JPH09501325A

JPH09501325A - 形質転換植物における蝋エステル

Info

Publication number: JPH09501325A
Application number: JP8501055A
Authority: JP
Inventors: ラスナー，マイケル; ジョージメッツ，ジェームズ
Original assignee: カルジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1994-06-01
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 1997-02-10
Also published as: CN1129014A; WO1995033055A2; DE69534815D1; EP0711351B1; US5723747A; WO1995033055A3; ATE318911T1; DE69534815T2; CA2168042A1; EP0711351A1

Abstract

(57)【要約】本発明は植物細胞において蝋エステルを生産する方法を提供する。本発明は更に、蝋エステルを含む植物細胞、並びに主要成分として44：２蝋エステルを含んで成る新規の油組成物及び蝋組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】形質転換植物における蝋エステル序論本発明は、植物酵素、かかる酵素を精製及び獲得するための方法、それに関連するアミノ酸及び核酸配列、並びにかかる組成物の利用方法、特に植物細胞の中での蝋（ワックス）エステルの製造におけるかかる組成物の利用方法に向けられている。植物の遺伝子操作技術の発展を通じて、新規、且つ所望の特徴を有する植物を提供するよう、様々な植物種を形質転換及び再生することが可能となっている。かかる植物遺伝子操作技術にとっての一の課題分野は植物組織の中での価値ある生成物の生産である。かかる用途は、所望の生成物を生産する植物を作り上げる形質転換操作において利用するための様々なDNA 構築体及び核酸配列の利用を必要とする。例えば、植物機能性プロモーターが、植物全体における、又は選定された植物組織における遺伝子配列の適切な発現にとって必要とされている。更に、形質転換された物質を同定するのに選択マーカー配列が往々にして利用されている。かかる植物プロモーター及び選択マーカーは、新規植物を獲得するうえで有用である。価値のある手段を担っている。脂肪酸は約４〜24の炭素数の炭化水素鎖を有する有機酸である。多種多様の脂肪酸が知られており、それらは互いと、鎖長において、並びに二重結合の有無、数及び位置において相違し合う。細胞の中では、脂肪酸は一般に共有結合形態において存在しており、そのカルボキシル部は脂肪アシル基と呼ばれている。これらの分子の鎖長及び飽和度は往々にして式CX：Ｙにより表され、ここで「Ｘ」は炭素の数を表し、そして「Ｙ」は二重結合の数を表している。脂肪アシル基は数多くの脂質の主成分であり、そしてその長い非極性炭化水素鎖はこれらの脂質分子の水不溶性的性質にとって重要である。他の因子に対するこの脂肪アシル基の共有結合のタイプは様々でありうる。例えば、生合成反応においては、それらは特定の酵素反応に依存して、チオエステル結合を介してアシル担体タンパク質 (ACP)又は補酵素Ａ (CoA)に共有結合しうる。蝋においては、脂肪アシル基はエステル結合を介して脂肪アルコールに連結されており、そしてトリアシルグリセロール類はエステル結合を介してグリセロール分子に連結されている３個の脂肪アシル基を有している。脂質を、長鎖（16又は18個の炭素を有する）脂肪アシル基より主として構成されているトリアシルグリセロール類として貯蔵している数多くの植物が研究されている。非常に長鎖（20〜24個の炭素を有する）のモノ不飽和脂肪アシル基がアシル−CoA 伸長経路によりＣ18：１から形成され、そしてそれは数多くの植物種子、特に十文字 (Crucifereae)科の構成員の中で見い出されている。ホホバとしてよりよく知られているデザート・シュラブ、Simmondsia chinens isは、その種子貯蔵脂質の主成分として大量の液状蝋を生産及び貯蔵するという能力において、高等植物（種子担持植物）の中では異常である。かかる単純な蝋化合物は非常に長鎖のモノエン脂肪アシル基とアルコールとの酸素エステルである（Ohlroggeら、Lipids（1978）13：203-210）。1993年５月27日公開の国際出願WO 93/10241 号には、蝋エステルを製造するために、植物細胞の中でリダクターゼと一緒にワックスシンターゼを発現させる方法が記載されている。1992年９月３日公開のWO 92/14816 号においては、ホホバの脂肪アシルリダクターゼについての核酸配列が開示されている。他の数多くの生物がアルコール及びアシル基質から蝋エステルを生成する。例えば、植物は表皮蝋又は小皮蝋を生成する(Kolattukudy（1980）のThe Biochemi stry of Plants（Stumpf，P．K．and Conn，E．E．編）第４巻、頁571-645)。様々な細菌の種、例えばアシネトバクター（Acinetobacter）（Fixterら（1986）J ．Gen．Microbiol．132：3147-3157）及びマイクロコッカス（Micrococcus）(Ll oyd（1987）Microbios 52：29-37)、並びに単細胞生物ミドリムシ（Euglena）（ Khan and Kolattukudy（1975）Arch．Biochem．Biophys．170：400-408）についての蝋も報告されている。更に、牛のマイボーム腺（Kolattukudy ら（1986）J ．Lipid Res．27：404-411）、鳥類の尾腺、並びに様々な昆虫及び海洋生物由来のミクロソーム調製品における蝋の生産が報告されている。これらの蝋の組成及び生合成経路はホホバ種子の蝋とは異なることがある。ホホバに関しては、非常に長鎖の脂肪アシル−CoA の対応のアルコールに至る還元は単一の酵素に依存しているものと考えられており、その酵素の活性は発育中のホホバ種子由来の粗抽出物において見い出されている(Pollard ら（1979）Lipid s 14：651-662；Wuら（1981）Lipids 16：897-902)。それに対し、植物の小皮蝋の形成に関して、二段過程が報告されている（Kollattukudy（1980）The Bioche mistry of Plants（Stumpf，P．K．and Conn，E．E．編）第４巻、頁571-645）。脂肪アシル−CoA はNADH−依存性リダクターゼの作用によって遊離アルデヒドに変換され、その後NADPH-依存性脂肪アルデヒドリダクターゼの作用によりそのアルコールが形成される。脂肪アシル−CoA リダクターゼ活性を有するミドリムシ（Euglena gracilis）由来の多重酵素複合体の可溶性化がWildner and Hall ick により報告されている（The Southwest Consortium第５回恒例会議、1990年４月22〜24日、Las Cruces，NM由来の要旨集）。ミドリムシの貯蔵蝋の形成において、アルコール部は脂肪アシル−CoAリダクターゼにより触媒される脂肪アシルのNADH−依存性還元により形成される。図面の簡単な説明図１。ホホバの脂質アシルリダクターゼの核酸配列及び翻訳アミノ酸配列を提供する。図２。再合成したホホバ脂質アシルリダクターゼの核酸配列及び翻訳アミノ酸配列を提供する。図３。ホホバ油及びコントロールのレストン（reston）植物由来の油に対してプロットした、pCGN 7677-形質転換レストン植物由来の形質転換油の高温ガスクロマトグラフィー対比である。発明の概要本発明は植物細胞において蝋エステルを製造するための方法であって、前記植物にとって異種な配列から発現された脂肪アシルリダクターゼを有する植物細胞を増殖せしめる工程を含んで成る方法を提供する。本発明に至るまで、蝋エステルが植物において、それにとって異種な配列から発現される蝋シンターゼの存在抜きで製造されうることは知られていなかった。好ましくは、植物細胞であって、その植物細胞において機能的な調節要素のコントロール下にあるホホバ脂肪アシルリダクターゼコード核酸配列を含んで成る組換構築体から発現されたリダクターゼを有する細胞を増殖させる。ホホバリダクターゼを発現し、且つ蝋エステルを生成する十文字科の植物の種子細胞、詳しくはアブラナ（Brassica）属及びシロイヌナズナ（Arapidopsis）属の細胞を例示する。それ故、本発明は天然では蝋エステルを生成することが知られていない植物細胞において蝋エステルを製造するのに利用されうる。リダクターゼ配列を発現する細胞において蝋エステルが生成されるメカニズムはわかっていない。それは、ホホバ細胞以外の植物細胞が、リダクターゼより生成された脂肪アルコールと植物細胞にとって内因性の脂肪アシル基質から蝋エステルを合成できる何らかの活性を含んでいることにあるかもしれない。蝋合成能力を含む植物細胞を決定するための方法も本明細書において説明する。本発明において利用するリダクターゼは、アシル−CoA 類及びアシル−ACP 類を含む様々な脂肪アシル基質に対して活性でありうる。これらの基質の炭素鎖の長さは様々でありうる。しかしながら、一定のリダクターゼは、特定の鎖長のアシル基質に対して優先性を示しうることがあり、又は好適な炭素鎖長の点において広いアシル基質域を有することがある。例示のリダクターゼ配列はホホバから獲得できうる長鎖脂肪アシルリダクターゼであるが、その他の脂肪アシルリダクターゼを植物細胞において蝋エステルを製造するのに利用できうる方法も提供する。ホホバ油は極端な圧力条件にとって適当な鯨油の代用品として奨励されており、その理由はある程度、この目的にとって一般的な油である鯨油の輸入が禁止されるようになったためである。ホホバ油は97％より多くの蝋エステルを含んで成り、トリアシルグリセリド類は含まない。鯨油は総脂質の20％又はそれより多くに至るほどのかなりの量のトリアシルグリセリド類を含む。本発明は、ホホバ植物をその種子のために栽培する試みにおいて経験してきた数多くの困難を回避することを可能にする。本発明の新規の植物油及び新規の蝋組成物を提供する。総脂質の約７％に至るまでの蝋エステル成分を有し、残りがトリアシルグリセリド類である油組成物を提供する。他に、本発明は主流の蝋成分が長鎖の44：２蝋エステルである蝋エステル組成物を提供する。この44：２蝋エステルは蝋組成物の約60％又はそれより多くで存在しうる。蝋エステルの性質は脂肪アルコール及び脂肪アシル基の鎖長及び飽和度に依存して変わるであろう。当業者は、多種多様な所望の蝋エステル生成物を有する植物細胞をもたらしめる数多くのメカニズムを知っているであろう。宿主植物細胞により供される基質の変化がその細胞により生成される蝋エステルの変化の一のメカニズムであるが、しかしながらホホバリダクターゼをコードする配列の特異性を改変することによっても、又は別の入手源に由来するリダクターゼをコードする配列を利用することによっても、その細胞により生成される蝋エステルを変えることができうる。更に、その他のリダクターゼをコードする配列を利用することが、例えばその植物細胞がホホバリダクターゼの内因性長鎖脂肪アシル基質を含まないとき、又は植物宿主細胞がホホバリダクターゼにより生成される長鎖脂肪アルコールに対して活性である蝋合成能力を含まないとき、必要でありうる。従って、宿主細胞により提供される基質及びリダクターゼに依存して、様々な特性を有する蝋エステルが本発明によって考えられる。リダクターゼをコードする配列の潜在的な入手源はその脂肪アルコール又は蝋エステルの生産能力により同定されうる。いくつかの方法を説明し、それにより本明細書において例示しているリダクターゼタンパク質アミノ酸配列以外の配列が同定及び獲得できうる。他のリダクターゼ配列の単離のための構造遺伝子配列の利用、並びにリダクターゼ核酸配列の転写及び／又は宿主細胞におけるリダクターゼタンパク質の発現にとっての組換構築体におけるこの構造遺伝子配列の利用を述べる。リダクターゼタンパク質に関連するその他の核酸配列の利用、例えば５′及び３ ′非コード領域の利用も考慮する。本発明の更なる別の観点において、本発明の蝋エステルを含む細胞も考慮する。例示しているのは、ホホバリダクターゼにとって好適な基質を含む細胞、例えば一定の十文字科の植物の胚における細胞である。蝋エステルは種子細胞の総脂質の約７％のレベルに至るまでの成分として存在している。発明の詳細な説明脂肪アシルリダクターゼ又は「リダクターゼ」は脂肪アシル基の対応のアルコールに至る還元を触媒するうえで活性である。引用することで本明細書に組入れる同時係属米国特許出願第07,659,975号（91年２月22日出願）（第08/149,007号（93年８月11日出願）として継続）、第07/767,251号（91年９月27日出願）及び第07,920,430号（92年７月31日出願）はかかるリダクターゼタンパク質に向けられている。配列をコードする核酸を含むホホバリダクターゼに関する情報も、引用することで本明細書に組入れる1992年９月３日公開のPCT 特許出願WO 92/1481 6 号に供されている。本発明において利用する脂肪アシルリダクターゼには、任意のアミノ酸配列、例えばタンパク質、ポリペプチド又はペプチドフラグメントであって、脂肪アシル基の対応のアルコールに至る還元の触媒活性があるものが含まれる。脂肪アシル基は担体、例えばACP 又は補酵素Ａに共有結合している任意の脂肪アシル基を意図している。本発明により、外来の脂肪アシルリダクターゼタンパク質は、蝋エステルの生産を引き起こすように植物細胞の中で発現されうることが認められた。植物細胞における蝋エステルの生産は、その植物にとって外来の配列から発現される蝋シンターゼ抜きで起こる。例示の十文字科植物細胞はこの方法によって長鎖蝋エステルを発現したが、このリダクターゼタンパク質の更なる研究は、その触媒特性を更に特性決定及び改善せしめるための、又はそのアシル基質特異性を改変せしめるための部位特異的突然変異誘発研究をもたらしうる。改変された基質特異性を有するリダクターゼはその他のFAS 酵素を伴う用途に有用でありうる。例えば、中鎖（Ｃ12−Ｃ14）優先性植物性チオエステラーゼ（同時係属米国特許出願第07/662,007号を参照のこと）及び適当なアシルトランスフェラーゼが、中鎖アルコールを生成するのに改変リダクターゼと一緒に利用できうる。この中鎖アルコールは次に宿主植物細胞により、その植物細胞にとって内因性の蝋合成活性を介して中鎖蝋エステルへと変換されうる。更に、ホホバリダクターゼの精製のために開発された方法を、他の生物からの類似の膜結合型アシル−CoA リダクターゼの精製に応用できうることが理解される。そのリダクターゼも植物宿主細胞における蝋エステルの製造に似たようにして利用できうる。このようにして、一連の基質優先性又は特異性を有する様々なリダクターゼを獲得することができうる。かかるリダクターゼのとりわけ所望される入手源はアシネトバクター（Acinetobacter）種、マイクロコッカス（Micro coccus）及び緑藻類（Euglena）である。実質的に精製されたリダクターゼタンパク質の回収は様々な方法により成し遂げられうる。例えば、ポリアクリルアミドゲルを泳動し、そしてそのタンパク質を膜支持体、例えばニトロセルロース又はポリビニリデンフルオリド（PVDF）に転写させてよい。次にこの膜の特定したタンパク質を含んでいる区画を獲得して、その特定したタンパク質が実質的にその他のタンパク質を含まないようにすることができうる。当業界に公知の、及び以下の実施例の中にも記載されている技術を利用し、そのタンパク質を膜から取り出し、そしてそのアミノ酸配列を決定できるように更なる操作にかけることができうる。例えば、アミノ酸配列は、全タンパク質からＮ−末端アミノ酸領域を配列決定することにより、又は臭化シアンによる消化によって所望のタンパク質のフラグメントを調製することにより、もしくは他にプロテアーゼを利用する酵素切断により、決定されうる。有用でありうるプロテアーゼの例には、エンドプロティナーゼlysC，gluC，AspN及びトリプシンが含まれうる。このようにして得たフラグメントを次に精製し、次いで当業界に公知の方法に従って配列決定できうる。薬品、化粧品、洗剤、プラスチック類及び湿潤油において用途を有するアシルアルコール生成物を供するために、植物細胞においてリダクターゼタンパク質を発現させることも所望されうる。本明細書に記載の通り、遺伝子導入アブラナ属及びシロイヌナズナ属におけるホホバリダクターゼの発現は、これらの植物の種子における長鎖蝋エステルの生産をもたらす。このエステルは公知のけん化又はエステル交換工程によって対応の脂肪アシルアルコール及び脂肪アシル基質へと容易に変換される。ある状況において、例えば他のリダクターゼ入手源の利用において、細胞におけるリダクターゼ活性の発現のために様々な操作が必要とされうる。例えば、膜挿入にとって重要なリーダーペプチドを同定しておき、そして成熟リダクターゼをコードする配列のみを含む構築体を調製することができる。本発明のリダクターゼ核酸はゲノム又はcDNAであり、そしてcDNAもしくはゲノムライブラリーから単離するか、又は単離した植物DNAから直接単離することができうる。タンパク質が単離できたときの及び／又はタンパク質のアミノ酸配列が獲得できたときの遺伝子配列の単離方法は当業者に公知である。例えば、抗体をその単離タンパク質に対して、生起させ、次いで発現ライブラリーをスクリーニングに用い、これにより植物アシルリダクターゼタンパク質又はその抗原性フラグメントを生産するクローンを同定することができる。他方、そのアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドを合成し、そして核酸配列の単離に利用することができる。このオリゴヌクレオチドは、cDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングに用いられうる核酸フラグメントを作製するPCRにおいて有用でありうる。別の手法において、このオリゴヌクレオチドは、有用なプローブを同定するために、及びcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングにこれらのオリゴヌクレオチドを利用できうるハイブリダイゼーション条件を同定するために、ノーザン又はサザンブロットに直接利用できうる。本発明において例示するアシルリダクターゼ核酸配列にはホホバアシル−CoA リダクターゼタンパク質に関係するもの、及びホホバタンパク質又は核酸配列から獲得できうる配列が含まれる。「関係するもの」とは、DNA 又はRNA のいづれかである、ホホバアシルリダクターゼタンパク質又はその一部をコードするもの；ホホバの胚においてそのリダクターゼの転写及び翻訳（発現）を誘発する、前記コード配列に対して５′又は３′に認められる調節配列；cDNAの中には存在しないイントロン配列；並びに小胞体の膜への挿入にとって必要とされうるが、しかし成熟又はプロセスを経たアシルリダクターゼ酵素においては見い出せないリダクターゼタンパク質前駆体の任意のリーダー又はシグナル配列をコードする配列；を意味する。ホホバの配列又はタンパク質から「獲得できうる」配列とは、ホホバアシルリダクターゼアミノ酸配列から合成されうる所望の脂肪酸リダクターゼタンパク質に関連した、又はプローブとしてホホバリダクターゼ核酸配列を、もしくはホホバリダクターゼタンパク質に対して調製された抗体を用いて他の生物から単離した、任意の核酸配列を意図している。これによると、核酸ハイブリダイゼーション又は抗原的方法のいづれかによりホホバ配列を利用して所望の生物から単離した他のアシルリダクターゼの配列は、更なる他のアシルリダクターゼを単離するのに似たように利用できうることが理解されうる。ホホバリダクターゼを介して単離された種子植物リダクターゼを通じて得られたリダクターゼも本明細書においても「獲得できうる」と考えられる。核酸配列の単離のために、cDNA又はゲノムライブラリーを当業者に公知のプラスミド又はウィルスベクター及び技術を利用して調製することができうる。所望の配列についてスクリーニングに用いられうる有用な核酸ハイブリダイゼーション及び免疫学的方法も当業者に公知であり、そして例えばManiatisら（1989）（ Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版（1989）Cold Spring Harbor ，Cold Spring Harbor，New York）に提供されている。一般に、核酸プローブの利用より獲得できうる配列は標的配列と注目のアシルリダクターゼ酵素をコードする所定の配列との間で60〜70％の配列同一性を示すであろう。しかしながら、50〜60％ほどの低い配列同一性を有する冗長配列も得られうる。核酸プローブはその核酸配列の冗長フラグメントであるか、又はより短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。プローブとして長めの核酸フラグメントを採用するとき（約100bpより大）、プローブとして利用する配列から20〜50％のずれを有する（即ち、50〜80％の配列相同性を有する）配列を標的サンプルから獲得するのに、より低めのストリンジェンシーでスクリーニングすることができうる。オリゴヌクレオチドプローブはアシルリダクターゼ酵素をコードする核酸配列全体よりもかなり短くてよいが、しかしながら少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、そしてより好ましくは少なくとも約 20のヌクレオチドであるべきである。長めの領域に反してより短めの領域を使用するとき、より高度の配列同一性が所望される。即ち、相同遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブをデザインするには、アミノ酸配列同一性の高い酵素活性部位を同定することが所望されうる。所定の配列とのハイブリダイゼーションによって近縁遺伝子が単離できうるかを調べるため、その配列を検出できるように、一般に放射能を利用してラベルするが、しかしながらその他の方法も有用である。ラベルしたプローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、そして所望の核酸を含むノーザンブロット又はサザンブロットいづれかのためのフィルターとインキュベートするか（所望の起源を相同性についてスクリーニングするため）、又はスクリーニングすべきcDNAもしくはゲノムクローンを含むフィルターとインキュベートする。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、そのプローブの注目の配列に対するハイブリダイゼーションを最適化するために変えることができうる。低めの温度及び高めの塩濃度はより遠縁の配列のハイブリダイゼーションを可能にする（低ストリンジェンシー）。低ストリンジェンシー条件下でバックグランドハイブリダイゼーションが問題となるなら、ハイブリダイゼーションもしくは洗浄工程のいづれかの温度を上げるか、及び／又は塩濃度を下げて、特異的なハイブリダイゼーション配列の検出性を高めることができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度はBeltz ら（Methods in Enzymology （1983）100：266-285）に論じられている通り、プローブの推定アニーリング温度に基づいて調節できうる。有用なプローブ並びに適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件は上記の通りに同定され、cDNA又はゲノムライブラリーはそのラベル化配列及び最適化条件を利用してスクリーニングされる。このライブラリーはまず固形寒天培地上でプレート培養し、そしてそのDNA を通常はニトロセルロース又はナイロンフィルターである適当な膜に移す。次いでこれらのフィルターをラベル化プローブとハイブリダイズさせ、そして前記の通りに洗って近縁配列含有クローンを同定する。免疫学的スクリーニングのため、ホホバアシルリダクターゼに対する抗体を、ウサギ又はマウスに精製タンパク質を注射することによって調製することができうる。抗体を調製するかかる方法は当業者に公知である。モノクローナル又はポリクローナル抗体のいづれも製造できるが、一般に遺伝子単離にとってはポリクローナル抗体がより有用である。所望の植物種をスクリーニングするためには、ホホバリダクターゼに対する抗体と交差反応する近縁タンパク質が所望の植物種の抽出物の中に存在しているかを決定するウェスタン分析を行う。これは植物抽出タンパク質の、通常ニトロセルロースの膜の上での固定化、それに続く電気泳動及び抗体とのインキュベーションにより成し遂げられる。ニトロセルロースフィルター上での抗体／タンパク質複合体の検出の多種多様な系、例えば抗体の放射性ラベリング及び第二抗体／酵素コンジュゲート系が有用である。いくつかの有用な系がOber felder (Focus （1989）BRL/Life Technlogies，Inc．１１：1-5)により述べられている。交差反応が観察できたら、近縁タンパク質をコードする遺伝子を、所望の植物種を代表する発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離される。発現ライブラリーは、Maniatisら（前掲）に記載されているようなラムダgt11を含む様々な市販のベクターにおいて構築されうる。 DNA ハイブリダイゼーション又は免疫学的スクリーニング技術を利用して上記の通りに同定したクローンを次に精製し、そしてそのDNA を公知の技術を利用して単離及び分析する。このようにして、そのクローンが近縁アシルリダクターゼタンパク質をコードするかを確認する。その他の種子植物脂肪アシルリダクターゼも、ホホバリダクターゼを利用するのと同じ方法でこれらのリダクターゼを利用することを通じて得られうる。当業者は、本発明のアシルリダクターゼ核酸配列は部位特異的突然変異もしくはPCR の標準技術を利用して改変できること、又は配列の改変は合成核酸配列の製造の際に成し遂げられうることを理解しているであろう。このような改変配列も本発明のアシルリダクターゼ核酸配列と考えられる。例えば、コドンの中の自由度のある位置をその核酸配列が同一のアミノ酸配列をコードするように変えてよく、またはそうでなければ、コドンを保存性アミノ酸置換が得られるように改変させてよい。いづれにしても、このペプチドは所望の酵素活性を維持しており、それ故本発明の一部と考慮される。本発明のアシルリダクターゼ酵素の核酸配列は、ゲノムDNA，cDNA，mRNAに由来するDNA もしくはRNA 配列であるか、又は全体的もしくは部分的に合成されたものであってよい。この遺伝子配列は例えばゲノムDNA を適当な起源から単離し、そして注目の配列をポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を利用して増幅及びクローニングすることによってクローニングすることができうる。他方、この遺伝子配列は、特に植物にとって好適とされる配列を供することを所望する場合、完全に又は部分的に合成されたものであってよい。即ち、所望の構造遣伝子全体又は一部（リダクターゼタンパク質をコードする遺伝子部分）を、選定された宿主にとって好適とされるコドンを用いて合成してよい。宿主にとって好適なコドンは、例えば所望の宿主種において発現されるタンパク質において最も頻繁に利用されるコドンから決定されうる。ホホバリダクターゼコード配列内の一定の領域は75％前後に至るまでのAT利用率を有し、その平均は57％を上まわる。再合成したコード配列は好ましくは55％未満、最も好ましくは51％以下程度の相対的に均一なAT組成を有する。本発明の脂肪アシルリダクターゼをコードするDNA 配列は様々な方法で外来DN A 配列と組合せてよい。「外来」DNA 配列とは、自然ではリダクターゼと関係していることが見い出されていない任意のDNA 配列、例えば同一生物由来の自然では互いと結合し合っていないDNA 配列の組合せを意味する。例えば、トランジットペプチドをコードする配列を本発明のリダクターゼ配列に連結することが所望されうる。このようにして、脂肪アシル基質、特に脂肪アシル−ACP が利用可能となっているクロロプラストを、このリダクターゼは標的とすることができるようになりうる。また、ホホバ・デサチュラーゼゲノムDNA に由来する、又は他の植物のゲノムDNA に由来するイントロンを、特定の植物細胞における発現レベルの促進手段として導入することが所望されうる。種子胚細胞において通常発現される配列由来のイントロン、例えばデサチュラーゼ又はナピン (napin)ゲノム配列由来のイントロンがこの目的にとって適当である。本発明のアシルリダクターゼをコードするDNA 配列は、リダクターゼに通常係っている遺伝子配列全体又はその一部と一緒に採用できうる。その構成部において、リダクターゼをコードするDNA 配列は、５′から３′に至る転写方向において、宿主細胞の中での転写及び翻訳を促進できる転写開始コントロール領域、リダクターゼをコードする核酸配列、並びに転写終止領域を有する組換構築体において組合せてよい。宿主に依存して、その調節領域は様々であり、ウィルス、プラスミド又は染色体遺伝子等に由来する領域がある。原核又は真核微生物、特に単細胞宿主における発現のため、多種多様な構成的又は調節性プロモーターを採用してよい。微生物における発現は植物酵素の簡単な供給源となりうる。転写開始領域は、記載のもののうちでとりわけ、細菌及び酵母宿主、例えば大腸菌 (E．coli)、Ｂ．スブチリス (B．subtilis)、サッカロマイセスセレビジエ（Saccharomyces cerevi siae）由来の領域、例えばベーターガラクトシダーゼ、T7ポリメラーゼ、トリプトファンＥ等の如くの遺伝子である。ほとんどの場合、この組換構築体はアシルリダクターゼの生産を司る、植物において機能的な調節領域を含むであろう。植物リダクターゼ又はその機能性フラグメントをコードするオープンリーディングフレームは、転写開始調節領域に対してその５′末端において連結されるであろう。転写開始領域も所望され、そしてそれはリダクターゼcDNA配列の５′非コード領域より供されるか、又はこの構築体の転写開始領域に自然に結合している転写開始領域より供されうる。一般に、転写及び翻訳調節領域の組合せはプロモーターと呼ばれている。植物における構造遺伝子の多種多様な構成的又は調節性、例えば誘導型発現を司る莫大な数のプロモーター領域がある。植物における構成的遺伝子発現を司るうえで有用であることが知られている配列としてはとりわけアグロバクテリア (Agrobacterium)遺伝子に係る調節領域、例えばノパリン・シンターゼ (Nos)、マノパイン・シンターゼ (Mas)又はオクトパインシンターゼ (Ocs)にとってのもの、更にはウィルス遺伝子の発現をコードする領域、例えばカリフラワー・モザイク・ウィルス（CaMV）の35Ｓ及び19Ｓ領域がある。本明細書で用いている「構成的」なる語は、遺伝子が全てのタイプの細胞において同一レベルで発現されることを必ず意味しているわけではなく、その遺伝子が広域の細胞タイプの中で発現はされるが、量における多少の変動が往々にして検出されることも意味する。その他の有用な転写開始領域、例えばナピン、種子又は葉のACP に由来するもの、RUBISCO の小サブユニット等が、一定の組織においての、又は所定の増殖条件下での転写を優先的に担う。完全な植物アシルリダクターゼ遺伝子全体又はその一部の利用が様々な場合に所望されることがあり、即ち５′上流非コード領域（プロモーター）を、構造遣伝子配列及び３′下流非コード領域とともに利用してよい。例えば、ホホバリダクターゼcDNAがわかっているため、このリダクターゼ構造遺伝子に係っているプロモーターはPCR ハイブリダイゼーション技術を利用して、ホホバゲノムDNA から獲得できうる。別のプロモーター、例えば注目の植物宿主にとって天然のプロモーター、又は改変プロモーター、即ち、ある遺伝子源に由来する転写開始領域とそれとは別の遺伝子源に由来する翻訳開始領域とを有するプロモーター、又は増強型プロモーター、例えばダブル35Ｓ CaMV プロモーターを所望するなら、それらの配列を標準の技術を利用して連結してよい。５′上流非コード領域を種子の成熟中に調節されるような他の遺伝子から獲得する場合の用途にとっては、植物胚組織の中で優先的に発現されるもの、例えば ACP 及びナピン誘導型転写開始コントロール領域が所望される。かかる「種子特異的プロモーター」は88年１月25日に出願された米国出願第07/147,781号（現在、91年８月８日に出願された米国出願第07/742,834号）及び1990年３月16日前後に出願された表題「Novel Sequences Preferentially Expressed i n Early Seed Development and Methods Related Thereto」の米国出願第07/494 ,722号の教示に従って獲得及び利用されうる。これらの同時係属出願は全て引用することで本明細書に組入れる。種子組織の中で優先的に発現される転写開始領域は、他の植物器官における遺伝子生成物の任意の破綻又はそれに対する有害な作用を最少限とするために脂肪アルコール生産にとって所望されると考えられている。調節転写終止領域も本発明の組換構築体の中に設けてよい。転写終止領域は、植物アシルリダクターゼをコードするDNA 配列により、又は別の遺伝子起源に由来する慣用の転写終止領域、特にこの転写開始領域と自然に係っている転写終止領域により供されうる。この転写終止領域は一般に、少なくとも約 0.5kb、好ましくは約１〜３kbの配列を、その終止領域が由来している構造遣伝子の３′側に含むであろう。発現にとっての注目のDNA 配列として植物アシルリダクターゼを有する植物発現構築体は、多種多様な植物生命体、特に非常に長鎖の脂肪アシル−CoA 分子を供する植物生命体（例えばアブラナ属）、及び特にナタネ（rapeseed）の高エルカ酸変異体を供する植物生命体に利用することができうる。注目のその他の植物は所望の基質、例えば中鎖又は長鎖の脂肪アシル分子を供し、そして限定することなく、ナタネ（カノーラ（Canola）変異種）、シロイヌナズナ属、ヒマワリ、ベニバナ、綿、タバコソウ属（Cuphea）、ダイズ、ピーナッツ、ココナッツ及びアブラヤシ、並びにトウモロコシが含まれる。宿主細胞の中にDNA 発現構築体を導入するための方法に依存して、その他のDNA 配列が必要でありうる。重要には、本発明は双子葉植物及び単子葉植物の種等に適用でき、そして新規の及び／又は改良型の形質転換及び再生技術に容易に適用できるであろう。形質転換の方法は本発明に関して制限されない。様々な植物形質転換法が現状有用である。新たな方法が作物を形質転換するのに有用となったら、それらは以降直接採用されうる。例えば、アグロバクテリア感染に天然では感受性である数多くの植物種が、アグロバクテリア媒介型形質転換の三分節系交配又はバイナリーベクター法を介して有効に形質転換されうる。宿主植物細胞への核酸配列の移入を供するうえで有用なその他の配列は植物病原性ウィルス又は植物転移因子に由来しうる。更に、様々な単子葉植物種及び双子葉植物種の形質転換を可能にするマイクロインジェクション、DNA 粒子ボンバードメント、エレクトロポレーションの技術が開発されている。組換構築体を開発するうえで、この構築体の様々な成分又はそのフラグメントは通常、細菌宿主、例えば大腸菌の中で複製可能である慣用のクローニングベクターの中に挿入されるであろう。論文において記載された莫大な数のベクターが存在する。各クローニングの後、そのプラスミドを単離し、そして更なる操作、例えば制限酵素処理、新フラグメントの挿入、ライゲーション、欠損、挿入、リセクション等に委ね、所望の配列の成分も仕立ててよい。構築体が完成したら、宿主細胞の形質転換法に従い、更なる操作にとって適当なベクターに移入してよい。通常、この組換構築体に含まれているのは、宿主における発現にとって必須の調節領域及び形質転換細胞の選別を担う領域を有する構造遣伝子であろう。この遺伝子は細胞障害剤、例えば抗生物質、重金属、毒素等に対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養性を供する補完、ウィルス免疫性等を司どる。同様に、色調変化により (例えばGUS)又は発光により（例えばルシフェラーゼ）同定可能な化合物の生成を担う酵素をコードする遺伝子が有用である。発現構築体を導入する様々な宿主に依存して、１又は複数種のマーカーを形質転換組織の選別又は検出のために採用してよく、ここで種々の選別条件が種々の宿主にとって利用される。植物形質転換のためにアグロバクテリアを利用するとき、核酸配列はその一方又は両末端で、特に左側及び右側ボーダー領域で、そしてより特に、少なくとも右側のボーダー領域でT-DNA と接していることが所望されうる。これらのボーダー領域は、別の形質転換法を採用するときにも有用でありうる。アグロバクテリア又はリゾジーンズ（Rhizogenes）配列を植物形質転換のために利用する場合、宿主において存在しているTi−又はRi−プラスミド上のT-DNA との相同組換のためにアグロバクテリア宿主の中に導入できうるベクターを使用してよい。組換にとってのT-DNA を含むTi又はRiはアームド（瘤形成可能）又はディスアームド（瘤形成不能）であってよく、後者は植物宿主細胞へのDNA の移入にとって必須のトランス作用因子をコードするvir 遺伝子の機能補完が形質転換アグロバクテリア宿主の中に存在している限り、許容される。うでつきアグロバクテリア株の利用は正常な植物細胞（その一部は所望の核酸配列を含む）と、腫瘍形成遺伝子の存在に基づき瘤形成可能な植物細胞との混合物をもたらしうる。所望の核酸配列を含むが、腫瘍遺伝子を欠く細胞をこの混合から選択でき、これにより正常な遺伝子導入植物が得られうる。宿主植物細胞を形質転換するための媒体としてアグロバクテリアを利用する好適な方法において、T-DNA ボーダー領域により境界が設けられている発現又は転写構築体を大腸菌及びアグロバクテリアの中で復製可能な広宿主域ベクターの中に挿入することができ、かかる広宿主域ベクターは論文の中に記載されている。一般に利用されているのはpK２又はその誘導体である。例えばDitta ら（Proc． Nat．Acad．Sci.，U．S．A（1980）77：7347-7351）及びEPA 0,120,515 号を参照のこと。それらは引用することで本明細書に組入れる。他に、一方がベクターを大腸菌の中で安定化せしめ、そして他方がアグロバクテリアの中で安定化せしめる別々の複製配列を含むベクターの中に、植物細胞の中で発現させるべき配列を挿入してよい。例えばMcBride and Summerfelt（Plant Mol．Biol．（1990）1 4：269-276）を参照のこと。これにおいては、pRiHRI (Jouanin ら、Mol．Gen． Genet．（1985）201：370-374)複製起点を利用しており、そしてそれは宿主アグロバクテリア細胞の中での植物発現ベクターの増強した安定性を司る。アグロバクテリアの中で複製できる上記の如くベクターの利用が好ましい。このようにして、プラスミドの組合せは必要でなくなり、そして宿主アグロバクテリアvir 領域はT-DNA ボーダー配列を植物宿主細胞に移入するのに必要なトランス作用因子を提供することができる。アブラナ属細胞の形質転換のため、例えばアグロバクテリア形質転換法が利用できうる。一のかかる方法はRadke ら (Theor．Appl．Genet．（1988）75：685- 694)に記載されている。植物細胞についての蝋合成能力を決定することのできうる方法を提供する。例示するのはアブラナ属 (カノーラ及び高エルカ酸ナタネ (HEAR))及びシロイヌナズナの胚アッセイであり、それぞれはホホバの胚について決定されたレベルに比べて低い相対レベルで蝋合成活性を含むことが示される。このようにして、蝋エステル製造にとっての候補を決定するのに、あらゆる植物を内因性蝋合成活性の検出のためにアッセイすることができる。また、この蝋合成活性の好適な基質、並びに内因性蝋合成活性の好適な脂肪アルコール基質を生成するリダクターゼをコードする配列を含むように仕立てられたリダクターゼ構築体、又は他に所望の蝋エステルの生産性を高めるように選ばれたリダクターゼが決定されうる。アブラナ属の胚細胞の中で認めれる蝋合成活性は、発現されたホホバリダクターゼにより作られた脂肪アルコールを蝋エステルへと変換する活性を構成しているようである。かかる活性が、その植物細胞にとって異種のリダクターゼをコードする配列により形質転換された細胞中の脂質アルコールから蝋エステルに至る変換につかさどるかどうかはわかっていない。この活性は、もしつかさどっているなら、専用の酵素であるか、又は別の主要活性を有する酵素のいづれかでありうる。例えば、ジアシルグリセロール・アシル・トランスフェラーゼ (DAGAT)はリガーゼ活性を含むことができうる。アシルリダクターゼの好適な基質を含む宿主植物細胞中でのリダクターゼタンパク質の発現は検出可能な蝋エステル成分を有する細胞をもたらす。粗製油は高温ガスクロマトグラフィーにより検出可能な蝋エステルを含むが、誘導化油においては、その蝋エステルはその脂質アルコールと脂肪アシル基質に戻り変換するため、これが検出されるこのエステルの脂肪アシルアルコール成分である。これらの遺伝子導入植物から得られる油は蝋エステルとトリアシルグリセリドとのブレンドである。鯨油もかかる成分のブレンドである。植物油からの蝋の分離のための又は鯨油からの蝋エステルの分離のための公知であり、且つ長年利用されている簡単な方法が、遺伝子導入リダクターゼ植物から獲得できた蝋エステルとトリアシルグリセリド成分とを分けるのに利用できる。一のかかる方法はウインタリゼーション（winterization）脱蝋操作であり、これによれば油を冷却して蝋成分を結晶化させ、それを次に固体としてその油から機械的に分離させている。莫大な数のその他の分画手順がかかる目的にとって知られ、有機溶媒を利用する抽出方法が利用されている。様々なかかる方法がGunstoneらのThe Lipid Handbook第２版、Chapman ＆ Hall（1994）London に記載されている。本発明を概説してきたが、本発明は、例示の目的で含ませ、従って何らかのことわりのない限り本発明を限定することを意図していない以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるようになるであろう。実施例実施例１−アシル−CoA リダクターゼアッセイミクロソーム膜調製品又は可溶化タンパク質調製品中のアシル−CoA リダクターゼ活性をアッセイするための方法を説明する。Ａ．放射性ラベル化材料長鎖〔１−¹⁴Ｃ〕脂肪酸〔比活性51〜56Ci／mole）、即ち11−cis −エイコセン酸、13−cis −ドコセン酸及び15−cis −テトラコセン酸を、〔¹⁴Ｃ〕シアン化カリウムと対応のアルキルメシレートとの反応、それに続くアルキルニトリルの遊離脂肪酸に至る塩基性加水分解により、調製する。この遊離脂肪酸をエーテル系ジアゾメタンによりそのメチルエステルに変換させ、そして調製硝酸銀薄層クロマトグラフィー (TLC)により精製する。その脂肪酸メチルエステルを遊離脂肪酸へと加水分解で戻す。放射性化学純度は３通りのTLC 法により評価する：ノーマル相シリカTLC、硝酸銀TLC 及びＣ18逆相TLC。これらの方法により測定された放射性化学純度は92〜98％であった。長鎖〔１−¹⁴Ｃ〕アシル−CoA を対応の１−〔¹⁴Ｃ〕遊離脂肪酸から、Young and Lynen の方法（J．Bio．Chem．（1969 ）244：377）により、10Ci／moleの比活性に至るように調製する。その他の〔１ −¹⁴Ｃ〕アシル−CoA、例えば〔１−¹⁴Ｃ〕テトラカセノイル−CoA はAmersham (Arlington Heights，IL)より購入した。〔１−¹⁴Ｃ〕ヘキサデカナールはPletc her and Tate の方法 ( Tet．Lett．（1978）1601-1602)の小スケール改良法に従って、〔１−¹⁴Ｃ〕ヘキサデカン−１−オールのジクロメート酸化により調製する。その生成物を調製シリカTLC により精製し、そしてヘキサン溶液として−70℃で使用時まで保存する。Ｂ．ミクロソーム膜調製品中のリダクターゼ活性のアッセイ１．アッセイ：ミクロソーム膜調製品中のリダクターゼ活性は20μＭの〔１−¹⁴ Ｃ〕アシル−CoA(通常のテトラコセノイル−CoA ；比活性２〜５Ci／mol)の、アッセイすべきサンプル及び２mMのNADPH との全容量0.25mlでのインキュベーションにより測定する。そのインキュベーション混合物は10％ｗ／ｖのグリセロール、１mMのDTT も含み、そして50mMのHEPES（４−〔２−ヒドロキシエチル］ −１−ピペラジンエタン−スルホン酸）（ここで及び以降において、HEPES はpH 7.5 に調整した１Ｍのストック溶液より添加）で緩衝化されている。このアッセイはアシル−CoA 基質の添加により開始し、そしてインキュベーションは30℃で１時間行う。アッセイはアッセイチューブを氷の上に載せ、そして直ちに0.25mlのイソプロパノール：酢酸（５：１，ｖ／ｖ）を加えることにより停止させる。未ラベルの蝋エステル(0.1mg) 及びオレイルアルコール (0.1mg)を担体として加える。〔¹⁴Ｃ〕脂質をHara及びRadin のスケールダウンプロトコール（Anal．Biochem．（1978）90：420）により抽出する。６mlのヘキサン／イソプロパノール（３：２，ｖ／ｖ）を終了アッセイに加える。そのサンプルをボルテックスにかけ、２mlの水性硫酸ナトリウム溶液(5.5％ｗ／ｖ）を加え、そしてそのサンプルを再びボルテックスにかける。２．アッセイ２：ミクロソーム膜調製品中のリダクターゼ活性は20μＭの〔１ −¹⁴Ｃ〕アシル−CoA(通常のテトラコセノイル−CoA 、比活性２〜５Ci／mol)の、アッセイすべきサンプル及び２mMのNADPH との全容量0.25mlでのインキュベーションにより測定する。そのインキュベーション混合物は10％ｗ／ｖのグリセロール、１mMのDTT も含み、そして50mMのHEPES（４ −〔２−ヒドロキシエチル〕−１−ピペラジンエタン−スルホン酸）（ここで及び以降において、HEPES はpH7.5に調整した１Ｍのストック溶液より添加）で緩衝化されている。この膜調製品の中に更に存在している（且つリダクターゼ反応生成物を消費する）アシルCoA：アルコールアシルトランスフェラーゼ活性を阻害することを所望するなら、0.3％ｗ／ｖのCHAPS をそのアッセイ混合物の中に含ませる。CHAPS のこの濃度はリダクターゼ酵素に対して最少限の作用を及ぼすが、しかしアシルトランスフェラーゼ反応を完全に阻害し、それ故リダクターゼ活性の定量を簡単にする。アッセイはアシル−CoA 基質の添加により開始し、そしてインキュベーションは30°で１時間行う。アッセイはアッセイチューブを氷の上に載せ、そして直ちに0.25mlのイソプロパノール：酢酸（４：１，ｖ／ｖ）を加えることにより停止させる。未ラベルの蝋エステル（25μｇ）、オレイルアルコール（50μｇ）及びオレイン酸（50μｇ）を担体として加える。〔¹⁴Ｃ〕脂質をHara及びRadin のスケールダウンプロトコール（Anal．Biochem．（1978）90：420）により抽出する。４mlのヘキサン／イソプロパノール（３：２，ｖ／ｖ）を終了アッセイに加える。そのサンプルをボルテックスにかけ、２mlの水性硫酸ナトリウム溶液(6.7％ｗ／ｖ) を加え、そしてそのサンプルを再びボルテックスにかける。Ｃ．可溶化リダクターゼ活性についてのアッセイ可溶化リダクターゼ活性をアッセイするためには、酵素の活性化のための塩の添加を含むいくつかの変更を必要とする。可溶化リダクターゼアッセイにとってのアッセイバッファーはミクロソーム膜調製品について前記した通りであるが、ただし以下の変化を伴う：ａ．NaClを 0.3〜0.5 Ｍの最終濃度となるように加える；ｂ．EDTAを〜１mMで含ませる；及びｃ．一般に0.75％のCHAPS を含むアッセイすべきサンプルを≦0.3％に希釈する（CHAPS にとってのCMC は〜 0.5％）。Ｄ．アッセイ生成物の分析ミクロソーム膜調製品のリダクターゼアッセイ又は可溶化リダクターゼアッセイのいづれかの生成物の分析のため、２通りのプロトコールが開発されている。以下に「長時間アッセイ」として説明する一のプロトコールは時間がかかるが、よりよい定量的な結果を供する。以下に「迅速アッセイ」として説明する他のプロトコールもリダクターゼ活性の測定を供するが、より迅速であり、より便利であり、しかしながら定量性に欠ける。１．長時間分析：硫酸ナトリウムの添加及びサンプルのボルテックスの後、上部有機相を除去し、そして下部水性相を４mlのヘキサン／イソプロパノール（７：２ｖ／ｖ）で洗う。その有機相をプールし、そして窒素のもとで乾くまでエバポレートする。その脂質残渣を小容量のヘプタンに再懸濁し、そしてそのアリコートを液体シンチレーションカウンティングにより放射能についてアッセイする。サンプルの残りは、ラベル化されたクラスのTLC 分析のために、又は蝋エステルを解裂させるように誘導し、これにより生成した総アルコール量の測定値を得るために利用できる。脂質クラス分析のため、サンプルをシリカTLC プレートに載せ、そしてそのプレートをヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（例えば80：20：１又は70：30：１ｖ／ｖ／ｖ）の中で展開させる。脂質クラス、大半の蝋エステル（リガーゼが存在しているときは、ミクロソーム膜調製品アッセイにおける通り）、遊離脂肪酸、脂肪アルコール及び起源にある極性脂質間の放射能の分布をAMBIS 放射能分析用イメージングシステム（AMBIS Systems Inc.，San Diego，CA）を用いて測定する。必要ならば、個々の脂質クラスを更なる分析のためにTLC プレートから回収してよい。蝋エステルの解裂のため、Pinaら（Lipids（1987）22：358-361）のグリニヤール誘導化プロトコールを基礎とするスケールダウンプロトコールを利用する。このサンプルと200μｇの担体蝋エステルとを、テフロンライン・スクリューキャップの付いたガラス管の中で乾かす。ドライジエチルエーテル(0.4ml)、酢酸エチル（３μｌ）３Ｍのエチルマグネシウムブロミドのジエチルエーテル溶液を (0.1ml)を順次加える。そのサンプルをボルテックスにかけ、そして室温で少なくとも２時間放置し、その後水飽和化ジエチルエーテルを過剰の試薬を破壊するために慎重に加える。２mlづつの１ＭのHCl 及びヘキサンを加え、そしてこのガラス管をボルテックスにかける。上部有機相を水で洗い（２×２ml）、そして50 〜100 μｌのエタノールの存在下で乾くまでエバポレートする。そのサンプルを50〜100 μｌのヘキサンに再懸濁し、そしてTLC プレートに載せる。順相及び逆相TLC の両方の系を分析のために利用する。順相TLC はシリカ TLC プレートを使用し、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（70：30：２ｖ／ｖ／ｖ）で展開させる。逆相系はＣ18プレートを利用し、メタノール中で展開させる。２．迅速分析：硫酸ナトリウムの添加及びサンプルのボルテックスの後、所定の割合いの有機相を取り出し、そして液体シンチレーションカウンティングを介して計測する。この計測は有機相中の総計測数を推定するために用いる。別の有機相部を取り出し、窒素のもとで乾かし、ヘプタンの中に再溶解し、そしてTLC プロット上に点着し、次いで展開させ、そして詳細のアッセイについて記載の通りにスキャンする。このようにして、アルコールに組込まれた総計測数の％が決定される。実施例２−ホホバアシル−CoA リダクターゼの特性決定リダクターゼ活性を有するタンパク質調製品を獲得する方法及びこの酵素活性の試験結果をホホバを利用して例示する。Ａ．種子の発育及びアシル−CoA リダクターゼ活性のプロフィール胚の発育をDavis，CA において５体の植物に基づいて二夏かけて追跡した。胚の新鮮、且つ乾燥した重量は約80日目から約 130日目にかけてかなり一定の割合で上昇することが見い出せた。脂質抽出は、胚の新鮮重量が約 300mgに到達するとき（約80日目）、脂質の重量、対、乾燥重量の比は50％の最大レベルに達することを示した。アシル−CoA リダクターゼ活性を実施例１に記載の通りにして発育中の胚で測定した。ホホバの種子被膜が阻害因子の起源であることがわかっているため、種子被膜を除去してから胚を液体窒素の中で凍結し、−70℃で保存した。無細胞ホモジネート又は膜画分のいづれかにおいて測定されるアシル−CoA リダクターゼ活性についての発育プロフィールはリダクターゼ活性の大幅な誘導を示唆し、それは開花して約 115日後にピークを迎える。従って、酵素研究のための胚は開花後約90〜110 日目の間である、リダクターゼ活性が高く、脂質蓄積が最大レベルを迎えておらず、そして種子被膜が容易に除去できる期間中に収穫した。リダクターゼ活性の上昇の最大速度は開花後80日〜90日目に認められた。従って、cDNAライブラリーの構築のための胚は開花後約80〜90日目の間に収穫し、その際、リダクターゼタンパク質の合成速度は最大であろう。関連して、アシル −CoA リダクターゼをコードするmRNAのレベルはこの段階において最大であろう。Ｂ．分画研究ホホバ胚サンプルを分画する初期の研究は、遠心分離により得られる脂質パッド、上清液及び粒状画分におけるリダクターゼ活性の様々な分布をもたらす。活性の分布に潜在的に影響を及ぼすかなりの数の処理、例えば音波処理、浮遊勾配及び抽出バッファーへの様々な試薬の添加を試験した。抽出バッファーの中に塩を含ませることは、100,000ｇで１時間にわたる遠心分離を経た上清画分において、リガーゼ活性の回収率における最大の向上をもたらした。この抽出バッファーは３ＭのNaCl,0.3Ｍのシュースクロース、100mMのHEPES,２mMのDTT、並びにプロテアーゼインヒビター、１mMのEDTA,0.7mg／mlのロイペプチン、0.5mg／mlのペプスタチン及び17mg／mlのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）より成る。Ｃ．ミクロソーム膜調製品高レベルのリダクターゼ活性を有する粒子は、上記の上清画分から、透析、それに続く 100,000ｇでの遠心分離により、又は硫酸アンモニウム分画により得られうる。透析方法は実施例３に詳細する。リダクターゼ活性を有するこれらの粒子の更なる分析、例えば密度勾配遠心分離、ゲル浸透クロマトグラフィー及びタンパク質／リン脂質分析は、これらの粒子が膜画分を占めていることを確立する。この膜調製品は高いチトクロームＣリダクターゼ活性も有し、その活性は小胞体（ER）膜にとってのマーカーとして利用される。即ち、これらの試験はリダクターゼタンパク質が膜に結合していることを確立せしめる。硫酸アンモニウム分画のため、実施例３に本質的に記載の通りにしてホホバ胚から 100,000ｇの上清液を獲得した。等容量の硫酸アンモニウム溶液 (33.2ｇ／ 100ml)をその上清画分に（撹拌しながら）ゆっくりと加えて硫酸アンモニウム濃度を30％にする。その濃度はリダクターゼ酵素を効率的に沈殿するであろう濃度である。更に30分撹拌後、その懸濁物を 26,000ｇで30分遠心し、そしてそのペレットを最初の上清液画分S1の容量の１／ 10の容量に、25mMのHEPES，１ＭのNaCl，１mMのDTT，0.1mMのPMSFより成る溶液を用いて再懸濁する。その懸濁物を 100,0O0ｇで１時間遠心分離し、そして得られるペレットを25mMのHEPES,10％のグリセロール（これもS1容量の１／10）に再懸濁する。100,000ｇでのこの懸濁物の遠心分離は洗浄されたミクロソームペレットを供し、それをS1の１／20の容量の25mMのHEPES,10％のグリセロールに再懸濁し、約３〜４mg／mlのタンパク質濃度にする。その後の使用のためにアリコートを−70℃に凍結する。Ｄ．リダクターゼ活性の膜結合の研究 Bordier（J．Biol．Chem．（1981）256：1604-1607）に記載のTriton X114 相分画手順を、ホホバリダクターゼが膜内在性タンパク質であるか、又は膜の層にもっとゆるく結合したもの（より親水性の高いタンパク質）であるかどうかを調べるために利用する。この技術は本質的に、膜と１％のTriton X114 との氷上でのインキュベーション、それに続いてその混合物の温度をその条件下での界面活性剤の曇点よりも高い温度に上昇させる、ことを含む（この曇点は、非常に大型のミセルが自発的に形成され始める温度である；１％のTriton X114 にとってはこれは〜20℃である）。遠心分離後、２つの別々の相、即ち、下部の界面活性剤に富む相と上部の界面活性剤の少ない相（ここでは水性相と呼ぶ）とが観察できる。膜内在性タンパク質はその界面活性剤に富む相に優先的に分配され、一方、より親水性の高いタンパク質は水性相において回収される。ホホバ膜調製品をこのTriton X114 相分画プロトコールにかけると、リダクターゼ活性は界面活性剤に富む相に含まれており、水性相においてはリダクターゼ活性は検出されない。このことは、リダクターゼ酵素が膜内在性タンパク質であることを証明する。Ｅ．リダクターゼ酵素の更なる特性決定上記のミクロソーム膜調製品をリダクターゼ酵素の更なる特性化のために利用する。このリダクターゼ酵素はpH５〜９の域にわたって活性であることが示された。特性決定実験をpH7.5 で行い、それは細胞質の推定生理学的pHに近い。１．塩効果：様々な塩類を、一塩基塩類当り 0.5Ｍの標準濃度を利用し、それらのリダクターゼ活性に及ぼす効果について調べた。二価のカチオン又はアニオンとの塩類を 0.167Ｍ(O.5Ｍの一塩基塩類と同一のイオン強度を供する) そして更に 0.5Ｍで調べた。0.5ＭのNaClの添加により15倍に至る剌激が認められた。一価及び二価（例えばLiCl，KCl，MgCl₂，CaCl₂及びNa₂SO₄）の両方のその他の塩類もリダクターゼ活性を剌激することが示されたが、ただし一般にNaCl剌激に比べて度合いが低かった。強力なカオトロピック塩類、KSCN及びNaSCN はリダクターゼ活性の剌激を供さないか、又は最低限の剌激を供した。２．その他のエフェクター：ジチオスレイトール (DTT)は、必須ではないが、リダクターゼ活性に対する剌激剤であることが見い出され、一方、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）は若干の剌激を供し、その最適濃度は 2.5mMであった。活性のわずかな剌激が低（0.02〜0.075 mg／ml）BSA（牛血清アルブミン）濃度で認められ、一方、活性の阻害が 0.2mg／ml以上の濃度のBSA で認められた。アシル−CoA リダクターゼがNADPH 特異的依存性活性であるという初期の所見（Pollard ら、前掲）が確証された。バックグランドを超えるほどのNADH依存性活性は測定されなかった（NADPH 依存性活性の＜２％）。また、リダクターゼ反応の両水溶性最終産物CoA及びNADP⁺ は有意義な活性阻害を供し（ミリモラー濃度で）、一方NADH及びNAD+は活性に対して最低限の作用を及ぼした。３．基質特異性：様々な鎖長の脂肪酸、アシル−ACP 及びアシル−CoA のチオエステルをリダクターゼ酵素にとっての基質として比べた。試験は10μｍの基質濃度で行い、なぜならテトラコセノイル−CoA(24：１−CoA)基質はより高い濃度では強力な基質阻害を示すからである。これらのアッセイにおけるNaCl濃度は0. 5Ｍとする。基質特異性実験の結果を以下の表１に示す。テトラコセノイル−CoA は試験したもののうちで最大の基質活性を有し、従ってこれを更なる酵素精製及び特性化実験におけるリダクターゼアッセイのために用いる。パルミトイル−CoA (C16：０−CoA)とパルミトイル−ACP (C16：０−AC P)を基質として直接比較した。パルミトイル−CoA に対する活性はかろうじてバックグランドより高く、一方パルミトイル−ACP に対する活性は高かった。既に、ステアロイル−ACP (C18：０−ACP)が基質としての活性を有していることが示されている（Pollardら、前掲）。また、パルミトイル−CoA はリダクターゼ酵素にとっての劣った基質のようであるにもかかわらず、未ラベルのパルミトイル−CoA（０〜30mM）及び〔１−¹⁴ Ｃ〕テトラコセノイル−CoA (20mM)を用いて行う競合阻害実験においては、テトラコセノイル−CoA に対するリダクターゼ活性の50％の阻害が５mMのパルミトイル−CoA で認められた。即ち、このアッセイ条件下ではパルミトイル−CoA は劣った基質ではあるが、有効なインヒビターである。４．リダクターゼインヒビターアッセイ：その他のタイプのリダクターゼタンパク質のいくつかの既知のインヒビターを、ホホバアシル−CoA リダクターゼ活性に及ぼすその効果について試験した。HMG-CoA リダクターゼ（３−ヒドロキシル−３−メチルグルタリル−補酵素Ａリダクターゼ）の強力なインヒビターであるメビノリンは、HMG-CoA リダクターゼに対する阻害濃度（約１nMのKi）に比て比較的高い濃度（100μＭ）においてのみ効果を有していた。セルリネンはβ− ケトアセチルチオエステルシンターゼに共有結合することでよく知られているが、ホホバアシル−CoA リダクターゼに対して強力な阻害作用を有さない。スルフィドリルブロッキング剤もリダクターゼ活性に及ぼすその作用についてスクリーンした。Ｎ−エチルマレイミドは強力な阻害活性を示し、一方、para− ヒドロキシマーキュリ−ベンゾエートも多少の阻害作用を示し、そしてヨードアセトアミドは作用を有さなかった。このことは、アシル−CoA リダクターゼが、様々なスルフヒドリルブロッキング試薬に対してかなりの特異性を示す本質的なスルフィドリル基を有する所見に至る。実施例３−アシル−CoA リダクターゼの精製リダクターゼ活性を有するホホバ膜調製品の単離、リダクターゼ活性の可溶化及びリダクターゼタンパク質の更なる精製のために利用できうる方法を説明する。Ａ．ミクロソーム膜調製品ホホバの胚を花成（flowering）して約90〜110日目に収穫し、胚の水分含有量を評価する（45〜70％）。外殻及び種子被膜を除き、そしてその子葉を液体窒素の中で急速凍結し、そして将来の使用のために−70℃で保存する。一次タンパク質調製品のため、凍結胚をスチール製乳鉢の中で液体窒素温度で粉砕することにより粉末状にする。典型的な実験において、70ｇの胚を処理する。この粉末を、70ｇの胚当り 280mlの溶液の割合で、以下の高塩溶液に加える：３ＭのNaCl,0.3Ｍのスクロース、100mMのHEPES,２mMのDTT、並びにプロテアーゼインヒビター、１mMのEDTA,0.7mg／mlのロイペプチン、0.5mg／mlのペプスタチン及び17mg／mlのPMSF。無細胞ホモジネート (CFH)を、この粉末胚をバッファーの中にPolytron組織ホモジナイザーで約30秒間分散させることにより形成する。このホモジネートを三層のMiracloth（Cal Biochem，La Jolla，CA）で濾過し、そしてその溶液を100,000ｇで１時間遠心分離する。得られるサンプルはペレット、上清液及び浮遊脂肪パッドより成る。この脂肪パッドを除去し、そしてその上清画分を集め、次いで１mMのNaCl，100mM のHEPE S,２mMのDTT 及び１mMのEDTAを含む溶液に対して一夜透析する（バッファー溶液は３回交換）。その透析物を200,000ｇで１時間遠心してペレットDP２を得る。そのペレットを25mMのHEPES (pH7.5),10％（ｗ／ｖ）のグリセロール、１mMのED TA及び0.5ＭのNaClの中にもとのCFH 容量の約１／20の容量で懸濁し、ミクロソーム膜調製品を得る。活性は実施例１に記載の通りにアッセイする。アシル−CoA リダクターゼ活性の回収率はこの無細胞ホモジネート品中のもとの活性の約30％であると評価された。この調製品におけるアシル−CoA リダクターゼ活性は−70℃で保存したときに安定である。Ｂ．リダクターゼタンパク質の可溶化固形CHAPS(３−〔（３−クロラミドプロピル）−ジメチル−アンモニオ〕−１ −プロパンスルホネート) をミクロソーム膜調製品に加え、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度にする。このサンプルをゆっくりとしたゆらし運動にかけながら約１時間氷上でインキュベートし、次いで25mMのHEPES (pH7.5),10％のグリセロール、0. 34ＭのNaCl，１mMのEDTAで希釈して、CHAPS 濃度を0.75％に、そしてNaCl濃度を約 0.4Ｍに下げる。次いでこのサンプルを 200,000ｇで１時間遠心し、次いでその上清液を回収し、そして実施例１に記載の通りにしてリダクターゼ活性をアッセイする。一般に、その上清液画分においてミクロソーム膜調製品から85％のリダクターゼ活性が回収される。Ｃ．Blue Ａカラムクロマトグラフィー約25mlのベッド容量を有するBlue Ａ（Cibacron Blue F3GA；Amicon Divisio n，W．R．Grace ＆ Co.）を含むカラム（1.8×〜10cm）を用意し、そしてそのカラムを0.4ＭのNaClを含むバッファーＡ（25mMのHEPES (pH7.5),20％（ｗ／ｖ）グリセロール、0.75％のCHAPS，１mMのEDTA）で平衡にする。前記の可溶化リダクターゼ調製品をBlue Ａカラムに載せる。このカラムを0.4ＭのNaClを含む数倍のカラム容量のバッファーＡで洗い、次いで0.5ＭのNaClを含むバッファーＡで洗う。90％より高いリダクターゼ活性がカラムに結合し、同時に85％より多くのその他のタンパク質が通過する。リダクターゼ活性は1.0ＭのNaCl を含むバッファーＡでカラムから溶離する。画分を集め、そして実施例１に記載の通りにしてリダクターゼ活性についてアッセイする。リダクターゼ活性含有画分をプールし、そして−70℃で保存する。一般に、添加したリダクターゼ活性の 30〜50％が1.0ＭのNaClバッファーでの溶離により回収される。Ｄ．サイズ排除クロマトグラフィー Blue Ａカラムからのプールした活性画分を、YM30膜（Amicon Division，W． R．Grace）の付いた加圧セルの中での限外濾過を介して〜10倍に濃縮する。一般に、活性は〜90mlでBlue Ａカラムから溶出し、そして〜８mlにまで濃縮し、次いで以下の通りにして２本のSephacryl S100カラムに載せる。カラム(2.5×7.5c m)にS100 HR媒体 (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway，NJ)を充填し、次いで0.5ＭのNaClを含むバッファーＡで平衡化する。これらのカラムを以下のタンパク質標準品でサイズ検量する：牛血清アルブミン（66kD）、カルボニックアンヒドラーゼ（29kD）、チトクロームＣ（12.4kD）及びブルーデキストラン（ボイドボリュームを決定するために使用）。濃縮サンプルのアリコート４mlを各 S100カラムに載せ、それを約17cm／hrの直線流速において展開させる。〜４時間にわたり画分を集め、そしてそれら画分中のリダクターゼ活性を実施例１に記載の通りに測定する。添加した活性のうちの60％より高い活性が１本のメインピークにおいて回収され、それは約49kDの見かけ上の分子量において溶出した。プールした活性画分の容量は〜30−35ml／カラムとする。Ｅ．アフィニティークロマトグラフィーカラム(1.5cm×〜２cm) にパルミトイル−CoA アガロース（Sigma Chemical C o.，St．Louis，MO)を充填し、そしてバッファーＢ(0.1ＭのNaClを含むバッファーＡ)で平衡化する。ゲル濾過カラム由来のプールした活性画分を上記の通りの限外濾過を介して〜16倍に濃縮する。濃縮サンプル中のNaClレベルをバッファーＡによる希釈によって0.5Ｍ〜0.1 Ｍに下げる。希釈サンプルをこのカラムに載せ、次いで数倍のカラム容量のバッファーＢで洗う。次いでこのカラムを15mMのNADHを含むバッファーＢ 10mlで洗い、次いでバッファーＢで更に洗う。リダクターゼ活性はそのカラムにバッファ−Ｂ中の15mMのNADPH 15mlを通すことにより溶出させる。一般に、一度に一本のゲル濾過カラム由来の材料をアフィニティーカラムで処理し、そしてそのカラムに載せた活性のうち70％より高い活性がNADPH による溶出により回収される。活性画分をプールし、そしてリダクターゼ活性、タンパク質濃度及びポリペプチド組成について分析する。タンパク質濃度は市販のキット (Bio．Rad Laboratories，Ｉnc.，Richmond，CA)を用い、Bradford (Analy．Biochem．（1976）72：248-25 4)に記載の色素結合法に基づいて評価する。対照タンパク質としてBSA を用いる。Ｆ．精製表典型的な精製実験における各段階でのタンパク質回収率及びリダクターゼ活性を以下の表２に示す。Ｇ．SDS PAGE分析サンプルのポリペプチド組成をSDS PAGE（Laemmli，U．K．（1970）Nature（L ondon）227：680-685）により分析する。これらのサンプルを、SDSと、ストック溶液由来のジチオスレイトールとをそれぞれ２％及び30mMの最終濃度となるまで加えることにより、電気泳動のために用意する。約50μｌのサンプルを12％の分離用ゲル（NUVEX，San Diego，CA）を有するアクリルアミドゲルのウェルの上に載せる。分子量標準品はBio-Rad Laboratoriesから購入した。タンパク質は銀染色により検定する（Blumら、Electrophoresis（1987）8：93-99）。約52及び54kDの見かけ上の分子量を有する２本の主要ポリペプチドバンドがアフィニティーカラム由来の活性サンプルにおいて検出され、これらは一緒になってこの調製品の中のタンパク質の＞95％を占めている。55kDのタンパク質標準品を含むタンパク質サイズマーカー系を用いてのこれらのサンプルの更なる分析は、54kD及び56kDという異なる分子量評価をもたらす。自然状態のリダクターゼ酵素の見かけ上のサイズは約49kDであるため（上記のサイズ排除クロマトグラフィーにより決定）、これらのバンドは、一つの酵素のうちの２つの異なるサブユニットではなく、リダクターゼ酵素の近縁形態を示しているようである。Ｈ．膜に対するタンパク質のブロッティング上記のリダクターゼポリペプチドをアミノ酸配列決定のため、これらのタンパク質をニトロセルロース又はPVDFのいづれかであるImmobilon-Ｐ(Millipore；Be dford，MA)又はPro Blott (Applied Biosystems；Foster City，CA)のいづれかの膜に転写し、次いでSDS-PAGEにかけることにより単離する。ニトロセルロースはタンパク質をその後酵素的に消化するときに好ましく、一方PVPFはＮ−末端配列決定法のため及び臭化シアン消化より得られるペプチドの配列決定のために有用である。１．ニトロセルロースへのブロッティング：タンパク質をニトロセルロースにエレクトロブロットするとき、そのブロッティング時間は、５〜20％のメタノール中の25mMのトリス、192mMのグリシンの如くのバッファー中では一般に１〜５時間とする。エレクトロブロッティング後、膜を１％（ｖ／ｖ）の酢酸中の0.1 ％（ｗ／ｖ）のPonceau Ｓの中で２分染色し、次いで0.1％（ｖ／ｖ）の酢酸を２回交換して脱色する（交換当り２分とする）。これらの膜をヒートシールプラスチックバッグの中でウェットのまま−20℃で保存する。時間が許すなら、ブロットは凍結せず、下記のアミノ酸配列の決定のためのペプチドを作り上げるよう直ちに消化のために用いる。２．PVDFへのブロッティング：タンパク質をImmobilon Ｐ PVDFにエレクトロブロットするとき、そのブロッティング時間は一般に10％（ｖ／ｖ）のメタノール中の12.5mMのトリス／５Ｍのグリシンの如くのバッファー中では約１〜２時間とする。PVDFに対するエレクトロブロッティングの後、膜を50％（ｖ／ｖ）のメタノール／10％（ｖ／ｖ）の酢酸中の0. 1％（ｗ／ｖ）のクマジーブルーの中で５分間染色し、そして50％（ｖ／ｖ）のメタノール／10％（ｖ／ｖ）の酢酸を２回交換して脱色する（交換当り２分とする）。PVDF膜を次に30分間風乾し、次いでドライの状態でヒートシールプラスチックバックの中で−20℃で保存する。PVDF膜、例えばPro Blott にブロットしたタンパク質は完全タンパク質のＮ−末端配列を決定するために直接用いることができうる。タンパク質をPro Blott にエレクトロブロットするためのプロトコールは以下の実施例4Aに記載する。実施例４−アミノ酸配列の決定本実施例においては、アシル−CoA リダクターゼ活性に係る植物タンパク質のアミノ酸配列の決定のための方法を述べる。Ａ．タンパク質の臭化シアノ解裂及びペプチドの分離臭化シアン解裂を、Promega，Inc．（Madison, WI）由来のProbe-Design Pept ide Separation System Technical Manual に記載の方法を利用して課題のタンパク質について行う。リダクターゼタンパク質を上記の通りにしてPVDF膜にブロットする。タンパク質バンドをブロットから切り取り、70％（ｖ／ｖ）のギ酸中の臭化シアン溶液に入れ、そしてこの溶液の中で室温で一夜インキュベートする。このインキュベーションに続いて、臭化シアンを取り出し、プールし、次いで Reacti-Vapエバポレーター（Pierce，Rockford，IL）を用いて連続窒素流のもとで乾かす。完璧な取り出しを確実なものとするため、70％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール、0.2％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸、0.1mMのリジン及び0.1mMのチオグリコール酸を用い、臭化シアンペプチドの更なる溶出を行ってよい。次に溶出溶媒を取り出し、そして乾燥臭化シアン溶液を含むチューブに加え、そして上記の通りに乾燥させる。この溶出手順を新鮮な溶出溶媒で繰り返してよい。HPLC 級の水50μｌを次にこの乾燥ぺプチドに加え、そしてその水をSpeed-Vac（Savan t，Inc.，Farmigdale，NY）の中でのエバポレーションにより除去する。 9)に記載と類似のトリス／トリシンSDS-PAGE系を利用してペプチドを分離させる。ゲルを 125〜150 ボルトの定電圧において約１時間、又はトラッキング色素がこのゲンの下端から流出し始めるまで泳動させる。転写の前に、ゲルを転写バッファー(125mMのトリス、50mMのグリシン、10％（ｖ／ｖ）のメタノール)の中に1 5〜30分浸しておく。ゲルをPro Blott 配列決定用膜(Applied Biosystems，Fost er City，CA)に50ボルトの定電圧で２時間にわたりブロットする。これらの膜をクマジーブルー（50％（ｖ／ｖ）のメタノール／10％（ｖ／ｖ）の酢酸中で0.1 ％）で染色し、次いで50％（ｖ／ｖ）のメタノール／10％（ｖ／ｖ）の酢酸の中で２分づつ、３回脱色する。膜を30〜45分風乾し、次いで−20℃でドライで保存する。 Pro Blott にブロットしたペプチドは、ポリブレン・コート化ガラスファイバーフィルターを取り付けることなくタンパク質シーケンサーのシーケンサーカートリッジに直接載せることができる。ペプチドはApplied Biosystemsより供給された、若干改良された反応サイクルでBLOT−１を用いて配列決定する。また、溶液S3（塩化ブチル）をS1とS2との50：50の混合物（ｎ−ヘプタン及び酢酸エチル）に置き換える。これらの２通りの改良はPro Blott にブロットしたサンプルを配列決定するとき常に利用する。Ｂ．プロテアーゼ消化及びペプチドの分離ニトロセルロースにブロットしたタンパク質を、配列決定のためのペプチドを得るために、プロテアーゼによる消化に委ねることができる。利用した方法はAebersold ら (PNAS（1987）84：6970)のそれとする。リダクターゼタンパク質のバンド、そしてまたコントロールとして使用した同じ大きさのブランクニトロセルロースをこのニトロセルロース膜から切り出し、そしてHPLC級の水で数回洗ってPonceau Ｓを除去する。この洗浄の後、0.5％の酢酸中の0.5％のポリビニルピロリドン（PVP-40，Aldrich，Milwaukee，WI）1.0ml をこの膜片に加え、そしてその混合物を37℃で30分インキュベートする。PVP-40を完璧に除去するため、ニトロセルロース片を多量のHPLC級水（８×５ml）で洗い、214nmでの洗液の吸収を光度計でチェックしておく。また、PVP-40処理及び洗浄が終えるまでバンドを小片に切らなければPVP-40はもっと簡単に除去できる。これら２通りの改良はPVP-40による妨害の問題を排除する。次にこれらの断片を適当な消化用バッファー、例えばトリプシン消化用バッファー、100mMの炭酸水素ナトリウムpH8.2、又はエンドプロティナーゼglucバッファー、25mMの炭酸アンモニウム／１mMのEDTA pH7.8の中に懸濁する。この消化用混合物にアセトニトリルを５〜10％（ｖ／ｖ）の濃度となるまで加える。プロテアーゼを消化用バッファーの中で希釈し、そしてこの消化用混合物に、一般にプロテアーゼ、対、タンパク質の比を１：10（ｗ／ｗ）にして加える。消化用物を 18〜24時間インキュベートする。例えば、トリプシン消化用物は37℃でインキュベートし、そしてエンドプロティナーゼglucC 消化用物は室温でインキュベートする。同様に、その他のプロテアーゼ、例えばlysC及びaspNをリダクターゼタンパク質を消化するのに用いてよい。個々の消化用バッファー条件は異なるが、消化、ペプチド分離、精製及び配列決定のためのプロトコールはトリプシン及びgl ucによる消化について記載したものと実質的に同じである。一夜のインキュベーション後、消化反応を10mlの10％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸 (TFA)又は１μｌの100％のTFA の添加により停止させる。この消化混合物をニトロセルロース片から除去し、そのニトロセルロース片を５〜10％のアセトニトリルを有する消化用バッファー 100ml容量で１〜５回洗い、次いでその容量をSpeed-Vac の中で 100ml未満の容量となるまで濃縮する。これらのペプチドをApplied Biosystems（Fostger City，CA）モデル130高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）に取付けたVydac 逆相Ｃ18カラム(2.1mm×100mm)上で分離させる。ペプチドを溶出させるのに用いる移動相は：バッファーＡ：0.1mMのリン酸ナトリウム、pH2.2；バッファーＢ：0.1mMのリン酸ナトリウム中の70％のアセトニトリル、pH2.1とする。50ml／分の流速で、２時間かけての10〜55％のバッファーＢ；５分かけての55〜75％のバッファーＢ；及び15分にわたる75％のバッファーＢイソクラチック；の３段勾配を利用する。ペプチドは 214nmで検出し、手動で集め、次いで−20℃で保存する。Ｃ．タンパク質及びペプチドのＮ−末端配列決定配列決定は全て、Applied Biosystems 477A Pulsed-Liquid Phase Protein Se quencer でエドマン分解により行う；このシーケンサーにより生成されるフェニルチオビタントイン (PTH)アミノ酸をオン−ライン・Applied Biosystems 120A PTH Analyzerにより分析する。データーを集め、そしてApple Macintosh 用のAp plied Biosystemsモデル610Aデーター分析システムを用いて保存し、そして更に PE NELSON，Inc.，(Cupertino，CA)由来のACCESS^★CHROM ソフトウェアーを用いてDigital Microvaxで保存する。配列データーをチャートレコーダーから読み取り（このレコーダーはPTH Analyzerからのインプットを受容する）、そしてモデル610Aソフトウェアーから得られる定量的なデーターを利用して確認する。配列データーは全て２人のオペレーターにより、データー分析システムの助けを借りて個別に読み取る。 HPLCのオフ−ピークとして得られるペプチドサンプルに関して、このサンプルを、シーケンサーにおいて３回のプレーサイクルに委ねたポリブレンコート化ガラスファイバーフィルター (Applied Biosystems，Foster City，CA)に載せる。還元及びアルキル化したペプチドに関して、各シーケンサーサイクル由来のPTH- アミノ酸生成物質の一部を液体シンチレーションカウンターにおいて計測する。 Immobilon-Ｐにエレクトロブロットさせたタンパク質サンプルに関して、課題のバンドを切り出し、次いで上記の通りにプレサイクルに付してあるポリブレンコート化ガラスファイバーフィルターの上に載せ、そして反応カートリッジを製造者の仕様に従って組立てる。Pro Blott にエレクトロブロットさせたタンパク質サンプルに関しては、このガラスファイバーフィルターは必要でない。少量のサンプル (５〜30pmole)からタンパク質配列を得るためには、Tempst a nd Riviere (Anal．Biochem．（1989） 183：290)に記載の477A変換サイクル及び120Aアナライザーを用いる。Ｄ．リダクターゼペプチドのアミノ酸配列精製リダクターゼ調製品をSDS-PAGEに載せ、54kDと56kDのタンパク質を分離させる。分離した物質をニトロセルロース型膜（Immobilon Ｎ）に転写し、そして Ponceau Redで染色してバンドの位置を決定する。56kD又は54kDタンパク質のいづれかを含むブロットの切り出し部をトリプシンで処理し、そしてこのトリプシン処理ペプチドを逆相HPLCで分離させる。各リダクターゼタンパク質由来のいくつかのペプチドから得られる配列情報（SEQ ID N0：１〜18）を以下の表３に示す。ペプチド配列はアミノ酸についての標準１文字コードを用いて記載してある。「ｘ」はその位置のアミノ酸が同定されていないことを示す。小文字で示しているアミノ酸表示は、そのアミノ酸にとっての同定が仮りであることを示す。２つのリダクターゼタンパク質間の類似性は上記のペプチド配列から明らかである。54kDのタンパク質由来のペプチドは全て配列決定された56kDのペプチドにおいても見い出せる。決定されたアミノ酸配列と、この56kDリダクターゼをコードするcDNAから（図１（SEQ ID NO：９））推定されるリダクターゼアミノ酸配列との間では一箇所の不一致がある。cDNA配列データーに従うとアミノ酸 460はセリンである。54kD及び56kDのペプチド（それぞれ６及び９）由来の情報は、その位置にグリシンがあることを示している。Ｅ．ウェスタン分析リダクターゼ56kDタンパク質のアミノ酸167-235（図１参照）をコードするリダクターゼcDNA（実施例５）の一部を、Taq プロモーターからのリダクターゼペプチドの発現のために、大腸菌pGEX発現ベクター (AMRAD；Burwood，Victoria； Australia)にイン・フレームでライゲートさせる。得られる構築体をこのリダクターゼタンパク質の生産のために大腸菌細胞に形質転換させるのに用いる。このようにして作った69アミノ酸のペプチドを精製し (Smithら（1988）Gene 67：31 -40)、そしてこのリダクターゼペプチドに対するポリクローナル抗体を得るために用いる。 56kD及び54kDのバンドを含む精製リダクターゼ調製品並びにホホバ無細胞ホモジネート品（実施例3A）のウェスタンブロットを、上記の抗体調製品を用いるリダクターゼ調製品分析のために調製する。56kDのバンドは無細胞ホモジネート品及び精製リダクターゼ調製品の両者において検出され、一方54kDバンドは精製リダクターゼ調製中のみに検出された。これらの結果は、精製リダクターゼ調製品の中で認められた54kDバンドが、リダクターゼ精製手順より得られる56kDタンパク質の分解生成物であることを示唆する。更に、４種類の制限酵素を用いての制限酵素消化ホホバゲノムDNA のサザンブロット分析はリダクターゼcDNA（実施例５）プローブにハイブリダイズする一本のメジャーバンド及び一本のマイナーバンドの検出をもたらす。実施例５−ホホバリダクターゼcDNA Ａ．ホホバRNAの単離 RNA は、最初にJackson and Larkins により述べられた（Plant Physiol．（1 976）57：5-10），Goldbergらにより改良された (Developmental Biol．（1981 ）83：201-217)方法によってポリリボソームから単離する。この手順においては、何らかのことわりのない限り、全ての工程を４℃で実施する。開花後80〜90日目に集めた10ｇのホホバ胚をWaringブレンダー中の液体窒素の中でその組織が微粉末となるまで粉砕する。液体窒素が蒸発した後、170mlの抽出用バッファー（2 00mMのトリス pH9.0，160mMのKCl，25mMのEGTA，70mMのMgCl₂,１％のTriton X- 100,0.5％のナトリウムデオキシコレート、１mMのスペルミジン、10mMのβ−メルカプトエタノール及び500mMのシュークロース）を加え、そしてその組織を約２分ホモジナイズにかける。そのホモジネート品を滅菌ミラクロスで濾過し、そして12,000ｇで20分遠心分離する。その上清液を500mlの滅菌フラスコにデカントし、そして１／19の容量の20％の清浄溶液（20％のBrij 35,20％のTween 40， 20％のNoidet p-40 ｗ／ｖ）を室温で加える。その溶液を４℃で30分中速で撹拌し、次いでその上清液を12,000ｇで30分遠心分離する。約30mlの上清液を滅菌Ti 60 遠沈管に小分けし、そして40mlのトリスpH9.0,５ mMのEGTA，200mM のKCl，30mM のMgCl₂，1.8Ｍのスクロース、５mMのβ−メルカプトエタノールを含む溶液７mlを下に敷く。これらのチューブを頂部に至るまで抽出用バッファーで満たし、そして60,000rpm で４時間４℃でTi 60 ローターにおいて回転させる。遠心後、その上清液をアスピレート除去し、そして0.5mlの再懸濁用バッファー（40mMのトリス pH9.0,５mMのEGTA，200mM の KCl，30mM のMgCl₂,５mMのβ−メルカプトエタノール）を各チューブに加える。これらのチューブを氷の上に30分置き、その後そのペレットをよく再懸濁し、そしてプールする。次にその上清液を 120ｇで10分遠心して不溶性物質を除去する。20mMのトリス pH7.6，200mMのEDTA，２％のＮ−ラウリル−サルコシネート中の一容量の自己消化した１mg／mlのプロティナーゼＫをその上清液に加え、そしてその混合物を室温で30分インキュベートする。 RNA を１／10容量の酢酸ナトリウム及び２容量のエタノールを加えることにより沈殿させる。−20℃で数時間後、RNA を４℃で12,000ｇでの30分の遠心によりペレット化する。そのペレットを10mlのTEバッファー（10mMのトリス、１mMのED TA）に再懸濁し、そして等容量のトリス pH7.5飽和フェノールで抽出する。相を10,000ｇで20分、４℃で遠心することにより分離させる。その水性相を除き、そして有機相を１容量のTEバッファーで再抽出する。次いでその水性相をプールし、そして１容量のクロロホルムで抽出する。これらの相を再び遠心により分け、そしてその水性相を前記の通りに沈殿させてポリリボソームRNA を得る。ポリリボソームRNA 調製品中の多糖類夾雑物を、そのRNA をセルロースカラム (Sigma-cell 50)に高塩バッファー(0.5ＭのNaCl，20mMのトリス pH7.5,１mMの EDTA,0.1％のSDS)で流すことにより除去する。夾雑物はカラムに結合し、そして RNA は溶離液に集まる。その溶離画分をプールし、そしてRNA をエタノール沈殿させる。沈殿させた全RNA を小容量に再懸濁し、そしてオリゴｄ（Ｔ）セルロースカラムに載せてポリアデニル化RNA を単離する。Ｂ．プラスミドベクターの中でのcDNAライブラリーの構築市販のクローニングベクターBluescribe M13- (Stratagene Cloning Systems ；San Diego，CA)に由来し、そして下記の通りに作ったプラスミドクローニングベクターpCGN 1703 の中にcDNAライブラリーを構築するためにポリアデニル化RNA を使用する。BluescribeM13−のポリリンカーをBam HＩによる消化、マングビーン（mung bean）エンドヌクレアーゼによる処理及びブラント末端ライゲーションによって改変し、BamHＩ欠失型プラスミドpCGN 170 0にする。pCGN 1700 をEcoRＩ及び SstＩ（隣り合う制限部位）で消化し、次いでBamHＩ,PstＩ,XbaＩ,ApaＩ及び SmaＩにとっての制限部位、AATTの５′突き出し及びTCGAの３′突き出しを有する合成リンカーとアニールさせる。pCGN 1700 へのリンカーの挿入はEcoRＩ部位を排除し、Bluescribeにおいて見い出せる Sst Ｉ（本明細書は時折り「SacＩ」とも呼ぶ）を再生させ、そしてそのリンカー上に含まれている新たな制限部位を付加する。得られるプラスミドpCGN 1702 をHi ndIIIで消化し、そしてクレノウフラグメントでブラント末端化する。その線形D NA を PvuIIで部分消化し、そして希薄溶液中でT4 DNAリガーゼとライゲートさせる。lac プロモーター領域の欠失した形質転換体を選定し (pCGN 1703)、そしてプラスミドクローニングベクターとして用いる。要約すると、cDNA合成用のクローニングは方法は以下の通りである。プラスミドクローニングベクターを SstＩで消化し、そして末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、得られる３′突き出し接着末端の上にホモポリマーＴ−テールを作り上げる。このテール付きプラスミドをオリゴ（dA）−セルロースクロマトグラフィーにより未消化又はテール無しプラスミドから分離させる。得られるベクターは、ベクタープラスミドの両端に共有結合しているcDNA第一鎖の合成のためのプライマーを担う。cDNA−mRNA−ベクター複合体をデオキシグアノシン三リン酸の存在下で末端トランスフェラーゼにより処理し、cDNA鎖の先端にＧ−テールを作り上げる。BamHＩ部位の隣りの追加のcDNA−mRNA複合体をBamHＩ消化により除き、一端に BamHＩ接着末端を、そして他端にＧ−テールを有するcDNA−mRNA−ベクター複合体が残る。この複合体を、５′BamHＩ接着末端、制限酵素NotＩ，EcoRＩ及びSst Ｉにとっての認識配列、並びに３′Ｃ−テール末端を有するアニール化合成サイクリングリンカーを用いて環化する。リゲーション及び修復後、その環状複合体を大腸菌株 DH5α (BRL，Gaithersburg，MD)に形質転換させ、cDNAライブラリーを作り上げる。ホホバ胚cDNAバンクは、約500塩基対の平均cDNAインサートサイズを有するクローンを約1.5×10⁶個含む。Ｃ．ラムダベクターの中でのcDNAライブラリーの構築ホホバポリアデニル化RNA はクローニングベクター１ ZAPII／EcoRＩ (Strata gene，San Diego，CA)の中でcDNAライブラリーを構築するためにも用いる。このライブラリーはその製造者により供給されているプロトコール、DNA及び細菌株を用いて構築する。クローンはGigapack Gold パッケージング抽出物（Stratage ne）を用いてパッケージングする（これも製造者の推奨に従う）。このようにして構築したcDNAライブラリーは、約 400塩基対の平均cDNAインサートサイズを有するクローンを約１×10⁶個含む。Ｄ．リダクターゼcDNAの単離 pCGN 1703 細菌ベクター中のホホバライブラリーをスクリーニングするために、リダクターゼペプチド配列よりデザインしたプライマーによるPCR 技術を、リダクターゼ核酸配列の約１kbの部分を作り上げるのに用いる。このライブラリーを例えばManiatisら（前掲）に記載の如くの当業界に公知の技術を利用してスクリーニングする。56kDのリダクターゼタンパク質にとってのクローンpCGN 7571 を獲得し、そしてDN A 配列を決定する。pCGN 7571 の核酸及び推定アミノ酸配列（SEQ ID N0：19）を図１に示す。Ｅ．大腸菌中でのリダクターゼcDNAの発現 pCGN 7571 をインビトロ突然変異誘発せしめてリダクターゼコード配列の最初のATG に NdeＩ部位を導入し、そしてこの NdeＩ部位のすぐ上流に BglII部位を導入する。BamHＩリンカーをリダクターゼコード領域の下流の SphＩ部位に導入する。この 1.5kbの BglII−BamHＩフラグメントをゲル精製し、そして BglII− BamHＩ消化pCGN 3686にクローニングし（以下参照）、pCGN 7582を得る。 pCGN 3686 はBluescript KS+（Stratagene Cloning Systems；San Diego，CA ）由来のクローニングベクターであるが、しかしクロラムフェニコール耐性遺伝子及び改変リンカー領域を有する。クロラムフェニコール耐性遺伝子の起源、pC GN 565はpUC 12-cm（K．Buckley Ph．D．Thesis，Regulation and expression o f the phi X174 lysis gene，University of California，San Diego，1985）を基礎とするクローニングベクターであるが、しかしpUC リンカー（Yanisch-Perr onら、Gene（1985）53：103-119）を含む。pCGN 565を HhaＩで消化し、そしてクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むフラグメントを切り出し、マングビーンヌクレアーゼを利用してブラント化し、そしてBluescript KS-（Stratagene：La Jolla，CA）のEcoRＶ部位に挿入しpCGN 2008 を作り上げる。pCGN 2008 のクロラムフェニコール耐性遺伝子をEcoRＩ／HindIII消化により取り出す。その末端をブラント化するためにクレノウ酵素で処理した後、そのフラグメントを DraＩ消化Bluescript KS+にライゲートする。アンピシリン耐性遺伝子の代わりにクロラムフェニコール耐性を含むDraＩフラグメントを有するクローンを選定し、そしてpCGN 2015と命名する。pCGN 2015 のリンカー領域を、以下の制限消化部位を lac Ｚリンカー領域において５′から３′にかけて含むpCGN 3686とするように改変させる：PstＩ,BglII,XhoＩ，HincIII,SalＩ，HindIII，EcoRＶ，EcoRＩ,Ps tＩ,SmaＩ，BamHＩ,SpeＩ,XbaＩ及び SacＩ。このリダクターゼ遺伝子の下流のBamHＩ部位はpCGN 7582 の構築中にこわされてしまうため、BamHＩリンカーをpCGN 7582 の中にそのリダクターゼ遺伝子の下流の XhaＩベクター部位に挿入し、そしてリダクターゼ遺伝子を含む NdeＩ−Ba mHＩフラグメントをBamHＩ− NdeＩ消化pET3A（Studierら（1990）Methods Enzy mol．185：60-89）にクローンする。このプラスミドをpCGN 7800 と命名する。p CGN 7800を、誘導性プロモーターのコントロール下においてT7 RNAポリメラーゼを有する大腸菌 BL21（Stndierら、前掲）に形質転換させる。リダクターゼ構築体を含むBL21大腸菌細胞BL21（pCGN 7800）を、pET3A ベクターのみを有するコントロールBL21細胞と比較する。培養物を40μｇ／mlのカルベニシリンを有するECLBの中で一夜増殖させ、40μｇ／mlのカルベニシリンを有する新鮮なECLBの中で１／10に希釈し、そして１時間増殖させる。IPTGを１mMになるように加え、そしてその細胞を回収前に更に３時間増殖させる。その細胞を遠心により回収し、そして細胞ペレットを−70℃で保存する。細胞をフレンチプレスの中で破砕し、そしてタンパク質抽出物を実施例1Cに記載のリダクターゼアッセイを利用してリダクターゼ活性をアッセイする。ただし、NADPH の濃度は２ mMから５mMに高めておく。このアッセイ生成物を実施例1Dに記載の通りにしてアッセイする。BL21 (pCGN 7800)細胞抽出物のアッセイ生成物の薄層クロマトグラフィー (TLC)分析はアルコール形成を示し、一方BL21 (pET3A)コントロール細胞由来の抽出物はアルコール形成を触媒しない。更に、BL 21 (pCGN 7800)及びBL21 (pET3A)細胞のSDS PAGE分析は、56kDのタンパク質がBL 21 (pCGN 7800)細胞の中に存在しており、そしてBL21 (pET3A)細胞にはないことを示す。リダクターゼ発現大腸菌細胞がアルコールを生成するかを調べるため、BL21 ( pCGN 7800)細胞及びコントロール細胞から全脂質を、ヘキサン：イソプロパノール（３：２）抽出法（シューカー上で一夜）により抽出する。その有機相を乾くまでエバポレートし、そして脂質を小容量のヘキサンに溶かし、TLC により分析し、そしてヨウ素染色により可視化させる。この分析は、BL21 (pCGN 7800)細胞から抽出された脂質はアルコールを含み、一方コントロール細胞から抽出された脂質は含まないことを示す。 BL21 (pCGN 7800)細胞において生成されるアルコールの炭素鎖の長さを調べるため、アルコールバンドをTLC プレートからかき取り、そして逆相TLC 及びガスクロマトグラフィー（GC）により分析する。GC分析はPinaら（Lipids（1987）22 ：358-361）に記載の通りにして、30ｍのSUPELCOWAX（商標）10 (Supelco，Inc ；Bellefonte，PA)溶融キャピラリーカラム（内径0.32mm；フィルムの厚み0.2mm ）を用いて行う。プログラムのパラメーターは下記の通りにする：190℃で15分、続いて１分当り５°づつの温度上昇により250℃にし、250℃に３分保つ。このようにして、ホホバリダクターゼの発現の結果としての16：０及び18：１のアルコールが、大腸菌の中で生成される主要アルコールであることが決定された。蝋は脂肪アルコール基質に対して活性である内因性蝋合成活性を含まないことが明らかな形質転換大腸菌においては検出されない。実施例６−植物発現のための構築体Ａ．発現カセット種子組織において優先的に発現される遺伝子に由来する５′及び３′調節領域を含む発現カセットは、例えばWO 92/03564 号に記載の通りにして、ナピン、Bce ４及びACP 遺伝子から調製できうる。例えば、ナピン発現カセットは以下のようにして調製できうる。蝋シンターゼ又はリダクターゼ遺伝子の発現のために利用できうるナピン発現カセットpCGN 1 808 は、引用することで本明細書に組入れるKridl ら (Seed Science Research （1991）１：209-219)に記載されている。他方、pCGN 1808は、バイナリベクター、例えばpCGN 1557に対する発現配列のみの移動を可能とし、抗生物質耐性マーカーの移動はできない隣接制限酵素切断部位を含むように改変してよい。KpnＩ,NotＩ及びHindIII制限酵素切断部位を含む合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、そしてpCGN 1808 の固有HindIII部位に、一つのHindIII部位のみが回復するようにライゲートさせる。得られるプラスミドpCGN 3200 は、配列分析による確認に従い、ナピン３′−調節配列の３ ′末端におけるHindIII,NotＩ及び KpnＩ制限酵素切断部位を含んでいる。ナピン発現カセットの主要部をpCGN 3200から、HindIII及び SacＩにより消化し、HindIII及び SacＩ消化pIC19R (Marsh ら（1984）Gene 32：481-485)にライゲーションさせることによりサブクローニングしてpCGN 3212 を作る。このナピンプロモーター領域の最端５′−配列は、鋳型としてのpCGN 3200、並びに Sac Ｉ部位及びナピン５′−プロモーターとpCGN 1808 構築体に由来するpCGN 3200 のpUC 骨格との接合部に隣接する２種のプライマーを用いるPCR により再構築させる。順方向プライマーは ClaＩ，HindIII,NotＩ及びKpnＩ制限部位並びにナピン５′−配列のヌクレオチド408-423(EcoRＶ部位から) を含み、そして逆方向プライマーは５′−プロモーターの中に固有 SacＩ部位を含むナピン配列718-739 に対する相補配列（complement）を含む。PCR はPerkin Elmer／Cetus サーモサイクラーを用い、その製造者の仕様に従って行う。PCR フラグメントをブラント末端化フラグメントとしてpUC8 (Vieira and Messing（1982）Gene 19：259-268)にサブクローニングし、そしてHindIIで消化してpCGN 3217 を得る。ナピンインサートを含むpCGN 3217の配列は、不適切なヌクレオチドがPCR により導入されなかったことを確証せしめる。pCGN 3217 中のナピン５′配列をナピン発現カセットの残りの部分に、ClaＩ及び SacＩによる消化並びに ClaＩ及び SacＩにより消化したp CGN 3212 へのライゲーションによってライゲートさせる。得られる発現カセットpCGN 3221 をHindIIIで消化し、そしてそのナピン発現配列をゲルより精製し、そしてHindIIIで消化したpIC20H（Marsh 前掲）にライゲートさせる。最終発現カセットはpCGN 3223 であり、それはアンピシリン耐性バックグランドの中に pCGN 1808 において見い出せるものと本質的に同一の1.725ナピン５′及び1.265 ３′調節配列を含んでいる。その調節領域はHindIII,NotＩ及び KpnＩ制限酵素切断部位と隣接しており、そして固有 SalＩ,BglII,PstＩ及び XhoＩクローニング部位は５′及び３′非コード領域の間に位置している。同様にして、オレオシン遺伝子由来の５′及び３′領域のコントロール下にある転写調節についての配列のクローニング用のカセットを調製することができうる。ブラシカナプス（Brassica napus）オレシン遺伝子の配列がLee and Huang （Plant Phys．（1991）96：1395-1397）により報告されている。公開の配列に対するプライマーを、ブラシカナプスcv．Westar由来のオレオシン遺伝子の５′ 及び３′調節領域を獲得するためにPCR 反応に用いる。２通りのPCR反応を行い、一方はオレオシン遺伝子にとってのATG 開始コドンの上流約 950ヌクレオチドを増幅し、そして他方はオレオシン遺伝子にとってのTAA 停止コドン及びその下流の約 600bpのPCR 増幅する。これらのPC R 生成物をプラスミドベクターpAMP１ (BRL)に製造者のプロトコールに従ってクローンした。オレオシン５′隣接する領域を含むプラスミドpCGN 7629 及び３′ 隣接する領域を含むpCGN 7630 を得る。PCR プライマーは５′及び３′隣接する領域を一緒に発現カセットの中にクローニングするための慣用制限酵素切断部位を含む。pCGN 7629 由来の５′隣接する領域を含む PstＩフラグメントを PstＩ消化pCGN 7630 にクローンし、プラスミドpCGN 7634を得る。オレオシン発現カセット全体を含む、pCGN 7634 由来のBssHＩ (New England BioLabs)フラグメントをBssHＩ消化 pBCSK＋（Stratagene）にクローニングしてプラスミドpCGN 763 6 の中にオレオシンカセットを供する。pCGN 7636 中のオレオシンカセットの配列を図４に提供する。このオレオシンカセットにはBssHＩ， KpnＩ及び XbaＩ制限酵素切断部位が隣接しており、そして５′及び３′オレオシン領域の間に蝋シンターゼ、リダクターゼ又はその他課題のDNA 配列を挿入するための SalＩ， BamHＩ及びPstＩ部位を含む。遺伝配列をかかるカセットに挿入して、植物形質転換方法のための発現カセットを提供する。例えば、かかる構築体は下記のようにしてアグロバクテリア媒介型形質転換のためにバイナリーベクターの中に挿入してよい。Ｂ．植物形質転換のためのベクターバイナリーベクターをpCGN 1578，pCGN 1559及びその他のベクターから、McBr ide ら（前掲）に記載の通りにして、pCGN 1578 及びpCGN 1559リンカー領域を、以下の制限酵素切断部位： Asp 718/ AscＩ/PacＩ/XbaＩ/ BamHＩ/SwaＩ/Sse 8387（PstＩ）/ HindIIIを含むリンカー領域に置き換えることにより調製する。これはpCGN 1578 PASS又はpCGN 1559 PASS及び似たようにデザインされたその他の改変ベクターをもたらす。AscＩ,PacＩ,SwaＩ及びSse 8387は８塩基の制限酵素認識部位を有する。これらの酵素はNew England BioLabs（AscＩ,PacＩ）；Boeh ringer Mannheim（Swai）；及びTakara（日本）（Sse 8387）より入手できる。Ｃ．植物形質転換のためのリダクターゼ構築ナピン遺伝子由来の５′及び３′調節領域を用いての植物細胞におけるリダクターゼの発現のための構築体を以下のようにして調製する。 pCGN 7571 と命名したリダクターゼcDNA（上記のpCGN 1703ベクターの中にある）を SphＩで消化し（塩基1594-1599 にある３′未翻訳配列における部位）、そして SalＩリンカーをこの部位に挿入する。得られるプラスミドをBamHＩ及び SalＩで消化し、そしてこのリダクターゼcDNAを含むフラグメントをゲルより精製し、そしてBglII/XhoＩ消化した上記のナピンカセットpCGN 3223 にクローニングしてpCGN 7585 を得る。ナピン５′／リダクターゼ／ナピン３′を含むpCGN 7585 のHindIIIフラグメントをHindIII消化したpCGN 1578（McBride and Summerfelt 前掲）にクローニングし、植物形質転換のためのバイナリーベクターpCGN 7586 を得る。ナピンプロモーターの発現下にあるホホバリダクターゼ遺伝子をも含む植物形質転換用構築体pCGN 7589 は以下のようにして調製する。 pCGN 7571 をインビトロ突然変異誘発させて NdeＩ部位をリダクターゼコード配列の第一ATG に、そして BglII部位を NdeＩ部位のすぐ上流に導入する。BamH Ｉリンカーをリダクターゼコード領域の下流の SphＩ部位に導入する。1.5kbのB glII−BamHＩフラグメントをゲルより精製し、そして BglII−BamHＩ消化したpCGN 3686 にクローニングして（以下参照のこと）、pCGN 7582 を得る。 pCGN 3686 はBluescript KS+（Stratagene Cloning Systems；San Diego，CA ）由来のクローニングベクターであるが、しかしクロラムフェニコール耐性遺伝子及び改変リンカー領域を有する。クロラムフェニコール耐性遣伝子の起源、pC GN 565はpUC 12-cm（K．Buckley Ph．D．Thesis，Regulation and expression o f the phi X174 lysis gene，University of California，SanDiego，1985）を基礎とするクローニングベクターであるが、しかしpUC 18リンカー（Yanisch-Pe rronら、Gene（1985）53：103-119）を含む。pCGN 565を HhaＩで消化し、そしてクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むフラグメントを切り出し、マングビーンヌクレアーゼを利用して平滑末端化し、そしてBluescript KS- (Stratagene： La Jolla，CA)のEcoRＶ部位に挿入しpCGN 2008 を作り上げる。pCGN 2008のクロラムフェニコール耐性遺伝子をEcoRＩ／HindIII消化により取り出す。その末端を平滑末端化するためにクレノウ酵素で処理した後、そのフラグメントを DraＩ消化Bluescript KS+にライゲートする。アンピシリン耐性の代わりにクロラムフェニコール耐性を含む DraＩフラグメントを有するクローンを選定し、そしてpC GN 2015 と命名する。pCGN 2015 のリンカー領域を、以下の制限酵素切断部位を lac Ｚリンカー領域において５′から３′にかけて含むpCGN 3686とするように改変させる：PstＩ,BglII,XhoＩ，HindIII,SalＩ，HindIII，EcoRＶ，EcoRＩ,Ps tＩ,SmaＩ，BamHＩ,SpeＩ,XbaＩ及びSacＩ。 XhoＩリンカーをpCGN 7582 の XbaＩ部位に挿入する。リダクターゼ遺伝子を含む BglII−XhoＩフラグメントを単離し、そしてBglII−XhoＩ消化pCGN 3223 にクローニングする。ホホバ遺伝子由来の５′非翻訳リーダー配列を欠く得られるプラスミドをpCGN 7802 と命名する。pCGN 7802 由来のナピン／リダクターゼフラグメントをHindIIIにより切り出し、そしてHindIII消化pCGN 1578 にクローニングしてpCGN 7589 を得る。別のナピン／リダクターゼ構築体を以下のようにして調製する。リダクターゼ cDNA pCGN 7571（図１）を突然変異させてSalＩ部位をATG 開始コドンに対して５′側に（その部位はATG に対して８塩基対５′側にある）及びTAA 翻訳停止コドンのすぐ３′側に挿入し、pCGN 7631 を得る。pCGN 7631 をSalＩで消化し、そしてリダクターゼをコードする配列を含む約 1.5kbのフラグメントを SalＩ/X hoＩで消化したナピンカセットpCGN 3223 にクローニングする。センス方向でリダクターゼ配列を含む得られるプラスミドをpCGN 7640と命名する。pCGN 7640 をHindIIIで消化し、そしてオレオシン／リダクターゼ構築体を含むフラグメントをHindIIIで消化したバイナリーベクターpCGN 1559 PASSにクローニングし、バイナリー構築体pCGN 7642を得る。オレオシン調節領域のコントロール下にあるリダクターゼ発現のための構築体は以下のようにして調製する。リダクターゼをコードする配列を SalＩによるpC GN 7631 の消化により獲得し、そして SalＩ消化したオレオシンカセットpCGN 7 636 にリゲートさせる。センス方向にリダクターゼ配列を含む得られるプラスミドをpCGN 7641 と命名する。pCGN 7641 を XbaＩで消化し、そしてオレオシン／リダクターゼ構築体を含むフラグメントを XbaＩで消化したバイナリーベクター pCGN 1559 PASSにクローニングし、バイナリー構築体pCGN 7643を得る。Ｄ．リダクターゼ遺伝子の再合成ホホバリダクターゼ遺伝子を、そのAT含有率を低下させ、57.5％から約51％のレベルにまで下げるために再合成した。これはタンパク質のアミノ酸組成（図２）を改変することなく成し遂げられ、そして全体にわたって比較的均質なAT含有量を有する配列をもたらす。再合成前のホホバをコードする配列は 75％に近いAT含有率の局在領域を有する。遺伝子再合成はBambot and Russell ( Bamot，S．B．and Russell，A．J．（1993）PCR methods and applications ２：266-271)のプロトコールにより実施し、そして再合成遺伝子を含むプラスミドはpCGN 7675 と命名した。 pCGN 7675 由来の再合成リダクターゼの XhaＩ−BamHＩフラグメントを、Sal Ｉ及びBamHＩによる消化を経たオレオシンカセットpCGN 7636（前記）にクローニングした。このオレオシン−リダクターゼ遺伝子融合体を、ASP718を用いて植物形質転換用ベクターpCGN 1559 PASSにクローニングして。pCGN 7677 を作った。従って、プラスミドpCGN 7677 は、PCGN 7643 由来のホホバアシル−CoA リダクターゼ遺伝子が低めのAT含有率の合成遺伝子により置き換えられていることを除き、pCGN 7643 と本質的に同一である。これと同じフラグメントを、SalＩ及び BglIIの消化を経たpCGN 3223 のナピンカセットにもクローニングした。次いでこのナピン−リダクターゼ遺伝子融合体をASP718消化により植物形質転換用ベクターpCGN 1559 PASSにクローニングして、pCGN 7698 を作った。プラスミドpCGN 7698 は、pCGN 7642 由来のホホバアシル−CoA リダクターゼ遺伝子のみが低めのAT含有率を有する合成遺伝子により置き換えられていることを除き、pCGN 7642 と本質的に同一である。アグロバクテリア細胞、例えばEHA 101株（Hoodら、J．Bacteriol．（1986）1 68：1291-1301）を、Holstersら (Mol．Gen．Genet．（1978）163：181-187)の方法によりバイナリーベクター構築体で形質転換し、そして以下の植物形質転換方法に利用する。実施例７−蝋合成活性についてのアッセイ蝋シンターゼ又は蝋合成能についてアッセイするための方法を述べる。Ａ．放射性ラベル化材料蝋シンターゼアッセイにおいて一般的に利用されている基質〔１−¹⁴Ｃ〕パルミトイル−CoA をAmersham（Arlington Heights，IL）より購入する。その他の長鎖の基質と、鎖長特異性研究を行うために合成した。長鎖〔１−¹⁴Ｃ〕脂肪酸（比活性51〜56Ci／mole）、即ち11−cis−エイコセン酸、13−cis−ドコセン酸及び15−cis−テトラコセン酸は、〔¹⁴Ｃ〕シアン化カリウムと対応のアルコールメシレートとの反応、それに続くアルコールニトリルの遊離脂肪酸に至る塩基性加水分解により、調製する。この遊離脂肪酸をエーテル系ジアゾメタンによりそのメチルエステルに変換させ、そして調製硝酸銀薄層クロマトグラフィー (TL C)により精製する。その脂肪酸メチルエステルを遊離脂肪酸へと加水分解で戻す。放射性化学純度は３通りのTLC 法により評価する：ノーマル相シリカTLC、硝酸銀TLC 及びＣ18逆相TLC。これらの方法により測定された放射性化学純度は92 〜98％であった。長鎖〔１−¹⁴Ｃ〕アシル−CoA を対応の〔１−¹⁴Ｃ〕遊離脂肪酸から、Young and Lynen の方法（J．Bio．Chem．（1969）244：377）により、 10Ci／moleの比活性に至るように調製する。〔１−¹⁴Ｃ〕ヘキサデカナールはPl etcher and Tate の方法 (Tet．Lett．（1978）1601-1602)の小スケール改良法に従って、〔１−¹⁴Ｃ〕ヘキサデカン−１−オールのジクロメート酸化により調製する。その生成物を調製シリカTLC により精製し、そしてヘキサン溶液として −70℃で使用時まで保存する。Ｂ．蝋シンターゼ活性のアッセイ蝋シンターゼ活性は、40μＭの〔１−¹⁴Ｃ〕アシル−CoA(通常のパルミトイル −CoA；比活性5.1〜5.6mCi／mol)の、200mMのオレイルアルコール及びアッセイすべきサンプルとの全容量0.25mlでのインキュベーションにより測定する。そのインキュベーション混合物は20％ｗ／ｖのグリセロール、１mMのDTT，0.5Ｍの NaClも含み、そして25mMのHEPES（４−〔２−ヒドロキシエチル〕−１−ピペラジンエタン−スルホン酸）で緩衝化されている。ここで及び以降において、HEPE S はpH7.5 に調整した１Ｍのストック溶液より添加する。基質混合物をガラスバイアルの中で調製し、使用直前にオレイルアルコールを加え、そしてサンプルに加える。インキュベーションは30℃で１時間行う。アッセイはアッセイチューブを氷の上に載せ、そして直ちに0.25mlのイソプロパノール：酢酸（４：１，ｖ／ｖ）を加えることにより停止させる。未ラベルの蝋エステル(0.1mg)及びオレイルアルコール (0.1mg)を担体として加える。〔¹⁴Ｃ〕脂質をHara及びRadin のスケールダウンプロトコール（Anal．Biochem．（1978）9 0：420）により抽出する。４mlのヘキサン／イソプロパノール（３：２，ｖ／ｖ）を終了アッセイに加える。そのサンプルをボルテックスにかけ、２mlの水性硫酸ナトリウム溶液(6.6％ｗ／ｖ)を加え、そしてそのサンプルを再びボルテックスにかける。Ｃ．アッセイ生成物の分析蝋シンターゼアッセイの生成物を以下の通りにして分析する。硫酸ナトリウムの添加及びサンプルのボルテックスの後、所定の割合の有機相を取り出し、そして液体シンチレーションカウンティングを介して計測する。次いで有機相の別の部を取り出し、窒素のもとで乾かし、ヘキサンの中に再溶解させる。脂質クラス分析のため、そのサンプルシリカTLC プレートに載せ、そしてそのプレートをヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（80：20：１ｖ／ｖ／ｖ）の中で展開させる。脂質クラス、大半の蝋エステル、遊離脂肪酸、脂肪アルコール及び起源にある極性脂質間の放射能分布をAMBIS 放射能分析用イメージングシステム(AMBIS Systems Inc.，San Diego，CA)を利用して測定する。必要ならば、個々の脂質クラスを更なる分析のためにTLC プレートから回収してよい。Ｄ．基質特異性様々な炭素鎖長及び不飽和度を有するアシル−CoA 及びアルコール基質を蝋シンターゼ活性を有するミクロソーム膜画分に加え、ホホバ蝋シンターゼにより認識される基質域を決定した。蝋シンターゼ活性は実施例１に記載の通りにして、アシル特異性を80mMのアシル−CoA 基質及び 100mMの放射性ラベル化オレイルアルコールを用いて測定することで測定した。アルコール特異性は100mMのアルコール基質及び40mMの放射性ラベル化エイコセノイル−CoA を用いて測定した。これらの実験の結果を以下の表４に示す。上記の結果は、ホホバ蝋シンターゼが広域にわたる脂肪アシル−CoA 及び脂肪アルコール基質を利用することを実証する。更に、様々なチオエステル基質に対する蝋シンターゼ活性をパルミトイル−Co A、パルミトイル−ACP 及びＮ−アセチル−Ｓ−パルミトイルシステアミンをアシル基質として用いて同様に試験した。最大の活性はアシル−CoA 基質で認めれた。有意な活性（アシル−CoA のそれの〜10％）がアシル−ACP で認められたが、Ｎ−アセチル−Ｓ−パルミトイルシステアミン基質では活性は検出されなかった。実施例８−植物形質転換方法課題のDNA 配列を植物宿主のゲノムに挿入してその配列の転写又は転写と翻訳を獲得し、表現型変化を起こさせる様々な方法が開発されている。アブラナ属の形質転換高エルカ酸種子、例えば栽培品種レストン又はブラシカナプスのカノラ型変種を95％のエタノールの中に２分浸漬する。表面を１滴のTween 20を含む次亜塩素酸ナトリウムの１％の溶液の中で45分滅菌し、次いで滅菌蒸留水で３回すすぐ。次いで種子を、ピリオドキシン（50μｇ／ｌ）、ニコチン酸（50μｇ／ｌ）、グリシン（200μｇ／ｌ）及び0.6％のPhytagar（Gibco） p5.8 の添加された１／1 0の濃度のムラシゲ最少有機系培地（Gibco；Grand Island，NY）を有するMagent a ボックスの中で培養する。種子をPercivalチャンバーの中で22℃において、１秒につき平方メートル当り約65μ Einstein(μEm^-2Ｓ^-1) の強度の低温蛍光及び赤色光の16時間の照光時間のもとで発芽させる。胚軸を５〜７日目の実生から切り取り、長さ約４mmの断片へと切り、そしてフィーダープレートの上にまく（Horschら、Science（1985）227：1229-1231）。フィーダープレートは使用１日前に、1.0mlのタバコ懸濁培養物を約30ml MS 塩ベース(Carolina Biological，Burlington，NC)、100mg／ｌのイノシトール、1. 3mg／ｌのチアミン−HCl,３％のスクロース、２，４−Ｄ（1.0mg／ｌ）を伴う20 0mgのKH₂PO₄,0.6％ｗ／ｖのPhytagar（オートクレーブにかける前に 5.8にpH を合わせてある）（MS ０／１／０培地）を含むペトリ皿(100×25mm)上にまくことにより調製する。滅菌濾紙ディスク（Whatman ３mm）を使用前のフィーダー層の上に載せる。タバコ懸濁培養物は、10m1の培養物を、２，４−Ｄ(0.2mg／ｌ )、キネチン(0.1mg／ｌ)を有するフィーダープレートについて述べた 100ml の新鮮MS培地の中に移すことによって毎週継代培養する。フィーダー細胞を使用しない実験においては、胚軸外植体を切り取り、そしてMS ０／１／０培地の上の濾紙ディスクの上に載せる。胚軸外植体は全てフィーダープレート上で24時間、22℃において30μEm^-2Ｓ^-1〜65μEm^-2Ｓ^-1の強度の連続光を伴ってプレインキュベートしておく。所望の遺伝子構築体を有するバイナリープラスミドを含むＡ．トゥメファシエンス（A．tumefaciens）株 EHA 101の独立コロニーを５mlのMG／Ｌ培養液に移し、そして30℃で一夜増殖させる。胚軸外植体を１×10⁸個の細菌／mlに希釈しておいた細菌を有する７〜12mlのMG／Ｌ培養液の中に浸し、そして10〜25分後、フィーダープレートの上に載せる。MG／Ｌ培養液はリットル当り５ｇのマンニトール、１ｇのＬ−グルタミン酸又は1.15ｇのグルタミン酸ナトリウム、0.25ｇのKH₂ PO₄，0.10ｇのNaCl，0.10ｇのMgSO₄・７H₂O，１mgのビオチン、５ｇのトリプトン及び2.5ｇの酵母抽出物を含み、そしてこの培養液はpH7.0 に調整してある。アグロバクテリアと一緒に48時間インキュベートした後、胚軸外植体を、濾過除菌したカルベニシリン(500mg／ｌ；オートクレーブ後に添加)及び25mg／ｌの濃度の硫酸カナマイシン（Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN）を含むB5 ０／１／０カルス誘導培地に移す。 65μEm^-2Ｓ^-1の連続光のもとで３〜７日間培養後、カルス組織が切断面の上に見えるようになり、そして胚軸外植体をシュート誘導培地B5BZ（３mg／ｌのベンジルアミノプリン、１mg／ｌのゼアチン、１％のスクロース、0.6％のPhytagar が添加され、そしてpHが 5.8に合わせてあるB5塩類及びビタミン類）に移す。この培地もカルベニシリン(500mg／ｌ)及び硫酸カナマイシン（25mg／ｌ）を含む。胚軸外植体は２週間毎に新鮮なシュート誘導培地に継代培養する。胚軸カルスからシュートが１〜３ヶ月後に再生する。高さ１cm以上の生きのよいシュートをカルスから切り取り、そしてB5塩類及びビタミン類、１％のシュークロース、カルベニシリン（300mg／ｌ）、硫酸カナマイシン（50mg／ｌ）及び0 .6％ｗ／ｖのPhytagarを含む培地の上にまく。２〜４週間後、生きのよいままである苗条を根元から切り、そして発根誘導培地（B5塩類及びビタミン類、１％のスクロース、２mg／ｌのインドール酪酸、50mg／ｌ硫酸カナマイシン及び 0.6 ％のPhytagar）を含むMagenta ボックスに移す。生きのよい発根したシュートをリダクターゼ活性について試験する。シロイヌナズナ属の形質転換遺伝子導入シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物はValverkensら(Pro c．Nat．Acad．Sci．（1988）85：5536-5540)に記載の通りにしてアグロバクテリア媒介形質転換により獲得し得る。構築体はアグロバクテリア細胞、例えばEH A 101 株(Hoodら、J．Bacteriol（1986）168：1291-1301)の細胞に、Holstersら (Mol．Gen．Genet．（1978）163：181-187)の方法によって形質転換する。ピーナッツの形質転換注目のDNA 配列は、少なくともプロモーター領域、注目のゲノム及び終止領域を含んで成る発現カセットとして、粒子ボンバードメント法を介して植物ゲノムの中に導入することができうる。要約すると、0.5mM〜３mMのサイズの範囲のタングステン又は金粒子に発現カセットのDNA をコートする。このDNA は水性混合物又はドライ DNA／粒子沈殿物の形態であってよい。ボンバードメイントにとっての標的として利用する組織は子葉外植体、シュート分裂組織、未熟葉又は葯に由来しうる。DNA コート粒子による組織の砲撃はBi olistics（商標）粒子ガン(Dupont；W ilmington，DE)を用いて実施する。粒子をバレルの中に、バレル口から１cm〜14 cmに範囲する様々な距離において入れる。砲撃すべき組織ストッピングプレートの下に置く；試験は20cmまでの距離において組織に対して行う。発射時、その組織はナイロンネットにより、又はナイロンネットと10mM〜300mM に範囲するメッシュとの組合せにより保護しておく。砲撃の後、植物をAtreyaら(Plant Science Letters（1984）34：379-383)の方法に従って再生させる。要約すると、胚軸組織又は子葉区画をMS培地（Murashig e and Skoog，Physio．Plant．（1962）15：473）（子葉区画のためのMSと 2.0m g／ｌの６−ベンジルアデニン（BA））の上にまき、そして暗所の中で１週間25 ±２℃でインキュベートし、次いで連続低温白色蛍光のもと(6.8ｗ／ｍ²)に移す。培養の10日目、苗木を滅菌土壌を含む鉢に移し、日影の下で３〜５日間保ち、そして最後に温室に移す。予測の遺伝子導入シュートが発根する。外性DNA の植物ゲノムへの組込みは当業者に公知の様々な方法によって確認できうる。実施例９−形質転換化植物の分析 pCGN 7586 ナピン／リダクターゼ構築体で形質転換されたシロイヌナズナ属植物由来の発育中の種子を実施例1Cに記載の通りにしてリダクターゼ活性について分析する。分析した15体の植物のうちの11体が、５〜30pmol/min/mg タンパク質に範囲する比活性のリダクターゼ酵素活性を有することが見い出された。ウェスタン分析は、遺伝子導入シロイヌナズナの胚に存在しているリダクターゼの量が総タンパク質の約0.01％であることを示した。形質転換植物を、本明細書に記載の通りにして脂肪アルコール及び蝋エステル成分を測定するためにアッセイする。かかる植物は上記のアグロバクテリア形質転換法により調製されうる。植物は、蝋エステルの存在について、例えばTLC による蝋エステルからのトリグリセリド類 (TAG)の分離によってアッセイできうる。得られる蝋を更に分析するためにGC分析を利用できうる。Ａ．形質転換植物のガスクロマトグラフィー（GC）分析未エステル化又は粗製油の含有物は一般のGCカラムを通過しなく、その理由は TAG 成分を燃焼させるためには高温を必要とするからである（約 350℃〜365℃ ）。例えばSUPELCOWAX（商標）10カラムは約 280℃の頂部温度域を有する。脂質をシロイヌナズナの成熟種子から抽出し、誘導化し（Browseら（1986）An al．Biochem．152：141-145）、そして上記の通りにしてアルコール含有量について分析する。これらの分析は、形質転換したシロイヌナズナ植物のうちの３体における20：１アルコールの存在を示す。コントロールのナタネ植物及びpCGN 7643 ナタネ植物由来の種子油を同様に、メタノール／H₂SO₄ において、以下の方法によりエステル交換させる。各植物由来の25個の種子をメタノール（５％）中の４mlのH₂SO₄ の中に80℃で90分インキュベートする。このインキュベート混合物に、１mlの 0.9％のNaCl及び１mlのヘキサンを加え、そしてその上部有機相を分析のために取り出す。SUPELCOWAX（商標）10カラム上でのガスクロマトグラフィー（GC）は、pCGN 7643サンプルが22 ：１アルコールを含み、一方非形質転換コントロール植物はそのアルコールを含まないことを示す。アルコールとしてのこのピークの同定はマススペクトロメーター（MS）を用いて確認される。 T2種子由来の粗製油も分析する。各植物由来の25個の種子を集め、そして２ml のヘキサンの中でホモジナイズする。その抽出物を濾過し、そしてCHROMPAK（商標）トリグリセリドカラムを用いて高温 GC分析を行う（約 370℃の最大温度）。このカラムはTAG 及び蝋の分析にとって適当である。蝋エステルとに相当する保持時間でのいくつかのピークがpCGN 764 3 サンプルにおいて検出されるが、しかし脂肪アルコールに相当するピークは認められない。蝋エステルピークは非形質転換コントロールサンプルには存在しない。最も主要たるピークは40：２蝋エステルに相当する保持時間を有する。エステル交換油中で唯一検出される脂肪アルコールは22：１アルコールであるため、この主要蝋エステルは22：１脂肪アルコールへとエステル化される18：１脂肪酸を含んで成るものと信じられる。メタノール／H₂SO₄ の中でエステル交換させた形質転換ナタネ油を更に分析するために高温GC分析プロトコールを利用する。蝋エステルピークはpCGN 7643 植物由来のエステル交換油の中には存在しない。これは予測でき、なぜならエステル交換は油の蝋成分から脂肪酸メチルエステル及びアルコールを生成せしめるからである。誘導化油の22：１脂肪アルコール成分は形質転換ナタネ植物の一部の種子において、重量による測定に従い、総脂質の約0.5％を占めると予測される成分として存在する。高温GC／MS分析をCHROMPAK（商標）トリグリセリドカラムを用い、ナタネ植物のT2種子油で行う。T2油のマスクロマトグラフィー（選定のイオンをモニターする）は遺伝子導入油中の38：２，40：２，42：２及び44：２蝋エステルの存在に相当する保持時間及び質量を有するピークを示した。これらのピークはコントロール油においては検出されなかった。pCGN 7643 植物由来の40：２蝋エステルピークのマススペクトルは、それが22：１アルコール及び18：１脂肪酸を含んで成ることを確証する。トリグリセリドカラムを利用する、pCGN 7643 植物のT3種子由来の油の高温GC 分析は、その遺伝子導入油が、T2種子油におけるGC／ MS分析の特徴の40：２蝋エステルピークを含むことを示す。この蝋エステルピークは非形質転換油においては検出されない。プラスミドpCGN 7677 を用いて作製した30体の遺伝子導入レストン植物からプールしたT2種子を油組成について分析した。この構築体で形質転換した植物のうちの半分における誘導化油は、pCGN 7643 により形質転換した最良の植物由来の油よりも高レベルのアルコールを示した。この最良植物はプールしたT2種子中で〜0.9％の脂肪アルコールを有し、一方、pCGN 7643 植物由来の最良のプールを種子油の組成では0.16％のアルコールであった。最大脂肪アルコール含有量を有するpCGN 7677 植物から、15個の半種子を分析した。半種子は遺伝子導入効果のより良い尺度であり、なぜならT2種子は分裂中の種子であり、それ故非発現性及びヘテロ接合種子、並びに遺伝子導入の特徴に関する種子ホモ接合体を含むからである。植物7677-R-15 及び7677-R-16 に由来する個々のT2半種子由来の誘導化油は最高のアルコールレベルを示した。これらの植物の個々の誘導化種子油において見い出せる脂質の 3.5％のほどが脂質アルコールである。蝋エステルの脂肪アルコール基質は蝋エステルの総重量の約半分を占めるため、蝋エステルは形質転換植物由来の油中の約７重量％に至るまでの成分として生成されうる。単一個のT2種子（7677-R-15-49）由来の油の高温GC分析は、38：１，38：２， 40：１，40：２，40：３，40：４，42：１，42：３，44：１，44：２及び44：３の考えられる組成を有する一連の蝋エステルの存在を示す（図３）。これらのうち、38：２，40：２，42：２及び44：２のみが有意義な量で存在している。表５はかかるGC分析の結果を提供し、蝋全体の％として示しているいくつかの個別の 7677-R-15 種子に由来する油の蝋成分中の蝋エステルの相対量を示している。多数の7677-R-15 半種子由来の油において、最も豊富な蝋エステルは、豊富さの順に挙げて、44：２，40：２、そして42：２である。一方、7643形質転換レストン植物に由来する油の中で見い出せる最も豊富な蝋エステルは40：２蝋エステルであった。7677-R-15 由来の一部の半種子においては、44：２蝋エステルは油の中で見い出せる蝋成分の60％より多くを占めていた。これは図３から見た油の高温GCグラフトレースにおいて劇的に実証されている。これらの7677-R-15 植物由来の油におけるプロフィールは、42：２蝋エステルが一般に蝋の47％を占め、そして44：２蝋エステル成分が油の約８％しか占めていないホホバにおいて見い出せる蝋エステルプロフィールからのかなりの相違を示す。主要蝋エステルとして44：２を含んで成る蝋組成物はホホバ油よりも勝る一定の利点を有するであろう。この主要蝋エステルの高めの分子量は遺伝子導入蝋組成物に高い融点、高い安定性及び剪断応力に対する高い安定性を与えるであろう。60％以上の44：２蝋エステルを有する油組成物は、高発現性T2植物由来の混合トリアシルグリセリド／蝋エステル油の分画により、対応の蝋及びトリアシルグリセリド成分への結晶化又は溶媒抽出法により、簡単に得られる。Ｂ．精製して蝋画分の分析ナタネ油サンプルの蝋を濃縮するため、及び油からトリグリセリドを排除するために調製薄層クロマトグラフィーを利用する。油サンプルをシリカ−Ｇ TLCプレート上に点着し、そしてヘキサン：酢酸エチル（95：５）で展開する。蝋バンドの位置はヨウ素染色により同定する。蝋画分をヘキサン：酢酸エチル（70：30 ）によりシリカ媒体から溶離させ、窒素ガスのもとで乾かし、そしてヘキサンの中に再懸濁させる。蝋画分を次にトリグリセリドカラムを用いて高温GCにより分析する。40：２蝋エステルピークはpCGN 7643 植物由来のサンプルの中に存在している最も豊冨な物質の一つであるが、しかし非形質転換コントロールサンプルの中には、存在しない。次にTLC 精製蝋をメタノール／H₂SO₄ でエステル交換する。高温GC分析は、蝋のピークがもはやサンプルの中に存在していないことを示す。これは予測され、なぜならエステル交換は蝋エステルから脂肪酸メチルエステル及びアルコールを生成せしめるであろうからである。 SUPELCOWAX（商標）10カラムを用いてのエステル交換蝋画分のGC 分析は、pCGN 7643 植物由来の遺伝子導入サンプルが主要22：１脂肪アルコールピークを含むことを示す。コントロールサンプル由来の画分は脂肪アルコールを含まない。 TLC 精製蝋を銀カラムHPLCによって分析した。pCGN 7643 遺伝子導入植物から抽出した油において、44：２，42：２，40：２及び38：２ホホバ蝋標準品と同一の保持時間で溶離するピークがある。これらのピークは非形質転換コントロール油の中にはない。ノーマル相TLC と銀HPLCとの組合せを7643油から40：２蝋エステルを精製するために用いた。この精製蝋エステルをエステル交換した。GC分析は、蝋エステルが18：１脂肪酸及び20：１脂肪アルコールを含んで成ることを示した。この精製サンプルに対する高温GC分析及び銀カラムHPLCは、遺伝子導入油から単離した蝋エステルを対照標準品と混合したとき、２種の化合物が単一ピークとして溶出することを示した。精製蝋エステルをIRスペクトル、NMR 及び高分解マススペクトルによっても分析した。IR及びNMR スペクトルを対照標準品のスペクトルと比較し、そして遺伝子導入油中の40：２蝋エステルの同一性を確認した。蝋エステルの高分解マススペクトルは、それが40：２蝋エステルについて予測される分子量及び分子式を有することを示した。上記の結果は、植物細胞であってそれに対して外来の配列から発現された脂肪アシルリダクターゼを有する植物細胞を増殖させる工程を含んで成る方法による、植物細胞の中で蝋エステルを生成する能力を実証する。ホホバリダクターゼ核酸配列により形質転換された長鎖蝋エステルを含む細胞を例示した。植物細胞においてその他の脂肪アルコール及び蝋を生成するためのその他のリダクターゼタンパク質及びコード配列を獲得するための方法を提供した。本明細書において挙げた公開物及び特許出願は全て、あたかも個々の公開物又は特許出願を本明細書に引用することにより組入れることを表示しているかの如く、本明細書に引用することで組入れる。明瞭化及び理解の目的で以上の発明を具体例及び実施例により多少詳しく説明してきたが、当業者は本発明の教示において、一定の変更及び改良を請求の範囲を逸脱することなく本発明に施すことができることを理解しているであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9359−4ＢＣ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｐ 7/64 9359−4ＢＣ１２Ｎ 9/04 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 9/04 9281−4Ｂ 5/00 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．天然ではホホバ脂肪アシルリダクターゼを生成しない植物細胞において蝋エステルを生産するための方法であって、その植物細胞の中で機能的な調節要素のコントロール下にあるホホバ脂肪アシルリダクターゼをコードする核酸配列を有する植物細胞を増殖させてホホバ脂肪アシルリダクターゼを生産することを含んで成る方法において、 55％未満のAT含有率を有する再合成核酸配列により前記リダクターゼを発現させるという改良を含んで成る方法。２．前記リダクターゼをコードする核酸配列が52％未満のAT含有率を有する、請求項１記載の方法。３．前記リダクターゼをコードする核酸配列が約51％のAT含有率を有する、請求項１記載の方法。４．前記コード配列が図２において示している再合成配列である、請求項３記載の方法。５．前記植物細胞が種子胚細胞である、請求項１記載の方法。６．前記細胞がアブラナ属の細胞である、請求項５記載の方法。７．請求項１記載の方法により生産された蝋エステルを含んで成る種子胚細胞。８．請求項７記載のアブラナ属の種子胚細胞。９．約 1.0重量％以上が蝋エステルである内在脂質貯蔵物を含んで成る、天然ではホホバ脂肪アシルリダクターゼを生成しない植物種子胚細胞。 10．前記内在脂質貯蔵物が約 5.0重量％より多くの蝋エステルを含んで成る、請求項９記載の細胞。 11．前記内在脂質貯蔵物が約 7.0重量％の蝋エステルを含んで成る、請求項10記載の細胞。 12．請求項９記載のアブラナ属の細胞。 13．前記蝋エステルが主に44：２蝋エステルである、請求項９記載の細胞。 14．前記44：２蝋エステルが前記内在脂質貯蔵物の構成成分である蝋エステル成分のうちの50％より多くを占めている、請求項13記載の細胞。 15．前記44：２蝋エステルが前記内在脂質貯蔵物の構成成分である蝋エステル成分のうちの60％より多くを占めている、請求項14記載の細胞。 16．請求項７〜15のいづれか一項記載の細胞から獲得した油。 17．約10％より多くの44：２蝋エステルを含んで成る油組成物。 18．約50％より多くの44：２蝋エステルを含んで成る油組成物。 19．約60％より多くの44：２蝋エステルを含んで成る油組成物。