KR101993161B1 - 애기장대 유래의 mcamt 유전자를 이용한 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 MCAMT 유전자를 이용한 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 애기장대 유래의 MCAMT 유전자의 발현이 저해 또는 과발현되도록 제작된 재조합 벡터를 이용하여 형질전환 식물체를 제조하여, MCAMT 유전자가 저해된 형질전환 식물체에서 잎의 길이 및 종자 배아 발달이 현저하게 저해되고, MCAMT 유전자가 과발현된 형질전환 식물체에서 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량이 현저하게 증가된 것을 확인하였다. 따라서 본 발명을 통해, 식물의 성장 및 발달을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 저비용 및 저노력으로 식물성 유지 생산 및 작물의 종자 오일 함량 증진에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

애기장대 유래의 MCAMT 유전자를 이용한 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 용도{Transgenic plant with regulated growth, development and seed storage oil content using MCAMT gene from Arabidopsis thaliana and uses thereof}

본 발명은 애기장대 유래의 MCAMT 유전자를 이용한 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 용도에 관한 것이다.

지방산이 글리세롤에 에스테르화되어있는 식물 지방은 모든 유기체에 존재하는 필수 거대 분자로써 세포와 세포 내 소기관을 구획화하는 주요 장벽인 막을 형성한다. 또한, 식물 지방은 탄소 및 에너지 저장 물질인 TAG(triacylglycerol) 형태로 저장되고, 이는 탄수화물이나 단백질과 같은 저장 물질보다 저장 에너지가 약 두배 높은 것으로 알려져 있으며, 화장품 및 윤활유와 같은 산업적 응용이 가능한 공급 원료로 사용되기도 한다. 특히 최근에 저장 TAG는 재생 가능한 에너지원으로써 기존 디젤의 대체품으로 사용되고 있다. 이에 식물에서 지방산 생합성에 대한 이해의 폭을 넓히고, 특히 종자 오일의 함량을 증진시키려는 노력들이 이루어지고 있다.

식물의 드 노보(de novo) 지방산 생합성은 색소체에서 일어난다. 먼저, ACC(acetyl-CoA carboxylase)에 의해 지방산 생합성의 전구체인 아세틸-CoA에 카르복실기(carboxyl group)가 전이되어 말로닐-CoA가 생성된다. 말로닐-CoA와 홀로-ACP가 MCAMT(Malonyl CoA-ACP malonyltransferase)에 의해 말로닐-ACP와 CoA로 전환된다. 이렇게 형성된 말로닐-ACP는 아실 사슬 신장 사이클(acyl chain elongation cycle) 동안 2개의 탄소 공여체(donor)로 사용되어 FAS(fatty acid synthase)에 의해 탄소 수 16개 혹은 18개를 갖는 아실-ACP가 생성된다. 생성된 아실-ACP는 원핵생물 경로(prokaryotic pathway)에 의해 글리세롤지질(glycerolipid)을 생성하거나, 티오에스터라아제(thioesterase)에 의해 가수분해되어 지방산과 ACP로 분해된 다음, 생성된 C16과 C18 지방산은 아실-CoA 형태로 세포질로 나와 소포체에서 진핵생물 경로(eukaryotic pathway)를 통해 글리세롤지질을 생산한다.

또한, 미토콘드리아에서도 미토콘드리아를 이루는 막과 특정 효소의 보조인자로 사용될 지방산을 합성한다. 디카르복실산 운반체(Dicarboxylic acid transporter)를 통해 미토콘드리아로 들어온 말론산(malonate)은 ACP와 함께 MAS(malonyl-ACP synthetase)에 의해 말로닐-ACP가 생성되거나, MCS(malonyl-CoA synthetase)에 의해 말로닐-CoA로 전환되고, MCAMT에 의해 말로닐-ACP가 생성된다. 이렇게 생성된 말로닐-ACP는 미토콘드리아 FAS(mtFAS; mitochondrial fatty acid synthesis)를 통해 옥탄오일-ACP(octanoyl-ACP)를 생성하며, 생성된 옥탄오일-ACP는 글리신 디카르복실라아제(glycine decarboxylase)와 피루브산탈수소효소(pyruvate dehydrogenase), α-케토글루타르산탈수소효소(α-ketoglutarate dehydrogenase)의 보조인자인 리포산(lipoic acid)을 생성하는 전구체로 사용된다. 또한, mtFAS에 의해 신장된 3-히드록시-14:0-ACP는 지질다당류(lipopolysaccharide) 형성에 사용되거나 C16 혹은 C18 지방산으로 신장(elongation)되어 미토콘드리아 막에 존재하는 인지질(phospholipids)과 카르디올리핀(cardiolipin)을 생성하는 전구체로 사용되는 것으로 알려져 있다.

현재까지 보고에 의하면, 보리(Hordeum vulgare L.), 시금치(Spinacia oleracea) 및 대두(Glycine max)의 MCAMT의 효소 활성이 엽록체에 존재한다고 알려져 있다. 또한 완두(Pisum sativum) 잎으로부터 미토콘드리아를 분리하였을 때, 말론산(malonate)을 말로닐-ACP로 전환하는 MAS와 말로닐-CoA를 말로닐-ACP로 전환하는 MCAMT의 활성이 동시에 측정됨으로써 미토콘드리아에서 MCAMT 활성이 존재함을 관찰된 바 있다. 이와 같이, 식물에는 두 개의 MCAMT 동질효소(isozyme)가 존재하는 것으로 알려져 있지만, ARALIP(plant acyl lipid metabolism website, http://aramaic. plantbiology.msu.edu/ enzymes)에 의하면 애기장대는 1개의 MCAMT 유전자를 가지고 있음을 확인할 수 있다. 아직까지 1개의 MCAMT 유전자가 2개의 MCAMT 동질효소를 생성하는 것인지 혹은 1개의 다른 동형(isoform)이 존재하는지는 밝혀진 바 없다.

식물성 오일은 다양한 산업 원료로 사용될 수 있지만 그 수요에 비해 전 세계적으로 생산되는 함량은 매우 부족한 실정이다. 이에 식물 종자 오일 함량을 증진시키기 위해 지방산 생합성 증진, TAG 생합성 증진 및 TAG 분해 억제와 같은 여러 방법들이 시도되고 있다. 그 중, 지방산 생합성을 증진시키기 위한 대표적인 사례로 지방산 생합성 초기에 관여하는 애기장대 SSU / ACC1 유전자를 과발현시킨 유채(Brassica napus) 종자에서 총 종자 오일 함량이 야생형 종자에 비해 5% 증가됨을 관찰하였다. 그리고 TAG 생합성 증진에 관여하는 카멜리나(Camilina sativa) DGAT1을 카멜리나에 과발현시켰을 때, 총 종자 오일 함량이 5~24% 증가한 보고가 있었다. TAG 분해 억제 사례로 퍼옥시좀 ABC 운반체(peroxisomal ABC transporter) 돌연변이체인 COMATOSE(cts2)에 애기장대 LEC2 유전자를 발현시킨 형질전환체의 TAG 함량은 비형질전환체에 비해 약 4배 증가됨을 관찰하였다. 이와 같이 다양한 방법으로 종자 오일 함량을 증가시키려는 시도들이 진행되고 있으며, 그 중 새로운 유전자를 발굴하는 것이 가장 중요한 과정으로 여겨지고 있다.

한편, 한국등록특허 제1743117호는 카멜리나 식물의 종자 무게, 크기 및 저장 오일 함량을 증가시키는 애기장대 유래 AtWRI1 유전자 및 이의 용도를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제0914454호는 들깨 유래 마이크로좀 리놀레산 불포화효소 유전자로 형질전환된 형질전환 식물체, 및 이 유전자를 이용하여 형질전환 식물체의 종자 오일에서 지방산 조성을 조절하는 방법을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 애기장대 유래의 MCAMT 유전자를 이용한 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 애기장대 유래의 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 유전자가 애기장대 식물체의 전 조직에서 발현되고, 특히 개화한 지 10일 된 발달 종자에서 가장 많이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 MCAMT 유전자의 발현이 저해 또는 과발현되도록 제작된 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질전환 식물체의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량을 측정한 결과, MCAMT 유전자가 저해된 형질전환 식물체에서 잎의 길이 및 종자 배아 발달이 현저하게 저해되고, MCAMT 유전자가 과발현된 형질전환 식물체에서 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량이 현저하게 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 방법에 의해 제조된 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 애기장대 유래의 MCAMT 유전자의 발현이 저해 또는 과발현되도록 제작된 재조합 벡터를 이용하여 형질전환 식물체를 제조하여, MCAMT 유전자가 저해된 형질전환 식물체에서 잎의 길이 및 종자 배아 발달이 현저하게 저해되고, MCAMT 유전자가 과발현된 형질전환 식물체에서 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량이 현저하게 증가된 것을 확인하였다. 따라서 본 발명을 통해, 식물의 성장 및 발달을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 저비용 및 저노력으로 식물성 유지 생산 및 작물의 종자 오일 함량 증진에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 애기장대 식물체의 다양한 조직에서 MCAMT 유전자의 발현 양상을 확인한 결과이다. R은 뿌리(root); YS는 유묘(young seedling); RL은 로제트 잎(rosette leave); CL은 줄기 잎(cauline leaves); S은 줄기(stem); B는 꽃봉오리(bud); F는 개화한 꽃(open flower); 및 DS는 발달 종자(developing seed)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 MCAMT 프로모터 조절하에 GUS(β-glucuronidase) 리포터 유전자를 융합시킨 구축물로 형질전환된 애기장대 식물체의 조직별로 GUS 유전자의 발현 양상을 확인한 결과이다. A는 MCAMT 프로모터 조절하에 GUS 유전자가 발현되도록 제작한 벡터 구조이며, B는 MCAMT 프로모터 조절하에 GUS 유전자를 융합시킨 구축물로 형질전환된 식물체에서 GUS 유전자의 발현 양상을 확인한 PCR 결과이며, C는 MCAMT 프로모터 조절하에 GUS 유전자가 발현되도록 제작한 벡터로 형질전환된 식물체를 조직별로 염색하여 GUS 유전자의 발현 양상을 나타낸 사진이다. C에서 i는 10일 된 유묘; ii는 배수조직(hydathode); ⅲ는 경정분열조직(shoot apical meristem); ⅳ는 유묘의 근단(root tip); 및 v는 개화한 지 7일 된 발달종자를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 MCAMT 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위해, 전장 MCAMT 단백질의 C-말단에 eYFP를 융합시킨 fMCAMT:eYFP 구축물(A)로 형질전환된 담배 식물체를 대상으로 MCAMT 단백질의 형광 신호를 통해 세포 내 위치를 확인한 결과(B)이다. dMCAMT:eYFP 구축물은 MCAMT 단백질이 미토콘드리아로 타겟될 수 있는 미토콘드리아 시그널 펩티드를 제거한 것이며, 바는 10μm이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 T-DNA가 삽입된 MCAMT/mcamt 돌연변이체의 분리 및 종자 배아 발생 과정을 나타낸 결과이다. A는 T-DNA가 삽입된 MCAMT 유전자의 구조이며, B는 비형질전환체(WT)와 MCAMT/mcamt-1 및 MCAMT/mcamt-2 돌연변이체를 대상으로 T-DNA가 삽입된 MCAMT 유전자의 발현 유무를 확인한 PCR 결과이며, C는 비형질전환체(WT)와 MCAMT/mcamt-1 및 MCAMT/mcamt-2 돌연변이체의 장각 내 발달 종자 상태를 나타낸 사진이며, D는 비형질전환체(WT)와 MCAMT/mcamt-1 돌연변이체의 발달 종자의 배아 발생 과정을 나타낸 사진이다. WT는 비형질전환체이며, 바는 100μm이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 MCAMT가 안티센스 방향으로 들어간 형질전환체를 제조하여 이의 표현형 및 MCAMT의 발현 양상을 확인한 결과이다. A는 MCAMT 프로모터 조절하에 MCAMT CDS가 안티센스 방향으로 삽입된 구축물의 구조 모식도이며, B는 MCAMT가 안티센스 방향으로 들어간 형질전환체(aT23 및 aT35)를 대상으로 수행한 PCR 결과이며, C는 MCAMT 안티센스 형질전환체의 표현형을 나타낸 사진이며, D는 MCAMT 안티센스 형질전환체에서 MCAMT의 발현 정도를 측정한 그래프이며, E는 MCAMT 안티센스 형질전환체에서 로제트 잎의 길이를 측정한 그래프이다. NT는 비형질전환체이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 MCAMT 안티센스 형질전환체(aT23 및 aT35) 잎의 향축면(adaxial surface)에 대해 현미경을 이용하여 촬영한 사진(A)과 형질전환체 잎의 세포 크기(B) 및 세포 수(C)를 측정하여 나타낸 결과이다. NT는 비형질전환체이며, 바는 50μm이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 SEN1 프로모터 조절하에 MCAMT 유전자가 과발현되는 구축물로 형질전환된 MCAMT 과발현 형질전환체의 분리와 이의 성장 및 발달 변화를 확인한 결과이다. A는 MCAMT 과발현 애기장대 형질전환체의 조직별로 SEN1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이며, B는 SEN1 프로모터 조절하에 MCAMT 유전자가 과발현되는 구축물의 구조 모식도이며, C는 MCAMT 유전자가 과발현된 MCAMT 과발현체를 대상으로 MCAMT 유전자의 발현 양상을 확인한 결과이며, D는 MCAMT 과발현 애기장대 형질전환체의 초장(height), 생중량(FW), 건중량(DW), 장각 개수(NTS) 및 종자 무게(TSW)를 측정한 그래프이다. A에서 YS는 유묘(young seedling); RL은 로제트 잎(rosette leaves); S은 줄기(stems); B는 꽃봉오리(bud); F는 개화한 꽃(open flower); 및 DS1, DS2 및 DS3은 개화한지 6-8일, 9-10일 및 20-22일 된 각각의 발달 종자(developing seed)를 나타낸다. WT는 비형질전환체이다.
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 비형질전환체(WT) 및 MCAMT 과발현 애기장대 형질전환체(OX4, OX12 및 OX15)의 종자로부터 지방산을 추출하여 GC 분석을 통해 지방산 함량(A) 및 조성(B)을 확인한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 상기 MCAMT 단백질을 코딩하는 유전자를 저해시켜 비형질전환체에 비해 식물의 잎 길이 성장 및 종자 배아 발달을 저해시키거나, 상기 MCAMT 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물의 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량을 증가시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 증가된 종자 저장 오일 성분은 가돌레산(20:1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 MCAMT 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, MCAMT 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 MCAMT 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량을 조절하는 활성을 의미한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 MCAMT 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.

본 발명의 MCAMT 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

상기 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이고, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물세포일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 상기 MCAMT 단백질을 코딩하는 유전자를 저해시켜 비형질전환체에 비해 식물의 잎 길이 성장 및 종자 배아 발달을 저해시키거나, 상기 MCAMT 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 비형질전환체에 비해 식물의 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 MCAMT 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 선발하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

상기 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 MCAMT 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 성장, 발달 및 종자 저장 오일 함량을 조절할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 생육조건

애기장대(Arabidopsis thaliana) Columbia-0(Col-0)를 백그라운드(background)로 사용하였다. 애기장대 식물체 종자를 4℃에서 3일간 저온처리 후 70%(v/v) 에탄올에 1분, 20%(v/v) 락스에 5분 동안 소독 후, 멸균수로 5번 씻어내었다. 그 후 1% 수크로오스와 0.6% 피토아가(phytoagar)가 함유된 1/2 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지에 파종하였다. 10일 된 애기장대 유묘를 상토, 질석 및 펄라이트가 3:2:1로 혼합된 토양으로 옮겨주었다. 그리고 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 유전자의 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체의 종자도 TAIR 사이트(www.arabidopsis.org)로부터 분양받아, 표면 소독 후 1/2 MS 배지에 파종하였다. 세포 내 단백질 발현 위치를 분석하기 위하여 담배(Nicotiana benthamiana)를 토양(상토:질석:펄라이트=3:2:1)에 파종하여 14일 뒤에 다른 화분으로 옮겨주었다. 모든 생육조건은 24℃에서 장일 조건(16h light/8h dark cyle)으로 유지시켰다.

2. 바이너리 벡터 제작

MCAMT 프로모터 분석을 수행하기 위해, 애기장대 게놈 DNA를 주형으로 XbaⅠ을 포함하는 MCAMT 프로모터_F2 프라이머와 SmaⅠ을 포함하는 MCAMT 프로모터_R3 프라이머 및 pfu taq 폴리머라아제(New England Biolabs)를 이용하여 PCR을 수행하였고, 약 1.7kb의 MCAMT 프로모터 서열을 증폭하였다. 그 후 72℃에서 7분 동안 A-테일링(A-tailing)을 한 후 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 삽입하여 염기서열을 확인하였다. 서열이 확인된 MCAMT 프로모터 DNA를 XbaⅠ및 SmaⅠ을 이용하여 절단하고 삽입 DNA를 GUS 리포터 유전자를 가진 pCAMBIA1391Z 벡터에 삽입하였다.

fMCAMT:eYFP와 dMCAMT:eYFP 재조합 DNA를 제작하기 위해, SmaⅠ 제한효소 염기 서열을 포함하는 정방향 프라이머(MCAMT_F1, MCAMT_F4_Sma1)와 역방향 프라이머(MCAMT_R1)를 이용하여 애기장대 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 삽입 DNA를 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 삽입한 후, 확인된 DNA를 SmaⅠ을 이용하여 절단하고 삽입 DNA를 CaMV 35S 프로모터, eYFP(enhanced yellow fluorescent protein)와 rbs 터미네이터로 재조합된 pPZP212 벡터에 삽입하였다.

MCAMT 안티센스 형질전환체를 제작하기 위해, pCAMBIA1300 벡터에 NOS 터미네이터를 삽입하였고 pCAMBIA1391Z 벡터에 삽입된 MCAMT 프로모터를 XbaⅠ 및 SmaⅠ을 이용하여 절단하고 재조합된 pCAMBIA1300 벡터에 삽입하였다. 그 후, pPZP212 벡터에 삽입되어진 MCAMT를 SmaⅠ을 이용하여 절단하여 안티센스 방향으로 재조합된 pCAMBIA1300 벡터에 삽입하였다.

MCAMT 과발현체를 제작하기 위해, 애기장대 cDNA를 주형으로 BglⅢ를 포함하는 AT2G30200_SOE_F 프라이머, BstEⅡ를 포함하는 AT2G30200_SOE_R 프라이머 및 pfu taq 폴리머라아제(New England Biolabs)를 이용하여 PCR을 수행하였고, MCAMT CDS 서열을 증폭하였다. 그 후 72℃에서 7분 동안 A-테일링(A-tailing)을 한 후 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 삽입하여 염기서열을 확인하였다. 서열이 확인된 MCAMT CDS를 Bgl Ⅲ과 BstE Ⅱ을 이용하여 절단하고 삽입 DNA를 pCSEN 벡터에 삽입하였다. 각 PCR에 사용된 특이적 프라이머의 서열 정보는 하기 표 1에 개시였다.

MCAMT 프로모터:GUS와 MCAMT 안티센스 형질전환체 및 MCAMT 과발현체 제작은 재조합된 구축물을 냉해동 방법을 이용하여 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주에 형질전환시켰다(An, 1987, Method Enzymol., 153:292-305). 그리고 형질전환된 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 야생형(이하 '비형질전환체'라 칭함) 식물체로 플로랄 딥 방법을 이용하여 유전자를 도입시켰다(Clough and Bent, 1998, The Plant Journa, 16, 735-43).

본 발명에 사용된 프라이머

프라이머 이름	서열번호	염기서열(5'-3')
MCAMT_F1	3	CCCCGGGATGCGTTCACTGCTTCACCG
MCAMT_F2	4	GGCTGACAAAGTTCAGATCGC
MCAMT_F4_Sma Ⅰ	5	CCCCGGGATGGCCTCCTCTTCCTTGC
MCAMT_R1	6	CCCCGGGAGCACTGATGTTTTCGAAACTTGC
MCAMT promoter_F1	7	TTCTAGAGTGTGGTTGCGATTCCGTTG
MCAMT promoter_F2	8	TTCTAGAGCCGTCAATGCCTATAACTC
MCAMT promoter_F3	9	CCGGTGATAGTCATCACCATCTGC
MCAMT promoter_R3	10	CCCCGGGTCAGAGAAGTAAACAGTAG
MCAMT antisense_R1	11	CACTAGAGAGATCCACAGACATACG
BCCP1_qRT-F	12	CTTCGTCGTTCTCAGTCACATC
BCCP1-qRT-R	13	GCAGAGAGACGGAAAGAAACTC
AT2g30200_SOE_F	14	AGATCTATGCGTTCACTGCTTCACCGT
AT2g30200_SOE_R	15	GGTGACCTCAAGCACTGATGTTTTCGAAAC
KASIII_RT_F:	16	GGGTCTAGTTTCAGCTGCTT
KASIII_RT_R	17	CGATATGACTCTCTCTGGTG
FATB_RT_F	18	GGCTGAGAAACAGTGGATGA
FATB_RT_R	19	GGCAAGGACAGGATCAGAAT
FATA_RT_F	20	AGAGTGAAGGAAGGATTGGG
FATA_RT_R	21	AATTTCAGAGGTGGTGGTGG
FAB2_RT_F	22	TAAGAGAGAGGGCTAGAGAG
FAB2_RT_R	23	GGAAGAGAAGTTGTCAAAGAG
AtGPAT9-RT-F	24	ATGAGCAGTACGGCAGGGAGGC
AtGPAT9-RT-R	25	TGCAAAAGTGAGTTATGTTTATTGAGA
DGAT1_SF1	26	ACAGAGCCATGCCGGATT
DGAT1_SR1	27	CACAATGTGGGAGCGACC
AtPDAT1-RT-F	28	GCGATTGCCCCAGGATTCTTAGAC
AtPDAT1-RT-R	29	CCACGCGCCATCATCTTAGGAG
AtLPAT2-RT-F	30	GCGTACTAACTCTTGGAGCAA
AtLPAT2-RT-R	31	CAAAACTGACACGCGCTTCTT
LBa1	32	TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
PP2A_F	33	GCGGTTGTGGAGAACATGATACG
PP2A_R	34	GAACCAAACACAATTCGTTGCTG
TUB_F	35	CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA
TUB_R	36	TCACCTTCTTCATCCGCAGTT
SEN1_F	37	ATGATAGAGACTCGAAGATCG
SEN1_R	38	GGCACTTGAAAGATCCAC

3. 총 RNA 분리 및 유전자 발현 분석

MCAMT 유전자의 조직 부위별 발현량 분석을 위해, 애기장대의 뿌리(6주), 유묘(10일), 로제트 잎(6-7주), 줄기 잎(6주), 줄기(6주), 꽃봉오리(6주), 꽃(6주) 및 발달 종자(6주, DAF 10)로부터 뉴클레오스핀 RNA 식물 추출 키트 (MACHEREY-NAGEL)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 500ng의 총 RNA는 Gostrip™ 역전사 효소(Promega)와 올리고 dT 프라이머를 이용하여 역전사시킨 다음, MCAMT_F2과 MCAMT_R1 프라이머를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 정량적 RT-PCR은 KAPA SYBR FAST qRT-PCR 키트(KAPA biosystem)를 이용하여 C1000™ 유전자증폭기(Bio-Rad)에서 수행하였다. 정량적 RT-PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 20초, 변성, 60℃에서 20초 및 72℃에서 20초 신장시키는 반응을 40 사이클 반복하는 방법으로 수행하였다.

MCAMT 안티센스 형질전환체와 MCAMT 과발현체의 전사체 발현량을 확인하기 위해, 각 식물체의 잎으로부터 위와 동일한 방법으로 총 RNA를 추출하였다. 800ng의 총 RNA를 역전사시킨 다음, MCAMT 안티센스 형질전환체는 MCAMT F2와 MCAMT 안티센스_R1 프라이머를 이용하고, MCAMT 과발현체는 AT2G30200_SOE_F 프라이머와 AT2G30200_SOE_R 프라이머를 이용하여 정량적 RT-PCR에 수행하였다. MCAMT 안티센스 형질전환체의 전사체 발현 분석에서는 PP2A(AT1G69960) 유전자를, MCAMT 과발현체의 전사체 발현 분석에서는 Tublin(At5g62690) 유전자를 cDNA의 정량적 또는 정성적 대조구로 사용하였다.

4. 게놈 DNA 추출 및 PCR 분석

분양받은 돌연변이체에 T-DNA가 삽입되었는지 확인하기 위해, 2주 된 식물의 잎에서 DNA 추출 버퍼(200mM Tris-HCL, pH7.5, 250mM NaCL, 25mM EDTA 및 0.5% SDS)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 그리고 MCAMT_F1과 MCAMT_R1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, T-DNA가 삽입되어있는지 확인하기 위해 게놈 DNA를 이용하여 T-DNA의 LBa1 프라이머와 MCAMT_F1 및 MCAMT_R1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 동일한 방법으로 MCAMT 프로모터:GUS 형질전환체는 MCAMT 프로모터_F1 및 MCAMT 프로모터_R3 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하였고, MCAMT 안티센스 형질전환체의 게놈 DNA를 추출한 뒤, MCAMT_F2 및 MCAMT 프로모터_F3 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 5주된 MCAMT 과발현체도 동일한 방법으로 게놈 DNA를 추출하여 MCAMT_F2와 MCAMT_R1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 각각의 특이적 프라이머의 정보는 상기 표 1에 개시하였다.

5. 형질전환체를 이용한 GUS(β- glucuronidase ) 발현 분석

항생제 저항성을 보이는 애기장대 MCAMT 프로모터:GUS T1 형질전환체의 유묘(10일)와 발달 종자(DAF 7-10)를 GUS 염색 버퍼에 담군 다음, 37℃의 인큐베이터에 16시간 이상 반응시켰다(Jefferson et al., 1987, EMBO Journal, 6, 3901-3907). 그 후, 10%부터 100%의 에탄올을 사용하여 30분씩 순차적으로 엽록체를 제거하였다. 엽록체가 제거된 식물들은 LEICA S6D 현미경(LEICA)를 이용하여 GUS 발현을 관찰하였다.

6. 형광 단백질을 이용한 세포 내 단백질의 위치 분석

MCAMT 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위해, MCAMT:eYFP 벡터들을 가진 아그로박테리움 세포를 OD=1.0의 농도로 p19 헬퍼 DNA를 포함하는 아그로박테리움 세포(OD=0.4)와 함께 담배 잎 뒷면에 주입시켰다. 담배에 주입한 후, 48시간이 지나면 아그로박테리움 세포가 주입된 담배 잎의 원형질체를 분리하였다(Yoo et al., 2007, Nat Protoc., 2, 1565-1572). 그리고 TCS SP5 AOBS/탠덤 공초점 레이저 현미경(Leica)을 이용하여 형광 신호를 확인하였다(extraction, 500nm; emission, 535nm). 엽록체를 관찰하기 위해, RFP를 이용하여 엽록체 자가 형광을 확인하였다(extraction, 514nm; emission, 561nm). 담배 원형질체의 미토콘드리아를 염색하기 위해, 담배 원형질체를 200nM 미토트랙커(Thermo Fisher Scientific)에 3분 반응 후 형광 신호를 관찰하였다(extraction, 579nm; emission, 599nm).

7. 현미경을 이용한 비형질전환체와 MCAMT / mcamt 돌연변이체의 발달 종자와 배아 발달 관찰

MCAMT / mcamt 돌연변이체들의 장각 내 종자 발달 상태를 확인하기 위해, 비형질전환체와 MCAMT / mcamt 돌연변이체들의 개화한 지 6일 된 장각을 핀셋을 이용하여 벗기고 장각 안의 발달 종자의 상태를 니콘 쿨픽스 P1 디지털 카메라와 해부 현미경(Leica DFC 280)을 이용하여 관찰하였다.

MCAMT / mcamt 돌연변이체들의 하얀색 종자 배 발달을 관찰하기 위해, 먼저 비형질전환 식물체의 개화한지 4일부터 8일 된 장각의 초록색 표현형 발달 종자를 확보하고 MCAMT / mcamt 돌연변이체 개화한지 4일부터 8일 된 장각의 하얀색 표현형 발달 종자를 확보하였다. 그리고 발달 종자를 에탄올:아세트산(9:1) 용액으로 12시간 동안 고정시킨 다음, 70% 에탄올과 90% 에탄올로 차례로 치환시켰다. 그 후에 발달 종자는 1시간 동안 호이어의 용액(클로랄 수화물:물:글리세롤= 3:0.8:0.4)에 처리하고 액시오캠 MRc5 카메라가 연결된 광학 현미경(Lumar. V12, steREO)을 이용하여 관찰하였다.

8. 세포 크기와 세포 수 측정

MCAMT 안티센스 형질전환 식물체의 세포 크기와 세포 수를 측정하기 위해, 비형질전환 식물체와 MCAMT 안티센스 형질전환 식물체의 6-8번째 로제트(rosette) 잎의 세로와 가로 크기를 측정하였다. 그 잎을 메탄올에 24시간 처리하고 락트산에 30분 처리한 뒤 액시오캠 MRc5 카메라가 연결된 광학 현미경(Lumar. V12, steREO)을 이용하여 관찰하였다.

9. GC(Gas chromatography)를 이용한 지방산 성분 및 함량 분석

비형질전환체와 MCAMT 과발현체의 종자 지방산의 성분 및 함량을 분석하기 위해 건종자 100개를 2.5% H₂SO₄가 들어 있는 메탄올에 넣고 50㎍의 내부 표준인 C17:TAG을 첨가한 후, 100℃에서 1시간 30분 동안 반응이 끝난 다음, 1.5ml의 0.9%의 NaCl과 2ml의 헥산을 각각 세 번씩 첨가한 후, 원심분리를 이용하여 분리시킨 후 상등액을 추출하였다. FAMEs(Fatty acid methyl esters)를 농축시키기 위해 추출한 용액을 질소가스로 증발시켰다. 용매를 완전히 증발시킨 다음, 농축된 FAMEs는 50㎕의 헥산에 녹여서 DB-23 칼럼(J&W Scientific, Folsom. CA, USA)이 장착된 GC-2010(Shimadzu, Japan)에 반응시켰다. 각각의 지방산은 내부 표준의 머무름 시간과 피크 면적을 비교해서 분석하였다.

실시예 1. MCAMT 의 조직부위별 발현 분석

다양한 애기장대 조직에서 MCAMT 유전자의 발현 정도를 확인하기 위해, 6주 된 뿌리, 로제트(rosette) 잎, 줄기(cauline) 잎, 줄기, 꽃봉오리, 꽃과 10일 된 유묘, 개화한 지 10일 된 발달종자에서 mRNA를 추출한 뒤 정량적 real-time PCR(qRT-PCR)을 이용하여 MCAMT 발현량을 확인하였다. 그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 MCAMT의 전사체는 애기장대의 전 조직에서 확인되었고, 특히 개화한 지 10일 된 발달 종자에서 가장 많이 존재함을 확인하였다.

또한, 애기장대 식물체의 성장과 발달에 따른 MCAMT 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해, MCAMT 프로모터하에 GUS(β-glucuronidase) 리포터 유전자를 융합시킨 구축물로 형질전환된 T₁ 식물체를 확보하였다(도 2A 및 2B). 형질전환된 T₁ 식물체를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-글루쿠로니드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuronide) 시약을 이용하여 염색해본 결과, 발아한 지 10일 된 유묘의 유관속 조직에서 GUS 유전자의 발현을 관찰할 수 있었고, 특히 배수 조직과 자엽, 뿌리의 정단 분열 조직 및 개화한 지 7~10일 된 발달종자의 배아에서 강하게 발현하는 것을 확인하였다(도 2C).

실시예 2. MCAMT 단백질의 세포 내 위치 분석

MCAMT가 엽록체와 미토콘드리아 안에서 지방산 생합성에 관여한다고 알려져 있고, 애기장대 게놈 분석 결과(https://www.arabidopsis.org/), 1개의 MCAMT 유전자가 발현되므로, 이 유전자로부터 만들어진 단백질이 2개의 세포 내 소기관으로 이동하는지를 확인하기 위해, 전장 MCAMT 단백질의 C-말단에 eYFP를 융합시킨 fMCAMT:eYFP 구축물을 제작하였고, eYFP 구축물을 음성 대조군으로 사용하였다(도 3A). 재조합된 벡터를 아그로박테리움으로 형질전환시킨 세포를 담배 잎으로 침윤시켰다. TCS SP5 AOBS/탠덤 공초 레이저 현미경(Leica)을 이용하여 엽록체의 자가 형광과 미토크래커의 형광 신호, fMCAMT:eYFP의 형광 신호를 관찰해 본 결과, 음성 대조군인 35S pro::eYFP의 형광 신호는 세포질에 위치하는 반면에, MCAMT 단백질의 형광 신호는 자가 형광인 엽록체와 일치하였고 미토콘드리아와도 일치하는 것을 관찰하였다(도 3B). 이 결과를 통해 MCAMT 단백질은 엽록체와 미토콘드리아 두 곳에서 기능을 하는 것을 알 수 있다.

또한, iPSORT(http://ipsort.hgc.jp/)와 TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/) 프로그램을 이용하여 MCAMT가 엽록체와 미토콘드리아로 타겟팅될 수 있는 타겟팅 펩티드인 것을 확인함으로써, MCAMT 아미노산 서열의 1부터 30이 미토콘드리아로 위치하는데 요구되는 추정 타겟 펩티드임을 알 수 있었다. 따라서 미토콘드리아 시그널 펩티드를 제거한 dMCAMT:eYFP를 제작하였다(도 3A). 상기 설명한 동일한 방법으로 담배 원형질체에서 형광 신호를 관찰한 결과, dMCAMT:eYFP의 형광 신호는 엽록체에 위치함을 확인하였고, 이는 MCAMT N-말단 아미노산 서열 1부터 30 아미노산 잔기가 MCAMT 단백질이 미토콘드리아로 위치되는데 중요한 시그널 펩티드임을 확인하였다(도 3B). 이러한 결과를 통해 MCAMT 유전자로부터 생성된 단백질이 미토콘드리아 및 엽록체로 모두 위치함을 알 수 있었다.

실시예 3. T-DNA MCAMT / mcamt 돌연변이체의 분리 및 비형질전환체와 MCAMT/mcamt 돌연변이체의 배아 발달 과정

애기장대에서 MCAMT 유전자의 기능을 알아보기 위해, TAIR(http://www. arabidopsis.org/)에서 MCAMT의 1번째 엑손에 T-DNA가 삽입되어 있는 SALK_143365(MCAMT/mcamt-1)와 8번째 엑손에 T-DNA가 삽입되어있는 SALK_047933(MCAMT/mcamt-2) 돌연변이체 종자를 분양받았다(도 4A). 비형질전환체와 MCAMT / mcamt 돌연변이체들의 2주 된 식물체 잎에서 게놈 DNA를 추출하여 MCAMT_F1/MCAMT_R1 프라이머를 이용해 PCR을 수행한 결과, 비형질전환체와 MCAMT/mcamt 돌연변이체들 모두 PCR 산물을 확인할 수 있었다(도 4B). 또한, MCAMT_R1/LBa1 프라이머로 PCR을 수행한 결과, 비형질전환체에서는 PCR 산물이 보이지 않고, MCAMT/mcamt 돌연변이체에서 확인되는 것을 통해 T-DNA가 삽입되어 있는 이형접합(heterozygote) 돌연변이체임을 확인하였다(도 4B).

상기 실시예 1에서 조직 부위별 MCAMT 발현 분석을 통하여 MCAMT 유전자가 발달 종자에서 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었기 때문에, MCAMT의 기능 상실이 발달 종자에 어떠한 영향을 미쳤는지 알아보기 위해 MCAMT / mcamt 돌연변이체의 발달 종자를 확인하였다. 비형질전환 식물체의 장각 안의 발달 종자는 초록색으로 잘 발달되어 있는 반면, MCAMT / mcamt 돌연변이체의 장각에서는 초록색 발달 종자뿐만 아니라 하얀색 표현형의 발달 종자가 관찰되었다(도 4C). MCAMT / mcamt 돌연변이체에서 관찰된 초록색 발달종자와 하얀색 표현형의 발달 종자의 비율이 3:1인 것으로 보아 하얀색 발달종자는 동형접합체(homozygote)인 MCAMT / mcamt 돌연변이체임을 예측해 볼 수 있었다.

비형질전환 식물체의 초록색 발달 종자와 MCAMT / mcamt 돌연변이체의 하얀색 발달 종자의 차이를 알아보기 위해, 비형질전환 식물체의 개화한 지 6일 된 초록색 발달 종자와 MCAMT / mcamt 돌연변이체의 개화된 지 6일 된 하얀색 발달 종자의 배아 발생 과정을 현미경을 이용하여 관찰하였다. 먼저, 비형질전환 식물체의 초록색 발달 종자의 배아 발달을 살펴본 결과, 개화한 지 4일 된 배아는 구상(globular) 단계, 5일 된 배아는 심장(heart) 단계, 6일 된 배아는 선형 어뢰(linear torpedo) 단계, 7일 된 배아는 굽어진 어뢰(torpedo) 단계, 8일 된 배아는 성숙(mature) 단계의 배아를 관찰할 수 있었다. 이와 달리 MCAMT / mcamt 돌연변이체의 하얀색 발달 종자의 배 발달을 살펴본 결과 개화한 지 4일에 구상(globular) 단계의 배가 관찰되고 그 이후 시기부터는 배가 관찰되지 않았다(도 4D). 이러한 결과를 통해 MCAMT/mcamt 돌연변이체가 배아 치사(embryo lethal) 표현형을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. MCAMT 안티센스 형질전환체 분리 및 형태 관찰

상시 실시예 3에서 mcamt / mcamt 돌연변이체의 배아가 치사되는 것을 확인하였다. 따라서 애기장대가 성장하는 동안 MCAMT의 역할을 확인하기 위해 MCAMT 프로모터 하에 MCAMT CDS가 안티센스 방향으로 삽입되어진 구축물로 비형질전환 애기장대를 형질전환하였으며(도 5A), MCAMT가 안티센스 방향으로 들어간 형질전환체(aT23, aT35)를 확보하였다(도 5B). 4주 된 MCAMT 안티센스 T₁ 형질전환체들의 표현형을 살펴보면, NT(비형질전환체)는 정상적으로 생장하는 반면, MCAMT 안티센스 형질전환체(aT23 및 aT35)들은 완전한 개체로 성장하지 못하고 키가 작고 크기가 작게 자라는 표현형이 관찰되었다(도 5C). T₁ 식물체에서 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 수행한 결과, 비형질전환체(NT)에 비해 MCAMT 안티센스 형질전환체인 aT23 및 aT35에서 MCAMT의 발현량이 약 20% 감소하였다(도 5D). 또한 비형질전환체(NT)와 MCAMT 안티센스 형질전환체들(aT23, aT35)의 로제트(rosette) 잎의 길이를 측정해본 결과, 비형질전환체(NT)의 로제트 잎의 길이는 약 4cm인 반면, MCAMT 안티센스 형질전환체들(aT23, aT35)의 로제트 잎은 약 1.2cm로 비형질전환체(NT)보다 약 70% 감소된 잎의 크기가 관찰되었다(도 5E).

MCAMT 안티센스 형질전환체의 감소된 잎의 크기가 세포 크기나 세포의 수의 감소와 관련이 있는지 알아보기 위해, 비형질전환체(NT)와 MCAMT 안티센스 형질전환체(aT23, aT35)의 로제트 잎의 향축(adaxial) 부분을 레이카 DM2500 현미경을 이용하여 관찰하였다(도 6A). 그 결과, MCAMT 안티센스 형질전환체(aT23, aT35)의 세포 크기는 비형질전환체(NT)에 비해 약 2배 이상 증가되었고 세포의 수는 비형질전환체(NT)에 비해 약 2배 감소하였다(도 6B 및 도 6C). 이 결과를 통해, MCAMT 유전자가 세포 분열에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. MCAMT 과발현체 분리 및 형태 관찰

MCAMT 유전자가 과발현되면 종자 내의 오일 함량이 증가되는지 확인하기 위해, 종자 오일 함량 증가에 요구되는 새로운 프로모터를 확보하고자 하였다. 따라서, 기존에 구성적(constituve) 프로모터이면서, 에틸렌과 ABA 처리, 당 결핍 등과 같은 반응에서도 유도되고, 노화 시기 동안에도 유도된다고 보고된 바 있는 SEN1(senescence1) 유전자의 발현을 확인하였다(Oh et al., 1996, Journal of Plant Physiology, 151, 6, 339-345; Chung et al., 1997, J. Plant Physiol., 151, 339-345). 그 결과, SEN1은 다른 조직에서는 발현되지 않는 반면, 약 6주 된 로제트(rosette) 잎과 개화 후 20일 된 발달 종자에서 발현되었다(도 7A). 개화 후 20일 된 발달 종자에서 발현되는 SEN1 프로모터 하에 MCAMT가 과발현되는 구축물로 아그로박테리움을 이용하여 애기장대(Col-0)를 형질전환하였다(도 7B). 그 결과, MCAMT 유전자가 과발현된 MCAMT 과발현체(OX4, OX12 및 OX15)를 확보하였으며, 약 5주 된 MCAMT 과발현체에서 추출한 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과, MCAMT의 발현량이 비형질전환 식물체에 비해 매우 증가함을 확인하였다(도 6C). 비형질전환체와 MCAMT 과발현체의 초장(height), 생중량(FW), 건중량(DW), 장각 개수(NTS) 및 종자 무게(TSW)를 측정하여 비교한 결과, 초장, 생중량 및 건중량은 큰 차이가 없었지만, 한 식물체당 총 장각의 개수와 한 식물체에서 수확한 모든 종자의 무게는 비형질전환체보다 MCAMT 과발현체에서 증가한 것을 확인하였다(도 7D).

실시예 6. MCAMT 과발현체 종자의 지방산 함량 분석

지방산 생합성 초기 과정에 관여한다고 알려진 MCAMT가 과발현되면 지방산 생합성의 최종 산물인 종자 오일 함량이 증가하는지 알아보기 위해, 먼저 MCAMT 과발현체의 종자의 크기를 살펴본 결과, MCAMT 과발현체의 종자의 크기는 비형질전환체와 비슷하였다(데이터 미제시). 그렇다면, 종자 지방산 함량은 증가하였는지 확인해보기 위해, MCAMT 과발현체 종자의 총 지방산 함량을 분석해 본 결과, 비형질전환체 대비 MCAMT 과발현체의 종자 지방산 함량은 9~27% 증가하였으며(도 8A), 지방산 구성 성분을 살펴보면, 다른 구성 성분은 차이가 미비한 반면, 비형질전환체에 비해 MCAMT 과발현체의 가돌레산(20:1) 성분이 증가하였다(도 8B). 이를 통해 MCAMT의 과발현은 종자 오일 함량 증진에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Transgenic plant with regulated growth, development and seed storage oil content using MCAMT gene from Arabidopsis thaliana and uses thereof <130> PN18055 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1182 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgcgttcac tgcttcaccg tactatctta ctcacatctc cgtctcattc tcttatccgg 60 cgcacttctc tctccgccat ggccaccacc gcctcctctt ccttgctcct cccttccata 120 tctctcaaca atctctcctc ctctaaaaat gcctcctttg gcttcgccgc caagaatctc 180 agccgatcta ggatttctat gagcgtctct gctggatctc agagtactac tgttcacgat 240 tctctgttcg ctgattacaa acccacctct gcttttctct ttcccggtca gggagctcaa 300 gcagtaggaa tgggaaaaga gtctcagagt gttggagcag ctggagagtt gtataagaaa 360 gctaatgata tcttagggta tgatcttttg gatatttgtg ttaatggacc aaaagagaag 420 cttgattcta cggtcataag ccagcctgct atttatgtca caagtttagc agcagttgaa 480 ttgctccgtg ttcgtgaagg cggagaacaa ataattaact cggttgatgt gacttgcggt 540 ctcagtttgg gagagtatac tgctctggct tttgctggag ccttcagctt 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Phe Gly Phe Ala Ala Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg 50 55 60 Ile Ser Met Ser Val Ser Ala Gly Ser Gln Ser Thr Thr Val His Asp 65 70 75 80 Ser Leu Phe Ala Asp Tyr Lys Pro Thr Ser Ala Phe Leu Phe Pro Gly 85 90 95 Gln Gly Ala Gln Ala Val Gly Met Gly Lys Glu Ser Gln Ser Val Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Glu Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Asp Ile Leu Gly Tyr Asp 115 120 125 Leu Leu Asp Ile Cys Val Asn Gly Pro Lys Glu Lys Leu Asp Ser Thr 130 135 140 Val Ile Ser Gln Pro Ala Ile Tyr Val Thr Ser Leu Ala Ala Val Glu 145 150 155 160 Leu Leu Arg Val Arg Glu Gly Gly Glu Gln Ile Ile Asn Ser Val Asp 165 170 175 Val Thr Cys Gly Leu Ser Leu Gly Glu Tyr Thr Ala Leu Ala Phe Ala 180 185 190 Gly Ala Phe Ser Phe Glu Asp Gly Leu Lys Leu Val Lys Leu Arg Gly 195 200 205 Glu Ala Met Gln Ala Ala Ala Asp Ala Ala Lys Ser Ala Met Val Ser 210 215 220 Ile Ile Gly Leu Asp Ser Glu Lys Val Gln Gln Leu Cys Asp Ala Ala 225 230 235 240 Asn Gln Glu Val Asp Glu Ala Asp Lys Val Gln Ile Ala Asn Tyr Leu 245 250 255 Cys Pro Gly Asn Tyr Ala Val Ser Gly Gly Leu Lys Gly Ile Glu Val 260 265 270 Val Glu Ala Lys Ala Lys Ser Phe Lys Ala Arg Met Thr Val Arg Leu 275 280 285 Ala Val Ala Gly Ala Phe His Thr Ser Phe Met Glu Pro Ala Val Ser 290 295 300 Arg Leu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Glu Ile Arg Ser Pro Arg Ile 305 310 315 320 Pro Val Ile Ser Asn Val Asp Ala Gln Pro His Ala Asp Pro Asp Thr 325 330 335 Ile Lys Lys Ile Leu Ala Arg Gln Val Thr Ser Pro Val Gln Trp Glu 340 345 350 Thr Thr Val Lys Thr Leu Leu Ser Lys Gly Leu Lys Ser Ser Tyr Glu 355 360 365 Leu Gly Pro Gly Lys Val Ile Ala Gly Ile Phe Lys Arg Val Asp Lys 370 375 380 Ser Ala Ser Phe Glu Asn Ile Ser Ala 385 390 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccccgggatg cgttcactgc ttcaccg 27 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggctgacaaa gttcagatcg c 21 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccccgggatg gcctcctctt ccttgc 26 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> 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Claims (11)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 상기 MCAMT 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량을 증가시키는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 증가된 종자 저장 오일 성분은 가돌레산(20:1)인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 상기 MCAMT 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제5항에 있어서, 상기 증가된 종자 저장 오일 성분은 가돌레산(20:1)인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제5항 또는 제8항의 방법에 의해 제조된 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량이 증가된 형질전환 식물체.
10. 제9항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
11. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 MCAMT(Malonyl CoA-ACP Malonyl Transferase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물의 장각 개수, 종자 무게 및 종자 저장 오일 함량 증가용 조성물.

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