JP2003509050A - テトラヒメナから得られるδ−6−デサチュラーゼをコードする核酸、その産生と使用 - Google Patents
テトラヒメナから得られるδ−6−デサチュラーゼをコードする核酸、その産生と使用Info
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Abstract
Description
びその調製および使用に関する。
UFA、すなわちポリ不飽和脂肪酸(polyunsaturated fat
ty acids)と称する)の生合成に関与する、繊毛虫特異のΔ−6−デサ
チュラーゼをコードするテトラヒメナからの核酸に関する。これに関して、本発
明による核酸、および、それから得ることのできるポリペプチドは、他の既知の
天然デサチュラーゼと驚くべき程ほとんど配列同一性を示さない。本発明はさら
に、脂肪酸構成(スペクトル)を特異的に修飾する目的で、特にPUFAの形成
を増加する目的で、真核生物、特に繊毛虫、好ましくはテトラヒメナ、特に好ま
しくはテトラヒメナ・サーモフィラにおいて過度に発現するための核酸の使用に
関する。
くはテトラヒメナ・サーモフィラ、非常に高含量のGLAを有するGLA産生生
物、から得ることができる。
する酵素を示す(Gill&Valivety、Trends Biotech
nol.1997、15:401〜409に従って作成)。 ステアリン酸(18:0)からオレイン酸(18:1Δ9)への変換は、Δ−
9−デサチュラーゼにより触媒される。オレイン酸は、Δ−12−デサチュラー
ゼによりリノール酸(18:2Δ9、12;LAと略称)に変換され、これは、
次いで、Δ−6−デサチュラーゼにより、γ−リノレン酸(18:3、Δ6、9
、12;GLAと略称)に、または、Δ−15−デサチュラーゼによりα−リノ
レン酸(18:3Δ9、12、15;ALAと略称)に変換される。
γ−リノレン酸(20:3Δ8、11、15;DGLAと略称)が、γ−リノレ
ン酸から形成され、ジホモ−γ−リノレン酸は、次いで、Δ−5−デサチュラー
ゼによりアラキドン酸(20:4Δ5、8、11、15;ARAと略称)に変換
される。これは、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンお
よびロイコトリエンなどの生理活性エイコサノイドの直接的な前駆体である。
るPUFA(以下ではΔ−6−不飽和脂肪酸と称する)形成の律速段階であるこ
とが判明した(Huang YS&Mills DE(1996)γ−リノレン
酸、代謝および栄養および医薬におけるその役割。イリノイ州シャンペイン所在
AOCS Press、1996)。
.ピリフォルミスに存在することが知られているが(Peng,Y.M.および
Elson,C.E.(1971)J.Nutr.101、1177〜1184
)、繊毛虫から得られ、このような活性を有する均一タンパク質はこれまで入手
できなかった(例えば、Koll,MおよびErwin,J.A.(1990)
J.Protozool.37(3)229〜237)。
ALAなどの不飽和脂肪酸は、脊椎動物が合成できない必須栄養分であり、食事
では、基本的に植物源から得られる(図1参照)。
のGLAはARAの前駆体であり、この前駆体は大半のプロスタグランジンの必
須前駆体である。EPAの前駆体のステアリドン酸(18:4Δ6、9、12、
15)のALAからの形成は、同様に、Δ−6−デサチュラーゼにより触媒され
る。従って、Δ−6−デサチュラーゼは、エイコサノイド生合成の最初の必須段
階である(図1参照)。
栄養不足および加齢プロセスなどの因子により損なわれ得ることが分かった(H
uang&Mills、1996;Horrobin(1990)Rev.Co
ntemp.Pharmacother.1:1〜45;Bolton−Smi
th C et al.(1997)Eur.J.Clin.Nutr.51:
619〜624;Leventhal LJ et al.(1993)Ann
.Intern.Med.119:867〜873)。そのため、GLAの供給
が不十分となり、従って、すでに前記したように、LAからのGLAの形成はP
UFA合成の律速段階であるので、最終的にGLAから得られる分子、例えば、
ARAおよびそれから形成される生理的に重要なエイコサノイドが欠乏する(B
renner RR(1976)Adv.Exp.Med.Biol.83:8
5〜101;Nakahara T et al.(1993)J.Jpn.O
il Chem.Soc.42:242〜253;Chapkin,RS(19
98)必須脂肪酸の再評価、食物中の脂肪酸およびその健康との関連性、第2版
(Chow CK編)NY州ニューヨーク所在Marcel Dekker)。
し、かつ、これらの脂肪酸の要求の増加にも対応する(Horrobin(19
90))。それ故、食事を介してGLAを取込むことは、GLAから得られる分
子の生合成に有利である(Fan,YY&Chapkin,RS(1998)J
.Nutr.128:1411〜1414)。
れまで、多くの科学的研究により支持されている。従って、臨床試験により、例
えばアトピー性湿疹(Shimasaki,H:PUFA含量およびアトピー性
湿疹に罹患した小児の血漿中のn−6、n−3代謝物のプロフィルに対するγ−
リノレン酸の豊富な油の食事による摂取の効果、J.Clin.Biochem
.Nutr(1995)19(3)、183〜192)、慢性関節リウマチ(Z
urier RB、Rossetti RG、Jacobson EW、DeM
arco DM、Liu NY、Temming JE、White BM、L
aposata M(1996)慢性関節リウマチのγ−リノレン酸による処置
:無作為プラセボ対照試験 Arthritis Rheum.39(11)1
808〜1817)、アテローム性動脈硬化症(Leng GC、Lee AJ
、Fowkes FGR、Jepson RG、Lowe GDO、Skinn
er ER、Mowat BF、末梢動脈疾患におけるγ−リノレン酸およびエ
イコサペンタエン酸の無作為対照試験、Clinical Nutrition
(1998)17/6 265〜271)、糖尿病性神経障害(Pfeifer
MA、Schumer MP(1995)糖尿病性神経障害の臨床試験:過去
、現在および未来、Diabetis 44(12)1355〜61)、偏頭痛
(Wagner W、Nootbaar−Wagner U(1997)γ−リ
ノレン酸およびα−リノレン酸による偏頭痛の予防的処置、Cephalalg
ia 17/2 127〜130)、精神分裂病(Vaddadi,KS(19
82)精神分裂病の処置におけるプロスタグランジンE1前駆体の使用に関する
観察、Biol.Aspects Schizophr.Addict.183
〜91.刊行者:英国チェスター所在Wiley)および癌(Kairemo
KJA、Jekunen AP、Korppi−Tommola ET、Pyr
honen SO(1997)肝臓灌流および膵臓癌の組織に対するγ−リノレ
ン酸リチウムの効果、Anticancer Research 17/5 B
3729〜3736)に対するGLAのプラスの効果が実証された。これらの
研究は、病気像において統計的にも臨床的にも有意な改善を達成した。これに関
連して、GLAの効果は、特に、生合成においてGLAが前駆分子となっている
エイコサノイド(プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンお
よびロイコトリエン)を形成することによる(図1)。
産業において、GLAは広く応用される(Horrobin(1990)、Ho
rrobin(1992)Prog.Lipid.Res.31:163〜19
4;Chapkin(1998)、Fan&Chapkin(1998))。
たは、食事をとおして供給される必須脂肪酸のデサチュラーゼおよびエロンガー
ゼによる変換により形成される。この理由から、これらのPUFAが天然に存在
する生物から得られるPUFA生合成遺伝子は、商業的関心が高い。PUFAの
商業的製造は、生物または細胞で、特異的かつ機能的に系の中でこれらの遺伝子
を発現することにより達成できる。この理由から、PUFA生合成に関与するデ
サチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする遺伝子が求められ、そして、PU
FAおよびPUFA油を商業的に確実かつ経済的方法により得る上でこれらの遺
伝子の使用が必要となる。
は、一般のオオマツヨイグサ(Oenothera biennis、約10%
のGLA)、ルリヂサ(Borago officinalis、約23%)お
よびクロクサスグリの実(Ribes nigrum、約18%)などの種々の
植物の種子から得られた油にしか存在しない。
)、藍藻Spirulina(約12〜18%)、およびその他の種々の微生物
が、GLA源であることが知られている。テトラヒメナ(47%まで;Hill
,DL(1972)テトラヒメナの生化学および生理、第3章、46〜73、A
cademic Press、ニューヨーク、ロンドン;Erwin,J&Bl
och,K(1963)J.Biol.Chem.238:1618〜1624
)などの繊毛虫は、特に豊富なGLA源であると報告されている。Philli
ps&Huangは、GLAの天然源に関する良好な総説を提供している(Ph
illips JC、Huang YS(1996)γ−リノレン酸の天然源お
よび生合成:総説、1〜13:γ−リノレン酸、代謝および栄養および医薬にお
けるその役割、Huang YS、Mills DE(編)イリノイ州シャンペ
イン所在AOCS Press、1996)。
。これらの生物から得られる油の品質および量の両方が変化し、場合によっては
、油の組成は非常に不均一である。よって、GLAを濃縮するために面倒で費用
のかかる精製段階の使用が必要となる。これに加えて、GLA含有植物の栽培は
、あまり経済的なプロセスではない(Hansen CEら(1991)J.S
ci.Food Agric.54:309〜312)。
物の方が顕著に良好であることが判明した。この理由から、微生物を使用したG
LAの発酵による生産は、他のGLA源に向けての見込みある別法を提供する。
多くの微生物の脂肪酸構成(スペクトル)は、しばしば、高等生物のそれよりも
かなり単純である。これは、精製において大きな利点を提供する特徴である。ま
た、発酵による生産は、気候、栄養分の供給等の外的因子に依存しない。さらに
、このように調製したPUFAは、例えば、環境汚染の源となり得る汚染物質を
あまり含まない。さらなる利点は、天然源から得られたGLAとは対照的に、発
酵プロセスにより単離したGLAは、入手の点で変動を受けない。
Ratledge C(1993)Trends Biochem.11:27
8〜284;Ratledge C(1989)Biochem.Soc.Tr
ans.17:1139〜1141;Gosselin Y et al.(1
989)Biotechnol.Lett.11:423〜426;WO86/
03518)。しかし、発酵によりGLAを製造するのに微生物を商業的に使用
する場合、PUFA産生微生物の発酵は、比較的面倒で費用がかかり、結果とし
てあまり経済的ではないために、GLAの含量を高くすることが望ましい(上記
のRatledge1993参照)。テトラヒメナ・サーモフィラは、GLAが
比較的高い含量であるため(上記参照)、発酵によりGLAを得るのに特に適し
ている。テトラヒメナは、発酵槽で容易に培養でき、高い細胞密度が達成できる
(Kiy,T.&Tiedtke(1992)Appl.Microbiol.
Biotechnol.37、576〜579;Kiy,T.&Tiedtke
,A(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol.38
、141〜146)。
をコードし、GLAおよび/またはΔ−6−不飽和脂肪酸の増大のために、宿主
生物、好ましくはテトラヒメナに機能的に発現および過度に発現されるテトラヒ
メナからの核酸を提供することである。
列を有するΔ−6−デサチュラーゼをコードする核酸、またはその機能的変異体
、および少なくとも8個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも15または20
個のヌクレオチドを含み、特に少なくとも100個のヌクレオチド、特に少なく
とも300個のヌクレオチドを含む、その一部に関する(以下で「本発明による
核酸(群)」と称する)。本発明はさらに、同様に、配列番号3に示し、ゲノム
配列を含み、Δ−6−デサチュラーゼをコードする配列に加えて、イントロン、
プロモーターおよびフランキング配列などの非コード核酸配列も含む核酸に関す
る。
の理論的分子量を有するタンパク質をコードする。本発明による配列解析により
、この核酸は、テトラヒメナΔ−6−デサチュラーゼをコードする核酸であるこ
とが確認される。
した、タンパク質配列を、Δ−6−デサチュラーゼと同定した。BLASTP機
能(Altschul et al.(1997)Nucleic Acids
Res.25:3389〜3402)を、相同性比較に使用した。デサチュラ
ーゼ、特にΔ−6−デサチュラーゼ(E.C.1.14.99.25;リノレオ
イル−CoAデサチュラーゼ)を、データベースから相同タンパク質であると同
定した(図2及び図3参照)。
ド配列と最大25%の同一性を示す(図4〜8参照)。 本発明によるポリペプチド配列を用いた種々の既知のΔ−6−デサチュラーゼ
のマルチプルアラインメントを図9に示す。
s&Murata、1998、Biochem.Biophys.Acta 1
394:3〜15;Shanklin,J et al.、1997、Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 92、6743〜6747)。これに
加えて、チトクロムb5ドメインを他の真核Δ−6−デサチュラーゼのものと同
じと同定することができた(Lederer,F.(1994)Biochim
ie 76、674〜692;Choら、J.Biol.Chem.1999、
274(1):471〜477)。
他のΔ−6−デサチュラーゼとはかなり異なる。352アミノ酸がある配列が、
他の真核Δ−6−デサチュラーゼよりも約20%短いことは特に驚きである。こ
れに加えて、配列は、強く保存された領域で多くの独特の差異を示す。かくて、
他のΔ−6−デサチュラーゼでは100%保存されているHHLFPモチーフは
、HHFFPに変換している(図9参照)。これらの理由から、既知のデサチュ
ラーゼと本発明によるポリペプチド配列の同一度は、驚くべき程に低い。
過度に発現することにより有意に修飾できる(表1および2参照)。これらの環
境下で、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比は、有意により多くの不飽和脂肪酸の方
向に転換する。ここで特に興味深いのは、このようにして達成できるGLAの生
産性の増加である。
しくは二本鎖DNA、特に核酸配列を有するDNA、または33位から1091
位までの配列番号1に示したような核酸配列の機能的変異体である。本発明によ
ると、2つの位置が、コード領域の開始および終結を決定する。
ラーゼに機能的に関連した核酸を意味すると理解される。関連核酸の例は、例え
ば、他の繊毛虫細胞由来の核酸、または対立遺伝子の変異体または同義性の変異
体である。本発明は、同様に、本発明による核酸の機能的変異体を包含し、これ
は、異常なコドン使用度のために(Wuitschick JD、Karrer
KM(1999)テトラヒメナ・サーモフィラにおけるゲノムG+C含量、コ
ドン使用度、開始コドン内容および翻訳終結部位の解析、J.Eukaryot
.Microbiol.1999 46(3):239〜47)、選択した発現
系において本発明による核酸が適合することを必要とする。
ドンであるコドンTAAおよびTAGを、CAAおよびCAGで置換することに
関する。これに加えて、当業者は、本発明による核酸を、異なる発現系の、ある
特定のコドン優先度(これをコドン使用度と称する)に最適に適合させることに
は慣れている。 核酸は、特異的に塩基を置換することにより既知の方法で修飾できるか、また
は必要な核酸を、人工的に調製したオリゴヌクレオチドから得ることができる。
好ましい発現系における配列の適合は、例えば、既知のコドン使用度の表(例え
ば、インターネット:GenBankから作表したコドン使用度:http:/
/www.dna.affrc.go.jp./〜nakamura/CUTG
.html)に基づいて、実施できる。本発明は、核酸の一部しか含まない核酸
の変異体も包含する。
60%、好ましくは約75%、特に約90%および特に約95%の配列同一性を
示す核酸を意味すると理解される。
ローブとして、またはアンチセンス核酸として個々のエピトープの調製に使用で
きる。例えば、少なくとも約8個のヌクレオチドを含む核酸は、アンチセンス核
酸として使用するのに適し、一方、少なくとも約15個のヌクレオチドを含む核
酸は、PCR法でプライマーとして使用するのに適し、少なくとも約20個のヌ
クレオチドを含む核酸は、他の変異体の同定に適し、そして少なくとも約100
個のヌクレオチドを含む核酸は、プローブとしての使用に適する。
列(とりわけUTR)を含む。非コード配列は、例えば、Δ−6−デサチュラー
ゼコード遺伝子の制御発現のためのイントロン配列または、プロモーターまたは
エンハンサー配列などの調節配列である。それ故、本発明は、配列番号3に示し
た本発明による核酸に関し、この核酸は、テトラヒメナ・サーモフィラから単離
でき、イントロン、プロモーターおよびUTRを含むΔ−6−デサチュラーゼの
ゲノム配列を示す。
くは発現ベクターに含まれる。
の発現用の原核発現ベクターの例は、T7発現ベクターpGM10(Marti
n、1996)であり、これは、N−末端Met−Ala−His6タグをコー
ドし、また、その発現タンパク質が、Ni2+−NTAカラムにより有利に精製
されることを可能にするものである。
クターp426Met25またはp426GAL1(Mumberg et a
l.(1994)Nucl.Acids Res.22、5767)であるが、
昆虫細胞での発現に適した前記ベクターの例は、EP−B1−0127839ま
たはEP−B1−0549721に開示されたようなバキュロウイルスベクター
であり、哺乳類細胞での発現に適したベクターの例は、一般に入手できるSV4
0ベクターである。
ば、EP−B1−0154133)、酵母での発現用のADH−2プロモーター
(Russel et al.(1983)、J.Biol.Chem.258
、2674)、昆虫細胞での発現用のバキュロウイルスポリヘドリンプロモータ
ー(例えば、EP−B1−0127839参照)、および、例えばMMTV(マ
ウス哺乳類腫瘍ウイルス;Lee et al.(1981)Nature、2
14、228)から得られた初期SV40プロモーターまたはLTRプロモータ
ーなどの、宿主細胞に適した調節配列を含む。
ech 17:462〜465)またはGaertig&Kapler((19
99)Methods in Cell Biol 62:485〜500)に
よって記載されたベクターは、テトラヒメナの形質転換およびテトラヒメナにお
ける発現に適する。
て、配列番号1および3に開示した配列を使用して、または、配列番号2に開示
したペプチド配列及び列挙した遺伝子コード(例えば、Uhlman,E&Pe
yman,A(1990)Chemical Reviews、90、543、
No.4)を使用して合成できる。本発明による核酸を得る別の可能性は、適切
なプローブを使用して、Δ−6−デサチュラーゼ活性を有する生物から調製した
適切な遺伝子ライブラリーから前記核酸を単離することである(例えば、Sam
brook,J et al.(1989)分子クローニング:実験マニュアル
第2版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)。適切なプローブの例は
、約100から1000ヌクレオチド長を有する、好ましくは約200から50
0ヌクレオチド長を有する、特に約300から400ヌクレオチド長を有する、
一本鎖DNA断片であり、その配列は、配列番号1または3に示した核酸配列か
ら得ることができる。
、前記核酸は、化学合成されるか、またはプローブを使用して遺伝子ライブラリ
ーから単離される。
自体、またはその機能的変異体、および、少なくとも6個のアミノ酸を含む、好
ましくは少なくとも12個のアミノ酸を含む、特に少なくとも65個のアミノ酸
を含む、特に少なくとも150個のアミノ酸を含む、その一部に関する(以下に
おいて「本発明によるポリペプチド」と称する)。例えば、約6〜12アミノ酸
長、好ましくは約8アミノ酸長のポリペプチドは、担体に結合した後に、特定の
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製に使用できる、エピトープを含
むことができる(これに関しては、例えば、米国特許第5,656,435号参
照)。少なくとも約65個のアミノ酸長を有するポリペプチドは、担体を全く用
いずに、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製に直接使用できる。
的に関連した、すなわちΔ−6−デサチュラーゼ活性を示すポリペプチドを意味
すると理解される。
と、配列相同性、特に約70%、好ましくは約80%、特に約90%、特に約9
5%の配列同一性を有するポリペプチドを意味するとも理解される。
インを有するポリペプチドである。特に好ましいのは、HHFFPモチーフを含
む本発明によるポリペプチドである。
好ましくは約1〜30、特に約1〜15、特に約1〜5個の範囲のアミノ酸の欠
失を含む。例えば、最初のアミノ酸メチオニンを、ポリペプチドの機能を有意に
変化させることなく欠失することができる。 「機能的変異体」なる語はまた、本発明による上記のポリペプチドを含む融合
タンパク質を含み、融合タンパク質それ自体は、すでに、Δ−6−デサチュラー
ゼの機能を有しているか、または融合部分をとり除いた後にはじめて特異的機能
を獲得できる。これらの融合タンパク質は、特に、約1〜200、好ましくは約
1〜150、特に約1〜100、特に約1〜50個のアミノ酸の非繊毛虫配列の
構成部分を含む融合タンパク質を含む。
、または、ヒスチジンタグ、例えばMet−Ala−His6タグと称される、
原核ペプチド配列である。ヒスチジンタグと称されるものを含む融合タンパク質
は、金属イオン含有カラム、例えば、Ni2+−NTAカラムを用いて、発現タン
パク質を精製するのに特に適切である。「NTA」は、キレート剤のニトリロト
リ酢酸(キアゲンGmbH、Hilden)を意味する。
プは、抗体により特異的に認識可能である。 本発明によるポリペプチドは、例えば、当業者に既知の方法に従って、本発明
の核酸を、すでに上記したような適切な発現系で発現することにより調製できる
。 適切な宿主細胞の例は、大腸菌株DH5、HB101またはBL21、酵母株
サッカロミセス・セレビジアエ、昆虫細胞系例えばスポドプテラ・フルジペルダ
から得られるレピドプテラン、または、COS、Vero、293およびHeL
aなどの動物細胞であり、その全てが一般的に入手できる。
ド技術)により合成できる。それらは、特に、このようにして、本発明によるポ
リペプチドのさらなる機能的変異体を得るために、適切な遺伝子発現ライブラリ
ーをスクリーニングすることに使用できる抗血清を得ることに適する。 本発明は、それ故また、本発明の核酸を適切な宿主細胞で発現し、適切な場合
には単離する、本発明によるポリペプチドの調製法に関する。
こで上記のポリペプチド部分それ自体は免疫原性であるか、またはウシ血清アル
ブミンなどの適切な担体に結合させることにより、免疫原性となることができる
、またはその免疫原性を増加させることができる。
調製は、例えば、哺乳動物、例えばウサギを、本発明によるポリペプチドまたは
前記のその一部を用いて、適切な場合には例えばフロイントアジュバントおよび
/水酸化アルミニウムゲルの存在下で免疫化することによる既知の方法に従って
行なう(例えば、Diamond,B.A.et al.(1981)The
New England Journal of Medicine、1344
)。次いで、既知の方法を使用して、免疫反応の結果として動物に形成されたポ
リクローナル抗体をすぐに血液から単離し、それらを、例えばカラムクロマトグ
ラフィーにより精製できる。C末端デサチュラーゼ断片が、例えば、NHS活性
化されたHiTrapカラムに結合している、抗体のアフィニティ精製が好まし
い。
er,G.&Milstein,C.(1991)Nature、349、29
3)の既知の方法に従って調製できる。
ナは組換え法により生産性の高い商業的に重要な株を作成する出発点として、お
よび、PUFA生合成の遺伝子源としての両方の使用に適している。なぜなら、
GLAを産生する場合に空間的/時間的収量が特に高いからである。従って、G
LA産生繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラから得られるΔ−6−デサチュラー
ゼおよびその使用を本発明に記載する。
ることは、Napier J et al.(Curr.Opin.Plant
Biol.(1999)123〜127)、Murphy&Piffanel
li(Soc.Exp.Biol.Semin.Ser.67(植物脂質生合成
)、(1998)95〜130)およびFacciotti&Knauf(Ad
v.Photosynth.6:光合成における脂質:構造、機能および遺伝子
学、Siegenthaler&Murata(編)Kluwer Acade
mic Publishers、オランダ(1998)225〜248)に記載
されている。
文書は、真菌Mortierellaから得られたデサチュラーゼおよびPUF
A産生における遺伝子の使用、およびまたデサチュラーゼのいくつかの部分的配
列を記載する。第WO93/06712および第WO96/21022は、シア
ノバクテリウムからおよびルリヂサから得られたΔ6−デサチュラーゼ、および
、シアノバクテリアおよび植物でのPUFAの産生におけるこれらの配列の使用
をも記載する。第WO99/27111は、線虫から得られたデサチュラーゼお
よびPUFAの産生におけるその使用を記載する。
−デサチュラーゼは、特に、植物(ルリヂサ(Sayanova et al.
(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997、94
:4211〜4216)、ヒメツリガネゴケ(Girke et al.、(1
998)Plant−J.1998 15(1):39〜48)、ヒマワリ(S
perling et al.(1995)Eur.J.Biochem.19
95、232:798〜805))、真菌(モルチェレラ)、動物(マウス、ラ
ット、カエノラブディティス(Napier et al.(1998)Bio
chem.J.330(2)、611〜614))、およびシアノバクテリウム
(Reddy et al.(1993)Plant Mol Biol.19
93、293〜300)から得られたΔ−6−デサチュラーゼである。
どの油料種子における、これらの遺伝子の機能的で異種的な発現である。しかし
、これまで刊行された全ての場合において、GLA収量は非常に低い、および/
またはΔ−6−デサチュラーゼ活性を有し、遺伝子工学により生産されたGLA
産生生物は、商業的な重要性がない(Knutzon&Knauf(1998)
Soc.Exp.Biol.Semin.Ser.67:287〜304)。
logy(1999)10:175〜180)およびKnutzon&Knau
f(1998)は、例えば、トランスジェニック植物において脂肪酸スペクトル
を特異的に修飾する上での問題および困難を記載している。
高度に生産的で商業的に重要な株を開発するために、この生物由来のPUFA生
合成遺伝子を使用することが有利である。テトラヒメナは大量培養で良好に、高
い細胞密度で培養できる可能性があるということから、このように高度に生産的
で商業的に興味ある株を、組換え法により作製するために、テトラヒメナそれ自
体を使用することはさらに有利である。さらに、本発明の核酸を用いて、テトラ
ヒメナ以外の他の生物を、GLAおよび他のΔ−6−不飽和脂肪酸の産生に使用
することもできる。
酸構成(スペクトル)がかなり単純であるため、特に有利である。これに加えて
、発酵的産生は、気候、栄養分供給等の外的因子に影響されない。さらに、この
ように得られた産物は、例えば、天然から得られる産物の場合にみられる環境汚
染により生じ得る不純物をあまり含まない。
核酸を使用して、GLAおよびΔ−6−不飽和脂肪酸を産生するか、または、前
記脂肪酸の含量が実質的に野生型細胞(この場合、テトラヒメナ・サーモフィラ
)と比べて増加している、トランスジェニック生物を産生できる(表1および2
参照)。これらのトランスジェニック生物は、本発明による核酸配列を有するか
、または、機能的にそれを発現する、好ましくは繊毛虫、特に好ましくはテトラ
ヒメナである。このようなデサチュラーゼの発現により、Δ−6−不飽和脂肪酸
またはそれから得られる二次産物が比較的増加する。この増加は、PUFA合成
に関与する酵素および基質の濃度の変化に基づく。
LAから得られる他の二次産物、またはΔ−6−不飽和脂肪酸の商業的生産に使
用できる(図1参照:PUFA生合成)。GLAに加えて、このように、ALA
を不飽和化することにより、例えば、産業で頻繁に使用される原材料であるステ
アリドン酸(18:4Δ6、9、12、15)を調製できる。
を、適切な調節配列と機能的に組合せて使用することにより、酵素の発現を増加
し、よってGLA産生生物でのGLA含量を増加するか、またはLA産生生物で
GLAを産生できる。これに関連して、ヒマワリ、セイヨウアブラナおよび大豆
などの油を産生する生物、および他の生物も同様に、特に関心をひく。これに加
えて、例えばΔ−12−デサチュラーゼ(例えば、Sakuradani E
et al.(1999)Eur.J.Biochem.261:812〜82
0、Okuley et al.、Plant Cell(1994)6(1)
147〜58)を同時に使用することにより、LAを全く含まないか、LAをほ
とんど含まない生物または細胞で、前記PUFAを産生できる。同様に、GLA
およびΔ−6−不飽和脂肪酸の産生のために、GLAの生成に関与する3つのデ
サチュラーゼ、すなわちΔ6、Δ9およびΔ12の組合せを使用できる。さらに
、PUFA生合成(図1参照)に関与する他の遺伝子と合わせることは、本発明
の別の好ましい実施形態を構成し、GLAおよびΔ−6−不飽和脂肪酸は、GL
Aが基質として作用する他の酵素により転換され、それにより、例えば、ARA
(20:4)およびGLAから得られる他の分子を調製することが可能である。
不飽和脂肪酸から得ることのできる分子(特にPUFA、例えばARA)の豊富
な栄養源の調製に使用できる。
生成体、および異種調節配列とΔ−6−デサチュラーゼをコードする配列の機能
的組合せも記載する。
び上記のΔ−6−デサチュラーゼ遺伝子の機能的生成体を使用することにより、
GLA含量の増加した(表1および2参照)、トランスジェニック生物の調製に
関する。
およびcDNAライブラリーを調製するための、多くの十分に確立された方法が
知られている(例えば、Sambrook et al.(1989)分子クロ
ーニング:実験マニュアル、コールドスプリングハーバー、NY)。 本発明に記載のデサチュラーゼまたはその一部を含む適切なベクターは、例え
ばAusubel et al.(Ausubel et al.(1995)
分子生物学の現在のプロトコル、Green Publishing Assi
ciates、ニューヨーク)およびSambrook et al.(198
9)に記載されているような、当業者に既知の方法を使用して調製できる。
フェクション、電気穿孔法、粒子による撃ち込みおよび他の方法により細胞に導
入できる。その場合、形質転換は、一般に、外来DNAの細胞への導入を意味す
ると理解される。その実施法は十分に確立され、当業者に既知の方法で実施でき
る(例えばSambrook et al.(1989)、Potrykus
I(1991)Annu.Rev.Plant.Biol.Plant Mol
.Biol.42:205〜225、Christou P(1993)Cur
r.Opp.Biotech.4:135〜141)。
一部を、宿主細胞の中で活性であるプロモーターまたは他の調節エレメントとの
機能的組合せで含む。好ましい実施形態において、これらの調節エレメントは、
繊毛虫、特にテトラヒメナで機能的に活性である核酸配列、例えばヒストンH4
およびαおよびβ−チューブリンおよびその他のプロモーターである。
発明に記載されている。それによって、これらの生物でΔ6−PUFAを産生す
る可能性に加えて、例えば、組換えΔ6−デサチュラーゼまたはその一部を、標
準的なタンパク質精製法(例えばAusubel et al.(1995))
を使用して単離する可能性もある。種々の生物でΔ−6−デサチュラーゼをコー
ドする配列の発現に使用できるベクターは、当業者に既知の方法で調製できる。
適切なベクターに関する詳細な情報は、例えば、Sambrook et al
.(1989)、Goeddel編(1990)Methods in Enz
ymology 185 Academic PressおよびPerbal(
1988)分子クローニングの実践的なガイド、John Wiley and
Sons社に見出し得る。 これらのベクターは、好ましくは、プロモーター、エンハンサーエレメント、
上流活性化配列等の、発現に影響を及ぼす配列エレメント含む。誘導性および構
成性プロモーター、または、例えば、組織特異的プロモーターは、発現の奏効に
適する。カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター(Re
strepo et al.(1990)Plant Cell 2 987)
、または、例えば、種子発達に関連して活性化されるプロモーターが、植物細胞
での発現に適している。
al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1561
〜1565、Bustos et al.(1991)J.Bacteriol
.174:7525〜7533)。
でテトラヒメナにおいて発現する(例えばテトラヒメナβ−チューブリンプロモ
ーター、Gaertig et al.(1999)Nature Biote
ch.)。形質転換は、好ましくは、Gaertigら(1999)Natur
e Biotech.17:462〜465(または例えば、Gaertig&
Gorovsky(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89:9196〜9200)に記載の方法に従って行なうことができる。例え
ば、テトラヒメナ・サーモフィラα−またはβ−チューブリンプロモーターを、
発現の調節エレメントとして使用できる。形質転換したテトラヒメナ細胞を選択
培地で同定し、次いで、強化し培養する。細胞から脂質(リポイド)を単離する
ために標準的な方法を使用できる(例えば、Dahmer et al.(19
89)Journal of American Oil Chemical
Society 66、543)。脂肪酸のメチルエステルは、ガスクロマトグ
ラフィーにより解析できる。
他の原生生物から、特に繊毛虫から関連遺伝子を単離するのに使用できる。本発
明による核酸またはその一部は、相同遺伝子を単離するための、標識プローブと
して使用できる。他の生物から単離しておいた核酸にプローブをハイブリダイズ
することにより相同核酸配列を同定および単離できる。プローブは、当業者に既
知の方法で標識できる(Ausubel、Sambrook(上記参照))。 放射性ヌクレオチド、または蛍光分子、ジゴキシゲニン、ビオチン、磁性分子
または酵素などの検出可能な分子に連結したヌクレオチドが、例えば、プローブ
の標識に適する。相同DNA配列は、異種DNAにプローブをハイブリダイズさ
せた後に標識を検出することにより、同定および単離する。cDNAライブラリ
ーまたはゲノムライブラリーは、相同配列の探索に適している。これに加えて、
サザンおよびノザンブロットが、相同配列の検出に適する。別に、標識プローブ
を選択的に保持すること(例えば磁気を使用して)により、標識プローブとハイ
ブリダイズする相同DNAを単離できる。
は、当業者に既知であり、例えばAusubelら(1995、分子生物学の現
在のプロトコル、Green Publishing Associates、
ニューヨーク)またはSambrook et al.(1989、分子クロー
ニング)に記載された方法により行なうことができる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による相同核酸配列の増幅に使用できる、オリ
ゴヌクレオチドを設計できる。
ドされる、タンパク質またはその一部に対して指向された特定の抗体(例えばペ
プチド抗体)を使用して検出することにある。
デサチュラーゼをコードするcDNAのヌクレオチド配列。開始および終結コド
ンを強調している。
テトラヒメナΔ−6−デサチュラーゼのタンパク質配列(Wuitschick
JD、Karrer KM(1999)またはCUTG(GenBankから
作表したコドン使用度):http://www.dna.affrc.go.
jp./〜nakamura/CUTG.html)。
クレオチド配列。
である。 実施例1 生物および培養条件 テトラヒメナ・サーモフィラ(B1868VII、B2086 II、B*V
I、CU427、CU428およびCU522株、米国ジョージア州アーセンズ
所在ジョージア大学のJ.Gaertig博士より親切にも提供された)を、修
飾SPP培地(2%プロテオースペプトン、0.1%酵母抽出物、0.2%グル
コース、0.003%Fe−EDTA(Gaertig et al.(199
4)PNAS 91:4549〜4553))またはスキムミルク培地(2%ス
キムミルク粉末、0.5%酵母抽出物、1%グルコース、0.003%Fe−E
DTA)またはMYG培地(2%スキムミルク粉末、0.1%酵母抽出物、0.
2%グルコース、0.003%Fe−EDTA)中、抗生物質溶液(100Uの
ペニシリン/ml、100μgのストレプトマイシン/mlおよび0.25μg
のアムホテリシンB/ml(SPPA培地))を加えた存在下で、30℃で、2
50mlの三角フラスコ中50mlの容量で振盪(150rpm)しながら培養
した。 プラスミドおよびファージを、大腸菌XL1−BlueMRF’、TOP10
F’、またはJM109で複製し、選び出した。細菌を、標準的な濃度の抗生物
質を含む、LBまたはNZY培地中で標準的な条件下で培養した(Sambro
okら(1989)分子クローニング:実験マニュアル、コールドスプリングハ
ーバー研究所、コールドスプリング、ニューヨーク)。
ール/クロロホルム法を使用して単離した(Chomzynski&Sacch
i(1987)Anal.Biochem.161:156〜159)。mRN
Aを、オリゴテックス−dTビーズ(キアゲン)を使用して全RNAから単離し
た。cDNAを、ストラタジーンZAP発現cDNA合成法およびクローニング
キットを使用して合成した。EcoRIアダプターをライゲートし、XhoIで
消化した後、DNAを、アガロースゲル上で分離し、サイズ分画した(S:50
0〜1500bp、B:1500bpより大きい)。DNAを、ゲル(クイアク
イックゲル抽出キット、キアゲン)から単離し、EcoRIおよびXhoIで切
断しておいた、ZAP 発現ベクターにライゲートした。ライゲートしたDNA
を、インビトロでファージにパッケージングし(ストラタジーン ギガパックI
IIゴールド)、ファージを、大腸菌 XL1−Blue MRF’中で複製し
た。ScDNAライブラリーは、平均挿入サイズが1.1kbの約5×105個
のクローンを含むが、BcDNAライブラリーは、平均挿入サイズが2kbの約
6×104個のクローンを含んでいる。
特殊な繊毛虫コドン使用度ないしテトラヒメナコドン使用度を考慮に入れ、特に
強く保存されたアミノ酸領域WWKWNHNAHH(配列番号4)およびGGL
QFQIEHHLFP(配列番号5)のPCRプライマーを設計することができ
た(Wuitschick,JD、Karrer KM(1999)テトラヒメ
ナ・サーモフィラにおけるゲノムG+C含量、コドン使用度、開始コドン内容お
よび翻訳終結部位の解析、J.Eukaryot.Microbiol.46(
3)239〜47;Martindale(1989)J.Protozool
.36、1:29〜34、CUTG、(GenBankから作表したコドン使用
度):http://www.dna.affrc.go.jp./〜naka
mura/CUTG.html)。
3’(配列番号6) プライマー2(アンチセンス):5’−CGDGGRAANARRTGRTGT
TC−3’(配列番号7) 100ngの単離mRNAを、AMV逆転写酵素(ベーリンガーマンハイム)
を使用する第一鎖合成に使用した。反応は、50mMトリス−HCl(pH8.
5)、8mM MgCl2、30mM KCl、1mM DTT、1mM dN
TP、2pmolのオリゴ−DTアンカープライマー(5’−GACCACGC
GTATCGATGTCGACT(16)V−3’;配列番号8)、2単位のA
MV逆転写酵素、20μlの容量中60分間55℃、続いて10分間65℃で、
製造業者のプロトコルに従って実施した。 この第一鎖反応の1/10を、PCRに使用した。PCRは、1×キアゲンH
otStarTaqPCR緩衝液(キアゲン)、pH8.7(20℃)、10p
molの各Δ−6−デサチュラーゼ特異的プライマー、各場合とも200μMの
dNTP、1.5mM MgCl2、1単位のHotStarTaqポリメラー
ゼ(キアゲン)を含む、25μlの容量中で実施した。 PCRは、以下の条件下で実施した:最初に95℃で15分間で変性、これに
次いで、各場合とも94℃で30秒間、45℃で30秒間、72℃で1分間から
なる35サイクル、最後に72℃で10分間。 PCR断片を、ベクターpCR2.1に、T/Aクローニング(インビトロゲン
)によりライゲートし、大腸菌 TOP10F’(インビトロゲン)で複製した
。プラスミドDNAを、陽性クローンから単離し(Qiaprep Spin、
キアゲン)配列決定した。
設計した: プライマーd6/1−F(センス):5’−GGAATCACAATCAACA
TCATATGTTCAC−3’(配列番号9)および プライマーd6/1−R(アンチセンス):5’−CTTCGTCCTTTAG
AATGTTGTTTGTGAAC−3’(配列番号10) 完全Δ−6−デサチュラーゼをコードするcDNAを、PCRにより、cDNA
ライブラリーから、これらのプライマーをベクター特異的プライマー(T3およ
びT7)と組合せて使用して単離した。2μl(105pfu/μl)のcDN
Aライブラリーを、PCRに使用した(上記参照)。 上記の条件とは別に、PCRを、以下のプロトコルに従って実施した:95℃
で15分間変性し、これに次いで、94℃で20秒間、57℃で20秒間および
72℃で1分間からなる35サイクル、最後に72℃で10分間。 PCR産生物を、PCRにも使用したプライマーを使用して配列決定した。この
ように得られた配列情報に基づいて、cDNA配列の5’末端に位置する新規プ
ライマーを設計した: プライマーd6−5’−F:AGTAAGCAAACTAAATTTAAAAA
ACAAGC(配列番号11) このプライマーを、ベクター特異的プライマーと組合せて使用して、PCR(P
CR条件については上記参照)により完全cDNAを増幅および単離することが
できた。プラスミドpDES6は、このPCR産生物をベクターpCR2.1に
クローニングすることにより得た。
ナから単離し、EcoRIで切断した。切断DNAを、EcoRIで同様に切断
しておいた、λベクター(Zap Express、ストラタジーン)にライゲ
ートした。さらなる処理は、cDNAライブラリーの場合に記載した手順に応じ
て行った。
コード配列およびイントロンを含む、約2200bpのサイズのPCR産生物を
、ゲノムDNAから、cDNAの5’および3’末端からのプライマーを使用し
て作製した: d6−5’−F:AGTAAGCAAACTAAATTTAAAAAACAAG
C(配列番号12) d6−3’−R:GGTCCTTCATGAATCTTAAGGTTCCACT
TC(配列番号13) ゲノムウォーカーシステム(クロンテック)を使用して、Δ−6−デサチュラ
ーゼ遺伝子のフランキング配列を単離した。このシステムからの普遍的なプライ
マーおよび決定しておいたΔ−6−デサチュラーゼ配列に基づいた特異的プライ
マー、すなわち、 d6−5’−R:CTTAAGTCTTATCAACTCCCATAATGC(
配列番号14) d6−3’−F:GAAGTGGAACCTTAAGATTCATGAAGGA
CC(配列番号15) を使用して、テトラヒメナΔ−6−デサチュラーゼ遺伝子のフランキング領域を
単離できた。ゲノム配列の完全構造を図11に示す。
re Biotech.17:462〜465)は、テトラヒメナ・サーモフィ
ラBTU1遺伝子の非コード調節配列によりフランキングされる、Ichthy
ophthirius I抗原(G1)プレタンパク質をコードする配列を含む
。開始点にNsiI切断部位を含む、修飾プラスミド(pBICH3−Nsi)
(米国GA州アセンズ所在ジョージア大学のJ.Gaertig博士より親切に
も提供された)を使用して、Δ−6−デサチュラーゼ発現生成体pBDES6を
調製した。このために、PCRを使用して、テトラヒメナΔ−6−デサチュラー
ゼをコードする配列の始点および終点にNsiIおよびBamHI切断部位を挿
入した。Δ−6−デサチュラーゼ(pDES6)の完全cDNA配列を含む、単
離プラスミドを、PCRの鋳型として使用した。
AAGAAG−3’(配列番号16) D6−Bam−R:5’−TATGGATCCTCAAAGGTGAGATTT
TTCAAAAATAG−3’(配列番号17) は、NsiIおよびBamHI切断部位によりフランキングされる、Δ−6−デ
サチュラーゼをコードする完全配列を含む、PCR産生物を作製した。PCR産
生物およびプラスミドpBICH3−Nsiを、制限酵素NsiIおよびBam
HIで切断し、アガロースゲル上で精製し、共にライゲートした(プラスミド作
製図参照)。得られたpBDES6発現生成体は、BTU1遺伝子の調節配列の
正しいリーディングフレーム内に挿入された、完全Δ−6−デサチュラーゼをコ
ードする配列を含んでいる(図12参照)。 テトラヒメナを形質転換するために、生成体を、制限酵素XbaIおよびSa
lIで消化することにより線形化した。形質転換が成功裡にできれば、BTU1
遺伝子を、相同的組換えにより、これらの生成体と交換し、よって、細胞はパク
リタキセルに耐性となった。
所在ヒューレットパッカード社)ガスクロマトグラフ(HP GC 6890)
を使用して決定した。使用したカラムはFFAP(遊離脂肪酸相)Permbo
nd(Macherey&Nagel GmbH、デューレン)であった。脂肪
酸は、脂肪酸メチルエステル標準の保持時間との比較により同定した。既知濃度
の標準に基づいて、試料中の脂肪酸の濃度を決定することができた。 脂肪酸スペクトルを決定するために、単離した形質転換体を、24〜96時間
、MYG培地中で30℃で150rpmで培養した。50mlの培養液を、15
00Gで15分間遠心分離し、その後、上澄を廃棄し、ペレットを−80℃で凍
結し、続いて凍結乾燥した。50mgの凍結乾燥試料を秤量し、1mlの20%
メタノール性HClおよび1mlのメタノール性標準溶液(1mg/ml)で処
理した。脂肪酸を遊離し、それらを脂肪酸メチルエステルにエステル交換するた
めに、試料を、60℃で2時間、封をした試験管の中で水浴中で撹拌し、次いで
室温まで冷却した。次いで、1mlの炭酸水素ナトリウム飽和水溶液を加えて、
注意深く混合しながら、試料を中和した。脂肪酸メチルエステルを、n−ヘキサ
ンを添加することにより抽出した。続いて、調製物を、激しく十分に混合し、4
300rpmで2分間遠心分離することにより相分離を起こした。上の有機相の
約2/3を取り出し、1μlの試料を、GCカラムに注入し、分析した。
2%増加した、全脂肪酸スペクトル中のGLA含量を示している(表1)。GL
A含量の変動に加えて、高含量の不飽和脂肪酸への、脂肪酸スペクトルの顕著な
変動も驚きである。形質転換体では、不飽和(主)脂肪酸と飽和(主)脂肪酸の
比も、ほぼ2倍である(表2)。
ertig et al.(1994)Nucl.Acids Res.22:
5391〜5398)からのneoカセットを、Δ−6−デサチュラーゼゲノム
配列に挿入した。このneoカセットは、テトラヒメナヒストンH4プロモータ
ーの制御下のネオマイシン耐性遺伝子およびBTU2遺伝子の3’−フランキン
グ配列からなる。テトラヒメナでは、この生成体は、パロモマイシンに対する耐
性を媒介する。プラスミドp4T2−1ΔH3をEco RV/SmaIで切断
し、約1.4kbサイズのneoカセット断片を、EcoRVで切断しておいた
プラスミドpgDES6に含まれるテトラヒメナΔ−6−デサチュラーゼゲノム
配列にライゲートした(図14参照)。これにより、プラスミドpgDES6:
:neoが得られる。形質転換が成功裡にできれば、Δ−6−デサチュラーゼを
コードする遺伝子を、この生成体と、相同的組換えにより交換し、よって、細胞
はパロモマイシンに耐性となった。
換 5×106個のテトラヒメナ・サーモフィラ細胞(CU522)を、形質転換
に使用した。細胞を、250mlの三角フラスコ中50mlのSPPA培地中、
30℃で150rpmで振盪しながら、細胞密度が約3〜5×105細胞/ml
に達するまで培養した。細胞を、5分間遠心分離(1200G)することにより
ペレット化し、細胞ペレットを、50mlの10mMトリス−HCl(pH7.
5)に再懸濁し、前記のように遠心分離した。この洗浄段階を繰り返し、細胞を
、細胞密度3×105細胞/mlで、10mMトリス−HCl(pH7.5、抗
生物質も加える)に再懸濁し、その後、それらを250mlの三角フラスコに移
し、30℃で16〜20時間振盪せずにインキュベートした(飢餓期)。飢餓期
後、細胞数を、再度決定し、その後細胞を、上記のように遠心分離し、その後、
10mMトリス−HCl(pH7.5)で、5×106細胞/mlの濃度まで調
整した。1mlの細胞を形質転換に使用した。形質転換は、微粒子撃ち込みによ
り行なった(下記参照)。
せずにインキュベートした。3時間後、パクリタキセル(登録商標)を加えて、
最終濃度を20μMとし、細胞を、100μlずつ、96穴マイクロタイタープ
レートに移した。細胞を、30℃で、湿気のある暗いボックス中でインキュベー
トした。2〜3日後、パクリタキセル耐性クローンを同定できた。陽性クローン
を、25μMのパクリタキセルを含む新しい培地に接種することにより移した。
完全「表現型組合せ」(Gaertig&Kapler(1999))は、細胞
を、濃度をあげたパクリタキセル(80μMまで)中で培養することにより行な
った。クローンを解析するために、約4mlの培養液を、パクリタキセル含有S
PPA中で増殖し、その後、DNAを単離し(Jacek Gaertig e
t al.(1994)PNAS 91:4549〜4553)、BTU1座に
組込んだDNAを、PCRにより増幅した。 使用したプライマーは、BTU1特異的プライマーBTU1−5’F(AAA
AATAAAAAAGTTTGAAAAAAAACCTTC、開始コドンの約5
0bp上流、配列番号18)およびBTU1−3’R(GTTTAGCTGAC
CGATTCAGTTC、終結コドンの3bp下流、配列番号19)であった。 PCR産生物を、非切断状態で、または、HindIIIまたはEcoRV(
pBDES6)またはEcoRI(pBDES9)で切断しておいて、1%アガ
ロースゲル上で解析した。完全「表現型組合せ」は、BTU1特異的プライマー
(Gaertig&Kapler(1999))を使用して、RT−PCRによ
り確認した。
核および巨核形質転換 異なる対を形成する型(CU428VIIおよびB2086II)のテトラヒ
メナ株を、別々に、SPPA培地中で、30℃で振盪(150rpm)しながら
、三角フラスコ中で培養した。細胞密度が3〜5×105細胞/mlの時に、細
胞を、5分間室温で遠心分離(1200G)した。細胞を、3回、50mlの1
0mMトリス−HCl(pH7.5)で洗浄し、最後に、50mlの10mMト
リス−HCl(pH7.5)に再懸濁し、その後、抗生物質溶液を加えた。細胞
を30℃で振盪せずに三角フラスコ中でインキュベートした。約4時間後、2つ
の培養液を再度計測し、10mMトリス−HCl(pH7.5)で3×105細
胞/mlまで希釈し、その後、30℃でさらに16〜20時間インキュベートし
た。この飢餓期後に、2つの培養液からの同じ(絶対)数の細胞を、2L三角フ
ラスコ中で混合した。細胞を30℃でインキュベートし(コンジュゲーションの
開始)、コンジュゲーションの効率を、2時間後に決定した。形質転換を成功さ
せるためには、約30%の細胞が、この時点で対として存在すべきである。 微小核形質転換のために、各場合とも、1×107のコンジュゲート細胞(5
×106対)を、コンジュゲート開始の3時間、3.5時間、4時間および4.
5時間後に、1200Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを1mlの10mM
トリス−HCl(pH7.5)に再懸濁した。 新規巨核原生生物の形質転換のために、細胞を、上記のように、コンジュゲー
ト開始の11時間後に遠心分離し、トリス−HClに再懸濁した。形質転換は、
微粒子撃ち込みにより行なった(上記参照)。Δ−6−デサチュラーゼノックア
ウト変異体を培養するために、200μgのルリヂサ油(20〜25%GLA;
シグマ)を培地に加えた。
微小核の形質転換の場合、パロモマイシン(最終濃度100μg/ml)を、コ
ンジュゲート開始の11時間後に加え、細胞を、100μlずつ96穴マイクロ
タイタープレートに分配した。細胞を、30℃の加湿ボックス中でインキュベー
トした。2〜3日後に耐性クローンを同定できた。6−メチルプリンに対する巨
核形質転換体の耐性に基づいて、真の微小核形質転換体を識別できた。 巨核を形質転換する場合、パロモマイシン(最終濃度100μg/ml)を、
形質転換の約4時間後に加え、細胞を、100μlずつ96穴マイクロタイター
プレートに分配した。細胞を30℃の加湿ボックス中でインキュベートした。2
〜3日後に耐性クローンを同定できた。陽性クローンを、120μgのパロモマ
イシン/mlを含む新しい培地に接種することにより移した。完全「表現型組合
せ」(Gaertig&Kapler(1999))は、この高いパロモマイシ
ン濃度中で細胞を培養することにより数世代後に達成された。B*VI株と微小
核形質転換体を交雑することにより、ホモ接合性ノックアウト変異体を作成する
ことができた(Bruns&Cassidy−Hanley、Methods
in Cell Biology、第62巻(1999)229〜240)。
Methods in Cell Biology、第62巻(1999)50
1〜502);Gaertig et al.(1999)Nature Bi
otech.17:462〜465)またはCassidy−Hanley e
t al.((1997)Genetics 146:135〜147)に記載
のように、微粒子銃による形質転換により形質転換した。バイオリスティック(
登録商標)PDS−1000/He粒子送達系(バイオラッド)の操作は、添付
マニュアルに詳述されている。形質転換のために、6mgの金粒子(0.6μm
;バイオラッド)に、10μgの線形化プラスミドDNA(Sanford e
t al.(1991)Biotechniques 3:3〜16;Brun
s&Cassidy−Hanley(1999)Methods in Cel
l Biology、第62巻:501〜512)を装着する。
エタノールに再懸濁した。このために、粒子を、3回、各場合について1〜2分
間、ボルテックスで激しく混合した。続いて、粒子を1分間遠心分離(1000
0G)し、上澄をピペットを使用して注意して取り出した。金粒子を、1mlの
無菌水に再懸濁し、上記のように遠心分離した。この洗浄段階を、1回繰り返し
、粒子を、1mlの50%グリセロールに再懸濁し、100μlずつ−20℃で
保存した。 形質転換体の調製:マクロ担体ホールダー、マクロ担体およびストップスクリ
ーンを、数時間、100%エタノール中で保存し、一方、破裂ディスクはイソプ
ロパノールに保存した。マクロ担体を、続いて、マクロ担体ホールダーに挿入し
、風乾した。
クター、2.5M CaCl2、1Mスペルミジンおよび70%および100%
エタノールを、氷上で冷却した。10μlの線形ベクターDNA(1μg/ml
)を、100μlの調製した金粒子に加え、混合物を、注意して10秒間ボルテ
ックスにかけた。続いて、100μlの2.5M CaCl2を、最初に加え、
その後、混合物を10秒間ボルテックスにかけ、次いで、40μlの1Mスペル
ミジンを加え、混合物を注意して10分間ボルテックスにかけた。200μlの
70%エタノールを添加した後、粒子を1分間ボルテックスにかけ、次いで10
000gで1分間遠心分離した。ペレットを、20μlの100%エタノールに
再懸濁し、遠心分離し、次いで35μlの100%エタノールに再懸濁した。こ
のように調製しておいた粒子をピペットを使用して、注意してマクロ担体の中心
に加えた。続いて、マクロ担体を、形質転換が生じるまで、吸湿性シリカゲルを
含むボックスに保存した。
−HCl(pH7.5)で加湿しておいた丸いフィルターの中心に加え、バイオ
リスティック(登録商標)PDS−1000/He粒子送達システム形質転換チ
ャンバー中の最も低いスライドイン棚に挿入した。形質転換は、形質転換チャン
バー中、900psiの圧力と(2つの450psiの破裂ディスク)、27イ
ンチHgの減圧下で、調製した金粒子を使用して実施した。次いで、細胞を、直
ちに、50mlのSPPA培地を含む三角フラスコに移し、振盪せずに30℃で
インキュベートした。
TPのデータベースで比較した結果を示す図である。
TPのデータベースで比較した結果を示す図である。
トの図である。
トの図である。
トの図である。
トの図である。
トの図である。
列のマルチプルアラインメント。チトクロムb5ドメイン由来のヒスチジンボッ
クスおよび保存HPGGモチーフに下線を付してある。
列のマルチプルアラインメント。チトクロムb5ドメイン由来のヒスチジンボッ
クスおよび保存HPGGモチーフに下線を付してある。
造図である。
)と、テトラヒメナpBDES6形質転換体(AX601およびAX604)の
脂肪酸のスペクトルの比較を示す図である。
Claims (16)
- 【請求項1】 配列番号2に示したアミノ酸配列を有するテトラヒメナから
得られるΔ−6−デサチュラーゼをコードする核酸、またはその機能的変異体、
および、配列番号1が請求項の一部である、少なくとも8個のヌクレオチドを含
むその一部。 - 【請求項2】 繊毛虫から得られることを特徴とする請求項1に記載の核酸
。 - 【請求項3】 テトラヒメナ・サーモフィラから得られることを特徴とする
請求項1または2に記載の核酸。 - 【請求項4】 DNAまたはRNA、好ましくは二本鎖DNAであることを
特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸。 - 【請求項5】 33位から1091位までの配列番号1に示した核酸配列を
有するDNAであることを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の核
酸。 - 【請求項6】 1つ以上の非コード配列を含むことを特徴とする請求項1か
ら5のいずれか一項に記載の核酸。 - 【請求項7】 配列番号3に示した請求項1から6のいずれか一項に記載の
単離核酸、またはその機能的変異体、および、配列番号3が請求項の一部である
、少なくとも8個のヌクレオチドを含むその一部。 - 【請求項8】 ベクターに、好ましくは発現ベクターに含まれることを特徴
とする請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸。 - 【請求項9】 核酸は、構成性および/または誘導性プロモーターと、およ
び所望により終結シグナルと機能的に結合していることを特徴とする請求項8に
記載の発現ベクター。 - 【請求項10】 核酸を化学的に合成する、または核酸をプローブを使用し
て遺伝子ライブラリーから単離することを特徴とする請求項1から7のいずれか
一項に記載の核酸の調製方法。 - 【請求項11】 配列番号2に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドま
たはその機能的変異体、および少なくとも6個のアミノ酸を含むその一部。 - 【請求項12】 適切な発現系または宿主生物において請求項1から7のい
ずれか一項に記載の核酸を発現することを特徴とする請求項11に記載のポリペ
プチドの調製方法。 - 【請求項13】 請求項11に記載のポリペプチドに対向する抗体。
- 【請求項14】 請求項1から10のいずれか一項に記載の核酸を有するト
ランスジェニック生物。 - 【請求項15】 植物または繊毛虫から選び出される、請求項11に記載の
トランスジェニック生物。 - 【請求項16】 繊毛虫においてΔ−6−デサチュラーゼ−依存性脂肪酸を
増強するための、請求項1から7に記載の核酸および/または請求項11に記載
のポリペプチドの使用。
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