Phe Gin Val Ala His Val Val Asp Asp Ala Val Phe Pro Val 365 370 375 380 geg gaa aca gat ggt gga aaa gca aag att cct tet ggt tgg gca gaa 1562

Ala Glu Thr Asp Gly Gly Lys Ala Lys lie Pro Ser Gly Trp Ala Glu 385 390 395 atg cag gtc aga acc act acc aat ttc age tea ega tea atg ttc tgg 1610

Met Gin Val Arg Thr Thr Thr Asn Phe Ser Ser Arg Ser Met Phe Trp 400 405 410 aca cat att agt ggc ggt ctg aac cat cag ate gag cac cat ett ttc 1658

Thr His lie Ser Gly Gly Leu Asn His Gin lie Glu His His Leu Phe 415 420 425 ccg ggt gtc tgt cat gtt cac tac cca age ata cag cca ate gtg aag 1706 200525030

Pro Gly Val Cys His Val His Tyr Pro Ser lie Gin Pro lie Val Lys 430 435 440 • get acc tgt gac gag ttc aac gtg cct tat act tcc tac ccc act ttc ， 1754

Ala Thr Cys Asp Glu Phe Asn Val Pro Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr Phe 445 450 455 460 tgg geg gcc ett agg gca cat ttt caa cat ctg aaa aac gtc gga eta • 1802

Trp Ala Ala Leu Arg Ala His Phe Gin His Leu Lys Asn Val Gly Leu 465 470 475 caa gat gga eta ega ctg gat ggc tga actgtgacag catgctttgg 1849

Gin Asp Gly Leu Arg Leu Asp Gly 480 485 Φ gcctgcactt teagattteg gategaaggt gcgggcgatg gaaataatca gataagagtt 1909 gtaagtaacg ttcaggagga gageagaaeg gattgatgag tgtccatttg tgaggcttcc 1969 acctttcagg aacagaagtt gattegaatg cgaaacctcc aatgageatt tcacagccgt • 2029 cttctccttg gccatcatgt gttcctccta gggagetteg gtttttggaa gttagteage 2089 82 200525030 ttactttcga agatcgttca acgctcaagg ctagattttg tcgacactat ttagttaggt 2149 ccgatagata ggtgataaga ttccggtgcc ctcacacatg tttcatcagt tgcgatgtaa 2209 ttccagtaat ccacgtatgt ggctccagtg tctgctgaaa tcagcacagg cagctatatc 2269 atgctccttg atctctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2307 <210 6 <211>484 <212>蛋白質 <213>地錢 <400> 6

Met Pro Pro His Ala Pro Asp Ser Thr Gly Leu Gly Pro Glu Val Phe 15 10 15

Arg Leu Pro Asp Asp Ala lie Pro Ala Gin Asp Arg Arg Ser Thr Gin 20 25 30

Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Asp Val Ser Lys His Asn Thr Pro Asn Asp 35 40 45

Cys Trp Leu Val lie Trp Gly Lys Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Val 50 55 60 200525030

Lys Val His Pro Gly Gly Ser Leu lie Phe Val Lys Ala Gly Gin Asp 65 70 75 80

Ser Thr Gin Leu Phe Asp Ser Tyr His Pro Leu Tyr Val Arg Lys Leu 85 90 95

Leu Ala Gin Phe Cys He Gly Glu Leu Gin Thr Ser Ala Gly Asp Glu 100 105 110

Lys Phe Lys Ser Ser Thr Leu Glu Tyr Ala Gly Glu Glu His Glu Val # 115 120 125

Phe Tyr His Thr Leu Lys Gin Arg Val Glu Thr Tyr Phe Arg Lys Gin 130 135 140

Lys lie Asn Pro Arg Tyr His Pro Gin Met Leu Val Lys Ser Ala Val 145 150 155 160 lie lie Gly Thr Leu Leu Leu Cys Tyr Tyr Phe Gly Phe Phe Trp Ser 165 170 175 β Gin Asn Val Leu Leu Ser Met Phe Leu Ala Ser He Met Gly Phe Cys 180 185 190

Thr Ala Glu Val Gly Met Ser lie Met His Asp Gly Asn His Gly Ser 195 200 205

Tyr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Gly Tyr Val Met Gly Ala Thr Leu Asp w 210 215 220

Leu Val Gly Ala Ser Ser Phe Met Trp Arg Gin Gin His Val Ala Gly 225 230 235 240 84 200525030

His His Ser Phe Thr Asn lie Asp His Tyr Asp Pro Asp He Arg Val 245 250 255

Lys Asp Pro Asp Leu Arg Arg Val Thr Ser Gin Gin Pro Arg Arg Trp 260 265 270

Phe His Glu Tyr Gin His lie Tyr Leu Gly Val Leu Tyr Gly Val Leu 275 280 285

Ala Leu Lys Ser Val Leu lie Asp Asp Phe Ser Ala Phe Phe Ser Gly 290 295 300

Ala He Gly Pro Val Lys lie Ala Gin Met Thr Pro Leu Glu Met Gly 305 310 315 320

Val Phe Trp Gly Gly Lys Val Val Tyr Ala Leu Tyr Met Phe Leu Leu 325 330 335

Pro Met Met Tyr Gly Gin Tyr Asn lie Leu Thr Phe lie Gly Leu Tyr 340 345 350 lie Leu Ser Gin Leu Val Ala Gly Trp Thr Leu Ala Leu Phe Phe Gin 355 360 365

Val Ala His Val Val Asp Asp Ala Val Phe Pro Val Ala Glu Thr Asp 370 375 380

Gly Gly Lys Ala Lys lie Pro Ser Gly Trp Ala Glu Met Gin Val Arg 385 390 395 400

Thr Thr Thr Asn Phe Ser Ser Arg Ser Met Phe Trp Thr His lie Ser 405 410 415 200525030

Gly Gly Leu Asn His Gin He Glu His His Leu Phe Pro Gly Val Cys 420 425 430

His Val His Tyr Pro Ser lie Gin Pro lie Val Lys Ala Thr Cys Asp 435 440 445

Glu Phe Asn Val Pro Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr Phe Trp Ala Ala Leu 450 455 460

Arg Ala His Phe Gin His Leu Lys Asn Val Gly Leu Gin Asp Gly Leu • 465 470 475 480

Arg Leu Asp Gly <210>7 <211>20 <212> DNA <213>人造序列 <220> 鲁<223>人造序列之說明：引子 <220> <221>n <222〉 （12) <400〉 7 tggtggaarg anaarcayaa 20 <210>8 86 200525030 <211>21

<212>DNA <213〉人造序列 · <220> <223>人造序列之說明：引子 <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (4) · <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (7) <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 · <222〉（10) <223> i <220〉 <221>經修飾之鹼基 <222>(13) " <223> i <400> 8 87 200525030 rttnamccn ccngtraacc a 21 • <210〉9 - <211>22 <212>DNA <213>人造序列 <220 • <223>人造序列之說明：引子 <400〉9 aagttgcctt cgatgtttct gg 22 <210> 10 <211>22 <212> DNA _ <213〉人造序列e <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 10 gctcgcctgg agcaaggaaa tc ^ 22 <210> 11 <211〉20 88 200525030 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明··引子 <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (3) <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222>(18) <223> i <400〉 11 gtngarttya tggayacngt 20 <210> 12 <211>20 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 89 <220> 200525030 <221>經修飾之鹼基 <222> (3) -<223> i . <220> <221>經修飾之鹼基 <222>(12) <223> i φ <400> 12 cknccccara anarrtaytt 20 <210> 13 <211>22 <212〉DNA <213>人造序列 • <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉 13 gcgagctttc tcgttctttc cc 22 <210> 14 -<211>22

<212〉DNA 200525030 <213>人造序列 <220> <223〉人造序列之說明：引子 <400〉14 · tatgattttg aagcgcaaca eg 22 <210> 15 <211>22 # <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (6) · <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (9) <223> i -<220> <221>經修飾之鹼基 91 200525030 <222>(14) <223〉i • <400> 15 - athrangma artntaygay gt 22

<210> 16 <211>23 φ <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：弓丨子 <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (3) φ <223>i <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (6) <223> i -<220〉 -<221〉經修飾之鹼基 <222> (9) 200525030 <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222>(18) <223> i <400〉16

ggnaynkwnt sdatrtcngg rtc 23 <210> 17 <211>22 <212>DNA <213>人造序列 <220>

<223>人造序列之說明：引子 <400> 17 gtgtgtacga tccgtggtta cc 22 <210> 18 <211>22 <212> DNA <213〉人造序列 <220> 93 200525030 <223>人造序列之說明··引子 <400〉18 aaggcgggac aggattcaac ac - 22

<210> 19 <211>30 <212〉DNA • <213> Artificial Sequence <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉 19 ggaattcgcg atggcctcgt ccaccaccac 30 <210> 20 • <211>29 <212〉DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明··引子 <400> 20 ggaattctac tttcgcagcg tatgctacc 29 94 200525030 <210>21 <211>29 <212> DNA * <213>人造序列 · <220> <223〉人造序列之說明··引子 <400> 21 ggaattcgcg atggaggcgt acgagatgg · 29 <210 22 <211>29 <212〉DNA <213>人造序列 <220> <223〉人造序列之說明：引子 _ <400> 22 ggaattcttc tgcctttttg ctcttgatc 29 <210> 23 <211>30 · <212> DNA <213>人造序列 95 200525030 <220> <223>人造序列之說明：引子 . <400> 23 gttgaattcg acagttatgc cgccacacgc 30 <210> 24 φ <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 24 gttgaattca ggcccaaagc atgctgtcac • 30 <210> 25 <211>28 <212>DNA <213>人造序列 -<220〉 • <223>人造序列之說明：引子 <400> 25 96 200525030 cgggatcctc tcctggcgca ccatcgtc 28 <210> 26 · <211〉28 . <212> DNA <213>人造序列 <220> <223〉人造序列之說明：引子 _ <400> 26 ggggtaccaa cgcgctttcc caccaacg 28

<210> 27 <211>29 <212〉DNA <213〉人造序列 _ <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 27 gctctagagc gatggcctcg tccaccacc <210〉 28 97 29 * 200525030 <211>29 <212> DNA - <213>人造序列e . <220〉 <223>人造序列之說明：引子 <400> 28 gctctagact atactttcgc agcgtatgc φ 29 <210> 29 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 • <400〉29 gctctagagc gatggaggcg tacgagatgg 30

<210> 30 <211>27 ‘ <212〉DNA -<213>人造序列 <220> 98 200525030 <223>人造序列之說明··引子 <400> 30 gctctagatt attctgcctt tttgctc - 27 * <210 31 <211>29

<212>DNA <213>人造序列 φ <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉31 gctctagaga cagttatgcc gccacacgc 29 <210> 32 <211>29 ·

<212>DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 32 ^ gctctagaag gcccaaagca tgctgtcac 29 99 200525030 <210>33 <211〉18 <212> DNA ▲ <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明··引子 <400> 33 • caggaaacag ctatgacc 18 <210> 34 <211>30 <212> DNA <213>人造序列 <220> 馨<223>人造序列之說明··引子 <400> 34 aaactgcaga ttcccgatct agtaacatag 30 <210〉35 -<211>30 <212〉DNA <213〉人造序列 200525030 <220〉 <223>人造序列之說明：引子 <400〉 35 ccggaattcg catgcctgca ggtccccaga 30 <210〉36 <211> 18 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 36 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 37 <211>7 <212>蛋白質 <213>未知生物 <220> <221>Xaa <222> (4) <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 200525030 <400> 37

Trp Trp Lys Xaa Lys His Asn . 1 5 <210>38 <211>7 <212>蛋白質 <213>未知生物 _ <220〉 <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <400> 38

Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn 1 5 <210> 39 <211>7 _ <212>蛋白質 <213>未知生物 <220> <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <400> 39

Val Glu Phe Met Asp Thr Val 1 5 <210> 40 102 200525030 <211>7 <212>蛋白質 <213>未知生物 <220> <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <400 40

Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg 1 5 <210>41 <211〉8 <212>蛋白質 <213>未知生物 <220> <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <220> <221> Xaa <222> (2) <223> Glu or Asn <220> <221>Xaa <222> (3) <223〉Gly or Asp 103 200525030 <400〉41

He Xaa Xaa Lys Val Tyr Asp Val 1 5 <210> 42 <211>8 <212>蛋白質 <213>未知生物 I <220> <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <220> <221> Xaa <222> (5) <223> Gin or Asp <220> _ <221〉Xaa <222> (6) <223> Tyr or Thr <220> <221>Xaa <222> (7) <223> Met or Val <400> 42 104 200525030

Asp Pro Asp lie Xaa Xaa Xaa Pro 1 5 <210> 43 <211〉26 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列之說明：引子XbaMpELOf <400> 43 agtctctaga gcgatggagg cgtacg 26 <210> 44 <211>26 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子SacMpELOr <400〉44 cagtgagctc ggtgtcttat tctgcc 26 <210> 45 <211>29 200525030 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223〉人造序列之說明：引子XbaMpD5f <400> 45 agcttctaga gccatgccgc cacacgccc 29 <210> 46 <211>26 <212〉DNA <213>人造序列 <220> <223〉人造序列之說明：引子SacMpD5r <400〉46 cagtgagctc tcagccatcc agtcgt 26

Claims (1)

1. 2Θ0525030 十、申請專利範圍： 1· 一種來自地錢目生物之基因，其在嚴苛條件下會與序列 編號1所示之鹼基序列構成之DNA之全部或一部分、 或和該DNA互補之驗基序列構成之DNA之全部或一部 分雜交，且編瑪具有△ 6脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 2· —種編碼具有Δ6脂肪酸不餘和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基因·· (a) 具有序列編號1所示之鹼基序列之基因；或 (b) 在嚴苛條件下可與序列編號1所示之驗基序列構成之 DNA、或和該DNA互補之驗基序列構成之DNA雜交 之基因。 3· —種編碼具有Δ6脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基因： (a) 具有序列編號1所示鹼基序列中之第253至1698號之 鹼基序列之基因； (b) 在嚴苛條件下可與序列編號1所示驗基序列中之第253 至1698號之鹼基序列構成之DNA、或和該DNA互補 之驗基序列構成之DNA雜交之基因。 4· 一種編碼具有Λ6脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記載之基因： (a) 編碼序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質之基 因； (b) 編碼序列編號2所示之胺基酸序列之1個或以上之胺基 酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構 107 200525030 成之蛋白質之基因。 5· —種來自地錢目生物之基因，其在嚴苛條件下會與序列 • 編號3所示之鹼基序列構成之DNA之全部或一部分、 或和該DNA互補之驗基序列構成tDNA之全部或一部 为雜父’且編碼具有△ 6脂肪酸鏈長延長活性之蛋白質。 6· —種編碼具有Λ6脂肪酸鏈長延長活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或中記載之基因·· (a)具有序列編號3所示之鹼基序列之基因；或 籲（b)在嚴苛條件下可與序列編號3所示之鹼基序列構成之 DNA、或和該DNA互補之鹼基序列構成之DNA雜交 之基因。 7. —種編碼具有Λ6脂肪酸鏈長延長活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)記載之基因： (a) 具有序列編號1所示鹼基序列中之第194至1〇66號之 驗基序列之基因； (b) 在嚴苛條件下可與序列編號1所示鹼基序列中之第194 修 至1066號之驗基序列構成之DNA、或和該DNA互補 之驗基序列構成之DNA雜交之基因。 8· —種編碼具有脂肪酸鏈長延長活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或（b)中記栽之基因· (a)編碼序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質之某 • 因； -(b)編碼序列編號4所不之胺基酸序列之1個或以上之胺其 酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列二 108 2Θ0525030 成之蛋白質之基因。 9· 一種來自地錢目生物之基因，其在嚴苛條件下會與序列 編號5所示之鹼基序列構成之DNA之全部或一部分、 · 或和该DNA互補之鹼基序列構成之DNA之全部或一部 刀雜父’且編碼具有△ 5脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 10. —種編碼具有Λ5脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記載之基因： (a) 具有序列編號5所示之鹼基序列之基因；或 (b) 在嚴苛條件下可與序列編號5所示之鹼基序列構成之 _ DNA、或和該DNA互補之鹼基序列構成之DNA雜交 之基因。 11· 一種編碼具有脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（3)或（1))中記載之基因： (a) 具有序列編號5所示驗基序列中之第3乃至1幻9號之 驗基序列之基因； (b) 在厫苛條件下可與序列編號5所示嶮基序列中之第3乃 至1829號之驗基序列構成之DNA、或和該·Α互補 · 之驗基序列構成之DNA雜交之基因。 12· —種編碼具有脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生 物之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記載之基因： (a) 編碼序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋白質之基 因； 、土 (b) 編碼序列編號6所示之胺基酸序列之1個戍以上之胺芙 酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構 109 200525030 成之蛋白質之基因。 Π. —種蛋白質，係由請求項〗至12中任何一項之基因所 編碼。 14· 一種如下列(a)或⑻之蛋白質： ⑷序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質； (b)2序職號2所*之胺基酸序财1個或以上之胺基酸 、工取代、冊彳除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構成， 且/、有Λ6骑肪酸不飽和化活性之蛋白質。 15· 一種如下列(a)或(b)之蛋白f : ⑷序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質； 二二錢4所示之胺基酸序列中1個或以上之胺基酸 I且古^除、插人及/或附加所成之胺基酸序列構成， 有A6腊肪酸鏈長延長活性之蛋白質。 16.—種如下列（a)或(b)之蛋白質： ⑷序列錢6所示之胺基酸相構成之蛋 (b)由序列編號6所示之胺基酸序列中】個或以上 =△:除、插入及/或附加所成之胺 : 且具有Λ5脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。傅城 白 17·—種抗體’其能識別請求項13幻: 質。 Y任何一項之蛋 至〗2之任何 18· 一種重組表現載體，其包含至少請求 一項之基因。 、 至12中任何一項之 19. 一種轉形體，其導入至少請求項 基因。 、 110 200525030 植物體之組織，其係以可表現之方式導 項1至】2中任何一項之基因之植物體，5^ 與祕物體具有相同性質之該植物體之子孫。一戈 21入广體之組織，其係以可表現之方式導 組成被改變之jj2令任何一項之基因，以致脂肪酸 植物體之子Γ體，或與雜物财有㈣性質之該 =種°月求項20或21之植物體之繁殖材料。 種月曰肪酸之生產方法，其係使用請 或植物體之組織〜 、1之植物體 種材料，其包含選自藉由請求項μ =到之Γ亞麻稀酸、升二碳--亞麻:酸、^方 十八碳四烯酸（stearidonic a _ 四 二十碳五烯酸中之至少—種。 —十⑽歸酸及 至 25:種中：肪:…^ T任何一項之基因。 26.:=因檢測器具’係以請求項…中任 ;，-部分之驗基序列或其之互補序列做為〜： 27·Γ=節請求項13至16項中任何—項之蛋白質之其 該蛋白質之物質之筛選方法，其係使用3因 16項中任何一項之蛋白質。 未項 28· 一種藉由請求項27之筛選方法得到之基因或物質。 111