JPH08502892A - 植物における中鎖チオエステラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明により、さらなる植物中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、並びに中鎖チオエステラーゼ配列とともに長鎖チオエステラーゼ配列の使用が提供される。第一の態様において、本発明は、ニレ及びCupheaからの特定の中鎖チオエステラーゼ配列、並びにＣ8 及びＣ10脂肪酸の産生のための宿主細胞中でのこれらのチオエステラーゼの発現のためのＤＮＡ構築物に関する。本発明の他の態様は、植物中鎖チオエステラーゼ又は植物細胞中で中鎖脂肪酸を提供するための非植物供給源からの中鎖チオエステラーゼの使用方法に関する。さらに別の態様として、植物細胞におけるアンチセンス法のための長鎖チオエステラーゼ配列の使用を、植物細胞における中鎖チオエステラーゼの発現とともに記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物における中鎖チオエステラーゼ 本出願は、1992年10月30日出願の米国逐次番号第07/968,971号の一部係属であ る。 産業上の利用分野 本発明はアミノ酸及び核酸の配列及び構築物、並びにそれに関連する方法に関 する。 発明の背景 いくつかの植物の科の成員は、分化した貯蔵組織中で多量の主に中鎖（Ｃ8〜 Ｃ14）のトリアシルグリセロールを合成し、そのいくつかは重要な食物又は工業 的中鎖脂肪酸の製造のために採取される（F.D．Gunstone，The Lipid Handbook （Chapman & Hall，New York，1986）pp.55-112）。例えばラウレート（Ｃ12:0 ）は一般に、年間約100万トンの割合で熱帯樹木の種子から抽出される（Battey ，et al.，Tibtech（1989）71:122-125）。 遍在長鎖脂肪酸合成が特殊化中鎖産生に切り替えられる機序が多年に亘って考 察の対象であった（Harwood，Ann．Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biology（ 1988）39:101-138）。最近、Pollard等（Arch．of Biochem．and Biophys.（199 1）284:1-7）は、カリフォルニアベイ Umbellularia californicaの発生中の脂 肪種子における中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を同定した。この活性 は、発生中の子葉がラウロイル（12:0）及びカプロイル（10:0）脂肪酸によるト リグリセリドのほとんど占有的産生に関わり合うよう になった場合にのみ現れる。この研究は、植物における中鎖脂肪酸合成に関する 機序の最初の証拠を呈示した。伸長中は、脂肪酸はアシルキャリヤータンパク質 （ＡＣＰ）とエステル結合したままである。チオエステルが早期に加水分解され ると、中鎖脂肪酸の放出により伸長は終結される。次いで、Davies等（Arch．Bi ochem．Biophys．（1991）290:37-45）によりゲッケイジュのチオエステラーゼ が精製され、これにより関連クローンを得るためにそして植物のトリグリセリド 組成を修正するために用いられてきた対応するｃＤＮＡのクローニングが可能に なった（ＷＯ 91/16421及びＷＯ 92/20236）。 発明の要約 本発明により、さらなる植物中鎖チオエステラーゼ、及び植物長鎖チオエステ ラーゼアンチセンス配列の使用が提供される。さらに非植物供給源からの中鎖チ オエステラーゼの使用が考慮される。 第一の態様において、本発明は、植物中鎖選択チオエステラーゼ、特にＣ8又 はＣ10の炭素鎖長を有する脂肪アシル−ＡＣＰｓに対する選択的活性を示すもの をコードする核酸配列に関する。これは、生物学的に活性な植物チオエステラー ゼをコードする配列、並びにプローブ、形質転換のためのベクター又はクローニ ング中間体として用いられる配列を含む。生物学的に活性な配列は、種々の構造 物中に見出される転写調節領域に関してセンス配向で優先的に見出される。植物 チオエステラーゼコード配列は、意図される用途によって完全又は部分配列をコ ードする。本発明は、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列の全部又は一部に、そして前 駆体又は成熟植物チオエステラーゼを含めたそれによりコードされるチオエステ ラーゼタンパク質に関する。本明細書中に例示する植物チオエステラーゼは、Cu phea hookeriana （Cuphea）及びニレ科 Ulmacea（ニレ）チオエステラーゼを 含む。例示したチオエステラーゼ配列は、他の同様の植物チオエステラーゼを得 るためにも用い得る。 特に興味深いのは、植物チオエステラーゼ配列の転写又は転写と翻訳（発現） を提供し得る組換え体ＤＮＡ構築物である。特に、植物宿主細胞中で転写又は転 写及び翻訳ができる構築物が好ましい。このような構築物は、植物種子組織中で 優先的に発現される遺伝子から得られる転写開始領域を含めた種々の調節領域を 含有する。 第二の態様において、本発明は宿主細胞、特に植物宿主細胞中のこのような構 築物の存在、並びに細胞中での構築物の発現を介しての宿主細胞又はその子孫中 での植物チオエステラーゼの製造方法に関する。この関連態様においては、本発 明は、その中に植物チオエステラーゼを発現しているトランスジェニック宿主細 胞を含む。 異なる態様において、本発明は細胞、特に植物細胞内で産生される遊離脂肪酸 の割合の修正のために植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列を用いる方 法に関する。このような修正遊離脂肪酸組成を有する植物細胞も、本明細書で意 図される。 中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含有するよう遺伝子処理された植物か らの植物種子油の中鎖脂肪酸含量をさらに増大するための方法が、別の態様で提 供される。特に植物長鎖チオエステラーゼに関連したアンチセンス配列の使用は 、生植物長鎖チオエステラーゼを低減するために行ない、このようにして中鎖チ オエステラーゼに対してより大きな基質利用可能性を提供する。 本発明の他の態様は、植物中鎖チオエステラーゼの使用方法に関する。中鎖脂 肪酸を産生するための細菌細胞中での植物中鎖チオエステラーゼの発現が提供さ れる。この方法により、多量のこのような脂肪酸を細菌から採取し得る。本使用 で例示されるのは、ニレ及 びCuphea チオエステラーゼを発現する大腸菌 E．coliの使用である。いくつ かの使用においては大腸菌ｆａｄＤ突然変異株が好ましい。さらに、中鎖脂肪酸 産生改良のための温度範囲が記載される。 同様に、中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する非植物酵素が考察 された植物及び細菌発現法に有用である。特に、ビブリオ菌Vibrio harveiから のアシルトランスフェラーゼはＣ14中鎖脂肪酸の産生のための使用に有用である 。 植物中鎖チオエステラーゼの使用による不飽和中鎖チオエステラーゼの産生方 法も本明細書中に記載する。大量の飽和中鎖アシル−ＡＣＰ脂肪酸を占有的に産 生し、トリグリセリド中に組込む植物においてさえ、チオエステラーゼは同一長 の不飽和脂肪酸に対する活性を有することが、目下判明している。 図面の簡単な説明 図１は、ゲッケイジュ Ｃ12:0- ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡクローンの 核酸配列及び翻訳アミノ酸配列を示す。 図２は、ニレ Ｃ10:0- ＡＣＰチオエステラーゼ部分ｃＤＮＡクローンの核酸 配列及び翻訳アミノ酸配列を示す。 図３は、Cuphea チオエステラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列及びＰＣＲ断片を示す 。Cuphea チオエステラーゼ遺伝子に対応する領域の翻訳アミノ酸配列も示す。 図４は、クローン１４−２及び１４−９からのC．hookeriana Ｃ９３Ａ Ｐ ＣＲ断片のＤＮＡ配列を示す。 図５は、Cuphea hookerianaチオエステラーゼ（ＣＵＰＨ−１）ｃＤＮＡクロ ーンの５’末端からの予備ＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を示す。 図６は、全長Cuphea hookerianaチオエステラーゼ（ＣＵＰＨ−１）ｃＤＮＡ クローン ＣＭＴ９の全核酸配列及び翻訳アミノ酸配列を示す。 図７は、全長Cuphea hookerianaチオエステラーゼ（ＣＵＰＨ−２）ｃＤＮＡ クローン ＣＭＴ７の核酸配列及び翻訳アミノ酸配列を示す。 図８は、Cuphea hookerianaチオエステラーゼｃＤＮＡクローン ＣＭＴ１３ の核酸配列を示す。 図９は、Cuphea hookerianaチオエステラーゼｃＤＮＡクローン ＣＭＴ１０ の核酸配列を示す。 図１０は、Cuphea hookerianaチオエステラーゼｃＤＮＡクローン ＣＬＴ７ の核酸配列及び翻訳アミノ酸配列を示す。 図１１は、アブラナ属Brassica campestris 長鎖アシル−ＡＣＰ チオエス テラーゼクローンの核酸配列及び翻訳アミノ酸配列を示す。 発明の詳しい説明 植物チオエステラーゼは、中鎖植物チオエステラーゼを含めて、ＷＯ 91/164 21（ＰＣＴ／ＵＳ91／02960）、ＷＯ 92/20236（ＰＣＴ／ＵＳ92／04332）及び ＵＳＳＮ 07/824,247（それらは全文を引用により本明細書中に取り込むものと する）に記載されている。 本発明の植物中鎖チオエステラーゼは、植物酵素反応条件下でＣ8〜Ｃ14脂肪 アシル−ＡＣＰ基質からの遊離脂肪酸の産生を触媒する能力を示す植物供給源か ら得られるアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のあらゆる配列を 含む。”酵素反応条件”という用語は、ある環境で得られる、酵素を機能させる のに必要なあ らゆる条件（即ち、温度、pH、基質阻害の欠如のような因子）を意味する。本適 用で特に興味深いのは、Cuphea hookeriana及びニレ（Ulmus 種）から得られる Ｃ8及びＣ10選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。 植物チオエステラーゼは、本明細書に示した特定例示配列から、及び関連供給 源から得られる。例えば、Cuphea hookeriana 属のいくつかの種、例えばprocum bens、lutea、hookeriana、hyssopifolia、wrightii及びinflataは、それらの種 子中に中鎖脂肪酸を含有するトリグリセリドを蓄積する。中鎖脂肪酸の別の天然 植物供給源は、クスノキ科：例えばピサ Pisa（Actinodophne hookeri）及びゲ ッケイジュ（Laurus nobilis）の種子である。他の植物供給源としては、ニクズ ク科Myristicaceae、ニガキ科Simarubaceae、Vochysiaceae科及びSalvadoraceae 科、並びにErisma、Picramnia及びVirolaの多雨林種が挙げられが、これらはＣ1 4脂肪酸を蓄積することが報告されている。 上記のように、その中に中鎖脂肪酸の有意の存在を有する植物が、天然中鎖選 択植物チオエステラーゼを得るのには好ましい。しかしながら、中鎖脂肪酸の有 意の存在を有さない他の植物供給源が他の酵素源として容易にスクリーニングさ れることも認識すべきである。さらに、内生的中鎖選択植物チオエステラーゼ間 、並びに長鎖及び／又は短鎖選択植物チオエステラーゼ間の比較により、合成中 鎖選択植物チオエステラーゼ並びに上記のものを生成するためのタンパク質模型 作製又は他の修飾のための洞察がなされる。 非植物供給源から得られるが、しかし植物遺伝子工学的適用のための構築物中 に使用するための植物配列を用いて修飾及び結合され得る、中鎖アシル−ＡＣＰ チオエステラーゼ活性を有する別の酵素も本明細書に記載する。さらに、このよ うな配列はゲッケイジュ チオエステラーゼに関して本明細書に上記したような原核生物細胞中での中鎖脂 肪酸の産生に用い得る。 当業者は、抗体製剤、核酸プローブ（ＤＮＡ及びＲＮＡ）等を調製し、種々の 植物供給源から”相同の”又は”関連した”チオエステラーゼをスクリーニング し及び回収するために用い得ることを容易に認識する。免疫学的スクリーニング 法に関しては、モノクローナル又はポリクローナル抗体製剤を用いる。検出のた めには、放射能あるいは市販の種々の二次抗体／酵素抱合体系のいずれかを用い て抗体を標識する。利用可能な抗体検出系のいくつかの例は、Oberfilder（Focu s（1989）BRL Life Technologies，Inc.，11:1-5）により記載されている。 相同配列は、配列の同一性が認められる場合に見出され、これは配列情報、即 ち核酸又はアミノ酸の比較時に、あるいは公知のチオエステラーゼと候補供給源 との間のハイブリダイゼーション反応により確定し得る。Glu/Asp、Val/Ile、Se r/Thr、Arg/Lys及びGln/Asnのような保存性変化も、アミノ酸配列相同性を確定 する場合に考慮される。アミノ酸配列は２つの完全成熟タンパク質間の25％とい う少ない数値の配列同一性で相同であると考えられる（一般に、Doolittle，R.F .，OF URFS and ORFS（University Science Books，CA< 1986）参照）。一般的 には、長い核酸配列は50〜60%の小さな数値の、さらに好ましくは少なくとも約7 0%の配列同一性を標的配列と問題の既知の植物チオエステラーゼ（但し存在し得 る欠失はすべて除く）との間に示し得るし、そして依然として関連があると考え られる。 問題の候補植物供給源から調製されるゲノム又は他の適切なライブラリーは、 相同的関連配列を同定するために植物チオエステラーゼからの保存配列でプロー ブされる。高度保存配列が同定され得る 場合に特に、短いプローブがポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）にはしばしば特に有 用である。 長い核酸断片をプローブとして用いる（>100 bp）場合、特に完全又は大型ｃ ＤＮＡ配列を用いる場合には、20〜50%偏差を有する標的サンプル、即ち相同配 列からのシグナルを得るために、低緊縮性（例えばプローブの溶融温度より40〜 50℃低い）でスクリーニングし得る（Beltz，et al.，Methods in Enzymology（ 1983）100:266-285 参照）。 当業者に公知の方法を用いて、植物中鎖チオエステラーゼをコードするＤＮＡ 配列を、トランスジェニック植物の発現のために選択される宿主細胞中に導入し 得る構築物中に挿入できる。したがって考え得る宿主細胞としては、原核生物及 び真核生物細胞の両方が挙げられる。宿主細胞は、意図する用途によって、単細 胞であるかあるいは多細胞分化又は未分化生物中に見出だされる。本発明の細胞 は、その中に存在する野生型細胞とまったく異なる植物チオエステラーゼを有す ることで、例えばその中に存在する植物チオエステラーゼをコードする組換え体 核酸構築物を有することで区別し得る。 さらに宿主によって、調節領域は、ウイルス、プラスミド又は染色体遺伝子等 からの領域を含めて変化する。原核又は真核生物微生物、特に単細胞宿主中での 発現に関しては、広範な種々の構成性又は調節性プロモーターを用い得る。記載 済の転写開始領域としては、ベーターガラクトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、ト リプトファン Ｅ等を含めた細菌及び酵母菌宿主、例えば大腸菌 E．coll、枯 草菌 B．subtilis、ビール酵母菌 Sacchromyces cerevisiaeからの領域が挙げ られる。 ほとんどの部分に関しては、植物宿主細胞中での発現が望ましい場合、構築物 は植物中で機能的な調節領域（プロモーター及び終結 領域）を包含する。植物チオエステラーゼ又はその機能断片をコードする読み取 り枠は、その５’末端で転写開始調節領域、例えばチオエステラーゼ構造遺伝子 に対して５’上流に天然に見出される野生型配列と接合される。広範な種々の構 成性又は調節性の、例えば誘導性の構造遺伝子機能の転写を提供する多数の他の 転写開始領域が利用できる。植物に対して用いられる転写開始領域としては、Ｃ ａＭＶ 35Ｓ並びにノパリン及びマンノピンシンターゼに対するような構造遺伝 子と、又はナピン、ＡＣＰプロモーター等と関連したこのような領域が挙げられ る。このような構造遺伝子に対応する転写/ 翻訳開始領域は、それぞれの開始コ ドンに対して５’上流で直に見出される。問題の植物宿主がもともと有するプロ モーター、又は修飾プロモーター、即ち問題の植物チオエステラーゼをコードす る配列を含む、１つの遺伝子供給源に由来する転写開始領域及び異なる遺伝子供 給源に由来する翻訳開始領域を有するプロモーター、あるいは増強プロモーター 、例えば二重35Ｓ ＣａＭＶプロモーターのような特定のプロモーターを所望す る場合は、標準技法を用いて一緒に接合し得る。植物中での中鎖チオエステラー ゼの発現を所望するほとんどの適用に関しては、種子特異的プロモーターの使用 が好ましい。 このような構築物が遺伝子工学的応用に首尾よく用いられて、このような中鎖 脂肪酸を通常は含有しない植物中にＣ12（ラウレート）を産生した（ＷＯ 91/1 6421）ことは、留意すべきである。特にゲッケイジュ Ｃ12選択アシル−ＡＣＰ チオエステラーゼは、アブラナ属及びArabidopsis植物中で発現された。その 結果生じた植物からの種子は、種子油中に50mol %までのラウレートを含有する ことが観察された（ＷＯ 92/20236）。 このようなトランスジェニック植物中での中鎖脂肪酸産生を増大 するためのさらなる遺伝子工学的アプローチは、標的宿主植物における生長鎖チ オエステラーゼのアンチセンス配列を用いる。このように、長鎖チオエステラー ゼの量は低減される。その結果、導入中鎖チオエステラーゼは利用可能な基質を 増大し、産生される中鎖脂肪酸の含量は同様に増大される。 中鎖脂肪酸産生を増大するための他の遺伝子工学的アプローチとしては、例え ば植物チオエステラーゼ構造遺伝子をコードする付加的ＤＮＡ配列の細胞中への 挿入、高ｍＲＮＡコピー数を立証する転写開始領域の使用又は基質の有効性によ く対応する改良時機特異性プロフィールが挙げられる。例えば、ナピンプロモー ターの調節制御下でのラウレート産生の時間経過の分析からは、アブラナ属植物 の種子において、中鎖チオエステラーゼ活性の出現が貯蔵油合成の開始から約５ 〜７日遅れることが立証される。全脂肪酸の約20% が中鎖チオエステラーゼが有 意の影響力を持つ前にすでに合成されていることが計算から示される。したがっ て、チオエステラーゼ遺伝子が胚発生の初期段階で発現される場合には、実質的 により高い中鎖脂肪酸レベル（10〜20%）が得られる。 さらに、翻訳効率を増大するための手段としては、中鎖チオエステラーゼ遺伝 子の完全構造性コード配列の使用が挙げられる。したがって、中鎖チオエステラ ーゼコード配列の完全５’領域を使用すると、中鎖脂肪酸産生が改良される。 植物中鎖チオエステラーゼが細菌細胞中で、特に脂肪酸を有効に分解できない 細菌細胞中で発現されると、多量の中鎖脂肪酸が産生され、細胞から採取される 。同様に、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する非植物酵素の過剰産生 も、大腸菌 E．coliにおける中鎖脂肪酸の産生に有用である。いくつかの場合 、中鎖脂肪酸塩は、細菌細胞から容易に分離される結晶を形成する。アシル−Ｃ ｏＡシンターゼを欠く細菌突然変異体、例えば大腸菌 ｆａｄＤ及びｆａｄＥ突 然変異株を用い得る。 ゲッケイジュ チオエステラーゼを用いた研究において、ベクター形質転換対 照と比較してｆａｄＤゲッケイジュ チオエステラーゼ形質転換体の成長は37℃ で非常に阻害され、25〜30℃ではそれほどでない。低温で増殖する液体培養は沈 殿物を蓄積し、25℃でペトリ皿上に形成されるコロニーは、特に表面に多量のラ ウレート結晶を沈積する。これらの沈積物は、ＦＡＢ−質量分析により同定する と、ラウレートとして同定された。異常成長速度表現型も、ニレ中鎖選択アシル −ＡＣＰチオエステラーゼを発現する大腸菌細胞で認められた。37℃で、ニレチ オエステラーゼは細胞に対して有毒であると考えられ、25℃又は30℃では、細胞 は対照非形質転換細胞よりもゆっくりと成長する。形質転換細胞を数世代増殖す る場合、25℃又は30℃で対照細胞と同じ速度で成長する変異体が選択されるとい うことがゲッケイジュ及びニレ チオエステラーゼ発現大腸菌細胞に関して認め られた。さらに、ゲッケイジュ チオエステラーゼ発現正常成長表現型変異体が ゲッケイジュ チオエステラーゼコードプラスミドを除かれ、そしてニレチオエ ステラーゼ発現構築物を含有する同様のプラスミドで再形質転換されると、ニレ チオエステラーゼ発現細胞は構築物を包含する細胞の第一世代で正常成長表現 型を示す。同様に、ミリステート結晶は、ビブリオ属 Ｃ14チオエステラーゼ遺 伝子を発現する大腸菌ｆａｄＤ形質転換株中で産生される。この場合、成長温度 は細胞成長又はミリステート産生に有意に作用しない。ガスクロマトグラフィー による分離及び定量後、ペトリ皿上にｆａｄＤ−ゲッケイジュ チオエステラー ゼ形質転換株により沈積されたラウレート結晶は産生細菌の総乾燥重量の約30〜 100 % に相当した。 中鎖チオエステラーゼの発現が植物細胞において所望される場合、問題の種々 の植物としては、ナタネ（Canola and High Erucic Acid varieties）、ヒマワ リ、ベニバナ、ワタ、Cuphea、ダイズ、ラッカセイ、ココヤシ及びギネアアブラ ヤシ、並びにトウモロコシが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞中 への組換え体構築物の導入方法によって、他のＤＮＡ配列が必要な場合もある。 重要なのは、本発明が双子葉植物及び単子葉植物種に同様に適用可能であり、新 規の及び／又は改良型の形質転換及び調節技術に容易に適用できる。 とにかく、形質転換の方法は本発明にとっては重要ではない。植物形質転換の 種々の方法が広く利用できる。作物を形質転換するためにより新しい方法が利用 できるので、それらは直接下文に適用し得る。例えば、アグロバクテリア感染が 当然疑われる多数の植物種を、アグロバクテリア介在形質転換の３分節系又は２ 元ベクター法により首尾よく形質転換し得る。さらに、種々の単子葉及び双子葉 植物種の形質転換を可能にする微量注射法、ＤＮＡ粒子ボンバード、電子穿孔が 開発されている。 本発明のトランスジェニック宿主細胞中で産生される中鎖脂肪酸は、種々の商 業的用途に有用である。例えば、Ｃ12及びＣ14は、洗剤工業に広く用いられる。 Ｃ8及びＣ10脂肪酸は滑剤として、例えばジェットエンジンに用いられる。Ｃ8及 びＣ10脂肪酸はまた高性能スポーツ食品に及び低カロリー食物用に用途が見出さ れる。 以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。 実施例実施例１ ：植物Ｃ8及びＣ10アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの供 給源 Cuphea hookerianaからの種子の分化におけるＣ10選択アシルーＡＣＰチオエ ステラーゼ活性の発見は、ＷＯ 91/16421に記載されている。他の植物もＣ8又 はＣ10の脂肪酸鎖長の方を選ぶ所望のチオエステラーゼの供給源であり得る。こ のようなさらに別の植物チオエステラーゼは、種々の植物油のトリアシルグリセ リド組成物及び適切なアシル−ＡＣＰ基質を用いた検定により確証された特定の チオエステラーゼの存在を分析することにより同定し得る。Ｃ10選択アシル−Ａ ＣＰチオエステラーゼに関する検定は、例えばＷＯ 91/16421に記載されている ように、このような分析に用い得る。 例えば、所望のチオエステラーゼ酵素を有することが目下発見されている他の 植物としては、ニレ（Ulmacea）及びココナツ（Cocos nucifera）が挙げられる 。有意のパーセンテージの10:0脂肪酸がニレ種子中に検出され、8:0及び10:0脂 肪酸がともにココナツからの種子中に顕著である。ニレ及びココナツからの胚の 分化におけるチオエステラーゼ活性を調べるための生化学的検定の結果を下の表 １に示す。 ニレに関しては、長鎖基質での有意の活性の他に、チオエステラーゼのピーク はＣ10:0−ＡＣＰ基質で観察された。この証拠は、Ｃ10:0−ＡＣＰ基質に対する 特異的活性を有するチオエステラーゼがニレ胚中に存在することを示唆する。コ コナツに関しては、表６に示すように、内乳チオエステラーゼ活性はＣ8:0、Ｃ1 0:0、Ｃ12:0及びＣ14:0中鎖基質で観察された。これらの活性は、内乳油の多量 のＣ8:0、Ｃ10:0、Ｃ12:0及びＣ14:0脂肪酸含量と一致し、このことは、これら の中鎖アシル−ＡＣＰに及ぼす活性を有する１つ又はそれ以上のチオエステラー ゼがココナツ内乳中に存在し、その中での中鎖形成に関与することを示唆する。実施例２ ：アシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡ配列 Ａ．ゲッケイジュ 全長ゲッケイジュＣ12選択アシル−ＡＣＰｃＤＮＡクローン，ｐＣＧＮ3822の 配列（３Ａ−１７）を、図１に示す。 発生中の種子から単離した成熟ゲッケイジュチオエステラーゼのＮ−末端配列 は、誘導タンパク質配列のアミノ酸残基84で始まると報告されている（ＷＯ 92 /20236）。残りのＮ−末端アミノ酸は、したがってトランジットペプチドの配列 を示すと予測される。この83個のアミノ酸配列は、通常は40〜100アミノ酸配列 長であるプラスミドトランジットペプチドに共通の特徴を示し、（Keegstra et al.，Ann．Rev．Plant Physiol．and Plant Mol．Biol．（1989）40:471-501） 。このトランジットペプチド領域のヒドロパシープロットにより、トランジット 配列の各末端の疎水性ドメインが明らかになった。他のトランジットペプチド配 列は、同様の疎水性Ｎ−末端ドメインを含有することが示されている。このＮ− 末端ドメインの意味は不明であるが、しかしある種の実験により、いくつかのタ ンパク質のプラスミド輸入には脂質媒介結合が重要であることが示 唆された（Friedman and Keegstra，Plant Physiol.（1989）89:993-999）。Ｃ −末端ドメインに関しては、公知の輸入葉緑体ストロマタンパク質のヒドロパシ ープロット（Keegstra等。上記）の比較により、これらのトランジットペプチド がＣ−末端に疎水性ドメインを持たないことが示された。しかしながら、葉緑体 のチラコイド内腔に予定されたプレタンパク質は、それらのトランジットペプチ ドのＣ−末端に富アラニン疎水性ドメインを有する（Smeekens et al.，TIBS（1 990）15:73-76）。ゲッケイジュチオエステラーゼのトランジット配列中のこの ようなドメインの存在は、それがこの酵素をチラコイド等価物の内腔又は内膜間 隙の目標に向ける二重ドメイントランジットペプチドを有することを示唆する。 これは、基質アシル−ＡＣＰがストロマ中で検出されていたために（Ohlrogge e t al.，Proc．Nat．Acad．Sci．（1979）76:1194-1198）、予期できなかった。 ゲッケイジュチオエステラーゼプレタンパク質におけるこのようなドメインの存 在の別の解釈は、それが精製時に開裂され、人工Ｎ−末端の配列決定に導く成熟 タンパク質の膜固着部を示すというものである。その時、成熟チオエステラーゼ タンパク質のin vivo Ｎ−末端は、アミノ酸配列分析により示されるよりもさら に上流位置にある。 別の植物中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列、例えば本明細書中に記載 のニレ及びCuphea クローンによりコードされるものの分析から、ゲッケイジュ Ｃ12選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼトランジットペプチドのＣ−末端ドメ インとして初めに同定された領域における広範な相同性がしめされた。したがっ て、この仮定したトランジットペプチド”Ｃ−末端ドメイン”は、実際、成熟ゲ ッケイジュチオエステラーゼの別のＮ−末端を示すと考えられる。このような場 合、図１でアミノ酸第60番として示されたロイシン残 基は、成熟ゲッケイジュＣ12チオエステラーゼタンパク質のＮ−末端の候補であ る。ゲッケイジュＣ12チオエステラーゼタンパク質を発現するトランスジェニッ クアブラナ属植物のウエスターン分析から、約41kbのタンパク質バンド（このサ イズは成熟タンパク質Ｎ−末端がロイシン残基、即ちアミノ酸第60番に又はその 近くに位置することを示唆する）が明らかになった。 植物中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの誘導アミノ酸配列を用いた遺 伝子バンクサーチにより、脊椎動物中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ ＩＩ を含めたあらゆる記載物との有意の適合が明らかにされるわけではない（Nagger t et al.，Biochem．J．（1987）243:597-601）。さらに、植物中鎖選択アシル −ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸シンテターゼチオエステラーゼ活性部位の 特色に類似した配列を含有しない（Aitken，1990 in Identification of Protei n Concensus Sequences， Active Site Motifs，Phosphorylation and other Po st-translational Modifications（Ellis Horwood，Chichester，West Sussex， England，pp.40-147））。 Ｂ．Cuphea Cuphea hookerianaチオエステラーゼタンパク質の一部分をコードするＤＮＡ 配列（図３）は、ＷＯ 92/20236に記載されているように、ＰＣＲにより得られ る。 Cuphea チオエステラーゼペプチド領域に対応する別のＤＮＡ配列は、ＷＯ 92/20236に記載されているように植物チオエステラーゼの保存領域からのペプチ ド断片から設計される縮退オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより得られる。 前進プライマー ＴＥＣＵ９は、ゲッケイジュ及びクスノキチオエステラーゼタ ンパク質のアミノ酸176 〜181に対して考え得るすべてのコード配列に対応する1 7個のヌクレオチドを含有する。復帰プライマー ＴＥＣＵ３Ａは 、ゲッケイジュ及びクスノキチオエステラーゼタンパク質のアミノ酸283 〜288 に対して考え得るすべてのコード配列に対応する18個のヌクレオチドを含有し、 さらに前進及び復帰プライマーは５’末端にそれぞれＢａｍＨＩ又はＸｈｏＩ制 限部位を含有し、そして復帰プライマーは３’末端にイノシンヌクレオチドを含 有する。ベニバナ、ゲッケイジュ及びクスノキ配列は前進プライマー領域の２つ のアミノ酸位置、並びに前進プライマー領域の１つのアミノ酸残基で分岐する。 オリゴヌクレオチドプライマーの縮退は、それらがベニバナ、ゲッケイジュ及び クスノキ配列をコードし得るようなものである。 鋳型としての復帰転写Cuphea hookeriana ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドプラ イマー各々１μMを用いて、ポリメラーゼ鎖反応サンプル（100μl）を調製した 。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分析して、約300 bpのＤＮＡ断 片（チオエステラーゼペプチド配列からの予測サイズ）を観察した。Ｃ93Ａ（Cu phea）と呼ばれるＤＮＡ断片を単離し、ＰＣＲ挿入ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限 消化部位を用いて便利なプラスミドベクター中にクローン化した。代表的クロー ンのＤＮＡ配列を得た。これらの配列の分析から、少なくとも２つの異なるがし かし相同のCuphea hookeriana ｃＤＮＡが増幅されたことが示された。２つのCu phea ＰＣＲ断片のＤＮＡ配列 １４−２及び１４−９を図４に示す。 ＷｅｂｂとＫｎａｐｐ（Plant Mol．Biol．Reprter（1990）8:180-195）のＤ ＮＡ単離方法の変法を用いて、ｃＤＮＡライブラリー構築のための総ＲＮＡを発 生中のCuphea胚から単離した。緩衝液には以下のものが含まれた： ＲＥＣ ： 50mM TrisCl pH 9，0.7 M NaCl，10mM EDTA pH 8，0.5% CTAB． ＲＥＣ＋ ： 使用直前にＢ−メルカプトエタノールを加えて １％にする。 ＲＥＣＰ ： 50mMTrisClpH9， 10mMEDTA pH8,及び0.5 % CTAB． ＲＥＣＰ+ ： 使用直前にＢ−メルカプトエタノールを加えて 1% にする。 組織１ｇを抽出するために、10mlのＲＥＣ＋及び0.5ｇのＰＶＰＰを組織に加 えて、これを液体窒素中で粉砕し、均質化した。均質化物質を、1200 rpmで10分 間遠心分離した。上清をミラクロスに通して３mlの冷クロロホルム上に注ぎ入れ て、再び均質化した。12,000rpmで10分間遠心分離した後、上相を取り出して、 その容量を測定した。等容量のＲＥＣＰ＋を加え、混合物を室温に20分間放置し た。その物質を10,000rpmで20分間、２回遠心分離し、各回転後に上清を捨てた 。ペレットを0.4 mlの１M NaCl（ＤＥＰＣ）に溶解し、等容量のフェノール/ ク ロロホルムで抽出した。エタノールで沈殿させた後、ペレットを１mlのＤＥＰＣ 水溶液中に溶解した。Maniatis等（Molecular Cloning: Laboratory Manual（19 82）Cold Springs Harbor，New York）に従って、この総ＲＮＡからポリ （Ａ） ＲＮＡを単離した。市販のプラスミド又はファージベクター中にｃＤＮＡライブ ラリーを作製した。 上記のようにＰＣＲから得られたチオエステラーゼコード断片を標識し、これ を用いてCuphea ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてチオエステラーゼ ｃＤＮＡを単離した。Cuphea ｃＤＮＡ クローン ＴＡＡ 342の予備ＤＮＡ 配列を図５に示す。推定上の成熟Ｎ−末端からのCupheaクローンの翻訳済アミノ 酸配列（ゲッケイジュチオエステラーゼとの相同性に基づく）を示す。 配列は予備的なものであって、クローンの５’領域における単一 読み取り枠を明示するものではない。成熟タンパク質配列を示すと考えられる読 み取り枠を対応するＤＮＡ配列の下に示した。ゲッケイジュチオエステラーゼタ ンパク質との相同性に基づいて、Ｎ−末端アミノ酸を選択した。 Ｕｎｉ−ＺＡＰ（Stratagene）ファージライブラリークローニング系を用いて 調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、別のCuphea ｃＤＮＡクローンを得た。放射能標識化ＴＡＡ 342 ＤＮＡを用いてライブラリ ーをスクリーニングした。30% ホルムアミドを用いて42℃でライブラリーをハイ ブリダイズし、低緊縮で（室温で１ｘＳＳＣ，0.1% ＳＤＳを用いて）洗浄を実 施した。多数のチオエステラーゼクローンを同定し、ＤＮＡ配列を確定した。３ 種類のCuphea ｃＤＮＡクローンが同定された。上記の原ＴＡＡ 342は、他の 植物中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと相同の広範な領域を有するＣＵ ＰＨ−１型クローンの代表的なものである。ＣＵＰＨ−１クローンの核酸配列及 び翻訳されたアミノ酸配列を図６に示す。成熟タンパク質は、88番目のアミノ酸 位置のロイシンで又は112番目のアミノ酸位置のロイシンで、あるいはその近く で始まると考えられる。ＴＡＡ 342とＣＭＴ９との比較から、ＴＡＡ 342配列 は、存在する場合にはＣＭＴ９上のＣＵＰＨ−１チオエステラーゼコード配列と 一致するようにＴＡＡ 342 ＣＵＰＨ−１クローンの読み取り枠を移し変える塩 基を欠いていると考えられる。特に、ＣＵＰＨ−１に関する停止コドンは、図５ のヌクレオチド1391〜 1393でＴＡＧトリプレットであると目下考えられている 。 別のＣＵＰＨ−１クローン ＣＭＴ10のＤＮＡ配列を図９に示す。ＣＭＴ10は ＣＭＴ９との90% より大きい配列同一性を有するが、しかし他のＣＵＰＨ−１型 クローンからの断片では約99% 未満の配 列同一性が認められた。 Cuphea チオエステラーゼｃＤＮＡの第二の種類は、ＣＵＰＨ−２と同定され た。これらのｃＤＮＡも、他の植物中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに対す る広範な相同性を示した。大腸菌中での代表的クローン ＣＭＴ７の発現（以下 で詳述）は、ＣＵＰＨ−２がＣ8及びＣ10アシル−ＡＣＰ基質に対する選択的活 性を有する中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードするこ とを示した。ＣＭＴ７のＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を図７に示す。 別のＣＵＰＨ−２クローン ＣＭＴ13の５’末端からの予備ＤＮＡ配列を図８ に示す。ＣＭＴ13はＣＭＴ７との広範な配列同一性を立証するが、しかしＤＮＡ 配列線形は、まとめて総計約４８ヌクレオチドとなるいくつかのギャップを示し 、ここではＣＭＴ13クローンはＣＭＴ７クローンに存在する配列を欠いている。 第三の種類のCuphea チオエステラーゼｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は 、ＤＮＡ及びアミノ酸レベルで、アブラナ属（図１１）及びベニバナ（ＷＯ 92 /20236）からの18:1 アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとの広範な相同を示した 。代表的クローン ＣＬＴ２のＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配列を図10に示す。 Ｃ．ニレ Cupheaに関して上記したように植物チオエステラーゼ配列のためのＰＣＲプラ イマーを用いて、ニレアシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローンを得た。鋳型と してニレ胚から単離される復帰転写ＲＮＡを用いるＰＣＲ反応に、ＴＥＣＵ９及 びＴＥＣＵ３Ａを用いた。Cupheaの場合と同様に、約300ヌクレオチド断片 Ｅ9 3Ａを得て、これを用いてニレｃＤＮＡライブラリーをプローブした。ニレ中鎖 選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローンの核酸配列及び翻訳 アミノ酸配列を図２に示す。クローンは全成熟ニレチオエステラーゼタンパク質 をコードするが、しかしトランジットペプチドコード領域のいくつかを欠く。た の植物中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとの比較により、成熟ニレタンパク 質は第54番目のアミノ酸として示されたロイシンで、又は第79アミノ酸として示 されたアスパラギン酸塩で始まると考えられた。実施例３ ：大腸菌中でのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現 Ａ．ニレチオエステラーゼの発現 ニレアシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡクローンを１ａｃＺ融合体とし て大腸菌中で発現させた。図２に示したＵＬＭ１ ｃＤＮＡクローン ＫＡ10を ＳｔｕＩ及びＸｂａＩで消化して、大多数の成熟ニレチオエステラーゼコード配 列を含有する約1000塩基対の断片を生成した。ＳｔｕＩ部位は、図２に示した配 列のヌクレオチド250 〜255 に位置し、ＸｂａＩ部位はヌクレオチド1251〜1256 、即ち終止コドンまで３’に位置する。上記のように、成熟ニレチオエステラー ゼに関するＮ−末端はヌクレオチド160 〜162 によりコードされるロイシン残基 又はヌクレオチド235 〜237 によりコードされるアスパラギン酸残基であると考 えられる。ＳｔｕＩ/ ＸｂａＩ断片は、ＳｔｕＩ/ ＸｂａＩ消化ｐＵＣ118中に 挿入されて、構築物ＫＡ11を生じる。発現分析のために、ＫＡ11を用いて中鎖特 異的アシル−ＣｏＡシンセターゼを欠く大腸菌ＤＨ５ａ株又は大腸菌突然変異株 ｆａｄＤ（Overath et al.，Eur．J．Biochem.（1969）7:559-574）を形質転 換した。 ゲッケイジュチオエステラーゼ構築物で観察されたように、ニレチオエステラ ーゼを発現する大腸菌クローンは異常成長速度及び形態学的表現型を示した。ニ レチオエステラーゼを発現する大腸菌ＤＨ５ａ（ｆａｄＤ＋）又はｆａｄＤ突然 変異体細胞の成長速度は 、初期には25℃又は30℃では対照細胞の成長より遅かった。37℃では、ニレチオ エステラーゼプラスミドは大腸菌細胞に対して有毒であるようにみえた。形質転 換培養を数世代増殖後、25℃又は30℃で対照細胞と同じ速度で成長する変異株を 選択し得る。同様の結果は、ゲッケイジュチオエステラーゼ発現構築物を包含す るｆａｄＤ細胞を用いて観察された。ゲッケイジュチオエステラーゼを発現する 場合に正常成長速度を有するとして選択されたｆａｄＤ突然変異株はゲッケイジ ュチオエステラーゼ構築物を除かれて、ニレチオエステラーゼ構築物で形質転換 された。この株は、ニレチオエステラーゼ構築物を包含する細胞の第一世代にお いて正常成長表現型を示した。 チオエステラーゼ活性及び脂肪酸組成検定のために、ニレチオエステラーゼ構 築物を含有する大腸菌細胞の25〜50ml培養、及び対照細胞の同様の培養を25℃で 〜0.5 までのＯＤ600 に増殖させた。チオエステラーゼ発現の誘導は、ＩＰＴＧ の0.4 mMまで付加し、その後１〜２時間さらに増殖させることにより達成した。 緩徐成長培養に関しては、より長い増殖期間とその後のＩＰＴＧ付加を要する。 各培養の10mlアリコート（細胞＋培地を含有）を以下に示すようにＣ10:0−Ａ ＣＰ及びＣ16:0−ＡＣＰ基質に対する特異的活性に関して検定した。遠心分離に より細胞を採取して、0.5 mlの検定緩衝液中に再懸濁し、音波処理により溶解し た。さらに遠心分離して細胞屑を除去した。次にＣ10:0−ＡＣＰ及びＣ16:0−Ａ ＣＰ基質を用いてPollard等（Arch．Biochem & Biophys．（1991）281:306-312 ）の通りにチオエステラーゼ活性検定に上清を用いた。 正常成長表現型ＫＡ11細胞は、Ｃ10:0−ＡＣＰ及びＣ16:0−ＡＣＰ加水分解活 性の示差的上昇を再現可能的に立証した。ＩＰＴＧによる誘導時に、Ｃ10:0−Ａ ＣＰ及びＣ16:0−ＡＣＰ活性は別様に作 用された。Ｃ16:0−ＡＣＰ加水分解の特異的活性はわずかに減少し、一方Ｃ10:0 −ＡＣＰ加水分解の場合は約44% 増大した。このデータは、Ｃ16:0−ＡＣＰ加水 分解活性がニレチオエステラーゼよりむしろ大腸菌細胞に由来することを示唆す る。下記に詳述するように、同様のＣ16:0−ＡＣＰ加水分解活性はCuphea hooke riana チオエステラーゼクローン ＣＵＰＨ−１で形質転換された大腸菌細胞中 に検出された。 脂肪酸組成の分析のために、上記のように増殖させ、誘導した大腸菌細胞の4. 5 mlサンプルをテフロンの内張りをした蓋のある15mlガラスバイアル中に移した 。１：１ クロロホルム/ メタノール中にＣ11:0遊離脂肪酸、Ｃ15:0遊離脂肪酸 及びＣ17:0ＴＡＧを各々１mg/ml 含有する１mg/ml 標準溶液 100μl をサンプ ルに加え、その後氷酢酸 200μl及び１：１ クロロホルム/ メタノール 10ml を加えた。サンプルを攪拌し完全に混合して、1000 rpmで５分間遠心分離し、完 全相分離した。下部（クロロホルム）相を注意深く取り出して清浄なフラスコに 移し、回転蒸発器（Rotovap）で用いるために割り当てた。サンプルを蒸発させ てほぼ乾燥させた。中鎖脂肪酸は、溶媒除去後に選択的に蒸発されると思われる ので、バイアルを室温に保持するのにまさに十分な熱を用いることが重要である 。メタノール中に溶解した５% 硫酸 １mlを加えて乾燥サンプルをメタノール化 し、サンプルを５mlバイアルに移して、90℃水浴中で２時間サンプルをインキュ ベートした。サンプルを冷却し、その後0.9%ＮａＣｌ １ml及びヘキサン 300 μlを加えた。サンプルを攪拌し、十分混合して、1000 rpmで５分間遠心分離し た。上部（ヘキサン）相を注意深く取り出し、ガラス円錐インサートを含入する プラスチック製自動試料採取器に入れた後、クリンプシールでバイアルを蓋締め した。 10又はそれより少数の炭素原子を有する成分の分離を増強するために温度プロ グラムを用いるガス−液体クロマトグラフィー（ＧＣ）によりサンプルを分析し た。用いた温度プログラムは３分間140℃の温度を提供し、その後230℃に達する まで５℃／分で温度を上昇させて、230℃に11分間保持した。Hewlett-Packard 5 890（PaloAlto，CA）ガスクロマトグラフィーでサンプルを分析した。脂肪酸含 量の計算は、内部基準を基礎にした。 ＧＣ分析は、ニレチオエステラーゼを発現する緩徐成長大腸菌ＤＨ５ａ細胞が 約46.5 mol % のＣ10:0及び33.3 mol % のＣ8 :0脂肪酸を含有することを示した が、これに比して対照培養における脂肪酸レベルは1.8 mol % のＣ10:0及び3.1 mol % のＣ8 :0 であった。対照培養の最大パーセンテージ成分は、Ｃ16:0で45. 2 mol% であった。比較した場合、ＫＡ11培養は約8.4 mol % のＣ16:0−のみを 含有した。正常成長速度表現型を示した後世代のＫＡ11細胞に関する同様の分析 からは、低パーセンテージのＣ10:0（25.9mol % ）及びＣ8 :0（18.9 mol % ） 脂肪酸が明示された。この後者の試験では、対照大腸菌培養は各々約５ mol % のＣ10:0及びＣ8 :0を含有した。 Ｂ．Cuphea hookerianaチオエステラーゼの発現 １．図７に示したＣＵＰＨ−２型C．hookeriana ｃＤＮＡクローン（ＣＭＴ ７）は、大腸菌中でｌａｃＺ融合体として発現された。ＣＭＴ７をＳｔｕＩで消 化し、ＸｈｏＩで部分的に消化して、大多数のチオエステラーゼコード領域を含 有する約1100塩基対断片をＳｍａＩ／ＳａｌＩ消化ｐＵＣ118中にクローン化し 、構築物ＫＡ17を生じた。ＣＭＴ７中のＳｔｕＩ部位は、図７に示した配列のヌ クレオチド380 〜385 に位置し、ＸｈｏＩ部位はベクタークローニング領域のｃ ＤＮＡクローンの３’末端の後に位置した。上記のよう に、成熟ＣＵＰＨ−２チオエステラーゼに関するＮ−末端はヌクレオチド365 〜 367 によりコードされるアスパラギン酸残基か又はヌクレオチド293 〜295 によ りコードされるロイシン残基であると考えられた。発現分析のために、ＫＡ17を 用いて大腸菌 ｆａｄＤ＋細胞（ＢＲＬからのＳＵＲＥ細胞のような市販細胞を 用い得る）又は中鎖特異的アシル−ＣｏＡシンテターゼを欠く大腸菌突然変異株 ｆａｄＤ（Overath et al.，Eur．J．Biocem（1969）7:559-574）を形質転換 した。 ゲッケイジュ及びニレを用いた結果とは異なって、ＫＡ17で形質転換された大 腸菌 ｆａｄＤ＋細胞は異常成長又は形態学的表現型を示さなかった。しかしな がら、ｆａｄＤ突然変異株においては、プラスミドは37℃で保持されなかった。 30℃では、形質転換細胞はわずかにゆっくりと増殖し、培地プレート上に小さな コロニーを形成したが、しかしプラスミドは安定して保持された。 ＫＡ17チオエステラーゼを発現するｆａｄＤ＋及びｆａｄＤ突然変異株の両方 の培養でＧＣ分析を実施した。Ｃ8 :0の増大及び少程度までのＣ10:0脂肪酸蓄積 がｆａｄＤ＋及びｆａｄＤ突然変異株の両方で観察された。一実験において、２ 時間誘導後のｆａｄＤ＋細胞中のＣ8 :0及びＣ10:0脂肪アシル基のレベルは、そ れぞれ23.5及び8.1 mol % であった。対照細胞における２時間誘導後のＣ8 :0及 びＣ10:0脂肪アシル基のレベルは、それぞれ3.9及び3.0 mol %であった。ｆａｄ Ｄ突然変異株では、一夜誘導後に脂肪酸を測定した。ＫＡ17で形質転換された細 胞においては、Ｃ8 :0及びＣ10:0レベルはそれぞれ51.5及び14.3 mol % であっ た。対照細胞では、Ｃ8 :0及びＣ10:0レベルはそれぞれ2.3及び2.5 mol % であ った。 ２．大腸菌中のCuphea hookeriana ＣＵＰＨ−１型チオエステラーゼの発現の ための構築物も調製した。構築物は、図５に示したCu phea成熟タンパク質配列の１ａｃＺ融合体をコードした。融合タンパク質は大腸 菌の野生型（Ｋ12）及びｆａｄＤ株の両方で発現された。Cuphea発現構築物で形 質転換すると、大腸菌の両株は多量の結晶を沈積した。さらに、形質転換株はと もに成長遅延を示したが、これはＫ−12細胞中ではわずかで、ｆａｄＤ突然変異 株中では重度であった。緩徐成長表現型は、大腸菌細胞に及ぼすＣ8 及びＣ10脂 肪酸の毒性作用によるものと考えられた。Ｋ12及びｆａｄＤ形質転換体の脂肪酸 分析（酸メタノリシス）は、特定脂肪酸の蓄積を示さなかった。これらの細胞中 に認められた結晶は、用いた酸メタノリシス法では検出されない変更形態の中鎖 脂肪酸を示すと考えられた。アシル−ＡＣＰ基質を加水分解する細胞抽出物の能 力の試験からは、形質転換ｆａｄＤ細胞中の中鎖脂肪アシル−ＡＣＰ Ｃ8 、Ｃ 10及びＣ12基質に対するアシル−ＡＣＰ活性の増大は示されなかった。これらの 分析の結果を表２に示す。 Ｃ18:1レベルに対する検定結果の標準化により、Ｃ8 :0、Ｃ10:0及びＣ12:0−Ａ ＣＰチオエステラーゼ活性の有意の増大が明示された。 さらにＣＵＰＨ−１チオエステラーゼを発現する迅速成長変異株の分析を実施 した。ＣＵＰＨ−１発現大腸菌細胞により生成された結晶の単離及び分析から、 これらの結晶が主にＣ16及びＣ14脂肪酸から成ることが示された。さらに、さら なる分析から、これらの細胞中のＣ16脂肪酸に対する加水分解活性の増大が明ら かになった。Ｃ16活性及び脂肪酸産生がＣＵＰＨ−１チオエステラーゼの直接的 結果であるか、又はこの作用が大腸菌細胞に由来するものであるか否かは明らか でない。 Ｃ．大腸菌中のミリストイルＡＣＰチオエステラーゼの発現 最初のＡＴＧコドンを欠くビブリオ菌 Vibrio harvei ミリストイルＡＣＰチ オエステラーゼコード配列（Miyamoto et al.，J．Biol．Chem．（1988）262:13 393-13399）をＰＣＲにより調製した。１ａｃＺ融合体として大腸菌中で遺伝子 を発現させ、大腸菌抽出物を検定して、ミリストイルＡＣＰチオエステラーゼ活 性を確証した。Ｃ14チオエステラーゼ構築物を用いて大腸菌 ｆａｄＤ株を形質 転換した。この方法で形質転換された細胞は多量の結晶を沈積したが、これは質 量分光測定によりミリスチン酸カリウムと同定された。大腸菌抽出物の脂肪酸分 析により、脂肪酸の50% 以上（mol を基礎にして）がＣ14:0であることが明示さ れたが、これに比して対照大腸菌ｆａｄＤ細胞は約11.5mol % のＣ14:0を含有し た。実施例４ ：植物形質転換のための構築物 ナピンｎａｐｉｎ発現カセットを用いる植物細胞中のCuphea hookeriana 及び ニレチオエステラーゼの発現のための構築物を以下のように調製した。 Ａ．ナピンｎａｐｉｎ発現カセット ナピンｎａｐｉｎ発現カセット ｐＣＧＮ1808は、同時係属中の米国特許出願 第07/742,834号に記載されている（この記載内容を、引用により本明細書中に取 り込むものとする）。ｐＣＧＮ1808を修飾して側面に位置する制限部位を含入さ せて、発現配列のみは動けるが二元ベクターに対する抗生物質耐性マーカーは動 けないようにした。ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する 合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＣＧＮ1808の独特のＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位に結紮して、一ＨｉｎｄＩＩＩ部位のみが回収されるようにした。その結 果生じたプラスミド ｐＣＧＮ3200は、配列分析により確証されたように、ナピ ンｎａｐｉｎ３’調節配列の３’末端に独特のＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ及びＫ ｐｎＩ制限部位を含有した。 ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩ消化ｐＩ Ｃ19Ｒに結紮することによりｐＣＧＮ3200から大多数のナピンｎａｐｉｎ発現カ セットをサブクローニングして（Marsh，et al．（1984）Gene 32:481-485）、 ｐＣＧＮ3212を作った。鋳型としてのｐＣＧＮ3200、ＳａｃＩ部位の側面に位置 する２つのプライマー、及びナピンｎａｐｉｎ５’プロモーターとｐＣＧＮ1808 からのｐＣＧＮ3200のｐＵＣ主鎖の結合体を用いたＰＣＲによりナピンｎａｐｉ ｎプロモーター領域の高度５’配列を再構築した。前進プライマーはＣｌａＩ、 ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ及びＫｐｎＩ制限部位、並びにナピンｎａｐｉｎ５’ 配列のヌクレオチド408 〜42３（ＥｃｏＲＶ部位から）を含有し、そして復帰プ ライマーはナピンｎａｐｉｎ配列に対する全部のヌクレオチド718 〜739 （これ は５’プロモーターの独特のＳａｃＩ部位を含む）を含有した。メーカーの仕様 書にしたがってPerkin Elmer/Cetus熱循環器中で用いて ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ断片を盲端断片としてＨｉｎｃＩＩＩで消化したｐＵ Ｃ８（Vieira and Messing（1982）Gene 19:259-268）中にサブクロ−ニングし て、ｐＣＧＮ3217を得た。ナピンｎａｐｉｎ挿入物の横へのｐＣＧＮ3217のシー ケンシングは、不適当なヌクレオチドがＰＣＲにより導入されなかったことを立 証した。ｐＣＧＮ3217中のナピンｎａｐｉｎ５−配列を、ＣｌａＩ及びＳａｃＩ で消化し、ＣｌａＩ及びＳａｃＩで消化したｐＣＧＮ3212に結紮することにより ナピンｎａｐｉｎ発現カセットの残り部分に結紮した。その結果生じた発現カセ ットｐＣＧＮ3221をＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ナピンｎａｐｉｎ発現配列をゲ ル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＩＣ20Ｈ（Marsh,上記）に結紮した。最 終発現カセットはｐＣＧＮ3223であり、これは、アンピシリン耐性バックグラウ ンド中に、ｐＣＧＮ1808に見出されたのと本質的に同じ1.725 ナピンnapin５’及び 1.265 ３’調節配列を含有した。調節領域をＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ及びＫ ｐｎＩ制限部位を側面に位置させて、独特のＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ及 びＸｈｏＩクローニング部位を５’及び３’ノンコード領域間に置いた。 Ｂ．Cupheaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現構築物 Cuphea hookeriana復帰転写ｃＤＮＡのＰＣＲ分析は、ＴＡＡ 342 ＣＵＰＨ −１クローンの５’領域が図５に示した配列のヌクレオチド144 後のグアニンヌ クレオチド（Ｇ）を欠くことを示した（ＣＭＴ９ ＣＵＰＨ−１クローンのＤＮ Ａ配列分析は、その領域内のＧヌクレオチドの存在を確証した）。したがって、 特定ＰＣＲ突然変異誘発によりＴＡＡ 342のヌクレオチド144 後にＧヌクレオ チドを挿入して、図５に示した配列の143 〜145 にＡＴＧで始まるコード領域を 生じた。ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位（これもＰＣＲ反応に挿入）を用いて便宜上 のベクター中にクローニングして、ＫＡ ２を生じた。その結果生じた、図５に示した配列のヌクレオチド137 〜1464を包 含するＳａｌＩ断片（十上記の挿入Ｇヌクレオチド）をナピンｎａｐｉｎ発現カ セットｐＣＧＮ3223中にクローニングした。次にナピンｎａｐｉｎ/ Cuphea チ オエステラーゼ／ナピンｎａｐｉｎ構築物をＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出し て、二元ベクターｐＣＧＮ1557（McBride and Summerfelt（1990）Plant Mol．B iol．14:269-276 ）中にクローニングした。その結果生じた構築物ｐＣＧＮ4800 をアグロバクテリア Agrobacterium tumefaciens中に形質転換し、これを用いて 形質転換植物を調製した。 同様に、Cuphea ＣＵＰＨ−２クローン ＣＭＴ７をナピンｎａｐｉｎ発現カ セット中に挿入して、その結果生じたナピンｎａｐｉｎ５’/ ＣＵＰＨ−２/ ナ ピンｎａｐｉｎ３’構築物を植物形質転換のために二元ベクターに移した。 Ｃ．ニレアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現構築物 ナピンｎａｐｉｎ発現カセットを用いた植物種子細胞中のニレＣ10及びＣ８ア シル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現のための構築物を、以下のように調製した 。上記のように、ニレＵＬＭ−１中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡ は全チオエステラーゼトランジットペプチドをコードするとは考えられない。し たがって、ニレチオエステラーゼコード領域を以下のようにCuphea ＣＵＰＨ− １クローンからのトランジットペプチドコード領域と融合させた。ｐＣＧＮ4800 （ナピンｎａｐｉｎカセット中のＣＵＰＨ−１）をＸｂａＩで消化し、盲端化し て、ＳｔｕＩで消化し、ＣＵＰＨ−１構築物の成熟タンパク質コード部分を除去 した。ＳｔｕＩ部位は、図５に示したＣＵＰＨ−１配列のヌクレオチド496 〜50 1 に位置した。ＸｂａＩ部位は、Cuphea チオエステラーゼｃＤＮＡ配列とナピ ンｎａｐｉｎ３’調節領域との間に位置した。ＵＬＭ−１成熟タン パク質コード領域を、以下のようにCuphea 成熟タンパク質コード領域の除去に より生じたナピンｎａｐｉｎ/ Cuphea トランジットペプチド主鎖中に挿入した 。ＵＬＭ−１クローンをＸｂａＩで消化し、盲端化して、ＳｔｕＩで消化し、ニ レチオエステラーゼ成熟タンパク質コード領域を得た。ＳｔｕＩ部位は、図２に 示した配列のヌクレオチド250 〜255 に位置し、ＸｂａＩ部位は、停止コドンま で３’のヌクレオチド1251〜1256に位置した。ニレＳｔｕＩ/ ＸｂａＩ断片をナ ピンｎａｐｉｎ/ Cuphea トランジットペプチド主鎖中に結紮すると、ナピンｎ ａｐｉｎ５’/ Cuphea トランジット：ニレ成熟/ ナピンｎａｐｉｎ３’発現構 築物を有するｐＣＧＮ4802を生じた。ｐＣＧＮ4802をＨｉｎｄＩＩＩ断片として ｐＣＧＮ1557に移すと、植物形質転換のための二元構築物であるｐＣＧＮ4803を 生じた。実施例５ ：植物形質転換 問題のＤＮＡ配列を植物宿主のゲノム中に挿入してはれの転写又は転写及び翻 訳を生じさせて表現型変化をもたらすための種々の方法が開発された。 Ａ．アブラナ属形質転換 アブラナ属Brassica napus cv．Westarの種子を95% エタノールに２時間浸漬 して、Tween 20を１滴含有する次亜塩素酸ナトリウムの1.0 % 溶液中で45分間表 面滅菌して、滅菌蒸留水で３回すすいだ。次に種子を、ピリオドキシン（50μg /l）、ニコチン酸（50μg/l）、グリシン（200 μg /l）及び0.6 % フィタガルP hytagar （Gibco），pH 5.8を補充した1/10濃度のMurashige 最少有機質培地（ Gibco; Grand Island，NY）中に入れた。種子をPercivalチェンバー中で22℃で 発芽させて、冷蛍光及び赤色光で約65μアインシュタイン/ m2/ 秒（μEm-2S-2 ）の強度で16時間光を当てた。 胚軸を５〜７日齢苗から切り出して、約４mmの長さの小片にして、栽培板の上 に置いた（Horsch et al.，Science（1985）227:1229-1231）。約30mlのＭＳ塩 ベース（Carolina Biological，Burlington，NC）、100 mg/lのイノシトール、1 .3 mg/lのチアミン−ＨＣ１、200 mgのＫＨ２ＰＯ４＋３％ショ糖、２，４−Ｄ （1.0 mg/l）、0.6 % w/v フィタガル Phytagarを含有し、オートクレーブ前 にpHを5.8に調整したタバコ懸濁培養をペトリ皿（100x25mm）上に入れて、使用 する１日前に栽培板を調製した。滅菌濾紙円板（Whatman 3mm）を使用前に栽培 層の上に置いた。２，４−Ｄ（0.2 mg/l）、キネチン（０．１mg/l）を含む培養 板に関して記載したように、100 mlの新鮮なＭＳ培地中に10mlの培養を入れて、 タバコ懸濁培地を毎週サブクローニングした。栽培細胞を用いない実験では、胚 軸移植片を切断してＭＳ ０／１／０培地の上面の濾紙円板上に置いた。全胚軸 移植片を栽培板上で24時間、22℃で、30μEm-2S-2 〜65μEm-2S-2の強さで連続 照明下で予備インキュベートした。二元プラスミドを含有するA．tumefaciens ＥＨＡ 101の単一コロニーを５ml ＭＧ/ Ｌブロスに移して、30℃で一夜増殖 させた。胚軸移植片を、1x108個の細菌/ mlに希釈した細菌を含む７〜12mlのＭ Ｇ/ Ｌブロス中に浸漬して、10〜25分後に栽培板上に置いた。１リットル当たり 、ＭＧ/ Ｌブロスはマンニトール ５g、Ｌ−グルタミン酸 １g又はグルタミン 酸ナトリウム 1.15g、ＫＨ２ＰＯ４ 0.25g、ＮａＣｌ 0.10g、ＭgＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ 0.10g、ビオチン １mg、トリプトン ５g及び酵母菌抽出物 2.5 gを 含有し、ブロスをpH 7.0に調整した。アグロバクテリア Agrobacteriumと同時 インキュベーシヨン後48時間目に、胚軸移植片を、フィルター滅菌カルベニシリ ン（500mg/l，オートクレーブ処理後に付加）及び硫酸カナマイシン（Boehringe r Mannheim; Indianapolis，IN ）を25mg/lの濃度で含有するＢ５ ０／１／０ カルス誘導培地に移した。 65μEM-2S-2連続照明で培養中で３〜７日後、カルス組織が切断面上に目に見 えるようになり、胚軸移植片を発芽誘導培地 Ｂ５ＢＺ（Ｂ５塩及びビタミンに 、３mg/lのベンジルアミノプリン１mg/lのゼアチン、１% ショ糖、0.6 % フィタ ガル Phytagar を加えて、pHを5.8 に調整）に移した。この培地はさらに、カル ベニシリン（500 mg/l）及び硫酸カナマイシン（25mg/l）を含有する。胚軸移植 片を新鮮な発芽誘導培地上で２週間に１回サブクローニングした。 １〜３か月後に胚軸カルスから新芽が再び生じた。少なくとも１cmの長さの緑 色の新芽をカルスから切り取って、Ｂ５塩及びビタミン、１% シヨ糖、カルベニ シリン（300 mg/l）、硫酸カナマイシン（50mg/l）及び0.6 % w/v フィタガル P hytagar を含有する培地上に置いた。２〜４週間後、依然として緑色の新芽を根 本で切り取って、根付誘導培地（Ｂ５塩及びビタミン＋１% ショ糖、２mg/lのイ ンドール酪酸、50mg/lの硫酸カナマイシン及び0.6 % フィタガル Phytagar ）を 含有するMagenta 箱に移した。緑色の根付いた新芽をチオエステラーゼ活性に関 して調べた。 Ｂ．Arabidposis形質転換 Valverkens等（Proc．Nat．Acad．Sci．（1988）85:5536-5540）が記載してい るように、アグロバクテリア Agrobacterium介在形質転換により、トランスジェ ニック Arabidopsis thaliana植物を得た。構築物を、Holsters等（Mol．Gen．G enet．（1978）163:181-187）の方法により、アグロバクテリア Agrobacterium 細胞の例えばＥＨＡ101 株（Hood et al.，J．Bacteriol （1986）168:1291-130 1）中に形質転換した。 Ｃ．ラッカセイ形質転換 少なくとも１つのプロモーター領域、問題の遺伝子及び終結領域を包含する発 現カセットとして問題のＤＮＡ配列を、欧州特許出願第332,855号及び同時係属 中の米国特許出願第07/225,332号（1988年７月27日提出）に記載されているよう に、粒子ボンバードにより植物ゲノム中に導入し得る。 手短に言えば、0.5μM〜３μMの範囲のサイズのタングステン又は金の粒子を 発現カセットのＤＮＡで被覆した。このＤＮＡは水性混合物又は乾燥ＤＮＡ/ 粒 状沈殿物の形態である。 ボンバードの標的として用いる組織は、子葉移植片、新芽分裂組織、未成熟小 葉又は朽からである。 ＤＮＡ被覆粒子による組織のボンバードは、バイオリスチックスBiolisticsTM 粒子ガン（Dupont; Wilmington，DE）を用いて実施した。粒子を、バレルロか ら１〜14cmの範囲の種々の距離でバレルに入れた。ボンバードされる組織を停止 板の下に置き、20cmまでの距離で組織上で試験を実施した。排出の瞬間、組織は 10μM 〜300μMのメッシュを有するナイロン製ネット又はナイロンネットの組合 せにより保護された。 ボンバード後、Atreya等（Plant Science Letters （1984）34: 379-383）の 方法にしたがって植物を再生させ得る。要するに、胚軸組織又は子葉セグメント をＭＳ培地（Murashige and Skoog，Physio．Plant．（1962）15:473）上に置き （子葉セグメント用には、ＭＳ＋2.0 mg/lの６−ベンジルアデニン（ＢＡ））、 25±２℃で暗所で１週間インキュベートして、続いて冷白色蛍光灯（6.8 W/m2） の連続照明下に移した。培養10日目に、苗を滅菌土壌を入れた鉢に移して、３〜 ５日間日陰に置き、最後に温室に移した。 推定されるトランスジェニック新芽を根付かせた。外生的ＤＮＡ の植物ゲノム中への組込みは、当業者に公知の種々の方法により確証し得る。実施例６ ：アンチセンス植物チオエステラーゼによる形質転換 植物細胞中のアンチセンス アブラナ属チオエステラーゼの発現のための構築 物を以下のように調製した。ｐＣＧＮ3266挿入物のＰＣＲ増幅により、全長アブ ラナ属長鎖チオエステラーゼの約1.1 kb断片を得た。前進プライマーはアンチセ ンス鎖に結合し、センスチオエステラーゼ配列の合成の準備をする。このプライ マーは図６Ａに示したｐＣＧＮ3266配列のヌクレオチド27〜42を含有し、５’末 端にＸｈｏＩ制限部位を有する。復帰プライマーはセンス鎖と結合して、アンチ センスチオエステラーゼＤＮＡの合成を準備する。それは、図６Ａに示したｐＣ ＧＮ3266のヌクレオチド1174〜1191と相補的な復帰体を含有し、５’末端にＳａ ｌＩ制限部位を有する。 メーカーの仕様書に従ってＤＮＡ熱循環器（Perkin Elmer/Cetus）中でＴａｑ ポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を実行した。周期パラメーターを変えて最大 収量のチオエステラーゼＰＣＲ生成物を提供し得た。制限マッピング及びアガロ ースゲル電気泳動により、1.1 kb ＰＣＲ生成物が立証された。ＰＣＲ生成物を ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ制限酵素で消化し、ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ制限酵素で消化 済のナピンｎａｐｉｎ発現カセットｐＣＧＮ3233中にクローニングした。 これらの操作で生成したナピンｎａｐｉｎ/ アンチセンスチオエステラーゼ/ ナピンｎａｐｉｎプラスミドを消化して、ナピンｎａｐｉｎ/ アンチセンスチ オエステラーゼ/ ナピンｎａｐｉｎ断片を得て、これを植物形質転換のために 二元ベクター中に挿入した。カナマイシン耐性マーカーを有するトランスジェニ ックラウレート産生植物の再形質転換のために、以下のように断片をハイグロマ イシ ン二元ベクター中に挿入した。〜1.7 kbのナピンｎａｐｉｎ５’ノンコード配列 、〜1.1 kbのＳａｌＩ/ ＸｈｏＩアンチセンスチオエステラーゼｃＤＮＡ断片、 及び〜1.5 kbの３’ナピンｎａｐｉｎノンコード領域を含有する断片を処理して 、末端にＫｐｎＩ認識配列を含有させた。次に断片をＫｐｎＩで消化して、植物 形質転換のためにＫｐｎＩ消化ｐＣＧＮ2769（上記のハイグロマイシン二元ベク ター）に結紮した。 非トランスジェニック アブラナ属の形質転換のために、ＫｐｎＩで消化し、 ＢａｍＨＩで部分消化して、ナピンｎａｐｉｎ/ アンチセンスＢＴＥ/ ナピンｎ ａｐｉｎ断片を得て、〜1.7 kbのナピンｎａｐｉｎ５’ノンコード配列、〜1.1 kbのＳａｌＩ/ ＸｈｏＩアンチセンスチオエステラーゼｃＤＮＡ断片及び〜0.33 kbの３’ナピンｎａｐｉｎノンコード領域を含有する〜3.3 kb断片を生成した。 残りのナピンｎａｐｉｎ３’はこの領域ではＢａｍＨＩにより欠失されていた。 〜3.3kb ＫｐｎＩ/ ＢａｍＨＩ断片をＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ1578 に結紮して植物形質転換ベクターを提供した。 上記のアブラナ属アンチセンスチオエステラーゼ構築物の他に、アブラナ属チ オエステラーゼコード配列の種々の部分を含有する他の構築物も望ましい。ゲッ ケイジュ及びアブラナ属チオエステラーゼ配列間に相同の領域が認められるので 、アンチセンス アブラナ属配列によるゲッケイジュチオエステラーゼ発現の低 減の可能性は、ゲッケイジュ遺伝子と実質的に相同でないアブラナ属遺伝子の断 片を用いて避けることができる。例えば、アブラナ属クローンの５’及び３’末 端の配列はゲッケイジュ配列と有意に相同でなく、したがってアンチセンスアブ ラナ属チオエステラーゼのために望ましい。実施例７ ：植物中での非植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現 ナピンｎａｐｉｎプロモーター領域を利用する植物細胞中のビブリオ菌 Vibr io harvei ミリストイルＡＣＰチオエステラーゼの発現のための構築物を以下 のように調製した。２つの100 塩基オリゴ体を合成した： ２つのオリゴ体はアニーリングのための相補的配列の領域（アンダーライン領 域）を含有する。２つのオリゴ体を用いたＴＡＱポリメラーゼ延長反応により18 0 bP生成物を生じた。オリゴ体は本質的に、３つの考え得るポリ（Ａ）付加部位 を除去するために、そして細菌から植物にコドン選択を変えるために５つの塩基 を変更するために導入された配列変化を伴うｌｕｘＤ配列で構成される。変化は すべて保存的である。即ちアミノ酸配列を変えない。 180 bp ＴＡＱポリメラーゼ延長生成物を盲端化し、Bluescript中にクローニ ングした。次にＸｂａＩ及びＥａｅＩで消化することにより約180 bpのｌｕｘＤ 断片をBluescriptから取り出し、ＸｂａＩ/ ＸｈｏＩ消化Bluescript ＳＫ中へ の３方向結紮により残りのｌｕｘＤ遺伝子を含有するビブリオ菌ｃＤＮＡクロー ンからのＥａｅＩ/ ＸｂａＩ断片を有する枠内にクローニングした。ＸｂａＩで 消化し、ＰｓｔＩで部分消化してｌｕｘＤ遺伝子を取り出し、ナピンｎａｐｉｎ 発現カセット中のベニバナチオエステラーゼトランジットペプチドコード領域を 有する枠内にクローニングした。ナピンｎａｐｉｎ５’/ ベニバナトランジット ：ミリストイルＡＣＰチオエステラーゼ/ ナピンｎａｐｉｎ３’断片をＫｐｎＩ / ＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ1557 （McBride and Summerfelt，上記）中にクロー ニングして、ｐＣＧＮ3845、即ち植物形質転換のための二元発現ベクターを得た 。 その結果生じたトランスジェニック植物を種子に成長させて、細菌アシルトラ ンスフェラーゼ遺伝子の挿入の結果として生じたＣ14脂肪酸のパーセンテージを 確定するために分析した。24の隔離トランスジェニック（Ｔ１）アブラナ属植物 Brassica napusからのプールされた種子サンプルの分析の結果、Ｃ14脂肪酸レ ベルは0.12〜1.13 mol % の範囲であることが示された。２つの植物、3845-1及 び3845-18は、それらの種子油中に1mol % より多いＣ14:0脂肪酸を含有した。非 トランスジェニック B．napus種子の同様の分析は、約0.1 mol % のＣ14:0レベ ルを明示した。3845-18からの単一種子の分析からは、個々の種子がその油中に2 mol % より多いＣ14:0を有することが明らかになった。ウエスターン分析を実施 して、トランスジェニック植物中に存在するＣ14:0チオエステラーゼの量を確定 した。生成したタンパク質量とＣ14:0（ミリステート）のmol% を比較すると、 チオエステラーゼタンパク質量の増加に伴ってミリステートレベルが増大するこ とが示された。 本明細書中に記載した出版物及び特許出願はすべて、本発明が関係する当業者 の技術レベルを示している。出版物及び特許出願はすべて、個々の出版物又は特 許出願が特別に及び個別に引用により取り込まることを示されたのと同程度に、 引用により本明細書中に取 り込むものとする。 明確に理解するために説明及び実施例によりやや詳細に本発明を記述してきた が、添付の請求の範囲の範囲内である種の変更及び修正をなし得ることは明らか である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｚ 8827−4Ｂ // Ｃ１２Ｐ 7/64 7432−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．転写の５’〜３’方向に、植物細胞において機能的な転写開始領域、植物 長鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡ 構造遺伝子配列を包含するＤＮＡ構築物であって、上記ＤＮＡ構造遺伝子配列が アンチセンスアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列の転写のために配向される構 築物。 ２．上記植物長鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼがアブラナ属（Brassi ca ）Ｃ18:1選択チオエステラーゼである請求項１記載のＤＮＡ構築物。 ３．上記転写開始領域が植物胚細胞中で優先的に発現される遺伝子からである 請求項１記載のＤＮＡ構築物。 ４．請求項１記載のＤＮＡ構築物を包含する植物細胞。 ５．請求項２記載のＤＮＡ構築物を包含するアブラナ属植物細胞。 ６．上記細胞が種子胚細胞である請求項５記載のアブラナ属植物細胞。 ７．上記植物細胞中での中鎖選択アシルＡＣＰチオエステラーゼの発現を提供 する組換え体ＤＮＡ構築物をさらに包含する請求項４記載の植物細胞。 ８．転写の５’〜３’方向に、植物細胞中で機能的なプロモーター、中鎖選択 アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする構造遺伝子配列、及び植物細胞で 機能的な転写終結領域を包含するＤＮＡ構築物であって、上記チオエステラーゼ コード配列が非植物供給源からである構築物。 ９．上記非植物供給源が原核生物である請求項８記載のＤＮＡ構築物。 １０．上記中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼがＣ14:0選択アシル−Ａ ＣＰチオエステラーゼである請求項８記載のＤＮＡ構築物。 １１．上記非植物供給源がビブリオ菌（Vibrio harvei）である請求項１０記 載のＤＮＡ構築物。 １２．植物中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼコード配列を包含する組 換え体ＤＮＡ構築物であって、上記チオエステラーゼがＣ8又はＣ10脂肪酸に対 する加水分解活性を有する構築物。 １３．前駆体植物中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする請求 項１２記載の構築物。 １４．上記植物がニレである請求項１２記載の構築物。 １５．上記植物が（Cuphea hookeriana）である請求項１２記載の構築物。 １６．宿主細胞中で植物中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを産生し得 る発現カセットを包含する組換え体ＤＮＡ構築物であって、上記構築物が転写の ５’〜３’方向に、上記宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、上記宿主細胞 中で機能的な翻訳開始調節領域、Ｃ8又はＣ10脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する 活性を有する生物学的に活性な植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列、 並びに上記宿主細胞中で機能的な転写及び翻訳終結調節領域を包含し、上記植物 チオエステラーゼコード配列が上記調節領域の制御下にある構築物。 １７．上記宿主細胞が植物細胞である請求項１６記載の構築物。 １８．上記転写開始領域が植物種子組織中で優先的に発現される遺伝子から得 られる請求項１７記載の構築物。 １９．上記配列が（Cuphea hookeriana）又はニレから得られる請求項１６記 載の構築物。 ２０．上記配列が（Cuphea hookeriana）ＣＵＰＨ−２チオエステラーゼ遺伝 子からである請求項１６記載の構築物。 ２１．請求項１６〜２０のいずれかの植物チオエステラーゼコード配列構築物 を包含する宿主細胞。 ２２．上記細胞が植物細胞である請求項２１記載の細胞。 ２３．上記植物細胞がアブラナ属植物細胞である請求項２２記載の細胞。 ２４．Ｃ8又はＣ10脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する発現植物チ オエステラーゼを包含するトランスジェニック宿主細胞。 ２５．上記宿主細胞が植物細胞である請求項２４記載の細胞。 ２６．植物宿主細胞中での中鎖脂肪酸の産生方法であって、上記方法がＤＮＡ 構築物をそのゲノム中に組込んだ植物細胞を成長させることを包含し、上記構築 物が転写の５’〜３’方向に上記植物細胞中で機能的な転写調節領域及び植物チ オエステラーゼコード配列を上記植物チオエステラーゼの発現を可能にする条件 下で包含し、上記植物チオエステラーゼがＣ8又はＣ10脂肪アシル−ＡＣＰ基質 に対する活性を有する方法。 ２７．上記植物細胞が脂肪種子胚植物細胞である請求項２６記載の方法。 ２８．上記植物チオエステラーゼコード配列が（Cuphea hookeriana）又はニ レから得られる請求項２６記載の方法。 ２９．上記植物チオエステラーゼコード配列が（Cuphea hookeriana）ＣＵＰ Ｈ−２チオエステラーゼ遺伝子からである請求項２６記載の方法。 ３０．請求項２６〜２９のいずれかの方法により産生される修正遊離脂肪酸組 成を有する植物細胞。 ３１．請求項８〜１１のいずれかの非植物中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステ ラーゼ構築物を包含する植物宿主細胞。 ３２．上記植物細胞がアブラナ属の植物細胞である請求項３１記載の細胞。 ３３．植物宿主細胞中での中鎖脂肪酸の産生方法であって、上記方法がＤＮＡ 構築物をそのゲノム中に組込んだ植物細胞を成長させることを包含し、上記構築 物が転写の５’〜３’方向に上記植物細胞中で機能的な転写調節領域及び非植物 供給源からの中鎖選択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼコード配列を上記中鎖選 択アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を可能にする条件下で包含する方法。 ３４．上記チオエステラーゼがビブリオ菌（Vibrio harvei）からであり、上 記中鎖脂肪酸がＣ14の炭素鎖長を有する請求項３３記載の方法。 ３５．上記植物細胞が脂肪種子胚植物細胞である請求項３４記載の方法。 ３６．請求項３３又は３４の方法に従って産生された修飾遊離脂肪酸組成を有 する植物細胞。