JPWO2017169699A1 - 青系花色を有する植物及びその作出方法 - Google Patents
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Abstract
アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメントとなるフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体を植物の花弁など花器官の細胞内で共存させる。
Description
[1] 青系花色を有する植物の作出方法であって、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメント(フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体)を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法。
[2] 前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、1に記載の方法。
[3] 前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン7-マロニルグルコシド、ルテオリン7-グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、2に記載の方法。
[4] 前記トリセチン配糖体が、トリセチン7-マロニルグルコシド又はその誘導体である、2に記載の方法。
[5]前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、2に記載の方法。
[6]前記アカセチン配糖体が、アカセチン7-ルチノシド又はその誘導体である、2に記載の方法。
[7]前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、1に記載の方法。
[8]前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である,7に記載の方法。
[9]前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-(6′′-マロニル)グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である、7に記載の方法。
[10] 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド(テルナチンC5)、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド(プレテルナチンC5)、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、1〜9のいずれかに記載の方法。
[11] 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体とが、1:1〜1:10の量比で共存することを特徴とする、1〜10のいずれかに記載の方法。
[12] 前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、1〜11のいずれかに記載の方法。
[13] 前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、1〜12のいずれかに記載の方法。
[14] 青系花色を有する植物であって、植物の細胞内でアントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体が共存していることを特徴とする植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[15] 前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、14に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[16] 前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン7−マロニルグルコシド、ルテオリン7−グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[17] 前記トリセチン配糖体が、トリセチン7-マロニルグルコシド又はその誘導体である、15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[18]前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[19]前記アカセチン配糖体が、アカセチン7-ルチノシド又はその誘導体である、15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[20]前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、14に記載の方法。
[21]前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である,20に記載の方法。
[22]前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-(6′′-マロニル)グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である,20に記載の方法。
[23] 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド(テルナチンC5)、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド(プレテルナチンC5)、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、14〜22のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[24] 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体とが、1:1〜1:10の量比で共存する特徴とする、14〜23のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[25] 前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、14〜24のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[26] 前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、14〜25のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
[27] 14〜26のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[28] 14〜27のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
フラボノール類はフラボノイドのカテゴリーの1つであり、3-ヒドロキシフラボン(3-ヒドロキシ-2-フェニルクロメン-4-オン)骨格をもつ。植物内では、主に配糖体として存在する。本願明細書中、「フラボノール配糖体」は、フラボノール類に属する誘導体の配糖体を意味する。フラボノール配糖体としては、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体が挙げられるがこれらに限定されない。ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体もまた、ケンフェロール、ケルセチン、ミリセチンの誘導体の配糖体を含む。ケンフェロール配糖体としては、例えばケンフェロール3-グルコシド、ケンフェロール3-ルチノシド又はそれらの誘導体があげられ、また、ケルセチン配糖体としては、例えばケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-(6′′-マロニル)グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド又はそれらの誘導体があげられる。
カンパニュラ由来のF3′5′H(CamF3′5′H;特許文献13;GenBank accession number: FW570877)とチョウマメ由来のアントシアニン3′,5′-配糖化酵素をコードするCtA3′5′GT (特許文献2;GenBank accession number: AB115560)を共発現させるバイナリーベクターpB423を導入したアグロバクテリウムを用いて形質転換して得られた青色を示す‘大平’形質転換体の主要アントシアニンをLC-MSで分析した。用いたキク舌状花弁の花色は英国王立園芸協会カラーチャート(RHSCC)第5版を用いて、蛍光灯下で比較して測色したところViolet-Blue 97やBlue 100に相当する青色花色を有していた。CIEL*a*b*表色系における L*値(明度)、a*値(赤/緑)、b*値(黄/青)を、CD100測色計 (横河メータ&インスツルメンツ) を用いて3回以上測定した値の平均値を算出し、その値を基に色相角(Hue angle)を算出したところ、230-290°の青色を表す色相角の値を示した。LC-MS分析は、ACQUITY UPLC BEH C18カラム (1.7μm, 2.1 i.d. x 100 mm; ウォーターズ) を用いて35℃でACQUITY UPLCで分画し、ACQUITY UPLCフォトダイオードアレイ(PDA)検出器とACQITY タンデム四重極質量分析計(TQD)(ウォーターズ)で検出した。UPLCの移動相には、1%ギ酸水溶液(溶媒A)と1%ギ酸含有アセトニトリル(溶媒B)を用いた。移動相の流速は、0.1ml/分で、0-5%B (0-5分), 5-35%B (5-20分), 35%B (20-25分)のグラジエント溶出をおこなった。PDAで200-800nmを検出し、フラボノイドとアシルキナ酸類のクロマトグラムを360nmで、アントシアニンのクロマトグラムを530nmで得た。質量分析計の分析条件は以下の通りとした:ESIポジティブイオンモード、キャピラリ電圧, 3.5 kV; コーン電圧, 45 V; ソース温度 150 °C; 脱溶媒温度, 350 °C; 脱溶媒ガス流速 flow rate, 500 L/h; コーンガス流速, 50 L/h; コリジョンエナジー, 6 V, 20 V; 測定質量範囲, 180-1080 m/z。検出波長530nmのクロマトグラムを解析した結果、主要アントシアニン色素はA7とA8だった。また、微量色素としてA3をはじめ8つのアントシアニン成分(A1-6, A9-10, 図1)を検出した。
デコラ咲きのピンク色品種である‘セイアラベラ’にCamF3′5′H及びCtA3′5′GTを導入することで得られた形質転換体系統の花色とアントシアニンの組成、導入遺伝子の発現を解析した。シアニジン型アントシアニンが主要アントシアニンである花は、3′位の配糖化に関わらず、紫がかってはいるが宿主の花色に近いピンク色を示した。デルフィニジン型アントシアニンが主要アントシアニンである花は、宿主に比べて青色の色調が強くなり紫色あるいは青色を呈し、3′位及び5′位が配糖化されたアントシアニンの割合が高いほど青の色調が強くなった。デルフィニジン型アントシアニンの割合とCamF3′5′Hの発現量、及び3′位及び5′位が配糖化されたアントシアニンの割合とCtA3′5′GTの発現量には相関が認められた。以上の結果からも、3′,5′位のグルコシル化されたデルフィニジン型アントシアニンであるA7とA8が青色の発色を担っていることが明らかになった。
キク舌状花弁の吸光スペクトルを、積分球付属装置ISR-2200を装着した分光光度計UV-2450 (島津製作所)を用いて測定した。宿主品種‘セイアラベラ’のピンク色の花弁の可視光領域の吸収極大(λvismax)は556 nmであり、紫色の組換え体のλvismaxはより長波長域の561nmであった。青色の組換え体のλvismaxはさらに長波長域の573 nmであり、615 nm付近に特徴的なショルダー領域を有していた。HPLCの酸性条件における測定では、ピンク花色の宿主の主要色素A1, A2のλvismaxは518 nmであるのに対し、紫色の組換え体の主要色素A5のλvismaxは527 nmであった。一方、青色の組換え体の主要アントシアニンであるA8のλvismaxはA1やA2よりも短波長域の511 nmであった。それぞれの主要アントシアニンを花弁の搾汁液のpHであるpH5.6の酢酸バッファーに溶解した場合、A1のλvismaxは533 nmにあった。A5のλvismaxは535 nmにあり570 nm付近にショルダー領域が認められた。A8のλvismaxは561 nmにあり590 nm付近にショルダー領域が観察された。A8は、酸性条件では他のアントシアニンよりも短波長にλmaxを持つにも関わらず、弱酸性条件では、λvismaxが長波長側に大きくシフトして青紫色を発色する特徴があった。いずれの花弁のλvismaxも、それぞれの主要アントシアニンのλvismaxより長波長域にあったことから、キクの花色、特に青色の発色には深色効果を示すコピグメント物質の関与を推定した。
クロスTLC法 (非特許文献8)を用いて青色の花弁をもつキク‘大平’の形質転換体の主要アントシアニンと相互作用するコピグメント物質の探索を行なった。遺伝子組換えキクの青色花弁約200mgを凍結したまま破砕し、10%酢酸水溶液500μlを添加して花弁に含まれる成分を抽出した。セルロースTLCガラスプレート (100 x 100 mm, メルク社)を用い、抽出液を既報(非特許文献8)に従って、斜めに交差して展着した。展着したTLCプレートを展開溶媒BAW (n-ブチルアルコール:酢酸:水=4:1:2 (v/v/v)) を用い室温で展開した。展開したプレートは風乾し、蛍光灯下(ライトボックスNEW5000 インバーター, フジカラー)とUV光下 (254/360nm, CSN-15AC, コスモバイオ)で観察するとともに,デジタルカメラで撮影した。アントシアニン類のRf値 は、テルナチンC5 (A8): 0.15; プレテルナチンC5(A7): 0.11; Cy3MG3′G(A3): 0.30であった。
青色キク舌状花弁を採集して-80℃で保存した。約2.5kgの凍結花弁を液体窒素中で粉砕し、約5.9Lの10%ギ酸水溶液に浸漬して、成分の抽出を行った。抽出後の花弁に対して6Lの10%ギ酸水溶液を用いた抽出を再度行った。抽出液をメッシュフィルター(100メッシュ)を用いて濾過した後、3,000 rpmで10 分間、遠心して上清を得た。上清をDiaion HP-20樹脂(三菱化成)3Lを充填したカラムに注入した。カラムを9Lの0.1%ギ酸水溶液で洗浄した後、0.1%ギ酸含有メタノールを用いて、樹脂に吸着していたコピグメントとアントシアニンを再溶出した。溶出液を濃縮後、凍結乾燥して得られた14.2gの残渣を0.1%ギ酸含有20%アセトニトリル水溶液に溶解した。溶解した試料をYMC-Pack ODS A(S-15μm, 50mm i.d. × 250mm)カラムで、流速30 ml/分で0.1%ギ酸含有20%アセトニトリル水溶液を溶媒に用い、360nmで検出してさらに分画を行った。アントシアニンA7(プレテルナチンC5)、 A8(テルナチンC5)、及びA3(Cy3MG3′G)を含む画分1、コピグメント2(C2; Tr7MG) を含む画分2、コピグメント1(C1; Lt7MG) を含む画分3、それぞれを濃縮、凍結乾燥後、0.1%ギ酸含有10%アセトニトリル水溶液に再溶解した。画分1は、A3とA7およびA8それぞれを含む画分に0.1 %ギ酸含有35 %メタノールを溶媒に用いた分取HPLC(流速30 ml/分、検出波長530nm)で分画した。A3, A7とA8は0.5 % ギ酸含有20 %メタノールを溶媒に用いた分取HPLC(流速28 ml/分、検出波長530nm)でさらに分画して単離した。
HR-MSスペクトル、1H-NMRと13C-NMRの一次元NMRスペクトル、及びHMBC,HMQCの二次元NMRスペクトルの解析によりC1の構造をLt7MG、C2の構造をTr7MGと決定した(図2c及びd, 表2及び3)。
まず、青いキク花弁に含まれるアントシアニンとフラボンをHPLCで分析して定量した。アントシアニンでは検出波長530nm、フラボンでは検出波長360nmで得られるクロマトグラムのHPLCピークエリアの値から、デルフィニジン 3-グルコシド(アントシアニン)及びルテオリン(フラボン)の検量線を用いて花弁当たりの化合物量(nmol/mg)を算出した。その結果、青色花弁の3′-及び5′-位がともにグルコシル化されたアントシアニンA7-A9の合計とコピグメントC1(Lt7MG)及びC2(Tr7MG)のモル比率は平均で1.0:1.7:0.4であった。また、アントシアニン総量とフラボン総量のモル比率は平均で1:5であった。これらの比率を基にアントシアニンに対するフラボンの比率を1:1から1:10になるように混合液を作製した。
様々なキクの育成系統や品種、および形質転換体の花弁搾汁液のpHを測定した結果、その値は5.6〜6.1程度と幅があった。そこでまず、0.2Mリン酸水素二ナトリウム水溶液と0.1Mクエン酸水溶液をpH5.6、5.8、6.0になるように混合したマッキルベイン(McIlvaine)緩衝液を用い、B環配糖化アントシアニンとフラボン配糖体とのコピグメンテーション反応による青色発現へのpHの影響を調査した。B環配糖化アントシアニンにはA8(テルナチンC5)、フラボン配糖体にはC1(Lt7MG)を用いた。1.5mlマイクロチューブに各pHに調整したマッキルベイン緩衝液(88μl)を入れ、10mM C1のDMSO溶液(10μl)を添加して均一に溶解した。次に10mMのA8水溶液(2μl)を添加して均一に溶解させた反応液100μlを超ミクロブラックセル(光路長10 mm, 島津製作所)に注入し、UV-2450分光光度計(島津)を用いて吸光スペクトルを測定した。その結果、pH5.6よりもpH5.8の方が吸収極大波長が長波長側(約600nm)にシフトし、さらにpH6.0では600nm付近の吸光度が上昇した(図4)。この事は花弁の液胞内pHが5.6や、より高い5.8や6.0などになる品種・系統・植物種において、また液胞内pHが5.8や6.0になる栽培・保管・輸送条件において、B環配糖化アントシアニンとフラボン配糖体を共存させることで、より鮮やかな青色発現を可能にすることを示している。
植物の花でアントシアニンが蓄積している液胞内pHは、アジサイなどの4程度からアサガオなどの7程度など様々である。そこで次に、様々なpH条件がコピグメンテーションによる発色に及ぼす影響を調査した。3′,5′-配糖化アントシアニンにテルナチンC5、コピグメントのフラボン配糖体にC1(Lt7MG)を用い、1:5の量比で混合した。バッファーには、pH4.0、pH4.6、pH5.0、pH5.6、pH5.8、pH6.0、pH6.6、pH7.0のマッキルベイン緩衝液(リン酸・クエン酸緩衝液)を用いた。緩衝液88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル(島津製作所)に入れ、UV2450(島津製作所)で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、pH5.6で吸収極大波長が577nm付近、ショルダーが590-596nmとなり、また600-620nmのショルダー領域の吸収が認められる青いキクの生花弁と同等の吸収スペクトルパターンを示し、わずかに紫がかった青色となった。pH5.8〜6.0では吸収極大波長は593nm〜596nmとなり、青色を発色した。pH6.6〜7.0でさらに吸収極大波長は長波長側へシフト(597-598nm)したが、400-500nmの吸光度が高くなり、緑青〜青緑色を発色した。pH5.6からpH4.0へ酸性度が高くなるに従って、吸収極大波長は577nmから568nmの短波長側へとシフトするとともに、吸光度が著しく低下した。また反応液の色は、青色から赤紫色へと変化した。以上の結果より、B環配糖化デルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体のコピグメンテーションによる青色の発色に適したpH条件は5.6〜6.0程度で、青いキクの花弁搾汁液で測定されうるpHの範囲と同程度であることが明らかになった。
クロスTLC法により、青いキクの花弁において3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンと共存することによって青色を発現するコピグメントであることを明らかにした、Lt7MGおよびTr7MGと異なる構造を持つフラボン配糖体を用い、それらがB環配糖化デルフィニジン型アントシアニンの発色に及ぼす影響を調査した。アントシアニンに蒸留水に溶解したテルナチンC5を用いた。フラボン配糖体にB環4′位のみ水酸化されているアピゲニンの7-グルコシドと7-ルチノシド、B環4′位が水酸化、3′位がメトキシル化されているアカセチン7-ルチノシド、B環3′位および4′位が水酸化されているルテオリンの7-グルコシド、7-(6′′-マロニル)グルコシド(Lt7MG)、および3′,7-ジグルコシド、B環3′位,4′位,5′位が水酸化されているTr7MGをDMSOに溶解して用いた。pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して、アントシアニンとフラボンを1:5の量比で混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル(島津製作所)に入れ、UV2450(島津製作所)で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、テルナチンC5だけを溶解した時の吸収極大波長は559nmであったが、テルナチンC5とのコピグメンテーションを試験したフラボン配糖体の全てで、吸収極大波長が572-574nm、ショルダーが595-597nmのスペクトルパターンを示し、青色を発現した(図5)。この結果から、フラボンB環3′位および5′位の水酸基とメトキシル基による修飾パターンの違い、7位水酸基における糖残基の違い、7位グルコシル基のマロニル基による修飾の有無は、コピグメンテーションによる青色発現に大きな差を与えていないことが明らかになった。従って、青いキクの花弁では3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニン類全てとフラボン配糖体全てがコピグメンテーションして、青色を発現していると考えられる。 また、キクのフラボン配糖体とは異なる構造のフラボン配糖体を花で合成する他の植物種においても、3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンを蓄積させることで青色を発現させられることを示している。
Lt7MGが共存するとコピグメンテーションによって青色を発現するアントシアニンの構造的特徴を調査した。アントシアニンにはペラルゴニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド(Pg3MG)、Cy3MG、Dp3MG3′G、テルナチンC5(TC5)を用いた。図6左に示されるとおり、アントシアニンのB環3′位および5′位が修飾されていないPg3MGや、3′位が水酸化されているCy3MGでは青色を発色するスペクトルが得られなかった。青色を発現するTC5の5′位グルコシル基がないDp3MG3′Gでは吸収極大値はほぼ同じであったが、600nmのショルダーから620nmくらいまでの吸光度が低く、逆に短波長側の530nm付近にショルダー領域が観察されるスペクトルを示し、青色の発色は起きなかった。この事からフラボン配糖体をコピグメントとするアントシアニンの構造として、3′位及び5′位の水酸基がともに配糖化されていることが重要であることが示された。
フラボン配糖体とコピグメンテ−ションする際、3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンの3位グルコースのマロニル基の有無が、青色の発色に影響するかを調査した。アントシアニンに、テルナチンC5(TC5)およびプレテルナチンC5(pTC5)、コピグメントのフラボン配糖体に、Lt7MG、Tr7MGを用いた。プレテルナチンC5は、キクの青色花弁から精製し、LC-MS/MSで構造を確認してから用いた。アントシアニンとフラボンは1:5の量比で混合した。pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル(島津製作所)に入れ、UV2450(島津製作所)で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、図6右に示されるとおり、アントシアニンの3位グルコースにマロニル基がない場合(Lt7MG + pTC5)でも、ある場合(Lt7MG + TC5)と同様に吸収極大波長572nm,ショルダー595nm付近のスペクトルパターンを示し、青色を発色した。また、pHを5.6から5.8にすると、吸収極大波長が572nmから594nmへとシフトし、青色を発色した。一方で、マロニル基のあるTC5と比べ、pTC5の混合溶液では退色が著しく早く、より安定した青色の発色のためにはアントシアニン3位グルコースにおけるマロニル基による修飾が必要であると考えられた。
コピグメントのフラボン配糖体における糖の結合様式が青色発現に及ぼす影響を、C-グリコシル化フラボン(フナコシ)を用いて調査した。3′,5′-配糖化アントシアニンにテルナチンC5、コピグメントには、O-結合で糖がフラボンのアグリコンに結合しているLt7MG、C-結合で糖がフラボンのアグリコンに結合しているルテオリン8-C-グルコシド(オリエンチン,Lt8CG)、ルテオリン6-C-グルコシド(ホモオリエンチン,イソオリエンチン,Lt6CG)、アピゲニン8-C-グルコシド(ビテキシン,Ap8CG)、アピゲニン6-C-グルコシド(イソビテキシン,Ap6CG)の5種類を用いた。アントシアニンとフラボンは1:5の量比で混合した。 pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル(島津製作所)に入れ、UV2450(島津製作所)で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、図7に示されるとおり、8位に糖がC-結合しているLt8CGおよびAp8CGでは、Lt7OMGと比べて、吸収極大とショルダーがともに数nm短波長側にシフトし、紫青色になった。一方、6位に糖がC-結合しているLt6CGおよびAp6CGでは、Lt7OMGと比べ、吸収極大が3nm程度長波長側へシフトし、さらに595nm付近のショルダーの吸光度も上昇した。とくにAp6CG(イソビテキシン)では595nmにピークが現れており、Lt7OMGや他のC-グリコシルフラボンと比べて安定的できれいな青色を発現した。この結果は、6位にグルコースがC結合しているフラボン配糖体を共存させることが、 3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンの青色の発現に有効であることを示している。
フラボン配糖体と同様に花弁でアントシアニンともに蓄積することが数多く報告されているフラボノール配糖体をコピグメントに用い、コピグメンテーションによる青色の発現に及ぼす影響を調査した。3′,5′-配糖化アントシアニンにテルナチンC5、コピグメントにはフラボノ−ル配糖体であるケンフェロール3-グルコシド(Km3G)、ケルセチン3-グルコシド(Qu3G)、ケルセチン3-マロニルグルコシド(Qu3MG)、およびケルセチン3-ルチノシド(ルチン,Qu3RG)およびフラボンのLt7MGを用いた。アントシアニンとフラボノールまたはフラボンを1:5の量比で混合した。 pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボノールDMSO溶液またはフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル(島津製作所)に入れ、UV2450(島津製作所)で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、図8に示されるとおり、フラボンのLt7MGでは吸収極大波長は572nm,ショルダーを−595nm付近に持つ吸収スペクトルパターンを示し、青色を発現した。一方、フラボノ−ルのKm3G、Qu3MG、Qu3RGでは吸収極大が568-569nmの短波長側へシフトし、ショルダーも592mm付近となりLt7MGと比べて紫がかった青色となった。Qu3Gは、調査したフラボノ−ル4種の中で最もフラボンのLt7MGをコピグメントとした吸収スペクトルに近く、吸収極大波長とショルダーの位置はほぼ同じであった。以上の結果より、フラボン類だけでなくフラボノール類も、3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンとコピグメンテーションすることで青色や紫青色を発色することが可能であることが示唆された。
Claims (28)
- 青系花色を有する植物の作出方法であって、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法。
- 前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン7-マロニルグルコシド、ルテオリン7-グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項2に記載の方法。
- 前記トリセチン配糖体が、トリセチン7-マロニルグルコシド又はその誘導体である、請求項2に記載の方法。
- 前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項2に記載の方法。
- 前記アカセチン配糖体が、アカセチン7-ルチノシド又はその誘導体である、請求項2に記載の方法。
- 前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である、請求項7に記載の方法。
- 前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-(6′′-マロニル)グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である、請求項7に記載の方法。
- 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド(テルナチンC5)、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド(プレテルナチンC5)、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体とが、1:1〜1:10の量比で共存することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 青系花色を有する植物であって、植物の細胞内でアントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体が共存していることを特徴とする植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項14に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン7-マロニルグルコシド、ルテオリン7-グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記トリセチン配糖体が、トリセチン7-マロニルグルコシド又はその誘導体である、請求項15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記アカセチン配糖体が、アカセチン7-ルチノシド又はその誘導体である、請求項15に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である、請求項20に記載の方法。
- 前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-(6′′-マロニル)グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である、請求項20に記載の方法。
- 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド(テルナチンC5)、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド(プレテルナチンC5)、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項14〜22のいずれか1項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体とが、1:1〜1:10の量比で共存する特徴とする、請求項14〜23のいずれか1項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、請求項14〜24のいずれか1項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、請求項14〜25のいずれか1項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
- 請求項14〜26のいずれか1項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
- 請求項14〜27のいずれか1項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
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菅野善明他: "チョウマメ由来アントシアニン3',5'-O-グルコシル基転移酵素遺伝子を導入した形質転換ロベリアの解析", 日本植物細胞分子生物学会つくば大会・シンポジウム講演要旨集, vol. 24, JPN6016037116, 2006, pages 40 - 1, ISSN: 0004178924 * |
Cited By (1)
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US20220186240A1 (en) * | 2019-03-29 | 2022-06-16 | Suntory Holdings Limited | Flavone 7-o-methyltransferase gene and use for same |
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