MXPA05001829A - Metodos para aumentar el contenido de aceite de las plantas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se encuentra en el campo de la genetica vegetal y la bioquimica; mas especificamente, la presente invencion se refiere a los genes que afectan el nivel y la composicion de aceite en las plantas, en particular, la presente invencion se refiere a los metodos para incrementar el nivel de aceite en las plantas y semillas; ademas, la presente invencion incluye y proporciona metodos para producir plantas y obtener semillas con una composicion de acido graso alterada.

Description

METODOS PARA AUMENTAR EL CONTENIDO DE ACEITE DE LAS PLANTAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. 60/402,527, presentada el 12 de agosto de 2002, incorporada en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención pertenece al campo de la genética vegetal y la bioquímica. Más específicamente, la presente invención se refiere al contenido de aceite de las plantas. En particular, la presente invención está dirigida a métodos para aumentar el contenido de aceite y alterar la composición de aceite de las plantas y semillas. Además, la presente invención incluye y provee métodos para producir plantas y obtener semillas con un aumento en el contenido de aceite. Estas plantas y semillas también pueden exhibir composiciones de proteína esencialmente inalteradas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los aceites de las plantas se utilizan en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, el aceite de soya se usa en aplicaciones tan diversas como aceites para ensalada y para cocinar, hasta aceites de biodiesel y biolubricante. Los aceites de semilla están compuestos casi por completo de triacilgliceroles en los cuales los ácidos grasos están esterificados en los tres grupos hidroxilo del glicerol. El uso de triacilgliceroles como una reserva de la semilla maximiza la cantidad de energía almacenada dentro de un volumen limitado, porque los ácidos grasos son una forma muy reducida de carbono (Miquel y Browse, en "Seed Development and Germination", Galili y otros (ed.), Marcel Dekker, Nueva York, p. 169-193, 1994). En la naturaleza se encuentra una enorme variedad de estructuras diferentes de ácidos grasos (Gunstone y otros, "The Lipid Handbook", Chapman & Hall, Londres, 1994; Hilditch y Williams, 'The Chemical Constituents of Natural Fats", Chapman & Hall, Londres, 1964; Murphy, "Designer Oil Crops", VCH, Weinheim, 1994; van de Loo y otros, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 92:6743-6747, 1993), pero solo cinco representan el 90% del aceite vegetal comercial producido: ácido palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1 ), linoleico (18:2) y a-llnolénico (18:3). Los factores que controlan el contenido de aceite en una planta, o una parte de la planta como una semilla, son complejos. Por tanto, la selección de un mayor contenido de aceite es con frecuencia un procedimiento laborioso que frecuentemente produce plantas que exhiben una variación considerable de planta a planta (Jensen, "Plant Breeding Methodology", John Wiley & Sons, Inc., E.U., 1988). Además, la selección de mayor contenido de aceite frecuentemente da como resultado una reducción de la fracción de proteína de la semilla. De esta manera, persiste la necesidad de métodos para producir plantas con un mayor contenido de aceite, particularmente un método que también produzca plantas con un contenido de proteína esencialmente inalterado.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye y provee un método para aumentar el contenido de aceite de una semilla, que comprende: (A) transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende, como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia de ácido nucleico estructural capaz de modular el contenido de ARNm FAD2 o la proteína FAD2; y (B) desarrollar la planta. La presente invención incluye y provee un método para aumentar el contenido de aceite de una semilla, que comprende: (A) transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende, como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia de ácido nucleico estructural capaz de aumentar el contenido de ácido oleico; y (B) desarrollar la planta. La presente invención incluye y provee un método para obtener una semilla que tiene un mayor contenido de aceite, que comprende: (A) desarrollar una planta que tiene una contenido modulado de proteína FAD2 o ARNm FAD2; y (B) obtener la semilla de la planta. La presente invención incluye y provee un método para aumentar el porcentaje de aceite de una semilla, que comprende: (A) transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende, como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia de ácido nucleico estructural capaz de modular el contenido de ARNm FAD2 o de proteína FAD2; y (B) desarrollar la planta. La presente invención incluye y provee un método para la producción de una planta que tiene un mayor porcentaje de aceite, que comprende; (A) cruzar una primera planta que tiene un contenido modificado de proteína FAD2 o ARNm FAD2, con una segunda planta para producir una población segregada; (B) examinar la población segregada para buscar un miembro que tenga mayor porcentaje de aceite; y (C) seleccionar el miembro. La presente invención incluye y provee genes quiméricos que comprenden un fragmento aislado de ácido nucleico que codifica delta-12-desaturasa, o cualquier subfragmento funcionalmente equivalente, o el complemento inverso de dicho fragmento o subfragmento que está ligado operativamente, y en donde la expresión de dichas combinaciones produce un aumento del aceite. Esta invención también incluye plantas y partes de plantas que contienen los diversos genes quiméricos, semillas de dichas plantas, aceite obtenido del grano de dichas plantas, alimento para animales derivado del procesamiento de dicho grano, el uso del aceite anterior en alimentos, alimentos para animales, aceite para cocinar o aplicaciones industriales, productos hechos de la hidrogenación, fraccionamiento, interesterificación o hidrólisis de dicho aceite, y métodos para mejorar la calidad de cadáver de un animal.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa la construcción pMON67563. La figura 2 representa una correlación del porcentaje de aceite contra el porcentaje de ácido oleico (18:1) en pMON67563 y líneas de control pCGN9979. La figura 3 representa el porcentaje de ácido oleico (18:1) contra el porcentaje de aceite en semillas de Arabidopsis. La figura 4 representa el porcentaje medio (SEM) de aceite en semilla T3 de líneas transgénicas que expresan la construcción de supresión ARNids FAD2 (derecha) contra líneas de control que contienen un vector vacío (izquierda). La figura 5 representa la construcción pMON67589. La figura 6 representa la construcción pMON67591. La figura 7 representa la construcción p ON67592. La figura 8 representa la construcción pMON68655. La figura 9 representa la construcción pMON68656.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Como se usa aquí, "contenido de aceite" se refiere a la cantidad total de ácido graso en conjunto, sin considerar el tipo de ácido graso. Como se usa aquí, el término "gen" se usa para referirse a la secuencia de ácido nucleico que abarca la región promotora 5' asociada con la expresión del producto del gen, cualquier región de intrón y exón, y regiones 3' no traducidas asociadas con la expresión del producto del gen. Como se usa aquí, una "FAD2", "?-12-desaturasa" u "omega-6-desaturasa", es una enzima capaz de catalizar la inserción de un doble enlace en una porción del ácido graso en la posición doce, contada desde el extremo carboxilo. Los términos "subfragmento que es funcionalmente equivalente" y "subfragmento funcionalmente equivalente", se usan aquí intercambiablemente. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento aislado de ácido nucleico en la cual se retiene la capacidad para alterar la expresión del gen o producir un cierto fenotipo, ya sea que el fragmento o subfragmento codifiquen o no una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento se puede usar en el diseño de genes quiméricos para producir un fenotipo deseado en una planta transformada. Los genes quiméricos se pueden diseñar para usar en cosupresión o antisentido, ligando un fragmento o subfragmento de ácido nucleico en la orientación apropiada con respecto a una secuencia promotora de planta, ya sea que codifiquen o no una enzima activa. El término "no codificadora" se refiere a secuencias de moléculas de ácido nucleico que no codifican una proteína expresada, ni parte de la misma. Las secuencias no codificadoras incluyen, sin limitación, intrones, regiones promotoras, regiones 3' no traducidas y regiones 5' no traducidas. El término "intrón", como se usa aquí, se refiere al sentido normal de un segmento de moléculas de ácido nucleico, usualmente ADN, que no codifica una proteína expresada ni parcial ni totalmente y que, en condiciones endógenas, es transcrito a moléculas de ARN, pero que es empalmado fuera del ARN endógeno antes de que el ARN sea traducido en una proteína. El término "exón", como se usa aquí, se refiere al sentido normal de un segmento de moléculas de ácido nucleico, usualmente ADN, que codifica una proteína expresada o una parte de la misma. Como se usa aquí, haciendo referencia a proteínas y ácidos nucleicos, el uso de mayúsculas sencillas, por ejemplo "FAD2", se refiere a una enzima, proteína, polipéptido o péptido, y el uso de mayúsculas en letra cursiva, por ejemplo "FAD2", se refiere a ácidos nucleicos que incluyen, sin limitación, genes, ADNc's y ARNm's. Como se usa aquí, un promotor que está "ligado operativamente" a una o más secuencias de ácido nucleico, es capaz de manejar la expresión de una o más secuencias de ácido nucleico que incluyen secuencias de ácido nucleico no codificadoras o de codificación múltiple dispuestas en una configuración policistrónica. Como se usa aquí, el término complemento de una secuencia de ácido nucleico se refiere al complemento de la secuencia a lo largo de su longitud completa. Como se usa aquí, cualquier escala señalada es incluyente de los puntos finales de la escala, a menos que se indique de otra manera. El experto en la materia puede consultar los textos de referencia generales para revisar las técnicas conocidas expuestas en la presente o técnicas equivalentes. Estos textos incluyen: Ausubel y otros, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook y otros, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (2a ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; Birren y otros, "Genome Analysis: A Laboratory Manual", volúmenes 1 a 4, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1997-1999; "Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual", Clark (ed.), Springer, Nueva York, 1997; Richards y otros, "Plant Breeding Systems"- (2d ed.), Chapman & Hall, The University Press, Cambridge, 1997; y Maliga y otros, "Methods in Plant Molecular Biology", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1995. Desde luego, también se puede consultar estos textos para practicar un aspecto de la invención. La presente invención incluye y provee un método para aumentar el contenido de aceite en una semilla, que comprende: (A) transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende, como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia de ácido nucleico estructural capaz de modular el contenido de ARNm FAD2 o proteína FAD2; y (B) desarrollar la planta. La secuencia de ácido nucleico estructural se puede seleccionar del grupo de SEQ ID NOs: 1 , 4, 7-11 , 14, 19, 22, 25 o 26, o el complemento inverso de la misma, cualquier subfragmento funcionalmente equivalente ..del mismo, o un complemento inverso de dicho fragmento o subfragmento. La presente invención provee un método para aumentar el contenido de aceite de una semilla. El aumento de aceite puede ser en cualquier cantidad. Un aumento del contenido de aceite puede ser el resultado de una alteración del contenido de cualquier enzima o transcrito que aumente el contenido de ácido oleico (18:1). En un aspecto preferido, el aumento del contenido de aceite es el porcentaje de aumento entre el aceite encontrado en una semilla o colección de semillas y el aceite medido en una segunda o subsiguiente semilla o colección de semillas. Como se usa aquí, el porcentaje de aumento se calcula como la diferencia entre el aceite encontrado en una semilla o colección de semillas y el aceite medido en una segunda o subsiguiente semilla o colección de semillas. En un aspecto particularmente preferido, el aumento de aceite se mide con respecto a una semilla de una planta con bases genéticas similares pero que carece de una secuencia estructural de ácido nucleico capaz de afectar el contenido de ácido oleico (18:1). En otro aspecto particularmente preferido, el aumento de aceite se mide con respecto a una semilla de una planta con bases genéticas similares pero que carece de una secuencia estructural de ácido nucleico capaz de modular el contenido de ARNm FAD2 o proteína FAD2. Cuando se comparan las concentraciones de un agente, dicha comparación se lleva a cabo preferiblemente entre organismos con bases genéticas similares. En un aspecto preferido, las bases genéticas similares son cuando el organismo comparado comparte 50% o más de su material genético nuclear. En un aspecto más preferido, las bases genéticas similares son cuando el organismo comparado comparte 75% o más, muy preferiblemente 90% o más, de su material genético nuclear. En otro aspecto preferido, las bases genéticas similares son cuando los organismos comparados son plantas y las plantas son isogénicas excepto por cualquier material genético introducido originalmente usando técnicas de transformación de plantas. En otro aspecto, el aumento se mide en una semilla de una planta producida por cruzamiento de dos plantas, y el aumento del contenido de aceite en la semilla de esa planta se mide con respecto a una o más de las otras semillas de una o más de las plantas utilizadas para generar la planta en cuestión (esto es, las progenitoras). El contenido de aceite se puede medir con cualquier método apropiado. Por ejemplo, sin limitación, la cuantificación del contenido de aceite de las semillas se realiza con frecuencia con los métodos convencionales tales como análisis de infrarrojo cercano (NIR), imagografía de resonancia magnética nuclear (RMN), extracción en Soxhlet, extracción acelerada de solvente (ASE), extracción en microondas y extracción de fluido supercrítico. La espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) se ha convertido en un método estándar para examinar muestras de semilla, siempre que la muestra de interés se haya hecho receptiva de esta técnica. Las muestras estudiadas incluyen trigo, maíz, soya, cañóla, arroz, alfalfa, avena y otras. Se puede usar análisis de NIR de semillas solas (véase Velasco y otros, "Estimation of Seed Weight, Oil Contení and Fatty Acid Composition in lntact Single Seeds of Rapeseed (Brassica napus L.) by Near-lnfrared Reflectance Spectroscopy" Euphytica, Vol. 106, 1999, p. 79-85; Delwiche, "Single Wheat Kernel Analysis by Near-lnfrared Transmittance: Protein Content", Analytical Techniques and Instrumentation, Vol. 72, 1995, p. 11-16; Dowell, "Automated Color Classif ¡catión of Single Wheat Kernels Using Visible and Near-lnfrared Reflectance" Vol. 75(1 ), 1998, p. 142-144; Dowell y otros, "Automated Single Wheat Kemel Quality Measurement Using Near-lnfrared Reflectance" ASAE Annual International Meeting, 1997, documento número 973022, todas las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia). La RMN también se ha usado para analizar el contenido de aceite en semillas (véase, por ejemplo, Robertson y Morrison, "Analysis of Oil Content of Sunflower Seed by Wide-Line NMR" Journal of the American Oil Chemists Society, 1979, Vol. 56, 1979, p. 961-964, que se incorpora aquí en su totalidad como referencia). Para determinar el contenido de aceite se pueden usar otras técnicas que incluyen extracción en Soxhiet, extracción acelerada de solvente (ASE), extracción en microondas y extracción de fluido supercrítico. Algunas técnicas utilizan gravimetría como el paso final de medición (véase, por ejemplo, Taylor y otros, "Determination of Oil Content in Oilseeds by Analytical Super-critical Fluid Extraction" Vol. 70 (No. 4), 1993, p. 437-439, que se incorpora aquí en su totalidad como referencia). Sin embargo, la gravimetría no es adecuada para usar con muestras pequeñas, que incluyen semillas pequeñas y semillas con bajo contenido de aceite, porque la concentración de aceite en estas muestras puede estar por abajo del nivel de sensibilidad mínima de la técnica. Además, el uso de gravimetría es tardado y no es susceptible de automatización de alto rendimiento. Los métodos de la presente invención se pueden usar para aumentar el contenido de aceite en cualquier semilla. En una modalidad preferida, una semilla incluye endosperma o embrión. En otra modalidad preferida, una semilla incluye tanto endosperma como embrión. Las semillas pueden ser de dicotiledóneas o de monocotiledóneas. En una modalidad preferida, la semilla se puede seleccionar del grupo que consiste de semilla de Arabidopsis, semilla de Brassica, semilla de cañóla, semilla de maíz, semilla de palma, semilla de colza, semilla de cacahuate, semilla de cártamo, semilla de soya y semilla de girasol, siendo particularmente preferida la semilla de Arabidopsis, semilla de Brassica, semilla de cañóla, semilla de maíz y semilla de soya. La transformación de una planta se puede realizar por cualquier medio que resulte en la introducción de una construcción en una planta. Se tienen disponibles varios métodos para la introducción de una secuencia, de polinucleótido deseada en las células de una planta, y son conocidos para el experto en la materia; incluyen, sin limitación: (1) métodos físicos como microinyección, electroporación y suministro mediado por proyectil (biolística o tecnología de pistola de genes); (2) métodos de suministro mediados por virus; y (3) métodos de transformación mediados por Agrobacteríum. Los métodos usados más comúnmente para la transformación de células de planta son el procedimiento de transferencia de ADN mediado por Agrobacteríum y el procedimiento biolístico o mediado por bombardeo de microproyectiles (esto es, la pistola de genes). Típicamente se busca la transformación nuclear, pero cuando es deseable transformar específicamente plástidos, tales como los cloroplastos o amiloplastos, los plástidos de la planta se pueden transformar utilizando un suministro mediado por microproyectil del polinucleótido deseado. La transformación mediada por Agrobacterium se logra usando una bacteria del suelo construida por ingeniería genética que pertenece al género de Agrobacterium. Para transferir genes a las plantas se pueden usar varias cepas de tipo silvestre y desarmadas de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que alojan los plásmidos Ti o Ri. La transferencia de genes se hace mediante la transferencia de un ADN específico conocido como "ADN-T", que puede ser construido por ingeniería genética para llevar cualquier pieza de ADN deseada a muchas especies de plantas. La transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium incluye varios pasos. El primer paso, en el cual se ponen en contacto primero el Agrobacterium virulento y las células de la planta, generalmente se llama "inoculación". Después de la inoculación se dejan desarrollar juntos el Agrobacterium y las células/tejidos vegetales durante un período de varias horas a varios días, o más, bajo condiciones adecuadas de crecimiento y transferencia de ADN-T. Este paso se denomina "cocultivo". Después del cocultivo y suministro de ADN-T, las células vegetales se tratan con agentes bactericidas o bacteriostáticos para matar el Agrobacterium remanente en contacto con el explante o en el recipiente que contiene el explante. Si esto se hace en ausencia de cualquier agente selectivo para promover el crecimiento preferente de células vegetales transgénicas contra las no transgénicas, entonces esto es referido típicamente como el paso de "retraso". Si se hace en presencia de presión selectiva que favorece a las células vegetales transgénicas, entonces es referido como el paso de "selección". Cuando se usa un "retraso" normalmente se continúa con uno o más pasos de "selección". Con respecto al bombardeo de microproyectiles (patente de E.U.A. No. 5,550,318; patente de E.U.A. No. 5,538,880; patente de E.U.A. No. 5,610,042; y publicación de PCT WO 95/06128; todas estas incorporadas específicamente en su totalidad como referencia), se recubren partículas con ácidos nucleicos y se suministran en células mediante una fuerza de propulsión. Las partículas ejemplares incluyen las comprendidas de tungsteno, platino y, preferiblemente, oro. Una modalidad ilustrativa de un método para suministrar ADN a células vegetales por medio de aceleración es el sistema biolístico de suministro de partículas (BioRad, Hercules, California), que se puede usar para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células vegetales cultivadas en suspensión. Las técnicas de bombardeo de microproyectiles son ampliamente aplicables y se pueden usar para transformar virtualmente cualquier especie de planta. Ejemplos de especies que se han transformado por bombardeo de microproyectiles incluyen especies de monocotiledóneas tales como el maíz (publicación de PCT WO 95/06128), cebada, trigo (patente de E.U.A. No. 5,563,055, incorporada específicamente aquí en su totalidad como referencia), arroz, avena, centeno, caña de azúcar y sorgo; así como también varias dicotiledóneas que incluyen tabaco, soya (patente de E.U.A. No. 5,322,783, incorporada específicamente aquí en su totalidad como referencia), girasol, cacahuate, algodón, tomate y legumbres en general (patente de E.U.A. No. 5,563,055, incorporada específicamente aquí en su totalidad como referencia). Para seleccionar o calificar las células vegetales transformadas sin considerar la metodología de transformación, el ADN introducido en la célula puede contener un gen que funcione en un tejido vegetal regenerabie para producir un compuesto que confiere al tejido vegetal resistencia contra un compuesto tóxico. Los genes de interés para usar como un marcador seleccionable o calificable incluirían, sin limitación, los genes de GUS, proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa (LUX), o genes de tolerancia a antibiótico o herbicida. Ejemplos de genes de resistencia a antibiótico incluyen los de penicilinas, kanamicina (y neomicina, G4 8, bleomicina); metotrexate (y trimetoprim); cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina. La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de varios explantes transformados están bien documentados. Este proceso de regeneración y crecimiento incluye por lo general los pasos de seleccionar las células transformadas y cultivar las células individualizadas mediante las etapas usuales de desarrollo embriónico hasta la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos se regeneran similarmente. Los vástagos enraizados transgénicos resultantes se plantan posteriormente en un medio de crecimiento de planta apropiado tal como tierra. Las células que sobreviven a la exposición del agente selectivo, o las células que han sido calificadas como positivas en una prueba de selección, se pueden cultivar en un medio que soporte la regeneración de las plantas. Las plántulas en desarrollo se transfieren a una mezcla de crecimiento de planta sin tierra y se fortalecen, antes de transferirlas a un invernadero o cámara de crecimiento para su maduración. La presente invención se puede usar con cualquier célula o tejido transformable. Por transformable, como se usa aquí, se entiende una célula o tejido que es capaz de propagación adicional para dar origen a una planta. Los expertos en la materia reconocen que varias células o tejidos vegetales son transformables, en los cuales después de la inserción de ADN exógeno y condiciones de cultivo apropiadas, las células o tejidos vegetales se pueden convertir en una planta diferenciada. Los tejidos adecuados para este fin pueden incluir, sin limitación, embriones inmaduros, tejido escutelar, cultivos de células en suspensión, inflorescencia inmadura, meristema de vástago, explantes nodales, tejido calloso, tejido hipocotíleo, cotiledones, raíces y hojas. Se puede usar cualquier medio de cultivo de planta. Ejemplos de medios adecuados incluirían, sin limitación, los medios basados en MS (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962), o los medios basados en N6 (Chu y otros, Scientia Sínica 18:659, 1975), suplementados con reguladores del crecimiento de plantas adicionales que incluyen, sin limitación, auxinas, citocininas, ABA y giberelinas. Los expertos en la materia están familiarizados con la variedad de medios de cultivo de tejido, que cuando se suplementan apropiadamente, sostienen el crecimiento y desarrollo de los tejidos de las plantas y son adecuados para la transformación y regeneración de las plantas. Estos medios de cultivo de tejido se pueden comprar como una preparación comercial, o se pueden preparar y modificar a voluntad. Los expertos en la materia saben que los medios y los suplementos de medios tales como nutrientes y reguladores del crecimiento, para usar en la transformación y regeneración, y otras condiciones del cultivo como son la intensidad de la luz durante la incubación, el pH y la temperatura de incubación, se pueden optimizar para la variedad de intereses particulares. Una construcción o vector puede incluir un promotor de planta para expresar la molécula de ácido nucleico de elección. En una modalidad preferida, cualquier molécula de ácido nucleico descrita en la presente se puede ligar operativamente a una región promotora que funcione en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm. Por ejemplo, se puede usar sin limitación cualquier promotor que funcione en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm, tal como los promotores descritos en la presente. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor de planta. Se han descrito en la literatura varios promotores que son activos en células vegetales. Estos incluyen, sin limitación, el promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5745-5749, 1987), el promotor de octopina sintasa (OCS) (que es portado por plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de caulimovirus tales como el promotor 19S del virus del mosaico de coliflor (CaMV) (Lawton y otros, Plant Mol. Biol. 9:315-324, 1987) y el promotor 35S de CaMV (Odell y otros, Nature 313:810-812, 1985), el promotor 35S del virus del mosaico de escrofularia (patente de E.U.A. No. 5,378,619), el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO), el promotor Adh (Walker y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:6624-6628, 1987), el promotor de sacarosa sintasa (Yang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:4144-4148, 1990), el promotor complejo del gen R (Chandler y otros, The Plant Cell 1 :1175-1183, 1989), y el promotor del gen de proteína de unión de clorofila a/b. Estos promotores se han usado para crear construcciones de ADN que se han expresado en plantas; véase, por ejemplo, la publicación de PCT WO 84/02913. Para usar en las plantas se prefieren los promotores CaMV 35S. En la invención se pueden usar promotores conocidos o que se descubra que ocasionen la transcripción de ADN en células vegetales. También se pueden usar otros promotores para expresar un polipéptido en tejidos específicos tales como semillas o frutos. En realidad, en una modalidad preferida, el promotor usado es un promotor específico de semilla. Ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de genes tales como napina (Kridl y otros, Seed Sci. Res. 1 :209:219, 1991 ), faseolina (Bustos y otros, Plant Cell, 1 (9):839-853, 1989), inhibidor de tripsina de soya (Riggs y otros, Plant Cell 1 (6):609-621 , 1989), ACP (Baerson y otros, Plant Mol. BioL, 22(2):255-267, 1993), estearoil-ACP desaturasa (Slocombe y otros, Plant Physiol. 104(4): 167-176, 1994), la subunidad a' de ß-conglicinina de soya (P-Gm7S, véase, por ejemplo, Chen y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. 83:8560-8564, 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 , 2 y 3 en la solicitud de patente de E.U.A. No. Ser. 10/429,516) y promotor de oleosina L3 de Zea mays (P-Zm.L3, véase, por ejemplo, Hong y otros, Plant Mol. Biol., 34(3):549-555, 1997). También se incluyen las zeínas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en el endosperma del maíz. Se han aislado clonas genómicas para genes de zeína (Pedersen y otros, Cell 29:1015-1026, 1982; y Russell y otros, Transgenic Res. 6(2):157-168) y también se podrían usar los promotores de estas clonas, incluyendo los genes 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD. Otros promotores conocidos que funcionan por ejemplo en el maíz, incluyen los promotores para los siguientes genes: waxy, Bríttle, Shrunken 2, enzimas de ramificación I y II, sintasas de almidón, enzimas desramificadoras, oleosinas, glutelinas y sacarosa sintasas. Un promotor particularmente preferido para la expresión en endosperma de maíz es el promotor del gen de glutelina de arroz, más particularmente el promotor Osgt-1 (Zheng y otros, Mol. Cell Biol. 13:5829-5842, 1993). Ejemplos de promotores adecuados para la expresión en trigo incluyen los promotores de las subunidades de ADP-glucosa pirosintasa (ADPGPP), la sintasa de unión de gránulo y otra almidón sintasa, las enzimas ramificadora y desramificadora, las proteínas abundantes en embriogénesis, las gliadinas y las gluteninas. Ejemplos de dichos promotores en arroz incluyen los promotores de las subunidades ADPGPP, la sintasa de unión de gránulo y otra almidón sintasa, las enzimas ramificadoras, las enzimas desramificadoras, sacarosa sintasas y las glutelinas. Un promotor particularmente preferido es el promotor de glutelina de arroz, Osgt-1. Ejemplos de dichos promotores para cebada incluyen los de las subunidades ADPGPP, la sintasa de unión de gránulo y otra almidón sintasa, las enzimas ramificadoras, las enzimas desramificadoras, sacarosa sintasas, las hordeínas, las globulinas de embrión y las proteínas específicas aleurona. Un promotor preferido para la expresión en semilla es un promotor de napina, referido aquí como P-Br.Snap2. Otro promotor preferido para la expresión es un promotor Arcelin5 (publicación de patente de E.U.A. No.2003/0046727). Otro promotor preferido es un promotor 7S de soya (P-Gm.7S) y el promotor 7S de ß-conglicinina de soya (P-Gm.Sphas1 ). Vectores adicionales que se pueden utilizar se describen por ejemplo en las patentes de E.U.A. Nos. 5,378,619; 5,391 ,725; 5,428,147; 5,447,858; 5,608,144; 5,614,399; 5,633,441 ; 5,633,435; y 4,633,436. Además, se puede usar un incrementador específico de tejido. Las construcciones o vectores también pueden incluir, con la región de interés, una secuencia de ácido nucleico que actúa, total o parcialmente, para terminar la transcripción de esa región. Se han aislado varias de estas secuencias, incluyendo la secuencia Tr7 3' y la secuencia NOS 3' (Ingelbrecht y otros, The Plant Cell 1 :671-680, 1989; Bevan y otros, Nucleic Acids Res. 11 :369-385, 1983). También se pueden proveer regiones reguladoras de terminación de transcripción en las construcciones de expresión de planta de esta invención. Las regiones de terminación de transcripción pueden ser provistas por la secuencia de ADN que codifica el gen de interés, o una región de terminación de transcripción conveniente derivada de una fuente génica diferente, por ejemplo, la región de terminación de transcripción que está asociada naturalmente con la región de iniciación de transcripción. El experto en la materia reconocerá que en las construcciones de la presente invención se puede emplear cualquier región de terminación de transcripción conveniente que sea capaz de terminar la transcripción en una célula vegetal. Un vector o construcción también puede incluir elementos reguladores. Ejemplos de estos incluyen el intrón 1 de Adh (Callis y otros, Genes and Develop. 1 :1183-1200, 1987), el intrón de sacarosa sintasa (Vasil y otros, Plant Physiol. 91:1575-1579, 1989) y el elemento TMV omega (Gallie y otros, The Plant Cell 1 :301-31 1 , 1989). Estos y otros elementos reguladores se pueden incluir cuando sea apropiado. Se entiende que dos o más moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden introducir en una planta usando una sola construcción, y esa construcción puede contener uno o más promotores. En modalidades en donde la construcción se diseña para expresar dos moléculas de ácido nucleico, se prefiere que los dos promotores sean: (i) dos promotores constitutivos, (ii) dos promotores específicos de semilla, o (iii) un promotor constitutivo y un promotor específico de semilla. Los promotores específicos de semilla preferidos son los promotores del gen de 7S, napina y globulina 1 de maíz. Un promotor constitutivo preferido es un promotor de CaMV. Se entiende, además, que dos o más de las moléculas de ácido nucleico pueden estar enlazadas físicamente y se pueden expresar utilizando un solo promotor, preferiblemente un promotor específico de semilla o constitutivo. En una modalidad preferida de la presente invención se puede inducir en las plantas silenciación postranscripcional del gen, transformándolas con construcciones de antisentido o cosupresión. En particular, se pueden usar las construcciones realizadas con los métodos de Smith y otros {Nature 407: 319-320, 2000) para lograr un buen efecto. Otros métodos de construcción son bien conocidos para el experto en la materia y han sido revisados. Las secuencias estructurales de ácido nucleico capaces de reducir la concentración de ARNm FAD2 o proteína FAD2 incluyen cualquier secuencia de ácido nucleico con suficiente homología con el gen FAD2. Acidos nucleicos ejemplares incluyen los que se describen en US 6,372,965, US 6,342,658, US 6,333,448, US 6,291 ,741 , US 6,063,947, WO 01/14538 A3, US PAP 2002/20058340, y US PAP 2002/0045232. La presente invención incluye y provee un método para la producción de una planta que tiene un contenido de aceite mayor en comparación con al menos una de una primera o una segunda planta, que comprende: (A) cruzar una primera planta que tiene un contenido modificado de una proteína FAD2 o un ARNm FAD2 con una segunda planta, para producir una población segregada; (B) examinar la población segregada para buscar un miembro que tenga el contenido modificado de una proteína FAD2 o un ARNm FAD2; y (C) seleccionar el miembro. La presente invención incluye y provee un método para la producción de una planta que tiene un porcentaje mayor de aceite, que comprende: (A) cruzar una primera planta que tiene un contenido modificado de una proteína FAD2 o un ARNm FAD2 con una segunda planta, para producir una población segregada; (B) examinar la población segregada para buscar un miembro que tenga un aumento del contenido de aceite; y (C) seleccionar el miembro.

La presente invención incluye y provee un método para la producción de una planta que tiene un porcentaje mayor de aceite, que comprende: (A) cruzar una primera planta que tiene un contenido mayor de ácido oleico y un contenido menor de ácido linoleico, con una segunda planta, para producir una población segregada; (B) examinar la población segregada para buscar un miembro que tenga el contenido mayor de ácido oleico y el contenido menor de ácido linoleico; y (C) seleccionar el miembro. Las plantas de la presente invención pueden ser parte de un programa de reproducción o pueden ser generadas del mismo. La elección del método de reproducción depende del modo de reproducción de la planta, la heredabilidad de los rasgos que se mejoran y el tipo de cultivar usado comerciaimente (por ejemplo cultivar híbrido Fi, cultivar de línea pura, etc.). Más adelante se dan enfoques selectos no limitativos para reproducir las plantas de la presente invención. Un programa de reproducción se puede mejorar usando selección asistida por marcador de la progenie de cualquier cruza. Se entiende además que se puede utilizar cualquier cultivar comercial y no comercial en un programa de reproducción. Generalmente la elección será dictada por factores tales como por ejemplo vigor de emergencia, vigor vegetativo, tolerancia al estrés, resistencia a enfermedad, ramificación, floración, puesta de semilla, tamaño de la semilla, densidad de la semilla, verticalidad, trillabilidad, etc. Para rasgos altamente heredables será eficaz una elección de plantas individuales superiores evaluadas en un solo sitio, mientras que para rasgos con baja heredabilidad, la selección se debe basar en valores medios obtenidos de evaluaciones duplicadas de familias de plantas relacionadas. Los métodos populares de selección incluyen comúnmente selección genealógica, selección genealógica modificada, selección en masa y selección recurrente. En una modalidad preferida se efectúa un programa de reproducción de retrocruzamiento o recurrente. La complejidad de la herencia afecta la elección del método de reproducción. La reproducción de retrocruzamiento se puede usar para transferir uno o unos pocos genes favorables para un rasgo altamente heredable en un cultivar deseado. Este enfoque se ha usado extensamente para reproducir cultivares resistentes a enfermedad. Varias técnicas de selección recurrente se usan para mejorar cuantitativamente los rasgos heredados controlados por numerosos genes. El uso de la selección recurrente en cultivos autopolinizantes depende de la facilidad de la polinización, la frecuencia de los híbridos exitosos de cada polinización, y el número de descendencia híbrida de cada cruza exitosa. Las líneas reproductoras se pueden probar y comparar con estándares apropiados en medios representativos de las áreas objetivo comerciales durante dos o más generaciones. Las mejores líneas son candidatos a cultivares comerciales nuevos; los que son todavía deficientes en los rasgos se pueden usar como progenitores para producir poblaciones nuevas para selección adicional. Un método para identificar una planta superior es observar su rendimiento con respecto a otras plantas experimentales y a un cultivar estándar ampliamente desarrollado. Si una sola observación no resulta concluyente, las observaciones duplicadas pueden ofrecer una mejor estimación de su valor genético. Un reproductor puede seleccionar y cruzar dos o más líneas progenitoras, seguido por autofecundación y selección repetidas, y producir muchas combinaciones genéticas nuevas. El desarrollo de cultivares nuevos requiere el desarrollo y selección de variedades, la cruza de estas variedades y la selección de cruzas híbridas superiores. La semilla híbrida puede ser producida por cruzas manuales entre progenitores machos fértiles seleccionados o usando sistemas de esterilidad machos. Los híbridos se seleccionan para ciertos rasgos de gen único, tales como color de la vaina, color de la flor, rendimiento de la semilla, color de la pubescencia, o resistencia a herbicida, que indica que la semilla es verdaderamente un híbrido. Datos adicionales sobre líneas progenitoras, así como el fenotipo del híbrido, afectan la decisión del reproductor para continuar o no la cruza híbrida específica. Los métodos de reproducción genealógica y de reproducción de selección recurrente se pueden usar para desarrollar cultivares de poblaciones reproductoras. Los programas de reproducción combinan los rasgos deseables de dos o más cultivares o varias fuentes de base amplia en colecciones de reproducción de los cuales se desarrollan los cultivares por autofecundación y selección de los fenotipos deseados. Los cultivares nuevos se pueden evaluar para determinar los que tienen potencial comercial. La reproducción genealógica se usa comúnmente para el mejoramiento de cultivos autopolinizantes. Dos progenitores que poseen rasgos complementarios favorables se cruzan para producir un F-i. Una población F2 se produce por autofecundación de una o varias F-i's. Se seleccionan los mejores individuos de las mejores familias. El análisis duplicado de las familias puede comenzar en la generación F4 para mejorar la efectividad de selección de los rasgos con baja heredabilidad. En una etapa avanzada de ¡ntracruzamiento (es decir, Fs y F7), se prueban las mejores líneas o mezclas de líneas fenotípicamente similares para determinar la posible liberación como cultivares nuevos. La reproducción de retrocruzamiento se ha usado para transferir genes de un rasgo altamente heredable, heredado de forma simple, en un cultivar homocigótico deseable o línea endogámica, que es el progenitor recurrente. La fuente del rasgo por transferir se denomina el progenitor donador. Se espera que la planta resultante tenga los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo, cultivar) y el rasgo deseable transferido del progenitor donador. Después de la cruza inicial, los individuos que poseen el fenotipo del progenitor donador se seleccionan y se cruzan (retrocruzan) repetidamente con el progenitor recurrente. Se espera que el progenitor resultante tenga los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo, cultivar) y el rasgo deseable transferido desde el progenitor donador. El procedimiento de descendencia de una sola semilla en el sentido estricto se refiere a plantar una población segregada, cosechar una muestra de una semilla por planta, y usar la muestra de una semilla para plantar la siguiente generación. Cuando la población ha avanzado desde F2 hasta el nivel deseado de ¡ntracruzamiento, las plantas de las cuales derivan las líneas seguirán a diferentes individuos de F2. El número de plantas en una población declina cada generación debido a que algunas semillas no germinan o algunas plantas no producen al menos una semilla. Como resultado, cuando el avance de la generación se haya completado, no todas las plantas F2 muestreadas originalmente en la población serán representadas por una progenie. En un procedimiento de múltiples semillas, los reproductores cosechan comúnmente una o más vainas de cada planta en una población y las trillan juntas para forman una masa. Parte de la masa se usa para plantar la siguiente generación y parte se guarda de reserva. El procedimiento se ha referido como la técnica modificada de descendencia de una sola semilla o de vástago-masa. El procedimiento de múltiples semillas se ha usado para ahorrar trabajo en la cosecha. Es considerablemente más rápido trillar vainas con una máquina que remover cada semilla a mano con el procedimiento de una sola semilla. El procedimiento de múltiples semillas también hace posible plantar el mismo número de semillas de una población cada generación de intracruzamiento. Las descripciones de otros métodos de reproducción que son usados comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en varios textos de referencia (por ejemplo, Fehr, "Principies of Cultivar Development", Vol. 1 , 1987). Una planta transgénica de la presente invención también se puede reproducir usando apomixia. La apomixia es un método de reproducción de plantas controlado genéticamente, en donde el embrión se forma sin la unión de un huevo y un espermatozoide. La apomixia es económicamente importante, especialmente en plantas transgénicas, porque con ella cualquier genotipo puede ser reproducido verdaderamente sin importar qué tan heterocigótico sea. De esta manera, con la reproducción apomíctica las plantas transgénicas heteracigóticas pueden mantener su fidelidad genética durante ciclos de vida repetidos. Los métodos para la producción de plantas apomícticas son conocidos; véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,811 ,636. Todos los artículos, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no se consideran limitativos en modo alguno.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Se produce una construcción de silenciador de gen de acuerdo con el método de Smith y otros, para reducir la expresión de FAD2 en Arabidopsis mediante silenciamiento postranscripcional de gen (PTGS) (Smith y otros, Nature 407: 319-320, 2000). Se prepara una construcción (pMON67563, figura 1) usando el promotor de napina para manejar la expresión de un ARN de horquilla (ARNhp) que contiene 120 nucleótidos de la región 3' no traducida de FAD2, en orientación de sentido y antisentido que flanquean un intrón. Plantas de Arabidopsis se transforman con pMON67563 por transformación mediada por Agrobacteríum. Un vector de napina vacío (pCGN9979) también es transformado en plantas de Arabidopsis por transformación mediada por Agrobacteríum como un control.

Ejemplo 2 Semillas de plantas de Arabidopsis transformadas se analizan por medio de cromatografía de gases (GC) y espectroscopia de infrarrojo cercano ( IR) para determinar el perfil de ácidos grasos y el contenido de aceite. El análisis de GC demuestra que las plantas de Arabidopsis transformadas con pMON67563 tienen una proporción mayor de ácido oleico (18:1) y una proporción menor de ácido linoleico (18:2) con respecto a los controles. Las cepas transformadas 67563-1 a 67563-13 muestran una proporción mayor de ácido oleico (18:1 ) y una proporción menor de ácido linoleico (18:2) con respecto a las cepas de control no transformadas 9979-1 1 a 9979-15. Las cantidades relativas de ácido oleico y ácido linoleico se miden en porcentaje (p/p), con las cepas de control 9979-11 a 9979-15 exhibiendo un contenido de ácido oleico que varía entre aproximadamente 14% (p/p) y aproximadamente 18% (p/p), y un contenido de ácido linoleico que varía entre aproximadamente 30% (p/p) y aproximadamente 32% (p/p). Las cepas transformadas 67563-1 a 67563-3 y 67563-5 a 67563-15 muestran un contenido de ácido oleico que varía entre aproximadamente 34% (p/p) y aproximadamente 50% (p/p), y un contenido de ácido linoleico que varía entre aproximadamente 7% (p/p) y aproximadamente 18% (p/p). El análisis de NIR demuestra que las plantas transformadas con pMON67563 muestran un aumento del contenido de aceite y esencialmente el mismo contenido de proteína en comparación con una planta de control. Las cepas de control 9979-11 a 9979-15 exhibieron un porcentaje de aceite que varía entre aproximadamente 33.5% y aproximadamente 36.8%. En comparación con las cepas de control, las cepas transformadas 67563-1 a 67563-3 y 67563-5 a 67563-15 muestran un mayor porcentaje de aceite, que varía de aproximadamente 35.5% a aproximadamente 38.9%. Como se ¡lustra en la figura 2, cuando las cepas de control y las cepas transformadas se grafican para comparar el porcentaje de aceite (eje x) contra el porcentaje de ácido oleico (18:1), un aumento del contenido de ácido oleico se correlaciona con un aumento del contenido de aceite.

Ejemplo 3 Plantas de Arabidopsis transformadas con pMON67563 (figura 1 ) se desarrollan hasta la generación de semilla T3. La semilla T3 se cosecha y se analiza. Se usan análisis de cromatografía de gases (GC) e infrarrojo cercano (NIR) para determinar el perfil de ácidos grasos y el contenido de aceite, respectivamente. Los resultados del análisis de GC demuestran que 100% de la progenie de las plantas transformadas tienen un contenido mayor de ácido oleico (18:1 ), similar al observado en las plantas progenitoras. Las plantas de la progenie también exhiben un aumento del contenido de aceite. En la figura 3 se da una comparación del contenido de ácido oleico (18:1 ) contra el porcentaje de aceite. Como se ¡lustra en la figura 4, el porcentaje medio de aceite en las semillas T2 y T3 de las líneas transgénicas, aumenta en comparación con las semillas de control que contienen un vector vacío. La correlación entre el aumento en el porcentaje de ácido oleico y el aumento en el porcentaje de aceite, evidente en las semillas de la generación T3, parece ser genéticamente heredable. Como se ¡lustra en la figura 3, cuando se grafican las cepas de control y las cepas transformadas para comparar el porcentaje de aceite (eje x) contra el porcentaje de ácido oleico (18:1 ), un aumento en el contenido de ácido oleico se correlaciona con un aumento en el contenido de aceite en las semillas T3 de Arabidopsis transgénico.

Ejemplo 4 Construcción de FAD2 de cañóla Una sección del gen FAD2 de Brassica napus se aisló por amplificación de PCR. Se aparearon los iniciadores 17942 5'-GCGGCCGCGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTC-3' (SEQ ID NO: 2) y 17944 5'-CCATGGGAGACCGTAGCAGACGGCGAGG-3' (SEQ ID NO: 3), para amplificar los pares de bases 284-781 de la secuencia codificadora de FAD2 de ADN genómico de Brassica napus (cv. Ebony). Se agregó un sitio Notl en el extremo 5' y un sitio Ncol en el extremo 3' del fragmento para facilitar la clonación. Los fragmentos resultantes de la PCR se clonaron en pCR2.1 Topo. Se obtuvo la secuencia completa de doble cadena. Un fragmento de 444 pb que contenía CR-BN.BnFad2-0 (SEQ ID NO: 4) se removió por digestión con Notl y Ncol. El fragmento se ligó entre el promotor de Brassica napus y el primer intrón del gen FAD2 de Arabidopsis (At3g12120), que se había digerido con Notl y Ncol. El plásmido resultante se denominó pMON67589 (figura 5). La secuencia de ácido nucleico se determinó usando la metodología conocida, y confirmó la integridad de las uniones de clonación. Una sección del gen FAD2 de Brassica napus se aisló por amplificación de PCR. Se aparearon los iniciadores 17943 5'-CCCGGGGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTC-3' (SEQ ID NO: 5) y 7945 5'-GGTACCGAGACCGTAGCAGACGGCGAGG-3' (SEQ ID NO: 6), para amplificar los pares de bases 284-781 de la secuencia codificadora de FAD2 de ADN genómico de Brassica napus (cv. Ebony). Se agregó un sitio Kpnl en el extremo 3' y un sitio Smal en el extremo 5' del fragmento para facilitar la clonación. Los fragmentos resultantes de la PCR se clonaron en pCR2.1 Topo. Se obtuvo la secuencia completa de doble cadena. Un fragmento de 455 pb que contenía AS-BN.BnFad2-0 (SEQ ID NO: 7) se removió por digestión con Kpnl y Smal. El fragmento se ligó entre el primer intrón del gen FAD2 de Arabidopsis (At3g12120) y la UTR 3' en pMON67589, que se había digerido con Smal y Kpnl. El plásmido resultante se denominó pMON67591 (figura 6). La secuencia de ácido nucleico se determinó usando la metodología conocida, y confirmó la integridad de las uniones de clonación.

Un fragmento de 2030 pb que contenía CR-BN.BnFad2-0, seguido por el primer intrón del gen FAD2 de Arabidopsis thaliana (At3g12120) y AS-BN.BnFad2-0, se removió de pMON67591 por digestión con Notl y Smal. El fragmento se ligó en un plásmido que se había digerido con Notl y Hindlll (los extremos del sitio Hindlll se emparejaron antes de la ligación). El plásmido resultante se denominó pMON67592 (figura 7). La secuencia de ácido nucleico se determinó usando la metodología conocida, y confirmó la integridad de las uniones de clonación. Este vector se usó en la transformación subsiguiente de cañóla, que se hizo mediante transformación mediada por Agrobacteríum.

Ejemplo 5 Semillas de plantas de cañóla R2 transformadas con pMON67592 se analizaron para determinar el contenido de aceite, ácido oleico y proteína. Como se puede ver en el cuadro 1 , las diferencias entre los segregantes homocigóticos positivos y nulos variaron de 1.7% a 2.5% de aceite y de 20.4% a 25.6% de ácido oleico. El contenido de proteína permaneció igual. El cuadro 2 muestra los resultados combinados de todos los eventos.

Cuadro 1 Contenido promedio de aceite v ácido oleico en semilla de cañóla R2 derivada de transformantes individuales La media y el error estándar (SE) se calcularon en JMP versión 4.0.4 (SAS Institute). Las diferencias entre las medias de segregantes homocigoticos positivos y nulos, tanto para aceite como para ácido oleico en los 5 eventos, son estadísticamente significativas (p<.0001).

Cuadro 2 Contenido promedio de aceite y ácido oleico en semilla de cañóla R2 transformada con pMON65792 La media y la desviación estándar (SD) se calcularon en JMP versión 4.0.4 (SAS Institute). Las plantas se derivaron de 5 transformantes independientes. Las diferencias entre las medias de segregantes homocigoticos positivos y nulos son estadísticamente significativas (p<.0001).

Ejemplo 6 En base a la similitud de secuencia con Arabidopsis, se identificaron cuatro genes de delta-12-desaturasas (FAD2) de soya y maíz en una base de datos patentada de unigenes de maíz. Se designaron FAD2-1, FAD2-2, FAD2-3 y FAD2-4. La secuencia de ADNc de longitud completa de Z .FAD2-1 se muestra en la SEQ ID NO: 8. Codifica un polipéptido de 387 aminoácidos (marco de traducción: nucleótidos 182-1342). La secuencia de ADNc de longitud completa de Zm.FAD2-2 se muestra en SEQ ID NO: 9. Codifica un polipéptido de 390 aminoácidos (marco de traducción: nucleótidos 266-1435). La secuencia de ADNc de longitud completa de Z .FAD2-3 se muestra en SEQ ID NO: 10. Codifica un polipéptido de 382 aminoácidos (marco de traducción: nucleótidos 170-1315). La secuencia parcial de Zm.FAD2-4 se muestra en SEQ ID NO: 1 1. Codifica un polipéptido de 252 aminoácidos (marco de traducción: nucleótidos 1-256). Las regiones codificadoras de los tres genes comparten una identidad de secuencia significativa. FAD2-1 comparte 91 % de identidad con FAD2-2 en cuanto a nucleótidos y 88% de identidad en cuanto a aminoácidos. FAD2-1 comparte 85% de identidad con FAD2-3 en cuanto a nucleótidos y 68% de identidad en cuanto a aminoácidos. FAD2-1 comparte 82% de identidad con FAD2-4 en cuanto a nucleótidos y 68% de identidad en cuanto a aminoácidos. FAD2-3 comparte 80% de identidad con FAD2-4 en cuanto a nucleótidos y 65% de identidad en cuanto a aminoácidos. Se usó un Northern virtual para determinar cual de los 4 genes estaba presente en el tejido de semilla de maíz. Tanto FAD2-1 como FAD2-2 estaban presentes en las semillas y en tejido germinal y tejido embriónico, recolectados a diferentes tiempos durante el desarrollo de la semilla. Ni FAD2-3 ni FAD2-4 estuvieron presentes en los tejidos de semilla pero ambos se detectaron en tejido de hoja.

Construcción de ARNi de una fusión de UTR3' de FAD2-1 y FAD2-2 Se preparó una construcción que comprende un promotor de maíz L3, un intrón de actina de arroz en 3' con respecto al promotor y 5' con respecto al elemento ARNi, un elemento ARNi seguido por un extremo 3' de globulina localizado en 3' con respecto al elemento ARNi. El elemento ARNi estaba compuesto de un fragmento de la UTR3' Zm.FAD2-1, unido por un sitio BamH1 con un fragmento de la UTR3' Zm. FAD2-2, ambos en la orientación de sentido enlazados a los mismos dos fragmentos UTR3' FAD2 en la orientación de antisentido por un intrón HSP70 que contiene sitios de empalme de intrón. El intrón HSP70 está localizado de tal manera que está en la orientación de sentido con respecto al promotor. El orden de sentido y antisentido de los fragmentos UTR3' no es importante, siempre que cada fragmento (FAD2-1 y FAD2-2) quede en orientación de sentido en un lado del intrón central y de antisentido en el otro lado. La construcción es adecuada para transformación en maíz, ya sea por bombardeo de microproyectil o por transformación mediada por Agrobacterium. Se usó PCR para obtener el intrón HSP70 con un sitio Bsp120l sobre el extremo 5' y un sitio Stu1 sobre el extremo 3'. Se usaron iniciadores (SEQ ID NOs: 12 y 13) específicos para la secuencia de intrón HSP70 para clonar el intrón. El fragmento Bsp120l y Stul del producto de PCR de 820 pares de bases (SEQ ID NO: 14) se clonó en los mismos sitios de un turbo binario que contiene un promotor del virus del mosaico de coliflor que maneja nptll, con un NOS3' y un promotor de Zea mays L3 seguido por un intrón de actina de arroz y una globulina 3", para hacer una construcción intermedia. Los fragmentos de las UTR3' Zm.FAD2-1 y FAD2-2 se obtuvieron por PCR. Se usaron clonas de la colección de Monsanto como moldes, con iniciadores específicos para FAD2-1 (SEQ ID NO: 15, que contiene los sitios de clonación agregados Sse83871 y Sac1 ; y SEQ ID NO: 16, que contiene un sitio de clonación agregado BamH1 ), o iniciadores específicos para FAD2-2 (SEQ ID NO: 17, que contiene un sitio de clonación agregado BamH1 ; y SEQ ID NO: 18, que contiene sitios agregados Bsp120l y EcoRV). Para enlazar los dos productos de PCR, se sometieron a digestión con BamH1 , se purificaron en gel y se ligaron, y el producto de ligación se usó como un molde, con los iniciadores de SEQ ID NOs: 15 y 18. Resultó un fragmento de 447 pares de bases (SEQ ID NO: 19). El fragmento Sac1/Bsp120l de SEQ ID NO: 19 se clonó en los mismos sitios y el fragmento Sse8387l/EcoRV de SEQ ID NO: 19 se clonó en los sitios SSe83871/Stu1 de la construcción intermedia para producir pMON56855 (figura 8).

Ejemplo 7 Construcción de ARNi de una fusión de los intrones de FAD2-1 y FAD2-2 Se preparó una construcción de expresión que comprende un promotor de maíz L3, un intrón de actina de arroz-maíz en 3' con respecto al promotor y 5' con respecto ai elemento ARNí, un elemento ARNi seguido por un extremo 3' de globulina localizado en 3' con respecto al elemento ARNi. El elemento ARNi estaba compuesto de una porción del intrón de Zm.FAD2-1 unida por un sitio BamH1 a una porción del intrón de Zm.FAD2-2, ambas en la orientación de sentido enlazadas a los mismos dos fragmentos de intrón de FAD2 en la orientación de antisentido por un intrón HSP70 que contiene sitios de empalme de intrón. El intrón HSP70 está localizado de tal manera que está en la orientación de sentido con respecto al promotor. El orden de sentido y antisentido de los fragmentos de intrón no es importante, siempre que cada fragmento (FAD2-1 y FAD2-2) quede en orientación de sentido en un lado del intrón central y de antisentido en el otro lado. La construcción es adecuada para transformación en maíz, ya sea por bombardeo de microproyectil o por transformación mediada por Agrobacterium. Se usó PCR para obtener el intrón HSP70 como se describe en el ejemplo anterior. Se obtuvieron fragmentos de los intrones de los genes Zm.FAD2-1 y FAD2-2 por PCR. Se usó como molde ADN genómico preparado de las hojas de Z. mays, variedad LH59, usando el protocolo de Dellaporta y otros (Dellaporta y otros (1983), "A plant DNA minipreparation: versión II", Plant Mol Biol Rep 1 : 19-21). Para FAD2-1, se usaron iniciadores específicos (SEQ ID NO: 20 con sitios de clonación agregados SSe83871 y Sacl; y SEQ ID NO: 21), para producir un producto de 267 pares de bases (SEQ ID NO: 22). Para FAD2-2 se usaron iniciadores específicos (SEQ ID NO: 23, que incluye 21 bases que se traslapan con la secuencia 3' de SEQ ID NO: 22; y SEQ ID NO: 24, que contiene sitios agregados Bsp120l y EcoRV), para producir un producto de 260 pares de bases (SEQ ID NO: 25). Para enlazar los dos productos de PCR (SEQ ID NOs: 22 y 25), ambos se usaron como moldes en una reacción de PCR, usando los iniciadores de SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 24 para producir una fusión de 506 pares de bases (SEQ ID NO: 26). El fragmento de Sac1 y Bsp120l de SEQ ID NO: 26 se purificó en un gel y después se clonó en los mismos sitios para producir pMON68656 (figura 9).

LISTADO DE SECUENCIAS <110> SHEWMAKER, CHRISTINE K VAN EENENNAAM, ALISON HAWKINS, DEBRA T SANDERS, RICK <120> METODOS PARA AUMENTAR EL CONTENIDO DE ACEITE DE LAS PLANTAS <130> MONS:052MX <140> PCT/US2003/025751 <141> 2003-08-12 <150> US 60/402,527 <151> 2002-08-12 <160> 26 <170> Patentln versión 3.2 <210> 1 <211> 120 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gcatgatggt gaagaaattg tcgacctttc tcttgtctgt ttgtcttttg ttaaagaagc 60 tatgcttcgt tttaataatc ttattgtcca ttttgttgtg ttatgacatt ttggctgctc 120 <210> 2 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 2 gcggccgcgc gtcctaaccg gcgtctgggt c 31 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 3 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 3 ccatgggaga ccgtagcaga cggcgagg 28 <210> 4 <211> 440 <212> ADN <213> Brassica napus <400> 4 gcgcgtccta accggcgtct gggtcatagc ccacgagtgc ggccaccacg ccttcagcga 60 ctaccagtgg cttgacgaca ccgtcggtct catcttccac tccttcctcc tcgtccctta 120 cttctcctgg aagtacagtc atcgacgcca ccattccaac actggctccc tcgagagaga 180 cgaagtgttt gtccccaaga agaagtcaga catcaagtgg tacggcaagt acctcaacaa 240 ccctttggga cgcaccgtga tgttaacggt tcagttcact ctcggctggc cgttgtactt 300 agccttcaac gtctcgggaa gaccttacga cggcggcttc gcttgccatt tccaccccaa 360 cgctcccatc tacaacgacc gcgagcgtct ccagatatac atctccgacg ctggcatcct 420 cgccgtctgc tacggtctcc 440 <210> 5 <21 > 29 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 5 cccggggcgt cctaaccggc gtctgggtc 29 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 6 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 6 ggtaccgaga ccgtagcaga cggcgagg 28 <210> 7 <211> 441 <212> ADN <213> Brassica napus <400> 7 cgagaccgta gcagacggcg aggatgccag cgtcggagat gtatatctgg agacgctcgc 60 ggtcgttgta gatgggagcg ttggggtgga aatggcaagc gaagccgccg tcgtaaggtc 120 ttcccgagac gttgaaggct aagtacaacg gccagccgag agtgaactga accgttaaca 180 tcacggtgcg tcccaaaggg ttgttgaggt acttgccgta ccacttgatg tctgacttct 240 tcttggggac aaacacttcg tctctctcga gggagccagt gttggaatgg tggcgtcgat 300 gactgtactt ccaggagaag taagggacga ggaggaagga gtggaagatg agaccgacgg 360 tgtcgtcaag ccactggtag tcgctgaagg cgtggtggcc gcactcgtgg gctatgaccc 420 agacgccggt taggacgccc c 441 <210> 8 <211> 1729 <212> ADN <213> Zea mays <400> 8 ctgcagacac caccgctcgt ttttctctcc gggacaggag aaaaggggag agagaggtga 60 ggcgcggtgt ccgcccgatc tgctctgccc cgacgcagct gttacgacct cctcagtctc 120 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) agtcaggagc aagatgggtg ccggcggcag gatgaccgag aaggagcggg agaagcagga 180 gcagctcgcc cgagctaccg gtggcgccgc gatgcagcgg tcgccggtgg agaagcctcc 240 gttcactctg ggtcagatca agaaggccat cccgccacac tgctícgagc gctcggtgct 300 caagtccttc tcgtacgtgg tccacgacct ggtgatcgcc gcggcgctcc tctacttcgc 360 gctggccatc ataccggcgc tcccaagccc gctccgctac gccgcctggc cgctgtactg 420 gatcgcgcag gggtgcgtgt gcaccggcgt gtgggtcatc gcgcacgagt gcggccacca 480 cgccttctcg gactactcgc tcctggacga cgtggtcggc ctggtgctgc actcgtcgct 540 catggtgccc tacttctcgt ggaagtacag ccaccggcgc caccactcca acacggggtc 600 cctggagcgc gacgaggtgt tcgtgcccaa gaagaaggag gcgctgccgt ggtacacccc 660 gtacgtgtac aacaacccgg tcggccgggt ggtgcacatc gtggtgcagc tcaccctcgg 720 gtggccgctg tacctggcga ccaacgcgtc ggggcggccg tacccgcgct tcgcctgcca 780 cttcgacccc tacggcccca tctacaacga ccgggagcgc gcccagatct tcgtctcgga 840 cgccggcgtc gtggccgtgg cgttcgggct gtacaagctg gcggcggcgt tcggggtctg 900 gtgggtggtg cgcgtgtacg ccgtgccgct gctgatcgtg aacgcgtggc tggtgctcat 960 cacctacctg cagcacaccc acccgtcgct cccccactac gactcgagcg agtgggactg 1020 gctgcgcggc gcgctggcca ccatggaccg cgactacggc atcctcaacc gcgtgttcca 1080 caacatcacg gacacgcacg tcgcgcacca cctcttctcc accatgccgc actaccacgc 1140 catggaggcc accaaggcga tcaggcccat cctcggggac tactaccact tcgacccgac 1200 ccctgttgcc aaggcgacct ggcgcgaggc cagggagtgc atctacgtcg agcccgagga 1260 ccgcaagggc gtcttctggt acaacaagaa gttctagccg ccgccgctcg cagagctgag 1320 aggacgctac cataggaatg ggagcaggaa ccaggaggag gagacggtac tcgccccaaa 1380 gtctccgtca acctatctaa tcgttagtcg tcagtctttt agacgggaag agagatcatt 1440 tgggcacaga gacgaaggct tactgcagtg ccatcgctag agctgccatc aagtacaagt 1500 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) aggcaaattc gtcaacttag tgtgtcccat gttgtttttc ttagtcgtcc gctgctgtag 1560 gctttccggc ggcggtcgtt tgtgtggttg gcatccgtgg ccatgcctgt gcgtgcgtgg 1620 ccgcgcttgt cgtgtgcgtc tgtcgtcgcg ttggcgtcgt ctcttcgtgc tccccgtgtg 1680 ttgttgtaaa acaagaagat gttttctggt gtctttggcg gaataaaaa 1729 <210> 9 <211> 1804 <212> ADN <2 3> Zea mays <400> 9 ccgaaccgag gcggccaggc tccctcctcc ctcctcctcc ctgcaaatcg ccaaatcctg 60 caggcaccac cgctcgtttt cctgtgcggg gaacaggaga gaaggggaga gaccgagaga 120 gggggaggcg cggcgtccgc cggatctgct ccgacccccg acgcagcctg tcacgccgtc 80 ctcactctca gccagcgaaa atgggtgccg gaggcaggat gaccgagaag gagcgggagg 240 agcaggagca agtcgcccgt gctaccggcg gtggcgcggc agtgcagcgg tcgccggtgg 300 agaagccgcc gttcacgttg gggcagatca agaaggcgat cccgccgcac tgcttcgagc 360 gctccgtgct gaggtccttc tcctacgtgg cccacgacct ggcgaccgcc gcggcgctcc 420 tctacctcgc ggtggccgtg ataccggcgc tacccagccc gctccgctac gcggcctggc 480 cgctgtactg ggtggcccag gggtgcgtgt gcacgggcgt gtgggtgatc gcgcacgagt 540 gcggccacca cgccttctcc gaccacgcgc tcctggacga cgccgtcggc ctggcgctgc 600 actcggcgct gctggtgccc tacttctcgt ggaagtacag ccaccggcgc caccactcca 660 acacggggtc cctggagcgc gacgaggtgt tcgtgccgag gaccaaggag gcgctgccgt 720 ggtacgcccc gtacgtgcac ggcagccccg cgggccggct ggcgcacgtc gccgtgcagc 780 tcaccctggg ctggccgctg tacctggcca ccaacgcgtc gggccgcccg tacccgcgct 840 tcgcctgcca cttcgacccc tacggcccga tctacggcga ccgggagcgc gcccagatct 900 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) tcgtctcgga cgccggcgtc gcggccgtgg cgttcgggct gtacaagctg gcggcggcgt 960 tcgggctctg gtgggtggtg cgcgtgtacg ccgtgccgct gctgatcgtc aacgcgtggc 1020 tggtgctcat cacgtacctg cagcacaccc acccggcgct gccccactac gactcgggcg 1080 agtgggactg gctgcgcggc gcgctcgcca ccgtcgaccg cgactacggc gtcctcaacc 1140 gcgtgttcca ccacatcacg gacacgcacg tcgcgcacca cctcttctcc accatgccgc 200 actaccacgc cgtggaggcc accagggcga tcaggcccgt cctcggcgac tactaccagt 260 tcgacccgac ccctgtcgcc aaggccacct ggcgcgaggc cagggagtgc atctacgtcg 320 agcctgagat ccgcaacagc aagggcgtct tctggtacaa cagcaagttc tagccgccgc 1380 ttgctttttc cctaggaatg ggaggagaaa tcaggatgag aagatggtaa tgtctccatc 1440 tacctgtcta atggttagtc accagtcttt agacaggaag agagcatttg ggcttcagaa 1500 aaggaggctt actgcactac tgcagtgcca tcgctagatc taggcaaatt cagtgtgtct 1560 gtgcccatgg ctgtgagctt tgggtactct caagtagtca agttctcttg tttttgtttt 1620 tagtcgtcgc tgttgtaggc ttgccggcgg cggccgttgc gtggccgcgc cttgtcgtgt 1680 gcgtcttgct tttgtgtgcg ttcgtgctcc cttgtttttg tgtgcgttcg tgctcccttc 1740 gtgttgttgt aaaacactag tctggtgtct ttggcggaat aactaacaga tcgtcgaacg 1800 aaaa 1804 <210> 10 <211> 1543 <212> ADN <213> Zea mays <400> 10 cctgcaggta ccggtccgga attcccgggt cgacccacgc gtccgcatcc tcaaagcctc 60 cggttgcccg aagcagtcgc atctgctctt cgtggcaccg aactcttgga gcaatcaact 120 tttgaatcgt cgacaggaca gccgcgcgcg tcgtggcgaa ggctgcagga tggagcagca 180 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) gacgaagacg acgacacagc aagagggcaa aggcctcgcc accatggagc ggtcgatcgt 240 ggacaagccg ccattcacgc tagcggacct caggaaggcc atcccgccgc actgcttcca 300 gcgctcgctc atcaggtcct gctcctacct cgcccacgac ctcgccatcg ccgcggggct 360 cctgtacttg gctctggccg tcatccccgc cctcccgggc gtcctcctcc gcgccgccgc 420 ctggccgctc tactgggcgg cgcagggcag catcatgttc ggcgtgtggg tgatcgcgca 480 cgagtgcggg cacagcagct tctcccgcta cggcctcctc aacgacgccc tcggcctggt 540 gctgcactcg tgcctcttcg cgccctactt ctcgtggaag tacagccacc agcgccacca 600 cgccaacacc gcgtccctgg agcgcgacga ggtgttcgtg cccaagcaga ggcccgagat 660 gccgtggtac tccccgctcg tgtacaagcg cgacaacccc gtcgcccggc tggtcctcct 720 cgccgtgcag ctcaccgtcg gctggcccat gtacctggcg ttcaacacct ggggccgccg 780 ctactcccgc ttcgcgtgcc acttcgaccc ctacagcccc atctacggcg accgggagcg 840 cgcccagatc gccgtctccg acgccggcgt cctggccgtg tcgttcgcgc tgtacaggct 900 cgccgcggcc cacgggctct ggcccgtggt cagcgtctac ggcgtgccgc tgctggtgac 960 gaacgcctgg ctcgtggtgg tcacgtacct gcaccacacg caccgcgcgc tcccgcacta 1020 cgactccagc gagtgggact ggatgcgcgg ggcgctcgcc accgtcgacc gcgactacgg 1080 cgtcctcaac cgcgtgttcc accacatcgc cgacacgcat atcgctcacc atctcttccc 1140 ggccattccg cactaccacg ccatggaggc caccagagcg atccgtcctg tcctcggcga 1200 ctactaccgc tccgatagca cgcccatagc cgaggcgctc tggcgcgagg ctaaagagtg 1260 catctacgtc cagcgcgacg accagaaggg cgtattttgg tacaagaacg tgttctagct 320 gcagagctgc tggacgacgc aaaccccgag cggagccata ggggcacaga aataatatta 380 tttgtggtct tgtacatttt gttatatatt taccttgcac atgtcacaaa taaaaaactg 1440 gcatatatat ataacaaaat gtatactata cgtatatata tgtatcatct tgtgttatat 1500 gttaaatgtt taagatgttt taaatgccaa aaaaaaaaaa aaa 1543 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 11 <2 1> 774 <212> ADN <213> Zea mays <400> 11 ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg tccgagcctc tcgctgtgca 60 ttgaccagcg cagagacaag tagagcaggg agggaagccc aícgtgtgtt tctcagtccc 120 agtcagcagc atggctgccg gcgtcgcaac ggcggaggag atcaggaaga agagccactc 180 gggcggtgtg cggcggtcgc cggtggacag gccgccgttc acgctggggg acatcaagag 240 ggccatcccg ccgcactgct tccagcgctc ggcgctcagg tccttctcgt acctcctcca 300 cgacctcgcc atcgcggccg ggctcctgta cctggccgtg gcgggcatcc cggcgctccc 360 gagcgccgcg ctccgccgct tcgtggcgtg gccgctctac tgggcggcgc agggcagcgt 420 gctgacgggc gtctgggtca tcgggcacga gtgcggccac cacgccttct ccgactaccc 480 gctcctggac aacgccgtcg gcttcgtgct ccactccgcg ctgctcacgc ccttcttcgc 540 ctggaagtac agccaccggc gccaccacgc caacaccggc tccatggaga acgacgaggt 600 gtacgtggcc aagacccggg acgcgctgcg gtggtacacg ccgctcgtgt tcggcaaccc 660 ggtcggccgg ctggtgtaca tcgcgctgca gctcaccctc gcgtggccgc tctaccfggc 720 gttcaacctc tcagggcaga actacggcgg ccgctctaga ggatccaagc ttac 774 <210> 12 <2 1> 29 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 12 ttgggcccac cgtcttcggt acgcgctca 29 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 13 <2 > 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 13 gcaggcctcc gcttggtatc tgcattac 28 <210> 14 <211> 820 <212> ADN <2 3> Zea mays <400> 14 ttgggcccac cgtcttcggt acgcgctcac tccgccctct gcctttgtta ctgccacgtt 60 tctctgaatg ctctcttgtg tggtgattgc tgagagtggt ttagctggat ctagaattac 120 actctgaaat cgtgttctgc ctgtgctgat tacttgccgt cctttgtagc agcaaaatat 180 agggacatgg tagtacgaaa cgaagataga acctacacag caatacgaga aatgtgtaat 240 ttggtgctta gcggtattta tttaagcaca tgttggtgtt atagggcact tggattcaga 300 agtttgctgt taatttaggc acaggcttca tactacatgg gtcaatagta tagggattca 360 tattataggc gatactataa taatttgttc gtctgcagag cttattattt gccaaaatta 420 gatattccta ttctgttttt gtttgtgtgc tgttaaattg ttaacgcctg aaggaataaa 480 tataaatgac gaaattttga tgtttatctc tgctccttta ttgtgaccat aagtcaagat 540 cagatgcact tgttttaaat attgttgtct gaagaaataa gtactgacag tattttgatg 600 cattgatctg cttgtttgtt gíaacaaaat ttaaaaataa agagtttcct ttttgttgct 660 ctccttacct cctgatggta tctagtatct accaactgac actatattgc ttctctttac 720 atacgtatct tgctcgatgc cttctcccta gtgttgacca gtgttactca catagtcttt 780 gctcatttca ttgtaatgca gataccaagc ggaggcctgc 820 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 15 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 15 cctgcaggag ctcagagctg agaggacgct acca 34 <210> 16 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 16 gtggatccac taagttgacg aatttgcc 28 <210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 17 gtggatccgt gtgtctgtgc ccatggctgt 30 <210> 18 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <400> 18 cgatatcggg cccgtgtttt acaacaacac gaagg <210> 19 <211 > 447 <212> ADN <213> Zea mays <400> 19 cctgcaggag ctcagagctg agaggacgct accataggaa tgggagcagg aaccaggagg 60 aggagacggt actcgcccca aagtctccgt caacctatct aatcgttagt cgtcagtctt 120 ttagacggga agagagatca tttgggcaca gagacgaagg cttactgcag tgccatcgct 180 agagctgcca tcaagtacaa gtaggcaaat tcgtcaactt agtggatccg tgtgtctgtg 240 cccatggctg tgagctttgg gtactctcaa gtagtcaagt tctcttgttt ttgtttttag 300 tcgtcgctgt tgtaggcttg ccggcggcgg ccgttgcgtg gccgcgcctt gtcgtgtgcg 360 tcttgctttt gtgtgcgttc gtgctccctt gtttttgtgt gcgttcgtgc tcccttcgtg 420 ttgttgtaaa acacgggccc gatatcg 447 <210> 20 <211 > 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 20 cctgcaggag ctctgtgatc cccaacttgc tg <210> 21 <21 1> 24 <212> ADN <213> Artificial LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <220> <223> iniciador <400> 21 ctgacacaaa cgaggaagta cgct 24 <210> 22 <211> 267 <212> ADN <213> Zea mays <400> 22 cctgcaggag ctctgtgatc cccaacttgc tgtggcgtgg tagttggatc gtgtttaggc 60 aagaaagtaa atgcgatcat gcacggcata tttgccacct tcctgggaga cgccccctcg 20 tgccgtgatc tgttttactt tggttgattg gtggcctttc tcgtggttca cgtgacagct 80 tttctgatgg gatgagatca ctgtaatgtt gttgcttgat tcacgctcgc ttgatcttac 240 tgtagcgtac ttcctcgttt gtgtcag 267 <210> 23 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 23 gtacttcctc gtttgtgtca ggcaagaaag tgatgc 36 <210> 24 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para aumentar el contenido de aceite en una semilla, que comprende: (A) transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende, como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia de ácido nucleico estructural capaz de modular el contenido de ARNm FAD2 o proteína FAD2; y (B) desarrollar dicha planta. 2 - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta es Arabidopsis. 3.- El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta es el maíz. 4.- El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta es la cañóla. 5. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho promotor es un promotor específico de semilla. 6. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho promotor específico de semilla se selecciona del grupo que consiste de promotor de napina, promotor de inhibidor de tripsina de soya, promotor ACP,

Claims (1)

1. 52 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <400> 24 cgatatcggg cccattttcg ctggttgctg ge 32 <210> 25 <211> 260 <212> ADN <213> Zea mays <400> 25 gtacttcctc gtttgtgtca ggcaagaaag tgatgcggtc gtgcacggca catgccagct 60 ttgtgggagc cgcccctaac cctcgctgaa tcagtcagta gtgccaactt gctagagttt 120 tttttcttct tgttttggtt cactcgacag atttttgttt ggatgagatc gctgcaacat 180 tgttcttgat ccacacttgc ctgatcttac cgtctcgttc gtgttcgtgc cagcaaccag 240 cgaaaatggg cccgatatcg 260 <210> 26 <211> 506 <212> ADN <213> Zea mays <400> 26 cctgcaggag ctctgtgatc cccaacttgc tgtggcgtgg tagttggatc gtgtttaggc 60 aagaaagtaa atgcgatcat gcacggcata tttgccacct tcctgggaga cgccccctcg 120 tgccgtgatc tgttttactt tggttgattg gtggcctttc tcgtggttca cgtgacagct 180 tttctgatgg gatgagatca ctgtaatgtt gttgcttgat tcacgctcgc ttgatcttac 240 tgtagcgtac ttcctcgttt gtgtcaggca agaaagtgat gcggtcgtgc acggcacatg 300 ccagctttgt gggagccgcc cctaaccctc gctgaatcag tcagtagtgc caacttgcta 360 gagttttttt tcttcttgtt ttggttcact cgacagattt ttgtttggat gagategetg 420 caacattgtt cttgatccac acttgcctga tcttaccgtc tcgttcgtgt tcgtgccagc 480 aaccagcgaa aatgggcccg atatcg 506 promotor de estearoil-ACP desaturasa, promotor de la subunidad a' de ß-conglicinina de soya, promotor de oleosina, promotor de ß-conglicinina, promotor del gen de globulina 1 de maíz y promotor de zeína. 7. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el contenido de proteína permanece esencialmente sin cambio en dicha semilla, en comparación con una semilla de una segunda planta que carece de dicha construcción de ácido nucleico. 8. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque en dicha semilla el contenido de ácido oleico aumenta y el contenido de ácido linoleico disminuye, en comparación con una semilla de una segunda planta que carece de dicha construcción de ácido nucleico. 9. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el porcentaje de aceite en dicha semilla aumenta en comparación con una semilla de una segunda planta que carece de dicha construcción de ácido nucleico. 10. - Un método para aumentar el contenido de aceite en una semilla, que comprende: (A) transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende, como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia de ácido nucleico estructural capaz de aumentar el contenido de ácido oleico; y (B) desarrollar dicha planta. 11. - Un gen quimérico que comprende el fragmento de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 , 4, 7-11 , 14, 19, 22, 25 y 26, o el complemento inverso del mismo, cualquier subfragmento funcionalmente equivalente del mismo, o el complemento inverso de dicho fragmento o subfragmento, en donde dichos fragmentos están ligados operativamente y, además, en donde la expresión del gen quimérico produce un aumento del contenido de aceite. 12.- Un método para aumentar el contenido de aceite en una semilla, que comprende: (A) transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende, como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 , 4, 7-11 , 14, 19, 22, 25 y 26, o el complemento inverso del mismo, cualquier subfragmento funcionalmente equivalente del mismo, o el complemento inverso de dicho fragmento o subfragmento; y (B) desarrollar dicha planta. 13.- El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha planta es Arabidopsis. 14. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha planta es el maíz. 15. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha planta es la cañóla. 16. - El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor específico de semilla. 17.- El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho promotor específico de semilla se selecciona del grupo que consiste de promotor de napina, promotor de inhibidor de tripsina de soya, promotor ACP, promotor de estearoil-ACP desaturasa, promotor de la subunidad a' de ß-conglicinina de soya, promotor de oleosina, promotor de ß-conglicinina, promotor del gen de globulina 1 de maíz y promotor de zeína. 18.- El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el contenido de proteína permanece esencialmente sin cambio en dicha semilla, en comparación con una semilla de una segunda planta que carece de dicha construcción de ácido nucleico. 19.- El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque en dicha semilla el contenido de ácido oleico aumenta y el contenido de ácido linoleico disminuye, en comparación con una semilla de una segunda planta que carece de dicha construcción de ácido nucleico. 20.- El método para aumentar el contenido de aceite en una semilla de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el porcentaje de aceite en dicha semilla aumenta en comparación con una semilla de una segunda planta que carece de dicha construcción de ácido nucleico.