JP6517644B2 - ショウブノール合成酵素、ポリペプチド、遺伝子、並びに、組換え細胞 - Google Patents
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(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。
このうち、細菌と酵母が宿主細胞として特に好ましく用いられる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子(核酸、DNA)を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
ベチバー(Vetiveria zizanioides)の根および葉組織(図2)を切り取り、液体窒素にて凍結した。ビーズ式破砕装置(FastPrep 24、MPバイオメディカルズ社製)およびFastRNA Pro Green Kit(MPバイオメディカルズ社製)を用いて全RNAを抽出した。得られた全RNAについて、Agilent 2100 バイオアナライザ(アジレント・テクノロジー社製)およびAgilent RNA6000ナノキット(アジレント・テクノロジー社製)を用いてRNA Integrity Number(RIN)によりRNA品質を定量的に評価し、RIN=8以上のサンプルを以降の実験に供した。
VzTPS1の推定アミノ酸配列(配列番号2)をGenScript社に提供し、大腸菌コドン使用頻度に最適化したVzTPS1遺伝子を人工合成により作製した(配列番号3)。この際、開始メチオニンコドンATGを含むように制限酵素NdeI認識配列を5’末端に付加し、終止コドン直下に制限酵素XhoI認識配列を付加した。作製した人工合成遺伝子を含むプラスミドをNdeIおよびXhoIで消化し、得られたDNA断片をpRSFDuet-1プラスミド(Novagen社製)のNdeIおよびXhoI部位に連結した。このプラスミドをpVzTPS1と命名した。
pVzTPS1プラスミドは、Harada H, Yu F, Okamoto S, Kuzuyama T, Utsumi R, Misawa N 2009, 81: 915-925、に記載の方法に従ってpAC−Mevプラスミドと共に大腸菌に導入し、ドデカンを添加した液体培地にて培養、生産および生産物の抽出を行った。抽出したドデカン層1μLをガスクロマトグラフ質量分析計(GC−MS)にて分析を行った結果、pVzTPS1プラスミドを導入した大腸菌由来のサンプルにおいて、対照となるpRSFDuet−1を導入した大腸菌由来サンプルには見られない新規ピークが複数出現した(図3)。このうち最も大きい保持時間37.5分のピーク(図2、ピーク1)についてマススペクトル解析を行った結果、このピークがショウブノールのスペクトルと一致することが示された(図4)。
以上の結果より、VzTPS1はファルネシル二リン酸を基質としてショウブノールを特異的に合成する酵素の遺伝子であることが示された。
Claims (3)
- 下記(a)、(b)又は(c)のタンパク質からなる単離されたショウブノール合成酵素。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。 - 請求項1に記載のショウブノール合成酵素をコードする単離された遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を有し、当該遺伝子が発現することによりショウブノールを生産可能である、大腸菌の組換え細胞。
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JP2015183200A JP6517644B2 (ja) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | ショウブノール合成酵素、ポリペプチド、遺伝子、並びに、組換え細胞 |
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