KR20080009243A - 형질전환 구조체를 사용하는 하나 이상의 유전자의 유전자발현의 동조적 감소 및 증가 - Google Patents

형질전환 구조체를 사용하는 하나 이상의 유전자의 유전자발현의 동조적 감소 및 증가 Download PDF

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이넨나암 앨리슨 반
크리스틴 케이. 슈메이커
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Abstract

본 발명은 RNA들의 발현의 동시 상향- 및 하향-조절과 관련된 핵산 분자들과 핵산 구조체들 및 다른 작용물질들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 제 2의 RNA의 발현을 억제시킴과 동시에 제 1의 RNA의 발현을 동시에 향상시키는 방법들을 포함한다. 본 발명은 또한 제 1의 RNA의 발현을 동시에 향상시킬 수 있는 반면에, 제 2의 RNA의 발현을 동시에 억제할 수 있는 구조체들을 제공하고, 이러한 작용물질들을 이용하는 방법과 이러한 작용물질들을 포함하는 식물들을 제공한다. 본 발명은 또한 폴리시스트로닉 구조체들을 포함하는 다른 구조체들을 제공한다.
RNA, 형질전환, 유전자, 동조적 감소, 동조적 증가

Description

형질전환 구조체를 사용하는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 동조적 감소 및 증가{COORDINATED DECREASE AND INCREASE OF GENE EXPRESSION OF MORE THAN ONE GENE USING TRANSGENIC CONSTRUCTS}
본 발명은 RNA 발현의 동시 상향-조절 및 하향-조절과 관련된 핵산 분자들과핵산 구조체 및 다른 작용물질들(agents)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단일 구조체를 사용하여 제 2의 RNA의 발현을 억제함과 동시에 제 1의 RNA의 발현을 향상시키는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 특히 제 2의 RNA의 발현을 억제시키는 반면 제 1의 RNA의 발현을 동시에 향상시킬 수 있는 구조체들, 그러한 구조체를 이용하는 방법 및 이러한 구조체를 포함하는 식물들을 제공한다. 본 발명은 또한 폴리시스트론 구조체들을 포함하는 다른 구조체들을 제공한다.
지금까지, 일반적으로 단일 유전자들의 억제 또는 과-발현(over-expression)에 의해, 많은 복잡한 생화학적 경로들이 유전학적으로 조작되어 왔다. 더구나, 식물유전자 조작에 대한 가능성의 개발은 생화학적 경로에 있어서 다수 유전자들의 동조적(coordinated) 조작을 필요로 할 것이다. 많은 접근방법들이 - 교배, 재형질전환, 공동-형질전환 및 연결된 형질전환 유전자들(transgenes)의 사용 등을 포함 하는 - 하나의 식물 내에서 형질전환 유전자들을 결합하는데 사용되어 왔다. 연결된 부분적 유전자 서열들을 갖는 키메릭 형질전환 유전자는 많은 내생의 식물 유전자들을 동조적으로 억제하는데 사용될 수 있다. 바이러스성 폴리단백질을 모델로 한 구조체들은 다수의 코딩 유전자들을 식물세포들 내로 동시에 도입시키는데 사용될 수 있다(검토를 위하여, Halpin 등, Plant . Mol . Biol . 47:295~310(2001) 참고).
식물들에서 유전자 발현의 강화는, 유전자의 코딩서열들의 여분의 카피를 식물세포 내로 도입하므로써, 또는 바람직하게는, 식물 게놈 내로 유전자의 코딩서열들의 여분의 카피를 혼입시킴으로써 이루어질 수 있다. 과-발현은 또한 유전자들의 발현을 조절하는, 즉 유전자 발현을 상향-조절하는, 조절 메카니즘의 활성을 증가시키므로써 이루어질 수 있다.
식물들에서, 유전자들의 침묵(silencing)으로 알려진, 유전자 발현의 억제는 전사수준과 후-전사수준의 양쪽에서 일어난다. 숙주세포 내에서 내생적 서열들의 발현의 억제를 위한 여러 가지의 방법들이 있다. 그러한 방법들은, 제한되지는 않지만, 안티센스의 억제(스미스 등, Nature 334:724~726(1988)), 공동-억제(나폴리 등, Plant Cell 2:279~289(1989)), 리보자임(Kohler 등, J. Mol . Biol . 285:1935~1950(1999)), 센스와 안티센스의 조합(Water-House 등, PNAS USA 95:13959~13964(1998)), 프로모터 침묵(Park 등, Plant J. 9(2):183~194(1996)), 및 DNA결합 단백질(Beerli 등, PNAS USA 95:14628~14633(1997); Liu 등, PNAS USA 94:5525~5530(1998))을 포함한다.
이들 메카니즘들 중의 어떤 것은 DNA 또는 RNA 수준에서 핵산 상동성과 연관된다(Matzke 등, Current Opinion in Genetics and Development 11:221~227(2001)). 식물들에서, 이중-가닥의 RNA 분자들은 서열-특이성-침묵을 유발할 수 있다. 이 현상은 식물에서는 종종 이중-가닥 RNA("dsRNA")로서 언급된다. 이 현상은 또한 카에노르해브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에서도 보고되어 있고, 이 경우, 이 유전자-특이성 침묵은 종종 RNA 간섭 또는 RNAi로서 언급된다(Fire 등, Nature 391:806~811(1988)). 다른 연구들도 식물들, 균류들 및 동물들에서의 이 현상을 보고하였다(Sharp, Genes and Development 13:139~141(1999); Matzke 등, Curr . Opin . Genet . Dev, 11:221~227(2001); Cogoni 및 Macino, Curr . Opin. Genet . Dev, 10:638~643(2000); Sharp, Genes and Development 15:485~490(2001); Waterhouse 등, PNAS USA 95:13959~13964(1988); Wesley 등, Plant J. 27:581~590(2001); Grierson, WO 98/53083)). Wesley 등은 유전자 침묵 벡터로서 사용될 수 있는 pHANNIBAL 및 pHELLSGATE의, 두 개의 벡터들의 디자인과 사용을 보고했다(상기의 Wesley 등). 이들 벡터들은 센스와 안티센스 서열들이 타겟 코딩 서열인, 5'UTR 또는 3'UTR에 상응하는, 센스와 안티센스 서열들 사이의 인트론 서열을 포함하는 것으로 보고되어 있다. 타겟 센스 서열과 안티센스 서열들 사이의 비-타겟 인트론을 이용함으로써, 더 높은 비율의 침묵 형질전환체가 얻어졌다(상기의 Wesley 등). dsRNA에 의한 유전자 침묵의 다른 방법은 인트론 스페이서를 갖는 헤어핀 구조체를 포함한다(Smith 등, Nature 407:319~320(2000)).
다른 억제방법들은, 제한 없이, 안티센스 억제와 센스 억제를 포함한다. 예 컨대 Fillatti in PCT WO 01/14538 참조.
원하는 식물 표현형은 하나의 유전자의 발현과 동시에 다른 유전자의 발현의 감소를 필요로 할 것이다. 따라서, 단일 형질전환 구조체를 사용하는 식물들에서, 폴리펩티드의 과-발현, 및 제 2의 폴리펩티드 발현의 억제, 또는 하향-조절을 동시에 할 필요성이 존재한다. 게다가, 단일 구조체를 사용하여 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 동시에 억제 또는 하향-조절할 필요성이 존재한다.
본 발명은 폴리펩티드 인코딩 서열을 포함하는 제 1의 핵산 단편과 유전자 억제서열을 포함하는 제 2의 핵산 단편을 포함하는 핵산분자를 포함 및 제공하고, 숙주세포 내에서의 상기 핵산분자의 전사는 숙주세포 내에서 상기 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래한다.
본 발명은 폴리펩티드 인코딩 서열을 포함하는 제 1의 핵산 단편(segment)과 유전자 억제서열을 포함하는 제 2의 핵산 단편을 포함하는 핵산분자를 갖는 식물을 포함 및 제공하고, 숙주세포 내에서의 상기 핵산분자의 전사는 숙주세포 내에서 상기 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래하고, 상기 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 단일 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 인코딩 서열을 포함하는 제 1의 핵산 단편과 유전자 억제 서열을 포함하는 제 2의 핵산 단편을 포함하는 핵산 분자를 식물세포 내 로 도입시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 RNA분자의 발현을 동시에 변경시키는 방법을 포함 및 제공하고, 숙주세포 내에서의 상기 핵산 분자의 전사는 숙주세포 내에서 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래하고, 상기 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 단일 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되고, 그리고 상기 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 발현된다.
숙주세포 내에서의 본 발명의 핵산분자의 전사는 숙주세포 내에서 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래한다.
숙주세포 내에서의 본 발명의 핵산분자의 전사는 숙주세포 내에서 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래한다.
숙주세포 내에서의 본 발명의 핵산 분자의 전사는 숙주세포 내에서 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래한다.
핵산 서열의 설명
서열번호1은 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 감마-토코페롤 메틸트랜스퍼라제를 인코드하는 DNA 분자의 핵산 서열을 나타낸다.
서열번호2 및 3은 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 감마 메틸트랜스퍼라제의 증폭에 사용하기 위한 프라이머들의 핵산 서열을 나타낸다.
서열번호4는 pMON75565의 3345~4947 염기들에서 발견된 RNAi 작동 요소인 1405 뉴클레오티드 길이의 DNA 서열이다. 서열번호4는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) FAD2(1281~1405 염기들)로부터의 안티센스 방향의 3'UTR 서열에 연결된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) FAD2(144~1275 염기들)로부터 제거된 접합 사이트를 갖는 센스-방향의 인트론 서열에 연결된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) FAD2(1~135 염기들)로부터의 센스-방향의 3'UTR 서열을 5'에서 3' 방향으로 포함하고 있다. 서열번호4에서처럼, FAD2 인트론 요소들은 pMON75565 내의 3687~4818 염기들에서 발견되고, 그리고 서열번호5 내의 3396~4515 염기들에서 발견된다.
서열번호5는 벡터 pMON75565로부터의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 경계요소들 사이 즉, RNAi 및 BAR 마커용 제 2의 전사 유닛에 의한 GMT의 발현 증가와 Δ12 불포화화 효소의 발현 감소를 동시에 일어나게 하기 위한 제 1의 전사 유닛의 요소들 사이에 있는, 형질전환 삽입 요소의 8179 뉴클레오티드 길이의 DNA 서열이다.
서열번호6은 벡터 pMON75571로부터의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 경계요소들 사이, 즉 인트론 센스 억제와 BAR 마커용 제 2의 전사 유닛에 의한 GMT의 발현증가와 Δ12 불포화화 효소의 발현감소를 동시에 일어나게 하기 위한 제 1의 전사 유닛의 요소들 사이에 있는, 형질전환 삽입 요소의 7713 뉴클레오티드 길이의 DNA 서열이다.
정의:
여기에서 사용된, "유전자"는 유전자 생성물의 발현과 관련된 5' 프로모터 영역과, 유전자 생성물의 발현과 관련된 어떤 인트론과 엑손 영역 및 3' 비번역 영역("UTR")을 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.
여기에서 사용된, "형질전환 식물"은 유성 또는 무성 방법에 의해 식물로부터 형질전환 유전자의 전달을 용이하게 할 수 있도록 형질전환 유전자를 안정하게 통합시키는 식물이다.
여기에서 사용된, "형질전환 유전자"는, 유기체의 세포에 도입된 유전자의 발현과 관련된 핵산 서열을 나타낸다. 형질전환 유전자는, 제한되지는 않지만, 유기체에서의 내생적인 유전자 또는 유기체 내에서 자연적으로 발생하지 않는 유전자를 포함한다.
여기에서 사용된, "유전자 침묵" 또는 "억제"는, 제한 없이, 안티센스 억제, 센스 억제 및 센스 인트론 억제를 포함하는 어떠한 방법에 의한 유전자 발현의 하향-조절을 나타낸다. 그러한 하향-조절은 부분적인 하향-조절일 수 있다.
여기에서 사용된, "유전자 억제 서열"은 전사시에, 유전자 발현을 하향-조절할 수 있는 어떠한 핵산 서열이다. 그러한 방법들은, 제한되지는 않지만, 안티센스 억제, 센스 억제 및 센스 인트론 억제를 포함한다.
여기에서 사용된, "안티센스 억제"는 안티센스 RNA 분자의 도입에 의해 유도되는 유전자 침묵을 나타낸다.
여기에서 사용된, "센스 억제"는, 제한 없이, 코딩 영역 또는 이들의 단편을 포함하는 센스방향 내의 유전자의 단편의 도입에 의하여 유도되는 유전자 침묵을 나타낸다.
여기에서 사용된, "센스 인트론 억제"는 유전자의 센스방향 내의 인트론 또는 이들의 단편의 도입에 의해 유도되는 유전자 침묵을 나타낸다. 센스 인트론 억제는 Fillatti의 PCT WO 01/14538 A2에 기술되어 있다.
여기에서 단백질들과 핵산들을 언급할 때, 보통체 문자들의 사용, 예를 들면, "GMT" 또는 "FAD2"는 효소, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드에 대한 언급을 나타내고, 이탤릭체 문자의 사용, 예를 들면, "GMT" 또는 "FAD2"는 제한 없이 유전자, cDNAs, 및 mRNAs를 포함하는 핵산들을 나타낸다.
여기에서 단백질들과 핵산들과 같은 작용물질들을 나타낼 때, "유도된"은 직접적으로(예를 들면, 공지된 단백질 또는 핵산의 서열을 조사하고, 공지된 단백질 또는 핵산의 서열과, 적어도 부분적으로, 유사한 서열을 갖는 단백질 또는 핵산을 제조하는 것) 또는 간접적으로(예를 들면, 공지된 단백질 또는 핵산과 관련된 유기체로부터 단백질 또는 핵산을 얻는 것) 공지된 단백질 또는 핵산으로부터 단백질 또는 핵산을 얻는 것을 나타낸다. 공지된 단백질 또는 핵산으로부터 단백질 또는 핵산을 "유도하는" 다른 방법들도 당업자에게는 공지이다.
여기에서 핵산 구조체를 나타낼 때, 그 구조체는 선형 또는 원형일 수 있는 것으로 이해된다.
여기에서 사용된, "핵산 단편"은 큰 핵산 분자의 일부이다. 예를 들면, 그러한 핵산 단편들은, 제한 없이, 폴리펩티드 인코딩 서열 또는 유전자 억제 서열 또는 이들 모두를 포함한다.
여기에서 사용된, "RNAi"와 "dsRNA"는 이중-가닥 RNA분자의 도입에 의해 유 도된 유전자 침묵을 나타낸다.
여기에서 사용된, "dsRNA 분자"와 "RNAi 분자" 모두, 세포 또는 유기체 내로 도입될 경우, 세포 또는 유기체의 세포 내에 존재하는 mRNA 종들의 수준을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 이중-가닥 RNA분자를 나타낸다.
여기에서 사용된, "인트론 dsRNA 분자"와 "인트론 RNAi 분자" 모두, 하나 이상의 세포들 내에 존재하는 mRNA 종들의 수준을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 이중-가닥 RNA 분자를 나타내며, 상기 이중-가닥 RNA분자는, 세포 또는 유기체 내로 도입될 경우, 세포 또는 유기체 내에 존재하는 유전자의 인트론에 대하여, 해당 인트론 서열을 포함하는 mRNA의 수준을 감소시키기에 충분한 정도의 동일성을 나타낸다.
용어 "비-코딩"은 발현된 단백질의 일부분 또는 전부를 인코드하지 않는 핵산 분자들의 서열을 나타낸다. 비-코딩 서열들은, 제한되지는 않지만, 인트론, 프로모터 영역, 3' 비번역 영역("3'UTR")과 5' 비번역 영역("5'UTR")을 포함한다.
여기에서 사용된 용어 "인트론"은 발현된 단백질의 일부분 또는 전부를 인코드하지 않는, 핵산분자, 대개 DNA 단편을 의미하는, 상기 용어의 일반적인 의미를 나타내고, 이는 내생적 조건에서는 RNA분자로 전사되지만, RNA가 단백질로 번역되기 전에, 내생적 RNA로부터 분리된다.
여기에서 사용된 용어 "엑손"은 발현된 단백질의 일부분 또는 전부를 인코드하는, 핵산분자, 대개 DNA의 단편을 의미하는, 상기 용어의 일반적인 의미를 나타낸다.
여기에서 사용된, 하나 이상의 핵산 서열들에 "작동가능하게 연결된" 프로모터는 폴리시스트로닉 배열 또는 구조체에 배열된 다수 코딩 또는 비-코딩 핵산 서열들을 포함하는 하나 이상의 핵산 서열들의 발현을 유도해낼 수 있는 것이다.
여기에서 사용된, "식물 프로모터"는, 제한 없이, 식물 세포 내에서 mRNA의 발현을 촉진시키는 기능을 할 수 있는 단일 전사 유닛인, 식물 바이러스 프로모터, 키메릭 또는 잡종 합성 프로모터를 포함한다.
"폴리시스트로닉 배열" 또는 "폴리시스트로닉 구조체"는 하나 이상의 유전자 의 핵산 서열을 포함하는 배열이다. "폴리시스트로닉 배열" 내에, 엑손, 인트론 또는 이들 모두에 상응하는 서열들이 있을 수 있고, "폴리시스트로닉 배열"은 예를 들면, 제한 없이, 하나의 유전자로부터의 하나 이상의 엑손들 및 제 2의 유전자로부터의 하나 이상의 인트론에 상응하는 서열들을 포함할 수 있다.
여기에서 사용된, "폴리시스트로닉 유전자" 또는 "폴리시스트로닉 mRNA"는 하나 이상의 유전자의 핵산 서열들에 상응하는 핵산 서열들을 포함하는 어떤 유전자 또는 mRNA이다. 그러한 폴리시스트로닉 유전자들 또는 mRNA들은 엑손, 인트론 또는 이들 모두에 상응하는 서열들을 포함할 수 있고, 재조합 폴리시스트로닉 유전자 또는 mRNA는, 예를 들면, 제한 없이, 하나의 유전자로부터의 하나 이상의 엑손 및 제 2의 유전자로부터의 하나 이상의 인트론에 상응하는 서열들을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
여기에서 사용된, "물리적으로 연결된" 핵산 서열들은 단일 핵산 분자상에서 발견되는 핵산 서열들이다.
여기에서 사용된, "발현"은 전사와 번역의 공정을 나타낸다.
여기에서 사용된, mRNA 또는 단백질과 같은 한 가지 이상의 작용물질의 "동시 발현"은 다른 작용물질과 동시에 어느 작용물질이 발현되는 것을 나타낸다. 그러한 발현은 단지 부분적으로 겹칠 수 있고, 또한 다른 조직들 내에서 또는 다른 수준으로 일어날 수 있다.
여기에서 사용된, mRNA 또는 단백질과 같은 한 가지 이상의 작용물질의 "발현을 동시에 변경하는 것"은 다른 작용물질의 발현을 변경시킴과 동시에 어느 작용물질의 발현을 변경시키는 것을 나타낸다. 한 가지 이상의 작용물질의 그러한 발현은 다른 조직 내에서 또는 다른 수준으로 변경될 수 있다.
여기에서 사용된, mRNA 또는 단백질과 같은 한 가지 이상의 작용물질의 "공동발현"은, 다른 작용물질과 동일한 세포 또는 조직 내에서 동시에 어느 작용물질을 동시 발현시키는 것을 나타낸다.
여기에서 사용된, 한 가지 이상의 작용물질의 "동조적 발현"은 그러한 작용물질들의 발현이 공용 프로모터 또는 동일 프로모터를 사용하여 실시되는, 한 가지 이상의 작용물질의 공동발현을 나타낸다.
여기에서 사용된, 단백질 또는 mRNA와 같은 작용물질의 "적어도 부분적으로 향상된" 또는 "증가된" 수준은, 그 작용물질의 수준이 단백질 또는 mRNA를 인코딩하는 핵산 분자가 도입되지 않은 것을 제외하고는 유사한 유전적 배경을 갖는 세포, 조직, 식물 또는 유기체 내에 존재하는 그 작용물질의 수준에 비하여 증가된다면 적어도 부분적으로 향상되거나 또는 증가된 것에 해당된다.
여기에서 사용된, "폴리펩티드"는 15개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들을 포함한다.
여기에서 사용된, "펩티드"는 14개 또는 그 이하의 아미노산 잔기들을 포함한다.
여기에서 사용된, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 mRNA와 같은 작용물질의 "향상된" 수준은, 그 작용물질의 수준이, 단백질 또는 mRNA를 인코딩하는 핵산분자가 도입되지 않은 것을 제외하고는 유사한 유전적 배경을 지닌 세포, 조직, 식물 또는 유기체 내에 존재하는 그 작용물질의 수준에 비하여 적어도 25% 정도 증가된다면, 향상된 것에 해당된다.
여기에서 사용된, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 mRNA와 같은 작용물질의 수준은, 그 작용물질의 수준이, 단백질 또는 mRNA를 인코딩하는 핵산분자가 도입되지 않은 것을 제외하고는, 유사한 유전적 배경을 지닌 세포, 조직, 식물 또는 유기체 내에 존재하는 그 작용물질의 수준에 비하여 적어도 75% 정도 증가한다면, "상당히 향상된 것"에 해당된다.
여기에서 사용된, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 mRNA와 같은 작용물질의 수준의 "감소"는, 그 수준이, 작용물질을 감소시킬 수 있는 핵산 서열이 없는 것을 제외하고는, 유사한 유전적 배경을 지닌 세포, 조직, 식물 또는 유기체에 대해서 감소되는 것을 의미한다.
여기에서 사용된, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 mRNA와 같은 작용물질 수준의 "적어도 부분적인 감소"는, 그 수준이, 작용물질을 감소시킬 수 있는 핵산 서열이 없는 것을 제외하고는, 유사한 유전적 배경을 지닌 세포, 조직, 식물 또는 유기체에 대해 적어도 25% 정도가 감소되는 것을 의미한다.
여기에서 사용된, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 mRNA와 같은 작용물질 수준의 "실질적인 감소"는, 그 수준이, 작용물질을 감소시킬 수 있는 핵산 서열이 없는 것을 제외하고는, 유사한 유전적 배경을 지닌 세포, 조직, 식물 또는 유기체에 대해 감소되는 것을 의미하고, 여기에서 작용물질 수준의 감소는 적어도 75%이다.
여기에서 사용된, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 mRNA와 같은 작용물질의 "효과적인 제거"는, 작용물질을 감소시킬 수 있는 핵산 서열이 없는 것을 제외하고는, 유사한 유전적 배경을 지닌 세포, 조직, 식물 또는 유기체에 대해 작용물질의 수준이 95% 이상 감소되는 것을 의미한다.
여기에서 사용된, "이종성"은 자연적으로 함께 발생하지 않음을 의미한다.
여기에서 사용된, "내생적 유전자"는 형질전환 또는 형질감염에 의해 숙주 내로 도입되지 않은 어떤 유전자이다.
여기에서 사용된, "총 오일 수준"은 지방산 유형에 관계 없이 지방산의 전체 총량을 나타낸다.
여기에서 사용된, "변경된 종자오일 조성물"은 지방산들의 유형들의 상대 %가 변경된 종자 조성물을 나타낸다.
여기에서 사용된, 어떤 범위 표시는 다른 언급이 없으면, 범위의 종점이 포함된 것이다.
본 발명의 작용물질들은 다른 핵산분자에 대해 혼성화될 수 있는 핵산분자의 능력 또는 항체에 의해 결합될 수 있는 (또는 이러한 결합에 대하여 다른 분자와 경쟁할 수 있는) 단백질의 능력과 같은, 구조적인 속성에 관하여 바람직하게는 "생물학적으로 활성"일 것이다. 또는, 그러한 생물학적 활성은 촉매적일 수 있으므로, 따라서 화학반응이나 응답반응을 중재할 수 있는 작용물질의 능력을 포함한다.
작용물질들은 바람직하게는 "실질적으로 정제된 것"일 수 있다. 여기에서 사용된, 용어 "실질적으로 정제된"은 원래의 자연적 환경 조건하에서 그것과 정상적으로 관련된 모든 다른 분자들로부터 실질적으로 분리된 분자를 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 실질적으로 정제된 분자는 조제물에 존재하는 우세 종이다. 실질적으로 정제된 분자는 자연적 혼합물 내에 존재하는 다른 분자들(용매를 제외)로부터 60% 이상, 75% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 유리될 수 있다. 용어 "실질적으로 정제된"은 이들의 자연적 환경 조건에서 존재하는 분자들을 포함하고자 하는 의도는 아니다.
본 발명의 작용물질들은 또한 재조합체일 수 있다. 여기에서 사용된, 용어 "재조합체"는 핵산분자 또는 펩티드에 대한 인위적 조작으로부터, 간접적으로 얻어진 어떤 작용물질(예, 제한되지는 않지만, DNA, RNA, 펩티드를 포함하는)을 의미한다.
본 발명의 작용물질들은 작용물질의 검출을 용이하게 하기 위한 시약들로 표지될 수 있다(예를 들면, fluorescent labels, Prober 등, Science 238:336~340(1987); Albarella 등, EP 144914; chemical labels, Sheldon 등, 미국 특허 4,582,789; Albarella 등, 미국특허 4,563,417; 변형된 염기들, Miyoshi 등, EP 119448).
여기에서 사용된, "동질성%"는 다음의 매개변수들과 알고리즘을 사용하여 결정된다: 스미스 워터맨 알고리즘이 동질성을 결정하는데 사용된다. 전형적으로 폴리펩티드 서열비교를 위한 매개변수들은 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman과 Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443~453(1970). 비교 매트릭스: Hentikoff와 Hentikoff로부터의 BLOSSUM62, PNAS USA 89:10915~10919(1992). 갭 페널티(Gap Penalty): 12; 갭 길이 페널티(Gap Length Penalty): 4. 이들 매개변수들과 함께 사용될 수 있는 프로그램은 위스콘신의 매디슨에 위치한 Genetic Computer Group("GCG")의 "gap" 프로그램으로서 구입할 수 있다. 말단 갭(gap)에 대해 페널티가 없는 상기의 매개변수들은 펩티드 비교를 위한 기본 매개변수들이다. 핵산 분자서열 비교를 위한 매개변수들은 다음과 같다: 알고리즘: Needleman과 Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443~453(1970). 비교 매트릭스: 일치 - +10, 불일치 = 0: 갭 페널티: 50; 갭 길이 페널티: 3. "%동질성"은 핵산 분자서열 비교를 위한 기본 매개변수들로서의 상기 매개변수들과 GCG로부터의 "갭"프로그램(버전 10.2)을 사용하여 결정된다.
여기에서 사용된, 감마-토코페롤 메틸트랜스퍼라제(또한 GMT, γ-GMT, γ-MT, γ-TMT 또는 감마-메틸트랜스퍼라제로서 언급된다)는 γ-토코페롤의 α-토코페롤로의 전환을 특히 촉매화 할 수 있는 폴리펩티드이다. 콩과 같은 어떤 식물종에 있어서, GMT는 또한 δ-토코페롤의 β-토코페롤로의 전환을 촉매화할 수 있다. 다른 식물들에서, GMT는 또한 δ-토코트리엔올의 β-토코트리엔올로의 전환을 촉매화 할 수 있다.
여기에서 사용된 "FAD2", "Δ12 불포화화 효소" 또는 "오메가-6 불포화화 효소" 유전자는 카르복실 말단으로부터 12번째 위치의 지방 아실성분 내로의 이중결합의 삽입을 촉매화할 수 있는 효소를 인코드하는 유전자이다.
핵산분자들, 구조체들 및 벡터들
형질전환 DNA를 숙주 식물세포 내로 도입하기 위하여 적당한 벡터 시스템들은, 제한되지 않지만, 이성분 박테리아 인공 염색체(BIBAC) 벡터들(해밀톤 등, Gene 200: 107~116(1997)); RNA 바이러스성 벡터들(Della-Cioppa 등, Ann.N.Y.Acad.Sci. 792(Engineering Plants for Commercial Products and Applications): 57~61(1996)); Mullen 등, Molecular Breeding 4:449~457(1988)에 기술된 바와 같은 식물 선택성 YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터들; 코스미드; 및 박테리아 인공 염색체들(BACs)을 포함하며, 그러한 벡터 시스템들은 본 발명의 핵산분자들과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에서, 그러한 벡터들은 폴리펩티드 인코딩 서열을 포함하는 제 1의 핵산 단편과 유전자 억제 서열을 포함하는 제 2의 핵산 단편을 포함하는 핵산분자를 포함하고, 숙주세포 내에서의 상기 핵산분자의 전사는 숙주세포 내에서의 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래한다. 하나의 측면에서, 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 단일 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 제한되지 않고, 제 2의 핵산 단편은 dsRNA 분자, RNAi 분자, 인트론 dsRNA 분자, 또는 인트론 RNAi 분자로서 발현될 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에서, 그러 한 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 숙주세포 내에서 발현, 공동발현 또는 동조적으로 발현될 수 있고, 발현시에 제 2의 핵산 단편에 의해 인코드된 RNA는 억제된다.
A. 프로모터
본 발명의 하나의 측면에서, 핵산 분자들, 구조체들 또는 벡터들은 하나 이상의 핵산 서열들에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 여기에 기술된 프로모터들과 같은, 식물세포 내에서 mRNA 분자의 생성을 일으키는 기능을 하는 어느 프로모터들도, 제한 없이, 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프로모터는 식물프로모터이다.
식물세포들 내에서 활성인 많은 프로모터들이 문헌상에 기술되어 있다. 이들은 제한되지 않지만, 노파린 신타제(NOS) 프로모터(Ebert 등, PNAS USA 84:5745~5749(1987)), 옥토핀 신타제(OCS) 프로모터(Agrobacterium tumefaciens의 종양-유발 플라스미드상에 존재), 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 19S 프로모터(Lawton 등, Plant Mol . Biol . 9:315~324(1987))와 같은 콜리모바이러스 프로모터들, 및 CaMV 35S 프로모터(Odell 등, Nature 313:810~812(1985)), 현삼속식물 모자이크 바이러스 35S-프로모터(미국특허 No.5,378,619), 리부로스-1,5-비스-포스페이트카르복실라제의 작은 서브유닛으로부터의 광-유도 프로모터(ssRUBISCO), Adh 프로모터(Walker 등, PNAS USA 84:6624~6628(1987)), 슈크로즈 신타제 프로모터(Yang 등, PNAS USA 87:4144~4148(1990)), R 유전자 복합체 프로모터(Chandler 등, Plant Cell 1:1175~1183(1989))와 엽록소 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터들은 식물 내에서 발현되는 DNA 구조체들을 만드는데 사용되어 왔다(예컨대, PCT WO 84/02913 참고). CaMV 35S 프로모터들은 식물들에서의 사용에 바람직하다. 옥수수 RS81 프로모터를 개시하는 미국특허 제6,437,217호; 벼 액틴 프로모터를 개시하는 미국특허 제5,641,876호; 옥수수 RS324 프로모터를 개시하는 미국특허 제6,426,446호; 옥수수 PR-1 프로모터를 개시하는 미국특허 제6,429,362호; 옥수수 A3 프로모터를 개시하는 미국특허 제6,232,526호; 및 구성적 옥수수 프로모터를 개시하는 미국특허 제6,177,611호 참고. 벼 액틴 인트론을 갖는 벼 액틴 1 프로모터는 본 발명의 실시에 특히 유용하다.
특히 바람직한 프로모터들 또한 종자들 또는 과실들에서 본 발명의 핵산 분자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 실제로, 바람직한 구체예에서, 사용된 프로모터는 종자 특이성 프로모터이다. 그러한 프로모터들의 예들은 나핀과 같은 유전자들로부터의 5' 조절영역(Kridl 등, Seed Sci . Res . 1:209:219(1991)), 페이스올린(phaseolin)(Bustos 등, Plant Cell 1(9):839~853(1989)), 콩 트립신 억제제(Riggs 등, Plant Cell 1(6):609~621(1989)), ACP(Baerson 등, Plant Mol . Biol . 22(2): 255~267(1993)), 스테아로일-ACP 불포화화 효소(Slocombe 등, Plant Physiol. 104(4):167~176(1994)), b-콘글리시닌의 콩 a'서브유닛(콩 7s 프로모터(Chen 등, PNAS USA 83:8560~8564(1986))), 지방산 연신(FAE1) 프로모터(PCT WO 01/11061), 및 올레오신(예를 들면, Hong 등, Plant Mol.Biol. 34(3):549~555(1997) 참고)을 포함한다. 또 다른 예들은 β-콘글리시닌을 위한 프로모터(Chen 등, Dev. Genet. 10:112~122(1989))를 포함한다. 종자 내에서의 발현 을 위하여 바람직한 프로모터들은 7S와 나핀 프로모터들이다.
또한 옥수수 내배유 내에서 발견된 저장 단백질들의 그룹인 제인 프로모터들을 포함한다. 제인 유전자를 위한 게놈 클론들은 분리되었고(Pedersen 등, Cell 29:1015~1026(1982); Russell 등, Transgenic Res . 6(2):157~168(1997)), 15kD, 16kD, 19kD, 22kD 및 27kD 유전자들을 포함하는, 이들 클론들로부터의 프로모터들 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 옥수수 내에서 기능하는 것으로 알려진 다른 프로모터들은, 다음의 유전자들을 위한 프로모터들을 포함한다: 왁시(waxy), 브리틀(Brittle), 슈런켄 2(Shrunken 2), 브랜칭 효소(Branching enzyme) I 및 II, 전분 신타제, 디브랜칭 효소, 올레오신, 글루테린 및 슈크로즈 신타제. 옥수수 내배유 발현을 위하여 특히 바람직한 프로모터는, 벼로부터의 글루테린 유전자를 위한 프로모터이고, 좀더 특별하게는 Osgt-1 프로모터(Zheng 등, Mol . Cell Biol . 13:5829~5842(1993))이다. 밀에서의 발현을 위하여 적당한 프로모터들의 예는, ADP 글루코오즈 피로신타제(ADPGPP) 서브유닛을 위한 프로모터들, 그래뉼 바운드(granule bound) 전분 신타제 및 다른 전분 신타제, 브랜칭 및 디브랜칭 효소들, 배발생-강화 단백질들, 글리아딘과 글루테닌을 포함한다. 벼에 있어서 그러한 프로모터들의 예들은, ADPGPP 서브유닛을 위한 프로모터들, 그래뉼 바운드 전분 신타제와 다른 전분 신타제, 브랜칭 효소들, 디브랜칭 효소들, 슈크로즈 신타제들 및 글루테린을 포함한다. 특히 바람직한 프로모터는 벼 글루테린을 위한 프로모터, Osgt-1이다. 보리를 위한 그러한 프로모터들의 예들은, ADPGPP 서브유닛을 위한 프로모터들, 그래뉼 바운드 전분 신타제와 다른 전분 신타제, 브랜칭 효소들, 디브랜 칭 효소들, 슈크로즈 신타제, 호르데인, 태아 글로불린 및 호분 특이성 단백질들을 포함한다.
본 발명의 단백질의 조직-특이성 발현은 특히 바람직한 구체예이다. 사용될 수 있는 조직-특이성 프로모터들은 완두콩으로부터의 클로로-플라스트 글루타민 합성효소 GS2 프로모터(Edward 등, PNAS USA 87:3459~3463(1990)), 밀로부터의 클로로플라스트 프럭토오스-1,6-비포스파타제(FBPase) 프로모터(Lloyd 등, Mol . Gen . Genet. 225:209~216(1991)), 감자로부터의 핵 광합성 ST-LS1 프로모터(Stockhaus 등, EMBO J. 8:2445~2451(1989)), 세린/트레오닌 키나제(PAL) 프로모터 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 글루코아밀라아제(CHS) 프로모터를 포함한다. 또한 이스턴 낙엽송으로부터의 리부로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제(rbcS) 프로모터(Larix laricina), 소나무로부터의 cab 유전자, cab6를 위한 프로모터(Yamamoto 등, Plant Cell Physiol . 35:773~778(1994)), 밀로부터의 Cab-1 유전자를 위한 프로모터(Fejes 등, Plant Mol . Biol . 15:921~932(1990)), 시금치로부터의 CAB-1 유전자를 위한 프로모터(Lubberstedt 등, Plant Physiol . 104:997~1006(1994)), 벼로부터의 cab1R 유전자를 위한 프로모터(Luan 등, Plant Cell 4:971~981)(1992)), 옥수수로부터의 피루베이트, 오르토포스페이트 디키나제(PPDK) 프로모터(Matsuoka 등, PNAS USA 90:9586~9590(1993)), 담배 Lhcb1*2 유전자를 위한 프로모터(Cerden 등, Plant Mol . Biol . 33:245~255(1997)), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUC2 슈크로즈-H+ 심포터 프로모터(Truernit 등, Planta, 196:564~570(1995)) 및 시금치로부터의 틸라코이드 멤브레인 단백질을 위한 프로모터(psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS)도 광합성적으로 활성인 조직들 내에서 활성인 것으로 보고되었다. 백색 갓으로부터의 LhcB 유전자와 PsbP 유전자를 위한 프로모터들과 같은, 클로로필 a/b-결합 단백질들을 위한 다른 프로모터들 또한 이용될 수 있다(Sinapis alba; Kretsch 등, Plant Mol . Biol. 28:219~229(1995)).
덩이줄기-특이성 발현 또는 덩이줄기-강화 발현을 하는 유전자들을 위한 많은 프로모터들이 공지되어 있고 사용가능하고, 이들은 클래스 I 패태틴(patatin) 프로모터(Bevan 등, EMBO J. 8:1899~1906(1986); Jefferson 등, Plant Mol . Biol . 14:995~1006(1990)), 감자 덩이줄기 ADPGPP 유전자들을 위한 프로모터, 큰 서브유닛 및 작은 서브유닛 모두, 슈크로즈 신타제 프로모터(Salanoubat 및 Belliard, Gene 60:47~56(1987), Salanoubat 및 Belliard, Gene 84:181~185(1989)), 22kd 단백질 복합체들 및 프로테아제 억제제들을 포함하는 주요 감자 덩이줄기 단백질을 위한 프로모터(Hannapel, Plant Physiol. 101:703~704(1993)), 그래뉼-바운드 전분 신타제 유전자를 위한 프로모터(GBSS) (Visser 등, Plant Mol . Biol . 17:691~699(1991)) 및 다른 클래스 I 및 II 패태틴 프로모터들(Koster-Topfer 등, Mol. Gen . Genet . 219:390~396(1989); Mignery 등, Gene . 62:27~44(1988))을 포함한다.
뿌리특이성 프로모터들도 또한 사용될 수 있다. 그러한 프로모터들의 예는 산 키티나제 유전자를 위한 프로모터이다(Samac 등, Plant Mol . Biol . 25:587~596(1994)). 뿌리조직 내에서의 발현은 특성이 확인된 CaMV35S 프로모터의 뿌리 특이성 서브도메인을 이용하는 것에 의해 이루어질 수 있다(Lam 등, PNAS USA 86:7890~7894(1989)). 다른 뿌리 세포 특이성 프로모터들은 Conkling 등에 의해 보고된 것을 포함한다(Conkling 등, Plant Physiol . 93:1203~1211(1990)).
본 발명의 핵산 구조체들에서 사용된 프로모터들은, 원한다면, 그들의 조절특성에 영향을 주도록 변형될 수 있다. 프로모터들은 작동 영역과의 연결, 무작위의 또는 조절된 돌연변이 등에 의해 유도될 수 있다. 더욱이, 프로모터들은 유전자 발현을 향상시키는데 도움이 되기 위한 다수의 "인핸서 서열들"을 포함하도록 변경할 수 있다. 그러한 인핸서들은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 구조체와 함께 인핸서 서열을 포함함으로써, 선택된 단백질의 발현은 강화될 수 있다. 이들 인핸서들은 진핵세포들 내에서 기능을 하는 프로모터 내에서의 전사의 5' 개시점에서 발견되지만, 코딩서열에 대해서는 전방 또는 역방향인 5' 또는 3'에 삽입될 수 있다. 몇 가지 예들에 있어서, 이들 5' 인핸서 요소들은 인트론이다. 벼 액틴 1과 벼 액틴 2 유전자들의 5' 인트론들이 인핸서들로서 특히 유용할 것으로 생각된다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 다른 인핸서들의 예들은 CaMV 35S 프로모터, 옥토파인 신타제 유전자들, 옥수수 알코올 탈수소효소 유전자, 옥수수 슈렁켄 1 유전자 및 비-식물 진핵세포들로부터의 프로모터들로부터의 요소들을 포함한다.
선택된 단백질의 발현을 위하여 프로모터와 인핸서가 결합되어 사용되는 경우, 프로모터와 선택된 코딩 영역의 개시코돈 사이에 인핸서를 두는 것이 바람직할 것이라고 믿어진다. 그러나, 당업자는 다른 서열들에 대해서 다른 배열의 인핸서를 사용할 수도 있고, 여전히 인핸서에 의해 제공되는 유용성을 이해할 수 있을 것이 다. 예를 들면, 인핸서는 프로모터 영역의 5' 프로모터 영역 내, 코딩 서열 내(존재할 수도 있는 어떤 다른 인트론 서열 내를 포함) 또는 코딩영역의 3'에 위치할 수 있다.
강화활성을 갖는 인트론 이외에도, 다른 유형의 요소들이 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 비번역 리더 서열들은 "컨센서스(consensus)" 뿐만 아니라 유전자 발현을 강화하는 것으로 예견되었고, 바람직한 리더 서열들이 확인되었다. 바람직한 리더 서열들은 부착된 코딩 영역의 최적 발현을 유도하도록 예견되는 서열들을 갖는 것들 즉, mRNA 안전성을 증가 또는 유지시킬 수 있고, 번역의 부적절한 개시를 방지할 수 있는 바람직한 컨센서스 리더 서열을 포함하는 것이 고려된다. 당업자들은 본 발명의 개시에 의해 그러한 서열들의 선택을 알 수 있을 것이다. 식물들, 특히 옥수수 내에서 고도로 발현되는 유전자들로부터 유래되는 서열들이 가장 바람직할 것이다. 예를 들면, 이 서열들은 리부로스 비스포스페이트 카르복실라제(RUBISCO)의 작은 서브유닛으로부터 유래된다.
일반적으로, 게놈 내에서 이종성 DNA를 무작위로, 즉, 비-특이성 위치에 도입시키는 것이 바람직하다. 특별한 경우에 있어서, 부위 특이성 통합, 예컨대 게놈내에 존재하는 유전자를 치환하기 위해서 이종성 핵산 삽입을 타겟으로 하는 것이 유용할 수 있다. 몇가지 다른 경우에 있어서, 유전자 발현이 일어나는 것으로 알려진 게놈 내의 예정된 부위로 이종성 핵산 삽입을 타겟으로 하는 것이 유용할 수 있다. 미국특허 제4,959,317호에 개시된 바와 같은 크레-록스(cre-lox) 및 미국특허 제5,527,695호에 개시된 바와 같은 FLP-FRT를 포함하는 식물들에서 기능하는 것으 로 알려진 몇 가지의 부위 특이적 재조합 시스템이 존재한다.
예를 들면, 미국특허 제5,378,619호; 제5,391,725호; 제5,428,147호; 제 5,447,858호; 제5,608,144호; 제5,614,399호; 제5,633,441호; 제5,633,435호; 및 제4,633,436호에 기술되어 있는 추가적인 프로모터들이 이용될 수 있다. 또한, 조직 특이성 인핸서가 사용될 수 있다(Fromm 등, Plant Cell 1:977~984(1989)).
B. 핵산 분자들
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 핵산분자는, 세포나 유기체내로 도입될 때에, 하나 이상의 RNA 분자들을 동시에 과발현, 발현, 공동발현 또는 동조발현시켜서, 세포 또는 유기체 내에서 발현된 하나 이상의 RNA 분자들의 수준을 억제할 수 있는 하나 이상의 다른 RNA 분자들을 발현시키면서 하나 이상의 단백질들, 이들의 단편들, 폴리펩티드들, 또는 펩티드를 생성시키는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면에서, 어떤 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드가 발현될 수 있고, 어떤 RNA 분자는 억제될 수 있다. 세포 또는 유기체 내에서 발현된 하나 이상의 mRNA 분자들의 억제에 유용한 핵산 서열들 뿐만 아니라 그러한 단백질들, 이들의 단편들, 폴리펩티드들 및 펩티드들을 인코딩하는 핵산 서열은, 예를 들면, 제한 없이, 유전자 및 이들의 단편, cDNA 및 이들의 단편 등으로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 유전자는 내생적이거나 또는 도입된 어떤 유전자일 수 있다. 그러한 유전자들의 핵산 서열들은, 제한 없이, www-ebi.ac.uk/swisprot/; www-expasy.ch/; www-embl.heidelberg.de/; 및 www-ncbi.nlm.nih.gov.에서 볼 수 있는 EMBL과 Genbank와 같은 데이타베이스를 포함하는 다수의 소스로부터 얻어질 수 있다. 또한, 그러한 유전자들의 핵산 서열들은, 제한 없이, http-genes.mit.edu/GENSCAN.html.에서 볼 수 있는 GENSCAN과 같은 소스로부터 얻어질 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 추가적인 유전자들은 추가 유전자들이 확인될 수 있는 어떤 방법에 의해 얻어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 추가적인 유전자는 공지된 유전자 서열의 프로브로 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 그 후에 유전자는 클로닝되어 확인될 수 있다. 예를 들면, 추가 유전자들은, 제한 없이, 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 증폭될 수 있고, 본 발명의 구체예에 사용될 수 있다. 또한, 유전자들의 다른 핵산 서열들은 당업자들에게는 자명할 것이다.
다양한 방법들 중의 어떤 방법이 하나 이상의 유전자를 얻는데 사용될 수 있다. 자동화 핵산 신티사이저들이 이러한 목적을 위해 적용될 수 있고, 세포 또는 유기체 내에서도 발견되는 서열을 갖는 핵산분자를 만들 수 있다. 그러한 합성법 대신에, 제 1의 유전자의 어떤 원하는 핵산 분자 또는 단편을 증폭하여 얻기 위해 PCR에 사용될 수 있는 한쌍의 프라이머들을 정의하기 위해 핵산 분자들이 사용될 수 있다.
바람직한 측면에 있어서, 유전자, mRNA 또는 단백질은 비-바이러스성 유전자, mRNA 또는 단백질이다. 다른 바람직한 측면에 있어서, 유전자, RNA 또는 단백질은 내생의 유전자, RNA 또는 단백질이다. 바람직한 측면에 있어서, 유전자는 GMT 유전자이다. 본 발명의 바람직한 GMT 유전자는 식물 또는 시아노박테리아성 GMT이고, 더욱 바람직하게는, 아라비돕시스(Arabidopsis), 벼, 옥수수, 목화, 쿠페아, 유지종자 평지, 토마토, 콩, 금잔화, 수수 및 리크(부추의 일종)로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체 내에서도 발견되는 GMT이고, 가장 바람직한 것은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 오리자 사티바( Oryza sativa), 지아 메이스(Zea mays), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum), 쿠페아 풀체리마(Cuphea pulcherrima), 브라시카 나푸스(Brassica napus), 리코페르시콘 에스쿨레우툼(Lycopersicon esculeutum), 글리신 막스(Glycine max), 타게테스 에렉타(Tagetes erecta) 및 릴리움 아시아틱(Lilium asiatic)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체 내에서도 발견되는 GMT이다. GMT 유전자들을 위한 대표적인 서열들은, 제한 없이, 2002년 8월 16일자로 출원된 미국특허출원 번호 10/219,810에 개시된 것들이다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 다른 바람직한 유전자는 FAD2 유전자이다. FAD2를 위한 대표적인 서열들은, 제한 없이, 2002년 6월 21일자로 출원된 미국 특허출원 번호 10/176,149, 및 2000년 8월 11일자로 출원된 미국 특허출원 번호 09/638,508, 및 1999년 8월 26일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/151,224, 및 1999년 12월 17일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/172,128에 개시된 것들을 포함한다. 바람직한 측면에 있어서, GMT 단백질이 발현되고, FAD2 단백질의 발현은 억제된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 핵산 분자는 폴리펩티드 인코딩 서열을 포함하는 제 1의 핵산 단편과 유전자 억제서열을 포함하는 제 2의 핵산 단편을 포함하고, 숙주세포 내에서 상기 핵산 분자의 전사는 폴리펩티드 인코딩 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드의 발현과 유전자의 억제를 초래하고, 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 단일 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 상기 핵산분자는 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 인코드하는 본 발명의 핵산분자에 작동가능하게 결합된 색소체 트랜지트 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
본 발명의 핵산분자 또는 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드는 유전자 또는 그것의 번역된 생성물로부터의 핵산 또는 아미노산 서열 중의 어느 하나가 다를 수도 있지만, 그럼에도 불구하고 유전자로부터의 핵산 또는 아미노산 서열과 %동일성을 공유한다. 당 분야에서 잘 이해되는 바와 같이, "동일성"은 서열들을 비교함으로서 결정되는, 두 개 이상의 폴리펩티드 서열들 또는 두 개 이상의 핵산분자 서열들 사이의 관계이다. 당 분야에서, "동일성"은 그러한 서열들의 열(string) 사이의 매치(match)에 의해 결정되는, 폴리펩티드 또는 핵산분자 서열들 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 공지 방법들에 의해 쉽게 계산될 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 핵산 분자들의 핵산 서열은 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드가 하나 이상의 보존성 아미노산 변화를 가질 수 있고, 따라서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열들이 서열 차이를 가질 수 있다는 사실에 기인하여, 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코딩하는 서열들과는 다른 서열들을 포함할 수 있다.
천연 서열에서 하나 이상의 아미노산들은 전하와 극성이 천연 아미노산의 것 과 유사한 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있는, 즉 보존성 아미노산 치환은 당 분야에 잘 알려져 있다. 또한, 아미노산들의 수치료법(hydropathic) 지수도 아미노산 변경시에 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여함에 있어서, 수치료법 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당 기술분야에 알려져 있다(Kyte 및 Doolittle, J. Mol . Biol . 157:105~132(1982)). 유사한 아미노산들의 치환은 친수성을 기초로 하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 사실 또한 당 기술분야에 알려져 있다. 미국특허 제4,554,101호는 인접한 아미노산들의 친수성에 의해 결정되는, 단백질의 최대 국부적 평균 친수성은 단백질의 생물학적 성질과 상호관련된다는 것을 언급하고 있다. 이러한 변화들을 만드는데 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산들의 치환이 바람직하고, 이 값이 ±1 이내인 것들이 바람직하고, ±0.5 이내인 것들이 훨씬 더 바람직하다.
유전암호의 변성에 기인하여, 다른 뉴클레오티드 코돈들이 특정의 아미노산을 암호화하는 데 사용될 수 있다. 숙주세포는 종종 바람직한 패턴의 코돈 사용을 나타낸다. 구조적 핵산 서열들은 특정 숙주세포의 코돈사용 패턴을 이용하여 구성되는 것이 바람직하다. 이는 일반적으로 형질전환된 숙주세포 내에서 구조적 핵산 서열의 발현을 향상시킨다. 상기 기술된 핵산과 아미노산 서열들 중의 어느 것은 그들이 포함된 숙주세포 또는 유기체 내에서 바람직한 코돈사용을 반영하도록 변형될 수 있다. 식물들에서 최적의 코돈 사용을 위한 구조적 핵산 서열의 변형은 미국특허 제5,689,052호에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 식물 유전자에 대해 전체 길이에 걸쳐서 적 어도 50%, 60% 또는 70%가 일치하는 제 1의 핵산 단편, 제 2의 핵산 단편 또는 이 두 핵산 단편을 포함하는 핵산분자들을 포함한다. 더욱 바람직한 것은, 식물 유전자에 대해 전체 길이에 걸쳐서 적어도 80% 또는 적어도 85%가 일치하는 영역을 포함하는 제 1의 핵산 단편, 제 2의 핵산 단편 또는 이 두 핵산 단편들이다. 이것에 관련되어, 이들의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 90%가 일치하는 제 1의 핵산 단편 및 제 2의 핵산 단편들이 특히 바람직하고, 적어도 95%가 일치하는 것들이 특히 바람직하다. 더욱이, 적어도 97%가 일치하는 것들은 상당히 바람직하고, 적어도 98%와 적어도 99% 일치되는 것들이 특히 상당히 바람직하고, 100%의 동일성을 나타내는 것들이 가장 바람직하다.
본 발명의 핵산분자들의 제 1의 또는 제 2의 핵산 단편의 서브세트(subset)는 핵산분자들 단편(fragment)을 포함한다. 핵산분자의 단편들은 상당 부분이, 또는 실제로 대부분이 식물 유전자로 이루어질 수 있다. 또는, 단편들은 약 15개~약 400개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들을 갖고, 좀더 바람직하게는 약 15개~약 45개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들, 약 20개~약 45개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들, 약 15개~약 30개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들, 약 21개~약 30개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들, 약 21개~약 25개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들, 약 21개~약 24개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들, 약 19개~약 25개의 연속하는 뉴클레오티드 잔기들 또는 약 21개의 연속하는 뉴클레오티드를 갖는 작은 올리고뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 단편은 식물 유전자의 영역에 100% 동질성을 나타낸다. 다른 구체예에 있어서, 단편은 더 큰 핵산 서열의 일부분 을 포함한다. 다른 측면에 있어서, 핵산분자 단편은 본 발명의 핵산분자의 적어도 15, 25, 50 또는 100개의 연속하는 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 핵산분자는 식물유전자의 적어도 15, 25, 50 또는 100개의 연속하는 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 핵산은 어느 한쪽 방향일 수 있고, 그러한 분자들은 센스 방향 또는 안티센스 방향일 수 있다는 것이 이해된다.
제 1의 핵산 단편은 제 2의 핵산 단편과 함께 폴리시스트로닉 구조체에 물리적으로 연결되거나 또는 그것의 일부분일 수 있다. 제 1의 핵산 단편 또는 제 2의 핵산 단편 내의 핵산 서열들은 다른 핵산 단편들과 함께 폴리시스트로닉 구조체에 물리적으로 연결될 수 있거나 또는 그것의 일부분일 수 있다. 프로모터는 제 1의 핵산 단편 및 제 2의 핵산 단편과 함께 폴리시스트로닉 구조체에 물리적으로 연결되거나 또는 그것의 일부분일 수 있다. 그러한 폴리시스트로닉 구조체들은 폴리시스트로닉 mRNA를 발현시킬 수 있다.
i. 하나 이상의 RNAs 로서 전사될 수 있는 제 1의 핵산 단편
제 1의 핵산 단편은 mRNA로서 전사될 수 있고 발현될 수 있는 어떠한 핵산 서열일 수 있다. 하나의 측면에서, 핵산 서열은 자연적으로 발생하는 유전자 또는 유전자의 전사된 단편과 같은 유전자의 일부에서도 발견되는 핵산 서열에 상응한다. 그러한 유전자는 어떤 유기체로부터의 어떠한 유전자일 수도 있다. 바람직한 측면에서, 상기 유전자는 식물로부터의 유전자이다. 다른 바람직한 측면에서, 상기 유전자는 미생물로부터의 유전자이다. 예시적인 유전자는 GMT 유전자이다. mRNA로 서 전사되고 발현되는 제 1의 핵산 단편은 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역될 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 단백질, 이들의 단편들, 폴리펩티드들, 또는 펩티드들은 또한 숙주에 대해 내생적이다. 다른 측면에 있어서, 상기 단백질, 이들의 단편들, 폴리펩티드들 또는 펩티드들은 식물에서 일반적으로 발견되지 않는다. 또 다른 측면에 있어서, 상기 단백질, 이들의 단편들, 폴리펩티드들 또는 펩티드들의 아미노산 서열은 형질전환 되지 않은 숙주 내에서 발견되지 않는다.
제 1의 핵산 단편은 하나 이상의 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코드하는 서열들을 포함할 수 있다는 사실을 또한 이해해야 한다. 이러한 측면에 있어서, 상기 단백질들, 이들의 단편들, 폴리펩티드들 또는 펩티드들은 숙주에 대하여 내생적인 단백질들, 이들의 단편들, 폴리펩티드들 또는 펩티드들의 조합일 수 있고, 일반적으로는 식물에서 발견되지 않고, 또는 형질전환되지 않은 숙주 내에서 발견되지 않는다. 이러한 측면에 있어서, 제 1의 핵산 단편은 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 단백질들, 이들의 단편들, 폴리펩티드들 또는 펩티드들을 인코드할 수 있다.
ii . 하나 이상의 RNAs 를 억제할 수 있는 제 2의 핵산 서열
제 2의 핵산 단편은, 세포 또는 유기체 내로 도입될 경우, 유전자에 의하여 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나, 적어도 부분적으로 감소시키거나, 또는 감소시킬 수 있는 어떠한 핵산 서열일 수 있다. 본 발명의 측면에 있어서, 유전자는 내생적인 유전자이다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유전자는 식물 유전자이다. 예시적인 유전자는 FAD2 유전자이다.
제 2의 핵산 단편은, 세포 또는 유기체 내로 도입될 경우에, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 mRNAs의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나, 적어도 부분적으로 감소시키거나, 또는 감소시킬 수 있는 어떤 핵산 서열일 수 있다는 사실 또한 이해해야 한다. 이러한 측면에서, 개별적인 mRNA는 예를 들면, RNAi와 안티센스 억제와 같은 다른 방법론에 의해 억제될 수 있다는 사실 또한 이해해야 한다.
본 발명의 하나의 측면에서는, 바람직하게는 dsRNA 구조체, 바람직하게는 센스 RNA 구조체 또는 바람직하게는 안티센스 RNA 구조체인, 본 발명의 제 2의 핵산 서열은 단백질 또는 mRNA와 같은 다른 작용물질의 적어도 부분적인 감소, 좀더 바람직하게는 실질적인 감소, 또는 가장 바람직하게는 효과적인 제거를 제공할 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에서, 다른 작용물질은 FAD2 단백질 또는 FAD2 유전자에 의해 인코드된 mRNA이다.
다른 측면에 있어서, 하나 이상의 작용물질들의 수준이 감소되거나, 적어도 부분적으로 감소되거나, 실질적으로 감소되거나, 또는 효과적으로 제거되는 반면에, 하나 이상의 동시에, 공동-발현되거나 또는 동조발현된 작용물질들은 적어도 부분적으로 향상되거나, 적어도 향상되거나 또는 실질적으로 향상된다.
또 다른 구체예에서, 핵산분자가, 세포 또는 유기체내로 도입될 경우에, 제 1의 유전자에 의해 인코드된 제 1의 단백질 또는 RNA 전사 또는 이들 양쪽의 수준 을 증가시키는 동시에, 제 2의 유전자에 의해 인코드된 제 2의 단백질 또는 전사체 또는 이들 양쪽의 수준을 감소시키고, 또한 상기 세포 또는 유기체의 α-토코페롤 함량, 오일조성, 및 오일 수준을 변경시킨다.
다수의 방법론들이 유전자에 의해 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거시키거나, 실질적으로 감소시키거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시키기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 방법들은 유전자 특이성 침묵 또는 다수 유전자들의 침묵을 초래할 수 있다. 그러한 유전자 침묵의 예들은, 제한 없이, 이중가닥의 RNA 분자, 안티센스 및 센스 RNA의 도입에 의해 유도된 것들을 포함한다.
다른 측면에서, 제 2의 핵산 단편은, 세포 또는 유기체 내로 도입될 경우에, 유전자에 의해 인코드된 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을, 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나, 적어도 부분적으로 감소시키거나, 또는 감소시킬 수 있는 어떠한 핵산 서열일 수 있다.
a. dsRNA
유전자 침묵을 위하여 사용될 수 있는 이중-가닥 분자들은 전사체 내에서 발견된 핵산 서열에 상응하는 핵산 서열들을 포함하는 dsRNA 분자들을 포함한다. 그러한 핵산 서열들은, 제한 없이, 단백질, 이들의 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코드하는 핵산 서열들, 및 전사된 인트론, 전사된 3' 비번역 영역(UTRs) 및 전사된 5' UTRs에 상응하는 서열들을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자들의 제 2의 핵산 서열의 하나의 서브세트는 (1) 억제될 제 2의 유전자의 전사영역에 대해 동일성을 나타내는 제 1의 RNA 단편, 및 (2) 제 1의 RNA와 함께 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있는 제 2의 RNA를 포함하는 이중-가닥 RNA로서 발현되는 핵산 서열이다. 제 1의 RNA 단편은 억제될 식물 유전자의 상당 부분 또는 실제로 그것의 대부분으로 이루어질 수 있다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 핵산분자는, 제 2의 식물 유전자로부터의 하나 이상의 식물 인트론들에 대해 충분한 상동성을 나타내는 핵산 서열을 포함하는데, 이는 dsRNA 구조체로서 식물세포 또는 식물 내로 도입될 경우에, 인트론(들)이 유도되는 상기 유전자에 의해 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 것이다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 핵산분자는, 제 2의 식물 유전자로부터의 하나 이상의 식물 엑손들에 대해 충분한 상동성을 나타내는 핵산 서열을 포함하는데, 이는 dsRNA 구조체로서 식물세포 또는 식물 내로 도입될 경우에, 엑손(들)이 유도되는 상기 유전자에 의해 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 것이다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 핵산분자는, 제 2의 식물 유전자로부터의 하나 이상의 전사된 식물 3'UTR(s)에 대해 충분한 상동성을 나타내는 핵산 서열을 포함하는데, 이는 dsRNA 구조체로서 식물세포 또는 식물 내로 도입될 경우에, 3'UTR(s)가 유도되는 상기 유전자에 의해 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수 준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 것이다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 핵산분자는, 제 2의 식물 유전자로부터의 하나 이상의 전사된 식물 5'UTR(s)에 대해 충분한 상동성을 나타내는 핵산 서열을 포함하는데, 이는 dsRNA 구조체로서 식물세포 또는 식물 내로 도입될 경우에, 5'UTR(s)가 유도되는 유전자에 의해 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 것이다.
다른 바람직한 측면에 있어서, dsRNA 구조체는 엑손 서열들을 포함하지만, 상기 엑손 서열들은 엑손이 유도되는 제 2의 유전자에 의해 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있을 정도로 충분한 부분의 식물 엑손에 상응하지 않는다. dsRNA 구조체들로 유전자 발현을 억제하는 방법은 2000년 6월 9일자로 출원된 미국특허 가출원 번호 제60/390,186호에 개시된 내용을 포함한다.
b. 안티센스 억제
유전자 침묵을 위해 사용될 수 있는 안티센스 분자들은, 전사체 내에서 발견된 핵산 서열의 상보체 또는 이들의 일부분 또는 안티센스 분자로서의 역할을 하기에 충분한 상보성을 지닌 분자들에 상응하는 핵산 서열들을 포함하는 어떠한 분자를 포함한다. 그러한 분자들은, 제한 없이, 단백질, 이들의 단편 또는 폴리펩티드를 인코드하는 서열들의 상보체인 서열들과, 전사된 인트론들, 전사된 3' 비번역 영역(UTRs) 및 전사된 5'UTRs에 상응하는 서열들의 상보체인 서열들을 포함한다.
안티센스 접근 방법들은 유전 물질을 타겟으로 함으로써 유전자 기능을 방해하거나 또는 감소시키는 방법이다(Mol 등, FEBS Lett. 268:427~430(1990)). 안티센스 접근방법의 목적은, 선택된 단일 단백질의 수준이 선택적으로 감소되거나 또는 제거되는 돌연변이 세포주 또는 유기체의 발현과 생성을 막기 위하여 상기 타겟 유전자에 상보성이 있는 서열을 이용하는 것이다. 비활성화 부위와 그것의 성장 효과는 안티센스 유전자들을 위한 프로모터의 선택에 의해 또는 외적인 적용시기 또는 미량주입 시기에 의해 조작될 수 있다. 안티센스는 타겟 유전자의 고유의 영역들 또는 다른 관련된 유전자들에 대해 상동성을 공유하는 영역들 중의 어느 것을 선택함으로써 특이적으로 조작될 수 있다(Hiatt 등, In: Genetic Engineering , Setlow(ed), Vol.11, New York: Plenum 49~63(1989)).
안티센스 RNA 기술은 세포들 내로 도입되는 타겟 mRNA에 대하여 상보성이 있는 RNA의 도입을 포함하고, 이는 안티센스 기질과 타겟 mRNA 사이의 염기쌍에 의해 형성된 특정 RNA:RNA 중복을 야기한다(Green 등, Annu . Rev . Biochem . 55:569~597(1986)). 한가지 구체예에서, 이 공정은 안티센스 유전자 서열의 도입과 발현을 포함한다. 그러한 서열은, 정상적인 유전자 서열들의 일부분 또는 전부가 역방향으로 프로모터 아래에 위치하고 있어, "틀린" 또는 상보성 가닥이 타겟 mRNA와 함께 혼성화되는 비코딩 안티센스 RNA로 전사되어, 그것의 발현을 방해하는 서열이다(Takayama 및 Inouye, Crit , Rev . Biochem . Mol . Biol. 25:155~184(1990)). 안티센스 벡터는 표준 공정에 의해 구성되고, 형질전환, 형질감염, 전기 영동법, 미량주입법, 감염 등에 의해 도입된다. 형질전환의 유형과 벡터의 선택은 발현이 일시적인지 또는 안정한지 여부에 따라 결정될 것이다. 안티센스 유전자를 위해 사용된 프로모터는 안티센스 억제의 수준, 시기, 조직, 특이성 또는 유도성에 영향을 끼칠 수 있다.
c. 공동억제 또는 센스억제
유전자 침묵을 위하여 사용될 수 있는 센스 억제 분자들은, 전사체 또는 이들의 일부 또는 센스 분자들로서 작용을 할 수 있는 충분한 상보성을 지닌 분자들에서 발견된 핵산 서열에 상응하는 핵산 서열들을 포함하는 어떤 분자들을 포함한다. 그러한 분자들은, 제한 없이, 단백질, 이들의 단편 또는 폴리펩티드를 인코드하는 서열들 및 전사된 인트론들, 전사된 3' 비번역 영역들(UTRs) 및 전사된 5'UTRs에 상응하는 서열들을 포함한다.
공동억제는 내생적 유전자의 전사체와 동일한 사슬들의 mRNA를 전사시킬 수 있는 상동성 센스 구조체의 발현에 의해 특정의 내생 유전자 또는 유전자족의, 대개 RNA의 수준에서의, 발현수준을 감소시키는 것이다(나폴리 등, Plant Cell 2:279~289(1990); 반데크롤 등, Plant Cell 2:291~299(1990)). 공동억제는 세포 내에서 발견된 핵산 서열에 대해 상동성인 핵산분자의 단일 카피로 안정하게 형질전환시키거나(Prolls와 Meyer, Plant J. 2:465~475(1992)), 또는 세포 내에서 발견된 핵산 서열에 대해 상동성인 핵산 분자의 다수의 카피들로 안정하게 형질전환(Mittlesten 등, Mol . Gen . Genet. 244:325~330(1994))시키므로써 이루어질 수 있다. 비록 다른 유전자들일지라도, 상동성 프로모터에 연결된 유전자들은 공동으 로 억제될 수 있다(Vaucheret, C.R. Acad . Sci . III 316:1471~1483(1993); Flavell. PNAS USA , 91:3490~3496(1994); 반 블록랜드 등, Plant J. 6:861~877(1994); Jorgensen, Trends Biotechnol. 8:340~344(1990); Meins와 Kunz, In: Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants, Paszkowski(ed.), pp.335~348, Kluwer Academic, Netherlands(1994)).
ⅲ. 핵산분자들의 억제 또는 발현
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 단일의 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 단백질들, 이들의 단편들, 폴리펩티드들 또는 펩티드들을 인코드할 수 있는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은, 세포 또는 유기체 내로 도입될 경우에, 단일 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 유전자에 의해 인코드된 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 mRNA 전사체들 또는 단백질들의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나, 적어도 부분적으로 감소시키거나, 또는 감소시킬 수 있는 핵산분자를 제공한다.
C. 구조체/벡터의 다른 성분들
구조체들 또는 벡터들은, 목적하는 영역 내에서, 상기 영역의 전사를 종결시키도록, 전체적으로 또는 부분적으로 작용하는 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 그러한 많은 서열들은 분리되었고, Tr7 3'서열과 NOS 3'서열을 포함한다(Ingelbrecht 등, Plant Cell 1:671~680(1989); Bevan 등, Nucleic Acids Res . 11:369~385(1983)). 또한 조절 전사 종결영역들이 본 발명의 식물 발현 구조체 내 에 제공될 수 있다. 전사 종결영역들은 목적 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 의해 또는 다른 유전자원으로부터 유도된 편리한 전사 종결영역, 예를 들면, 전사 개시영역과 자연적으로 관련된 전사 종결영역에 의해 제공될 수 있다. 당업자는 식물세포 내에서 전사종결을 할 수 있는 어떠한 편리한 전사 종결영역이 본 발명의 구조체들에 적용될 수 있음을 인정할 것이다.
벡터 또는 구조체는 조절 요소들을 또한 포함할 수 있다. 그러한 예들은 Adh 인트론1(Callis 등, Gene and Develop . 1:1183~1200(1987)), 슈크로즈 신타제 인트론(Vasil 등, Plant Physiol. 91:1575~1579(1989)) 및 TMV 오메가 요소(Gallie 등, Plant Cell 1:301~311(1989))를 포함한다. 이들 및 다른 조절 요소들은 적절한 경우에 포함될 수 있다.
벡터 또는 구조체는 선택 가능한 마커를 또한 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커들은 외생적인 유전자 물질을 포함하는 식물들 또는 식물 세포들을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 예들은, 제한되지 않지만, 카나마이신 저항성을 코드하여, 카나마이신, RptII, G418, hpt의 사용을 위해 선택될 수 있는 네오 유전자(Potrykus 등, Mol . Gen . Genet . 199:183~188(1985)); 바이아라포스(bialaphos) 저항성을 코드화하는 바(bar) 유전자; 돌연변이 EPSP 신타제 유전자(Hinchee 등, Bio/Technology 6:915~922(1988); Reynaerts 등, 선택가능하고 스크리닝가능한 마커들, In Gelvin and Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht(1988)); 글리포세이트 저항성을 코드하는 aadA(Scofield 등, Mol . Gen . Genet. 244(2):189~96(1994)); 브로목시닐에 대한 저항성을 제공하는 니트릴라제 유전자(Stalker 등, J. Biol . Chem . 263:6310~6314(1988)); 이미다졸리논 또는 설포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타제 유전자(ALS)(유럽특허출원 제 154,204호(1985년 9월 11일)); ALS(D'Halluin 등, Bio / Technology 10:309~314(1992)); 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자(Thillet 등, J. Biol . Chem. 263:12500~12508(1988))를 포함한다.
벡터 또는 구조체는 또한 스크리닝 가능한 마커를 포함할 수 있다. 스크리닝 가능한 마커들은 발현을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝 가능한 마커들은, 여러 가지의 색원체 기질이 알려진 효소를 인코드하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자(GUS)(Jefferson, Plant Mol . Biol , Rep . 5:387~405(1987); Jefferson 등, EMBO J. 6:3901~3907(1987)); 식물조직 내에서 안토시아닌 염료(적색)의 생성을 조절하는 생성물을 인코드하는 R-로커스 유전자(Dellaporta 등, Stadler Symposium 11:263~282(1988)); β-락타마제 유전자(Sutcliffe 등, PNAS USA 75:3737~3741(1978)), 여러 가지의 색원체 기질이 알려진 효소를 인코드 하는 유전자(예컨대, PADAC, 색원체 세파로스포린); 루시페라제 유전자(Ow 등, Science 234:856~859(1986)); 색원체 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 인코드 하는 xylE 유전자(Zukowsky 등, PNAS USA 80:1101~1105(1983)); α-아밀라제 유전자(Ikatu 등, Bio / Technology 8:241~242(1990)); 티로신을 DOPA와 도파퀴논으로 산화시킨 다음, 멜라닌으로 농축시킬 수 있는 효소를 인코드하는 티로시나제 유전자(Katz 등, J. Gen . Microbiol . 129:2703~2714(1983)); 및 색원체 α-갈락토스 기질을 변화시킬 수 있는 효소를 인코드하는 α-갈락토시다제 유전자를 포함한다.
"선택 가능한 또는 스크리닝 가능한 마커 유전자들"이라는 용어에는 마커의 분비가 형질전환된 세포들의 확인수단 또는 선발수단으로서 검출될 수 있는 분비가능한 마커를 인코드하는 유전자들이 또한 포함된다. 실시예들은 항체 상호작용에 의해 확인될 수 있는, 분비가능한 항원을 인코드하거나, 또는 심지어 촉매적으로 검출할 수 있는 분비가능 효소들을 인코드하는 마커들을 포함한다. 분비가능한 단백질들은, 검출할 수 있는(예컨대, ELISA법에 의해) 작은 크기의 분산가능한 단백질들, 세포외 용액 내에서 검출가능한 작은 활성 효소들(예컨대, α-아밀라제, β-락타마제, 포스피노트리신 전이효소), 또는 세포벽 내에 삽입 또는 트랩되는 단백질들(확장 발현 유닛 또는 담배 PR-S 내에서 발견된 바와 같은 리더서열을 포함하는 단백질들과 같은 것)을 포함하는 다수의 부류들로 나뉜다. 다른 가능성 있는, 선택가능하고 및/또는 스크리닝 가능한 마커 유전자들은 당업자들에게는 자명할 것이다.
형질전환 식물들, 이들의 일부 및 식물 세포들
외생적 유전 물질은 식물세포 내로 이동될 수 있고, 그 식물 세포는 생식능력이 있거나 또는 생식능력이 없는 식물 전체 또는 식물의 일부로 재생될 수 있다. 외생적 유전 물질은 자연적으로 발생하거나 또는 그렇지 않은, 어떠한 유기체 내로 삽입가능한 어떤 소스로부터의 어떤 유전 물질이다. 그러한 외생적 유전 물질은, 제한 없이, 핵산 분자들과, 본원에 나타낸, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 구조체들을 포함한다.
바람직한 측면에 있어서, 본 발명의 식물 세포 또는 식물은 제 1 및 제 2의 핵산 서열을 포함하는 핵산분자들 포함하고, 상기 제 1의 핵산 서열은 발현될 경우에 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 적어도 부분적으로 향상시키거나, 증가시키거나, 향상시키거나 또는 실질적으로 향상시킬 수 있고, 그리고 상기 제 2의 핵산 서열은, 발현될 경우에, 유전자 또는 그 유전자에 대해 상동성을 갖는 어떠한 유전자에 의해 인코드된 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거하거나, 실질적으로 감소시키거나 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 하나 이상의 식물 유전자들에 대해 충분한 상동성을 나타낸다.
유전자의 발현을 억제할 수 있는 어떠한 방법론도 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 식물 세포 또는 식물은 GMT 유전자에 의하여 인코드되는 단백질, 전사체 또는 이들 모두를 증가시킬 수 있음과 동시에 FAD2 유전자에 의해 인코드되는 단백질, 전사체 또는 이들 모두를 선택적으로 감소시킬 수 있는 핵산 서열을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
바람직한 측면에 있어서, 본 발명의 식물 세포 또는 식물은 제 1의 핵산 단편 및 제 2의 핵산 단편을 포함하는 핵산분자를 포함하고, 상기 제 1의 핵산 단편, 제 2의 핵산 단편, 또는 이들 모두는 종자의 오일 조성을 변경시킬 수 있다. 좀더 바람직한 측면에 있어서, 제 1의 핵산 서열은, 발현될 경우에, α-토코페롤의 수준을 증가시킬 수 있고, 상기 제 2의 핵산 단편은, 발현될 경우에, 올레인산 또는 오일함량 또는 이들 모두의 수준을 증가시킬 수 있을 정도로, 하나 이상의 식물 유전자들의 상보체에 대해 충분한 상동성을 나타내고, 제 1의 핵산 서열과 제 2의 핵산 서열은 단일 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.
유전 물질은, 예를 들면, 제한되지는 않지만, 자주개자리, 사과, 아라비돕시스, 바나나, 보리, 브래시카 캠페스트리스, 캐놀라, 피마자씨, 국화, 커피, 솜, 목화씨, 옥수수, 크램브, 크랜베리, 오이, 덴드로비움, 디오스코레아, 유칼립투스, 김의털, 아마, 글라디올러스, 백합, 아마인, 기장, 머스크멜론, 겨자, 귀리, 기름야자, 유지종자 평지, 파파야, 땅콩, 낙화생, 다년생 식물, 감자, 평지씨, 벼, 호밀, 독보리 속의 목초, 잇꽃, 참깨, 수수류, 콩, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 담배, 토마토, 잔디풀 및 밀을 포함하는 단자엽 식물 또는 쌍떡잎 식물들과 같은 어떤 종들에 도입될 수 있으며(Christou, INO: Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit, Academic Press, San Diego, California(1996)), 그 중에서도 자주개나리, 아라비돕시스, 브래시카 캠페스트리스, 캐놀라, 피마자 씨, 옥수수, 목화, 목화씨, 크램브, 아마, 아마인, 겨자, 기름야자, 유지종자 평지, 땅콩, 감자, 평지씨, 잇꽃, 참깨, 콩, 해바라기, 담배, 토마토와 밀이 바람직하고, 특히 브래시카 캠페스트리스, 캐놀라, 옥수수, 기름야자, 유지종자 평지, 땅콩, 평지씨, 잇꽃, 콩과 해바라기가 더 바람직하다. 더욱 더 바람직한 측면에서, 유전자 물질은 캐놀라 내로 전이된다. 다른 더욱 바람직한 측면에서는, 유전자 물질은 유지종자 평지 내로 전이된다. 특히 다른 바람직한 구체예에서, 유전자 물질은 콩 또는 옥수수 내로 전이된다.
유전자 물질은 식물세포와 같은 적당한 세포 내로 또한 도입가능하다. 상기 세포는 다세포성 환경에서 존재할 수 있다. 본 발명의 측면에서는, 다세포성 환경 은 형질전환된 식물 내일 수 있다.
유전자 물질은 또한 포유동물 세포, 포유동물, 물고기 세포, 물고기, 새 세포, 새, 조류 세포, 조류, 균류 세포, 균류 또는 박테리아 세포와 같은 세포 또는 유기체 내로 도입될 수도 있다. 바람직한 숙주와 형질전환체는 다음을 포함한다: 아스퍼질러스와 같은 균류 세포들, 효모, 포유 동물들, 특히 소 및 돼지, 곤충들, 박테리아 및 조류. 특히 바람직한 박테리아는 아그로박테리움 투메파시엔스 및 E.Coli이다.
전사체들 또는 단백질들과 같은 생성물들의 수준은, 식물과 같은 유기체의 전체에서 또는 상기 유기체의 한정된 하나 이상의 특정 기관 또는 조직들에서 증가하거나 또는 감소하거나 또는 이들 양쪽 모두가 가능하다. 예를 들면, 생성물들의 수준은, 제한되지 않고, 뿌리, 괴경, 줄기, 잎, 대, 과일, 액과, 열매(nut), 수피, 깍지, 종자 및 꽃들을 포함하는 식물의 하나 이상의 기관들과 조직들 내에서 증가 또는 감소될 수 있다. 바람직한 기관은 종자이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 핵산을 갖는 식물 또는 다른 유기체의 형질전환 후에, 하나 이상 작용물질들의 수준은 적어도 부분적으로 향상되거나, 증가되거나, 향상되거나 또는 실질적으로 향상되는 반면, 제 2의 작용물질은 제 1의 작용물질과 함께 동시에 발현되거나, 공동발현되거나 또는 동조발현된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 핵산을 갖는 식물 또는 다른 유기체가 형질전환된 후에, 하나 이상의 작용물질들의 수준은 적어도 부분적으로 향상되거나, 증가되거나, 향상되거나 또는 실질적으로 향상되는 반면에, 제 2의 작용물질은 동시 에 발현되거나, 공동발현되거나 또는 동조발현되고, 상기 제 2의 작용물질의 동시발현, 공동발현 또는 동조발현은 다른 작용물질의 감소를 야기하고, 바람직하게는 다른 작용물질의 적어도 부분적인 감소, 실질적인 감소 또는 효과적인 제거를 야기한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 핵산을 갖는 식물 또는 다른 유기체가 형질전환된 후에, 하나 이상의 작용물질들의 수준은 적어도 부분적으로 향상되거나, 증가되거나, 향상되거나 또는 실질적으로 향상되는 반면에, 제 2의 작용물질은 두가지 이상의 작용물질들과 함께 동시에 발현되거나, 공동발현되거나 또는 동조발현된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 핵산을 갖는 식물 또는 다른 유기체가 형질전환된 후에, 하나 이상의 작용물질들의 수준은 적어도 부분적으로 향상되거나, 증가되거나, 향상되거나 또는 실질적으로 향상되는 반면에, 제 2의 작용물질은 세가지 이상의 작용물질들과 함께 동시에 발현되거나, 공동발현되거나 또는 동조발현된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 핵산을 갖는 식물 또는 다른 유기체가 형질전환 된 후에, 하나 이상의 작용물질들의 수준은 적어도 부분적으로 향상되거나, 증가되거나 또는 실질적으로 향상되는 반면에, 추가적인 작용물질들은 제 1의 작용물질과 동시발현되거나, 공동발현되거나 또는 동조발현되고, 상기 추가적인 작용물질들, 바람직하게는 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상 또는 다섯 이상의 작용물질들의 동시발현, 공동발현 또는 동조발현은 하나 이상의 작용물질들, 바람직하게는 둘 이 상, 셋 이상, 넷 이상 또는 다섯 이상의 작용물질들의 적어도 부분적 감소, 실질적 감소 또는 효과적인 제거를 초래한다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 핵산을 갖는 식물 또는 다른 유기체가 형질전환되 후에, 하나 이상의 작용물질들은 적어도 부분적으로 향상되거나, 증가되거나, 향상되거나 또는 실질적으로 향상되는 반면에, 다른 작용물질 또는 작용물질들은 동시발현, 공동발현 또는 동조발현되고, 그러한 발현은 하나의 작용물질 또는 작용물질들의 적어도 부분적인 감소, 실질적인 감소 또는 효과적인 제거를 야기한다.
작용물질의 수준을 비교할 때에, 그러한 비교는 유사한 유전적 배경을 갖는 유기체들 사이에서 실시하는 것이 바람직하다. 바람직한 측면에 있어서, 유사한 유전적 배경은, 비교대상 유기체들이 그들의 핵 유전 물질의 50% 또는 그 이상을 공유하는 배경이다. 좀더 바람직한 측면에 있어서, 유사한 유전적 배경은, 비교대상 유기체들이 그들의 핵 유전자 물질의 75% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 심지어 90% 또는 그 이상을 공유하는 배경이다. 좀더 바람직한 다른 측면에 있어서, 유사한 유전적 배경은, 비교대상 유기체들이 식물들이고, 이 식물들이 식물 형질전환 기술을 사용하여 원래 도입된 어떤 유전 물질을 제외하고는 동질 유전자형인 식물인 것을 의미한다.
바람직한 측면에 있어서, 작용물질의 수준을 부분적으로 향상시키거나, 향상시키거나 또는 실질적으로 향상시키기 위한 핵산 서열의 능력은 mRNA 전사체들의 수준비교에 의해 실행된다. 바람직한 측면에 있어서, 다른 유전자에 대한 어느 유 전자의 수준을 부분적으로 향상시키거나, 향상시키거나 또는 실질적으로 향상시키기 위한 핵산 서열의 능력은, 상기 유전자들에 의해 인코드된 단백질들, 이들의 단편들 또는 폴리펩티드들의 수준의 비교에 의해 실행된다. 바람직한 측면에 있어서, 다른 유전자에 대한 어느 유전자의 수준을 감소시키기 위한 핵산 서열의 능력은 mRNA 전사체들의 수준 비교에 의해 실행된다. 바람직한 측면에 있어서, 다른 유전자에 대한 어느 유전자의 수준을 감소시키기 위한 핵산 서열의 능력은, 상기 유전자들에 의해 인코드된 단백질들, 이들의 단편들 또는 폴리펩티드들의 수준 비교에 의해 실행된다. 여기에서 사용된, mRNA 전사체들은 가공처리된(processed) mRNA 및 비-가공처리된 mRNA 전사체를 포함한다. 여기에서 사용된, 단백질들, 이들의 단편들 또는 폴리펩티드들은 어떤 번역-후 변형이 있거나 또는 그런 변형이 없는 단백질들, 이들의 단편들 또는 폴리펩티드들을 포함한다. 다른 바람직한 측면에 있어서, 다른 유전자에 대한 어느 유전자의 수준을 증가시키기 위한 핵산 분자의 능력은 표현형의 비교에 의해 실행된다. 바람직한 측면에 있어서, 표현형의 비교는 α-토코페롤 함량의 비교이다. 바람직한 측면에 있어서, 표현형의 비교는 지방산 조성의 비교이다. 바람직한 측면에 있어서, 표현형의 비교는 총 오일 수준의 비교이다.
핵산 분자들을 식물들 또는 유기체들 내로 도입하는 방법들
핵산 분자들을 식물 세포들 내로 도입시키기 위한 많은 방법들이 있다. 적당한 방법들은, 예컨대, 형질감염, 주사, 반사, PEG-매개 형질전환과 같은 아그로박테리움 감염 또는 핵산 분자의 직접 운반에 의한 것, 전기영동에 의한 것, 또는 DNA 코팅된 입자들의 가속화에 의한 것 등과 같은, 핵산 분자를 세포들 내로 도입 시킬 수 있는 어떤 방법이 실질적으로 포함되는 것으로 여겨진다(Potrykus, Ann . Rev. Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 42:205~225(1991); Vasil, Plant Mol . Biol. 25:925~937(1994)). 예를 들면, 전기영동은 옥수수 원형질체들을 형질전환시키기 위해 사용된다(Fromm 등, Nature 312:791~793(1986)).
핵산들은 또한, 제한되지는 않지만, 접합, 세포이물흡수 및 식균작용을 포함하는 방법들을 통하여 유기체 내로 도입될 수 있다. 또한, 핵산은 식물, 식물 세포, 조류, 조류 세포, 균류, 균류 세포, 박테리아 세포, 포유동물 세포, 어류 세포 또는 새의 세포로부터 유래된 세포 또는 유기체 내로 도입될 수 있다. 특히 바람직한 미생물들은 E. Coli와 아그로박테리움종들이다.
DNA를 세포들 내로 도입시키는 기술은 당업자들에게는 공지이다. 유전자를 세포들 내로 전달하기 위한 4가지의 일반적 방법들이 기술되어 있다:
(1) 화학적 방법들(Graham and van der Eb. Virology 54:536~539(1973)); (2) 미량주입(Capecchi, Cell 22:479~488(1980)), 전기 영동법(Wong and Neumann, Biochem, Biophys , Res . Commun 107:584~587(1982);Fromm 등, PNAS USA 82:5824~5828(1985); 미국특허 제5,384,253호)과 같은 물리적인 방법들; 유전자 총(Johnston과 Tang, Methods Cell Biol . 43:353~365(1994)); 및 진공 침투(Bechtold 등, C.R. Acad . Sci . Paris . Life Sci . 316:1194~1199(1993)); (3) 바이러스성 벡터들(Clapp, Clin , Perinatol 20:155~168(1993); Lu 등, J. Exp . Med. 178:2089~2096(1993); Eglitis와 Anderson, Biotechniques 6:608~614(1988)); 및 (4) 수용체-매개 메카니즘(Curiel 등, Hum . Gen . Ther . 3:147~154(1992); 와그너 등; PNAS USA 89:6099~6103(1992)).
사용될 수 있는 가속화 방법들은, 예를 들면, 마이크로프로젝틸 충격 등을 포함한다. 핵산분자들을 식물세포 내로 형질전환시키기 위해 전달하는 방법의 한 가지 예는 마이크로프로젝틸 충격이다. 이 방법은 Yang 및 Christou(eds.)의 Particle Bombardment Technology for Gene Transfer , Oxford Press, Oxford, England(1994)에서 검토되어 있다. 비-생물학적 입자들(마이크로프로젝틸)은 핵산분자들로 코팅될 수 있고, 추진력에 의해 세포들 내로 전달된다. 예시적인 입자들은 텅스텐, 금, 백금 등을 포함하는 것들을 포함한다.
마이크로프로젝틸 충격의 특별한 잇점은, 외떡잎 식물들을 복제가능하게 형질전환시키기에 효과적인 방법인 것 이외에, 원형질체들의 분리(Cristou 등, Plant Physiol. 87:671~674(1988)) 및 아그로박테리움 감염에 대한 감수성이 필요하지 않다는 것이다. 가속화 방법에 의해 DNA를 옥수수 세포들 내로 전달하기 위한 방법의 예시적인 구체예는, 현탁액 내에서 배양된 옥수수 세포들로 덮힌 필터 표면상으로, 스테인레스스틸 또는 Nytex 스크린과 같은 스크린을 통해 DNA로 코팅된 입자들을 추진시키기 위해 사용될 수 있는 바이오리스틱 α-입자 전달 시스템이다. Gordon-Kamm 등은 DNA로 텅스텐 입자들을 코팅하기 위한 기본적인 방법을 설명하고 있다(Gordon-Kamm 등, Plant Cell 2:603~618(1990)). 스크린에 의해 텅스텐 핵산 입자들이 분산되므로, 이들은 큰 덩어리 형태로 수령세포 내로 전달되지는 않는다. 본 발명에 따른 사용에 적합한 입자 전달 시스템은 헬륨 가속화 PDS-1000/He 총이고, 이는 Bio-Rad Laboratories(Bio-Rad, Hercules, California)로부터 구입가능하 다(Sanford 등, Technique 3:3~16(1991)).
충격을 위하여, 현탄액 내의 세포들은 필터상에서 농축될 수 있다. 충격을 받을 세포들을 포함하는 필터들은 마이크로프로젝틸 스토핑 플레이트 아래에 적절한 거리를 두고 위치된다. 바람직하다면, 하나 이상의 스크린들이 또한 총과 충격을 받을 세포들 사이에 위치할 수 있다.
또는, 미숙 배 또는 다른 타겟 세포들이 고체 배양 배지상에 배열될 수 있다. 충격을 받을 세포들을 마이크로프로젝틸 스토핑 플레이트 아래에 적절한 거리를 두고 위치시킨다. 바람직하다면, 하나 이상의 스크린들이 또한 가속화 장치와 충격을 받을 세포들 사이에 위치한다. 여기에 나타낸 기술을 사용하므로써, 누구라도 마커 유전자를 일시적으로 발현시키는 세포들의 1000 또는 그 이상의 loci(염색체좌)를 얻을 수 있다. 충격 후 48시간 이내에 외생적 유전자 생성물을 발현하데 집중되는 세포들의 개수는 1~10개의 범위 내이고, 평균 1~3개이다.
충격 형질전환에 있어서, 최대수의 안정한 형질전환체를 얻기 위해서는 누구라도 충격전 배양조건들과 충격 매개변수들을 최적화할 수 있다. 충격을 위한 물리적 매개변수들과 생물학적 매개변수들 모두 이 기술에 있어서 중요하다. 물리적 요인들은 DNA/마이크로프로젝틸 침전을 조작하는 것과 관련된 요인들 또는 매크로프로젝틸 또는 마이크로프로젝틸의 비행과 속도에 영향을 주는 요인들이다. 생물학적 요인들은 충격전과 직후에, 세포들의 조작에 관련된 모든 단계들과, 충격과 관련된 외상을 완화시키기 위해서 도움이 되는 타겟 세포들의 삼투조절 및 선형 DNA 또는 완전한 슈퍼코일 플라스미드와 같은 형질전환 DNA의 성질을 포함한다. 충격-전 조 작들은 미숙 배의 성공적인 형질전환을 위해 특히 중요하다고 믿어진다.
따라서, 누구나 상기 조건들을 완전히 최적화하기 위해서는 소규모의 연구로 충격 매개변수들의 여러가지 측면들을 조절하기를 원할 수 있을 것이다. 특히 갭거리, 비행거리, 조직거리와 헬륨압과 같은 물리적 매개변수들을 조절하기를 원할 것이다. 수용 세포들의 생리적 상태에 영향을 끼쳐서, 형질전환과 통합효율에 영향을 미칠 수 있는 조건들을 개선시키므로써 외상의 감소 요인들을 최소화할 수 있다. 예를 들면, 삼투상태, 조직수화 및 2차 배양단계 또는 수용세포들의 세포사이클은 최적의 형질전환을 위해 조절될 수 있다. 다른 통상적인 조절들의 실행은 본 발명 개시 내용에 비추어 당업자들에게 자명할 것이다.
아그로박테리움-매개 전이는, DNA가 전체 식물 조직들에 도입될 수 있고, 이에 따라서 원형질체로부터 완전한 식물의 재생을 위한 필요성이 무시되기 때문에, 유전자들을 식물세포들 내로 도입하기 위하여 광범위하게 이용될 수 있는 시스템이다. DNA를 식물세포들 내로 도입시키기 위한 아그로박테리움-매개 식물 통합 벡터들의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Fraley 등, Bio / Technology 3:629~635(1985)와 Rogers 등, Methods Enzymol . 153:253~277(1987)을 참고. 또한, Ti-DNA의 통합은 약간의 재배열만 이루어지는, 대체적으로 간단한 공정이다. 이동될 DNA의 영역은 경계서열들에 의해 규정되고, 개입되는 DNA는 기술된 바와 같이 통상적으로 식물 게놈 내로 삽입된다(Spielmann 등, Mol . Gen . Genet . 205:34(1986)).
최근의 아그로박테리움 형질전환 벡터들은 아그로박테리움과 마찬가지로 E.coli 내에서 복제될 수 있고, Klee 등, Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell(eds.), Springer-Verlag, New York, pp.179~203(1985)에 기술된 바와 같이 편리한 조작을 가능하게 한다. 더구나, 아그로박테리움-매개 유전자 전이를 위한 벡터들에 대한 기술적인 진보는 여러 가지의 폴리펩티드-코딩 유전자들을 발현시킬 수 있는 벡터들의 구성을 용이하게 할 수 있도록 벡터들 내에서의 유전자들과 제한 부위들의 배치를 개선시켰다. 기술된 벡터들은 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자들의 직접적인 발현을 위하여 프로모터와 폴리아데닐화 부위에 의해 플랭크된(flanked), 편리한 다수-링커 영역들을 가지고 있고, 이들은 본 발명의 목적에 적합하다(Rogers 등, Methods Enzymol . 153:253~277(1987)). 또한, 병원성이 유지된(armed) Ti 유전자 및 병원성이 해제된(disarmed) Ti 유전자 양쪽 모두를 포함하는 아그로박테리움은 형질전환을 위하여 사용될 수 있다. 이것은 아그로박테리움-매개 형질전환이 효과적인 식물 변종들에 있어서, 유전자 전이의 용이하고 규정된 성질 때문에 선택되는 방법이다.
아그로박테리움 형질전환방법을 사용하여 형성된 형질전환 식물은, 전형적으로 하나의 염색체상에 단일 유전자를 포함한다. 그러한 형질전환 식물들은 추가된 유전자에 대해서 동형접합성인 것으로 언급될 수 있다. 더 바람직한 것은, 추가된 구조 유전자에 대해 동형접합성인 형질전환 식물이다; 즉 형질전환 식물은 염색체쌍의 각각의 염색체상의 동일한 부위에 하나의 유전자씩, 두 개의 추가된 유전자들을 포함한다. 동형접합성 형질전환 식물은 첨가된 단일 유전자를 포함하는 형질전환 식물인 독립된 분리체(segregant)를 유성적으로 교배시키고, 생성된 종자 몇가 지를 발아시키고, 목적 유전자를 위하여 생성된 결과의 식물들을 분석하므로써 얻어질 수 있다.
또한, 두 가지의 다른 형질전환 식물들은 두가지의 독립적으로 분리되는, 외생의 구조체들을 포함하는 자손을 만들기 위해 교배될 수 있다. 적절한 자손의 자배에 의해 목적 폴리펩티드를 인코드하는 추가된 외생의 유전자들에 대하여 동형접합성인 식물들을 만들 수 있다. 영양번식처럼, 부모 식물에 대한 역교배 및 비-형질전환 식물과의 이계교배 또한 이루어질 수 있다.
식물 원형질체의 형질전환은 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌글리콜 처리, 전기 영동 및 이들 처리방법들의 조합에 기초를 둔 방법들을 사용하여 이루어질 수 있다(예컨대, Potrykus 등, Mol . Gen . Genet . 205:193~200(1986); Lorz 등, Mol . Gen. Genet . 199:178(1985); Fromm 등, Nature 319:791(1986); Uchimiya 등, Mol . Gen. Genet . 204:204(1986); Marcotte 등, Nature 335:454~457(1988)). 다른 식물 종들에 대한 이 시스템들의 적용은, 원형질체들로부터 특정의 식물 종을 재생시킬 수 있는 능력에 따라서 달라진다. 원형질체들로부터 곡물들의 재생을 위한 예시적인 방법들이 기술되어 있다(Fujimura 등, Plant Tissue Culture Letters 2:74(1985); Toriyama 등, Theor . Appl . Genet. 205:34(1986); Yamada 등, Plant Cell Rep. 4:85(1986); Abdullah 등, Biotechnology 4:1087(1986)).
원형질체들로부터 성공적으로 재생될 수 없는 식물 종들을 형질전환시키기 위하여, 손상되지 않은 세포들 또는 조직들에 DNA를 도입시키는 다른 방법들이 이용될 수 있다. 기술된 바와 같이, 예를 들면, 미숙 배 또는 외식편(explants)들로 부터의 곡물들의 재생이 효과적일 수 있다(Vasil, Bio / Technology 6:397(1988)). 또한, "입자 총" 또는 고속 마이크로프로젝틸 기술이 이용될 수 있다(Vasil 등, Bio/Technology 10:667(1992)). 후자의 기술을 사용하여, 기술된 바와 같이, DNA는 작은 금속입자들의 표면상에서 세포벽을 통해서 운반되어, 세포질 내로 운반된다 (Klein 등, Nature 328:70(1987); Klein 등, PNAS USA 85:8502~8505(1988); McCabe 등, Bio / Technology 6:923(1988)). 금속 입자들은 세포들의 여러 층들을 통해 침투하여, 조직의 외식편 내에서 세포들의 형질전환을 가능하게 한다.
목화(미국특허 제5,004,863호; 미국특허 제5,159,135호; 미국특허 제5,518,908호); 콩(미국특허 제5,569,834호; 미국특허 제5,416,011호; McCabe 등, Biotechnology 6:923(1988); Christou 등, Plant Physiol, 87:671~674(1988)); 브래시카(미국특허 제5,463,174호); 땅콩(Cheng 등, Plant Cell Rep . 15:653~657(1996); McKently 등, Plant Cell Rep . 14:699~703(1995)); 파파야; 완두콩(Grant 등, Plant Cell Rep . 15:254~258(1995)); 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(Bechtold 등, C.R. Acad . Sci . Paris , Life Sci . 316:1194~1199(1993))에 대해서, 주로 아그로박테리움 투메파시엔스의 사용에 의하여, 쌍자엽 식물들을 형질전환시키는 방법들과 형질전환 식물들을 얻기 위한 방법들이 공개되었다. 아라비돕시스 탈리아나를 형질전환시키기 위한 후자의 방법은 통상적으로 "디핑(dipping)" 또는 진공침투 또는 생식질 형질전환이라 한다.
전기 영동, 입자충격 및 아그로박테리움을 사용하는 단자엽 식물들의 형질전환 또한 보고되었다. 형질전환과 식물재생은 아스파라거스(Bytebier 등, PNAS USA 84:5354(1987)); 보리(Wan and Lemaux, Plant Physiol 104:37(1994)); 옥수수(Rhodes 등, Science 240:204(1988); Gordon-Kamm 등, Plant Cell 2:603~618(1990); Fromm 등, Bio / Technology 8:833(1990); Koziel 등 Bio/Technology 11:194(1993); Armstrong 등, Crop Science 35:550~557(1995)); 귀리(Somers 등, Bio / Technology 10:1589(1992)); 오리새(목초)(Horn 등, Plant Cell Rep. 7:469(1988); 벼(Toriyama 등, Theor Appl . Genet . 205:34(1986); Part 등, Plant Mol . Bio1 . 32:1135~1148(1996); Abedinia 등, Aust . J. Plant Physiol . 24:133~141(1997); Zhang and Wu, Theor. Appl . Genet 76:835(1988); Zhang 등, Plant Cell Rep . 7:379(1988); Battraw and Hall, Plant Sci. 86:191~202(1992); Christou 등, Bio / Technology 9:957(1991)); 호밀(De la Pena 등, Nature 325:274(1987)); 사탕수수(Bower와 Birch, Plant J. 2:409(1992)); 키 큰 김의털(Wang 등, Bio / Technology 10:691(1992)) 및 밀(Vasil 등, Bio / Technology 10:667(1992); 미국특허 제5,631,152호)에서 이루어졌다.
클로닝된 핵산 구조체들의 일시적 발현에 기초한 유전자 발현을 위한 분석은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 처리, 전기 영동, 또는 입자충격에 의해 식물세포들 내로 핵산분자들을 도입시킴으로써 이루어졌다(Marcotte 등, Nature 335:454~457(1988); Marcotte 등, Plant Cell 1:523~532(1989); McCarty 등, Cell 66:895~905(1991); Hattori 등, Genes Dev . 6:609~618(1992); Goff 등, EMBO J. 9: 2517~2522(1990)). 일시적인 발현 시스템은 유전자 구조체들을 기능적으로 분석하는데 사용될 수 있다(일반적으로, Maliga 등, Methods in Plant Molecular Biology , Cold Spring Harbor Press(1995) 참고).
본 발명의 핵산분자들은 영구적인 또는 일시적인 방법으로 식물세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 핵산분자는 핵, 엽록체 또는 미토콘드리아 게놈 내로, 바람직하게는 핵 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다.
또한, 세포 또는 유기체 형질전환의 다른 방법들도 사용될 수 있고, 이들은 제한되지 않지만, 식물의 재생 기관 내로의 DNA의 직접적인 주입에 의해(Pena 등, Nature 325:274(1987)), 원형질체 내로의 DNA의 직접적인 미량주입에 의해(Crossway 등, Mol . Gen . Genet . 202:179~185(1986)), 또는 미성숙 배(embryos)의 세포들 내로 DNA를 직접 주사한 다음에 건조시킨 배(embryos)의 재수화 처리에 의해(Neuhaus 등, Theor . Appl . Genet. 75:30(1987)), 꽃가루 내로의 직접적 DNA 전달에 의해 식물들 내로 DNA를 도입(Hess 등, Intern . Rev . Cytol . 107:367(1987); Luo 등, Plant Mol Bio1 . Reporter 6:165(1988))하는 방법을 포함한다. 또한 EP 0 238 023; Yelton 등, PNAS USA, 81:1470~1474(1984); Malardier 등, Gene , 78:147~156(1989); Becker와 Guarente, In: Abelson and Simon(eds.), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology , Method Enzymol , Vol. 194, pp.182~187, Academic Press, Inc, New York; Ito 등, J. Bacteriol, 153:163(1983); Hinnen 등, PNAS USA, 75:1920(1978); 및 Bennett와 LaSure(eds.), More Gene Manipulationins in fungi , Academic Press, CA(1991) 참조.
단일 식물 원형질체 형질전환체들로부터 또는 여러 가지의 형질전환된 외식편들로부터 식물들의 재생, 성장 및 재배는 당업계에 공지되어 있다(Weissbach와 Weissbach, In Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA,(1988)). 이러한 재생 및 성장과정은 전형적으로 형질전환된 세포들의 선택단계와, 배아성장의 통상적인 단계 및 뿌리 내린 묘목단계를 통한 개별화 세포들의 배양단계를 포함한다. 형질전환 배와 종자들은 유사하게 재생된다. 그 후에 결과적으로 얻은 형질전환된 뿌리를 내린 새싹들은 토양과 같은 적절한 식물 성장배지 내에 이식된다.
목적의 단백질을 인코드하는 외래의, 외생 유전자를 포함하는 식물들의 개발 또는 재생은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 재생된 식물들은 동형집합성 형질전환 식물들을 제공하도록 자가수분한다. 또는, 재생식물들로부터 얻어진 화분(꽃가루)을 작물학상으로 중요한 계통의 종자-성장 식물들과 교배시킨다. 역으로, 이들 중요한 계통의 식물들로부터의 꽃가루는 재생된 식물들의 수분을 위해 사용된다. 원하는 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 형질전환 식물은 당업자들에 공지된 방법들을 사용하여 재배된다.
식물조직으로부터 식물들을 재생시키기 위한 다양한 방법들이 있다. 특별한 재생방법은 재생될 출발 식물조직과 특정 식물종들에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 또한 식물들의 일부분의 재생법, 특히 재생부분 또는 저장부분의 재생법을 제공한다. 식물부분들은, 제한 없이, 종자들, 내배유, 꽃가루, 뿌리, 괴경, 줄기, 잎, 대, 과일, 장과(berry), 열매(nut), 껍질, 깍지와 꽃들을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 식물 부분은 종자이다.
본 발명의 식물들 또는 이들 식물의 부분들 중의 어느 것은 가공 처리하여 사료, 가루식품(meal), 단백질 또는 오일 제제를 만들 수 있다. 이 목적을 위하여 특히 바람직한 식물 부분은 종자이다. 바람직한 구체예에서, 사료, 가루식품, 단백질 또는 오일 제제는 목축 동물들 또는 인간들 또는 이들 모두를 위하여 디자인된다. 사료, 가루식품, 단백질과 오일 제제들을 만드는 방법들은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국특허 제4,957,748호, 제5,100,679호, 제5,219,596호, 제5,936,069호, 제6,005,076호, 제6,146,669호 및 제6,156,227호 참고. 바람직한 구체예에서, 단백질 제제는 고단백질 제제이다. 이러한 고단백질 제제는 바람직하게는 5% w/v, 더 바람직하게는 10% w/v 및 아주 더 바람직하게는 15% w/v 이상의 단백질 함량을 갖는다. 바람직한 오일 제제에 있어서, 오일 제제는 본 발명의 식물 또는 식물의 일부분으로부터 유래된 오일함량을 5% w/v, 더 바람직하게는 10% w/v, 및 아주 더 바람직하게는 15% w/v 이상의 오일함량을 갖는 고함량 오일 제제이다. 바람직한 구체예에서, 오일 제제는 액체이다. 바람직한 구체예에서, 오일 제제는 1, 5, 10 또는 50ℓ보다 더 큰 부피이다. 본 발명은 본 발명의 식물들로부터 생성된 또는 본 발명의 방법에 의해 생성된 오일을 제공한다. 그러한 오일은 강화된 산화 안전성을 나타낼 수 있다. 또한, 그러한 오일은 어떤 결과 생성물의 최소 또는 최대 성분일 수 있다. 게다가, 그러한 오일은 다른 오일들과 혼합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 식물들로부터 생성되거나 또는 본 발명의 방법에 의해 생성된 오일은 어떤 조성물중의 오일성분의 체적비 또는 중량비로, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 90% 이상을 구성한다. 다른 구체예에서, 오일 제제는 혼합될 수 있고, 체적비로 혼합물의 10%, 25%, 35%, 50% 또는 75% 이상을 구성할 수 있다. 본 발명의 식물로부터 생성된 오일은 한 가지 이상의 유기용매들 또는 석유 증류물과 혼합될 수 있다.
본 발명의 식물들은 번식 프로그램의 일부분일 수 있거나 또는 번식 프로그램으로부터 생산될 수도 있다. 번식방법의 선택은 식물 재생방법, 개선된 특성(들)의 유전가능성, 및 상업적으로 사용된 재배종의 유형(예를 들면, F1 잡종 재배종, 순종 재배종 등)에 따라서 달라진다. 본 발명의 식물들의 번식을 위하여, 선택된, 비-제한적 접근방법들을 하기에 나타내었다. 번식 프로그램은 어떠한 교배의 자손의 마커-보조 선택을 사용하여 향상될 수 있다. 어떤 상업적 및 비-상업적인 재배종들이 번식 프로그램에 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일반적으로, 예를 들면, 출아활력, 생식활력, 스테레스 내성, 질병저항력, 분지, 개화, 종자세트, 종자크기, 종자밀도, 입성(standability), 및 탈립성과 같은 요인들에 의해 선택이 결정될 수 있다.
고도로 유전가능한 특성들을 위해서는, 단일 부위에서 평가된 우수한 몇 개 식물들의 선택이 효과적일 수 있는 반면에, 낮은 유전가능성을 지닌 특성을 위해서는, 관련된 식물들의 종족의 반복된 평가로부터 얻어진 평균값을 기초로 선택해야만 한다. 통상적인 선택방법들은 대개 계통선택, 개선된 계통선택, 집단선택 및 순환선택을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 역교배 또는 순환 번식 프로그램이 수행된다.
유전의 복잡성은 번식방법의 선택에 영향을 준다. 역교배 번식은 고도로 유 전가능한 특성을 위한 하나 또는 몇개의 유리한 유전자들을 원하는 재배종에 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근방법은 질병에 저항력이 있는 재배종을 번식시키는데 광범위하게 사용되어왔다. 다양한 순환 선택 기술들이 많은 유전자들에 의해 조절된 정량적으로 유전되는 특성들을 개선시키는데 사용된다. 자가-수분하는 작물들에서 순환선택의 사용은, 수분(pollination)의 용이성, 각각의 수분으로부터의 성공적인 잡종들의 빈도 및 각각의 성공적인 교배로부터의 잡종자손의 수에 따라서 달라진다.
번식계통은 2세대 이상의 세대들에 대한 상업적 타겟 분야의 대표적인 환경 내에서의 적합한 표준치에 대해 테스트되고, 비교될 수 있다. 가장 좋은 계통은 새로운 상업용 재배종을 위한 후보들이고; 특성들이 아직 부족한 것들은 또 다른 선택을 위하여 새로운 개체군을 만드는 부모로서 사용될 수 있다.
우수한 식물을 확인하는 한 가지 방법은 다른 실험식물들 및 상당히 성장된 표준 재배종에 대비되는 그것의 성능을 관찰하는 것이다. 만일, 단일 관찰로 결정될 수 없다면, 반복관찰로 유전자 가치를 더 잘 평가할 수 있다. 육종자(breeder)는 둘 이상의 양친계통을 선택 및 교배한 후, 반복된 자교배 및 선발을 행하므로써 많은 새로운 유전자 조합을 만들어낼 수 있다.
새로운 재배종들의 개발은 변종들의 개발과 선택 및 이들 변종들의 교배와 우수한 잡종교배의 선택을 필요로 한다. 잡종 종자는 선택된 남성-번식력이 있는 양친들 사이의 인위적 교배에 의해 또는 남성 불임 시스템을 사용함으로써 생성될 수 있다. 잡종들은 종자가 진짜 잡종인 것을 나타내는 깍지색, 꽃색, 종자수율, 연 모 색, 또는 제초제 내성과 같은 어떤 단일 유전자 특성들을 기준으로 선택된다. 잡종의 표현형과 마찬가지로, 양친계 계통에 관한 추가적인 데이터는, 특이적 잡종교배를 계속할 것인지의 여부에 대한 육종자의 결정에 영향을 준다.
계통 번식과 순환 선택번식 방법은 번식자손으로부터 재배종을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 번식 프로그램들은, 둘 이상의 재배종들로부터 또는 여러 가지의 광범위한 소스들로부터의 바람직한 특성들을, 재배종들이 자교배 및 원하는 표현형의 선택에 의해 개발되어지는 번식용 풀(pool) 내로 조합시킨다. 새로운 재배종들은 상업적인 가능성을 갖고 있는지를 결정하기 위해 평가될 수 있다.
계통번식은 자가-수분을 하는 작물들의 개선을 위하여 통상적으로 사용된다. 서로 보완적인 유리한 특성들을 갖는 두 양친들을 교배하여 F1을 만든다. F2 자손은 하나 또는 몇 개의 F1을 자교배시켜서 만든다. 가장 좋은 종족으로부터 가장 좋은 개체들의 선택이 실시된다. 종족들의 반복 테스트는 F4 세대에서 시작되어, 낮은 유전가능성을 갖는 특성들에 대한 선택의 효율성을 개선시킬 수 있다. 근친교배(즉, F6과 F7)의 발전된 단계에서, 가장 좋은 계통 또는 표현형이 유사한 계통들의 혼합물들이 새로운 재배종으로서의 가능성에 대해 테스트되었다.
역교배 번식은 순환 양친인, 원하는 동형집합성 재배종 또는 동계계통으로 용이하게 유전되는, 고도의 유전가능성이 있는 특성을 위한 유전자들을 전달하는데 사용되어 왔다. 전달될 특성의 원천은 기증자 양친(donor parent)이라 불리운다. 결과로 얻어진 식물은 순환 양친(예, 재배종)과 기증자 양친으로부터 전달된 원하 는 특성의 속성을 갖는 것으로 기대된다. 최초 교배 후에, 기증자 양친의 표현형을 소유하는 개체들이 선택되고, 순환 양친에 대해 반복적으로 역교배된다. 결과로 얻어진 양친은 순환 양친(예, 재배종)과 기증자 양친으로부터 전달된 원하는 특성의 속성을 갖는 것으로 기대된다.
엄격한 의미에서, 단일-종자 계통유전 과정은, 분리되는 개체군의 이식, 식물당 한 가지 종자시료의 수확 및 다음 세대를 이식하기 위한 한가지 종자 시료의 사용을 포함한다. 개체군이 F2로부터 근친교배의 원하는 수준까지 진전되었을 때, 계통이 유래되는 식물들은 각각 상이한 F2 개체들로 확인될 수 있다. 개체군 내에서 식물들의 수는 몇몇의 종자들이 발아되지 않거나, 또는 몇몇의 식물들이 최소한 하나의 종자조차 생산하지 못하는데 기인하여, 각 세대마다 감소된다. 결과적으로, 세대 진전이 완료되었을 때에, 원래 개체군으로부터 샘플링된 F2 식물들의 모두가 자손으로 재현되지는 않을 것이다.
다수-종자 과정에서는, 육종자는 개체군 내에서 각각의 식물로부터 대개 하나 이상의 깍지를 수확하고, 벌크를 형성하기 위해 그들을 함께 탈곡한다. 벌크의 일부가 다음 세대를 이식하기 위해 사용되고, 일부는 예비로 남겨둔다. 이 방법은 변형된 단일-종자 계통유전 기술 또는 벌크-깍지 기술로서 언급되어 왔다.
다수-종자 과정은 수확시에 노동력을 아끼기 위해 사용되었다. 단일-종자 과정을 위해, 수동으로 각각으로부터 하나의 종자를 제거하는 것보다 기계로 깍지들을 탈곡하는 것이 훨씬 더 빠르다. 또한, 다수-종자 과정은 동족 번식의 각 세대의 개체군의 동일수의 종자를 이식하는 것을 가능하게 한다.
다른 특성들과 작물들을 위해 통상적으로 사용되는 다른 번식 방법들의 설명은 몇 가지 참고서적들 중의 하나에서 발견될 수 있다(예컨대, Fehr, Principles of Cultivar Development Vol. 1, pp.2~3(1987)).
본 발명의 형질전환 식물은 또한 아포믹시스를 사용하여 재생될 수 있다. 아포믹시스(Apomixis)는 식물들에서 유전학적으로 조절된 재생방법이고, 이 방법에서는 배(embryo)는 에그(egg)와 정액의 결합 없이 형성된다. 무성 재생법에는 3가지 유형이 있다: 1) 배(embryo)가 핵으로부터 유래된 배낭 내에서 염색체 비환원성 에그(egg)로부터 전개되는 무포자생식, 2) 배(embryo)가 대포자 모세포로부터 유래된 배낭 내에서 비환원성 에그로부터 전개되는 디플로스포리(diplospory), 및 3) 배(embryo)가 체세포로부터 직접 전개되는 후천성 엠브리오니(embryony). 대부분의 형태의 아포믹시스에서, 내배유(endosperm)를 만들기 위한, 슈도가미(pseudogamy) 또는 극성 핵의 수정이 종자 생존력을 위해 필요하다. 무포자생식(apospory)에서, 보호 재배종이 종자들에서 내배유 생성을 위한 꽃가루 원으로서 사용될 수 있다. 보호 재배종은 재배종의 비환원성 에그가 단위생식으로서 개발되지만, 내배유 생성을 가능하게 하기 때문에, 무홀씨 생식의 무성재배의 유전학에는 영향을 끼치지 않는다. 아포믹시스는 경제적으로, 특히 형질전환 식물들에서는 중요한데, 이는, 어떠한 이형접합성이든간에, 순종의 자손을 육성하기 위한 어떠한 유전자형도 형성할 수 있기 때문이다. 따라서 무성 재생으로, 이형접합성 형질전환 식물들이 반복된 생명주기를 통하여 그들의 유전학적 충실도를 유지할 수 있다. 무성생식 식물들의 생산방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 미국특허 제5,811,636호 참조.
다음의 실시예들은 예시적이고, 어떤 식으로든 제한하려는 의도는 없다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 실시를 예증하기 위해 제조된 구조체들을 예시한다.
도 1은, 다음의 것들을 시리즈로 포함하는 DNA 구조체의 요소들을 개략적으로 나타내고 있다:
(a) 나핀(napin)프로모터의 DNA,
(b) 고시피움 히르수티움(Gossypium hirsutium)(목화)으로부터 분리된 감마 메틸 트랜스퍼라제(GMT)를 코딩하는 DNA,
(c) 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) fad2의 3'UTR의 센스 방향의 DNA,
(d) 제거된 접목부위를 갖는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) fad2 내의 인트론의 DNA,
(e) (c)요소의 상보체, 즉, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) fad2의 3'UTR의 안티센스 방향의 DNA.
(f) 나핀 3' 터미네이터의 DNA.
구조체를 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 TI 경계들 사이에 있는 벡터 내로 BAR 마커 성분과 함께 삽입했다. 서열번호5를 참고하여, pMON75565로 지정된 벡터의 관련 DNA 요소들은 하기 표 1에 기술되어 있다.
Figure 112008001073643-PAT00001
도 2는, 다음의 것들을 시리즈로 포함하는 DNA 구조체의 요소들을 개략적으로 나타내고 있다:
(a) 나핀 프로모터의 DNA,
(b) 고시피움 히르수티움(Gossypium hirsutium)(목화)으로부터 분리된 감마 메틸 트랜스퍼라제(GMT)를 코딩하는 DNA,
(c) 제거된 접목부위를 갖는, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) fad2 내의 인트론의 DNA, 및
(d) 나핀 3' 터미네이터의 DNA.
상기 구조체를 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 TI 경계들 사이에 있는 벡터 내로 BAR 마커 성분과 함께 삽입했다. 서열번호6을 참고로 하여, pMON75571로 지정된 벡터의 관련 DNA 요소들은 하기 표 2에 기술되어 있다.
Figure 112008001073643-PAT00002
pMON75565 및 pMON75571 에 의한 식물들의 형질전환
pMON75565 및 pMON75571 벡터들은, GMT의 발현을 유도하고, fad2 유전자의 발현을 억제하기 위해 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물 형질전환에 사용된다. 이성분 벡터 구조체들 pMON75565와 pMON75571은 Holsters 등, Mol . Gem. Genet . 163:181~187(1978)의 방법에 따라 AB1 스트레인 아그로박테리움 세포들 내로 형질전환된다. 형질전환 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물들은 Valverkens 등, PNAS USA 85:5536~5540(1988), Bent 등, Science 265:1856~1860(1994)와 Bechtold 등, C.R. Acad . Sci . Life Sciences 316:1194~1199(1993)에 기술된 바와 같은 아그로박테리움-매개된 형질전환에 의해 얻어진다. 형질전환 식물들은 형질전환된 R1 종자들을 토양 내로 직접 산포하고, 그 후에 이들을 햇빛 없이 4일 동안 4℃에서 춘화처리하여 선택된다. 그 후에 종자들을 21℃에서 16시간 동안 광선 아래로 둔 다음에, 파종 후 7일과 14일째에 Finale(Basta) 제초제를 1:200으로 희석시킨 용액을 분무했다. 형질전환된 식물들은 성숙기로 성장하고, 생성된 R2 종자를 토코페롤 함량에 대해 분석했다.
도 3a 및 3b는 나핀 종자-특이적 프로모터의 조절 하에서 pMON75565(도 3a) 또는 pMON75571(도 3b)로부터 GMT를 발현하는 형질전환 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물들의 R2종자로부터의 α-토코페롤 수준 분석의 데이터를 나타낸다. 하기의 표 3은 여러 가지의 형질전환된 식물 계통 및 대조군 식물 계통의 특이적 토코페롤 수준 결과들(알파, 감마 및 델타)을 제공한다.
Figure 112008001073643-PAT00003
도 3a와 3b 및 표 3은 비-형질전환 식물 계통과 비교된 형질전환 식물 계통 내에서 α-토코페롤의 수준이 증가된 구조체를 나타낸다.
지방산 조성은 구조체 pMON75565와 pMON75571로 형질전환된 아라비돕시스 계통의 종자로부터 가스크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 표 4는 이들 구조체들을 사용해서 얻어진 지방산 수준들의 요약을 제공한다. 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, pMON75565 구조체는 올레인산(18:1)의 발현이 증가되고, 리놀레산(18:2)과 리놀렌산(18:3)의 발현이 약간 감소되며, 스테아린산(18:0) 수준이 실질적으로 변화 없다는 사실을 나타낸다. 12:0, 14:0, 16:0, 16:1, 20:0, 20:1, 20:2, 22:0, 22:1과 22:2의 지방산 수준에서 심한 변화는 없다. pMON75571과 pMON75565에 대한 결과들은 다르다. 또한, 센스 억제와 비교시, RNAi 억제를 사용할 때 더 높은 성공율을 나타낸다.
표 5는 기술된 구조체들을 사용하여 얻어진 오일수준의 요약을 제공한다. 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, pMON75565와 pMON75571 구조체들과 대조군 구조체들을 비교시, 단백질, 탄소, 질소와 황의 전체 수준은 실질적으로 동일하게 유지된다.
도 4는 pMON75565와 pMON75571 구조체들을 사용하여 얻어진 지방산과 오일 수준의 그래프를 나타낸다. 계통 AT_G490과 AT_G499(양쪽 모두 pMON75565를 사용해서 얻음)는 가장 높은 올레산을 가지며, α-토코페롤 표현형을 나타내고, 이들 모두는 토코페롤과 올레산과 오일 분석을 위하여 다음 세대로 넘겨진다. 이중-가닥의 FAD2 RNA 서열들의 발현은 지방산과 오일 조성 모두의 변형을 초래한다.
pMON75565 구조체의 표현형을 확인하기 위하여, pMON75565 구조체를 발현하는 R2 식물들이 R3식물을 얻기 위하여 자가 교배되었다. 표 6은 R3식물들에 의한 이중-가닥 FAD2 RNA 서열들의 발현이 지방산과 오일 조성 모두의 변형을 야기한다는 것을 확인시켜준다. 특히, 올레인산의 수준은 대조군 구조체와 비교시 증가되고, 리놀레산과 리놀렌산의 수준은 다소 감소된다. 그러한 결과는 FAD2 발현의 하향-조절과 일치된다.
표 7과 도 5는, α-토코페롤의 수준을 증가시키는 반면, 토코페롤의 전체 수준은 본질적으로 동일하게 유지되어, R3식물들이 GMT RNA 서열을 발현시킨다는 것을 확인시켜준다.
이들 데이터는, 본 발명의 구조체들이 목화 GMT 단백질을 상향-조절하고, FAD2의 발현을 하향-조절하는 것을 나타낸다. GMT의 발현 증가는 α-토코페롤 수준의 증가를 초래한다(GMT는 감마-토코페롤을 α-토코페롤로 전환시킨다). 올레인산 수준 증가와 리놀레산 수준 감소는 하향조절과 일치한다.
Figure 112008001073643-PAT00004
Figure 112008001073643-PAT00005
Figure 112008001073643-PAT00006
Figure 112008001073643-PAT00007
도 1은 벡터 pMON75565 내의 DNA 구조체 요소들(elements)의 개략도이다.
도 2는 벡터 pMON75571 내의 DNA 구조체 요소들의 개략도이다.
도 3a 및 3b는 각각 pMON75565(도 3a) 또는 pMON75571(도 3b)로 형질전환된 식물들의 R2세대로부터의 아라비돕시스(Arabidopsis) 종자들의 총 토코페롤 함량 중의 α-토코페롤의 %를 나타내는 그래프이다.
도 4는 pMON75565로 형질전환된 식물들의 R3세대로부터 선택된 아라비돕시스(Arabidopsis) 종자들 내에서의 종자오일과 올레인산의 평균값(18:1)을 나타내는 그래프이다.
도 5a와 5b는 pMON75565로 형질전환된 식물들의 R3세대로부터의 아라비돕시스(Arabidopsis) 종자들의 총 토코페롤 함량(도 5a) 및 총 토코페롤 함량중의 α-토코페롤의 %(도 5b)를 나타내는 그래프이다.
<110> Van Eenennaam, Alison Shewmaker, Christine K. <120> COORDINATED DECREASE AND INCREASE OF GENE EXPRESSION OF MORE THAN ONE GENE USING TRANSGENIC CONSTRUCTS <130> 16517.330 <140> To Be Assigned <141> 2004-09-24 <150> US 10/668,240 <151> 2003-09-24 <160> 6 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1038 <212> DNA <213> Gossypium hirsutum <400> 1 atggctgccg cgttacaatt acaaacacac ccttgcttcc atggcacgtg ccaactctca 60 cctccgccac gaccttccgt ttccttccct tcttcctccc gctcgtttcc atctagcaga 120 cgttccctgt ccgcgcatgt gaaggcggcg gcgtcgtctt tgtccaccac caccttgcag 180 gaagggatag cggagtttta cgatgagtcg tcggggattt gggaagacat atggggtgac 240 catatgcacc atggatatta cgagccgggt tccgatattt cgggttcaga tcatcgtgcc 300 gctcagattc gaatggtcga agaatcgctc cgttttgctg gaatatcaga ggacccagca 360 aacaggccca agagaatagt tgatgttggg tgtgggatag gaggcagttc taggtatcta 420 gcaaggaaat atggggcaaa atgccaaggc attactttga gccctgttca agctggaaga 480 gccaatgctc ttgctaatgc tcaaggacta gcagaacagg tttgttttga agttgcagat 540 gccttgaacc aaccattccc 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ttttcttagt cgaatcttat tcttgctctg ctcgttgttt 6180 taccgataaa gctaggtaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 6240 aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 6300 taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 6360 atggcgccaa gctcctcgag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag aaaaggaagg 6420 tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag atgcctctgc 6480 cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 6540 tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 6600 cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt 6660 ggagaggaca cgctgaaatc accagtctct ctctacaaat ctatctctct ctattttctc 6720 cataataatg tgtgagtagt tcccagataa gggaattagg gttcttatag ggtttcgctc 6780 atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 6840 gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 6900 caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 6960 gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 7020 aacgcctacg actggacggc cgagtcaacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 7080 ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 7140 agcgtggttg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 7200 ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 7260 gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccagtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 7320 accgagattt gagaattgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc 7380 ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa 7440 taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc 7500 aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat 7560 cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc ctcgagcgat cgtgaagttt ctcatctaag 7620 cccccatttg gacgtgaatg tagacacgtc gaaataaaga tttccgaatt agaataattt 7680 gtttattgct ttcgcctata aatacgacgg atcgtaattt gtcgttttat caaaatgtac 7740 tttcatttta taataacgct gcggacatct acatttttga attgaaaaaa aattggtaat 7800 tactctttct ttttctccat attgaccatc atactcattg ctgatccatg tagatttccc 7860 ggacatgaag ccatttacaa ttgaatatat cctgccgccg ctgccgcttt gcacccggtg 7920 gagcttgcat gttggtttct acgcagaact gagccggtta ggcagataat ttccattgag 7980 aactgagcca tgtgcacctt ccccccaaca cggtgagcga cggggcaacg gagtgatcca 8040 catgggactt ttaaacatca tccgtcggat ggcgttgcga gagaagcagt cgatccgtga 8100 gatcagccga cgcaccgggc aggcgcgcaa cacgatcgca aagtatttga acgcaggtac 8160 aatcgagccg acgttcacg 8179 <210> 6 <211> 7713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector <400> 6 cgaagctcgg tcccgtgggt gttctgtcgt ctcgttgtac aacgaaatcc attcccattc 60 cgcgctcaag atggcttccc ctcggcagtt catcagggct aaatcaatct agccgacttg 120 tccggtgaaa tgggctgcac tccaacagaa acaatcaaac aaacatacac agcgacttat 180 tcacacgagc tcaaattaca acggtatata tcctgccagt cagcatcatc acaccaaaag 240 ttaggcccga atagtttgaa attagaaagc tcgcaattga ggtctgcgcc caatacgcaa 300 accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 360 ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 420 ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 480 atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgaattg taccgaatta tcactacaat 540 gtcggagaga caaggctgcg ccagcatata caaaagggaa atgaagatgg ccttttgatt 600 agctgtgtag catcagcagc taatctctgg gctctcatca tggatgctgg aactggattc 660 acttctcaag tttatgagtt gtcaccggtc ttcctacaca aggtaataat cagttgaagc 720 aattaagaat caatttgatt tgtagtaaac taagaagaac ttaccttatg ttttccccgc 780 aggactggat tatggaacaa tgggaaaaga actactatat aagctccata gctggttcag 840 ataacgggag ctctttagtt gttatgtcaa aaggttagtg tttagtgaat aataaactta 900 taccacaaag tcttcattga cttatttata tacttgttgt gaattgctag gaactactta 960 ttctcagcag tcatacaaag tgagtgactc atttccgttc aagtggataa ataagaaatg 1020 gaaagaagat tttcatgtaa cctccatgac aactgctggt aatcgttggg gtgtggtaat 1080 gtcgaggaac tctggcttct ctgatcaggt aggtttttgt ctcttattgt ctggtgtttt 1140 tattttcccc tgatagtcta atatgataaa ctctgcgttg tgaaaggtgg tggagcttga 1200 ctttttgtac ccaagcgatg ggatacatag gaggtgggag aatgggtata gaataacatc 1260 aatggcagca 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cactcacttc aaacacctaa gagcttctct ctcacagcgc acacacatat 2160 gcatgcaata tttacacgtg atcgccatgc aaatctccat tctcacctat aaattagagc 2220 ctcggcttca ctctttactc aaaccaaaac tcatcactac agaacataca caagataatt 2280 cgtcgaggat ccgcggccgt cgaatcaaca agtttgtaca aaaaagcagg ctgcggccgc 2340 acaatggctg ccgcgttaca attacaaaca cacccttgct tccatggcac gtgccaactc 2400 tcacctccgc cacgaccttc cgtttccttc ccttcttcct cccgctcgtt tccatctagc 2460 agacgttccc tgtccgcgca tgtgaaggcg gcggcgtcgt ctttgtccac caccaccttg 2520 caggaaggga tagcggagtt ttacgatgag tcgtcgggga tttgggaaga catatggggt 2580 gaccatatgc accatggata ttacgagccg ggttccgata tttcgggttc agatcatcgt 2640 gccgctcaga ttcgaatggt cgaagaatcg ctccgttttg ctggaatatc agaggaccca 2700 gcaaacaggc ccaagagaat agttgatgtt gggtgtggga taggaggcag ttctaggtat 2760 ctagcaagga aatatggggc aaaatgccaa ggcattactt tgagccctgt tcaagctgga 2820 agagccaatg ctcttgctaa tgctcaagga ctagcagaac aggtttgttt tgaagttgca 2880 gatgccttga accaaccatt ccctgatgac caatttgatc ttgtttggtc tatggaaagc 2940 ggagaacaca tgcctgacaa acccaagttt gttaaagagc tggtgcgagt ggcagctcca 3000 ggaggcacaa taatagtagt gacatggtgc catagggatc ttggtccatc tgaagagtct 3060 ttgcagccat gggagcaaaa gcttttaaac agaatatgtg atgcttacta tttaccagag 3120 tggtgttcta cttctgatta tgtcaaatta tttcagtccc tatctctcca ggatataaag 3180 gcaggagact ggactgagaa tgtagcaccc ttttggccag cagtgatacg ttcagcattg 3240 acatggaagg gcttcacatc gctgctacga agtggattaa aaacaataaa aggtgcactg 3300 gtgatgccat tgatgatcga aggtttccag aaaggggtga taaagtttgc catcattgct 3360 tgccggaagc cagctgagta gcctgcaggc cgtcgcttct cttccatttc ttctcatttt 3420 cgattttgat tcttatttct ttccagtagc tcctgctctg tgaatttctc cgctcacgat 3480 agatctgctt atactcctta cattcaacct tagatctggt ctcgattctc tgtttctctg 3540 tttttttctt ttggtcgaga atctgatgtt tgtttatgtt ctgtcaccat taataataat 3600 gaactctctc attcatacaa tgattagttt ctctcgtcta caaaacgata tgttgcattt 3660 tcacttttct tctttttttc taagatgatt tgctttgacc aatttgttta gatctttatt 3720 ttattttatt ttctggtggg ttggtggaaa ttgaaaaaaa aaaaaacagc ataaattgtt 3780 atttgttaat 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gctcatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg 6360 cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact 6420 tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc 6480 gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc 6540 cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc aaccgtgtac gtctcccccc 6600 gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg 6660 cacagggctt caagagcgtg gttgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca 6720 tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg 6780 ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccagta ccgccccgtc 6840 cggtcctgcc cgtcaccgag atttgagaat tgatcgttca aacatttggc aataaagttt 6900 cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta 6960 cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat 7020 gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa 7080 ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcctcgag cgatcgtgaa 7140 gtttctcatc taagccccca tttggacgtg aatgtagaca cgtcgaaata aagatttccg 7200 aattagaata atttgtttat tgctttcgcc tataaatacg acggatcgta atttgtcgtt 7260 ttatcaaaat gtactttcat tttataataa cgctgcggac atctacattt ttgaattgaa 7320 aaaaaattgg taattactct ttctttttct ccatattgac catcatactc attgctgatc 7380 catgtagatt tcccggacat gaagccattt acaattgaat atatcctgcc gccgctgccg 7440 ctttgcaccc ggtggagctt gcatgttggt ttctacgcag aactgagccg gttaggcaga 7500 taatttccat tgagaactga gccatgtgca ccttcccccc aacacggtga gcgacggggc 7560 aacggagtga tccacatggg acttttaaac atcatccgtc ggatggcgtt gcgagagaag 7620 cagtcgatcc gtgagatcag ccgacgcacc gggcaggcgc gcaacacgat cgcaaagtat 7680 ttgaacgcag gtacaatcga gccgacgttc acg 7713

Claims (10)

  1. 폴리펩티드 인코딩 서열을 포함하는 제 1의 핵산 단편과 유전자 억제 서열을 포함하는 제 2의 핵산 단편을 포함하는 핵산분자가 게놈내에 통합된 식물 세포로서, 상기 식물 세포내에서의 상기 핵산 분자의 전사는 상기 숙주 세포내에서 상기 폴리펩티드 인코딩 서열에 의한 폴리펩티드의 발현과 제 2의 유전자의 억제를 동시에 일으키고, 상기 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 폴리시스트로닉 배열로 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 제 1의 핵산 단편과 제 2의 핵산 단편은 다른 유전자들로부터 얻어진 것인 식물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제 2의 유전자는 FAD2인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제 2의 핵산 단편은 지방산 불포화효소-2(FAD2) 서열인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제 2의 핵산 단편의 발현은 내생 유전자의 억제를 초래하는 것을 특징으로 하는 식물 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제 2의 핵산 단편은 dsRNA 분자로서 발현되는 것을 특 징으로 하는 식물 세포.
  6. 복수의 제1항의 식물 세포들을 포함하는 식물.
  7. 폴리펩티드 인코딩 서열을 포함하는 제 1의 핵산 단편과 유전자 억제 서열을 포함하는 제 2의 핵산 단편을 포함하는 이중-가닥 DNA 분자로서, 식물 세포내에서의 상기 핵산 분자의 전사는 숙주 세포내에서 상기 폴리펩티드 인코딩 서열에 의한 폴리펩티드의 발현과 제 2의 유전자의 억제를 동시에 일으키고, 상기 제 1의 핵산 단편과 상기 제 2의 핵산 단편은 폴리시스트로닉 배열로 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 제 1의 핵산 단편과 상기 제 2의 핵산 단편은 다른 유전자들로부터 얻어진 것인 이중-가닥 DNA 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 비-바이러스성인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 DNA 분자.
  9. 제7항에 있어서, 상기 제 2의 유전자는 FAD2인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 DNA 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제 2의 핵산 단편은 지방산 불포화효소-2(FAD2) 서열인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 DNA 분자.
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