TW201142022A - A gene of unsaturated fatty acid synthetic enzyme isolated from marchantia polymorpha and its use - Google Patents

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201142022 六、發明說明： 【發明所眉之技術領域】 本發明係關於來自地錢（Marchantia polymorpha)之不飽和 脂肪酸合成系基因，亦即Δ5脂肪酸不飽和化酵素、A6脂肪 酸不飽和化酵素及Δ6脂肪酸鏈長延長酵素之基因以及其之利 用。 【先前技術】 花生四烯酸及及二十碳五烯酸（以下，簡稱為EPA)等高度 不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid : PUFA)，在人類中多 被包含於以神經系統為主之細胞膜脂質中。此等高度不飽和脂 肪酸係所謂「前列腺素及白三烯」等生理活性物質之前驅體， 在藥理學方面非常重要。近年來，包含花生四烯酸及EPA之健 康食品已經上市。再者’脂肪酸由於亦為洗劑及生物分解性塑 膠之原料，所以在材料學方面亦頗受注目。 目前’高度不飽和脂肪酸藉由從培養微生物或魚油萃取而 生產。因此，生產成本高、能源使用量及廢棄物量大，尤其從 魚油調製之方法，魚資源有限等，皆成為問題。 花生四烯酸及EPA，曾分別以亞油酸(lin〇leic狀⑷及^· 亞油烯酸（α-linolenicacid)為起點’藉由所謂ΓΛ6不飽和化、 脂肪酸鏈長延長及Δ5不飽和化」之三連續反應而生合成。此 等反應分別以Δ6脂肪酸不飽和化酵素（以下簡稱為「Δ6不飽 和化酵素」）、Δ6脂肪酸鍵長延長酵素（以下簡稱為「八6鏈長 延長酵素」）及Λ5脂肪酸不飽和化酵素（以下簡稱為「Λ5不飽 201142022 和化酵素」）做為觸媒。 △ 6不飽和化酵素之基因曾在數種植物中被選殖。例如曾 從石夕藻、立碗蘚(Physcomitrium)、角齒蘚（Ceratodon)、琉璃苣 (Borago)、备、草加以丨⑽咖）、櫻草（primr〇se)及銀蓮花(Anem〇ne) 選殖出Δ6不飽和化酵素之基因。再者，植物以外，亦曾從絲 狀菌、線蟲、藍藻、大鼠(rat)及人類中選殖出^6不飽和化酵 素基因（參照非專利文獻1 .「Eur. J. Biochem. 269，p4105, 2002」、非專利文獻2:「Plant J. 15，P39, 1998」、非專利文獻3 : 「Eur. J. Biochem” 267. p3801，2000」、非專利文獻 4 :「proc· Natl· Acad. Sci. USA94, p4211，1997」、非專利文獻 5 :「Lipids 37, 417, 2002」、非專利文獻 6 :「FEBS Lett. 542, pi〇〇, 2003」、 非專利文獻7 :「Whitney et al” Planta Epub 2003」、非專利文 獻 8:「Lipids34，p649, 1999」、非專利文獻 9:「Gene，238，p445, 1999」、非專利文獻 ι〇 :「Biochem J. 330, ρ611 1998」、非專利 文獻 11 :「Plant Mol. Biol.，22, p293 1993」、非專利文獻 12 : 「Biochem. Biophys. res. Commun. 255, p575, 1999」、及非專利 文獻 13 :「J. Biol. Chem. 274，p471，1999」）。再者，除藍藻之 △ 6不飽和化酵素之外，此等Λ6不飽和化酵素在任一 N終端 存在細胞色素b5功能域(domain)。 △ 6鏈長延長酵素之基因最初係從絲狀菌及線蟲中選瘦出 (參照非專利文獻 14 :「Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97，p8284 2000」、及非專利文獻 15:「proc· Natl. Acad. Sci. USA 97, p6421 2000」）。在植物中’則只有從風鈴草（biuebell)中選瘦出（參照 非專利文獻 16 :「Plant J. 31，p255, 2002」）。 201142022 在酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)中，存在參與勒脂質 之長鏈飽和醯基鏈合成之EL02蛋白質及EL03蛋白質（參照非 專利文獻 17 :「J. Biol. Chem.，272，pl7376, 1997」），鏈長 延長酵素之胺基酸序列顯示與彼等具相同性。另一方面，在植 物中存在另一類型之脂肪酸鏈長延長酵素，即酮基醯基 CoA合成酵素(KCS)。該酵素能催化長鏈飽和脂肪酸/一價不餘 和脂肪酸之鏈長延長（參照非專利文獻15以及非專利文獻18 : 「Plant Cell 7, p309, 1995」）。但是，未見到Λ6鏈長延長酵素 基因及酵母EL02/EL03基因，與KCS基因在進化上有直接之 關係（參照非專利文獻15及16)。 △ 5不飽和化酵素之基因最初從絲狀菌選殖出（參照非專 利文獻 19 :「J. Biol. Chem. 273, p29360, 1998」、非專利文獻 20 :「J. Biol. Chem. 273, pl9055」）。Δ5不飽和化酵素之構造 與Δ6不飽和化酵素具共通性，在N末端具有細胞色素b5功 能域。Δ5不飽和化酵素基因可從矽藻、線蟲、大鼠、人類、 或立碗蘚等中選殖出（參照非專利文獻1、非專利文獻21 : 「FEBS Lett· 439, p215, 1998」、非專利文獻 22:「Arch. Biochem. Biophys· 391，p8, 2001」、非專利文獻 23 :「J. Biol. Chem. 274, p37 335, 1999」、及非專利文獻 24 :「J. Biol. Chem. 278, 35115, 2003」）。 陸上植物由苔蘇植物（苔蘚植物門（Bryophyta)、蕨類植 物、裸子植物及被子植物構成。苔蘚植物為陸上植物中最古老 之分枝群，由蘚類（蘚綱(Bryosida))、苔類（苔綱(Hepaticopsida) 及角蘇類三類構成。地錢，在分類上最近似上述生物中之立碗 201142022 蘚’但立碗蘚屬於蘚類，而地錢則屬於苔綱中之地錢亞綱 (Marchantiidae)。上述3群在約4億3千年前已經分歧乃為確 定之事。因此’立碗蘚及地錢縱使同屬苔蘚植物，例如二億年 刖分化成之阿拉伯芬(arabid〇psis)及水稻沒有什麼差異，但在 進化上大不相同。（參照非專利文獻25 htt^V/www.nibbxajprmhasebe/ Phvscomitrella html」)〇 關於來自地錢之高度不飽和脂肪酸合成系酵素基因，上述 KCS樣鏈長延長酵素基因中之MpFAE2及MpFAE3已可取得 (參,、、、非專利文獻 26 :「Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p6〇5, 」及非專利文獻 27:「Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, pl667, 2003」）。但是，MpFAE2及ΜρρΑΕ3非為八6鏈長延長 酵素基因。 ’雖然多個高度不飽和脂肪酸合成系酵素基因已從 各式各樣生物種中選殖出，但是花生酸、舰等⑽以上且不 為 以上之向度不飽和脂肪酸在植物中生產之例子尚 少。關於此等例孓 向 及W不姊化藻之和化酵素基因 基因在亞麻中表現2因以及來自立碗蘚之Δ6鏈長延長酵素 生產花生四烯酸及ΕΡΑ之報告，但其詳鈿 隋形不明（參考非專利文獻♦ 七田 如上述，筘4 由於藉由從騎及ΕΡΑ等高度不飽和㈣酸之生產， 能源使用量魚油中萃取而生產，有生產成本高、 及ΕΡΑ等高以及魚資源有限等問題點。花生四歸峻 鍵」之獨特物u脂肪酸由於具有所謂「分子内有複數個雙 亦可利用於各式各樣之工業用途（例如薄獏、 201142022 生物分解性塑膠、機能性纖維、潤滑油及洗劑等材料）。藉由 利用基因重組植物生產此等高度不飽和脂肪酸，可以減低生產 成本’同時可以期待實現更利於環境之生產製程。若使用基因 重組技術’可以在油糧植物中大量生產高度不飽和脂肪酸，將 在得到便宜之多目的原料上非常有用。 另一方面，在使異種生物之基因在植物中表現之情況，關 於該基因在植物内可發揮何種程度之良好機能，由於要經過轉 錄、轉譯、及其後之修飾等過程，因此難以預測。尤其在表現 複數個異種生物基因之情況，可以預測與上述非專利文獻2 所述之表現來自不同生物種之複數個基因相比，表現來自同· 生物種之複數個基因者在植物中將發揮較佳之機能。再者，^ 最早陸上植物之苔蘚類之地錢，在做為高等植物之模型系上s

到’主目’可以期待其之基因在植物内將具有良好的機能。E 此，若能取得來自地錢之高度不飽和脂肪酸合成酵素基因，〕 P△不飽和化酵素基因、^6+飽和化酵素基因及^6鍵長多 2素基因’則藉由將此等基因導人植物中，可以期待花生^ 烯酸及ΕΡΑ在植物内可以效率良好地蓄積。 5不^者雖然已從與地錢同屬苔蘚植物之立碗蘚中選殖出Ζ 和化酵素基目、Λ6不飽和化酵素基因及Α6鍵長延長番 但賴與立讀在進化上大不㈣，若要 ΐ基因取得賴之使具有現在之技術水準亦^ 【發明内容】 8 201142022 本發明’鑑於上述之先前問題點，因而其目的為提供可以 在高等植物中生產花生四稀酸及EPA之來自地錢之不飽和脂 肪酸合成酵素基因，亦即Λ5不飽和化酵素基因、Δ6不飽和 化酵素基因及Δ6鏈長延長酵素基因，以及其之利用法。 本發明者為解決上述課題深入檢討，結果從來自地錢 (Marchantia P〇lym〇rpha)之cDNA選殖株鑑定出編碼上述^石 不飽和化酵素、Δ5不飽和化酵素及鏈長延長酵素之基因， 再者，成功地將此等基因導入甲醇利用性酵母菌（pichia pastoris)及使其表現，並發現此等基因所表現之蛋白質分別具 有Δό不飽和化、Λ5不飽和化及Λ6鏈長延長之酵素活性，於 是完成本發明。亦即，本發明包含以下之發明： (1) 一種來自地錢目生物之基因’其在嚴苛條件下會與序列編 號1所示之鹼基序列構成之DNA之全部或—部分、或和該 DNA互補之鹼基序列構成之DNA之全部或一部分雜交了 且編碼具有Δ6脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 (2) —種編碼具有脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生物 之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記載之基因： (a) 具有序列編號1所示之驗基序列之基因；戍 (b) 在嚴苛條件下可與序列編號丨所示之驗基序列構成之 DNA、或和該DNA互補之鹼基序列構成之dna雜交之 基因。 (3) -種編碼具有Λ6脂减不飽和化活性且來自地錢目生物 之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記載之基因： ⑷具有序列編號1所示驗基序列中之第253至刪號之驗 201142022 基序列之基因； (b)在嚴苛條件下可與序列編號1所示鹼基序列中之第253 至1698號之鹼基序列構成之DNA、或和該DNA互補之 驗基序列構成之DNA雜交之基因。 (4) 種編鳴具有△ 6脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生物 之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記載之基因： (a) 編碼序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質之基 因； (b) 編碼序列編號2所示之胺基酸序列之丨個或以上之胺基 酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構成 之蛋白質之基因。 (5) —種來自地錢目生物之基因，其在嚴苛條件下會與序列編 號3所示之驗基序列構成之DNA之全部或一部分、或和該 DNA互補之驗基序列構成之DNA之全部或一部分雜交， 且編碼具有Δ6脂肪酸鏈長延長活性之蛋白質。 (6) —種編碼具有Λ6脂肪酸鍵長延長活性且來自地錢目生物 之蛋白質之基因’其係下列（a)或(b)中記載之基因： (a) 具有序列編號3所示之鹼基序列之基因；咬 (b) 在嚴苛條件下可與序列編號3所示之鹼基序列構成之 DNA、或和該DNA互補之驗基序列構成之DNA雜交之 基因。 (7) —種編碼具有Δ6脂肪酸鍵長延長活性且來自地錢目生物 之蛋白質之基因’其係下列（a)或(b)中記載之基因： ⑷具有序列編號3所示驗基序列中之第194至腿號之驗 10 201142022 基序列之基因； (b)在嚴苛條件下可與序列編號3所示鹼基序列中之第194 至1〇66號之驗基序列構成之DNA、或和該dNA互補之 驗基序列構成之DNA雜交之基因。 ⑻種編碼具有脂肪酸鏈長延長活性且來自地錢目生物 之蛋白質之基因，其係下列（a)或(b)中記载之基因： ⑻編碼序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質之基 因； (b)編碼序列編號4所示之胺基酸序列之丨個或以上之胺基 I經取代、刪除、插人及/或附加所成之胺基酸序列構成 之蛋白質之基因。 ⑼-種來自地錢目生物之基因’其在嚴苛條件下會與序列編 號5所示之驗基序列構成之DNA之全部或—部分、或和該 DNA互補之驗基序列構叙DNA之全部或—部分雜交， 且編碼具有△5不飽和化活性之蛋白質。 ⑽-種編碼具有脂肪酸不飽和化活性且來自地錢目生物 之蛋白質之基因，其係下列(a)或(b)中記載之基因： (a)具有序列編號5所示之鹼基序列之基因；或 ⑻在嚴苛條件下可與序列編號5所^之驗基序列構成之 DNA、或和該DNA互叙料序舰成之dna雜交 之基因。 (11) -種編碼具有Δ5脂肪酸不飽和化活性之來自地錢目生物 之蛋白質之基因，其係下列⑷或(b)中記載之基因： ⑷具有序列編號5所示驗基序列中之第375至贈號之 201142022 驗基序列之基因； =嚴苛條件下可與序列編號5所示驗基 至1829號之驗基序列構成之〇从 ^中之第375 之驗基序列構叙DNA雜交之基目。3和4 DNA互補 (12) -種編碼具有Δ5脂肪酸不飽和^性 之蛋白質之基因，其係下列⑷或⑻中自地錢目生物 ⑷編碼序列編號6所示之胺基=基因. 因； 汁夕】構成之蛋白質之基 ⑻編喝相編號6所示之絲酸 酸經取代、刪除、插入及/或附 或以上之胺基 成之蛋白質之基因。 Μ所成之胺基酸序列構 (13) -種蛋白質，係由上述⑴ 碼。 ）之任—者記载之基因所編 (14) 種如下列⑷或⑼之蛋白質： 編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質，· 列編號2所示之胺基酸序 經取代、酸 且具有△⑽酸不飽和化活性之:：序列構成’ ()種如下列⑷或⑻之蛋白質： 質。 C號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質. ⑻由序列編號4所示"|… 蛋質， 酸經取代、刪广、^ 財1個或以上之胺基 成，且罝有/、、f入及/或附加所成之胺基酸序列構 ⑽-種如㈣咖之蛋白質。 12 201142022 (a) 序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋白質； (b) 由序列編號6所示之胺基酸序列中丨個或以上之胺美 酸經取代、删除、插入及/或附加所成之胺基酸序列二 成，且具有△5脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 (17) —種抗體，其能識別上述（13)至（16)中任何一項之蛋白質 (18) —種重組表現載體，其包含至少上述至中任 之基因。 項 (19) 一種轉形體，其導入至少上述（1)至（12)中任何一項之美 因。 、土 (20) —種植物體或該植物體之組織，其係以可表現之方式導入 至少上述（1)至（12)中任何一項之基因之植物體，或與該植 物體具有相同性質之該植物體之子孫。 (21) —種植物體或該植物體之組織，其係以可表現之方式導入 至少上述（1)至（12)中任何一項之基因，以致脂肪酸組成被 改變之植物體’或與該植物體具有相同性質之該植物體之 子孫。 (22) —種上述(2〇)或（21)之植物體之繁殖材料。 (23) —種脂肪酸之生產方法，其係使用上述(21)之植物體或植 物體之組織。 (24) —種材料，其包含選自藉由上述P3)之脂肪酸生產方法所 得到之7-亞麻烯酸、升二碳亞麻烯酸、花生四烯酸、 十八碳四稀酸（stearidonic acid)、二十碳四烯酸及二十碳五 稀酸中之至少一種。 (25) —種改變脂肪酸組成之方法，其使用至少上述（1)至（12)中 13 201142022 任何一項之基因。 (26) —種基因檢測器具，其以上述（1)至（12)中住何一項之基因 之至少一部分之驗基序列或其之互補序列做為探針。 (27) —種調節上述（13)至（16)中任何一項之蛋白質之^基因或調 節該蛋白質之物質之筛選方法，其係使用上述（13)至（16) 中任何一項之蛋白質。 (28) —種藉由上述(27)之篩選方法得到之基因或物質。

又，在本說明書中，若無特別之限制，A、C、G&T 表示腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶等各鹼基。 本發明之其他目的、特徵及優點，從以下之記載中當 可明白。又，本發明之利益藉由參照附圖及以下之說明當 可明白。 【實施方式】 [實施發明之最佳形態] 本發明之實施之-形態，如以下所述。再者，本發明不受 其所限。 以下依照花生四馳及二十碳五烯酸(EpA)之合成路徑、 本發明之基因、本發明之蛋白f、本發明之蛋白質及基因之取 得方法以及本發明之基因及蛋白質之利用方法（有用性）之順 序，詳細地說明本發明。 (1)花生四烯酸及二十碳五烯酸(EPA)之合成路徑 咸認為花生四烯酸及二十碳五烯酸(EPA)分別以亞麻 酸及亞麻烯酸為起點，藉由所謂不飽和化、鏈 201142022 長延長及Δ5不飽和化之3連續反應，而被 應分別藉由Λό不飽和化酵素、A6鏈長 &成。此等反 飽和化酵素催化，且分職稱為η_6路長酵素及不 路徑）及η-3路徑(ΕΡΑ合成路徑）。 &化生四烯酸合成 至目前為止，被報告之Λ6不飽和化 長酵素及Λ5不飽和化酵素之任一者皆參、厶6鏈長延 二者。亦即，Λ6不飽和化酵素在η_6路：：6及η·3路徑 Μ9，12，18表示碳數，2表示雙鍵之數目二中將亞麻酸（Μ : 在η-3路徑中將α •亞麻烯酸(ALA ; i8 : 3 &)， 脂四烯酸（STA，18 : 4 △HAis卜’）變換為硬 n-6路徑中將GLA變換為升二碳_ j鏈長延長酵素在 3八8’11’14)，在11_3路徑中將似變換為^1埽酸(1^八；20: …△…，。△”飽和化酵素在^

變換為花生四烯酸20 : 4Λ5,8，ιι，ΐ4). 路佐中將DGLA 變換為二十碳五稀酸(EPa，2 二徑中將eta ⑺本發明之基因 Δ 卜 [本發明之Δ6不飽和化酵素基因] 聽ίΓ明之Λ6不飽和化酵素基因係編碼具有Mr肪酸 不飽和化活性之蛋白質之來知肪酸 以下條件之基因： 錢目生物之基因，即符合 r具有序列編號1所示之驗基序列之基因。 2.在嚴苛條件下可與序 _ _、或和該DNA之之驗基序列構成之 夂補之鹼基序列構成之DNA雜交之 15 201142022

3.在嚴苛條件下 T'k' T A

4.具有序列編 基序列之基 可與序列編號1所示之鹼基序列構成之 叩分、或和該DNA互補之鹼基序列構成之 部分雜交之基因。

至1698號之驗基序列係轉譯成序列編號2所示之胺基酸 序列構成之蛋白質之領域。 5.在嚴苛條件下可與序列編號丨解驗基序列巾之第⑸ 至1698就之驗基序列構成之DNA、或和該DNA互補之 鹼基序列構成之DNA雜交之基因。 6·編碼序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質之基 因。 7.編碼序列編就2所示之胺基g《序列之丨彳目或以上之胺基 取代、刪除、插人及/或附加所成之胺基酸序列構成 之蛋白質之基因。 [本發明之Λ6鏈長延長酵素基因] 本發明之Λ6鏈長延長酵素基因係編碼具有八6鏈長延 長酵素活性之蛋白質之來自地錢目生物之基因，即符合以 下條件之基因： 1. 具有序列編號3所示之鹼基序列之基因。 2. 在嚴苛條件下可與序列編號3所示之鹼基序列構成之 DNA、或和該DNA互補之鹼基序列構成2DNA雜交之 201142022 3. 在嚴苛條件下可與序列編號3所示之鹼基序列之構成之 DNA之一部分、或和該〇ΝΑ互補之鹼基序列構成之 DNA之一部分雜交之基因。 4. 具有序列編號3所示鹼基序列中之第194至1066號之鹼 基序列之基因。又’序列編號3所示鹼基序列中之第194 至1066號之鹼基序列係轉譯成序列編號4所示之胺基酸 序列構成之蛋白質之領域。 5. 在嚴苛條件下可與序列編號3所示鹼基序列中之第194 至1066號之驗基序列構成之DNA、或和該DNA互補之 驗基序列構成之DNA雜交之基因。 6. 編碼序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質之基因。 7. 編碼序列編號4所示之胺基酸序列之丨個或以上之胺基 鲅經取代、删除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構成 之蛋白質之基因。 [本發明之Δ5不飽和化酵素基因] 本發明之Δ5残和化酵素基因係編碼具有Δ5脂肪酸 不飽和化活性之蛋白質之來自地錢目生物之基因即符合 以下條件之基因： 1. 具有序列編號5所示之鹼基序列之基因。 2. 在嚴苛條件下可與序列錢$㈣线基序列構成之 Α或和°玄DNA互補之驗基序列構成之DNA雜交之 基因。 在嚴可條件下可與㈣編號5所示之録序列構成之 DNA之-部分、麵，⑽八互補线基序列構成之 17 201142022 DNA之一部分雜交之基因。 4 編號5所讀基序列中之第375至1829號之驗 基序列之基因。又，序列編號5所示驗基序列中之第奶 至⑽號之驗基序列係轉譯成序列編號⑽示之胺 序列構成之蛋白質之領域。 土 5.在嚴苛條件下可與序列編號5所*驗基相巾之第奶 至⑽號之驗基序列構成之臟、或和該職互補之 驗基序列構成之DNA雜交之基因。 6. 編碼序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋自質之基因。 7. 編碼序列編號6所示之胺基酸序列之i個或以上之土胺基 酸經取代、刪除、插人及或附加所成之胺基酸序列構二 之蛋白質之基因。 再者’上述「嚴苛條件」意指只有在至少9〇%同一性，較 佳至少95%同一性，最佳至少97%同一性存在於序列間時發生 雜交。

上述雜交可藉由在 J· Sambrook et al. Molecular Cloning A

Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)中記載之方法等先前公知之方法進行。通常溫度越高， 鹽濃度越低，嚴苛性越高（越不易雜交），可以取得相同性較高 之基因。關於雜交之條件，可以使用先前公知之條件，雖無特 殊限定，可列舉例如42°C、6xSSPC、50%曱醯胺、1%SDS、 100/zg/ml 鮭魚精子 DNA、5x丹哈德（Denhalt)液（lxSSPE; 0.18M 氣化鈉、10mM 磷酸鈉、pH7.7、ImMEDTA)。 上述所謂「地錢目生物」未限於地錢（Marchantia 201142022 polymorph)，包含屬於地錢亞綱之地錢目之生物。此等之中， 已知在小孢綠苔（Monoclea forsteri)(綠苔目）、花地錢（Corsinia coriandrina(地錢目）、古地錢（Oximitra paleacea)(地錢目）、浮苔 (Ricciocarpos natans)(地錢目）、稀枝錢苔（Ricca huebeneriana)(地錢目）、浮錢苔（Ricca fluitans)(地錢目）、雙錢 苔（Ricca duplex)(地錢目）、溝紋錢苔（Ricca canaliculata)(地錢 目）、二裂錢苔（Ricca bifurca)(地錢目）、齒毛錢苔（Ricca ciliifera)(地錢目）、青綠錢苔（Ricca glauca)(地錢目）、聚果錢苔 (Ricca sorocarpa)(地錢目）、Ricca warnstorfii(地錢目）、米契林 錢苔（Ricca michelii)(地錢目）、乳突錢苔（Ricca papiii〇sa)(地錢 目）及查氏錢苔（Ricca zachariae)(地錢目）中存在超長鏈長高度 不飽和脂肪酸（參照Prog. Lipid Res· 32, p281, 1993)。要從此等 生物取得Λ6不飽和化酵素、A6鏈長延長酵素及A5不飽和化 酵素之基因’若具有現在之技術水準為容易之事。舉例言之， 編碼具有近緣生物之相同機能之酵素之基因，一般已知可藉由 進行交叉雜交而得。 本發明之基因不僅包含雙股DNA’亦包含構成其之所謂 意義股及反義股之各單股0]^八及RNA。反義股可被利用做為 探針或反義化合物。DNA例如包含藉由選殖或化學合成技術 或彼等之組合所得到之cDNA及染色體組DNA等。再者，本 發明之基因可以包含非轉譯領域(UTR)之序列及載體序列（包 含表現載體序列）等序列。 (3)本發明之蛋白質 [本發明之Δ6不飽和化酵素蛋白質] 201142022 本發明之Λό不飽和化酵素蛋白質，以來自地錢 蛋白質且具有△6脂肪酸不飽和化活性之蛋白質為佳 而言，以以下所示之蛋白質為佳。 1. 藉由在上述(2)中記載之本發明Λ6不飽和化酵素 之蛋白質。 y 2. 序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質。 丨.序列編號2所示之胺基酸序列之丨個或以上之 代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構成ζ峻緩取 [本發明之Δ6鏈長延長酵素蛋白質] 白質 本發明之Δ6鍵長延長酵素蛋白質，以來自地錢目 更具 因蝙螞 蛋白質且具有Δ6脂肪酸鏈長延長活性之蛋白質為佳 而言，以以下所示之蛋白質為佳。 丨.=述⑺中記載之本發明鍵長延長酵素基 生物 之 更具體 因編碼 2. 序列編號4所示之胺基酸序列構成之蛋白質。 3. 序列編號4所示之胺基酸序列之 代、刪除、插M/或附加所叙胺錢序之胺基酸^取 [本發明之不飽和化酵素蛋白幻 冑成之蛋白質。 本發明之Δ5不飽和化酵素蛋白質，以來 白質且具有Δ5脂妨酸不飽和化活性之 2目生物之蛋 言，以以下所示之蛋白質為佳。 質為佳。更具體而 1=)中記載之本發明〜化酵素基因編 2.序列編號6所示之胺基酸序列構成之蛋白質。 20 201142022 3·序列編號6所示之胺基酸序列之1個或以上之胺基酸經 取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構成之蛋 白質。 上述所謂「Λ6脂肪酸不飽和化活性」意指對於亞麻酸或 α-亞麻埽酸具有基質特異性’可分別將其變換為亞麻烯酸 或硬脂四烯酸之作用。又，上述所謂「Δ6脂肪酸鏈長延長活 陡」思指對於r-亞麻烯酸或硬脂四烯酸具有基質特異性，可 :、隻換為升一奴-γ-亞麻歸酸或二十碳四稀酸之作用。 上述所謂「Α5脂肪酸不飽和化活性」意指對於升二碳- ^歸^或二十碳四稀酸具有基質特異性’可分別將其變 、為化生四烯酸或二十碳五烯酸(EPA)之作用。 或附=塊Γ謂「1個或以上之胺基酸經取代、刪除、插入及/ 製作法Y忍指藉由部位特異性突變誘發法等公知之突變蛋白質 佳，以7將可取代、删除、插入及/或附加數目（以10個以下為 代、除、^下為較佳，以5個以下為更佳）之胺基酸予以取 藉由公^之ί入及7或附加。如此突變之蛋白質，不限於具有 藉由單變蛋白質製作法人為導入之突變之蛋白質，亦可 再在之同樣突變蛋白質而得。 為佳，隹非限^之蛋白質以胺基酸藉由肽鍵鍵結而成之多狀 其中，做為夕壯此’可為含有多狀以外之構造之複合蛋白質。 等’但無特‘限：外之構造者’可列舉糖鏈及異戊二烯類基 又，本發明之 等多狀之情、、兄 白質可為包含附加之多肽者。在附加有此 例如可列舉本發明之蛋白質以ms&Myc、Flag 21 201142022 標識抗原決定部位之情況。 本發明之蛋白質可為將上述本發明之基因（編碼本發明蛋 白質之基因）導入宿主細胞並使該蛋白質在細胞内表現之狀 態，亦可為從細胞及組織等單離精製之狀態。又，關於在上述 宿主細胞中之表現條件，本發明之蛋白質可為與其他蛋白質未 融合之蛋白質。再者，本發明之蛋白質可為化學合成者。 (4)本發明之蛋白質及基因之取得方法 本發明之蛋白質及基因之取得方法（生產方法）無特殊限 定，代表性之方法例如為以下所示之各方法。 [蛋白質之取得方法] 取得本發明蛋白質之方法（生產方法），如上述無特殊限 定，首先可列舉從表現本發明之蛋白質之細胞及組織單離及精 製之方法。對於精製之方法亦無特殊限定，可藉由公知之方法 從細胞及組織中調製細胞萃取液，然後使用公知之方法（例如 管柱等）精製該細胞萃取液。 又，取得本發明蛋白質之方法，可列舉使用基因重組技術 等之方法。在該情況，例如可以採用「將本發明之基因導入載 體中後，藉由公知之方法導入可表現之宿主細胞中，使其在細 胞内轉譯，然後將上述蛋白質精製」之方法等。 再者，將外來基因導入此等宿主之情況，由於在供表現外 來基因用之插入宿主内機能性啟動子之表現載體及宿主有各 式各樣，因此宜視使用目的而選擇。精製所產生蛋白質之方 法，雖視所用宿主及蛋白質之性質而異，但藉由利用標籤，可 以比較容易地精製目的蛋白質。 22 201142022 關於製作突變蛋白質之方法，無特殊限定。例如可以使 用：利用部位特異性突變誘發法(Hashimoto_Gotoh，Gene 152 271-275 (1995))或PCR法在鹼基序列中導入點突變而製作突變 蛋白質之方法，或者藉由插入轉位子(transposone)之突變株製 作法等周知之突變蛋白質製作法。突變蛋白質之製作亦可以利 用市售之套組。 本發明之蛋白質之取得方法，不受上述方法所限，例如可 藉由化學合成者。舉例言之，可利用無細胞系之蛋白質合成液 從本發明之基因合成本發明之蛋白質。 [基因之取得方法] 取得本發明之基因之方法（生產方法）雖無特殊限定，例如 可以利用差示篩選（減差選殖（subtractj〇n ci〇ning))之方法。在 該方法中，依照公知之技術，重覆進行在試管内之直接雜交， 可以濃縮目的cDNA(本發明之基因）。 上述差示篩選之各步驟可在通常使用之條件下進行。如此 得到之選殖株，藉由限制酵素圖譜之作成及其之鹼基序列決定 (sequencing)，可以更詳細地解析。藉由此等解析可以取得或容 易地確認包含本發明基因序列之DNA片段。 再者，關於取得本發明基因之方法，可列舉藉由公知之技 術單離及選包含本發明基因之DNA片段之方法。例如，調 製與本發明之基因之驗基序列之一部分特異性雜交之探針，可 以篩選染色體組DNA庫及cDNA庫。關於此等探針，若為與 本發明基因之鹼基序列或其之互補序列之至少一部分 雜交之探針，則可使用任一序列及長度。 、' 23 201142022 又’若從在上述地錢間被良好保存之領域中選擇上述探針 之序列’然後篩選其他地錢之染色體組DNA(或cDNA)庫，可 以單離及選殖出編碼具有與上述蛋白質同樣之機能之相同分 子及類緣分子之基因。 或者，取得本發明基因之方法例如為使用PCR等增幅手 段之方法。舉例言之，分別從本發明基因之cDNA序列中之5, 侧及3’側之序列（或其之互補序列）調製引子，使用此等引子做 為染色體組DNA(或cDNA)等之模板進行pCR等，藉由增幅兩 引子間所挾持之DNA領域，可以大量地取得包含本發明基因 之DNA片段。 (5)本發明之基因及蛋白質之利用方法（有用性） (5-1)重組表現載體 本發明之重組表現載體，若為包含上述(2)中記載之本發明 基因者’將無特殊限定。例如可列舉插入cDNA之重組表現載 體。在重組表現載體之製作上，可以使用質體、噬菌體或黏接 質體(cosmid)，但無特殊限定。又，製作方法亦可使用公知之 方法進行。 載體之具體種類無特殊限定，宜選擇在宿主細胞中可以表 現之載體。亦即，為了確實地表現基因，視宿主細胞之種類選 擇適當之啟動子，並使用將該啟動子與本發明之基因插入各種 質體等中者做為表現載體。 為了確認本發明之基因是否被導入宿主細胞中，以及在宿 主細胞中是否確實表現’可以使用各種標記。例如’使用在宿 主細胞中缺失之基因做為標記’將包含該標記及本發明基因之 24 201142022 質體等作為表現載體導人宿主細胞中。藉此可以從標記基因之 表現確認本發明基因之導人。或者，本發明之蛋白質可以融合 蛋白質之形式表現。例如可使用來自水母之綠色螢光蛋白質 GFP(Green Fl0順cent Protein)做為標記，而以GFp融合蛋白 質之形式表現本發明蛋白質。 上述宿主細胞，無特殊限定，適合使用先前公知之各種知 胞。具體而言，例如可以列舉大腸菌（Esehedehiae()ii)等細菌、 酵母（出芽酵母（Saccharomyces⑽仏㈣、分裂酵母 (Schizosaccharomyces pombe))，^ A(Caenorhabditis elegans) ^ 非洲爪«(XenGpuslaevis)之㈣細料，不過無特殊限定。 對於上述表現載體導入宿主細胞之方法，亦即轉形方法無 特殊限疋彳以適當地❹電氣穿孔法、罐賴法、核糖體法、 DEAE葡聚糖法等先前公知之方法。又，例如將本發明之蛋白 質在昆蟲巾轉移表現之情況，可以剌使料狀病毒之表現 系。 (5-2)轉形體 依照本發明之轉形體4為導人上述(2)記載之本發明基因 之轉开》體，將無特殊限定。装φ 紐繃Μ- β 其中月轉形體」不僅包含細胞、 、、且織及器g，亦包含生物個體。 =體之製作方法(生產方法)雖無特殊蚊，但可列 j重組表現載體導人宿主細胞之轉形方法。又，對於為轉形 對象之生物無特殊限定，可以丨嫉 _ 種微生物及動物。 依照本發明之轉形體，較佳為以可表現方式導人本發明基 25 201142022 因之植物體、或成為與該植物體具有同一性質之該植物體之子 孫之植物體、或此等植物體之組織。藉由此等轉形植物，可用 低成本且利於環境之生產製程生產花生四烯酸及£PA等高度 不飽和脂肪酸。 其中，所謂「以可表現方式導入基因」意指藉由公知之基 因工程手法(基因操作技術），以可表現方式導入對象細胞（宿主 細胞）内。 植物體轉形所使用之重組表現載體，若可以在該植物細胞 内表現插入基因，將無特殊限定。舉例言之，可以使用具有在 植物細胞内能恆常地表現基因之啟動子（例如花椰菜花葉病毒 (Cauliflower mosaic virus)之35S啟動子）之載體，或者具有被 外來刺激誘導而活性化之啟動子之載體。再者，在該植物細胞 中，包含各種形態之植物細胞，例如懸浮培養細胞、原生質體、 葉之切片及癒合組織等。 將重組表現載體導入植物細胞可採用聚乙二醇法、電穿孔 法（electroporation 法）、經由土壞桿菌（Agr〇bacterium)之方法、 粒子搶(particle gUn)法等本技藝人士公知之方法。轉形細胞從 植物體之再生，視植物細胞之種類，可以本技藝人士公知之方 法進行。 舉例言之，關於製作菸草轉形體之方法，現已確立數種技 術，諸如使轉形之土壌桿菌感染煙草葉圓片之方法、使用聚乙 二醇將基因導入原生質並使植物體再生之方法、藉由電脈衝將 基因導入原生質並使植物體再生之方法、藉由粒子搶法將基因 直接導入細胞並使植物體再生之方法等。在本發明中此等方法 26 201142022 均適用。 又，於草，與阿拉伯芥同為使用遺傳工程手法進行植物育 種之模型植物。在該菸草中，拚μ「^、 丁_再 _夕八旦^ 以取得花生四烯酸及 "η" 1形體」，縱使稱之為「可取得植物整體之 轉形體」亦不為過。再者，在本說明書中，如下述實 不僅可以轉科之_體，亦可轉水狀轉卵；證明依 照本發明’可以取得所有種類之轉形植物體。 舉例言之，關於製造水稻轉形植物體之手法，現已確立數 種技術，諸如使料乙二醇將基因導人原生質並使植物體再生 之方法、藉由電脈衝將基因導人原生質並使植物體再生之方 法、藉由粒子搶法將基因直接導入細胞並使植物體再生之方法 等。在本發明中此等方法均適用。 上述轉形體為水稻之情況，由於水翻之花生四稀酸及 ΕΡΑ之含量增加’從該轉形植物體得到之種子，亦即藉由食用 稻米，可容易地將花生四稀酸及ΕΡΑ等高度不飽和脂^酸攝取 至體内。因此’水稻之轉形植物體做為食糧之價值高在食品 產業及農業領域中極為有用。再者，若在現在不大被利用之米 糠、稻殼、胚芽等中生產花生四烯酸及ΕρΑ，則藉由從此等中 萃取出脂肪酸’可有效地利用做為健康食品之原料。又亦可 利用做為家畜之飼料。 -旦得到在染色體組内導人本發明基因之轉形植物體，可 藉由有性生殖或無性生殖從該植物體得到子孫。再者，從該植 物體、或其之子孫或選殖株得到繁殖材料(例如種子、果實、 切穗、塊莖、塊根、株、癒合組織、原生質等），基於此等可 27 201142022 量產該植物體。在本發明中亦包含：以可表現方式導入本發明 基因之植物體或成為具有與該植物體同一性質之該植物體子 孫之植物體，或者該植物體之組織或該植物體之繁殖材料。 又，在植物體、成為具有與該植物體同一性質之該植物體 子孫之植物體及該植物體之組織中，亦包含被營養增殖之植物 體。營養增殖亦被稱為營養繁殖、選殖株成長，一般係藉由插 芽、插枝等來增殖，亦可在試管内，藉由來自葉、莖、根等器 B之植物體之再分化或癒合組殖來增殖。視植物之種類，可將 枝之先端做成特殊之冬芽、將腋芽多肉化將花珠芽化及形成 芋等。 再者，本發明亦包含以可表現料導人本發喊因且脂! 酸組成改變之植物體，或成為具有與該植物體同—性質之糾 物體子孫之㈣體，或者該漏紅_或雜㈣之繁幻 料。、所謂「脂肪酸組成改變」意指在轉形前植物體中之脂肪遷 組成與轉形後植物體中之脂㈣組成不同。舉例#之，將原> 月旨肪酸組成中不包含花生四稀酸及腿之植物體藉由本發: 【因轉形後’轉形植物之脂肪酸組成中包含花生四烯㊆ (5-3)脂肪酸生產方法 本發明包含使用以本發明基因轉形且脂肪酸組成 植物體或植物體之組織生產脂肪酸之方法。 例如’從如上述之花生四烯酸及EpA之含量增加之本發 ，形植物製得之食用油，似生四烯酸及EPA之含量高而價值 商者。上述轉形植物體之種子、果實、切穗、塊莖、塊根等作 28 201142022 為含花生四烯酸及EPA之食物材料時， ^ (5-4)材料 續高。 在本發明中，亦包含藉由上述脂肪酸 質，亦即含有[亞麻浠酸、升二碳个亞麻方法得到 <物 硬脂四烯酸、二十碳四埽酸及二十碳五缔、生四％峻、 切穗 料。 料。所謂「材料」’除意指做為上述食物 ^少1切 、塊莖或塊根之外，亦指可利用做 種子、果 業·用〜 =於上述材料，例如可列舉含花生四埽 品、薄膜、生物分解性塑膠、機能性纖 Μ之健康食 料。上述不飽和脂肪酸具有所謂「在子〜月油、洗劑等材 之獨特物性。因此，例如藉由利用本發^内具魏數個雙鍵」 生稀酸及EM，可使生產成本降低 ==生= 實現利於環境之生產製程。 籍由本發明，可以 (5-5)脂肪酸組成之改變方法 在本發明巾’包含㈣本發明 法。例如，如上述，藉由制你道文變知肪酸組成之方 .^ 乍導入本發明基因之轉形體，可以 改變佰主細胞之脂肪酸組成。 殊限定，除植物以外，可以^2月曰肪酸組成之對象無特 對象。 動物、，，田菌、酵母等所有生物做為 (5-6)基因檢測器具 驗基具，係使用本發明基因之至少， 於在各種條件下進行本^為探針者°基因檢測器具’可利用 月基因之表現圖譜之檢測及測定等。 29 201142022 關於本發明之基因檢測器具，例如可列舉將與本發明基因 可特異性雜交之上述探針固定於基盤（載體）上而成之DNA晶 片。其中所謂「DNA晶片」雖主要意指以合成寡核苷酸做為 探針之合成型DNA晶片，但亦包含將PCR產物等cDNA用於 探針之貼附型DNA微陣列。 用作探針之序列，可藉由特定化來自cDNA序列中之特徵 序列之先前公知方法決定。具體而言，例如SAGE: Serial

Analysis of Gene Expression 法(Science 276:1268，1997 ; Cell 88 ： 243, 1997 ； Science 270:484, 1995 ； Nature 389:300, 1997 ； 美國專利第5,695,937號）。 再者，在DNA晶片之製造上，可採用公知之方法。例如， 使用合成寡核苷酸做為寡核苷酸之情況，藉由光微影術 (photolithography)與固相法DNA合成技術之組合，可以在該 基盤上合成該募核普酸。另一方面，在使用cDNA做為寡核：g： 酸之情況，可使用陣列機將其貼附於基盤上。 又’與一般DNA晶片同樣，配置成完全正確配對之探針（寡 核苷酸）以及在該完全正確配對之探針中有一驗基被置換之錯 配探針，基因之檢測精確度可更為提高。再者，為了同時檢測 出不同之基因，亦可將複數種募核苷酸固定於相同基盤上，構 成DNA晶片。 本發明之基因檢測器具，對於上文例示之DNA晶片無特 殊限定，可用本發明基因之至少一部分之鹼基序列或其之互補 序列做為探針。 (5·7)抗體 201142022 本發明之抗體，係以本發明之蛋白質或其部分蛋白質及部 ^胜肽做為抗原’藉由公知方法Μ株抗體或單株抗體得到之 抗體。關於公知之方法，例如為文獻(黯1qw等人之「An伽出以 A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988) ’ ^•崎等人之「單株抗體融合瘤及elisa，講談社 (1991)」）記載之方法。如此得到之抗體，可利用於本發明蛋白 質之檢測及測定。 (5-8)篩選方法 本發明之筛選方法，係使用本發明之蛋白質，篩選調節該 蛋白質之基因或調節該蛋白質之物質之方法。本發明之篩選方 法，可使用先前公知之各種調查物質間是否結合或是否解離之 方法，而無特殊限定。例如可以列舉促進本發明蛋白質之活性 (△6不飽和化活性、鏈長延長活性及/或^5不飽和化活性） 之物質之篩選法。 再者，本發明包含藉由上述篩選方法得到之基因或物質。 以下，雖例示實施例以詳細說明本發明，但本發明當然不 受以下實施例所限，細節部分不用說當然亦可有各種可能。再 者，本發明不限於上述之實施形態，可在申請專利範圍所示之 範疇中進行各種變更；將所揭示之技術手段適當地組合所得之 實施形態亦包含於本發明之技術範疇中。 [實施例] 在本實施例中’實驗手法若無特殊指定，將依照在 Molecular Cloning(Sambrook et. al. Cold Spring Harbour Laboratory Pess，1989)中記載之方法。 31 201142022 [實施例1 :來自地錢之△ 6不飽和化酵素基因之單離] 藉由比對至目前為止被選殖之Δ6不飽和化酵素之胺基酸 序列，可知胺基酸序列 Trp - Trp - Lys - (Glu/Asp) - Lys - His -Asn(序列編號 37)及 Trp - Phe · Thr - Gly - Gly _ Leu - Asn(序列 編號38)被保存。因此，為了單離來自地錢之Λ6不飽和化酵 素基因，使用編碼上述胺基酸序列之下述簡併引子： dA6DES - F 5J - TGGTGGAA(A/G)GA(A/G/T/C)AA (A/G) CA(T/C)AA - 3’（序列編號 7) dA6DES - R 55 - (A/G)TTIA(A/G)ICCICCIGT(A/G)AACCA - 35 (序列編號8) (I表示肌苷，（）内為複數個鹼基） 在試料方面，使用E系統地錢（參照Transgenic Res. 9, pl79, 2000)之葉狀體。從葉狀體單離聚(A)+RNA，係依照文獻 (Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p605, 2003；Biosci. Biotechnol. Biochem. 67，pl667, 2003)中記載之方法。使用 Ready-To-Go T-primed First Strand套組（Amersham公司製），將單離之聚 (A)+RNA 1.5 /z 1 轉錄成 cDNA。PCR，係以上述 cDNA 約 10 ng 做為模板，使用上述引子(dA6DES-F及dA6DES-R)及酵素 (Takara Ex Taq，Takara公司製）0.5U，並以製造者推薦之方法進 行。將反應液量調為20以卜使用GeneAmp PCR系統9700 (PE Applied Biosystems公司製），於94°C保持2分鐘後’反覆進 行「94。(：/1分鐘、45°C/1.5分鐘及72°C/2分鐘」之反應35次’ 然後冷卻至4°C。 將所得PCR產物在l%(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳’使用 32 201142022

Prep-AGene(Bio-rad公司製），從凝膠回收具有從先前Δ6不飽 和化酵素之胺基酸序列預測之尺寸之增幅片段。將回收之增幅 片段連結至pT7Blue Vector (Takara公司製），然後用其轉形大 腸菌 Electro-max DH10B 細胞（Invitrogen 公司製，Carlsbad， CA)。 使用BigDye終結子循環定序套組（BigDye Terminator Cycle Sequencing kit)(Applied Biosystems 公司製）及自動化定 序機 ABI PRISM 377 (Applied Biosystems 公司製），決定所得 選殖株之全部鹼基序列，以探索具有目的cDNA序列者。 再者，為了取得全長之CDNA序列，進行5’-RACE及 3’-RACE。其中，使用迅速增幅cdNA末端用之5’-RACE系統 2.0 版(Invitrogen 公司製）、Ready-To-Go T-primed First Strand 套組（Amersham公司製）及下述引子（MpDES6-02R及 MpDES6-01F) ’並依照製造者推薦之方法進行。

MpDES6_02R : 5’-AAGTTGCCTTCGATGTTTCTGG-3,（序 列編號9)

MpDES6-01F ： 5’-GCTCGCCTGGAGCAAGGAAATC-3, (序列編號10) 結果單離出一種類似基因候選者，將該基因稱為MpDES6 基因。該被單離之MpDES6基因之cDNA之長度（除去聚A部 分）為2,522 bp，其所編碼之推定胺基酸序列為481殘基。將其 之鹼基序列示於序列編號1中，將其之胺基酸序列示於序列編 號2中。 將MpDES6cDNA之推定胺基酸序列與立碗蘚之A6不飽 33 201142022 和化酵素之胺基酸序列比較’結果只顯示47.5%之同一性。 [實施例2 :來自地錢之Δ6鏈長延長酵素基因之單離] 將至目前為止所選瘦出之鏈長延長酵素之胺基酸序列 加以比對，可知胺基酸序列Val - Glu - Phe ~ Met - Asp - Thr ·

Val (序列編號 39)及 Lys - Tyr - Leu - Phe - Trp - 〇ly _ Arg (序 列編號40)被保存。因此’為了单離來自地錢之鏈長延長 酵素基因，使用編碼上述胺基酸序列之下述簡併引子。 dA6ELO-F ： 5’ -GTIGA(A/G)TT(T/C)ATGGA(T/C)ACIGT- 3，（序列編號 n)

dA6ELO-R: 5, -C(G/T)ICCCCA(A/G)AAIA(A/G)(A/G)TA (T/C)TT-3 ’（序列編號 12)。 使用上述引子（dA6ELO-F及dA6ELO-R)進行PCR，將得 到之DNA片段分段選殖。決定得到之選殖株之鹼基序列，對 於具有目的cDNA序列之選殖株，使用下述引子(MpELOl-02R 及MpELOl-OlF)取得全長cDNA。又，實驗材料及方法與實施 例1同樣。

MpELOl-02R : 5，-GCGAGCTTTCTCGTTCTTTCCC-3,（序 列編號13)

MpELOl-OlF : 5，-TATGATTTTGAAGCGCAACACG-3,（序 列編號14) 結果單離出一種類似基因候選者，將該基因稱為MpELOl 基因。該MpELOl基因之cDNA之長度（除去聚A部分）為1，559 bp，推定之胺基酸序列為290殘基。將其之鹼基序列示於序列 編號3中，其之胺基酸序列示於序列編號4中。 34 201142022 將MpELOlcDNA之推定胺基酸序列與立碗薄之鍵長 延長酵素之胺基酸相比較，結果顯示62 7%之同—性。 [實施例3 :來自地錢之Δ5不飽和化酵素基因之單離] 其他物種之Δ5不飽和化酵素在其之Ν末端具有細胞色素 b5功能域（cyt0chr0me b5 domain)。因此，推測來自地錢之μ 不飽和化酵素基因，與殘和化酵素基因同樣，隸屬於細 胞色素b5功能域融合型不飽和化酵素基因家族。但是，在矽 藻及真菌中，Δ5不飽和化酵素及Λ6不飽和化酵素於胺基酸 序列層級之相同性非常低。再者，比較絲狀菌（M.alpina)2A5 不飽和化酵素與Δ6不飽和化酵素間之胺基酸序列，發現局部 地存在具有設計簡併引子所需之最低限數目（即4至5個）連續 殘基之保存序列。又，出乎意料之外地發現此等保存序列，在 同種内之Δ5不飽和化酵素與^6不飽和化酵素之間，比在異 種之Δ5不飽和化酵素之胺基酸序列間被更良好地保存。因此 認為在細胞色素b5功能域融合型不飽和化酵素基因中，有時 存在種特異性之保存序列。再者，比較及深入檢討上述

MpDES6與在Genetics 159，p981，2001中記載之機能未知之 MpDES之鹼基序列，結果發現2個胺基酸序列

(I(E/N)(G/D)KVYDV (序列編號 41)及 DPDI(Q/D)(Y/T)(M/V)P (序列編號42)之胺基酸序列被保存。對應於各個胺基酸序列之 簡併引子之序列如下文所示：

d Δ 5DES-F ： 5,-AT(A/T/C)(A/G)AIG(A/G)IAA(A/G)TITA (T C)GA(T/C)GT-3’ (序列編號 15) dA5DES-R ： 5,-GGIA(T/C)I(G/T)(A/T)IT(G/C)(A/G/T) 35 201142022 AT(A/G)TCIGG(A/G)TC_3’（序列編號 16) 使用上述引子（dZ\5DES-F及d^5DES-R)進行PCR，將得 到之DNA片段分段選殖。決定得到之選殖株之鹼基序列，對 於具有目的cDNA序列之選殖株，使用下述引子(MpDES5-02R 及MpDES5-01F)取得全長cDNA。又，實驗材料及方法與實施 例1同樣。

MpDES5-02R : 5，-GTGTGTACGATCCGTGGTTACC-3,（序 列編號17)

MpDES5-01F ： 5’_AAGGCGGGACAGGATTCAACAC-3, (序列編號18)。 結果單離出兩種長度不同之選殖株C1及C2 (C1 : 2,427bp， c2 : 2,285bp)做為來自地錢之A5不飽和化酵素基因候選者。 若比較cl與c2之鹼基序列，可知在非轉譯領域發生選擇性拼 接(alternative splicing)。未因選擇性拼接而發生譯碼區變化， 任一選殖株均編碼484個胺基酸(序列編號6)。以下，將2427bp 長之選殖株cl稱為MPDES5基因（序列編號5)，並用於以下之 實施例。

MpDES5cDNA之推定胺基酸序列與絲狀菌（M alpina)之 △ 5不飽和化酵素之胺基酸序列相較，顯示314〇/。之同一性。 至於來自與地錢為近緣之立碗蘚之05不飽和化酵素由於其 之序列資料尚未被發表，因此在此無法進行比較。 [實施例4 :使用甲醇利用性巴氏畢赤酵母菌（pichia pastoris)之機能解析] 為 了調查 MpDES6，MpELOl 及]yipDES5 之 cDNA 機能， 36 201142022 首先製作將各個開放譯碼區（〇RF)配置在曱醇誘導性啟動子 AOX1之下游之構築體。將此等構築體導入甲醇利用性巴氏畢 赤酵母菌中，並解析其之脂肪酸組成。將MpDES6，MpELOl 及MpDES5之cDNA鹼基序列之ORF部分，用下述引子藉由 PCR增幅。 (MpDES6 ORF增幅用引子）

MpD6-17F : 5’-GGAATTCGCGATGGCCTCGTCCACCACCAC -3’（序列編 號19)

MpD6-18F ： 5，-GGAATTCTACTTTCGCAGCGTATGCTACC- 3’（序列編號 20) (MpELOlORF增幅用引子）

MpD6EL01-15F ： 5，-GGAATTCGCGATGGAGGCGTACGAG ATGG- 3’（序列編號 21)

MpD6EL01-16F : 5，-GGAATTCTTCTGCCTTTTTGCTCTT G ATC-3’（序列編號22) (MpDES50RF增幅用引子）

MpD5-llF : 5’-GTTGAATTCGACAGTTATGCCGCCGCCA CACGC-3,（序列編號23)

MpD5-12R ： 5’—GTTGAATTCAGGCCCAAAGCATGCTGTCA C-3’（序列編 號24) 37 201142022 此等引子包含EcoRI識別序列，將此等引子利用於以下之 選殖。再者’在PCR中’使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara 公司製）〇.5U’依照製造者推薦之方法，以20/zl之反應液量進 行。反應條件為於94°C保持2分鐘後，反覆進行「94Ϊ/1分 鐘、57°C/1分鐘及72°C/1分鐘」之反應25次’然後冷卻至4 °C。將得到之各〇RF片段用EcoRI消化後，以在實施例1中 記載之方法進行凝膠精製。然後，將其以意義（sense)方向連結 至甲醇利用性酵母之表現載體pPICZA(標記：吉新(geoein)耐 性基因’Invitrogen公司製）内之曱醇誘導性啟動子5，_Α〇χι 之下游之EcoRI部位。 將各個表現用構築體及做為對照之pPICZA載體用畢赤酵 母菌EasyComp套組(Invitrogen公司製）導入甲醇利用性酵母 之PPY1系統中’取得以吉新(geocin)财性做為標記之轉形體。 再者，曱醇利用性酵母雖可以合成A6不飽和化酵素之基質， 即亞麻酸及α -亞麻稀酸，但無法合成花生四稀酸及epa之其 他前驅體。 為了表現導入之基因，使用EasySelect畢赤酵母菌表現套 組(Invitrogen公司製），依照該套組製造者推薦之方法，將各轉 形體在以1.0%甘油為唯一碳源之最小培養基中培養至〇D(6〇〇 nm)成為0.5後，在以0.5%甲醇為唯一碳源之最小培養基中， 於30°C培養3日’直至培養成飽和狀態。之後，使用gc_ms 並依照公知之方法（Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p605, 2003) 測定各個轉形體之脂肪酸組成。 在表現MpDES6基因之轉形體中，新檢測出A6不飽和化 38 201142022 酵素之反應產物，即r ·亞麻埽酸及硬脂四烯駿分別為全部脂 肪酸之7.4%及〇.7%。於導入做為對照之pPICZA載體之酵母 中’則未檢測出此等酸。上述顯示M P D E s 6基因編碼△6不飽 和化酵素。 在表現MpELOl基因之轉形體中，於添加亞麻稀酸 時，升二破个亞麻缚酸伯全部脂肪酸之14.1%;於添加硬脂 四烯酸時，新檢測出之二十碳碳四烯酸佔1.冰。於導入做為 對照之pPICZA載體之酵母中，則未檢測出此等酸。以上顯示 MpELO 1編碼Z\6鍵長延長酵素 在表現MPDES5基因之轉形體中，於添加升二碳个亞麻 烯酸時’花生四稀酸佔全部脂肪酸之11% ;於添加二十碳四 烯酸時，檢測出之二十碳五烯酸佔〇1%。於導入做為對照之 pPICZA載體之酵母中’則未檢測出此等酸。上述顯示MpMS5 基因編碼△5不飽和化酵素。 如上述，從地錢中取得分別編碼Λ6不飽和化酵素、Δ6 鍵長延長酵素及Δ5不飽和化酵素之基因’即MpDES6、 MpELOl 及 MpDES5。 [實施例5 .於甲醇利用性巴氏畢赤酵母菌（p past〇ris)中地 錢之高度不飽和脂肪酸生合成系統之再構成] 為了同時表現MpDES6、MpELOl及MpDES5，將在上述 實施例4中製作之經EcoRI消化之MpELO 1及MpDES5之ORF 增幅片段’分別以有意義方向連結至甲醇利用性酵母菌表現載 體 pPIC3K(標記：HIS4 基因，Invitrogen 公司製）及 PPIC6A(標 記：保米黴素（blasticidin)耐性基因，Invitrogen公司製）之 39 201142022 5’ΑΟΧ1啟動子下游之EcoRI部位。再者，關於MpDES6，使 用在實施例4中製作之表現載體。 以下各表現載體分別表記成pPICZA_MpDES6、 pPIC3K-MpEL01 及 ppiC6A-MpDES5。 首先用pPICZA-MpDES6或只用做為對照之ppiczA載體 轉形甲醇利用性酵母PPY12系統(his4, arg4)，該酵母ρργ12 系統具有與上述實施例4中所用之甲醇利用性酵母ρργι系統 相同之脂肪酸組成，藉此取得以吉新（ze〇cin)耐性為標記之轉 形體。繼而將ppiC3K-mpeloi或只將做為對照之pPIC3K載 體導入染色體組中分別插有pPICZA_MpDES6或ppicZA之轉

形體中，取得以組胺酸合成能力為標記之轉形體。最後，將 pPIC6A-MPDES5或只將做為對照之pPIC6A 組t分別插有pPICZA.Mp娜及p職娜= PPICZA及PPIC3K之轉形體中，取得以博來斯妥新叫 耐性為標記之轉形體。 使用所得之導入2種或3種基因之轉形體，進行地錢之在 生四稀酸/EPA生合成系統之再構成。首先導人上述2種基因 (MP卿及MpEL01)。使用轉形體，以使Mp腿基因及 ，pE^H基因在甲_祕酵母㈣喊現。結絲生成為△ 不和化反應產物之r-亞麻烯酸(佔全脂肪酸之2 9%) 酸(佔全麟酸之G.4%)之外，尚生成此等之鏈長延長反 -匆βρ升一碳7••亞麻稀酸(佔全脂肪酸之2 8%)及二十 佔全脂肪酸之0.2%)。在做為對照之轉形體中則未檢 測出上述脂肪酸。於上述轉形體中再導入Μρ·5戶斤得之轉形 201142022 體中’除r -亞麻稀酸(佔全脂肪酸之2.8%)、硬脂四稀酸(佔全 脂肪酸之0.5%)、升二碳r _亞麻烯酸（佔全脂肪酸之1.5%)及二 十碳四烯酸(佔全脂肪酸之〇.1%)之外，確認生成花生四烯酸(佔 全脂肪酸之0.1%)及二十碳五烯酸（EPA，佔全脂肪酸之 0.03%)。在做為對照之轉形體中，則未檢測出上述脂肪酸。該 結果顯示藉由使來自地錢之A6不飽和化酵素、A6鏈長延長 酵素及Δ5不飽和化酵素之基因表現，縱使在地錢以外之生物 種中’亦可再構築成高度不飽和脂肪酸生合成系統。 [實施例6:導入水稻之載體之構築及該載體於水稻中之導 入] 為了使MpDES6、MpEL01及MpDES5基因在水稻中表 現’以下述⑴〜(iv)所示之步驟製作表現構築體，再者，製作步 驟如第一圖所示。 (i)藉由使用下述引子(被設計成黏接在pBI221(T0Y0B0 公司製）之花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子與NOS終結子 之間）之PCR，製作除去召-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因部分之表 現載體P35S-NOS。 MKOOl(F) : 5，-CGGGATCCTCTCCTGGCGCACCATCGTC - 3, (序列編號25) MKO02(R) : 5’-GGGGTACCAACGCGCTTTCCCACCAACG - 3, (序列編號26)

又’引子MKOOl(F)包含BamHI識別序列，且黏接於GUS 基因之3’末端；引子MKO02(R)黏接於GUS基因之5,末端（於 點接部位之上游存在BamHI部位）。PCR，係使用PyrobestDNA 201142022 聚合酶(Takara公司製）0.5U，依照製造者推薦之方法以50#1 之反應液量進行。反應條件為：於96°C保持5分鐘後，重覆「94 。(：/30秒，68°C/4分鐘」之反應30次，然後冷卻至4°C。將得 到之各ORF片段用BamHI消化後，用在實施例1中記載之方 法進行凝膠精製後，自行連結。 (ii)繼而將MpDES6基因、MpELOl基因及MpDES5基 因之ORF分別連結於p35S-NOS之Xbal部位。在ORF之增幅 方面，使用包含Xbal識別序列之下述引子 (MpDES6 ORF增幅用引子）

MpD6_21F : 5，-GCTCTAGAGCGATGGCCTCGTCCACCACC -3, (序列編號27)

MpD6-llR : 5，-GCTCTAGACTATACTTTCGCAGCGTATGC -3, (序列編號28) (MpELOl ORF增幅用引子）

MpD6EL01-l 8F : 5’-GCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACGA GATGG-3’(序列編號29)

MpD6EL01-13R : 5，-GCTCTAGATTATTCTGCCTTTTTGCT C-3, (序列編號30) (MpDES5 0RF增幅用引子）

MpD5 22F : 5， GCTCTAGAGACAGTTATGCCGCCACACGC -3 ’ (序列編號31)

MpD5 23R : 5，_GCTCTAGAAGGCCCAAAGCATGCTGTCAC _3, (序列編號32) PCR，係使用 PyrobestDNA 聚合酶(Takara 公司製)0.5U， 42 201142022 依照製造者推薦之方法以20#1之反應液量進行。反應條件 為：於94°C保持2分鐘後，重覆「94°C/1分鐘，57°C/1分鐘， 72°C/1分鐘」之反應25次，然後冷卻至4°C。將得到之各ORF 片段用Xbal消化後，用在實施例1中記載之方法進行凝膠精 製，然後用於選殖。 (iii) 得到之各基因之表現構築體（分別表記為 p35S-MpDES6、p35S-MpEL01 及 p35S-MpDES5)，均係利用 具有位於CaMV35S啟動子5’末端之pstl部位及位於NOS終 結子3’末端之EcoRI部位者，連結上述三基因之表現匣 (expression cassette)。首先，使用下文所示之引子並以 p35S_MpDES5為模板進行PCR，增幅MpDES5基因之表現匣 部分，然後選殖入在p35S-MpDES6之CaMV35S啟動子5’末 端之PstI部位（參照第一圖）。 (MpDES5基因表現匣增幅用引子） M13R : 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’（序列編號 33)

NOS-R4-PST ： 55- AAACTGCAGATTCCCGATCTAGTAACA TAG-3’（序列編號34) 再者，M13R引子黏接於CaMV35S啟動子上游之載體序 列。再者，NOS-R4-PST引子包含PstI，且黏接於NOS終結子 -3’末端。同時不包含存在於NOS終結子-3’末端之EcoRI部位。

PCR，係使用 Pyr〇bestDNA 聚合酶(Takara 公司製)0.5U， 依照製造者推薦之方法以20以1之反應液量進行。反應條件 為：於94°C保持2分鐘後，重覆「94。(：/1分鐘，57°C/1分鐘， 72°C/1分鐘」之反應25次，然後冷卻至4。(：。將得到之各〇RF 43 201142022 片段用PstI消化後，用在實施例1中記載之方法進行凝膠精 製，然後選殖入包含MpDES6基因之表現匣之質體 (p35S-MpDES6)之 PstI 部位。 (iv) 在上述得到之連結有MpDES5及MpDES6基因之 表現匣之構築體（表記成p35S-MpDES5/35S-MpDES6)上，再連 結MpELOl基因之表現匣。使用以下之引子並以p35S-MpEL01 做為模板進行PCR，增幅MpELOl基因之表現匣部分，然後 選殖入在MpDES6基因表現匣内之NOS終結子3’末端之 EcoRI部位。 (MpELOl基因表現匣增幅用引子） 35S-F3-EI ： 5,-CCGGAATTCGCATGCCTGCAGGTCCCCAGA-3, (序列編號35) M13F : 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’（序列編號 36) 再者，35S-F3-EI引子包含EcoRI識別序列，且黏接於 CaMV35S啟動子之5’末端。再者，M13F引子黏接於NOS終 結子下游之載體序列。 PCR，係使用 PyrobestDNA 聚合酶(Takara 公司製）〇.5U， 依照製造者推薦之方法以之反應液量進行。反應條件 為：於94°C保持2分鐘後，重覆「94°C/1分鐘，57°C/1分鐘， 72Ϊ/1分鐘」之反應25次，然後冷卻至4°C。將得到DNA片 段用EcoRI消化後，用在實施例1中記載之方法進行凝膠精 製，然後選殖入連結有MpDES5及MpDES6基因之表現匣之 構築體(p35S-MpDES5/35S- MpDES6)之 EcoRI 部位。 藉由以上之操作，製作3基因之表現匣以MpDES5、 201142022

MpDES6及MpELOl之順序連結而成之表現構築體（表記成 p35S-MpDES5/35S-MpDES6/p35S-MpEL01)。 將如此所得之上述構築體，藉由公知之方法（Genes Genet. Syst. 73, p219, 1998)，導入以拜拉磷(bialaphos)為選擇標記之 質體，然後用粒子搶將該質體導入水稻中，取得轉形水稻。 實施例7 :[在於草(N. tabacum SR-1)中地錢之高度不飽和 脂肪酸生合成系統之再構成] 在本實施例中，確認上述來自地錢之不飽和脂肪酸合成酵 素基因MpDES6基因、MpDES5基因及MpELOl基因在植物 中能良好地發揮機能。 具體而言，確認將MpDES6基因、MpDES5基因及MpELOl 基因導入菸草時，於該菸草中可生產花生四烯酸等。製作導入 來自絲狀菌（M. alpina)之3種基因：Δ6不飽和化酵素基因 (MaDES6)、Z\5不飽和化酵素基因（MaDES5)及Λ6鏈長延長酵 素基因（MaELO)之菸草，以做為對照組。 (0 包含來自絲狀菌之基因之載體(pSPB 1519)之構築 pE2113 (Mitsuhara et al. Plant Cell Physiol.37, 45-59 1996)具有 含反覆促進子（enhancer)序列之花椰菜花葉病毒35S(E 1235S) 啟動子及胭脂胺酸(nopaline)合成酶(nos)終結子。 將pE2113用SnaBI消化後，藉由與Xhol接頭（Takara公 司製)連結，製作質體。將該質體用SacI消化後，將末端平滑 化，再藉由與BamHI接頭(Takara公司製)連結，製作pUE7。 藉由將pUE7用Hindlll及EcoRI消化後得到之DNA片段中具 有E1235S啟動子之片段，與用Hindlll及EcoRI消化得到之植 45 201142022 物轉形用雙載體 pBINPLUS(van Engelen et al. Transgenic research 4, p288, 1995)連結，製作 pSPB505。 另一方面，藉由將係屬含MaDES6基因之質體之pMLDlOl 用Xhol消化後，再用BamHI部分消化，得到約1.6 kb之DNA 片段。將該片段，與用Xhol及BamHI部分消化pSPB505所 得之雙載體部分之DNA片段連結，製作pSPB559。 藉由將 pUCAP(van Engelen et al. Transgenic research 4, p288, 1995)用AscI消化後，將末端平滑化，然後與pacI接頭 連結，以製作pUCAPP。

將pE2113用SnaBI消化後，藉由與BamHI接頭(Takara 公司）連結，製作pUE6。將pUE6用SacI消化後，將末端平滑 化’藉由與Sail接頭(Takara公司）連結，製作PUE8。藉由將 pUE8用Hindlll及EcoRI消化所得之DNA片段中具有E1235S 啟動子之片段插在pUCAPP之Hindlll-EcoRI間，製作質體。 將該質體用BamHI及Sail消化所得之DNA片段，與MaELO 基因之cDNA用BamHI及Xhol消化所得之DNA片段連結， 製作pSPB1130。將pSPB1130用PacI消化，然後將所得之約 2.3 kbDNA片段插在pBINPLUS之PacI部位。選擇MaELO基 因之轉譯方向與pBINPLUS上之nptll基因之轉譯方向為同向 之質體，將該質體稱做PSPB1157P。 再者’將上述之PSPB1157P用PacI消化後，將末端平滑 化’藉由與AscI接頭連結，製作psPB559A。然後藉由將 PSPB559A用AscI消化所得之含MaDES6基因之DNA片段插 入 pSPB1157P.之 AscI 部位’製作 pSPB1157。 46 201142022 藉由將 pCGP1364(Plant Cell Physiol. 36，1023，1995)用 Hindlll及SacII消化所得之約i.3kb之DNA片段，pCGP1364 用PstI消化且將末端平滑後再用SacII消化所得之約2.9kb之 DNA片段，以及pUCAPA用SacI消化且將末端平滑後再用 Hindlll消化所得之約2.7kb之DNA片段連結，得到pSPB184。 另一方面’經Xbal及ΚρηΙ消化，從分段選殖有MaDES5 基因之pCRII載體切出含有MaDES基因之DNA片段。藉由將 該片段，與上述之pSPB184經由Xbal及ΚρηΙ消化所得之DNA 片段連結’製作PSPB1519A。將pSPB1519A用AscI消化，將 得到之片段插入pSPB1157之AscI部位，製作pPSPB1519。在 該 pPSPB1519 上’ MpDES6 基因、MpDES5 基因及 MpELOl 基因係以相同方向轉譯，且由相同構成之啟動子控制。 (ii) 來自地錢之基因之載體(pSPB2368)之構築 將 pUCAP(van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995)用AscI消化後，與Sgfl接頭連結，然後藉由與 用PacI消化後之Fsel接頭連結，製作pUCSAPF。再者，對於 pBINPLUS施以同樣之處理，以製作pBINSAPF。 關於其他選殖用載體，藉由將pUC19用Hindlll消化後， 與PacI接頭連結，再用EcoRI消化後，與Fsel接頭連結，製 作pUCPF。再者，藉由將pUC19用Hindlll消化後，與Sgfl 接頭連結’再用EcoRI消化後’與AscI接頭連結，製作pUCSA。 在 pUCSAPF 之 Hindlll-Xbal 間插入 E1235S 且在 SacI-EcoRI 間插入曼諾平（mannopin)合成酵素（mas)基因終結子之載體， 用Xbal及SacI消化後’將末端平滑化，得到pSPB2353A。在 201142022 pSPB2353A之平滑末端上，連結用xbaI從p35S_MpDES6切 出且將末端平滑化之含MpDES6基因之DNA片段，以製作 pSI>B2353。 分別在pUCSA之Hindlll-Xbal間插入E1235S及在 SacI-EcoRI間插入曼諾平合成酵素(mas)基因終結子之載體，用 XbaI 及 SacI 消化’以製作 pSPB2355A。 另一方面，以p35S-MpEL〇l做為模板，使用下述引子、

XbaMpELOf 及 SacMpELOr 進行 PCR。

XbaMpELOf : 5’-AGTCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACG_3,（配 列序號43)

SacMpELOr : 5’_CAGTGAGCTCGGTGTCTTATTCTGCC-3,(配列 序號44) PCR，係使用高精確度之KOD+DNA聚合酶(東洋紡織公 司製），於94°C保持2分鐘後’重覆「94t：/15秒及68〇C/1至3 分鐘」之循環25次。將如此調製之MpEL〇i DNA片段經XbaI 及SacI消化者’連結至上述pSPB2355A上，以製作pSPB2355。 然後將PSPB2355經Sgfl及AscI消化所得之DNA片段，連結 至經Sgfl及AscI消化之PSPB2353上，以製作PSPB2361。 分別在pUCPF之Hindlll-Xbal間插入E1235S及在 SacI-EcoRI間插入曼諾平合成酵素(mas)基因終結子之載體，用 XbaI 及 SacI 消化，以製作 pSPB2352A。 另一方面’以p35S-MpDES5為模板，使用下述引子、 XbaMpD5f及SacMpD5r進行PCR。PCR之反應條件與上述pcr 條件相同。 48 201142022

XbaMpD5f : 5，-AGCTTCTAGAGCCATGCCGCCACACGCCC -3’ (序列編號45)

SacMpD5r : 5，-CAGTGAGCTCTCAGCCATCCAGTCGT-3,（序列 編號46) 將藉由PCR調製之MpD5 DNA片段用Xbal及SacI消化， 然後將所得片段連結於PSPB2352A上，以製作pSPB2352。 將pBINSAPF經PacI及Fsel消化所得之DNA片段，與用 PacI及Fsel從pSPB2352切出之含有MpDES5基因之DNA片 段連結，以製作pSPB2368A。然後藉由將pSPB2368A經Sgfl 及PacI消化所得者，與用Sgfl及PacI從pSPB2361切出之含 有MpDES6基因及MpELOl基因之DNA片段連結，以製作 PSPB2368。在該質體上，MpDES6基因、MpDES5基因及 MpELOl基因係以相同方向轉譯，且由相同構成之啟動子控 制0 (iii) 基因在菸草中之導入 繼而，依據公知之方法(Plant J· 5, 81，1994)，用pSPB2368 或 pSPB 1519 將根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)(菌 株：AglO(Lazo et al· 1991，Biotechnology 9:963-967))轉形。使 該具有PSPB2368或pSPB1519之轉形根瘤土壤桿菌感染終草 葉圓片。用RNeasyPlantmini套組(Qiagen公司製）從如此所得 之重組菸草之葉子萃取RNA，依照確立之方法，藉由rt_pcr 選擇出導入之基因能表現之系統。 從如此所得之導入由來自絲狀菌之酵素基因構成之 PSPB1519之菸草（經PSPB1519轉形之菸草），及導入由來自地 49 201142022 錢之酵素基因構成之pSPB2368之菸草（經pSPB2368轉形之 菸草）之葉子，用公知之方法[藤野安彥編（1978)，生物化學實 驗法9，學會出版中心；山田晃弘編（1989)，生物化學實驗法 24，學會出版中心]，進行脂質之萃取。將得到之脂質以氣相 層析術(Hewlett Packard公司，HP-6800)分析，並將其之結果 示於表1中。 再者，使用未導入基因之菸草葉做為對照組，進行同樣的 分析。 【表1】

Control (%) Control (mg/gFW) pSPB2368 (%) PSPB2368 (mg/gFW) PSPB1519 (%) 亞麻酸 9.55 1.17 1.37 0.2 9.51 α-亞麻烯酸 49.99 6.12 17.83 2.58 39.24 γ-亞麻稀酸 0 0 4.06 0.59 3.37 升二碳γ-亞麻稀“ 0 0 10.85 1.57 3.09 硬脂四稀酸 0 0 10.27 1.49 0 二十碳 四稀酸 0 0 4.89 0.71 0 二十碳 五烯酸 0 0 2.68 0.39 0 全脂質量 12.25 _ 14.48 - 本實施例之氣相層析分析條件如以下所示。 (氣相層析分析條件） 管柱：Supelco SP-2330，熔融矽石毛細管（Fused Silica

Capillary Column), 30m χ 〇.32inm ID，0.2〆 m 溫度：注射：240¾，測定：25(rc，烘箱：18〇°c/3 50 201142022 分鐘，180°C — 220°C(2°C/分鐘） 管柱流量：30cm/秒，壓力：200kPa，檢出器：FID。 層析圖中之各尖峰藉由標準脂肪酸之甲酯之滯留時間及 GC-MASS(Hewlett Packard 公司，HP-5973)分析來決定，再者， 從尖峰面積決定各脂肪酸之比例。 在表1中，Control表示對照組，pSPB2368表示以pSPB2368 轉形之菸草，pSPB1519表示以pSPB1519轉形之菸草。 從表1之結果，雖可確認在導入包含來自絲狀菌之酵素基 因之pSPBl519之菸草（經pSPB1519轉形之菸草）中，升二碳7< -亞麻烯酸蓄積，但未觀察到花生四烯酸蓄積。另一方面，在 導入包含來自地錢之酵素基因之PSPB2368之菸草（經 PSPB2368轉形之菸草）中’確認不僅花生四烯酸蓄積，二十碳 四烯酸及二十礙五烯酸亦蓄積。基於此，認定在高等植物中， 來自地錢之酵素比來自絲狀菌之酵素具有更優異之機能，可以 亞麻酸及α-亞麻烯酸做為基質，合成以花生四烯酸為首之高 度不飽和脂肪酸。 . 誠#人報告，藉由將三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)之Λ6不飽和化酵素及八5不飽和化酵素以及 ★ 立碗蘚(PhySC〇mitrella patens)之鏈長延長酵素之基因導 入於草及普通亞麻(Llnum usitatissimum)，可 在於草之種子中蓄積⑽，在普通亞麻之種子中= l.〇%(Amine Abbadi et al. Piant Cell 16? 2734-2748, 2004) 〇 在本實施例中，藉由將來自地錢之Λ6 ’ 不飽和化酵素輯錢長料的每減_4草生 51 201142022 四烯酸在菸草之葉子中蓄積10%以上。該結果暗示本實施例之 經PSPB2368轉形之菸草，與上述之報告相比，可更有效率地 合成尚度不飽和脂肪酸。 再者’在「使用對等鞭金藻（Is〇chrySis gaibana)之△ 9鏈長 延長酵素、小眼蟲(Euglena gracilis)之Δ8不飽和化酵素、絲狀 菌之不飽和化酵素之3種基因，在阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)中進行脂質之改變」之報告中，於葉子中，花生四烯 酸為總脂質之6.6莫耳％，〇20以上之脂質為22.5莫耳％ (Baoxiu Qi et al. Nature Biotechnology 22, 739-745, 2004)。在該 報σ中，所谓使用八6不飽和化酵素、八5不飽和化酵素及鏈 長延長酵素之路徑，係以另外的修飾路徑製作高度不飽和脂肪 ，雖無法單純地比較，但使用來自地錢之酵素者可蓄積更多 的高度不飽和脂肪酸。 在、、息知質之30%以上成為改變脂肪酸之經pSpB2368轉形 之菸草中，未見到形態的異常。再者，在成熟性上亦沒有問題， 由於產生夕個種子，因此認定不同處所之高度不飽和脂肪酸增 加對於植物生育上之影響小。 至目前為止所報告之基因重組植物中之C2〇以上之高度 不飽。和脂肪酸之生產為總脂質之約2〇%，花生四稀酸則偈限於 二/〇但疋，如本實施例所示，藉由使用來自地錢之脂肪酸 合成酵素，打破該界限，在植物中可以生產更多的高度不飽和 脂肪酸。 I再者，實施發明之最佳形態乙節中之具體實施態樣或實施 例，畢竟為明確地施行本發明之技術内容者，不應被狹義地解 52 201142022 釋為僅只限定於此等實施例，而係可在本發明之精神及以下記 載之申請專利範圍内進行各種變更而實施者。 [產業上利用之可能性] 依照本發明之基因，係從同一種地錢單離之八5不飽和化 酵素基因、Δ6不飽和化酵素基因及Λ6鏈長延㈣素基因。 因此，使此3種基因在植物_時表現時，藉由使來自不同生 物種之複數個基因表現，可以發揮所謂「在植物内有良好機能」 之效果。再者，地錢，由於被認為係屬高等植物之模型系，因 而此等基因可以發揮所謂「在植物㈣有比來自植物以外之生 物種之基因更良好之機能」之效果。 入t林發明之轉形體，可以發揮所謂「生產花生 酸及二十碳五烯_PA)等高度不飽和脂肪酸」之效果。更特 =，！照本發明之轉形體，可以發揮所謂「以低成本且有 飽和脂肪酸」之效果。如此得到之花生 (EPA)可以發揮所謂「能活用做為便宜的多目的= 再者，當使用上述轉形植物體做為食料 」’ 做為花生四烯酸及EPA含量高之食料上之° ^發揮所胡「在 價值兩」之效果。

上有本發Γ基因，在生產花生四稀酸及EPA ^用二’以可表現方式導人本發明基因之轉频，在㈣ 產業、食扣產業及各種材料產業等中 八 ΡΡΑ _ L 」M生產it*生四稀酸及 EPA’所以極為有用。尤其在上述_體為植物體 於植物體内之花生四烯酸及EPA之含 /由 非常有用。 $增加，在農業領域等中 53 201142022 【圖式簡單說明】 第一圖係顯示實施例6中使用之MpDES6基因、MpELOl 基因及MpDES基因之各基因之表現匣（expression cassette)連 結而成之構築體之構築次序之說明圖。 【主要元件符號說明】 無0 54 201142022 序列表 <110> Suntory Limited <120>衍生自地錢之不飽和脂肪酸合成酶基因及其之利用 <130> <150〉JP 2003-425673 <151> 2003-12-22 <160 46 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211〉2519 <212> DNA <213〉地錢 <220> <221> CDS <222> (253)..(1698) <400〉1 atagatccaa tttcataagt cgacgagaaa ggcagaaggc gagaagcggc aggcagcgag 60 cgcgagcgcc agagctcttg ctcccctcgc tcatcgctcg cattgccgca ttttgtgagt 120 gtcggactga tcactcagtc cgtcactgca aacgcgagcg agcgagagtg cgagtgagcg 1 180 201142022 agcgagcgag cgagagccgc ggtgtgtctg tgagatccaa tcctttttct gctttgcgcg 240 ctgtggggcg eg atg gee teg tee acc acc acc gee gtg aag caa tet teg 291

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Val Lys Gin Ser Ser 1 5 10 ggt ggg ctg tgg teg aaa tgg ggc acc ggc age aac ttg age ttc gtg 339

Gly Gly Leu Trp Ser Lys Trp Gly Thr Gly Ser Asn Leu Ser Phe Val 15 20 25 teg ege aag gag cag cag cag cag cag cag cag age tet ccc gag geg 387

Ser Arg Lys Glu Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Ser Ser Pro Glu Ala 30 35 40 45 teg act ccc geg geg cag cag gag aaa tee ate agt aga gaa tee ate 435

Ser Thr Pro Ala Ala Gin Gin Glu Lys Ser lie Ser Arg Glu Ser lie 50 55 60 ccc gag ggc ttc ttg acc gtg gag gag gtg teg aag cac gac aat ccg 483

Pro Glu Gly Phe Leu Thr Val Glu Glu Val Ser Lys His Asp Asn Pro 65 70 75 201142022 age gac tgc tgg ate gtc ate aac gac aag gtg tac gac gtg age gca 531

Ser Asp Cys Trp lie Val lie Asn Asp Lys Val Tyr Asp Val Ser Ala 80 85 90 ttc ggg aag aeg cat ccg ggc ggc cct gtg ate ttc aeg cag gee ggc 579

Phe Gly Lys Thr His Pro Gly Gly Pro Val lie Phe Thr Gin Ala Gly 95 100 105 ege gac gee aeg gat tet ttc aag gtt ttc cac tee gee aag geg tgg 627

Arg Asp Ala Thr Asp Ser Phe Lys Val Phe His Ser Ala Lys Ala Trp 110 115 120 125 cag ttt etc cag gac ctg tac ate gga gat ctg tac aat gee gag cca 675

Gin Phe Leu Gin Asp Leu Tyr lie Gly Asp Leu Tyr Asn Ala Glu Pro 130 135 140 gtg teg gag ctg gtg aag gat tac ega gac ctg agg aeg geg ttc atg 723

Val Ser Glu Leu Val Lys Asp Tyr Arg Asp Leu Arg Thr Ala Phe Met 145 150 155 cgt tet cag eta ttc aag age agt aaa atg tac tac gtg acc aag tgc 3 771 201142022

Arg Ser Gin Leu Phe Lys Ser Ser Lys Met Tyr Tyr Val Thr Lys Cys 160 165 170 gtc aca aat ttt gca att ctt gcc gcc agt etc gca gtc ate geg tgg 819

Val Thr Asn Phe Ala lie Leu Ala Ala Ser Leu Ala Val lie Ala Trp 175 180 185 age cag aeg tat ctg geg gtt ttg tgc tcc agt ttc ctg ttg get etc 867

Ser Gin Thr Tyr Leu Ala Val Leu Cys Ser Ser Phe Leu Leu Ala Leu 190 195 200 205 ttc tgg cag caa tgt gga tgg tta teg cac gat ttt etc cac cac cag 915

Phe Trp Gin Gin Cys Gly Trp Leu Ser His Asp Phe Leu His His Gin 210 215 220 gtg acc gag aac ega teg etc aac aeg tac ttc ggc ggc ctg ttc tgg 963

Val Thr Glu Asn Arg Ser Leu Asn Thr Tyr Phe Gly Gly Leu Phe Trp 225 230 235 ggt aac ttc gcc cag ggc tac age gtg gga tgg tgg aag acc aag cac 1011

Gly Asn Phe Ala Gin Gly Tyr Ser Val Gly Trp Trp Lys Thr Lys His 240 245 250 4 201142022 aat gtg cac cac gcg gcc acg aac gaa tgc gac gac aag tat cag ccc 1059

Asn Val His His Ala Ala Thr Asn Glu Cys Asp Asp Lys Tyr Gin Pro 255 260 265 ate gat ccc gac ate gac acc gtg ccc ctg etc gcc tgg age aag gaa 1107 lie Asp Pro Asp lie Asp Thr Val Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu 270 275 280 285 ate ttg gcc acc gtc gac gac caa ttc ttc ega teg ate ate age gtg 1155 lie Leu Ala Thr Val Asp Asp Gin Phe Phe Arg Ser lie lie Ser Val 290 295 300 cag cac ett ctg ttc ttc ccg etc etc ttc ttg gca aga ttc age tgg 1203

Gin His Leu Leu Phe Phe Pro Leu Leu Phe Leu Ala Arg Phe Ser Trp 305 310 315 ctg cat teg agt tgg gcc cac gcc age aac ttc gag atg cct egg tac 1251

Leu His Ser Ser Trp Ala His Ala Ser Asn Phe Glu Met Pro Arg Tyr 320 325 330 atg aga tgg gcg gag aag gcc teg etc etc ggg cac tac ggc gcc tea 1299 201142022

Met Arg Trp Ala Glu Lys Ala Ser Leu Leu Gly His Tyr Gly Ala Ser 335 340 345 ate ggc gcc gcc ttc tac att ttg ccc ate ccc cag gcc ate tgc tgg 1347 lie Gly Ala Ala Phe Tyr lie Leu Pro lie Pro Gin Ala lie Cys Trp 350 355 360 365 etc ttc ttg teg caa ctg ttt tgc ggc get ctg etc age att gtc ttc 1395

Leu Phe Leu Ser Gin Leu Phe Cys Gly Ala Leu Leu Ser lie Val Phe 370 375 380 gtg ate age cac aat ggc atg gat gtg tac aac gac ccc egg gac ttc 1443

Val lie Ser His Asn Gly Met Asp Val Tyr Asn Asp Pro Arg Asp Phe 385 390 395 gtg aeg gcc caa gtc acc teg acc aga aac ate gaa ggc aac ttc ttc 1491

Val Thr Ala Gin Val Thr Ser Thr Arg Asn lie Glu Gly Asn Phe Phe 400 405 410 aac gac tgg ttc acc gga ggc ctg aac agg cag att gag cac cat ctg 1539

Asn Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Arg Gin lie Glu His His Leu 415 420 425 6 201142022 ttt ccg tct ctt ccg agg cac aac etc gee aag gtc geg cca cac gtc 1587

Phe Pro Ser Leu Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Val Ala Pro His Val 430 435 440 445 aag geg etc tgc gee aag cac ggt ttg cat tac gaa gaa ttg agt ctg 1635

Lys Ala Leu Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu Glu Leu Ser Leu 450 455 460 ggc aeg gga gtc tgt cgt gtc ttc aat egg eta gta gag gta gca tac 1683

Gly Thr Gly Val Cys Arg Val Phe Asn Arg Leu Val Glu Val Ala Tyr 465 470 475 get geg aaa gta tag ategaegaga gtttcccacc aacacagtta gaacaaggga 1738

Ala Ala Lys Val 480 atagtaegag agaaggagac agcaacctgg actttttgtt cctgatgttg catactttct 1798 egaatataeg tctccacgcc ttcaagtttc agcttcaact gattgtette agtaaccatc 1858 gcttgctcca actgggcgac ctgcagaatt gaagatcagt tttactgagt ttgtaccgag 1918 201142022 agtttcccaa attttgttgt aggctgatga cccaatccta gcatacactt taggaataag 1978 cagtctcaac ataattaggt ccatcattca gcaatttcga tacagcgcct gggattcgac 2038 gagtttacac gatgagtatg gcttgtaact ggccttctca aggtagcctt ggatctcccc 2098 gggcctcttg ccatcccatt cacccaatcg agattctgca gtctccaacc ttttctggaa 2158 gttctcaatc tgtaacctct gttgtagaga tagcatacgc cacaagacaa ggtctttgtg 2218 aacacagtcg tctaacaaac agcaagttgt gtggattggc atctaaataa ccgcctctgg 2278 tcaagtaaca gcaggtgttc cgcagtttcc aggaacatac tttgtttctg tcacagccag 2338 gcggtgaata gtaaagccaa ttcaacacat acgggagaag atgggtcgat atttgtattt 2398 ggcagggtgt ccagatttca cccatcagtc tctcacttgc ttgtatgtcc ctgacgtgct 2458 tcaaaatttt gcgcggggaa tcatcaatat acttaccatt tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa 2518 a 2519 8 201142022 <210>2 <211>481 <212>蛋白質 <213〉地錢 <400> 2

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Val Lys Gin Ser Ser Gly Gly Leu 15 10 15

Trp Ser Lys Trp Gly Thr Gly Ser Asn Leu Ser Phe Val Ser Arg Lys 20 25 30

Glu Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Ser Ser Pro Glu Ala Ser Thr Pro 35 40 45

Ala Ala Gin Gin Glu Lys Ser lie Ser Arg Glu Ser lie Pro Glu Gly 50 55 60

Phe Leu Thr Val Glu Glu Val Ser Lys His Asp Asn Pro Ser Asp Cys 65 70 75 80

Trp lie Val lie Asn Asp Lys Val Tyr Asp Val Ser Ala Phe Gly Lys 85 90 95

Thr His Pro Gly Gly Pro Val lie Phe Thr Gin Ala Gly Arg Asp Ala 100 105 110

Thr Asp Ser Phe Lys Val Phe His Ser Ala Lys Ala Trp Gin Phe Leu 115 120 125 9 201142022

Gin Asp Leu Tyr lie Gly Asp Leu Tyr Asn Ala Glu Pro Val Ser Glu 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Arg Asp Leu Arg Thr Ala Phe Met Arg Ser Gin 145 150 155 160

Leu Phe Lys Ser Ser Lys Met Tyr Tyr Val Thr Lys Cys Val Thr Asn 165 170 175

Phe Ala lie Leu Ala Ala Ser Leu Ala Val lie Ala Trp Ser Gin Thr 180 185 190

Tyr Leu Ala Val Leu Cys Ser Ser Phe Leu Leu Ala Leu Phe Trp Gin 195 200 205

Gin Cys Gly Tip Leu Ser His Asp Phe Leu His His Gin Val Thr Glu 210 215 220

Asn Arg Ser Leu Asn Thr Tyr Phe Gly Gly Leu Phe Trp Gly Asn Phe 225 230 235 240

Ala Gin Gly Tyr Ser Val Gly Trp Trp Lys Thr Lys His Asn Val His 245 250 255

His Ala Ala Thr Asn Glu Cys Asp Asp Lys Tyr Gin Pro lie Asp Pro 260 265 270

Asp He Asp Thr Val Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu lie Leu Ala 275 280 285

Thr Val Asp Asp Gin Phe Phe Arg Ser lie lie Ser Val Gin His Leu 290 295 300 201142022

Leu Phe Phe Pro Leu Leu Phe Leu Ala Arg Phe Ser Trp Leu His Ser 305 310 315 320

Ser Trp Ala His Ala Ser Asn Phe Glu Met Pro Arg Tyr Met Arg Trp 325 330 335

Ala Glu Lys Ala Ser Leu Leu Gly His Tyr Gly Ala Ser lie Gly Ala 340 345 350

Ala Phe Tyr lie Leu Pro lie Pro Gin Ala lie Cys Trp Leu Phe Leu 355 360 365

Ser Gin Leu Phe Cys Gly Ala Leu Leu Ser lie Val Phe Val lie Ser 370 375 380

His Asn Gly Met Asp Val Tyr Asn Asp Pro Arg Asp Phe Val Thr Ala 385 390 395 400

Gin Val Thr Ser Thr Arg Asn lie Glu Gly Asn Phe Phe Asn Asp Trp 405 410 415

Phe Thr Gly Gly Leu Asn Arg Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Ser 420 425 430

Leu Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Val Ala Pro His Val Lys Ala Leu 435 440 445

Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu Glu Leu Ser Leu Gly Thr Gly 450 455 460

Val Cys Arg Val Phe Asn Arg Leu Val Glu Val Ala Tyr Ala Ala Lys 465 470 475 480 201142022

Val <210>3 <211> 1577 <212> DNA <213〉地錢 <220〉 <221〉CDS <222> (194)..(1066) <400〉3 ctcaacgctc tctctcgccc gccctctgtc ttccgctgcg ccttcttctc ggcgcctctt 60 tctgtcgaga ggagcggcag ctgcagctct cgagagaggg gagcaggacg agagcgaggg 120 cgaatccgcc gagagtcgat cgggattggg tagaaggagg agaaggagga gaagaggagg 180 aggaggagca gcg atg gag gcg tac gag atg gtg gat agt ttt gtg teg 229

Met Glu Ala Tyr Glu Met Val Asp Ser Phe Val Ser 1 5 10 aag aeg gtt ttc gaa aeg ctg cag aga ctg agg ggc gga gtc gtg ttg 277

Lys Thr Val Phe Glu Thr Leu Gin Arg Leu Arg Gly Gly Val Val Leu 12 201142022 15 20 25 acg gaa tct gcg ate acc aaa ggt ttg cca tgc gtc gat age ccg aeg 325

Thr Glu Ser Ala lie Thr Lys Gly Leu Pro Cys Val Asp Ser Pro Thr 30 35 40 ccg ate gtt ett ggg ttg teg tee tac ttg aca ttc gtg ttt etc ggg 373

Pro lie Val Leu Gly Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Phe Val Phe Leu Gly 45 50 55 60 etc att gtc ate aag age ctg gat ett aag ccc ege tee aag gag ccc 421

Leu lie Val lie Lys Ser Leu Asp Leu Lys Pro Arg Ser Lys Glu Pro 65 70 75 gee att ttg aac ctg ttt gtg ate ttc cac aac ttc gtc tgc ttc gca 469

Ala lie Leu Asn Leu Phe Val lie Phe His Asn Phe Val Cys Phe Ala 80 85 90 etc agt ctg tac atg tgc gtg gga att gtc cgt caa get ate etc aac 517

Leu Ser Leu Tyr Met Cys Val Gly lie Val Arg Gin Ala lie Leu Asn 95 100 105 13 201142022 agg tac tct ctg tgg ggc aat gcg tac aat ccc aaa gaa gtt caa atg 565

Arg Tyr Ser Leu Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys Glu Val Gin Met 110 115 120 ggc cac ctg etc tac att ttc tac atg tea aag tac ate gag ttt atg 613

Gly His Leu Leu Tyr lie Phe Tyr Met Ser Lys Tyr lie Glu Phe Met 125 130 135 140 gac aeg gtc att atg att ttg aag ege aac aeg ege cag ate act gtg 661

Asp Thr Val lie Met lie Leu Lys Arg Asn Thr Arg Gin lie Thr Val 145 150 155 ttg cat gtg tac cac cac gca tee ate tee ttc ate tgg tgg ate ate 709

Leu His Val Tyr His His Ala Ser lie Ser Phe lie Trp Trp lie lie 160 165 170 gee tac cat get cct ggc ggt gaa get tat ttc tct gee gca ttg aac 757

Ala Tyr His Ala Pro Gly Gly Glu Ala Tyr Phe Ser Ala Ala Leu Asn 175 180 185 tee gga gta cat gtg etc atg tac etc tac tac ett ttg gca gca act 14 805 201142022

Ser Gly Val His Val Leu Met Tyr Leu Tyr Tyr Leu Leu Ala Ala Thr 190 195 200 ctg gga aag aac gag aaa get ege ege aag tac eta tgg tgg gga aaa 853

Leu Gly Lys Asn Glu Lys Ala Arg Arg Lys Tyr Leu Trp Trp Gly Lys 205 210 215 220 tac ttg aca cag ctg cag atg ttc cag ttt gtc ett aac atg att cag 901

Tyr Leu Thr Gin Leu Gin Met Phe Gin Phe Val Leu Asn Met lie Gin 225 230 235 get tac tac gat att aag aac aac teg cct tac cca caa ttt ttg ate 949

Ala Tyr Tyr Asp lie Lys Asn Asn Ser Pro Tyr Pro Gin Phe Leu lie 240 245 250 cag att ttg ttc tac tac atg ate teg ett tta geg eta ttt gga aac 997

Gin lie Leu Phe Tyr Tyr Met lie Ser Leu Leu Ala Leu Phe Gly Asn 255 260 265 ttt tac gtt cac aaa tac gta tea geg ccc gca aaa cct geg aag ate 1045

Phe Tyr Val His Lys Tyr Val Ser Ala Pro Ala Lys Pro Ala Lys lie 270 275 280 15 201142022 aag age aaa aag gca gaa taa gacaccaccc tagtgacaag aagattttac 1096

Lys Ser Lys Lys Ala Glu 285 290 actaaactgt agttttagca cccatcgttg acacgaatac attctggttc tgcctgtctt 1156 ggaagagteg aagcattcag gagctctccc gttccatcga tcaaactcgg aacgaagtgc 1216 accttttagc tgegatgaga gtctttactt cctgagccgt cgttcttgat gtggtctgta 1276 gctcagccat acgtgtagca tagctggaac atctggcttt tcaggaaagt cggcaaggca 1336 agaattegae ccttgaacta gacaaggttc tgctgattca gcaaccatta gtgagtcact 1396 ggttaacaaa atcacagttt tgggccctta gttagtgaca accaacccta acactttgat 1456 acacgagtta tegttegega gtggaagtgt aaaaatgtgc tttcccaatc atettgagtt 1516 ggttcctttt gaagtaaagg aaaattctat gattgttgag tccaaaaaaa aaaaaaaaaa 1576 1577 <210>4 201142022 <211>290 <212>蛋白質 <213>地錢 <400> 4

Met Glu Ala Tyr Glu Met Val Asp Ser Phe Val Ser Lys Thr Val Phe 1 5 10 15

Glu Thr Leu Gin Arg Leu Arg Gly Gly Val Val Leu Thr Glu Ser Ala 20 25 30 lie Thr Lys Gly Leu Pro Cys Val Asp Ser Pro Thr Pro lie Val Leu 35 40 45

Gly Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Phe Val Phe Leu Gly Leu lie Val lie 50 55 60

Lys Ser Leu Asp Leu Lys Pro Arg Ser Lys Glu Pro Ala lie Leu Asn 65 70 75 80

Leu Phe Val lie Phe His Asn Phe Val Cys Phe Ala Leu Ser Leu Tyr 85 90 95

Met Cys Val Gly lie Val Arg Gin Ala lie Leu Asn Arg Tyr Ser Leu 100 105 110

Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys Glu Val Gin Met Gly His Leu Leu 115 120 125

Tyr lie Phe Tyr Met Ser Lys Tyr lie Glu Phe Met Asp Thr Val lie 130 135 140 17 201142022

Met lie Leu Lys Arg Asn Thr Arg Gin lie Thr Val Leu His Val Tyr 145 150 155 160

His His Ala Ser lie Ser Phe lie Trp Trp lie lie Ala Tyr His Ala 165 170 175

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Val Leu Met Tyr Leu Tyr Tyr Leu Leu Ala Ala Thr Leu Gly Lys Asn 195 200 205

Glu Lys Ala Arg Arg Lys Tyr Leu Trp Trp Gly Lys Tyr Leu Thr Gin 210 215 220

Leu Gin Met Phe Gin Phe Val Leu Asn Met lie Gin Ala Tyr Tyr Asp 225 230 235 240 lie Lys Asn Asn Ser Pro Tyr Pro Gin Phe Leu lie Gin lie Leu Phe 245 250 255

Tyr Tyr Met lie Ser Leu Leu Ala Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Val His 260 265 270

Lys Tyr Val Ser Ala Pro Ala Lys Pro Ala Lys lie Lys Ser Lys Lys 275 280 285

Ala Glu 290 <210〉5 <211> 2307 18 201142022 <212〉DNA <213>地錢 <220> <221〉CDS <222> (375)..(1829) <400> 5 tcacattgct ggtcgtcgga gggaggtgca caatctgggg ggctgtcatc aatgcgacgg 60 tgtttcgaag agatcgctgc gagtggcgct gagtttcttg ccgctttcta cctgagctga 120 tgcctgctgc tgctgcctag agctgcttgg tgctgcttgg ggctgctata agagcgcgtc 180 gacagcgagt gtctctcgcg gtcctcattc gtggggtgct gtcgttccag tttagagccc 240 gctggacgta cagccggtgc tggaaattga ttttgtgaaa agcgagccta cctctatcca 300 tcatcgtcgc ccgtggtggc agatcttccg gattcctcat gcgcggatcg tggtcgcttt 360 gaaggtcgac agtt atg ccg cca cac gcc cct gac tcc aca ggt ctt ggg 410

Met Pro Pro His Ala Pro Asp Ser Thr Gly Leu Gly 5 10 19 201142022 ccc gaa gtt ttc cgc ctg cct gat gac gcg ate ccg gee cag gat ege 458

Pro Glu Val Phe Arg Leu Pro Asp Asp Ala lie Pro Ala Gin Asp Arg 15 20 25 aga tet aca cag aag aaa tac teg ett tea gac gtc age aag cac aac 506

Arg Ser Thr Gin Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Asp Val Ser Lys His Asn 30 35 40 act ccg aat gat tgc tgg etc gta att tgg ggg aag gtg tac gat gtt 554

Thr Pro Asn Asp Cys Trp Leu Val lie Trp Gly Lys Val Tyr Asp Val 45 50 55 60 act teg tgg gtt aag gtc cat cca ggt gga agt etc ate ttt gtg aag 602

Thr Ser Trp Val Lys Val His Pro Gly Gly Ser Leu lie Phe Val Lys 65 70 75 gcg gga cag gat tea aca caa etc ttt gat tet tat cac ccc etc tat 650

Ala Gly Gin Asp Ser Thr Gin Leu Phe Asp Ser Tyr His Pro Leu Tyr 80 85 90 gtc aga aag eta ett gca cag ttc tgc att ggt gaa etc caa aeg agt 20 698 201142022

Val Arg Lys Leu Leu Ala Gin Phe Cys lie Gly Glu Leu Gin Thr Ser 95 100 105 gcg gga gat gag aag ttc aag tct tea aeg ttg gag tat get ggt gaa 746

Ala Gly Asp Glu Lys Phe Lys Ser Ser Thr Leu Glu Tyr Ala Gly Glu 110 115 120 gaa cat gaa gta ttt tac cac act etc aag cag ege gtg gaa aeg tac 794

Glu His Glu Val Phe Tyr His Thr Leu Lys Gin Arg Val Glu Thr Tyr 125 130 135 140 ttc ege aag cag aag ata aat cct ega tac cat ccg caa atg ett gtg 842

Phe Arg Lys Gin Lys lie Asn Pro Arg Tyr His Pro Gin Met Leu Val 145 150 155 aag tea gee gtg ate att gga acc ett ett etc tgt tac tat ttt ggc 890

Lys Ser Ala Val lie lie Gly Thr Leu Leu Leu Cys Tyr Tyr Phe Gly 160 165 170 ttc ttc tgg tct caa aat gta etc etc teg atg ttt ctg gca age ate 938

Phe Phe Trp Ser Gin Asn Val Leu Leu Ser Met Phe Leu Ala Ser lie 175 180 185 21 201142022 atg ggg ttc tgc act gcg gag gtg ggc atg tcc ate atg cac gat ggt 986

Met Gly Phe Cys Thr Ala Glu Val Gly Met Ser lie Met His Asp Gly 190 195 200 aac cac gga teg tac aca caa tet acc ttg ett ggt tac gtc atg ggc 1034

Asn His Gly Ser Tyr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Gly Tyr Val Met Gly 205 210 215 220 gcc act ett gat ctg gtg gga get age agt ttc atg tgg agg cag cag 1082

Ala Thr Leu Asp Leu Val Gly Ala Ser Ser Phe Met Trp Arg Gin Gin 225 230 235 cat gtg gcc ggg cac cac teg ttc acc aac ate gac cat tac gat cca 1130

His Val Ala Gly His His Ser Phe Thr Asn lie Asp His Tyr Asp Pro 240 245 250 gac att cgt gtg aag gat cct gat tta ega egg gtt act tet caa caa 1178

Asp lie Arg Val Lys Asp Pro Asp Leu Arg Arg Val Thr Ser Gin Gin 255 260 265 ccc ega aga tgg ttt cac gag tat cag cat ate tac tta gga gta etc 22 1226 201142022

Pro Arg Arg Trp Phe His Glu Tyr Gin His lie Tyr Leu Gly Val Leu 270 275 280 tat ggc gtt ctt gcc tta aaa agt gtg ttg att gat gat ttc age gcc 1274

Tyr Gly Val Leu Ala Leu Lys Ser Val Leu lie Asp Asp Phe Ser Ala 285 290 295 300 ttc ttc agt ggt get ate ggc cca gta aag ata get caa atg aca cca 1322

Phe Phe Ser Gly Ala lie Gly Pro Val Lys lie Ala Gin Met Thr Pro 305 310 315 etc gag atg ggc gtc ttc tgg gga ggg aag gtt gtg tac gca ctg tac 1370

Leu Glu Met Gly Val Phe Trp Gly Gly Lys Val Val Tyr Ala Leu Tyr 320 325 330 atg ttt ttg etc cct atg atg tat ggt caa tac aac att ctt act ttc 1418

Met Phe Leu Leu Pro Met Met Tyr Gly Gin Tyr Asn lie Leu Thr Phe 335 340 345 att ggt etc tac att etc tea cag tta gtt gca ggg tgg act ctt gcc 1466 lie Gly Leu Tyr lie Leu Ser Gin Leu Val Ala Gly Trp Thr Leu Ala 350 355 360 23 201142022 etc ttc ttt caa gta gca cac gtt gtc gac gat gca gta ttt ccc gtt 1514

Leu Phe Phe Gin Val Ala His Val Val Asp Asp Ala Val Phe Pro Val 365 370 375 380 geg gaa aca gat ggt gga aaa gca aag att cct tet ggt tgg gca gaa 1562

Ala Glu Thr Asp Gly Gly Lys Ala Lys lie Pro Ser Gly Trp Ala Glu 385 390 395 atg cag gtc aga acc act acc aat ttc age tea ega tea atg ttc tgg 1610

Met Gin Val Arg Thr Thr Thr Asn Phe Ser Ser Arg Ser Met Phe Trp 400 405 410 aca cat att agt ggc ggt ctg aac cat cag ate gag cac cat ett ttc 1658

Thr His lie Ser Gly Gly Leu Asn His Gin lie Glu His His Leu Phe 415 420 425 ccg ggt gtc tgt cat gtt cac tac cca age ata cag cca ate gtg aag 1706

Pro Gly Val Cys His Val His Tyr Pro Ser lie Gin Pro lie Val Lys 430 435 440 get acc tgt gac gag ttc aac gtg cct tat act tee tac ccc act ttc 1754 24 201142022

Ala Thr Cys Asp Glu Phe Asn Val Pro Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr Phe 445 450 455 460 tgg gcg gcc ctt agg gca cat ttt caa cat ctg aaa aac gtc gga eta 1802

Trp Ala Ala Leu Arg Ala His Phe Gin His Leu Lys Asn Val Gly Leu 465 470 475 caa gat gga eta ega ctg gat ggc tga actgtgacag catgctttgg 1849

Gin Asp Gly Leu Arg Leu Asp Gly 480 . 485 gcctgcactt teagattteg gategaaggt gcgggcgatg gaaataatca gataagagtt 1909 gtaagtaacg ttcaggagga gageagaaeg gattgatgag tgtccatttg tgaggcttcc 1969 acctttcagg aacagaagtt gattegaatg cgaaacctcc aatgageatt tcacagccgt 2029 cttctccttg gccatcatgt gttcctccta gggagetteg gtttttggaa gttagteage 2089 ttactttcga agategttea acgctcaagg ctagattttg tcgacactat ttagttaggt 2149 ccgatagata ggtgataaga ttccggtgcc ctcacacatg tttcatcagt tgcgatgtaa 2209 25 201142022 ttccagtaat ccacgtatgt ggctccagtg tctgctgaaa tcagcacagg cagctatatc 2269 atgctccttg atctctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2307 <210〉6 <211〉484 <212>蛋白質 <213〉地錢 <400〉6

Met Pro Pro His Ala Pro Asp Ser Thr Gly Leu Gly Pro Glu Val Phe 15 10 15

Arg Leu Pro Asp Asp Ala lie Pro Ala Gin Asp Arg Arg Ser Thr Gin 20 25 30

Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Asp Val Ser Lys His Asn Thr Pro Asn Asp 35 40 45

Cys Trp Leu Val lie Trp Gly Lys Val Tyr Αφ Val Thr Ser Trp Val 50 55 60

Lys Val His Pro Gly Gly Ser Leu lie Phe Val Lys Ala Gly Gin Asp 65 70 75 80

Ser Thr Gin Leu Phe Asp Ser Tyr His Pro Leu Tyr Val Arg Lys Leu 85 90 95 26 201142022

Leu Ala Gin Phe Cys lie Gly Glu Leu Gin Thr Ser Ala Gly Asp Glu 100 105 110

Lys Phe Lys Ser Ser Thr Leu Glu Tyr Ala Gly Glu Glu His Glu Val 115 120 125

Phe Tyr His Thr Leu Lys Gin Arg Val Glu Thr Tyr Phe Arg Lys Gin 130 135 140

Lys lie Asn Pro Arg Tyr His Pro Gin Met Leu Val Lys Ser Ala Val 145 150 155 160 lie lie Gly Thr Leu Leu Leu Cys Tyr Tyr Phe Gly Phe Phe Trp Ser 165 170 175

Gin Asn Val Leu Leu Ser Met Phe Leu Ala Ser lie Met Gly Phe Cys 180 185 190

Thr Ala Glu Val Gly Met Ser lie Met His Asp Gly Asn His Gly Ser 195 200 205

Tyr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Gly Tyr Val Met Gly Ala Thr Leu Asp 210 215 220

Leu Val Gly Ala Ser Ser Phe Met Trp Arg Gin Gin His Val Ala Gly 225 230 235 240

His His Ser Phe Thr Asn lie Asp His Tyr Asp Pro Asp lie Arg Val 245 250 255

Lys Asp Pro Asp Leu Arg Arg Val Thr Ser Gin Gin Pro Arg Arg Tip 260 265 270 27 201142022

Phe His Glu Tyr Gin His lie Tyr Leu Gly Val Leu Tyr Gly Val Leu 275 280 285

Ala Leu Lys Ser Val Leu lie Asp Asp Phe Ser Ala Phe Phe Ser Gly 290 295 300

Ala lie Gly Pro Val Lys lie Ala Gin Met Thr Pro Leu Glu Met Gly 305 310 315 320

Val Phe Trp Gly Gly Lys Val Val Tyr Ala Leu Tyr Met Phe Leu Leu 325 330 335

Pro Met Met Tyr Gly Gin Tyr Asn lie Leu Thr Phe lie Gly Leu Tyr 340 345 350 lie Leu Ser Gin Leu Val Ala Gly Trp Thr Leu Ala Leu Phe Phe Gin 355 360 365

Val Ala His Val Val Asp Asp Ala Val Phe Pro Val Ala Glu Thr Asp 370 375 380

Gly Gly Lys Ala Lys lie Pro Ser Gly Trp Ala Glu Met Gin Val Arg 385 390 395 400

Thr Thr Thr Asn Phe Ser Ser Arg Ser Met Phe Trp Thr His lie Ser 405 410 415

Gly Gly Leu Asn His Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Gly Val Cys 420 425 430

His Val His Tyr Pro Ser lie Gin Pro lie Val Lys Ala Thr Cys Asp 435 440 445 28 201142022

Glu Phe Asn Val Pro Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr Phe Trp Ala Ala Leu 450 455 460

Arg Ala His Phe Gin His Leu Lys Asn Val Gly Leu Gin Asp Gly Leu 465 470 475 480

Arg Leu Asp Gly <210>7 <211>20 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <220> <221〉η <222> (12) <400〉7 tggtggaarg anaarcayaa 20 <210〉8 <211>21 <212〉DNA <213>人造序列 <220> 29 201142022 <223>人造序列之說明：引子 <220> <221>經修飾之鹼基 <222〉(4) <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (7) <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222〉（10) <223〉i <220> <221>經修飾之鹼基 <222>(13) <223〉i <400〉 8 rttnamccn ccngtraacc a 21 <210〉9 <211>22 201142022 <212〉DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 9 aagttgcctt cgatgtttct gg 22 <210> 10 <211〉22 <212> DNA <213>人造序列e <220> ) <223>人造序列之說明：引子 <400〉10 gctcgcctgg agcaaggaaa tc 22 <210>11 <211>20 <212〉DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：引子 31 201142022 <220〉 <221>經修飾之鹼基 <222> (3) <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222>(18) <223> i <400> 11 gtngarttya tggayacngt 20 <210> 12 <211>20 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (3) <223> i <220> 32 201142022 <221>經修飾之鹼基 <222>(12) <223> i <400> 12 cknccccara anarrtaytt 20 <210> 13 <211>22 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉13 gcgagctttc tcgttctttc cc 22 <210> 14 <211>22 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 14 33 201142022 tatgattttg aagcgcaaca eg 22 <210> 15 <211>22 <212>DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <220> <221〉經修飾之鹼基 <222〉⑹ <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (9) <223〉i <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (14) <223> i <400> 15 athrangma artntaygay gt 34 201142022 22 <210> 16 <211>23 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <220> <221〉經修飾之鹼基 <222> (3) <223> i <220〉 <221>經修飾之驗基 <222> (6) <223> i <220> <221>經修飾之鹼基 <222> (9) <223〉i <220> <221>經修飾之鹼基 <222>(18) 35 201142022 <223> i <400> 16 ggnaynkwnt sdatrtcngg rtc 23 <210> 17 <211〉22 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉17 gtgtgtacga tccgtggtta cc 22 <210> 18 <211>22 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉18 aaggcgggac aggattcaac ac 22 36 201142022

<210> 19 <211>30 <212〉DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉人造序列之說明：引子 <400> 19 ggaattcgcg atggcctcgt ccaccaccac 30 <210 20 <211>29 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 20 ggaattctac tttcgcagcg tatgctacc 29 <210〉21 <211>29 <212> DNA <213>人造序列 37 201142022 <220〉 <223>人造序列之說明：引子 <400> 21 ggaattcgcg atggaggcgt acgagatgg 29 <210 22 <211>29 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：引子 <400> 22 ggaattcttc tgcctttttg ctcttgatc 29 <210〉23 <211>30 <212〉DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：引子 <400> 23 38 201142022 gttgaattcg acagttatgc cgccacacgc 30 <210> 24 <211〉30 <212>DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 24 gttgaattca ggcccaaagc atgctgtcac 30 <210 25 <211>28 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 25 cgggatcctc tcctggcgca ccatcgtc 28 <210> 26 <211>28 39 201142022

<212>DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：引子 <400> 26 ggggtaccaa cgcgctttcc caccaacg 28 <210 27 <211> 29 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223〉人造序列之說明：引子 <400〉27 gctctagagc gatggcctcg tccaccacc 29 <210> 28 <211>29 <212> DNA <213〉人造序列e <220〉 40 201142022 <223>人造序列之說明：引子 <400〉28 gctctagact atactttcgc agcgtatgc 29 <210> 29 <211>30 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 29 gctctagagc gatggaggcg tacgagatgg 30 <210> 30 <211>27 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉30 gctctagatt attctgcctt tttgctc 27 41 201142022 <210>31 <211>29 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉31 gctctagaga cagttatgcc gccacacgc 29

<210 32 <211>29 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>人造序列之說明：引子 <400〉32 gctctagaag gcccaaagca tgctgtcac 29 <210〉33 <211>18 <212〉DNA <213>人造序列 42 201142022 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 33 caggaaacag ctatgacc 18 <210 34 <211>30 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 34 aaactgcaga ttcccgatct agtaacatag 30 <210>35 <211>30 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：引子 <400> 35 ccggaattcg catgcctgca ggtccccaga 43 201142022 30 <210 36 <211〉18 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子 <400> 36 tgtaaaacga cggccagt 18 <210〉37 <211>7 <212>蛋白質 <213>未知生物 <220> <221>Xaa <222> (4) <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <400〉37

Trp Trp Lys Xaa Lys His Asn <210> 38 5 201142022 <211>7 <212>蛋白質 <213>未知生物 <220〉 <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <400〉38

Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn 1 5 <210〉39 <211>7 <212>蛋白質 <213>未知生物 <220> <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <400> 39

Val Glu Phe Met Asp Thr Val 1 5 <210〉40 <211>7 <212>蛋白質 <213>未知生物 45 <220> 201142022 <223〉未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <400> 40

Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg 1 5 <210 41 <211>8 <212>蛋白質 <213〉未知生物 <220〉 <223>未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <220> <221> Xaa <222> (2) <223> Glu or Asn <220〉 <221> Xaa <222〉⑶ <223> Gly or Asp <400〉41 lie Xaa Xaa Lys Val Tyr Asp Val 1 5 <210> 42 46 201142022 <211〉8 <212>蛋白質 <213〉未知生物 <220> <223〉未知生物之說明：保存之胺基酸序列 <220> <221〉Xaa <222> (5) <223> Gin or Asp <220 <221> Xaa <222> (6) <223> Tyr or Thr <220〉 <221> Xaa <222> (7) <223> Met or Val <400> 42

Asp Pro Asp lie Xaa Xaa Xaa Pro 1 5 <210 43 <211>26 47 201142022 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子XbaMpELOf <400> 43 agtctctaga gcgatggagg cgtacg 26 <210 44 <211>26 <212〉DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子SacMpELOr <400> 44 cagtgagctc ggtgtcttat tctgcc 26 <210> 45 <211>29 <212〉DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：引子XbaMpD5f 48 201142022 <400> 45 agcttctaga gccatgccgc cacacgccc 29 <210 46 <211>26 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：引子SacMpD5r <400> 46 cagtgagctc tcagccatcc agtcgt 26 49

Claims (1)

1. 201142022 七 申5月專利範圍： 之種、爲馬具有A6月旨肪酸不飽和化活性且來自地錢目生物 蛋白質之基因’其係下列⑷或⑻中記載之基因： (I):有序列編號3所示之鹼基序列之基因；或 /、 十於序列編號3所示之驗基序列，具有至少9〇% 同—性的鹼基序列之基因。 之蛋二f具有Λ6月旨肪酸不飽和化活性且來自地錢目生物 1士質之基因，其係下列（…或⑦）中記載之基因： 鹼美二St: 3所示鹼基序列中之第194至1066號之 ίο二:編旒3所示鹼基序列中’具有相對於第194至 之基^之驗基Μ，具有至少慨同-性的驗基序列 之= 肪酸不飽和化活性且來自地錢目生物 因；或就4所示之胺基酸序列構成<蛋白質之基 (b)=^_4所示之胺基酸序列之 取代、删除、插入及/或附加所成：1〇個之胺 一籌成之蛋白質之基因。 成之按基酸序列 -:以(::請求項1至3中任何1U ⑷序列蝙號m之蛋白質： '^所編碼。 (b)由序列蝙號之胺基酸序列構成之蛋白質 苑4所不之胺基酸序列質；或 中1俩〜之胺基 4. 201142022 酸經取代、刪除、插入及/或附加所成之胺基酸序列構 成，且具有Λ6脂肪酸不飽和化活性之蛋白質。 6. —種重組表現載體，其包含至少請求項1至3之任何一項 之基因。 7. —種轉形細胞，其導入至少請求項1至3中任何一項之基 因。 8. —種以可表現之方式導入請求項1至3中任一項之基因之 植物體之製造方法，其係包含以可表現之方式導入至少請 求項1至3中任何一項之基因之步驟。 9. 一種含有花生四烯酸及二十碳五烯酸之脂肪酸之脂肪酸 組成被改變之植物體之製造方法，其包含以可表現之方式 導入至少請求項1至3中任何一項之基因之步驟。 10. —種脂肪酸之生產方法，其係使用以請求項9之方法所 獲得之植物體。 11. 一種改變植物體、細菌或酵母之含有花生四烯酸及二十 碳五烯酸之脂肪酸之脂肪酸組成之方法，其使用至少請 求項1至3中任何一項之基因。 2