JP2023505039A - 遺伝子編集のためのｔａｌエフェクターヌクレアーゼ - Google Patents

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Abstract

多重化組成物を使用して、ＦＡＤ３Ａ／Ｂ／Ｃ遺伝子などのいくつかの遺伝子における標的化された変異を一度に作製することを含む、ＴＡＬＥＮ組成物および使用方法、ＦＡＤ２タンパク質をコードする遺伝子などの単一の遺伝子における標的化された変異を作製するための組成物、ならびにそれらの組み合わせが開示される。組成物および方法は、対応する変化させられていない植物、植物部分、または植物細胞と比較して、改善された特徴を有する遺伝子編集された植物、植物部分、および植物細胞を提供し得る。例えば、標的化された変異を欠く対応する種子よりも比較的より高いオレイン酸のレベル、ならびにより低いリノール酸およびリノレン酸のレベルを有する油を含む種子を産生することができるダイズ植物、植物部分および植物細胞もまた提供される。【選択図】図１Ａ

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体の参照によって本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２０年１１月１９日に作成された、当該ＡＳＣＩＩコピーは、１７０２＿０２９ＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、４７，０３７バイトのサイズである。
低頻度切断エンドヌクレアーゼによる遺伝子編集を使用して、欠失、挿入を生成し、相同組換えを開始し得る。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、特異的な配列を標的化し、ＤＮＡにおいて正確な切断を生成し得る低頻度切断エンドヌクレアーゼである。１つのＴＡＬＥＮ設計プロセスは、約１５塩基対（ｂｐ）を認識する左ハーフＴＡＬＥＮ（ＨＴ）、それに続く約１５～１８ｂｐのスペーサー領域、および約１５ｂｐの右ＨＴ認識配列を前提とする（例えば、米国特許第８，４５０，４７１号を参照されたい）。このアプローチは、意図された標的に対する高いレベルの特異性を提供するが、しかしながら、複数の遺伝子編集能力が有利であろう。
本開示の態様は、ＴＡＬＥＮなどの低頻度切断エンドヌクレアーゼを使用する、遺伝子の編集（例えば、変異を導入することによる）のための組成物および方法に関する。
一態様では、組成物であって、第１の標的遺伝子の第１のハーフサイト配列に結合することができる第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸と、第２の核酸のセットと、を含む、組成物が本明細書において提供される。各第２の核酸は、第１の標的遺伝子の第２のハーフサイト配列または第２の標的遺伝子のセットに結合することができる第２の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする。この組成物において、第１のハーフサイト配列は、保存された配列であり、第１のハーフサイト配列および各第２のハーフサイト配列は、異なり、かつスペーサー配列によって分離されており、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーは、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼの各々とダイマーを形成することができ、したがって、ＴＡＬＥＮのセットを提供する。
いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが第１のハーフサイト配列に結合し、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが第２のハーフサイト配列に結合するときに、ダイマーは生細胞内で標的遺伝子を切断し得る。
いくつかの実施形態では、第１のハーフサイト配列は、１００％保存された配列である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、約１５～約１８ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、第１の核酸は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、各第２の核酸は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１の核酸は、ベクター中にある。いくつかの実施形態では、各第２の核酸は、ベクター中にある。いくつかの実施形態では、第１の核酸、および第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第２の核酸のセットは、単一のベクター中にある。
いくつかの実施形態では、第１の核酸は、プラスミド中のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、各第２の核は、プラスミド中のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の核酸および第２の核酸のセットは、プラスミド中のｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、第２の核酸のセットは、３つ以上の第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸のセットは、４つ以上の第２の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、第１の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ３遺伝子ファミリーの遺伝子である。いくつかの実施形態では、各第２の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ３遺伝子ファミリーの遺伝子である。
いくつかの実施形態では、第１の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ａ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第１の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｂ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第１の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｃ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第２の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ａ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第２の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｂ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第２の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｃ遺伝子の対立遺伝子である。
いくつかの実施形態では、第１のハーフサイト配列は、配列番号１８である。
いくつかの実施形態では、ここで、組成物は、第２のハーフサイト配列に結合することができる第２の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーを各々コードする、２つの第２の核酸を含み、第２のハーフサイト配列は、配列番号１７または配列番号１９である。
いくつかの実施形態では、組成物は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ２－１遺伝子ファミリーの対立遺伝子を標的とする１つ以上の低頻度切断エンドヌクレアーゼをさらに含む。１つ以上の低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＦＡＤ２－１ＡまたはＦＡＤ２－１Ｂを標的とするＴＡＬエフェクターヌクレアーゼであり得る。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、配列番号２７～３４のうちのいずれかに示される配列に結合するモノマーを含み得る。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、配列番号２７および２８、２９および３０、３１および３２、ならびに３３および３４からなる群から選択されるモノマーの対を含み得る。
いくつかの実施形態では、各第２の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ２遺伝子ファミリーの遺伝子である。いくつかの実施形態では、第１の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第１の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第２の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子の対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、第２の標的遺伝子は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の対立遺伝子である。
いくつかの実施形態では、第１のハーフサイト配列は、配列番号２５または２６内にある。
いくつかの実施形態では、組成物は、第２のハーフサイト配列に結合することができる第２の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーを各々コードする、２つの第２の核酸を含み、第２のハーフサイト配列は、配列番号１７または配列番号１９である。
別の態様では、本開示は、２つ以上の遺伝子内に変異を同時に導入する方法であって、２つ以上の遺伝子を有する細胞の集団を、上記の実施形態のうちの１つ以上による組成物と接触させることを含む、方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、上記の方法によって得られた、植物、植物部分、または植物細胞を特徴とする。植物、植物部分、または植物細胞は、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞であり得る。ダイズ植物部分、または植物細胞は、子葉細胞、種子、胚、胚形成性カルス細胞、および花粉細胞からなる群から選択され得る。
別の態様では、本開示は、上記の実施形態に記載されるダイズ植物、植物部分、または植物細胞によって産生されたダイズ油を含む、ダイズ油組成物であって、ダイズ油は、２つ以上の遺伝子における変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、オレイン酸含有量の増加、リノール酸含有量の減少、およびリノレン酸含有量の減少のうちの１つ以上を有する、ダイズ油組成物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる１つ以上の変異を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、植物、植物部分、または植物細胞は、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、オレイン酸含有量の増加を有する油を産生し、少なくとも１つの変異は、配列番号２７～３４に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発される、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる変異を有するダイズ植物を生成するための方法であって、方法は、（ａ）機能的ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子を有するダイズ植物からのダイズ植物細胞の集団を、配列番号２７～３４に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸配列と接触させることと、（ｂ）集団から、ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子またはＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の発現が低下している細胞を選択することと、（ｃ）選択された植物細胞をダイズ植物に再生することと、を含む、方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分、または植物細胞によって産生されたダイズ油を含む、ダイズ油組成物であって、ダイズ油は、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、オレイン酸含有量の増加、リノール酸含有量の減少、およびリノレン酸含有量の減少のうちの１つ以上を有し、１つ以上の変異は、配列番号２７～３４に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異を含む、ダイズ油組成物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、１つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、または１つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子、および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、における変異の第１のセットであって、変異の第１のセットは、第１の標的遺伝子の第１のハーフサイト配列に結合することができる第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸と、第２の核酸のセットであって、各第２の核酸は、第１の標的遺伝子の第２のハーフサイト配列および少なくとも１つの第２の標的遺伝子に結合することができる第２の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする、第２の核酸のセットと、の発現によって誘発され、第１のハーフサイト配列は、保存された配列であり、第１のハーフサイト配列および各第２のハーフサイト配列は、異なり、かつスペーサー配列によって分離されており、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーは、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼの各々とダイマーを形成することができる、変異の第１のセットと、１つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子、または１つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子、および１つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子、における変異と、を含み、植物、植物部分、または植物細胞は、変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、リノレン酸含有量の減少、オレイン酸含有量の増加、およびリノール酸含有量の減少を有する油を産生する、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞を特徴とする。植物、植物部分、または植物細胞は、導入遺伝子を欠き得る。植物部分は、種子であり得る。１つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子への変異は、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発されている場合がある。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼであり得る。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、配列番号２７～３４のうちのいずれかに示される配列に結合し得る。１つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子、および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子、および１つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子は変異し得る。
別の態様では、本開示は、ＦＡＤ３Ａ遺伝子、ＦＡＤ３Ｂ遺伝子、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子のうちの少なくとも２つの発現を低下させる変異を含むダイズ植物を生成するための方法であって、（ａ）機能的ＦＡＤ３Ａ遺伝子、ＦＡＤ３Ｂ遺伝子、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子を有するダイズ植物からのダイズ植物細胞の集団を、組成物であって、第１の標的遺伝子の第１のハーフサイト配列に結合することができる第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸と、第２の核酸のセットであって、各第２の核酸は、第１の標的遺伝子の第２のハーフサイト配列および少なくとも１つの第２の標的遺伝子に結合することができる第２の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする、第２の核酸のセットと、を含む、組成物と接触させることであって、第１のハーフサイト配列は、保存された配列であり、第１のハーフサイト配列および各第２のハーフサイト配列は、異なり、かつスペーサー配列によって分離されており、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーは、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼの各々とダイマーを形成することができ、第１の標的遺伝子は、ＦＡＤ３Ａ遺伝子であり、少なくとも１つの第２の標的遺伝子は、ＦＡＤ３Ｂ遺伝子およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子から選択される、接触させることと、（ｂ）集団から、第１の標的遺伝子および少なくとも１つの第２の標的遺伝子の発現が低下している細胞を選択することと、（ｃ）選択された植物細胞をダイズ植物に再生することと、を含む、方法を特徴とする。第１または第２のモノマーは、配列番号４～１９に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができ得る。
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、添付の図面と併せて考慮される際に、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるようになるため、より容易に認められるであろう。
本開示の１つ以上の実施形態による、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ３遺伝子ファミリーを標的化する例示的な多重ＴＡＬＥＮのアラインメントを示す。（Ａ）ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０１－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０１－Ｒ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０２－Ｌ１、およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０２－Ｒ１（それぞれ、出現順に、配列番号４５～４８）のアラインメント。 （Ｂ）ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０３－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０３－Ｒ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０４－Ｌ１、およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０４－Ｒ１（それぞれ、出現順に、配列番号４９～５２）のアラインメント。 （Ｃ）ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０５－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０５－Ｒ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０６－Ｌ１、およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０７－Ｌ１（それぞれ、出現順に、配列番号５３～５６）のアラインメント。 （Ｄ）ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０８－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０８－Ｒ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｌ１、およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｒ１（それぞれ、出現順に、配列番号５７～６０）のアラインメント。 本開示の１つ以上の実施形態による、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ２遺伝子ファミリーを標的化する例示的なＴＡＬＥＮのアラインメントを示す。（Ａ）ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０１－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０１－Ｒ１（それぞれ、出現順に、配列番号６１～６２）。 （Ｂ）ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０２－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０２－Ｒ１、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０３－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０３－Ｒ１、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０４－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０４－Ｒ１、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０５－Ｌ１、およびＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０５－Ｒ１（それぞれ、出現順に、配列番号６３～６５）のアラインメント。 図２Ｂの図の拡大した部分を、配列の拡大のためにＢ－１の図として示す。出現順に、図２Ｂ－１は配列番号６３～６５の残基１～４４を開示する。 図２Ｂの図の拡大した部分を、配列の拡大のためにＢ－２の図として示す。すべてそれぞれ、出現順に、図２Ｂ－２は配列番号６３～６５の残基４５～１０３を開示する。
特異的に操作された低頻度切断エンドヌクレアーゼ技術を使用して、単一の遺伝子配列を標的化するか、または複数の類似の遺伝子配列、例えば、植物のＦＡＤ３遺伝子ファミリーなどの遺伝子ファミリーの一部である遺伝子を同時に標的化するための組成物および方法が本明細書において提供される。
低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはクラスター化され規則的に配置された短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）であり得る。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、約１２～４０塩基対（ｂｐ）長、またはそれ以上の長さ（例えば、長さで１４～４０、１５～３６、または１６～３２；例えば、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：２３－２６，２０１２を参照されたい）の認識配列（標的配列）を有する核酸配列に向けられたエンドヌクレアーゼ活性を有する天然のまたは操作されたタンパク質であり得る。典型的な低頻度切断エンドヌクレアーゼは、それらの認識部位の内部で切断を引き起こし、３’ＯＨまたは５’ＯＨオーバーハングを有する４ヌクレオチド（ｎｔ）の互い違いの切断を残す。いくつかの実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、野生型またはバリアントホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、ドデカペプチドファミリーに属するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＷＯ２００４／０６７７３６を参照されたい）などのメガヌクレアーゼである。
低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的に配置された短い回文反復）適応免疫系からのＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼに基づき得る。このシステムは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短い配列モチーフに隣接するＤＮＡ配列の切断を可能にする。切断は、標的配列に相補的である特異的ｃｒＲＮＡを操作することによって達成される。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と複合体を形成する。二重トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）：ｃｒＲＮＡ構造は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを標的配列に向けるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として作用する。ＦＡＤ２－１遺伝子ファミリーまたはＦＡＤ３遺伝子ファミリーにおいて見出される配列中のＰＡＭモチーフは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを異種性に発現しており、ｃｒＲＮＡを用いてトランスフェクトされた植物細胞における変異の導入または１つ以上の標的化された遺伝子の不活性化に特異的なｃｒＲＮＡの設計を可能にする。
いくつかの実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインと、切断活性を有する触媒ドメインと、を含有する融合タンパク質である。ＴＡＬＥヌクレアーゼおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインの、エンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩの触媒ドメインとの融合物の例である。特別注文のＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ（商標）の商品名の下で市販されている（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）。転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターの特異性は、エフェクター可変反復に依存する。多型は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる反復位置１２および１３に主に存在する。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、その標的部位におけるヌクレオチドに、直接的で直線的な様式で、１つのヌクレオチドに対して１つのＲＶＤで、いくらかの縮重を有して、見かけ上の文脈依存なしで対応する。タンパク質－ＤＮＡ認識のためのこの機構は、新たな標的特異的ＴＡＬエフェクターのための標的部位予測、ならびに選択された部位に対する結合特異性を有する新たなＴＡＬエフェクターの標的部位選択および操作を可能にする。
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを、エンドヌクレアーゼ配列などの他の配列に融合させ、特異的な選択されたＤＮＡ配列を標的とするキメラエンドヌクレアーゼをもたらし、標的化された配列でのまたはその付近でのＤＮＡのその後の切断を導き得る。ＤＮＡにおけるそのような切断（二本鎖切断）は、例えば、ＮＨＥＪまたは相同組換えを介して野生型ＤＮＡ配列中に変異を誘発し得る。ＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して、複雑なゲノムにおける部位特異的変異誘発を容易にし、大きな正確さおよび高い効率で、ノックアウトするか、またはそうでなければ遺伝子機能を変化させ得る。
内因性標的配列を選択し、そのような配列を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼを生成するための方法は、当該技術分野において記載されているように行われ得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０７２２４６号（参照により組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位を特異的に特定するソフトウェアが使用され得る。
いくつかのエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）は、ダイマーとして機能し、それによって標的特異性を増強する。２つのＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位が近接している場合、不活性モノマーが一緒になって、ＤＮＡを切断する機能的酵素を作製し得る。ヌクレアーゼを活性化するためにＤＮＡ結合を必要とすることによって、高度に部位特異的な制限酵素が作製され得る。
本開示のＴＡＬＥＮには、共通の（例えば、保存された）配列を含む複数の遺伝子を標的化することができるＴＡＬＥＮが含まれる。本開示のＴＡＬＥＮは、共通の第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマー（例えば、左ハーフＴＡＬＥＮ（左ＨＴ）または右ハーフＴＡＬＥＮもしくは（右ＨＴ））、および第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのセット（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の第２のＨＴ）を含み、ここで、共通のＨＴは、すべての意図された配列の標的化を可能にするように、第２のＨＴのうちのいずれかとダイマーを形成することができる。本明細書で使用される場合、「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマー」、「ハーフＴＡＬＥＮ」、および「ＨＴ」という用語は、互換的に使用される。これらの第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマー、および第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのセットは、ＦＡＤ２－１遺伝子（例えば、ＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂのうちの少なくとも１つ）の配列などの単一の配列を標的化するように操作されたＴＡＬＥＮとの組み合わせで使用され得る。
開示される組成物および方法の使用は、配列間のほぼ保存された同一性の領域を決定するための、目的の遺伝子配列のアラインメントを含む。いくつかの実施形態では、共通の第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマー（例えば、左ＨＴまたは右ＨＴ）は、本開示の組成物および方法によって標的化されるすべての遺伝子にわたって約１００％保存された、約９５％保存された、約９０％保存された、約８５％保存された、または約８０％保存された配列を標的化する。
例えば、一実施形態では、１００％保存された標的化領域が、左ＨＴ結合ドメイン（ハーフサイト配列）のために選択される。右ＨＴ結合ドメインのために、各非保存配列について特有のＨＴが設計されて、標的化を可能にする。この非限定的な例では、遺伝子１は、左ＨＴ＃１および右ＨＴ＃１によって標的化され、遺伝子２は、左ＨＴ＃１および右ＨＴ＃２によって標的化され、遺伝子３は、左ＨＴ＃１および右ＨＴ＃３によって標的化される、など。
同様に、例えば、別の実施形態では、１００％保存された標的化領域が、右ＨＴ結合ドメインのために選択される。左ＨＴ結合ドメインのために、各非保存配列について特有のＨＴが設計されて、標的化を可能にする。この非限定的な例では、遺伝子１は、左ＨＴ＃１および右ＨＴ＃１によって標的化され、遺伝子２は、左ＨＴ＃２および右ＨＴ＃１によって標的化され、遺伝子３は、左ＨＴ＃３および右ＨＴ＃１によって標的化される、など。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法によって標的化される遺伝子は、同じタンパク質または異なるタンパク質をコードし得る（例えば、共通のＨＴは、遺伝子のすべてにおいて保存されているかまたは同一である配列を標的化する）。いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法によって標的化される遺伝子は、遺伝子の対立遺伝子である。
いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子は、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、またはＦＡＤ３Ｃ遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子は、配列番号１～３である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子のうちのいずれか２つにおいて、標的化し得る、例えば、変異を導入し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子の３つすべてにおいて、標的化し得る、例えば、変異を導入し得る。１つ以上の変異は、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、またはＦＡＤ３Ｃ遺伝子のコード配列または非コード配列中に存在し得る。ネイティブなダイズ遺伝子のゲノム配列は、Ｓｏｙｂａｓｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｓｏｙｂａｓｅ．ｏｒｇ）において見出され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、配列番号４～１９から選択される配列、または配列番号１～３のうちのいずれか１つ内の配列に結合することができる転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、ＦＡＤ２－１ＡまたはＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちのいずれかにおいて、標的化し得る、例えば、変異を導入し得る。いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子は、ＦＡＤ２－１ＡまたはＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子である。１つ以上の変異は、ＦＡＤ２－１ＡまたはＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のコード配列または非コード配列中に存在し得るダイズＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の内因性の例示的なゲノム配列を、それぞれ配列番号２３および２４に示す。いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子は、配列番号２３もしくは２４、または配列番号２３もしくは２４との少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するその機能的バリアントである。時おり、標的化された配列は、配列番号２５または２６に示されるコード配列などの、ＦＡＤ２－１ＡまたはＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のコード配列内にある。標的配列は、配列番号２５もしくは２６、または配列番号２５もしくは２６との少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するその機能的バリアント内の配列であり得る。
任意の核酸配列と、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）によって参照される配列との間のパーセント配列同一性は、従来の方法によって決定され得る。一例では、核酸配列は、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアローンバージョンからのＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用して、配列番号に示された配列と比較される。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列された配列として提示する。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは、整列された配列を提示しない。一旦整列されると、マッチの数は、同一のヌクレオチド残基が両方の配列において示される位置の数を計数することによって決定される。パーセント配列同一性は、マッチの数を、特定された配列（例えば、配列番号１）に示された配列の長さ、または分節された長さ（例えば、特定された配列に示された配列からの１００個の連続したヌクレオチド）のいずれかで割り、続いて、得られた値に１００を掛けることによって決定される。パーセント配列同一性の値は、最も近い１０分の１に丸められる。例えば、標的化された遺伝子は、配列番号２０、２１、２２、２５、または２６に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するコード配列を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちの少なくとも１つのゲノム配列またはコード配列内の配列に結合することができる転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーを含み、例えば、ＴＡＬＥＮモノマーは、配列番号２７～３４のうちの１つから選択され得、配列番号２７および２８、２９および３０、３１および３２、３３および３４、ならびに３５および３６からなる群から選択されるモノマーの対、またはこれらの配列の機能的バリアントが含まれ得る。機能的バリアントは、例えば、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、または挿入を有する配列を含むが、所望される活性を保持する。機能的バリアントは、当業者に利用可能ないくつかの方法のうちのいずれかによって、例えば、部位特異的変異誘発、誘発変異、対立遺伝子バリアントとして同定、制限酵素の使用を通した切断などによって作製され得る。
本明細書に開示される組成物は、本開示のＴＡＬＥＮおよび本開示のＴＡＬＥＮをコードする核酸を含む。したがって、いくつかの実施形態では、組成物であって、組成物によって標的化されるすべての遺伝子にわたって保存された共通の配列を標的化するＨＴをコードする第１の核酸と、第２の配列を標的化する複数の第２のＨＴをコードする第２の核酸のセットとを含み、共通の配列を標的化するＨＴは、第２のＨＴの各々とダイマーを形成することができる、組成物が本明細書において提供される。
ＴＡＬＥＮ遺伝子編集は、適切なプロモーター、ターミネーター、およびレシピエント細胞における発現に必要な他の非コード配列を含むプラスミド中にコードされたＤＮＡ認識ドメインおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含有する２つのハーフＴＡＬＥＮタンパク質の遺伝子特異的標的化に基づく。ＦｏｋＩは、ダイマーの組み合わせでのみ活性であり、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集に必要なエンドヌクレアーゼＤＮＡ切断を可能にするために、２つのハーフＴＡＬＥＮが必要とされる。
本開示の組成物は、真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または原核細胞に送達され得る。細胞中への導入は、当業者に既知の複数の方法で達成され得る。遺伝子編集ＴＡＬＥＮの導入の一般的な方法には、ＴＡＬＥＮ遺伝子カセットを含むプラスミドを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を用いた形質転換、ＴＡＬＥＮ配列カセットをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡを用いた微粒子銃、およびＴＡＬＥＮ配列カセットをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡを用いたＰＥＧ媒介性形質転換が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を使用して、組成物によってコードされたハーフＴＡＬＥＮタンパク質のセットを生成し得る。ハーフＴＡＬＥＮタンパク質は、例えば、ＰＥＧ媒介性トランスフェクション（例えば、Ｌｕｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１５ Ｓｅｐ；８（９）：１４２５－７に記載される技術など）を含む複数の方法によって、単離され、その後、植物細胞などの標的細胞中に導入され得る。
植物細胞は、ダイズ植物からのものであり得る。「ダイズ植物」または「植物部分」という用語は、任意の発生段階のダイズ植物、または植物カッティング、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、植物種子、および小植物を含むダイズ植物の部分を含むように広く使用される。植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一細胞もしくは細胞の凝集体、例えば、脆いカルス、または培養細胞の形態であり得るか、あるいはより高度に組織化された単位の一部、例えば、植物組織、植物器官、または植物であり得る。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または植物全体に再生し得る細胞もしくは細胞の集合であり得る。そのため、複数の植物細胞を含み、植物全体に再生することができる種子は、本開示の目的のための植物細胞であると考えられる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造的もしくは機能的単位に組織化される植物細胞の任意の他の群であり得る。植物の特に有用な部分には、収穫可能な部分および子孫植物の繁殖に有用な部分が含まれる。植物の収穫可能な部分は、植物の任意の有用な部分、例えば、花、花粉、実生、葉、茎、鞘、種子、根、根粒などであり得る。繁殖に有用な植物の部分には、例えば、種子、鞘、カッティング、実生、根茎などが含まれる。「種子」は、それが受精の存在下または非存在下で形成されるかどうかにかかわらず、かつ種子構造が稔性または不稔性であるか否かにかかわらず、開花時のその正常な成熟点に続いて、植物の胚珠の連続的な分化によって形成される任意の植物構造を指す。
低頻度切断エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥＮ）は、植物細胞における発現のために核酸配列によってコードされ得るか、またはタンパク質として導入され得る。配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸は、低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードするＴ－ＤＮＡを用いた植物部分もしくは植物細胞（例えば、葉、茎、葉柄、節間外植片、カルス、もしくはプロトプラスト）のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を用いた植物部分もしくは植物細胞の微粒子銃形質転換、細胞透過性ペプチド媒介性形質転換、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性形質転換によってダイズ植物に導入され得る。例えば、プロトプラストは、表面滅菌された葉から単離され、１つ以上の低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いてＰＥＧの存在下で形質転換され得る。形質転換効率は、ＹＦＰプラスミドなどの検出可能なマーカーの送達によってモニターされ得、これは、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーを使用して可視化され得る。ＰＥＧ媒介性形質転換の後、プロトプラストは、プロトプラスト培養の当業者に既知の方法および培地を使用して培養され得る。培養物中での好適な長さの時間の後、変異体として同定されたプロトプラスト由来のカルスは、増殖させられ、シュート誘導培地に移され、次いで（一旦根が形成されると）土壌に移され、種子生産のために成熟するまで成長させられ得る。
低頻度切断エンドヌクレアーゼは、一過性発現のための方法を使用して、または宿主ゲノム中への安定組み込みのための方法を使用することによって、ダイズ植物に送達され得る。配列特異的ヌクレアーゼを一過性に送達するために、形質転換されたダイズ植物部分または植物細胞（例えば、上記の方法を使用して）を、選択薬剤を含有しない再生培地上に置き得、ダイズ植物を再生させ得る。再生された植物をスクリーニングして、誘発された変異を含有するものを同定し得る。ゲノム操作試薬を宿主ゲノム中に安定に組み込むために、低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、植物選択マーカーをコードする核酸と共に同時送達され得る。選択マーカーは、低頻度切断エンドヌクレアーゼと同じベクター上に保持され得るか、または別個のベクターとして送達され得る。形質転換の後、ダイズ植物部分または植物細胞は、適切な選択薬剤を含有する再生培地上に置かれ得る。形質転換された植物細胞は、トランスジェニックダイズ植物に再生され得る。いくつかの場合では、ダイズ植物は、導入遺伝子または任意の外因性ＤＮＡ（例えばＴ－ＤＮＡ）を含まない。外因性ＤＮＡ（例えば、配列特異的ヌクレアーゼ配列）を含まない子孫は、分離によって生成され得る。分離は、誘発された変異を安定化し、バイオセーフティの懸念を満足させ得る。
上記の方法において、低頻度切断エンドヌクレアーゼを、１つ以上のエキソヌクレアーゼタンパク質をコードするプラスミドと共に植物細胞に同時送達して、配列特異的ヌクレアーゼ誘発性変異誘発効率を増加させ得る。そのようなエキソヌクレアーゼには、ＴＲＥＸ２などの、エキソヌクレアーゼのＴＲＥＸ（３’修復エキソヌクレアーゼ）ファミリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない。
本開示は、高オレイン酸脂肪酸および／または低リノール酸もしくはリノレン酸脂肪酸油を提供するために特に好適なダイズ植物および関連産物（例えば、種子および植物部分）を生成するために、低頻度切断エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用して、ＦＡＤ２またはＦＡＤ３をコードする１つ以上の遺伝子を編集するための材料および方法を提供する。本開示の組成物を使用する方法は、ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子、ＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子、ＦＡＤ３Ａ遺伝子、ＦＡＤ３Ｂ遺伝子、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子のうちの１つ以上を発現するダイズ植物細胞（例えばプロトプラスト）の集団を、１つ以上の遺伝子において標的化された変異を誘発するように操作された低頻度切断エンドヌクレアーゼと接触させることと、集団から、１つ以上の遺伝子の発現を低下させる変異を有する細胞を選択することと、を含み得る。加えて、方法は、１つ以上の標的化された遺伝子座（例えば、ＦＡＤ２－１Ａ、ＦＡＤ２－１Ｂ、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、またはＦＡＤ３Ｃ遺伝子座）の少なくとも一部を含有するゲノムＤＮＡを植物細胞から単離するステップを含み得る。いくつかの場合では、方法は、変異を含有する植物細胞を培養して、１つ以上の植物系統を生成するステップを含む。種子などのダイズ植物の部分は、脂肪酸を合成および蓄積し、これは同定および定量化され得る。例えば、実施例に記載されるような植物部分の脂肪酸組成の分析によって、変異が、変異を含有しないダイズ植物と比較して、生成された植物系統におけるオレイン酸のレベルの増加、リノール酸のレベルの減少、リノレン酸のレベルの減少、またはこれらの特徴の組み合わせを導くことが確認され得る。
特定の実施形態では、標的化された遺伝子の発現は、誘発された変異によって低下させられる。植物、植物部分、または植物細胞における遺伝子の発現を低下させることは、遺伝子の転写および／またはコードされたポリペプチドの翻訳が、遺伝子またはポリペプチドの発現が阻害、妨害、ノックアウト、またはノックダウンされていない対応する対照植物、植物細胞、または植物もしくは植物細胞の集団と比較して、低下するように、遺伝子を阻害、妨害、ノックアウト、またはノックダウンすることを含む。低下は、対応する対照植物、植物細胞、または植物もしくは植物細胞の集団と比較しての、発現レベルの任意の減少（例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または１００％さえの減少）を包含する。いくつかの実施形態では、発現を５０％以上低下させることは、特に有用であり得る。発現レベルは、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、核ランオンおよび／または核ランオフ、ＲＮａｓｅプロテクションなどの方法、あるいはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、およびウエスタンブロッティングなどの免疫学的および酵素的方法を使用して測定され得る。
低頻度切断エンドヌクレアーゼは、配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ベクターもしくはｍＲＮＡ）を介して、またはタンパク質として、細胞の集団中に導入され得る。例えば、１つ以上のＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子内に存在する保存されたヌクレオチド配列を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする核酸を使用して、ダイズ植物細胞または植物部分（例えば、プロトプラスト）を形質転換し得、そこでそれらを発現させ得る。いくつかの場合では、ＴＡＬＥヌクレアーゼタンパク質は、ダイズ植物細胞または植物部分（例えば、プロトプラスト）中に導入され得る。これらの細胞もしくは植物部分、またはこれらの細胞から生成された植物細胞株もしくは植物部分を分析して、次世代シーケンシング技術（例えば、４５４パイロシーケンシングまたはＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング）を使用して変異が標的部位で導入されているかどうかを決定し得る。配列決定のための鋳型は、保存されたヌクレオチド配列に相同なプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された標的化された遺伝子であり得る。細胞はまた、任意のオフターゲット変異について分析され得る。
いくつかの実施形態では、複数のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を使用して、ダイズ植物細胞または植物部分（例えば、プロトプラスト）を形質転換し得、そこでそれらを発現させる。これらのＴＡＬＥヌクレアーゼは、タンパク質として植物細胞または部分中に導入され得る。発現させられたかまたは導入されたＴＡＬＥヌクレアーゼは、同じ染色体上で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、介在配列の欠失をもたらし得る。これらの細胞もしくは植物部分、またはこれらの細胞から生成された植物細胞株もしくは植物部分は、標的化された遺伝子の消失について分析され得る。ＦＡＤ２－１遺伝子ファミリーまたはＦＡＤ３遺伝子ファミリーを含有する遺伝子座の欠失は、定性的または定量的手段で分析され得る。例えば、第１のプライマーは、第１のＴＡＬＥヌクレアーゼ標的部位の上流の配列に相同であるように設計され得、第２のプライマーは、第２のＴＡＬＥヌクレアーゼ標的部位の下流の配列に相補的であるように設計され得る。標的化された欠失が生じた場合、ＰＣＲ産物が得られる。標的化された遺伝子を含有する遺伝子座の欠失はまた、ｑＰＣＲによって分析され得る。非改変対照に対してより低い標的化された遺伝子のコピー数は、意図された欠失の存在を示唆し得る。Ｔ７Ｅ１アッセイにおいて、ゲノムＤＮＡを、プールされたカルスから単離し得、標的化された遺伝子のＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位に隣接する配列をＰＣＲ増幅し得る。次いで、増幅産物を、変性および再アニールさせ得る。再アニールさせられたフラグメントがヘテロ二重鎖を形成する場合、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、ミスマッチの部位で切断する。消化された産物を、ゲル電気泳動によって可視化して、ＴＡＬＥヌクレアーゼの変異誘発活性を定量化し得る。
配列特異的ヌクレアーゼを送達するためにダイズ植物細胞の集団を接触させるための方法には、配列特異的ヌクレアーゼをコードするＴ－ＤＮＡを用いた植物部分もしくは植物細胞（例えば、葉、茎、葉柄、節間外植片、カルス、もしくはプロトプラスト）のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を用いた植物部分もしくは植物細胞の微粒子銃形質転換、および／または精製された配列特異的ヌクレアーゼもしくは配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）を用いた植物部分もしくは植物細胞の細胞透過性ペプチド媒介性形質転換が含まれ得る。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性形質転換を使用して、配列特異的ヌクレアーゼを送達し得る。例えば、プロトプラストは、表面滅菌された葉から単離され、１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードするプラスミドを用いてＰＥＧの存在下で形質転換され得る。形質転換効率は、ＹＦＰプラスミドなどの検出可能なマーカーの送達によってモニターされ得、これは、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーを使用して可視化され得る。ＰＥＧ媒介性形質転換の後、プロトプラストは、プロトプラスト培養の当業者に既知の方法および培地を使用して培養され得る。培養物中での好適な長さの時間の後、変異体として同定されたプロトプラスト由来のカルスは、増殖させられ、シュート誘導培地に移され、次いで（一旦根が形成されると）土壌に移され、種子生産のために成熟するまで成長させられ得る。
いくつかの場合では、ダイズ植物は、植物、植物部分、または植物細胞によって産生される油の脂肪酸組成を変化させることに向けられた複数の変異を含む。ＦＡＤ２およびＦＡＤ３タンパク質の発現を調節する変異を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞を特徴とする実施形態であって、植物、植物部分、または植物細胞が、１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、オレイン酸の増加、リノール酸およびリノレン酸脂肪酸含有量の減少を有する油を産生する、実施形態は、本開示の範囲内にある。標的化されたＦＡＤ２－１Ａ、ＦＡＤ２－１Ｂ、またはＦＡＤ３Ａ／Ｂ／Ｃ発現変異体は、限定されないが、目的のダイズの任意の株、種、または栽培品種に対して与えられ得る。いくつかの実施形態では、標的化された遺伝子編集または他の遺伝子改変は、より高いオレイン酸のレベルおよびより低いリノール酸またはリノレン酸のレベルのために、特徴（例えば、遺伝的素因）をすでに持つ生殖質または他の植物組織に与えられ得る。
変異体ダイズ系統は、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３以外のタンパク質の発現を提供するかまたは変化させる変異を含み得る。組み合わせの効果は、複数の別個の核酸構築物または形質転換事象の使用を含み得る。例えば、上記のような複数の構築物は、得られる産物がそのゲノム中に組み込まれた両方の特徴を有する植物である限り、２つの転写カセットを単一の形質転換ベクター中に含めることによるそのような形質の導入、２つの発現構築物の同時形質転換、第２の発現構築物を用いた再形質転換を含む同じかもしくは異なる方法によって、または伝統的な植物育種方法を介してトランスジェニック植物を交雑させることによって、植物細胞中に導入され得る。
従来の育種技術は、上記の標的化されたアプローチと組み合わされ得る。いくつかの場合では、構築物を受けるダイズ植物は、バイオマス生産の増加、食物生産の増加、食物品質の改善、有害生物抵抗性、成長力、発育時間（収穫までの時間）、栄養素含有量の増強、新規の成長パターン、風味または色、塩、熱、乾燥および寒冷耐性などをもたらすものなどの１つ以上の特定の農学的に重要な形質を有するエリート系統である。
本開示の形質転換されたダイズ植物は、新規で有用な系統および品種を作製するための植物育種プログラムにおいて使用され得る。育種は、既知の手順を介して実施され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰ、または類似の技術をマーカー利用選抜（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用して、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子のうちの１つ以上の発現を調節する変異を他のダイズ植物に移行させるかまたは育種し得る。いくつかの実施形態では、そのような方法は、ダイズ変異体と、Ｆ１植物を産生するための第２のダイズ植物、または変異体と交雑し得る種との間で交雑種を作製することを含む。方法は、Ｆ１植物を第２のダイズ植物に戻し交雑し、戻し交雑ステップを繰り返して、当該第２のダイズ植物のゲノム中に変異が組み込まれたほぼアイソジェニックな系統を生成することをさらに含み得、ここで、組み込まれた変異を有する第２の植物に由来するほぼアイソジェニックな系統は、変化した脂肪酸プロファイル（例えば、より高いオレイン酸のレベル、より低いリノール酸のレベル、および／またはより低いリノレン酸のレベル）を有する。そのような方法は、分子マーカーまたはＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）によって容易にされ得る。したがって、本開示の変異体ダイズ植物は、新規で有用な系統および品種を生成するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、油の脂肪酸プロファイルから部分的に生じる優れた安定性および性能を有する油を有するダイズ品種を生成し得る。商品ダイズ油は、主にパルミチン酸（１０％）、ステアリン酸（４％）、オレイン酸（１８％）、リノール酸（５５％）、およびリノレン酸（１３％）の５つの脂肪酸で構成されている。より低いリノレン酸含有量を有するダイズ油は、その酸化およびフライ安定性を増加させ得る。そのような油は、特に、安定化のための多価不飽和脂肪酸の部分水素化を必要としないことから、より健康的であり得る。部分水素化は、その消費が心疾患のリスクの増加と関連するトランス脂肪酸を生成する。本開示のダイズ品種は、上記の変異を欠くダイズ品種と比較して、リノレン酸含有量の減少、オレイン酸含有量の増加、またはリノール酸含有量の減少を有する油を有し得る。例えば、ＦＡＤ２－１およびＦＡＤ３遺伝子ファミリー内に積み重ねられた変異を有する本開示のダイズ品種は、３％未満のリノレン酸およびリノール酸レベル、ならびに６５％超のオレイン酸レベルを有する油を有し得る。
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、遺伝子産物の発現に関連するプロモーター領域を含む核酸配列を指す。「遺伝子」はまた、遺伝子産物の発現に関連するイントロンおよびエキソン領域、ならびに遺伝子産物の発現に関連する５’または３’非翻訳領域を包含する。
「内因性遺伝子」は、野生型植物において生じる野生型配列の配列、またはコードされる産物の機能を保持することを可能にするパーセント同一性を有する配列（例えば、少なくとも９０％の同一性を有する配列）を含む核酸分子を指し、植物または細胞の植物部分から得られ得るか、または合成的に生成され得る。さらなる実施形態は、配列が少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有することを規定する。
「ＦＡＤ２」は、脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤ２）タンパク質を指し、これは、ダイズゲノム内の３つのＦＡＤ２デサチュラーゼ遺伝子によってコードされるが、しかしながら、ＦＡＤ２－１Ａ（Ｇｌｙｍａ１０ｇ４２４７０）およびＦＡＤ２－１Ｂ（Ｇｌｙｍａ２０ｇ２４５３０）は、ピーク油合成の間に高度に発現され、ダイズ種子におけるオレイン酸およびリノール酸レベルの主要な遺伝的決定因子である。ＦＡＤ２は、オレイン酸からリノール酸への変換を触媒する。
「ＦＡＤ３」は、脂肪酸デサチュラーゼ３（ＦＡＤ３）酵素を指し、これは、ＦＡＤ３Ａ（Ｇｌｙｍａ１４ｇ３７３５０）、ＦＡＤ３Ｂ（Ｇｌｙｍａ０２ｇ３９２３０）、およびＦＡＤ３Ｃ（Ｇｌｙｍａ１８ｇ０６９５０）からなる遺伝子のファミリーによって産生され、リノール酸からリノレン酸への変換を触媒する。
「機能的バリアント」という用語は、記載されるタンパク質もしくはタンパク質ドメインの触媒活性変異体、記載される配列番号と同じ機能を行うタンパク質もしくはタンパク質ドメインの変異体をコードするヌクレオチド配列、または記載される配列番号と同じ活性（例えば、ＴＡＬＥＮ媒介性切断）を媒介するヌクレオチド配列バリアントを指す。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、関連する値が、別段示されない限り、プラスまたはマイナス５パーセント（＋／－５％）修正され得、開示される実施形態の範囲内に留まることを示す。
本明細書に開示される本発明の代替的要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで参照され、特許請求され得る。グループの１つ以上のメンバーが、利便性および／または特許性の理由でグループに含まれるか、グループから削除され得ることが、予想される。任意のそのような包含または削除が生じる際、本明細書は、修正されたグループを含むように本明細書でみなされ、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのＭａｒｋｕｓｈグループの書面による記載を満たす。
別段示されない限り、核酸またはオリゴヌクレオチドは、５’から３’の配向で左から右に書かれる。
「本明細書」、「上記」、および「下記」という単語、ならびに同様の意味の単語は、本出願において使用される際、別段示されない限り、本出願全体を指し、本出願の任意の特定の部分を指すものではない。本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という単語は、記載された値の周り、通常は、記載された値の１０％以内などの標準的な誤差の範囲内でのわずかな変動を含む。
本明細書で参照される参照特許、特許出願、および科学的文献は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体の参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
１．ダイズにおける脂肪酸デサチュラーゼ３（ＦＡＤ３）遺伝子ファミリーのための多重ＴＡＬＥＮ設計。
Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、およびＦＡＤ３Ｃのゲノム配列（配列番号１～３）を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ）などのソフトウェアを使用して整列させ、遺伝子間の相同性の領域を特定した。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０１－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０１－Ｒ１（配列番号４～５）を、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｂ（配列番号１～２）に対する標的化特異性を有して設計した。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０２－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０２－Ｒ１（配列番号６～７）を、ＦＡＤ３Ｃ（配列番号３）に対する特異性を有して設計した（図１Ａ）。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０３－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０３－Ｒ１（配列番号８～９）を、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｂ（配列番号１～２）に対する標的化特異性を有して設計した。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０４－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０４－Ｒ１（配列番号１０～１１）を、ＦＡＤ３Ｃ（配列番号３）に対する特異性を有して設計した（図１Ｂ）。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０５－Ｌ１（配列番号１２）を、ＦＡＤ３Ａ（配列番号１）に対する特異性を有して設計し、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０５－Ｒ１（配列番号１３）を、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、およびＦＡＤ３Ｃ（配列番号１～３）に対する特異性を有して設計し、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０６－Ｌ１（配列番号１４）を、ＦＡＤ３Ｂ（配列番号２）に対する特異性を有して設計し、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０７－Ｌ１（配列番号１５）を、ＦＡＤ３Ｃ（配列番号３）に対する特異性を有して設計した（図１Ｃ）。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０８－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０８－Ｒ１（配列番号１６～１７）を、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｂ（配列番号１～２）に対する標的化特異性を有して設計した。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｒ１（配列番号１８～１９）を、ＦＡＤ３Ｃ（配列番号３）に対する標的化特異性を有して設計した（図１Ｄ）。
２．ダイズプロトプラストにおけるＨＴ対についてのヌクレアーゼ活性の実証
ハーフＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ハーフＴＡＬＥＮまたはＨＴ）を合成し、植物発現ベクター中にクローニングし、ＰＥＧ媒介性プロトコルを使用してダイズプロトプラスト中に形質転換して、ハーフＴＡＬＥＮ対の個々の組み合わせの活性を評価した。形質転換後４８時間でＤＮＡをプロトプラスト集団から抽出し、ＰＣＲを使用して、標的遺伝子であるＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、およびＦＡＤ３Ｃ（配列番号１～３）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ技術を使用して増幅および配列決定した。分析を行って、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ活性の測定値としての非相同末端結合（ＮＨＥＪ）頻度を決定した。各ＴＡＬＥＮの組み合わせについて、３つの標的遺伝子の各々についてのヌクレアーゼ活性を決定した。データを表１に要約する。２つのＨＴエフェクターヌクレアーゼを使用すると、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｂでの最も高いＮＨＥＪ頻度は、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０８－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０８－Ｒ１の組み合わせを使用して達成された（２２．８７％および１４．５７％）。ＦＡＤ３Ｃについては、２つのＨＴの組み合わせを使用した最も高い活性は、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｒ１を使用して観察された（１１．３２％）。
３．ダイズプロトプラストにおける多重ＨＴについてのヌクレアーゼ活性の実証
ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、およびＦＡＤ３Ｃでの最も高い活性を有する３つのハーフＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ハーフＴＡＬＥＮまたはＨＴ）の組み合わせを選択し、ＰＥＧ媒介性プロトコルを使用したダイズプロトプラスト中への送達のために単一の形質転換ベクター中にクローニングした。上記のように、形質転換後４８時間でＤＮＡをプロトプラスト集団から抽出し、ＰＣＲを使用して、標的遺伝子であるＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ｂ、およびＦＡＤ３Ｃ（配列番号１～３）を増幅および配列決定して、ＮＨＥＪ活性を決定した。ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｌ１、ＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０８－Ｒ１、およびＧｍＦＡＤ３＿Ｔ０９－Ｒ１の組み合わせの送達は、３つすべての遺伝子標的であるＦＡＤ３Ａ（１６．２８％）、ＦＡＤ３Ｂ（１４．８２％）、およびＦＡＤ３Ｃ（２１．４２％）で高効率ヌクレアーゼ活性を成功裏に達成した。データを表２に要約する。
Figure 2023505039000002
Figure 2023505039000003
Figure 2023505039000004
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対が内因性標的部位で標的化された改変を作製したことの検証の後、２つ以上のＦＡＤ３Ａ／Ｂ／Ｃにおける変異を有するダイズ植物を作製するために実験を行った。例示的なダイズ植物から特徴付けられた変異体対立遺伝子を配列番号４０～４４に示す。
ＦＡＤ３Ａ／Ｂ／Ｃのうちの２つ以上におけるホモ接合型変異体であるダイズ系統に由来する種子を、脂肪酸組成について分析した。簡潔に述べると、個々のダイズの種子を個別に粉砕する。ＤＮＡを、基本組織の一部から調製し、分析して、各種子の遺伝子型を確認する。ダブルおよびトリプルホモ接合型ノックアウト種子からの粉砕組織をプールする。次いで、脂肪酸組成を、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ガスクロマトグラフィー（Ｂｅｕｓｅｌｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４７：７４７－７５０，２００６）を使用して決定して、様々なＦＡＤ３Ａ／Ｂ／Ｃ変異を有する種子が、野生型種子に対してリノール酸、リノール酸およびオレイン酸の割合で変化しているかどうかを評価する。
４．Ｇ．Ｍａｘ ＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子を変異誘発するための配列特異的ヌクレアーゼ
Ｇ．ｍａｘにおけるＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の対立遺伝子を完全に不活性化またはノックアウトするために、開始コドンの近傍のタンパク質コード領域を標的化する配列特異的ヌクレアーゼを設計した。８つのＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対を、ＦＡＤ２－１遺伝子ファミリーを標的化するように設計した（表４）。ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０１－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０１－Ｒ１（配列番号２７および２８）、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０２－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０２－Ｒ１（配列番号２９および３０）、ＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０３－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０３－Ｒ１（配列番号３１および３２）、ならびにＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０４－Ｌ１およびＧｍＦＡＤ２＿Ｔ０４－Ｒ１（配列番号３３および３４）の対は、ＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子標的での高効率ヌクレアーゼ活性を達成した（表５）。
Figure 2023505039000005
Figure 2023505039000006
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対が内因性標的部位での標的化された改変を作製したことの検証の後、ＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂの一方または両方における変異を有するダイズ植物を作製するために実験を行った。例示的なダイズ植物から特徴付けられた変異体対立遺伝子を、配列番号３７～３９に示す。
ＦＡＤ２－１ＡまたはＦＡＤ２－１Ｂのいずれかにおけるホモ接合型変異体であるか、またはＦＡＤ２－１ＡおよびＦＡＤ２－１Ｂの両方についてホモ接合型であるダイズ系統に由来する種子を、脂肪酸組成について分析した。結果を表６に示す。簡潔に述べると、個々のダイズ種子を個別に粉砕した。ＤＮＡを、基本組織の一部から調製し、分析して、各種子の遺伝子型を確認する。ＦＡＤ２－１Ａホモ接合型、ＦＡＤ２－１Ｂホモ接合型、またはＦＡＤ２－１Ａ／ＦＡＤ２－１Ｂダブルホモ接合型ノックアウト種子からの粉砕組織をプールする。次いで、脂肪酸組成を、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ガスクロマトグラフィーを使用して決定して（上述のように）、様々なＦＡＤ２－１変異を有する種子が、野生型種子に対してリノール酸およびオレイン酸の割合で変化しているかどうかを評価する。
５．ＦＡＤ２およびＦＡＤ３変異の組み合わせ
１つ以上のＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子またはタンパク質の活性をノックアウトする変異の組み合わせを含有する植物を、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを使用して１つの遺伝子または複数の遺伝子を標的化することによるか、またはＦＡＤ２遺伝子および／もしくはＦＡＤ３遺伝子における変異を有する植物を交雑させることによるかのいずれかで作製した。２つ、３つ、４つ、または５つの遺伝子がノックアウトされた植物を含む、一連の変異の組み合わせを含有する植物を作製した。温室成長植物の種子油組成をＦＡＭＥによって評価した。結果を表６に示す。
Figure 2023505039000007
Figure 2023505039000008

Figure 2023505039000009

Figure 2023505039000010
脂肪酸プロファイルは、ＷＴ植物からの油に対する、変異体植物からの油におけるいくつかの脂肪酸レベルの有意な変化を示す。リノレン酸、リノール酸、およびパルミチン酸のレベルは減少し、一方、エイコセン酸、オレイン酸、およびステアリン酸のレベルは増加した。いくつかの変異体（例えば、試料ダイズ３１～５０および７１～７５）の油において、ＷＴ植物からの油に対して、エルカ酸のレベルが増加した。
例示的な実施形態が例証および説明されているが、様々な変更が、本発明の主旨および範囲から逸脱することなしにそれにおいてなされ得ることを理解されたい。

Claims (50)

  1. 組成物であって、
    第１の標的遺伝子の第１のハーフサイト配列に結合することができる第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸と、
    第２の核酸のセットであって、各第２の核酸が、前記第１の標的遺伝子の第２のハーフサイト配列または第２の標的遺伝子のセットに結合することができる第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする、第２の核酸のセットと、を含み、
    前記第１のハーフサイト配列が、保存された配列であり、
    前記第１のハーフサイト配列および各第２のハーフサイト配列が、異なり、かつスペーサー配列によって分離されており、
    前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの各々とダイマーを形成することができる、組成物。
  2. 前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが前記第１のハーフサイト配列に結合し、前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが前記第２のハーフサイト配列に結合するときに、前記ダイマーが生細胞内で前記標的遺伝子を切断し得る、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記第１のハーフサイト配列が、１００％保存された配列である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記スペーサー配列が、約１５～約１８ヌクレオチド長である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記第１の核酸が、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 各第２の核酸が、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記第１の核酸が、ベクター中にある、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 各第２の核酸が、ベクター中にある、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記第１の核酸および前記第２の核酸のセットが、単一のベクター中にある、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記第１の核酸が、プラスミド中のｍＲＮＡである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 各第２の核が、プラスミド中のｍＲＮＡである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記第１の核酸および前記第２の核酸のセットが、プラスミド中のｍＲＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記第２の核酸のセットが、３つ以上の第２の核酸を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記第２の核酸のセットが、４つ以上の第２の核酸を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記第１の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ３遺伝子ファミリーの遺伝子である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 各第２の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ３遺伝子ファミリーの遺伝子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記第１の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ａ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記第１の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｂ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記第１の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｃ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記第２の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ａ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記第２の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｂ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記第２の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ３Ｃ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記第１のハーフサイト配列が、配列番号１８である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ２－１遺伝子ファミリーの対立遺伝子を標的とする１つ以上の低頻度切断エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記１つ以上の低頻度切断エンドヌクレアーゼが、ＦＡＤ２－１ＡまたはＦＡＤ２－１Ｂを標的とするＴＡＬエフェクターヌクレアーゼである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが、配列番号２７～３４のうちのいずれかに示される配列に結合するモノマーを含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが、配列番号２７および２８、２９および３０、３１および３２、ならびに３３および３４からなる群から選択される配列に結合するモノマーの対を含む、請求項２５に記載の組成物。
  28. 各第２の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＦＡＤ２遺伝子ファミリーの遺伝子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記第１の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記第１の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の対立遺伝子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記第２の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子の対立遺伝子である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記第２の標的遺伝子が、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の対立遺伝子である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記第１のハーフサイト配列が、配列番号２５または２６内にある、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記組成物が、第２のハーフサイト配列に結合することができる第２の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーを各々コードする、２つの第２の核酸を含み、前記第２のハーフサイト配列が、配列番号１７または配列番号１９である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. ２つ以上の遺伝子内に変異を同時に導入する方法であって、前記２つ以上の遺伝子を含む細胞の集団を、請求項１～３４のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
  36. 請求項３５に記載の方法によって得られた、植物、植物部分、または植物細胞。
  37. 前記植物、植物部分、または植物細胞が、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞である、請求項３６に記載の植物、植物部分、または植物細胞。
  38. 前記ダイズ植物部分、または植物細胞が、子葉細胞、種子、胚、胚形成性カルス細胞、および花粉細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載の植物、植物部分、または植物細胞。
  39. 請求項３７に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞によって産生されたダイズ油を含む、ダイズ油組成物であって、前記ダイズ油が、前記２つ以上の遺伝子における前記変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、オレイン酸含有量の増加、リノール酸含有量の減少、およびリノレン酸含有量の減少のうちの１つ以上を有する、ダイズ油組成物。
  40. ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる１つ以上の変異を含む、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、オレイン酸含有量の増加を有する油を産生し、少なくとも１つの変異が、配列番号２７～３４に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発される、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  41. ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる変異を含むダイズ植物を生成するための方法であって、
    （ａ）機能的ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子を有するダイズ植物からのダイズ植物細胞の集団を、配列番号２７～３４に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸配列と接触させることと、
    （ｂ）前記集団から、前記ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子またはＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子の発現が低下している細胞を選択することと、
    （ｃ）前記選択された植物細胞をダイズ植物に再生することと、を含む、方法。
  42. ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子およびＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる１つ以上の変異を含むダイズ植物、植物部分、または植物細胞によって産生されたダイズ油を含む、ダイズ油組成物であって、前記ダイズ油が、前記１つ以上の変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、オレイン酸含有量の増加、リノール酸含有量の減少、およびリノレン酸含有量の減少のうちの１つ以上を有し、前記１つ以上の変異が、配列番号２７～３４に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された標的化された変異を含む、ダイズ油組成物。
  43. ダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、
    １つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子、
    １つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、
    １つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、または
    １つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子、および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、における変異の第１のセットであって、
    前記変異の第１のセットが、
    第１の標的遺伝子の第１のハーフサイト配列に結合することができる第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸と、
    第２の核酸のセットであって、各第２の核酸が、前記第１の標的遺伝子の第２のハーフサイト配列および少なくとも１つの第２の標的遺伝子に結合することができる第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする、第２の核酸のセットと、の発現によって誘発され、
    前記第１のハーフサイト配列が、保存された配列であり、
    前記第１のハーフサイト配列および各第２のハーフサイト配列が、異なり、かつスペーサー配列によって分離されており、
    前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの各々とダイマーを形成することができる、変異の第１のセットと、
    １つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子、
    １つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子、または
    １つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子および１つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子、における変異と、を含み、
    前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記変異を欠く対応するダイズ植物、植物部分、または植物細胞から産生された油と比較して、リノレン酸含有量の減少、オレイン酸含有量の増加、およびリノール酸含有量の減少を有する油を産生する、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  44. 前記植物、植物部分、または植物細胞が、導入遺伝子を含有しない、請求項４３に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  45. 前記植物部分が、種子である、請求項４３に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  46. 前記１つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子および前記１つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子への前記変異が、低頻度切断エンドヌクレアーゼによって誘発された、請求項４３に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  47. 前記低頻度切断エンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼであり、前記ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが、配列番号２７～３４のうちのいずれかに示される配列に結合する、請求項４６に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  48. １つ以上のＦＡＤ３Ａ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ３Ｂ対立遺伝子、および１つ以上のＦＡＤ３Ｃ対立遺伝子、１つ以上のＦＡＤ２－１Ａ対立遺伝子、および１つ以上のＦＡＤ２－１Ｂ対立遺伝子が変異している、請求項４３に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
  49. ＦＡＤ３Ａ遺伝子、ＦＡＤ３Ｂ遺伝子、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子のうちの少なくとも２つの発現を低下させる変異を含むダイズ植物を生成するための方法であって、
    （ａ）機能的ＦＡＤ３Ａ遺伝子、ＦＡＤ３Ｂ遺伝子、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子を有するダイズ植物からのダイズ植物細胞の集団を、組成物であって、第１の標的遺伝子の第１のハーフサイト配列に結合することができる第１の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸と、第２の核酸のセットであって、各第２の核酸が、前記第１の標的遺伝子の第２のハーフサイト配列および少なくとも１つの第２の標的遺伝子に結合することができる第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする、第２の核酸のセットと、を含む、組成物と接触させることであって、前記第１のハーフサイト配列が、保存された配列であり、前記第１のハーフサイト配列および各第２のハーフサイト配列が、異なり、かつスペーサー配列によって分離されており、前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの各々とダイマーを形成することができ、前記第１の標的遺伝子が、前記ＦＡＤ３Ａ遺伝子であり、前記少なくとも１つの第２の標的遺伝子が、前記ＦＡＤ３Ｂ遺伝子および前記ＦＡＤ３Ｃ遺伝子から選択される、接触させることと、
    （ｂ）前記集団から、前記第１の標的遺伝子および前記少なくとも１つの第２の標的遺伝子の発現が低下している細胞を選択することと、
    （ｃ）前記選択された植物細胞をダイズ植物に再生することと、を含む、方法。
  50. 前記第１または第２のモノマーが、配列番号４～１９に示される群からの核酸配列、またはその機能的バリアントに結合することができる、請求項４９に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。

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