BRPI0407822B1 - Polinucleotídeos e polipeptídeos nas plantas - Google Patents

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Jacqueline E. Heard
Volker Haake
Luc J. Adam
Lynne T. REUBER
James S. Keddie
Arnold N. DuBell
Omaira Pineda
Peter P. Repetti
Karen S. Century
Neal I. Gutterson
Guo-Liang Yu
Pierre E. Broun
Roderick W. Kumimoto
Marsha L. Pilgrim
Robert A. Creelman
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Abstract

polinucleotídeos e polipeptídeos nas plantas . a presente invenção refere-se aos polipeptídeos de fator de transcrição de plantas, polinucleotídeos que codificam os mesmos, homólogos de uma variedade de espécies de plantas e métodos de uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos para produzir plantas transgênicas possuindo propriedades vantajosas, em comparação à planta de referência. as informações da seqüência relacionada a esses polinucleotídeos e polipeptídeos podem também ser usadas nos métodos de pesquisa de bioinformática e são também descritas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLINUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS NAS PLANTAS.
Relação com os Pedidos Copendentes [0001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido US não provisório número 10/374,780, depositado em 25 de fevereiro de 2003 e do Pedido US não provisório número 10/675.852, depositado em 30 de setembro de 2003, o conteúdo dos mesmos sendo incorporado aqui como referência em sua totalidade.
Campo da Invenção [0002] Essa invenção se refere ao campo da biologia das plantas. Mais especificamente, a presente invenção se refere às composições e processos para modificar fenotipicamente uma planta.
Histórico da Invenção [0003] Os traços da planta, tais como suas características bioquímicas, de desenvolvimento ou fenotípicas podem ser controlados através de vários processos celulares. Um modo importante de manipular aquele controle é através dos fatores de transcrição - proteínas que influenciam a expressão de um gene ou conjuntos de genes específicos. Plantas transformadas e transgênicas que compreendem células possuem níveis alterados de pelo menos um fator de transcrição selecionado, por exemplo, possuem traços vantajosos ou desejáveis. Estratégias para manipular
2/726 os traços por alteração do teor do fator de transcrição da célula de uma planta podem, portanto, resultar em plantas e colheitas com propriedades novas aperfeiçoadas e/ou comercialmente valiosas.
[0004] Os fatores de transcrição podem modular a expressão genética, tanto aumentando quanto diminuindo (induzindo ou reprimindo) a razão de transcrição. Essa modulação resulta em níveis diferentes de expressão genética nos vários estágios de desenvolvimento, em tecidos e tipos de células diferentes, e em resposta aos diferentes estímulos exógenos (por exemplo, ambientais) e endógenos através de todo o ciclo de vida do organismo.
[0005] Em razão dos fatores de transcrição serem elementos de controle chave das vias biológicas, a alteração dos níveis de expressão de um ou mais fatores de transcrição pode alterar todas as vias biológicas em um organismo. Por exemplo, a manipulação dos níveis de fatores de transcrição selecionados pode resultar na expressão aumentada de proteínas economicamente úteis ou biomoléculas nas plantas ou aperfeiçoamento em outras características agricolamente relevantes. De modo contrário, a expressão bloqueada ou reduzida de um fator de transcrição pode reduzir a biossíntese de compostos indesejados ou remover um traço indesejável. Portanto, a manipulação dos níveis de fatores de transcrição em uma planta oferece um enorme
3/726 potencial à biotecnologia agrícola para modificação dos traços de uma planta. Várias características agricolamente relevantes das plantas e traços desejáveis que podem ser imbuídos por expressão genética são listados a seguir. Traços Úteis das Plantas
Categoria: estresse abiótico; traço desejado: tolerância ao resfriamento [0006] 0 termo sensibilidade ao resfriamento foi utilizado para descrever mitos tipos de danos fisiológicos produzidos a temperaturas baixas, porém acima do congelamento. Muitas colheitas de origem tropical, tais como, soja, arroz, milho e algodão são facilmente danificadas pelo resfriamento. O dano por resfriamento típico inclui murcha, necrose, clorose ou vazamento de íons das membranas celulares. Os mecanismos subjacentes da sensibilidade ao resfriamento não ainda completamente entendidos, porém provavelmente envolvem o nível de saturação da membrana e outras deficiências fisiológicas. Por exemplo, fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese devido a altas intensidades de luz) frequentemente ocorre sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites de verão/outono de resfriamento tardio. Por algumas estimativas, o resfriamento é responsável por prejuízos monetárias nos Estados Unidos, perdendo apenas para estiagem e inundação. Por exemplo, o
4/726 resfriamento pode levar à perdas de rendimento e da qualidade do produto através do amadurecimento retardado do milho. Outra consequência do fraco desenvolvimento é o revestimento fraco do solo nos campos de milho na primavera, frequentemente resultando em erosão do solo, ocorrência aumentada de ervas daninhas e ingestão reduzida de nutrientes. Uma ingestão retardada de nitrogênio mineral também levaria a perdas crescentes de nitrato na água do solo.
Categoria: estresse abiótico; traço desejado: tolerância ao congelamento.
[0007] O congelamento é um estresse ambiental principal que limita onde as colheitas podem ser desenvolvidas e reduz consideravelmente os rendimentos, dependendo das intempéries em uma colheita específica em desenvolvimento.
Além dos anos excepcionalmente estressantes que causam perdas mensuráveis de bilhões de dólares, estresse menos extremo quase certamente causa menos reduções no rendimento em relação às áreas maiores que produzem reduções de rendimento de valor semelhante em dólares a cada dano. Por exemplo, nos Estados Unidos, estima-se que as geadas do inverno de 1995 tenham causado perdas de mais de um bilhão de dólares as colheitas de milho e soja. A primavera de 1998 mostrou uma estimativa de 200 milhões de dólares de prejuízos somente à Geórgia, nas
5/726 indústrias que utilizam pêssegos, vacinios e morangos. As geadas ocasionais na Flórida mudaram o cinturão cítrico mais para o sul devido a perdas de mais de 100 milhões de dólares. A Califórnia sustentou 650 milhões de dólares de prejuízo em 1998 com a colheita de cítricos, devido as geadas do inverno. Além disso, determinadas colheitas tais como, Eucalyptus, que possuem propriedades muito favoráveis de crescimento rápido e boa qualidade de madeira para formação de polpa, não são capazes de desenvolver nos Estados do sul devido às geadas ocasionais.
[0008] A rigidez inerente ao inverno sobre as colheitas determina em quais áreas agrícolas elas podem sobreviver no inverno. Por exemplo, para o trigo, a porção central do norte dos Estados Unidos possui invernos que são muito frios para as boas colheitas de trigo no inverno. Aproximadamente 20% da colheita de trigo nos Estados Unidos é de trigo da primavera, com um valor de mercado de 2 bilhões de dólares. As áreas que desenvolvem trigo da primavera poderíam ser beneficiadas por desenvolvimento de trigo do inverno que teve a sua rigidez ao inverno aumentada. Presumindo-se um aumento no rendimento de 25% quando do desenvolvimento do trigo no inverno, isso traria um valor aumentado de 500 milhões de dólares. Adicionalmente, o trigo do inverno existente é severamente castigado pelas condições das geadas e teria rendimentos
6/726 aperfeiçoados com o aumento da tolerância a esses estresses. Uma estimativa de beneficio de rendimento desses traços é de 10% dos 4,4 bilhões de dólares da colheita de trigo do inverso nos Estados Unidos ou 444 milhões de dólares de aumento do rendimento, bem como uma melhor sobrevivência em condições extremamente geladas que ocorrem periodicamente.
[0009] Assim, plantas mais resistentes ao congelamento, ambos congelamento de meio de inverno e as geadas do sul, protegeríam o investimento dos fazendeiros, aperfeiçoando o rendimento e qualidade e permitindo que algumas áreas geográficas desenvolvam colheitas mais lucrativas e produtivas. Adicionalmente, as colheitas de inverno, tais como, canola, trigo e cevada possuem 25% a 50% de aumentos de rendimento em relação as variedades plantadas na primavera das mesmas colheitas. Esse aumento no rendimento deve-se a arrancada que a colheita plantada no outono tem em relação à colheita plantada na primavera e também à sua maturidade precoce, embora temperaturas, umidade do solo e falta de agentes patogênicos forneçam condições mais favoráveis.
Categoria: estresse abiótico; traço desejado: tolerância ao sal [0010] Um em cinco hectares de terra irrigada é danificado por sal um fator histórico importante no
7/726 declínio das sociedades agrárias envelhecidas. Espera-se que essa condição apenas se agrave, reduzindo adicionalmente a capacidade da terra arável e produção da colheita, uma vez que nenhum das cinco colheitas de alimentos principais, trigo, milho, arroz, batatas e soja podem tolerar sal excessivo.
[0011] Efeitos prejudiciais do sal nas plantas são uma consequência de deficiência de água resultando em tensão osmótica (semelhante ao estresse a estiagem) e os efeitos de íons de sódio em excesso nos processos bioquímicos importantes. Como com o congelamento e estiagem, a salmoura alta causa deficiência de água; a presença de sal em excesso torna difícil a extração de água do ambiente pelas raizes da planta (Buchanan e outros (2000) em Biochemistry and Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD) . A salinidade do solo assim é uma das variáveis mais importantes que determina onde uma planta pode desenvolverse. Em muitas partes do mundo, áreas de terra dimensionáveis não são cultivadas devido à salinidade do solo naturalmente alta. Para compor o problema, a salinização dos solos que são usados para produção agrícola é um problema significativo e crescente nas regiões que têm como base a agricultura. A última é composta por super utilização, super fertilização e esgotamento da água,
8/726 tipicamente causado por alteração climática e as demandas de aumento da população. A tolerância ao sal é de importância especifica em um ciclo de vida da planta, uma vez que a evaporação da superfície do solo causa movimento ascendente da água e o sal acumula-se na camada superior do solo, onde as sementes são colocadas. Assim, a germinação normalmente acontece em uma concentração de sal muito maior que o nível médio de sal no perfil total do solo.
Categoria: estresse abiótico; traço desejado: tolerância a estiagem.
[0012] Embora muito das intempéries que nós experimentamos sejam breves e de vida curta, a estiagem é um fenômeno mais gradual, tomando conta lentamente de uma área e enrijecendo sua sujeição com o tempo. Em casos severos, a estiagem pode durar por muitos anos, e pode ter efeitos devastadores na agricultura e fornecimentos de água. Com a germinação da população e escassez crônica de água fresca disponível, a estiagem não é apenas o número de um problema relacionado as intempéries na agricultura, porém também classifica-se como um dos maiores desastres naturais de todos os tempos, causando não apenas danos econômicos, porém também perda de vidas humanas. Por exemplo, os Estados Unidos tiveram perdas com a estiagem de 1988 que excederam $40 bilhões, superiores às perdas causadas pelo Furacão Andrew em 1992, as enchentes do rio
9/726
Mississipi em 1993 e o terremoto em São Francisco em 1989. Em algumas áreas do mundo, os efeitos da estiagem podem ser muito mais graves. No bico da África em 1984-1985 a estiagem levou à escassez de víveres que vitimou 750.000 pessoas.
[0013] Os problemas para as plantas causados pela baixa disponibilidade de água incluem estresses mecânicos causados pela retirada de água celular. A estiagem também faz com que as plantas fique mais suscetíveis a várias doenças (Simpson (1981). The Value of Physiological Knowledge [0014] of Water Stress in Plants, In Water Stress on Plants, (Simpson, G. M., ed. ) , Praeger, NY, pp. 235265) .
[0015] Além das muitas regiões de terra do mundo que são muito áridas para a maioria senão todas as plantas de colheita, o uso excessivo e a utilização demasiada da água disponível resulta em uma perda crescente da terra utilizada agricolamente, um processo que, ao extremo, resulta em desertificação. O problema é adicionalmente composto por aumento de acúmulo de sal nos solos, conforme descrito acima, o que adiciona-se à perda de água disponível nos solos.
Categoria: estresse abiótico; traço desejado: tolerância ao calor.
10/726 [0016] A germinação de muitas colheitas é muito sensível à temperatura. Um fator de transcrição que melhoraria a germinação em condições quentes seria útil para colheitas que são plantadas mais tarde na estação ou em climas quentes.
[0017] As sementeiras e plantas maduras que são expostas ao excesso de calor podem experimentar choque térmico, que pode surgir em vários órgãos, incluindo folhas e especificamente frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse pelo valor. 0 aquecimento também danifica estruturas celulares, incluindo organelas e citoesqueleto e prejudica a função da membrana (Buchanan, supra).
[0018] O choque térmico pode resultar em uma diminuição na síntese de proteína total, acompanhada por expressão das proteínas de choque térmico. As proteínas de choque término funcionam como acompanhantes e estão envolvidas no reenvolvimento das proteínas desnaturadas por aquecimento.
Categoria: estresse abiótico; traço desejado: tolerância ao baixo teor de nitrogênio e fósforo [0019] A capacidade de todas as plantas de remover nutrientes de seu ambiente é essencial à sobrevivência. Assim, a identificação dos genes que codificam polipeptideos com atividade do fator de transcrição pode
11/726 seguir a geração de plantas transgênicas que são mais capazes de fazer uso dos nutrientes disponíveis nos ambientes com poucos nutrientes.
[0020] Entre os macronutrientes mais importantes para crescimento da planta que possuem o impacto maior no rendimento da colheita estão os compostos contendo nitrogênio e fósforo. Os fertilizantes contendo nitrogênio e fósforo são usados intensivamente nas práticas agrícolas atualmente. Um aumento na colheita de grãos rende de 0,5 a 1,0 toneladas métricas por hectare a 7 toneladas métricas por hectare, acompanhado do uso de fertilizante de nitrogênio fixo comercial no cultivo de produção (Vance (2001) Plant Physiol. 127: 390-397). Em virtude das práticas atuais, a fim de satisfazer as demandas de produção de alimentos nos anos que virão, serão necessários aumentos consideráveis na quantidade de fertilizantes contendo nitrogênio e fósforo (Vance, supra).
[0021] O nitrogênio é o elemento mais abundante na atmosfera terrestre ainda que seja um dos elementos mais limitado para o crescimento da planta, devido a sua falta de disponibilidade no solo. As plantas obtêm N do solo de várias fontes incluindo fertilizantes comerciais, estrume e da mineralização de matéria orgânica. O uso intensivo de fertilizantes N nas práticas agrícolas presentes é problemático, o processo Haber-Bosch de energia intensiva
12/726 fabrica o fertilizante N e é estimado que os Estados Unidos utilizem anualmente entre 3-5% do gás natural nacional para esse processo. Além da despesa de produção do fertilizante de N e do esgotamento de recursos não renováveis, o uso de fertilizantes de N conduziu a eutroficação dos ecossistemas de água fresca e a contaminação da água de beber devido ao escorrimento de fertilizante em excesso para os fornecimentos de água no solo.
[0022] 0 fósforo é o segundo em relação ao nitrogênio em importância como um macronutriente para o crescimento da planta e para seu impacto no rendimento da colheita. O fósforo (P) é extremamente imóvel e não prontamente disponível às raízes no solo e, portanto, frequentemente limita o crescimento das plantas. O fosfato inorgânico (Pi) é um constituinte de várias moléculas importantes necessárias para transferência de energia, regulação metabólica e ativação da proteína (Marschner (1995) Mineral Nutrition of Higher Plants, 2nd ed. , Academic Press, San Diego, CA) . As plantas tem envolvido várias estratégias para ajudar a cope com a falta de P e N que incluem adaptações metabólicas, bem como de desenvolvimento. A maioria, se não todas, essas estratégias possuem componentes que são regulados ao nível de transcrição e portanto, são receptíveis para manipulação pelos fatores de transcrição. Adaptações metabólicas
13/726 incluem aumento na disponibilidade de P e N por aumento da absorção do solo, a despeito da indução de transportadores de alta afinidade e baixa afinidade, e/ou aumentando sua mobilização na planta. Adaptações de desenvolvimento incluem aumentos nas raizes primária e secundária, aumentos no número de pelos da raiz e comprimento e associações com fungos micorrizos (Bates and Lynch (1996) Plant Cell Environ. 19: 529-538; Harrison (1999) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 361-389).
Categoria: estresse abiótico; traço desejado: resistência a doença [0023] O controle de doenças representa uma despesa significativa na produção mundial de colheitas. De acordo com os relatório do EPA para 1996 e 1997, os fazendeiros norte-americanos gastam aproximadamente 6 bilhões de dólares com fungicidas anualmente. A despeito deste gasto, de acordo com uma inspeção conduzida pela organização de alimentos e agricultura, as doenças das plantas ainda reduzem a produtividade da colheita mundial em 12% e somente nos Estados Unidos, perdas econômicas devido as agentes patogênicos das plantas remontam a 9,1 bilhões de dólares (FAO, 1993). Os dados desses relatórios e outros demonstram que, a despeito da disponibilidade de controle químico, apenas uma pequena proporção das perdas devido a doença pode ser prevenida. Os tratamentos fungicidas e
14/726 antibacterianos não apenas são caros para os fazendeiros, porém sua aplicação difundida possui riscos ambientais e a saúde. 0 uso da biotecnologia da planta para projetar colheitas resistentes a doença possui o potencial de causar um impacto econômico significativo na agricultura e industrias florestais de dois modos: reduzindo a despesa em dinheiro e ambiental com aplicação de fungicidas e redução de perdas pré-colheita e pós-colheita que ocorrem agora a despeito do uso de práticas caras para controle de doenças.
[0024] As doenças causadas por fungos, bactérias, oomicete, vírus e nematóides nas plantas são ubíquas e problemas importantes freqüentemente ímpactam severamente o rendimento e qualidade da colheita e outras plantas. Alguns poucos exemplos de doenças em plantas incluem:
[0025] Míldio pulverulento, causado pelos fungos Erysiphe, Sphaerotheca, Phyllactinia, Microsphaera, Podosphaera, ou Uncinula, em, por exemplo, trigo, feijão, abóbora moranga, alface, ervilha, uva, colheitas de árvores frutíferas, bem como, rosas, phlox, lilás, gramas e evômino;
1 ]0026] Doenças causadas por Fusarium, tais como,
murcha por Fusarium em cucúrbitas, mangra causada por
Fusarium em cevada e trigo, mucha e coroa e podridão de
raiz em tomateiros;
[0027] Morte súbita de carvalho, causada por
15/726 oomicete Phytophthora ramorum; a doença foi detectada primeiro em 1995 nos carvalhos marrons da Califórnia. A doença matou cerca de mais do que 100.000 carvalhos marrons, carvalhos da costa, carvalhos pretos, e carvalhos de Shreve nas regiões da costa do norte da Califórnia e, mais recentemente no sudeste do Oregon (2001) National Geographic News, 6 de dezembro de 2001);
[0028] Sigatoka preta, uma doença causada pela espécie de fungo Mycosphaerella, que ataca a folhagem da bananeira, sendo dispersa através das regiões do mundo que são responsáveis pela maior colheita de bananas do mundo;
[0029] Desencadeamento progressivo das extremidades dos ramos, causado por Eutypa lata, afeta várias plantas de colheita, incluindo a uva para vinhos. O desencadeamento progressivo das extremidades dos ramos causado por Eutypa retarda a emergência do broto e causa clorose, parada no crescimento e esfarelamento das folhas;
[0030] Doença de Pierce, causada pela bactéria Xylela fastidiosa, impede o desenvolvimento das uvas nos sudoeste dos Estados Unidos, e ameaça a lucratividade da indústria de uvas para vinho no norte da Califórnia. A bactéria coagula a vasculatura dos vinhedos, resultando em abrasão foliar seguido por morte lenta das uvas. Não existe tratamento conhecido para a doença de Pierce;
[0031] Mancha bacteriana causada pela bactéria
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Xanthomonas campestris, causa vários problemas de doença em tomateiros e pimenteiras. É um problema significativo para a indústria de tomates da Flórida, uma vez que se dispersa muito rapidamente, especialmente em períodos quentes, quando existe chuva levada pelos vento. Nessas condições, não existem medidas de controle adequadas.
[0032] Doenças causadas por virus da família Geminiviridae são um problema agrícola que desenvolve-se mundialmente. Os geminivírus causaram perdas graves de colheita em tomates, mandioca e algodão. Por exemplo, na estação de crescimento entre 1991-1992 na Flórida, os geminivírus causaram $140 milhões de prejuízos à colheita do tomate (Moffat (1991) Science 286: 1835). Os geminivírus possuem a capacidade de recombinação entre cepas para produzir rapidamente novas variedades virulentas. Portanto, existe uma necessidade premente de controle para geminivírus de amplo espectro;
[0033] 0 nematóide de cisto de soja, Heterodera glycines, causa parada no desenvolvimento e clorose nas plantas de soja, o que resulta em perdas de rendimento ou morte da planta por infestação grave. As perdas anuais nos Estados Unidos foram estimadas em $1,5 bilhões (University of Minnesota Extension Service).
[0034] Os agentes patogênicos mencionados anteriormente representam uma fração muito pequena das
17/726 espécies diversas que afetam gravemente a saúde e rendimento da planta. Para uma descrição mais completa das inúmeras doenças de planta, vide, por exemplo, Vidhyasekaran (1997) Fungai Pathogenesis in Plants and Crops: Molecular Biology and Host Defense Mechanisms, Marcei Dekker, Monticello, NY) , ou Agrios (1997) Plant Pathology, Academic Press, New York, NY) . As plantas que são capazes de resistir a doença podem produzir rendimentos significativamente maiores e qualidade aperfeiçoada de alimento. Assim é de importância considerável obter-se genes que reduzam ou previnam a doença.
Categoria: resposta a luz; traço desejado: Esquivamento reduzido da sombra.
[0035] O esquivamento da sombra descreve o processo onde as plantas que se desenvolvem próximo uma da outra competem aumentando o comprimento do caule as custas do desenvolvimento das folhas, frutos e órgãos de armazenamento. Isso é causado pela resposta da planta à radiação de infravermelho distante, refletida das folhas das plantas vizinhas, o que é mediado por fotoreceptores de fitocromo. A proximidade das outras plantas, como é produzido nas plantações de colheita de alta densidade, aumenta a proporção relativa de irradiação infravermelho distante e, portanto, induz a resposta de esquivamento da sombra. O esquivamento da sombra afeta adversamente a
18/726 biomassa e o rendimento, especificamente quando as folhas, frutos ou outros órgãos de armazenamento constituem a colheita desejada (vide, por exemplo, Smith (1982) Annu. Rev. Plant Physiol. 33: 481-518; Ballare e outros (1990) Science 247: 329-332; Smith (1995) Annu. Dev. Plant Physiol. Mol. Biol., 46: 289-315; e Schmitt e outros (1995), American Naturalist, 146: 937-953). A alteração da resposta de esquivamento da sombra em tabaco através da alteração dos níveis de fitocromo mostrou a produção de um aumento no índice de colheita (biomassa da folha/biomassa total) em densidade de plantio alta, o que resultaria em um rendimento maior (Robson e outros (1996) Nature Biotechnol. 14: 995-998).
Categoria: tempo de floração; traço desejado: tempo de floração alterado e controle de floração [0036] O tempo de floração possui um impacto significativo na produção de produtos agrícolas. Por exemplo, as variedades com diferentes respostas de floração às disposições ambientais precisam adaptar as colheitas às diferentes regiões de produção ou sistemas. Tal faixa de variedades foi desenvolvida para muitas colheitas, incluindo trigo, milho, soja e morangos. Os processos aperfeiçoados para alteração do tempo de floração facilitarão o desenvolvimento de novas variedades adaptadas geograficamente.
19/726 [0037] Programas de reprodução para o desenvolvimento de novas variedades podem ser limitados ao ciclo de semente-a-semente. Assim, a reprodução de novas variedades de plantas com ciclos de múltiplos anos (tais como, bienais, por exemplo, cenoura ou árvores frutíferas, tais como, cítricas) podem ser muito lenta. Com relação aos programas de reprodução, havería uma vantagem significativa em ter-se plantas comercialmente valiosas que exibem períodos controláveis e modificados de floração (épocas de floração). Por exemplo, a floração acelerada encurtaria a colheita e os programas de reprodução de árvores.
[0038] O controle de floração aperfeiçoado permite que mais de um plantio e colheita sejam feitos dentro de uma estação simples. A floração precoce também aperfeiçoa o tempo para colheita das plantas no qual a porção da flor das plantas constitui o produto (por exemplo, brócolis, couve-flor e outras flores comestíveis) . Além disso, o controle químico da floração através da indução ou inibição de floração nas plantas fornecería uma vantagem significativa aos plantadores por indução de produção de fruto mais uniforme (por exemplo, nos morangos).
[0039] Um número mensurável de plantas nas quais a porção vegetativa da planta forma a colheita de valor tende a aparafusar dramaticamente (por exemplo, espinafre, cebolas, alface), após o que a produção da biomassa declina
20/726 e a qualidade do produto diminui (por exemplo, através de senescência desencadeada pela floração das partes vegetativas). 0 retardo ou prevenção da floração pode também reduzir ou impedir a disseminação do pólen de plantas transgênicas.
Categoria: razão de desenvolvimento; traço desejado: razão de crescimento modificada [0040] Para a maioria das colheitas comerciais, é desejável o emprego de planas que possam se estabelecer mais rapidamente, uma vez que as sementeiras e plantas jovens são especificamente suscetíveis às condições de estresse, tais como, salinidade ou doença. Uma vez que muitas ervas daninhas podem crescer em colheitas jovens ou competir com as mesmas pelos nutrientes, seria também desejável determinar meios para permitir que as plantas de colheitas jovens compitam com as espécies daninhas. O aumento da razão de crescimento da sementeira (emergência) contribui para dar vigor a sementeira e permitir que as colheitas sejam plantadas mais cedo com menos problemas de perdas devido aos fatores ambientais. O plantio precoce aumenta os dias para o período de enchimento do grão e aumenta o rendimento.
a. A provisão dos meios para agilizar ou tornar lento o desenvolvimento das plantas também seria desejável para horticultura ornamental. Se tais meios forem providos,
21/726 o desenvolvimento lento dos grãos pode exibir produção de pólen prolongada ou período de frutificação, aperfeiçoando assim a fertilização ou estendendo a estação de colheita. Categoria: razão de desenvolvimento; traço desejado:
senescência modificada e morte da célula [0041] A senescência prematura, desencadeada por vários estresses de plantas, pode limitar a produção de biomassa da folha e rendimento da semente. Os genes de fator de transcrição que suprimem a senescência prematura ou morte da célula em resposta aos estresses podem prover meios para aumentar o rendimento. O retardo da senescência de desenvolvimento normal também melhoraria o rendimento, especificamente para aquelas plantas nas quais a parte vegetativa da planta representa o produto comercial (por exemplo, espinafre, alface).
[0042] Embora a senescência da folha seja tida como sendo uma adaptação evolucionária para reciclar nutrientes, a capacidade de controlar a se senescência em um cenário agrícola tem valor significativo. Por exemplo, um retardo na senescência da folha, em alguns híbridos de milho está associado a um aumento significativo nos rendimentos e retardo de alguns dias na senescência das plantas de soja pode ter um grande impacto no rendimento. Em um cenário experimental, as plantas de tabaco projetadas para inibir a senescência da folha tiveram um período de vida
22/726 fotossintética maior e produziram um aumento de 50% no peso seco e rendimento da semente (Gan and Amasino (1995) Science 270: 1986-1988). A senescência retardada da flor pode gerar plantas que mantêm suas flores por mais tempo e isso pode ser de interesse em potencial para a indústria da horticultura ornamental e a senescência foliar e de frutos retardada aperfeiçoaria a vida em prateleira da produção após colheita.
[0043] Adicionalmente, a morte celular programada desempenha um papel importante em outras respostas da planta, incluindo a resposta de resistência a doença e alguns sintomas de doenças, por exemplo, causadas por agentes patogênicos necrotróficos, tais como, Botrytis cinerea e Sclerotinia sclerotiorum (Dickman e outros Proc. Natl. Acad. Sei., 98: 6957-6962). A senescência localizada e/ou morte da célula pode ser usada pelas plantas para conter a dispersão dos microorganismos prejudiciais. Uma resposta de morte de célula localizada, especifica, a resposta hipersensivel, é um componente da resistência a doença especifica de raça, mediada pelos genes de resistência da planta. Acredita-se que a resposta hipersensivel ajude a limiar o desenvolvimento do agente patogênico e iniciar uma via de transdução de sinal que conduz à indução das defesas sistêmicas da planta. A senescência acelerada pode ser uma defesa contra os agentes
23/726 patogênicos obrigatória, tais como, míldio pulverulento, que fiam-se no tecido saudável da planta para nutrientes. Com relação ao míldio pulverulento, Botrytis cinerea e Sclerotinia sclerotiorum e outros agentes patogênicos, fatores de transcrição que amenizam a morte celular e/ou lesão podem reduzir as perdas econômicas significativas encontradas, tais como, por exemplo, Botrytis cinerea em morangos e uvas.
Categoria: regulador do crescimento; traço desejado:
sensibilidade alterada ao açúcar [0044] Os açúcares são moléculas reguladoras chave que afetam os processos diversos em plantas superiores incluindo germinação, crescimento, floração, senescência, metabolismo de açúcar e fotossíntese. A sacarose, por exemplo, é a forma de transporte principal do fotossintato e seu fluxo através das células foi mostrado como afetando a expressão genética e alterando o acúmulo do composto de armazenamento nas sementes (relações de fonte-escoadouro). A sensibilidade a hexose específica de glicose também foi descrita em plantas e está implicada com a divisão celular e repressão de genes de escassez (ciclos fotossintéticos ou de glioxilato).
Categoria: morfologia; traço desejado: morfologia alterada [0045] Tricomas são desenvolvimentos epidérmicos ramificados ou não ramificados ou estruturas capilares em
24/726 uma planta. Tricomas produzem uma variedade de substâncias bioquímicas secundárias, tais como, diterpenos e ceras, os primeiros sendo importantes por exemplo, como feromonas de inseto e os últimos como protetores contra dissecação e pestes herbívoras. Uma vez que os diterpenos possuem também valor comercial como aromatizantes, pesticidas e cosméticos, e valor em potencial como agentes antitumor e substâncias que mediam a inflamação, eles têm sido os produtos e alvos de pesquisa considerável. Na maioria dos casos onde as vias metabólicas são impossíveis de serem projetadas, o aumento da densidade do tricoma ou tamanho nas folhas pode ser o único modo de aumentar a produtividade da planta. Assim, seria vantajoso descobrir os genes de fator de transcrição que afetam o tricoma, com o fim de aumentar a densidade do tricoma, tamanho ou tipo para produzir plantas que tem uma proteção melhor contra insetos ou que rendem quantidades maiores de metabolitos secundários.
[0046] A capacidade de manipular composição cerosa, quantidade ou distribuição modificaria a tolerância da planta a estiagem e baixa umidade ou resistência aos insetos, bem como aparência da planta. Especificamente, uma aplicação possível para um gene de fator de transcrição que reduz a produção de revestimentos cera nas sementes de girassol seria reduzir a incrustação durante o processo de
25/726 óleo da semente. 0 anti-sentido ou co-supressão dos fatores de transcrição envolvidos na biossintese da cera em uma maneira específica do tecido pode ser usado para alterar especificamente a composição cerosa, quantidade ou distribuição naquelas plantas e colheitas das quais a cera é tanto um atributo ou produto valioso, quanto um constituinte indesejável das plantas.
[0047] Outras características morfológicas que
podem ser desejáveis nas plantas incluem aquelas de
natureza ornamental. Essas alterações incluem a cor da
semente, cor total, forma da folha e da flor, cor da folha, tamanho da folha ou brilho das folhas. As plantas que produzem folhas escuras podem ter benefícios para saúde humana; flavonóides, por exemplo, foram usados para inibir o desenvolvimento do tumor, impedir a perda óssea e prevenir a oxidação de lipídeos em animais e seres humanos. As plantas nas quais o tamanho da folha é aumentado, forneceríam provavelmente mais biomassa, o que seria especificamente valioso para colheitas nas quais a parte vegetativa da planta constitui o produto. As plantas com folhas brilhantes geralmente produzem mais cera epidérmica, que se pudesse ser aumentada, resultaria em uma aparência agradável para muitas plantas ornamentais, ajudaria a impedir o ressecamento e resistência aos insetos herbívoros e agentes causadores de doença. As alterações na planta ou
26/726 coloração de parte da planta, ressaltadas pela modificação, por exemplo, dos níveis de antocianina, produziram novos aspectos morfológicos.
[0048] Em muitos exemplos, as sementes de uma planta constituem uma colheita valiosa. Essas incluem, por exemplo, as sementes de muitos legumes, nozes e grãos. A descoberta de meios para produzir sementes maiores fornecería um valor significativo, trazendo um aumento no rendimento da colheita.
[0049] As plantas com inflorescência alterada, incluem, por exemplo, flores maiores ou configurações florais distintas, podem ter valor alto na indústria de horticultura ornamental.
[0050] As modificações na estrutura da flor podem ter efeitos vantajosos ou prejudiciais na fertilidade, e seriam usadas, por exemplo, para diminuir a fertilidade na ausência, redução ou classificação de componentes reprodutivos. Isso seria um traço desejável, que podería ser explorado para impedir ou minimizar o escape de pólen de organismos geneticamente modificados para o ambiente.
[0051] A manipulação dos padrões de ramificação de inflorescência pode também ser usada para influenciar o rendimento e oferecer potencial para técnicas de colheita mais eficazes. Por exemplo, uma mutação poda alta de tomate resulta em um determinado padrão de desenvolvimento
27/726 e facilita a colheita mecânica (Pnueli e outros (2001) Plant Cell 13(12): 2687-2702).
[0052] Alterações do domínio apical ou arquitetura da planta criariam novas variedades de planta. Plantas anãs podem ser de interesse em potencial para a indústria de horticultura ornamental.
Categoria: bioquímica da semente; traço desejado: óleo alterado na semente [0053] A composição das sementes, especificamente, com relação a quantidade de óleo da semente e/ou composição, é muito importante para o valor nutricional e produção de vários alimentos e produtos alimentícios. Aperfeiçoamentos desejáveis para os óleos incluem estabilidade melhorada ao aquecimento, qualidade nutricional aperfeiçoada, através, por exemplo, da redução do número de calorias na semente, aumento do número de calorias nos alimentos animais ou alteração da razão de lipídeos saturados a insaturados compreendendo os óleos. Categoria: bioquímica de semente; traço desejado: proteína de planta alterada [0054] Como com os óleos de semente, o teor de proteína da semente e composição são muito importantes para o valor nutricional e produção de vários alimentos e produtos alimentícios. O teor de proteína alterado ou concentração nas sementes pode se usado para prover
28/726 benefícios nutricionais e pode também prolongar a capacidade de armazenamento, aumentar resistência da semente as pestes ou doenças ou modificar razões de germinação. A composição de aminoácido alterada das sementes, através da composição de proteína alterada, é também um objetivo desejado para aperfeiçoamento nutricional.
Categoria: bioquímica da semente; traço desejado: lipídeos de prenila alterados [0055] Lipídeos de prenila, incluindo, os tocoferóis, desempenham um papel importante no ancoramento das proteínas nas membranas e organelas membranosas. Os tocoferóis possuem atividade antioxidante e vitamina E. A composição de tocoferol modificada das plantas pode assim ser útil no aperfeiçoamento da integridade e função da membrana, o que pode mitigar o estresse abiótico, tal como estresse por aquecimento. O aumento do teor de antioxidante e vitamina das plantas, através do aumento do teor de tocoferol aumentado pode prover benefícios de saúde para os seres humanos.
Categoria: bioquímica da folha; traço desejado: níveis de glicosinolato alterados [0056] Os aumentos ou diminuições nos glicosinolatos específicos ou teor de glicosinolato total podem ser desejáveis, dependendo da aplicação específica.
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Por exemplo: (i) glicosinolatos são componentes indesejáveis das sementes oleosas usados em alimentos para animais, uma vez que eles produzem efeitos tóxicos; variedades de glicosinolato inferiores de canola foram desenvolvidas para combater esse problema; (ii) alguns glicosinolatos possuem atividade anticâncer; assim o aumento dos níveis ou composição desses compostos pode ser de uso na produção dos nutracêuticos; e (iii) glicosinolatos fazem parte de uma defesa natural da planta contra insetos; a modificação da composição ou quantidade do glicosinolato poderia, portanto, fornecer proteção aumentada contra herbívoros. Adicionalmente, os promotores específicos de tecido podem ser usados em colheitas comestíveis para garantir que esses compostos acumulem-se especificamente nos tecidos particulares, tais como, epiderme, que não são retirados para consumo humano.
Categoria: bioquímica da folha; traço desejado: produção de flavonóides [0057] A expressão dos fatores de transcrição que aumentam a produção de flanovóides nas plantas, incluindo antocianinas e taninas condensadas, pode ser usada para alterar a produção de pigmentos para fins de horticultura, e possivelmente, para aumentar a resistência ao estresse. Os flavonóides possuem atividade antimicrobiana e seriam usados para projetar resistência contra agente patogênico.
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Vários compostos flavonóides possuem efeitos de promover a saúde humana, tais como, inibição de desenvolvimento de tumor, prevenção de perda óssea e prevenção de oxidação por lipideo. Níveis aumentados de taninas condensadas em legumes de forragem fornecerão benefícios agronômicos em ruminantes por prevenção de timpanite de pastagem por ruptura das espumas de proteína dentro do rúmen. Para uma revisão das utilidades dos flanovóides e seus derivados, vide Dixon e outros (1999) Trends Plant Sei. 4: 394-400.
[0058] A presente invenção se refere aos processos e composições para produção de plantas transgênicas com traços modificados, especificamente traços que direcionamse às necessidades agrícolas e de alimentos descritas na informação de histórico acima. Esses traços podem fornecer valor significativo, pelo que permitem que a planta floresça em ambientes hostis, onde, por exemplo, temperatura, água e disponibilidade de nutrientes ou salinidade podem limitar ou prevenir o desenvolvimento de plantas não transgênicas. Os traços podem também compreender alterações morfológicas desejáveis, tamanho maior ou menor, resistência a doença e a pragas, alterações no tempo de floração, resposta a luz e outros.
[0059] Nós identificamos polinucleotídeos codificando fatores de transcrição, desenvolvemos várias plantas transgênicas usando esses polinucleotídeos
31/726 analisamos as plantas quanto a uma variedade de traços importantes. Assim fazendo, nós identificamos sequências de polinucleotideo e polipeptideo para produzir de plantas e colheitas comercialmente valiosas, bem como, para processos para fabricação e uso das mesmas. Outros aspectos e concretizações da invenção são descritos a seguir e podem ser derivados dos ensinamentos dessa revelação como um todo.
Sumário da Invenção [0060] A presente invenção se refere às plantas transgênicas que compreendem um polinucleotideo recombinante que inclui uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição HAP3, semelhante a HAP3 ou HAP5 CCAAT, com a capacidade de regular a tolerância ao estresse abiótico em uma planta.
[0061] São providos plantas transgênicas e processos para produção das plantas transgênicas. As plantas transgênicas compreendem um polinucleotideo recombinante possuindo uma sequência de polinucleotideo ou uma sequência que é complementar a essa sequência de polinucleotideo, que codifica um fator de transcrição.
[0062] A presente invenção é dirigida às plantas transgênicas com expressão alterada de um polipeptideo de fator de transcrição. Quando essas plantas são comparadas às plantas não transgênicas ou plantas de controle do tipo
32/726 selvagem das mesmas espécies (isto é, aquelas que não possuem a expressão do polipeptideo de fator de transcrição alterada), as plantas transgênicas são mostradas como possuindo tolerância aumentada a uma variedade de abióticos de estresse. Esses podem incluir, por exemplo, tensão osmótica, estiagem, estresse ao sal, estresse ao calor ou estresse ao frio. Um número dimensionável de sequências de fator de transcrição, que podem ser encontradas na Listagem de Sequência, foi usado para conferir essas vantagens. Por exemplo, a planta transgênica pode compreender como parte de seu genoma, um transgene codificando um elemento polipeptideo da família do fator de transcrição de ligação da caixa CCAAT ou da família do fator de transcrição relacionado a MYB. A superexpressão desses elementos de polipeptideo, faz com que a planta torne-se controle do tipo selvagem mais tolerante ao estresse abiótico.
[0063] Em um refinamento adicional da invenção, o elemento polipeptideo pode ser da família de fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT, e, mais especificamente, da subclasse G482 da classe não semelhante a LEC1 das proteínas da família do fator de transcrição CCAAT relacionado a L1L. Esses polipeptídeos compreendem um domínio B (os domínios B são adicionalmente caracterizados no relatório descritivo que se segue, com exemplos de várias espécies de planta listados). Os domínios B desses
33/726 polipeptideos são capazes de ligar uma região reguladora de DNA compreendendo o motivo CCAAT, e essa ligação é responsável pela regulação da transcrição daquele DNA. Essa regulação de transcrição confere tolerância aumentada ao estresse abiótico na planta transgênica.
[0064] Alternativamente, o elemento de polipeptídeo pode ser um fator de transcrição relacionado a MYB e, mas especificamente, um elemento da subclasse G682 dos fatores de transcrição relacionados a MYB. Esses polipeptideos compreendem um domínio relacionado a MYB (domínios relacionados a MYB adicionalmente caracterizados no relatório descritivo que se segue, com exemplos das várias espécies de plantas listados). Os domínios relacionados a MYB desses polipeptideos são capazes de ligar uma região reguladora de DNA, e essa ligação é responsável pela regulação da transcrição daquele DNA. Semelhante à normalização da transcrição pelos fatores de transcrição da família de CCAAT, a tolerância ao estresse abiótico aumentada na planta transgênica é obtido por ligação do fator de transcrição relacionado a MYB ao DNA.
[0065] Em outra alternativa, o elemento de polipeptídeo pode ser um elemento de uma ampla variedade de famílias e grupos de fator de transcrição, exemplificado pelos polipeptideos de fator de transcrição da invenção que foram mostrados, conferindo vantagens úteis ou traços as
34/726 plantas quando a expressão desses polipeptideos é alterada nas plantas.
[0066] As plantas trasngênicas da invenção podem ser tanto dicotiledôneas quanto monocotiledôneas e as sequências de polinucleotideo e polipeptideo da invenção podem ser derivadas de plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas ou serem criações que são estrutural e funcionalmente semelhantes. As plantas transgênicas que definem a invenção podem ser cruzadas com outras plantas ou com elas mesmas para gerar plantas de progênie, que podem possuir características vantajosas, tais como, tolerância aperfeiçoada ao estresse. Sementes derivadas de plantas transgênicas da invenção são também englobadas dentro do escopo da invenção.
[0067] A invenção é também dirigida aos processos para produção de uma planta transgênica possuindo tolerância aumentada ao estresse abiótico por introdução de um vetor de expressão que contém uma sequência de polinucleotideo codificando um polipeptideo da invenção na planta.
[0068] 0 polipeptideo pode compreender, por
exemplo, um elemento da subclasse G482 da classe não
semelhante a LEC1 das proteínas da família do fator de
transcrição CCAAT relacionado a L1L, ou um elemento da
subclasse G682 dos fatores de transcrição relacionados a
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MYB, ou um elemento de qualquer uma das famílias do fator de transcrição ou grupos da invenção que tenham sido mostrados para prover traços úteis nas plantas quando sua expressão é alterada. No caso onde o polipeptídeo compreende um elemento da subclasse G482, o polipeptídeo compreenderá um domínio B que possui homologia suficiente ao domínio B da G481, SEQ ID N°: 88, de modo que o domínio B funciona da mesma maneira que o domínio G481 por ligação ao DNA em uma região de regulação de transcrição compreendendo o motivo CCAAT, assim regulando a transcrição do DNA e conferindo tolerância aumentada ao estresse abiótico à planta transgênica, quando comparada às plantas não transgênicas da mesma espécie.
[0069] Alternativamente, o vetor de expressão pode também conter uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da subclasse G682 dos fatores de transcrição relacionados a MYB, o domínio relacionado a MYB do domínio relacionado a MYB liga-se ao DNA em uma região de regulação de transcrição e traz a tolerância ao estresse abiótico e transcricional na planta transgênica.
[0070] Independente da sequência de nucleotideo usada, o vetor de expressão também conterá um ou mais elementos reguladores operavelmente ligados à sequência de nucleotideo. É através dos elementos reguladores que a expressão da sequência de nucleotideo é controlada em uma
36/726 planta alvo. Introduzindo-se o vetor de expressão dentro de uma célula da planta alvo, o desenvolvimento da célula de planta em uma planta e deixando que a planta superexpresse o polipeptídeo, é gerada uma planta com tolerância ao estresse abiótico aperfeiçoada (em relação, por exemplo, aos controles do tipo selvagem). As plantas aperfeiçoadas podem ser identificadas por comparação com uma ou mais plantas de controle.
[0071] Qualquer planta com tolerância ao estresse aumentada por esse processo pode ser cruzada consigo mesma ou com outra planta. A semente que desenvolve-se como resultado desse cruzamento pode então ser selecionada, e uma progênie da planta desenvolve-se da semente. Isso teria o efeito de produzir uma planta de progênie transgênica que teria tolerância aumentada ao estresse abiótico, quando comparada a uma planta não transgênica da mesma espécie.
[0072] A invenção também se refere a um processo
para aumentar a tolerância da planta ao estresse abiótico
por provisão de um vetor compreendendo um nucleotídeo da
invenção ou um nucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção e elementos reguladores operavelmente ligados à sequência do nucleotídeo. Esses elementos reguladores são capazes de controlar a expressão da sequência de nucleotídeo em uma planta alvo. A planta alvo é transformada com o vetor para gerar uma planta transformada
37/726 com tolerância aumentada ao estresse abiótico, em comparação as plantas não transgênicas da mesma espécie. As sequências usadas nesse processo podem incluir, por exemplo, elementos de polinucleotídeo ou polipeptídeos da subclasse G482 da classe não semelhante a LEC1 das proteínas da família do fator de transcrição CCAAT relacionado cc L1L, ou da subclasse G682 dos fatores de transcrição relacionados a MYB. No caso de cada um desses exemplos, o domínio conservado que é, o domínio B ou não relacionado a MYB, seria suficientemente homólogo aos domínios correspondentes da SEQ ID N°: 88 ou 148, G481 ou G682, respectivamente, que o domínio conservado liga-se ao DNA em uma região de regulação de transcrição e assim regula a transcrição e aumenta a tolerância ao estresse abiótico na planta, quando comparado a uma planta não transformada ou transgênica da mesma espécie.
Breve Descrição da Listagem de Sequências e Desenhos [0073] A Listagem de Sequências provê sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo da invenção. Os traços associados ao uso das sequências estão incluídos nos Exemplos.
[0074] CD-ROM1 (Cópia 1) é um disco compacto regravável para computador apenas com memória de leitura e contém uma cópia da Listagem de Sequência em um formato de teste ASCII. A Listagem de Sequência é denominada
38/726
MBl0047PCT.ST25.txt e possui 6.312 kb de tamanho. As cópias da Listagem de Sequências no disco CD-ROM são incorporadas aqui como referência em sua totalidade.
[0075] CD-ROM2 (Cópia 2) é uma cópia exata do CD-R1 (Cópia 1).
[0076] CD-ROM3 contém uma cópia em formato que pode ser lido por computador (CRF) da Listagem de Sequências como um arquivo de texto (.txt).
[0077] A Figura 1 mostra uma estimativa conservadora das relações filogenéticas entre as ordens de plantas de floração (modificadas do Angiosperm Phylogeny Group (1998) Ann. Missouri Bot. Gard. 84: 1-49).
[0078] Aquelas plantas com um cotilédone simples (monocotos) são uma classe monoflética aninhada dentro de pelo menos duas linhagens maiores de dicotos; os eudicotos são adicionalmente divididos em rosidos e asteridos. Arabidopsis é um eudicoto rosidio classificado dentro da ordem da Brassicales; o arroz é um elemento da ordem de mococoto Poales. A Figura 1 foi adaptada de Daly e outros (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333.
[0079] A Figura 2 mostra um dendograma filogênico ilustrando relações filogenéticas de taxa de planta superior, incluindo classes contendo tomates e Arabidopsis; adaptados de Ku e outros (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 9121-9126; e Chase e outros (1993) Ann. Missouri Bot. Gard.
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80: 528-580.
[0080] As Figuras 3A, e 3B mostram um alinhamento de G682 (SEQ ID N°: 148) e sequências de polinucleotideo que são parálogas e ortólogas a G682. O alinhamento foi produzido usando o software MACVECTOR (Accelrys, Inc., San Diego, CA).
[0081] As Figuras 4A, 4B, 4C e 4D mostram um alinhamento de G867 (SEQ ID N°: 170) e sequências de polinucleotideo que são parólogas e ortólogas a G867. O alinhamento foi produzido usando um software MACVECTOR (Accelrys, Inc.).
[0082] As Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E e 5F mostram um alinhamento de G912 (SEQ ID N°: 186) e sequências de polinucleotideo que são parálogas e ortólogas a G912. O alinhamento foi produzido usando um software MACVECTOR (Accelrys, Inc.).
[0083] A Figura 6 foi adaptada de Kwong e outros (2003) Plant Cell 15: 5-18, e mostra sequências de colheita identificadas através de análise BLAST de várias sequências relacionadas a L1L. Uma árvore de filogênie foi então gerada usando ClustalX com base nas sequências de proteína total mostrando a classe HAP3 não semelhante a LEC1 dos fatores de transcrição (caixa grande). Essa classe contém sequências de Arabidopsis, bem como elementos de diversas espécies que são filogeneticamente distintas das proteínas
40/726 semelhantes a LEC1 (vide as próximas duas figuras). A caixa menor delineia a subclasse semelhante a G482, contendo fatores de transcrição que estão estruturalmente mais proximamente relacionados ao G481 e G482.
[0084] Semelhante à Figura 6, a Figura 7 mostra a relação filogênica das sequências dentro da subclasse G482 (dentro da caixa menor) e a subclasse não semelhante a LEC1 (caixa grande). A subclasse G482 contém elementos de diversas espécies, incluindo Arabidopsis, soja, arroz e sequências do milho que são filogeneticamente distintas das proteínas semelhantes a LEC1, algumas das quais são também mostradas na Figura 6. As plantas de Arabidopsis transportam uma mutação nos embriões que mostram o gene LEC1 que são intolerantes à dissecação e que mostram defeitos na maturação da semente (Lotan e outros (1998) Cell 93: 1195-1205) . Nós mostramos que os elementos da subclasse G482 conferem tolerância ao estresse abiótico. Dada sua divergência filogenética, é possível que as proteínas semelhantes a LEC1 vistas abaixo da subclasse G482 tenham evoluído para conferir tolerância a dissecação especificamente dentro do embrião, considerando-se que a outra subclasse G482 evoluiu para conferir tolerância ao estresse abiótico nos tecidos não embriônicos.
[0085] Para a Figura 8, foi gerada uma relação filogênica de sequências dentro da subclasse G482 com
41/726 processo diferente daquele usado para criar a Figura 7. Nesse caso, a árvore filogenética e alinhamentos de sequência múltipla de G481 e proteínas de comprimento pleno relacionadas foram construídas usando ClustalW (CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program version 1.83, 2003) e software MEGA2 (http://www.megasoftware.net). Os parâmetros de alinhamento múltiplos de ClustalW foram:
Penalidade de abertura de fenda :10,00
Penalidade de extensão de fenda :0,20
Sequências divergentes de retardo:30%
Peso das transições de DNA:0,50
Matriz de peso da proteína: série Gonnet
Matriz de peso de DNA:IUB
Matriz negativa de uso:OFF.
[0086] Um alinhamento formatado FastA foi então usado para gerar uma árvore filogenética em MEGA2 usando o algoritmo de ligação vizinho e um modelo de distância p. Um teste de filogênie foi realizado através de bootstrap com 100 replicações e conjunto de Velocidade Aleatória ajustado para default. Os valores de corte da árvore de bootstrap foram ajustados para 50%. A subclasse G482 da classe não semelhante a LEC1 de proteínas da família do fator de transcrição CCAAT relacionado a L1L (caixa), é derivada de um nodo simples comum (seta) e um número representativo incluindo sequências de Arabidopsis G481, G482, G485, G1364
42/726 e G2345, sequências de soja G3470, G3471, G3472, G3475, G3476, sequências de arroz G3395, G3397, G3398, G3429, e sequências de milho G3434, e G3436, foram mostradas para conferir tolerância ao estresse abiótico em plantas (vide Exemplo XIII).
[0087] A Figura 9 mostra a estrutura de domínio das proteínas HAP3. As proteínas HPA3 contêm um domínio amino terminal A, um domínio B central e um domínio C terminal carbóxi nos domínios A e C. Os domínios A e C poderíam assim prover um grau de especificidade a cada elemento da família HPA3. O domínio B é a região conservada que especifica a ligação de DNA e associação de subunidade.
[0088] Nas Figuras 10A-10F, são apresentados os alinhamentos dos polipeptídeos HAP3 incluindo G481, G482, G485, G1364, G2345, G1781 e sequências correlatas de Arabidopsis alinhadas com sequências de soja, arroz e milho, mostrando os domínios B (indicados pela linha que atravessa as Figuras 10B a 10D). Os resíduos de consenso dentro das sequências listadas são indicados por negrito. Os resíduos negritados na sequência de consenso que aparece na parte inferior das Figuras 10A a 10C em suas respectivas posições, são igualmente encontrados na classe não semelhante a LEC1. O resíduo de resina subjacente aparecendo na sequência de consenso em suas respectivas posições é unicamente encontrado dentro da subclasse
43/726 semelhante a G482. Conforme discutido em maiores detalhes abaixo no Exemplo III, as posições de resíduo indicadas pelas setas na Figura 10B estão associadas a alteração do tempo de floração quando esses polipeptídeos são superexpressos.
[0089] A Figura 11 é uma árvore filogenética de domínios conservados definidos de G682 e polipeptídeos correlatos construídos com ClustalW (CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program version 1.83, 2003) e software MEGA2 (http://www.megasoftware.net). Os parâmetros de alinhamento múltiplo de ClustalW foram como se segue:
Penalidade de abertura de fenda:10,00
Penalidade de extensão de fenda:0,20
Sequências divergentes de retardo:30%
Peso das transições de DNA :0,50
Matriz de peso da proteína: série Gonnet
Matriz de peso de DNA:IUB
Matriz negativa de uso:OFF.
[0090] Um alinhamento formatado FastA foi então usado para gerar uma árvore filogenética em MEGA2 usando o algoritmo de ligação vizinho e um modelo de distância p. Um teste de filogênie foi realizado através de bootstrap com 100 replicações e conjunto de Velocidade Aleatória ajustado para default. Os valores de corte da árvore de bootstrap foram ajustados para 50%. A subclasse G482 da classe não
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semelhante a LEC1 de proteínas da família do fator de
transcrição CCAAT relacionado a L1L (caixa), é derivada de
um nodo simples comum (seta), aparece dentro da caixa na
Figura 11.
[0091] As Figuras 12A-12D mostram os efeitos de privação de água e recuperação desse tratamento no controle de Arabidopsis e linhas de superexpressão 35S::G481. Após oito dias de tratamento de plantas superexpressando tratamento para estiagem tinham um verde mais escuro e menos aparência murcha (figura 12C) do que aquelas no grupo de controle (figura 12A) . As diferenças na aparência entre o controle e as plantas superexpressando G481 após elas terem sido novamente molhadas foi mesmo mais surpreendente. A maioria (11 das 12 plantas, exemplificadas na Figura 12B) desse conjunto de plantas de controle morreram antes de serem novamente molhadas, indicando a incapacidade de recuperar-se após privação severa de água, considerando-se que todas as nove plantas superexpressadoras da linhagem mostraram recuperação do tratamento de estiagem (exemplificado na Figura 12D). Os resultados mostrados nas Figuras 12A-12D eram típicos de um número de controle e linhas de superexpressão 35S::G481.
[0092] As Figuras 13A e 13B mostram os efeitos do estresse ao sal na germinação da semente de Arabidopsis. As três linhagens superexpressadoras G481- e G482 nessas duas
45/726 placas tinham raízes mais longas e mostraram maior expansão do cotiledôneo (setas) após três dias em 150 mM de NaCl que as sementeiras de controle nos lados direitos das placas.
[0093] Na Figura 14A, sementeiras mutantes nulas G481 (rotuladas K481) mostraram tolerância reduzida ao estresse abiótico, em relação às sementeiras de controle na Figura 14B, conforme evidenciado pela expansão de cotiledôneo reduzida e desenvolvimento da raiz no primeiro grupo. Sem tolerância de estresse ao sal no meio de controle (figuras 14C, mutantes nulos G481; e 14D, sementeiras de controle), as plantas de controle e as nocauteadas parecem as mesmas.
[0094] As Figuras 15A-15D mostram os efeitos dos tratamentos relacionados ao estresse em sementeiras superexpressando G485 (linhagens 35S::G485) em ensaios de placa. Em cada tratamento, incluindo ensaios ao frio, sacarose alta, sal alto e germinação de ABA, os superexpressadores passaram muito melhor do que os controles do tipo selvagem expostos aos mesmos tratamentos nas Figuras 15E-15H, respectivamente, conforme evidenciado pela expansão do cotilédone e desenvolvimento de raiz observado com as sementeiras de superexpressão.
[0095] As Figuras 16A - 16C ilustram os efeitos do nocauteamento de G485 e superexpressão na época de floração e maturação. Conforme visto na Figura 16A, uma mutação de
46/726 nocauteamento de inserção de T-DNA contendo uma inserção SALK_062245 mostrou florescer vários dias após as plantas de controle do tipo selvagem. As plantas na Figura 16A são mostradas 44 dias após a germinação. A Figura 16C mostra que os transformadores primários G485 floresceram distintivamente mais cedo que os controles do tipo selvagem. Essas plantas são mostradas 24 dias após germinação. Esses efeitos foram observados em cada um dos dois plantios de TI independentes, derivados de datas de transformação separadas. Adicionalmente, o florescimento acelerado foi também visto nas plantas que superexpressaram G485 de um sistema de dois componentes (35S::LexA;opLexA::G485). Esses estudos indicaram que G485 é suficiente para atuar como ativador floral e também necessário naquele papel dentro da planta. As plantas superexpressadoras de G485 também amadureceram e estabeleceram silíquas muito mais rapidamente que os controles do tipo selvagem, conforme mostrado na Figura 16B com plantas 39 dias após pós-germinação.
[0096] A Figura 17A mostra os efeitos de um meio de sal alto na germinação de 35S::G3392 (um ortólogo de arroz G682) linhagem 322. Nessa figura, as sementeiras pareceram maiores e mais verdes que as sementeiras de Arabidopsis do tipo selvagem tratadas de modo semelhante na Figura 17B.
[0097] A Figura 18A mostra os efeitos do tratamento
47/726 de resfriamento na germinação da linhagem 307 35S::G3450 (soja G682 ortóloga). Nessa figura, as sementeiras tinham menos antocianina que as sementeiras de Arabidopsis similarmente tratadas na Figura 18B.
[0098] A Figura 19A compara a germinação da linhagem 327 35S::G3431 (um milho G682 ortólogo) de sementeiras de Arabidopsis em uma placa de germinação de sacarose 9,4% com sementeiras de controle não transgênicas das mesmas espécies, tratadas de modo semelhante na Figura 19B. Os superexpressores eram mais verdes e tinham menos antocianina que as plantas de controle não transgênicas das mesmas espécies.
[0099] Na Figura 20, os efeitos prejudiciais de um tratamento térmico conforme visto nas plantas do tipo selvagem à direita e a uma extensão muito menor nas plantas superexpressando a sequência de soja G3450 à esquerda. Descrição Detalhada das Concretizações Exemplares [0100] Em um aspecto importante, a presente invenção se refere aos polinucleotideos e polipeptideos, por exemplo, para modificação de fenótipos das plantas. Através de toda essa revelação, várias fontes de informação são referidas e/ou são especificamente incorporadas. As fontes de informação incluem artigos em jornais científicos, documentos de patente, livros didáticos e endereços de páginas inativas de World Wide Web browser,
48/726 por exemplo. Embora a referência a essas fontes de informação indique claramente que elas podem ser usadas por um versado na técnica, cada e todas as fontes de informação citadas aqui são especificamente incorporadas em sua totalidade, se ou não uma menção especifica de incorporação como referência for feita. 0 conteúdo e os ensinamentos de cada uma e todas as fontes de informação têm crédito e são usados para constituir e usar concretizações da invenção.
[0101] Conforme usado aqui e nas reivindicações apensas, as formas singulares um, uma e o, a incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a uma planta inclui várias tais plantas, e uma referência ao estresse é uma referência a um ou mais estresses e equivalentes do mesmo, conhecidos pelos versados na arte e assim por diante.
[0102] As sequências de polinucleotídeo da invenção codificam polipeptídeos que são elementos de famílias de fatores de transcrição bem conhecidas, incluindo famílias de fatores de transcrição de planta, conforme revelado nas Tabelas 7-11. Geralmente, os fatores de transcrição codificados pelas presentes sequências estão envolvidos no metabolismo celular, diferenciação e proliferação da célula e regulação do crescimento. Consequentemente, um versado na
49/726 técnica reconhecería que, por expressão das presentes sequências em uma planta, pode-se alterar a expressão dos genes autólogos ou induzir a expressão dos genes introduzidos. Afetando-se a expressão das sequências autólogas similares em uma planta que possui atividade biológica das presentes sequências, ou por introdução das presentes sequências em uma planta, pode-se alterar um fenótipo de planta para um com traços aperfeiçoados. As sequências da invenção podem também ser usadas para transformar uma planta e introduzir traços desejáveis não encontrados nos cultivos ou cepas do tipo selvagem. As plantas podem então ser selecionadas para aquelas que produzem o grau mais desejado de super ou infra-expressão de genes alvo de interesse e aperfeiçoamento do traço coincidente.
[0103] As sequências da presente invenção podem ser de qualquer espécie, especificamente espécies de plantas, em uma forma ocorrendo naturalmente ou de qualquer fonte natural, sintética, semi-sintética ou recombinante. As sequências da invenção podem também incluir fragmentos das presentes sequências de aminoácido. Nesse contexto, um fragmento se refere a um fragmento de uma sequência de polipeptideo que possui pelo menos 5 a cerca de 15 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 14 aminoácidos e que retém alguma atividade biológica de um
50/726 fator de transcrição. Onde sequência de aminoácido é citada como referindo a uma sequência de aminoácido de uma molécula de proteína ocorrendo naturalmente, sequência de aminoácido e termos semelhantes não devem limitar a sequência de aminoácido a uma sequência de aminoácido nativa completa, associada à molécula de proteína citada.
[0104] Como um versado na técnica reconhecería, os fatores de transcrição podem ser identificados pela presença de uma região ou domínio de similaridade ou identidade estrutural em relação a sequência de consenso específica ou a presença de um sítio de ligação de DNA de consenso específico ou motivo de sítio de ligação de DNA (vide, por exemplo, Riechmann e outros (2000) Science 290:2105-2110). Os fatores de transcrição de planta podem pertencer a uma das famílias de fator de transcrição que se seguem: a família do fator de transcrição de domínio AP2 (APETALA2) (Riechmann and Meyerowitz (1998) Biol. Chem. 379: 633-646); a família do fator de transcrição MYB (ENBib; Martin and Paz-Ares (1997) Trends Genet. 13: 6773); a família do fator de transcrição de domínio MADS (Riechmann and Meyerowitz (1997) Biol. Chem. 378: 10791101); a família da proteína WRKY (Ishiguro and Nakamura (1994) Mol. Gen. Genet. 244: 563-571); a família da proteína de repetição ancirina (Zhang e outros (1992) Plant Cell 4: 1575-1588); a família (Z) da proteína dedo de zinco
51/726 (Klug and Schwabe (1995) FASEB J. 9: 597-604); Takatsuji (1998) Cell. Mol. Life Sei. 54:582-596); a família da proteína homeoboxe (HB) (Buerglin (1994) em Guidebook to the Homeobox Genes, Duboule (ed.) Oxford University Press); as proteínas de ligação do elemento CAAT (Forsburg and Guarente (1989) Genes Dev. 3: 1166-1178); as proteínas de ligação escamosas do promotor (SPB) (Klein e outros (1996) Mol. Gen. Genet. 1996 250: 7-16); a família da proteína ΝΆΜ (Souer e outros (1996) Cell 85: 159-170); as proteínas
IAA/AUX (Abel e outros (1995) J. Mol. Biol. 251: 533-549); a família da proteína HLH/MYC (Littlewood e outros (1994) Prot. Profile 1: 639-709); a família da proteína de ligação de DNA (DBP) (Tucker e outros (1994) EMBO J. 13: 29943002); a família bZIP dos fatores de transcrição (Foster e outros (1994) FASEB J. 8: 192-200); família da proteína de ligação da Caixa P (the BPF-1) (da Costa e Silva e outros (1993) Plant J. 4: 125-135); a família do grupo de alta mobilidade (HMG) (Bustin and Reeves (1996) Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 54: 35-100); a família scarecrow (SCR) (Di Laurenzio e outros (1996) Cell 86: 423-433); a família GF14 (Wu e outros (1997) Plant Physiol. 114: 14211431); a família polycomb (PCOMB) (Goodrich e outros (1997) Nature 386: 44-51); a família ramificada de teosinto (TEO) (Luo e outros (1996) Nature 383: 794-799); a família ABI3 (Giraudat e outros (1992) Plant Cell 4: 1251-1261); a
52/726 família de hélice tripla (TH) (Dehesh e outros (1990) Science 250: 1397-1399); a família EIL (Chao e outros (1997) Cell 89: 1133-44); a família AT-HOOK (Reeves and Nissen (1990) J. Biol. Chem. 265: 8573-8582); a família S1FA (Zhou e outros (1995) Nucleic Acids Res. 23: 11651169); a família bZIPT2 (Lu and Feri (1995) Plant Physiol. 109: 723); a família YABBY (Bowman e outros (1999) Development 126: 2387-96); a família PAZ (Bohmert e outros (1998) EMBO J. 17: 170-80); uma família de fatores de transcrição diversos incluindo a família DPBF (Kim e outros (1997) Plant J. 11: 1237-1251) e a família SPF1 (Ishiguro and Nakamura (1994) Mol. Gen. Genet. 244: 563-571); a família GARP (Hall e outros (1998) Plant Cell 10: 925-936), a família TUBBY (Boggin e outros (1999) Science 286 : 21192125), a família de choque térmico (Wu (1995) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11: 441-469), a família ENBP (Christiansen e outros (1996) Plant Mol. Biol. 32: 809-821), a família de dedo de zinco (Jensen e outros (1998/ FEBS Letters 436: 283-287), a família PDBP (Janik e outros (1989) Virology 168: 320-329), a família PCF (Cubas e outros Plant J.
(1999) 18: 215-22), a família SRS (relacionada a SHI) (Fridborg e outros (1999) Plant Cell 11: 1019-1032), a família CPP (semelhante a polycomb rico em cisteína) (Cvitanich e outros (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 81638168), a família ARF (fator de resposta de auxina) (Ulmasov
53/726 e outros (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. 96: 5844-5849), a família SWI/SNF (Collingwood e outros (1999) J. Mol. Endocrinol. 23: 255-275), a família ACBF (Seguin e outros (1997) Plant Mol. Biol. 35: 281-291), a família PCGL (semelhante a CG-1) (da Costa e Silva e outros (1994) Plant Mol. Biol. 25: 921-924) a família ARID (Vazquez e outros (1999) Development 126: 733-742), a família Jumonji (Balciunas e outros (2000), Trends Biochem. Sei. 25: 274276), a família bZIP-NIN (Schauser e outros (1999) Nature 402: 191-195), a família E2F (Kaelin e outros (1992) Cell 70: 351-364) e a família semelhante a GRF (Knaap e outros (2000) Plant Physiol. 122: 695-704). Conforme indicado por qualquer parte da lista acima e conforme conhecido na técnica, os fatores de transcrição foram, algumas vezes, categorizados por classes, família e subfamília, de acordo com seu teor estrutural e motivo de sítio de ligação de DNA de consenso, por exemplo. Muitas das classes e muitas das famílias e sufamílias são listadas acima. Contudo, a inclusão de uma subfamília e não outra, ou a inclusão de uma família e não a outra, não significa que a invenção não englobe polinucleotídeos ou polipeptídeos de uma determinada família ou subfamília. A lista provida aqui é meramente um exemplo dos tipos de fatores de transcrição e do conhecimento disponível concernente às sequências de consenso e motivos de sítio de ligação de DNA que ajudam a
54/726 definir as mesmas como conhecidas de um versado na técnica (cada uma das referências citadas acima é especificamente incorporada aqui como referência). Um fator de transcrição pode incluir, porém não está limitado, a qualquer polipeptídeo que pode ativar ou reprimir a transcrição de um gene simples ou vários genes. 0 grupo polipeptídeo inclui, porém não está limitado às proteínas de ligação de DNA, proteínas de ligação de proteína de ligação de DNA, proteínoquinases, proteínofosfatase, protreínometiltransferases, proteínas de ligação de GTP, receptores e semelhantes.
[0105] Além dos processos para modificar um fenótipo de planta por emprego de um ou mais polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção descrita aqui, os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção possuem uma variedade de usos adicionais. Esses usos incluem seu emprego na produção recombinante (isto é, expressão) das proteínas; como reguladores da expressão genética da planta, como sondas de diagnóstico quanto a presença de ácidos nucleicos complementares ou parcialmente complementares (incluindo a detecção de ácidos nucleicos de codificação naturais); como substratos para reações adicionais, por exemplo, reações de mutação, reações de PCR ou semelhantes; como substratos para clonagem, por exemplo, incluindo reações de digestão ou ligação e para
55/726 identificação de moduladores exógenos ou endógenos dos fatores de transcrição. Um polinucleotideo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo vários nucleotídeos polimerizados, por exemplo, pelo menos 15 nucleotídeos polimerizados consecutivos, opcionalmente pelo menos 30 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 50 nucleotídeos consecutivos. Um polinucleotideo pode ser um ácido nucleico, oligonucleotídeo, nucleotídeo ou qualquer fragmento do mesmo. Em muitos exemplos, um polinucleotideo compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptideo (ou proteína) ou um domínio ou fragmento da mesma. Em muitos exemplos, um polinucleotideo compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptideo (ou proteína) ou um domínio ou fragmento do mesmo.
Adicionalmente, o polinucleotideo pode compreender um promotor, um intron, uma região melhoradora, um sítio de poliadenilação, um sítio de iniciação de tradução, regiões 5' ou 3' não traduzidas, um gene repórter, um marcador selecionável ou semelhante. O polinucleotideo pode ser DNA ou RNA de filamento simples ou duplo. O polinucleotideo compreende, opcionalmente, bases modificadas ou um esqueleto modificado. 0 polinucleotideo pode ser, por exemplo, DNA ou RNA genômico, uma transcrição (tal como um mRNA) , um cDNA, um produto de PCR, um DNA clonado, um DNA ou RNA sintético ou semelhantes. O polinucleotideo pode ser
56/726 combinado com carboidrato, lipideos, proteína ou outros materiais para realizar uma atividade específica, tal como transformação ou formação de uma composição útil, tal como um ácido nucleico de peptídeo (PNA). 0 polinucleotídeo pode compreender uma sequência em cada uma das orientações sentido ou anti-sentido. Oligonucleotideo é substancialmente equivalente aos termos amplimer, iniciador, oligômero, elemento, alvo e sonda e é preferivelmente de filamento simples.
Definições [0106] Um polinucleotídeo recombinante é um polinucleotídeo que não está em seu estado nativo, por exemplo, o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo não encontrada na natureza, ou o polinucleotídeo está em um contexto que não aquele onde ele é naturalmente encontrado, por exemplo, separado das sequências de nucleotídeo com as quais está tipicamente em proximidade na natureza ou sequências de nucleotídeo adjacentes (ou contíguas) com as quais ele não está tipicamente em proximidade. Por exemplo, a sequência em questão pode ser clonada dentro de um vetor, ou de outra forma, recombinada com um ou mais ácido nucleico adicional.
[0107] Um polinucleotídeo isolado é um polinucleotídeo que ocorre naturalmente ou recombinante, que está presente fora da célula na qual ele tipicamente é
57/726 encontrado na natureza, se purificado ou não. Opcionalmente, um polinucleotideo isolado está sujeito a um ou mais procedimentos de purificação, por exemplo, lise de célula, extração, centrifugação, precipitação ou semelhante.
[0108] Um polipeptídeo é uma sequência de aminoácido compreendendo vários resíduos de aminoácido polimerizados consecutivos, por exemplo, pelo menos 15 resíduos de aminoácido polimerizados, consecutivos, opcionalmente, pelo menos cerca de 30 resíduos de aminoácido polimerizados, consecutivos, pelo menos cerca de 50 resíduos de aminoácido polimerizados, consecutivos. Em muitos exemplos, um polipeptídeo compreende uma sequência de resíduo de aminoácido polimerizado que é um fator de transcrição ou um domínio ou porção ou fragmento do mesmo. Um fator de transcrição pode regular a expressão genética e pode aumentar ou diminuir a expressão genética em uma planta. Adicionalmente, o polipeptídeo pode compreender 1) um domínio de localização, 2) um domínio de ativação, 3) um domínio de repressão, 4) um domínio de oligomerização ou 5) um domínio de ligação de DNA ou semelhante. O polipeptídeo compreende, opcionalmente, resíduos de aminoácido modificados, resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente não codificados por um códon, resíduos de aminoácido não ocorrendo naturalmente.
58/726 [0109] Um polipeptídeo recombinante é um polipeptídeo produzido por tradução de um polinucleotideo recombinante. Um polipeptídeo sintético é um polipeptídeo criado por polimerização consecutiva de resíduos de aminoácido isolados usando os processos bem conhecidos na arte. Um polipeptídeo isolado se ocorrendo naturalmente ou um polipeptídeo recombinante é mais enriquecido em (ou fora) de uma célula que o polipeptídeo em seu estado natural em uma célula do tipo selvagem, por exemplo, mais que cerca de 5% de enriquecimento, mais que cerca de 10% de enriquecimento ou mais que cerca de 20%, ou mais que cerca de 50% ou mais de enriquecimento, isto é, indicado alternadamente: 105%, 110%, 120%, 150% ou mais, enriquecido com relação a um tipo selvagem padronizado 100%. Tal enriquecimento não é o resultado de uma resposta natural de uma planta do tipo selvagem. Alternativa ou adicionalmente, o polipeptídeo isolado é separado de outros componentes celulares com os quais ele é tipicamente associado, por exemplo, por qualquer um dos vários processos de purificação de proteína.
[0110] Identidade ou similaridade se refere à similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotideo ou entre duas sequências de polipeptídeo, com a identidade sendo uma comparação mais estrita. As frases porcentagem de identidade e % de identidade se
59/726 referem à porcentagem de similaridade da sequência encontrada na comparação de duas ou mais sequências de polipeptideo. Similaridade de sequência se refere à porcentagem de similaridade na sequência de par de base (conforme determinado por qualquer processo apropriado) entre duas ou mais sequências de polinucleotideo. Duas ou mais sequências podem ter, em qualquer lugar, 0-100% de similaridade ou qualquer valor inteiro entre isso. A
identidade ou similaridade podem ser determinadas por
comparação da posição em cada sequência que pode ser
alinhada para fins de comparação. Quando a posição na
sequência comparada é ocupada pela mesma base de
nucleotideo ou aminoácido, então as moléculas são idênticas naquela posição. Um grau de similaridade ou identidade entre as sequências de polinucleotideo é uma função do número de nucleotideos idênticos ou de combinação nas posições compartilhadas pelas sequências de polinucleotideo. Um grau de identidade das sequências de polipeptideo é uma função do número de aminoácidos idênticos nas posições compartilhadas pelas sequências de polipeptideo. Um grau de homologia ou similaridade das sequências de polipeptideo é uma função do número de aminoácidos nas posições compartilhadas pelas sequências de polipeptideo.
[0111] Alinhamento se refere ao número de
60/726 sequências de DNA ou aminoácidos alinhadas comparando-se pelo comprimento, de modo que os componentes em comum (isto é, bases de nucleotídeo ou resíduos de aminoácido) podem ser visual e prontamente identificados. A fração ou porcentagem dos componentes em comum está relacionada à homologia ou identidade entre as sequências. Os alinhamentos, tais como aqueles das Figuras 3A e B, 4A-D, 5A-F e 9A-F podem ser usados para identificar domínios conservados e relação com esses domínios. Um alinhamento pode ser determinado, apropriadamente, pelo número de programas conhecidos na arte, tais como, software MACVETOR (1999) (Accelrys, Inc., San Diego, CA).
[0112] Os termos altamente estringente ou condição altamente estringente se refere às condições que permitem a hibridização dos filamentos de DNA, cujas sequências são altamente complementares, onde essas mesmas condições excluem hibridização de DNAs significativamente não combinados. As sequências de polinucleotídeo capazes de hibridizar sob condições estringentes com os polinucleotídeos da presente invenção podem ser, por exemplo, variantes de sequências de polinucleotídeo reveladas, incluindo variantes alélicas ou de fixação, ou sequências que codificam ortólogos ou parálogos de polipeptídeos presentemente revelados. Os processos de hibridização de ácido nucleico são revelados em detalhes
61/726 por Kashima e outros (1985) Nature 313:402-404, e Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y (Sambrook); e por Haymes e outros, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985), as citações sendo incorporadas aqui como referências.
[0113] Em geral, a estringência é determinada pela temperatura, resistência iônica e concentração de agentes de desnaturação, (por exemplo, formamida) usados em um procedimento de hibridização e lavagem (para uma descrição mais detalhada da estringência de estabelecimento e determinação, vide abaixo) . O grau ao qual dos ácidos nucleicos hibridizam sob várias condições de estringência está correlacionado à extensão de sua similaridade. Assim, sequências de ácido nucleico semelhantes para uma variedade de fontes, tais como, dentro de um genoma de planta (como no caso dos parálogos) ou de outra planta (como no caso dos ortólogos) que podem realizar funções semelhantes podem ser isoladas com base em sua capacidade de hibridizar com sequências de fator de transcrição conhecidas. Muitas variações são possíveis nas condições e meios pelos quais a hibridização do ácido nucleico pode ser realizada para isolar as sequências de fator de transcrição possuindo similaridade em relação às sequências de fator de
62/726 transcrição conhecidas na técnica e não estão limitadas àquelas explicitamente reveladas aqui. Tal abordagem pode ser usada para isolar sequências de polinucleotídeo possuindo vários graus de similaridade com as sequências de fator de transcrição reveladas, tais como, por exemplo, fatores de transcrição possuindo 60% de identidade, ou mais preferivelmente, superiores a cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente 72% ou mais de identidade com os fatores de transcrição revelados.
[0114] O termo equivalente descreve elementos de um conjunto de proteínas homólogas que são conservadas com relação à função, desde seu último ancestral comum. Proteínas correlatas são agrupadas em famílias equivalentes, e de outra forma nas famílias de proteínas com outros tipos de homologia hierarquicamente definidos. Essa definição é provida no Institute for Genomic Research (TIGR) website, www.tigr.org; Terms associated with TIGRFAMs.
[0115] O termo variante, conforme usado aqui, pode se referir aos polinucleotídeos ou polipeptídeos que diferem dos polinucleotídeos ou polipeptídeos presentemente revelados, respectivamente, na sequência um do outro e conforme estabelecido a seguir.
[0116] Com relação às variantes de polinucleotídeo, as diferentes entre os polinucleotídeos presentemente
63/726 revelados e suas variantes são limitadas, de modo que as sequências de nucleotideo do primeiro e o último são proximamente similares no total e, em muitas regiões, idênticas. A degeneração do código genético dita que muitos polinucleotideos variantes diferentes podem codificar polipeptideos idênticos e/ou substancialmente semelhantes, além daquelas sequências na Listagem de Sequências. Devido a sua degeneração, as diferenças entre os polinucleotideos presentemente revelados e sequências de nucleotideo variantes podem ser silenciosas em qualquer dada região ou por todo o comprimento do polipeptideo (isto é, os aminoácidos codificados pelo polinucleotideo são os mesmos e a sequência de polinucleotideo variantes assim codifica a mesma sequência de aminoácido, pelo que a região ou comprimento total do polinucleotideo presentemente revelado. Sequências de nucleotideo variantes podem codificar diferentes sequências de aminoácido, onde tais diferenças de nucleotideo resultarão em substituições de aminoácido, adições, deleções, inserções, truncagens ou fusões com relação às sequências de polinucleotideo reveladas semelhantes. Essas variações resultam em variantes de polinucleotideo codificando polipeptideos que compartilham pelo menos uma característica funcional (isto é, o fator de transcrição presentemente revelado e uma variante conferirão, pelo menos, uma das funções a uma
64/726 planta).
[0117] Dentro do escopo da invenção, uma variante de ácido nucleico está listada na Listagem de Sequência, isto é, uma possuindo uma sequência que difere de uma das
sequências de polinucleotídeo na Listagem de Sequência ou
uma sequência complementar, que codifica um polipeptídeo
funcionalmente equivalente (isto é, um polipeptídeo
possuindo algum grau de equivalência ou atividade biológica) porém difere em sequência da sequência na Listagem de Sequências, devido à degeneração no código genético.
[0118] Variante alélica ou variante alélica de polinucleotídeo se refere a qualquer duas ou mais formas de um gene ocupar o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente da mutação, e pode resultar em polimorfismo fenotípico dentro das populações. Mutações genéticas podem ser silenciosas ou podem codificar polipeptídeos possuindo sequências de aminoácido alteradas. Variante alélica e variante alélica de polipeptídeo podem também ser usadas com relação aos polipeptídeos e nesse caso, os termos se referem a um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
[0119] Variante de fixação ou variante de fixação de polinucleotídeo conforme usada aqui, se refere às formas alternativas do RNA transcrito de um gene. A variação de fixação ocorre naturalmente como resultado de
65/726 sítios alternativos que são fixados dentro de uma molécula de RNA transcrita simples ou entre moléculas de RNA transcritas separadamente e pode resultar em várias formas diferentes de mRNA transcrito do mesmo gene. Assim, variantes de fixação podem codificar polipeptideos possuindo diferentes sequências de aminoácido, que, no presente contexto, terão pelo menos uma função semelhante no organismo (variação de fixação pode também fornecer polipeptideos distintos possuindo funções diferentes). Variante de fixação ou variante de fixação de polipeptideo pode também se referir a um polipeptideo codificado por uma variante de fixação de um mRNA transcrito.
[0120] Conforme usado aqui, variantes de polinucleotideo podem também se referir às sequências de polinucleotídeo que codificam parálogos e ortólogos das sequências de polipeptideo presentemente reveladas. Variantes de polipeptideo pode se referir às sequências de polipeptideo que são parálogas e ortólogas das sequências de polipeptideo presentemente reveladas.
[0121] Diferenças entre polipeptideos e variantes de polipeptideo presentemente reveladas são limitadas, de modo que as sequências dos primeiros e dos últimos são proximamente semelhantes no total e, em muitas regiões, idênticas. As sequências de polipeptideo presentemente
66/726 reveladas e variantes de polipeptideo semelhantes podem diferir na sequência de aminoácido em uma ou mais substituições, adições, deleções, fusões e truncagens, que podem estar presentemente em qualquer combinação. Essas diferenças podem produzir alterações silenciosas e resultarem em um fator de transcrição funcionalmente equivalente. Assim, será prontamente apreciado pelos versados na técnica que qualquer de uma variedade de sequências de polinucleotideo é capaz de codificar os fatores de transcrição e polipeptideos homólogos de fator de transcrição da invenção. Uma variante de sequência de polipeptideo pode ter alterações conservadoras, onde um aminoácido substituído possui estrutura ou propriedades químicas semelhantes. Substituições de aminoácido deliberadas podem assim ser feitas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, à medida que a atividade funcional ou biológica do fator de transcrição for mantida. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente podem incluir ácido aspártico e ácido glutâmico, aminoácidos carregados positivamente podem incluir lisina e arginina e aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregados possuindo valores de hidrofilicidade semelhantes podem incluir leucina, isoleucina valina; glicina alanina; asparagina e
67/726 glutamina; serina e treonina e fenilalanina e tirosina. Para mais detalhes com relação as substituições conservadoras, vide Tabela 5. Mais raramente, uma variante pode ter alterações não conservadoras, por exemplo, substituição de uma glicina com um triptofano. Variações menores semelhantes podem também incluir deleções de aminoácido ou inserções, ou ambos. Polipeptideos correlatos podem compreender, por exemplo, adições e/ou deleções de um ou mais sítios de glicosilação ligados em N ou ligados em 0 ou uma adição e/ou deleção de um ou mais resíduos de cisteína. A diretriz na determinação de qual e como muitos resíduos de aminoácido podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir a atividade funcional ou biológica pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos na arte, por exemplo, software DNASTAR (vide USPN 5.840.544) .
[0122] O termo planta inclui plantas integrais, órgãos vegetativos de broto/estruturas (por exemplo, folhas, hastes e tubérculos), raízes, flores e órgãos florais/estruturas (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes (incluindo, embriões, endosperma, e revestimento da semente) e frutos (o ovário maduro) , tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido moído e semelhantes) e células (por exemplo, células de defesa, células ovo e
68/726 semelhantes) e progênie das mesmas. A classe de plantas que pode ser usada no processo da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores receptivas às técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias, cavalinhas, psilófitas, licófitas, briófitas, e algas multicelulares. (Vide, por exemplo, a Figura 1, adaptada de Daly e outros (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333; a Figura 2, adaptada de Ku e outros (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 9121-9126; e vide também Tudge, em The Variety of Life, Oxford University Press, New York, NY (2000) pp. 547-606).
[0123] Uma planta transgênica se refere a uma planta que contém material genético não encontrado em uma planta do tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivo. O material genético pode incluir um transgene, um evento de mutagenese insercional (tal como por transposon ou mutagenese insercional de T-DNA), uma ativação de sequência marcadora, uma sequência mutada, um evento de recombinação homóloga ou uma sequência modificada por quimeraplastia. Tipicamente, o material genético estranho foi introduzido na planta por manipulação humana, porém qualquer processo pode ser usado como um versado na técnica reconhecería.
[0124] Uma planta transgênica pode conter um vetor
69/726 de expressão ou cassete. 0 cassete de expressão compreende, tipicamente, uma sequência codificando um polipeptideo, operativamente ligada (isto é, sob controle regulador de) às sequências induzíveis apropriadas ou reguladoras constitutivas que permitem a expressão do polipeptideo. 0 cassete de expressão pode ser introduzido na planta por transformação ou por reprodução após transformação de uma planta de origem. Uma planta se refere a uma planta integral, incluindo sementeiras e plantas maduras, bem como uma parte da planta, tal como uma semente, fruto, folha ou raiz, tecido de planta, células de planta ou qualquer outro material de planta, por exemplo, um explante de planta, bem
como a progênie do mesmo, e aos sistemas in vi tro que
imitam os componentes bioquímicos ou celulares ou processos
em uma célula.
[0125] Fragmento com relação a um
polinucleotídeo, se refere a um clone ou qualquer parte de uma molécula de polinucleotídeo que retém uma característica utilizável, funcional. Fragmentos úteis incluem oligonucleotídeos e polinucleotídeos que podem ser usados nas tecnologias de hibridização ou ampliação ou na regulação da replicação, transcrição ou tradução. Um fragmento de polinucleotídeo se refere a qualquer sequência de um polinucleotídeo, tipicamente de pelo menos cerca de 9 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente pelo
70/726 menos cerca de 30 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 nucleotídeos de qualquer uma das sequências providas aqui. Fragmentos de polinucleotídeo exemplares são os primeiros seis nucleotídeos consecutivos dos polinucleotídeos de fator de transcrição listados na Listagem de Sequência. Fragmentos Exemplares também incluem fragmentos que compreendem uma região que codifica um domínio conservado de um fator de transcrição.
[0126] Fragmentos podem também incluir subsequências de polipeptídeos e moléculas de proteína ou uma sequência de polipeptídeo. Fragmentos podem possuir usos nos quais eles podem ter potencial antigênico. Em alguns casos, o fragmento ou domínio é uma subsequência do polipeptídeo que realiza pelo menos uma função biológica do polipeptídeo intacto substancialmente da mesma maneira ou a uma extensão semelhante, a do polipeptídeo intacto. Por exemplo, um fragmento de polipeptídeo pode compreender um motivo estrutura reconhecível ou domínio funcional, tal como um sítio de ligação de DNA ou domínio que liga-se a uma região promotora de DNA, um domínio de ativação ou um domínio para interações de protéina-proteína e pode iniciar a transcrição. Os fragmentos podem variar em tamanho de alguns 3 aminoácidos ao comprimento pleno do polipeptídeo intacto, porém possuem preferivelmente pelo menos 30 aminoácidos de comprimento e, mais preferivelmente, pelo
71/726 menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento. Fragmentos de polipeptídeo exemplares são os primeiros vinte aminoácidos consecutivos de uma proteína de mamífero codificada pelos primeiros vinte aminoácidos consecutivos dos polipeptídeos de fator de transcrição listados na Listagem de Sequências.
[0127] Fragmentos exemplares também incluem fragmentos que compreendem um domínio conservado de um fator de transcrição. Um exemplo de tal fragmento exemplar incluiría resíduos de aminoácido 20-110 ou G481 (SEQ ID N°: 88), conforme observado na Tabela 8.
[0128] A invenção também engloba a produção de sequências de DNA que codificam fatores de transcrição e derivados de fator de transcrição ou fragmentos dos mesmos, totalmente por química sintética. Após a produção, a sequência sintética pode ser inserida em qualquer um dos muitos vetores de expressão disponíveis e sistemas de célula usando reagentes bem conhecidos na técnica. Além disso, a química sintética pode ser usada para introduzir mutações em uma sequência codificando fatores de transcrição ou qualquer fragmento da mesma.
[0129] Um domínio conservado ou região
conservada conforme usado aqui se refere a uma região nas
sequências de polinucleotideo heterólogas ou de
polipeptídeo onde existe um grau relativamente alto de
identidade de sequência entre as sequências distintas.
72/726 [0130] Com relação aos polinucleotídeos codificando fatores de transcrição presentemente revelados, uma região conservada possui preferivelmente pelo menos 10 pares de base (bp) de comprimento.
[0131] Um domínio conservado com relação aos polipeptídeos presentemente revelados se refere a um domínio dentro de uma família de fator de transcrição que exibe um grau maior de homologia de sequência, tal como pelo menos 26% de similaridade de sequência, pelo menos 16% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 40% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 65% de identidade de sequência incluindo substituições conservadoras e, mais preferivelmente, pelo menos 80% de identidade de sequência e, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 85% ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de 87%, ou pelo menos cerca de 88% ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de resíduo de aminoácido de um polipeptideo de resíduos de aminoácido consecutivos. Um fragmento ou domínio pode ser referido como fora de um domínio conservado, fora de uma sequência de consenso ou fora do sítio de ligação de DNA de consenso, que é conhecido como existente ou que existe em uma classe de fator de transcrição específica, família ou subfamília. Nesse caso, o fragmento ou domínio não incluirá os
73/726 aminoácidos exatos de uma sequência de consenso ou sitio de ligação de DNA de consenso de uma classe de fator de transcrição, família ou subfamília, ou os aminoácidos exatos de uma sequência de consenso de fator de transcrição específico ou sítio de ligação de DNA de consenso. Adicionalmente, um fragmento específico, região ou domínio de um polipeptídeo, ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo pode estar fora de um domínio conservado, se todos os aminoácidos do fragmento, região ou domínio encontrarem-se fora do domínio(s) conservado(s) definido(s) para um polipeptídeo ou proteína. Sequências possuindo graus de identidade menores, porém comparáveis a atividade biológica são consideradas como equivalentes.
[0132] Como um versado na técnica reconhece, os domínios conservados dos fatores de transcrição podem ser identificados como regiões ou domínios de identidade em relação a sequência de consenso específica (vide, por exemplo, Riechamnn e outros (2000 supra). Assim, utilizando os processos de alinhamento bem conhecidos na técnica, os domínios conservados dos fatores de transcrição de planta
para cada um dos que se seguem podem ser determinados: A
família do fator de transcrição de domínio AP2
(APETALA2) (Riechmann and Meyerowitz (1998) supra) ; a
família do fator de transcrição MYB (ENBib; Martin and PazAres (1977) supra); a família do fator de transcrição de
74/726 domínio MADS (Riechmann and Meyerowitz (1997) supra); a família da proteína WRKY (Ishiguro and Nakamura (1994) supra); a família da proteína de repetição ancirina (Zhang e outros (1992) supra); a família (Z) da proteína dedo de zinco (Klug and Schwabe (1995) supra); Takatsuji (1998) supra); a família da proteína homeoboxe (HB) (Buerglin (1994) supra); as proteínas de ligação do elemento CAAT (Forsburg and Guarente (1989) supra); as proteínas de ligação escamosas do promotor (SPB) (Klein e outros (1996) supra); a família da proteína NAM (Souer e outros (1996) supra); as proteínas IAA/AUX (Abel e outros (1995) supra);
a família da proteína HLH/MYC (Littlewood e outros (1994) supra) ; a família da proteína de ligação de DNA (DBP) (Tucker e outros (1994) EMBO J. 13: 2994-3002); a família bZIP dos fatores de transcrição (Foster e outros (1994) supra); família da proteína de ligação da Caixa P (the ΒΡΕΙ) (da Costa e Silva e outros (1993) supra); a família do grupo de alta mobilidade (HMG) (Bustin and Reeves (1996) supra); a família scarecrow (SCR) (Di Laurenzio e outros (1996) supra); a família GF14 (Wu e outros (1997) supra); a família polycomb (PCOMB) (Goodrich e outros (1997) supra); a família ramificada de teosinto (TEO) (Luo e outros (1996) supra); a família ABI3 (Giraudat e outros (1992) supra); a família de hélice tripla (TH) (Dehesh e outros (1990) supra); a família EIL (Chao e outros (1997) supra); a
75/726 família AT-HOOK (Reeves and Nissen (1990) supra); a família
S1FA (Zhou e outros (1995) supra); a família bZIPT2 (Lu and
Feri (1995) supra); a família YABBY (Bowman e outros (1999) supra); a família PAZ (Bohmert e outros (1998) supra); uma família de fatores de transcrição diversos incluindo a família DPBF (Kim e outros (1997) Plant J. 11: 1237-1251) e a família SPF1 (Ishiguro and Nakamura (1994) supra); a família GARP (Hall e outros (1998) supra), a família TUBBY (Boggin e outros (1999) supra), a família de choque térmico (Wu (1995) supra), a família ENBP (Christiansen e outros (1996) supra), a família de dedo de zinco (Jensen e outros (1998) supra), a família PDBP (Janik e outros (1989) supra), a família PCF (Cubas e outros, (1999) supra), a família SRS (relacionada a SHI) (Fridborg e outros (1999) supra), a família CPP (semelhante a polycomb rico em cisteína) (Cvitanich e outros (2000) supra), a família ARF (fator de resposta de auxina) (Ulmasov e outros (1999) supra), a família SWI/SNF (Collingwood e outros (1999) supra), a família ACBF (Seguin e outros (1997) supra), a família PCGL (semelhante a CG-1) (da Costa e Silva e outros (1994) supra) a família ARID (Vazquez e outros (1999)
Supra), a família Jumonji (Balciunas e outros (2000), supra), a família bZIP-NIN (Schauser e outros (1999) supra), a família E2F (Kaelin e outros (1992) supra) e a família semelhante a GRF (Knaap e outros (2000) supra).
76/726 [0133] Os domínios conservados para cada umdos polipeptídeos da SEQ ID N°:2N, onde N = 1 -229,são listados na tabela 8, conforme descrito no ExemploVII.
Também, muitos dos polipeptídeos da tabela 8 possuem domínios conservados especificamente indicados por sítios de partida e parada. Uma comparação das regiõesdos polipeptídeos na SEQ ID N°: 2N, onde N = 1 - 229 ou daqueles na Tabela 8, permite que os versados na técnica identifiquem domínio(s) conservado(s) para qualquer um dos polipeptídeos listados ou referidos nessa revelação, incluindo aqueles nas Tabelas 7-11.
[0134] Conforme usado aqui, um gene é uma unidade funcional de hereditariedade e em termos físicos, é um segmento específico ou sequência de nucleotídeos ao longo de uma molécula de DNA (ou RNA, no caso de vírus de RNA) envolvido na produção de uma molécula de RNA funcional, tal como uma empregada para um papel estrutural ou regulador ou uma cadeia de polipeptídeo, tal como uma usada par um papel estrutural ou regulador (por exemplo, a última seria a regulação da transcrição como por um polipeptídeo de fator de transcrição). Os polipeptídeos podem então estar sujeitos ao processamento subsequente, tal como, fixação e/ou dobra para obter um polipeptídeo funcional. Um gene pode ser isolado, parcialmente isolado ou ser obtido com um genoma do organismo. Como exemplo, um gene de fator de
77/726 transcrição codifica um polipeptideo de fator de transcrição que pode ser funcional com ou sem processamento adicional para funcionar como um iniciador de transcrição.
[0135] Operacionalmente, os genes podem ser definidos pelo teste cis-trans, um teste genético que determina se duas mutações ocorrem no mesmo gene e que pode ser usado para determinar os limites da unidade geneticamente ativa (Rieger e outros (1976) Glossary of Genetics and Cytogenetics: Classical and Molecular, 4th ed., Springer Verlag. Berlin). Um gene geralmente inclui regiões precedentes (líderes; a montante) e seguintes (seguidores; a jusante) da região de codificação. Um gene pode também incluir sequências de intervenção, não codificadas, referidas como introns, que estão localizadas entre os segmentos de codificação individuais, referidos como éxons. A maioria dos genes possuem uma região promotora associada identificável, uma sequência reguladora 5' ou a montante do códon de iniciação de transcrição. A função de um gene pode também ser regulada por melhoradores, operadores e outros elementos reguladores.
[0136] Um traço se refere a uma característica fisiológica, morfológica, bioquímica ou física de uma planta ou material de planta específico ou célula. Em alguns exemplos, essa característica é visível ao olho
78/726 humano, tal como, tamanho da semente ou planta ou pode ser medida por técnicas bioquímicas, tais como, detecção do teor de proteína, amido ou óleo da semente ou folhas ou por observação de um processo metabólico ou fisiológico, por exemplo, por medição da absorção de dióxido de carbono ou por observação do nível de expressão de um gene ou genes, por exemplo, por emprego da análise Northern, ensaios de expressão de gene em microfileira RT-PCR ou sistemas de expressão de gene repórter, ou por observações agrícolas, tais como, tolerância ao estresse, rendimento ou tolerância a agente patogênico. Contudo, qualquer técnica pode ser usada para medir a quantidade, nível de comparação ou diferença em qualquer composto químico selecionado ou macromolécula nas plantas transgênicas.
a. Modificação do traço se refere a uma diferença detectável em uma característica em uma planta expressando ectopicamente um polinucleotídeo ou polipeptideo da presente invenção em relação a uma planta que não faz isso, tal como, uma planta do tipo selvagem. Em alguns casos, a modificação de traço pode ser avaliada quantitativamente. Por exemplo, a modificação de traço pode conter pelo menos cerca de 2% de aumento ou diminuição no traço observado (diferença), pelo menos 5% de diferença, pelo menos cerca de 10% de diferença, pelo menos cerca de 20% de diferença, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo
79/726 menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 100%, ou mesmo uma diferença maior em comparação à planta do tipo selvagem. Sabe-se que pode haver uma variação natural no traço modificado. Portanto, a modificação do traço observada contém uma alteração da distribuição normal do traço nas plantas em comparação com a distribuição observada na planta do tipo selvagem.
[0137] O termo perfil de transcrição se refere aos níveis de expressão de um conjunto de genes em uma célula em um estado específico, particularmente comparandose com os níveis de expressão daquele mesmo conjunto de genes em uma célula do mesmo tipo em um estado de referência. Por exemplo, o perfil transcrito de um fator de transcrição específico em uma célula de suspensão constitui os níveis de expressão de um conjunto de genes em uma célula superexpressando aquele fator de transcrição, em comparação aos níveis de expressão do mesmo conjunto de genes em uma célula de suspensão que possui níveis normais daquele fator de transcrição. 0 perfil de transcrição pode ser apresentado como uma lista daqueles genes cujo nível de expressão é significativamente diferente entre dois tratamentos, e as razões de diferença. As diferenças e similaridades entre os níveis de expressão podem também ser avaliadas e calculadas usando processos estatísticos e de agrupamento.
80/726 [0138] Tipo selvagem conforme usado aqui, se refere a uma célula, tecido ou planta que não foi geneticamente modificada para nocautear ou superexpressar um ou mais dos fatores de transcrição presentemente revelados. As células do tipo selvagem, tecidos ou plantas podem ser usados como controles para comparar níveis de expressão e extensão e natureza da modificação do traço com células modificadas (por exemplo, transgênicas), tecidos ou plantas nos quais a expressão do fator de transcrição é alterada ou ectopicamente expressa, por exemplo, nocauteando ou superexpressando um gene.
[0139] Expressão ectópica ou expressão alterada com referência a um polinucleotídeo indica que o padrão de expressão, por exemplo, em uma planta transgênica ou tecido de planta é diferente do padrão de expressão em uma planta do tipo selvagem ou planta de referência das mesmas espécies. O padrão de expressão pode também ser comparado ao padrão de expressão de referência em uma planta do tipo selvagem das mesmas espécies. Por exemplo, o polinucleotídeo ou polipeptideo é expresso em um tipo de célula ou tecido que não um tipo de célula ou tecido onde a sequência é expressa em uma planta do tipo selvagem ou por expressão em um tempo que não o tempo da sequência ser expressa na planta do tipo selvagem ou por resposta aos agentes induzíveis diferentes, tais como, hormônio ou
81/726 sinais ambientais ou em níveis de expressão diferentes (tanto maiores quanto menores) em comparação aqueles encontrados em uma planta do tipo selvagem. A expressão alterada pode ser obtida, por exemplo, por transformação de uma planta com um cassete de expressão possuindo um elemento promotor constitutivo ou induzível, associado ao gene do fator de transcrição. 0 padrão de expressão resultante pode assim ser constitutivo ou induzível e ser estável ou transiente. Expressão alterada ou ectópica pode também se referir aos padrões de expressão alterada que são produzidos por diminuição dos íeis de expressão abaixo do nível de detecção ou abolindo completamente a expressão, por exemplo, por nocauteamento da expressão genética por ruptura da expressão ou regulação do gene com um elemento de inserção.
[0140] Com referência a um polipeptideo, o termo expressão ectópica ou alterada adicionalmente pode se referir aos níveis de atividade alterada resultando das interações dos polipeptídeos com moduladores exógenos ou endógenos ou de interações com fatores ou como resultado da modificação química dos polipeptídeos.
[0141] O termo superexpressão conforme usado aqui se refere a um nível de expressão maior de um gene em uma planta ou célula de planta ou tecido de planta, em comparação à expressão em uma planta do tipo selvagem,
82/726 célula ou tecido, em qualquer estágio de desenvolvimento ou estágio temporal para o gene. A superexpressão pode ocorrer quando, por exemplo, os genes codificando um ou mais fatores de transcrição estão sob o controle de um sinal de expressão forte, tal como um dos promotores descritos aqui (por exemplo, a região de início de transcrição do vírus mosaico da couve-flor 35S). A superexpressão pode ocorrer através de uma planta ou em tecidos específicos de planta, dependendo do promotor usado, conforme descrito abaixo.
[0142] A superexpressão pode acontecer em células de planta que normalmente não possuem expressão de polipeptídeos funcionalmente equivalentes ou idênticas aos presentes fatores de transcrição. A superexpressão pode também ocorrer em células de plantas onde a expressão endógena dos presentes fatores de transcrição ou moléculas funcionalmente equivalentes normalmente ocorrem, porém, tal expressão norma está a um nível inferior no organismo ou tecidos do superexpressador. A superexpressão assim resulta em uma produção maior que a normal ou superprodução do fator de transcrição na planta, célula ou tecido.
[0143] O termo mudança de fase se refere a uma progressão de planta do embrião para adulto e por algumas definições, a transição onde as plantas florescendo ganham competência para se reproduzir. Acredita-se que a mudança de fase ocorra tanto após um determinado número de divisões
83/726 de célula no ápice do broto de uma planta em desenvolvimento, ou quando o ápice do broto obtém uma distância específica das raízes. Assim, alterando-se o tempo das mudanças de fase, isto afeta o tamanho da planta que, por sua vez, afeta o rendimento e a biomassa.
Traços que podem ser Modificados na Superexpressão ou Nocauteamento das Plantas [0144] As modificações de traço de interesse específico incluem aquelas das sementes (tais como, embrião ou endosperma), frutos, raiz, flores, folhas, hastes, broto, sementeiras ou semelhantes incluindo: tolerância melhorada às condições ambientais incluindo congelamento, resfriamento, aquecimento, estiagem, saturação com água, radiação e ozônio; tolerância aperfeiçoada às doenças por micróbios, fungos ou vírus; tolerância aperfeiçoada às infestações por pragas, incluindo insetos, nematódios, mollicutes, plantas superiores parasitas ou semelhantes; sensibilidade diminuída ao herbicida; tolerância aperfeiçoada aos metais pesados ou capacidade melhorada de absorção de metais pesados; crescimento aperfeiçoado sob condições fracas de luz (por exemplo, luz fraca e/ou dias curtos) ou mudanças nos níveis de expressão dos genes de interesse. Outro fenótipo que pode ser modificado se refere à produção de metabolitos das plantas, tais como, variações na produção de taxol, tocoferol, tocotrienol, esteróis,
84/726 fitoesteróis, vitaminas, monômeros cerosos, antioxidantes, aminoácidos, ligninas, celulose, taninas, prenilipideos (tais como, clorofila e carotenóides), glucosinolatos e terpenóides, proteína melhorada ou composicionalmente alterada ou produção de óleo (especialmente em sementes), ou açúcar modificado (insolúvel ou solúvel) e/ou composição de amido. As características físicas das plantas que podem ser modificadas incluem desenvolvimento da célula (tal como número de tricomas), tamanho e número de frutos e sementes, rendimentos das partes das plantas, tais como, caules, folhas, inflorescências e raízes, a estabilidade das sementes durante o armazenamento, características da casca da semente (por exemplo, suscetibilidade ao despedaçamento), comprimento capilar das raízes e quantidade, distâncias dos internodos ou a qualidade do revestimento da semente. As características de crescimento da planta que podem ser modificadas incluem razão de crescimento, razão de germinação das sementes, vigor das plantas e sementeiras, senescência a folha e flor, esterilidade do macho, apomixis, tempo de floração, abcissão da flor, razão de absorção de nitrogênio, sensibilidade osmótica às concentrações de açúcar solúvel, características de biomassa e transpiração, bem como características de arquitetura da planta, tais como, domínio apical, padrão das ramificações, número de órgãos,
85/726 identidade dos órgãos, forma ou tamanho dos órgãos.
Fatores de Transcrição que Modificam a Expressão dos Genes Endógenos [0145] A expressão dos genes que codificam os fatores de transcrição que modificam a expressão dos genes endógenos, polinucleotideos e proteínas é bem conhecida na arte. Além disso, as plantas transgênicas compreendendo fatores de transcrição codificando polinucleotideos isolados podem também modificar a expressão dos genes endógenos, polinucleotideos e proteínas. Exemplos incluem Peng e outros (1997) Genes and Development 11: 3194-3205, and Peng e outros (1999) Nature 400: 256-261. Além disso, muitos outros demonstraram que um fator de transcrição de Arabidopsis expresso em uma espécie de planta exógena promove a mesma resposta fenotípica ou muito semelhante. Vide, por exemplo, Fu e outros (2001) Plant Cell 13: 17911802; Nandi e outros (2000, Curr. Biol. 10: 215-218; Coupland (1995) Nature 377: 482-483; e Weigel and Nilsson (1995) Nature 377: 482-500.
[0146] Em outro exemplo, Mandei e outros (1992) Cell 71-133-143 e Suzuki e outros (2001) Plant J. 28: 409418, ensinam que um fator de transcrição expresso em outras espécies de planta promovem a mesma resposta fenotípica ou semelhante da sequência endógena, conforme freqüentemente previsto em estudos anteriores dos fatores de transcrição
86/726 de Arabidopsis em Arabidopsis (vide Mandei e outros (1992) supra; Suzuki e outros (2001) supra).
[0147] Outros exemplos incluem Müller e outros (2001) Plant J. 28: 169-179; Kim e outros (2001) Plant J. 25: 247-259; Kyozuka and Shimamoto (2002) Plant Cell Physiol. 43: 130-135; Boss and Thomas (2002) Nature 416: 847-850; He e outros (2000) Transgenic Res. 9: 223-227; e Robson e outros (2001) Plant J. 28: 619-631.
[0148] Ainda em outro exemplo, Gilmour e outros (1998) Plant J. 16: 433-442, ensinam um fator de transcrição ΆΡ2 de Arabidopsis, CBF1 (SEQ ID N° : 1956), que, quando superexpresso nas plantas transgênicas, aumenta a tolerância da planta ao congelamento. Jaglo e outros (2001) Plant Physiol. 127: 910-917, adicionalmente identificaram sequências em Brassica napus que codificam genes semelhantes a CBF e que transcrições para esses genes acumularam-se rapidamente em resposta a temperatura muito baixa. Foi também verificado que as proteínas semelhantes a CBF codificando as transcrições acumularam-se rapidamente em resposta a temperatura baixa no trigo, bem como no tomate. Um alinhamento das proteínas CBF de Arabidopsis, B. napus, trigo, centeio, e tomate revelou a presença de resíduos de aminoácido consecutivos conservados, PKK/RPAGRxKFxETRHP e DSAWR, que suportam os domínios de DNA de ligação AP2/EREBP das proteínas e distinguem as mesmas
87/726 de outros elementos da família da proteína AP2/EREBP. (Vide Jaglo e outros supra).
[0149] Gao e outros (2002) Plant Molec. Biol. 49: 459-471) recentemente descobriram quatro fatores de transcrição de CBF da Brassica napus: BNCBFs 5, 7, 16 e 17. Eles observaram que as primeiras três CBFs [0150] (Números de acesso ao GenBank AAM18958, AAM18959 e AAM18960, respectivamente) são muito semelhantes a Arabidopsis CBF1, considerando-se que BNCBF17 (número de acesso ao GenBank AAM18961) é semelhante, porém contém duas regiões extras de 16 e 21 aminoácidos em seu domínio de ativação ácido. Todas as quatro CBFs B. napus acumulam-se nas folhas das plantas após tratamento frio e BNCBFs 5, 7, 16 acumularam após tratamento de estresse ao sal. Os autores concluíram que essas BNCBFs funcionam provavelmente em resposta a baixa temperatura em B. napus.
[0151] Em um estudo funcional dos genes CBF, Hsieh e outros ((2002) Plant Physiol. 129: 1086-1094) verificaram que a expressão heteróloga de Arabidopsis CBF1 em plantas de tomate confere tolerância aumentada ao resfriamento e tolerância considerável ao estresse oxidativo, o que sugeriu aos autores que a expressão de Arabidopsis CBF1 ectópica pode induzir vários genes sensíveis ao estresse em tomate, para proteger as plantas.
[0152] Os fatores de transcrição mediam as
88/726 respostas células e controlam os trações através da expressão alterada dos genes contendo sequências de nucleotideo de atuação cis, que são ambos do fator de transcrição introduzido. É bem apreciado na técnica que o efeito de um fator de transcrição nas respostas celulares ou um traço celular é determinado pelos genes específicos cuja expressão é tanto direta quanto indiretamente (por exemplo, por uma cascata de eventos de ligação de fator de transcrição e alterações transcricionais) alterado pela ligação do fator de transcrição. Em uma análise global da transcrição comparando uma condição padrão com uma onde o fator de transcrição é superexpresso, o perfil de transcrição resultante associado a superexpressão do fator de transcrição está relacionado ao traço ou processo celular controlado por aquele fator de transcrição. Por exemplo, o gene PAP2 (e outros genes na família MYB) mostrou controlar a biossíntese da antocianina através da regulação da expressão dos genes conhecidos por estarem envolvidos na via biossintética da antocianina (Bruce e outros (2000) Plant Cell 12: 65-79; e Borevitz e outros (2000) Plant Cell 12: 2383-2393). Adicionalmente, perfis de transcrição global foram usados sucessivamente como ferramentas de diagnóstico para estados celulares específicos (por exemplo, cancerosos versas não cancerosos; Bhattacharjee e outros (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA
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98: 13790-13795; e Xu e outros (2001) Proc Natl Acad Sei, USA 98: 15089-15094). Consequentemente, é evidente a um versado na técnica que a semelhante do perfil de transcrição mediante superexpressão de fatores diferentes de transcrição indicaria semelhança da função do fator de transcrição.
Polipeptideos e Polinucleotídeos da Invenção [0153] A presente invenção provê, entre outras coisas, fatores de transcrição (TFs) e polipeptideos homólogos ao fator de transcrição e polinucleotídeos isolados ou recombinantes codificando os polipeptideos ou novos polipeptideos de variação de sequência ou polipeptideos codificando novas variantes dos fatores de transcrição derivados das sequências específicas providas aqui. Esses polipeptideos e polinucleotídeos podem ser empregados para modificar as características da planta.
[0154] Polinucleotídeos exemplares codificando os polipeptideos da invenção foram identificados na base de dados do GenBank de Arabidopsis thaliana usando programas de análise de sequência disponíveis publicamente e parâmetros. As sequências inicialmente identificadas foram então adicionalmente caracterizadas para identificar sequências compreendendo cordões de sequência especificados correspondendo aos motivos de sequência presentes nas famílias de fatores de transcrição conhecidos. Além disso,
90/726 os polinucleotideos exemplares adicionais codificando os polipeptideos da invenção foram identificados na base de dados GenBank de plantas usando programas e parâmetros de análise de sequência disponíveis publicamente. As sequências inicialmente identificadas foram então adicionalmente caracterizadas para identificar sequências compreendendo os cordões de sequência especificados correspondendo aos motivos de sequência presentes nas famílias dos fatores de transcrição conhecidos. As sequências de polinucleotideos que satisfazem tais critérios foram confirmadas como fatores de transcrição.
[0155] Polinucleotideos adicionas da invenção foram identificados por classificação de Arabidopsis thaliana e/ou outras bibliotecas de cDNA com sondas correspondendo aos fatores de transcrição conhecidos sob condições de hibridização de estringência baixa. Sequências adicionais, incluindo sequências de codificação de comprimento pleno foram subseqüentemente recuperadas por ampliação rápida do procedimento das extremidades do cDNA (RACE), usando um kit disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. Quando necessário, múltiplas etapas da RACE são realizas para isolar as extremidades 5' e 3'. O cDNA de comprimento pleno foi então recuperado por uma reação de cadeia de polimerase extremidade a extremidade de rotina (PCR) usando iniciadores específicos para as extremidades
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5' e 3' isoladas. Sequências exemplares são providas na Listagem de Sequências.
[0156] Os polinucleotideos da invenção podem ser ou foram expressos ectopicamente no superexpressador ou plantas nocauteadas e as variações na(s) característica(s) ou traço (s) das plantas observadas. Portanto, os polinucleotideos e polipeptídeos podem ser empregados para aperfeiçoar as características das plantas.
[0157] Os polinucleotideos da invenção podem ser ou foram ectopicamente expressos nas células de planta superexpressadoras e as alterações nos níveis de expressão de vários genes, polinucleotideos e/ou proteínas das células de planta foram observadas. Portanto, os polinucleotideos e polipeptídeos podem ser empregados para alterar os níveis de expressão dos genes, polinucleotideos e/ou proteínas das plantas. >
[0158] Exemplos específicos dos polipeptídeos e polinucleotideos da invenção e observações experimentais realizados após modificação de sua expressão nas plantas podem ser encontrados no texto e tabelas que se seguem.
Família de fator de transcrição de proteína de ligação do elemento CCAAT [0159] G481 (AT2G38880) e G482 são elementos do subgrupo HAP3 da família do fator de ligação CCAAT (CAAT). G481, G481 e suas sequências correlatas foram incluídos em
92/726 um programa para testar a capacidade dessas sequências de conferir o mesmo estresse abiótico relacionado a estiagem previamente observado por nós nas linhagens 35S::G481.
[0160] A família CAAT dos fatores de transcrição, também referida como a família CCAA.T ou caixa CCAAT é caracterizada por sua capacidade de ligar-se ao elemento de caixa CCAAT localizado 80 a 300 bp 5' do sítio de início de transcrição (Gelinas e outros (1985) Nature 313: 323-325). A caixa CCAAT é um elemento regulador de atuação cis conservado com a sequência de consenso CCAAT que é encontrada nos promotores dos genes de todas as espécies eucarióticas. O elemento pode atuar em cada orientação, sozinho ou como regiões multiméricas com cooperação possível com outros elementos reguladores cis (Tasanen e outros (1992) (J. Biol. Chem. 267: 11513-11519). Foi estimado que 25% dos promotores eucarióticos abrigam esse elemento (Bucher (1988) J. Biomol. Struct. Dyn. 5: 12311236) . Os elementos de caixa CCAAT mostraram funcionar na regulação da expressão do gene em plantas (Rieping and Schoffl (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 226-232; Kehoe e outros (1994) Plant Cell 6: 1123-1134; Ito e outros (1995) Plant Cell Physiol. 36: 1281-1289). Vários relatórios descreveram a importância do elemento de ligação CCAAT para expressão regulada; incluindo a regulação dos genes que são sensíveis a luz (Kusnetsov e outros (1999) <J. Biol. Chem.
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274: 36009-36014; Carre and Kay (1995) Plant Cell 7: 20392051), bem como ao estresse (Rieping and Schoffl (1992) supra). Especificamente, um motivo caixa CCAAT mostrou ser importante para a expressão regulada de luz do promotor CAB2 em Arabidopsis, contudo, as proteínas que ligam-se ao sítio não foram identificadas (Carre and Kay (1995) supra). Atualmente, nenhuma proteína de ligação caixa CCAAT de Arabidopsis específica foi funcionalmente associada com seus genes alvo correspondentes. Em outubro de 2002, em uma reunião EPSO em Plant Networks, um seminário foi oferecido por Detlef Weigel (Tuebingen) relacionado ao controle do gene AGAMOU (um gene de identidade de órgão floral) em Arabidopsis. A fim de obter elementos cis importantes que regulam a atividade de AGAMOUS, ele alinhou as regiões promotoras de 29 espécies diferentes de Brassicaceae e mostram que haviam duas regiões altamente conservadas; um sítio bem caracterizado que liga heterodímeros LEAFY/WUS e outro motivo de ligação de caixa CCAAT putativo. Nós descobrimos vários genes caixa CCAAT que regulam a época de floração e são candidatos a ligação ao promotor AGAMOUS. Um desses genes, G485, é uma proteína semelhante a HAP3, que está proximamente relacionada ao G481. Estudos de ganho e perda de função em G485 revelam efeitos postos na época de floração, indicando que o gene é suficiente para atuar como um ativador floral e é também necessário para aquele papel
94/726 dentro da planta.
[0161] As primeiras proteínas identificadas que ligam-se ao elemento de caixa CCAAT foram identificadas na levedura. Os fatores de transcrição de caixa CCAAT ligam-se como complexo hetero-tetramérico, denominado complexo HAP (complexo de proteína ativadora de hemo) ou o fator de ligação de CCAAT (Forsburg e Guarente (1988) Mol. Cell Biol. 8: 647-654). O complexo HAP na levedura é composto de pelo menos quatro subunidades, HAP2, HAP3, HAP4 e HAP5. Além disso, as proteínas que constituem o complexo HAP2,3,4,5 são representadas por genes simples. Sua função é específica para ativação dos genes envolvidos na biogênese mitocondrial e metabolismo de energia (Dang e outros (1996) Mol. Microbiol. 22:681-692). Nos mamíferos, o fator de ligação CCAAT é um complexo trimérico consistindo em subunidades NF-YA (semelhante a HAP2), NF-YB (semelhante a HAP3) e NF-YC (semelhante a HAP5) (Maity and de Crombrugghe (1998) Trends Biochem. Sei. 23: 174-178). Nas plantas, elementos análogos ao complexo de fator de ligação CCAAT são representados por famílias de genes pequenos, e é provável que esses genes desempenhem um papel mais complexo na regulação da transcrição do gene. Na Arabidopsis existem dez elementos da subfamília HAP2, dez elementos da subfamília HAP3, treze elementos da subfamília HAP5. As plantas mamíferos, contudo, não parecem ter um
95/726 equivalente a proteína de HAP4 de levedura. HAP4 não é necessário para ligação de DNA, embora forneça o domínio de ativação primário para o complexo (McNabb e outros (1995) Genes Dev. 9: 47-58; Olesen and Guarente (1990) Genes Dev. 4, 1714-1729).
[0162] Nos mamíferos, o elemento de caixa CCAAT é encontrado nos promotores de muitos genes e foi portanto proposto que os fatores de ligação de CCAAT servem como reguladores transcricionais gerais que influenciam a freqüência da iniciação transcricional (Maity and de Crombrugghe (1998) supra}. Fatores de ligação CCAAT, contudo, podem servir para regular os promotores alvo em resposta as questões ambientais e foi demonstrado que o conjunto de fatores de ligação de CCAAT nos promotores alvo ocorre em resposta a uma variedade de sinais (Myers e outros (1986) Myers e outros (1986) Science 232: 613-618; Maity and de Crombrugghe (1998) supra; Bezhani e outros (2001) J. Biol. Cheia. 276: 23785-23789). CPI de mamífero e NF-Y são complexos de fator de ligação CCAAT heterotriméricos (Johnson and McKnight (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 799-839. Os fatores de ligação de CCAAT de planta são tidos como sendo triméricos, como é o caso dos mamíferos, contudo, eles associam-se aos outros fatores de transcrição ou promotores alvo como parte do complexo maior. A caixa CCAAT é geralmente encontrada em proximidade
96/726 aos outros elementos promotores e é geralmente aceito que o fator de ligação de CCAAT funcione sinergisticamente com outros fatores de transcrição na regulação da transcrição. Além disso, foi mostrado recentemente que uma proteína semelhante a HAP3 do arroz, OsNF-YBl, interage com a proteína MADS-box OsMADS18 in vitro (Masiero e outros (2002) J. Biol. Chem. 277: 26429-26435). Foi também mostrado que no complexo ternário in vitro entre esses dois tipos de fatores de transcrição requer que ambos OsNF-YBl forme um dímero com a proteína semelhante a HAP5 e que OsMADS18 forme um heterodímero com outra proteína MADS-box. De forma interessante, o dímero da proteína OsNF-YBl/HAP5 é incapaz de interagir com subunidades semelhantes a HAP2 e portanto, não pode ligar-se ao elemento CCAAT. Os autores, portanto, especulam que existe um grupo selecionado de proteínas semelhantes a HAP3 nas plantas que atuam nos elementos não promotores de CCAAT, em virtude de sua interação com outros fatores de transcrição de não CCAAT (Masiero e outros (2002) supra). Para sustentar isso, dímeros de subunidade HAP3/HAP5 mostraram ser capazes de interagir com TFIID em ausência de subunidades HAP2 (Romier e outros (2003) J. Biol. Chem. 278: 1336-1345).
[0163] O motivo da caixa CCAAT é encontrado nos promotores de uma variedade de genes de plantas. Além disso, o padrão de expressão dos muitos genes semelhantes a
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HAP em Arabidopsis mostra regulação do desenvolvimento. Nós usamos RT-PCR para analisar a expressão endógena de 31 das 34 proteínas de caixa CCAAT. Nossas verificações sugerem que embora a maioria das transcrições de gene de caixa CCAAT sejam encontradas de forma ubíqua através de toda a planta, em mais da metade dos casos, os genes são predominantemente expressos nas flores, embriões e/ou tecidos de síliquas. A localização específica do tipo de célula dos genes CCAAT na Arabidopsis seria muito informativa e ajudaria a determinar a atividade dos vários genes CCAAT na planta.
[0164] A análise genética determinou a função de um gene CCAAT de Arabidopsis, LEAFY COTYLEDON (COTILEDÔNEO FOLIAR) (LEC1) . LEC1 é um gene de subunidade HAP3 que acumula-se apenas durante o desenvolvimento da semente. As plantas Arabidopsis realizam uma mutação nos embriões que revelam gene LEC1 que não são tolerantes a dessecação e que mostram defeitos na maturação da semente (Lotan e outros (1998) Cell 93: 1195-1205). Esse fenótipo pode ser resgatado se os embriões forem deixados crescer antes do processo de dessecação ocorrer durante maturação normal da semente. Esse resultado sugere que LEC1 possui um papel que permite que o embrião sobreviva à dissecação durante a maturação da semente. As plantas mutantes também possuem tricomas ou pelos epidérmicos em seus cotilédones, uma
98/726 característica que é normalmente restrita aos tecidos adultos como folhas e caules. Tal efeito sugere que LEC1 também desenvolva um papel na especificação da identidade de órgão embriônica. Além da análise de mutante, a expressão ectópica (superexpressão não regulada) do gene LEC1 do tipo selvagem induz aos programas embriônicos e desenvolvimento embrionário nas células vegetativas consistente com seu papel na coordenação do desenvolvimento embrionário da planta superior. 0 ortólogo de LEC1 foi identificado recentemente no milho. 0 padrão de expressão de ZmLECl no milho durante desenvolvimento somático do embrião é semelhante aquele do LEC1 na Arabidopsis durante desenvolvimento do embrião zigótico (Zhang e outros (2002) Planta 215:191-194).
[0165] A combinação dos fatores de transcrição de
CCAAT com promotores alvo e a análise dos fenótipos
mutantes de nocauteamento e superexpressão ajudará a
classificar se essas proteínas atuam especificamente ou não no controle das vias da planta. 0 fato de que os elementos da caixa CCAAT não estão presentes na maioria dos promotores de plantas sugere que os fatores de ligação de CCAAT de plantas mais provavelmente não funcionam como componentes em geral da maquinaria de transcrição. Além disso, o papel muito específico da proteína LEC1 nos processos de desenvolvimento da planta sustenta a idéia de
99/726 que os complexos de ligação da caixa CCAAT desempenham papéis muito importantes no crescimento e desenvolvimento da planta.
A estrutura de dominio dos fatores de transcrição de ligação do elemento CCAAT e novos domínios conservados em Arabidopsis e outras espécies [0166] Os fatores de ligação de CCAAT de planta ligam potencialmente DNA como heterotrímeros compostos de subunidades semelhantes a HAP2, HAP3 e HAP5. Todas as subunidades contêm regiões que são necessárias para ligação do DNA e associação à subunidade. As proteínas de subunidade parecem não possuir domínios de ativação; portanto, aquela função deve vir das proteínas com as quais elas interagem nos promotores alvos. Nenhuma proteína que fornece a função do domínio de ativação para os fatores de ligação de CCAAT foi identificada nas plantas. Na levedura, contudo, a proteína HAP4 provê o domínio de ativação primário (McNabb e outros (1995) Genes Dev. 9: 47-58; Olesen and Guarente (1990) Genes Dev. 4, 1714-1729).
[0167] As proteínas semelhantes a HAP2-, HAP3- e HAP5 possuem dois subdomínios altamente conservados, um dos quais funciona em interação de subunidade e o outro que atua em uma associação direta com o DNA. Fora essas duas regiões, as proteínas semelhantes a HAP Arabidopsis não parálogas, são completamente divergentes em sequência e no
100/726 comprimento total.
[0168] A estrutura de domínio geral das proteínas HAP3 é encontrada na Figura 9. As proteínas HAP3 contêm um domínio de terminal A de amino, um domínio B central e um domínio de terminal C de carbóxi. Existe muito pouca semelhante de sequência entre as proteínas HAP3 nos domínios A e C; é portanto razoável presumir que os domínios A e C forneceríam um grau de especificidade funcional a cada elemento da subfamília HAP2. O domínio B é a região conservada que especifica a ligação de DNA e associação à subunidade.
[0169] Nas Figuras 10A-10F, as proteínas de HAP3 de Arabidopsis, soja, arroz e milho são alinhadas com G481, com os domínios A, B e C e os domínios de ligação de DNA e interação de subunidade indicados. Conforme pode ser visto na Figura 10B-10C, o domínio B da classe específica não LEC1 (identificado nas Figuras 6 e 7) pode ser distinguido pelos resíduos de aminoácido: 8>er/Gly-Arg-Ile/Leu-Met-Lys- (Xaa) 2 -Lys/Ile/Val-Pro-XaaAsn-Ala/Gly-Lys-Ile/Val-Ser/Ala/Gly-Lys-Asp/Glu-Ala/SerLys-Glu/Asp/Gln-Thr/Ile-Xaa-Gln-Glu-Cys-Val/Ala-Ser/ThrGlu-Phe-Ile-Ser-Phe-Ile/Val/His-Thr/Ser-[Pro]-Gly/Ser/CysGlu-Ala/Leu-Ser/Ala-Asp/Glu/Gly-Lys/Glu-Cys-Gln/HisArg/Lys-Glu-Lys/Asn-Arg-Lys-Thr-Ile/Val-Asn-Gly-Asp/GluAsp-Leu/Ile-Xaa-Trp/Phe-Ala-Met/Ile/Leu-Xaa-Thr/Asn-Leu101/726
Gly-Phe/Leu-Glu/Asp-Xaa-Tyr- (Xaa)2-Pro/Gln/Ala-Leu/ValLys/Gly;
[0170] onde Xaa pode ser qualquer aminoácido. 0 resíduo de prolina que parece nos parêntesis é um resíduo adicional que foi encontrado apenas em uma sequência (não mostrado na Figura 10B). Os resíduos negritados que aparecem aqui e nas sequências de consenso das Figuras 10B10C em suas presentes posições são unicamente encontradas na classe não semelhante a LEC1 e podem ser usados para identificar os elementos dessa classe. A subclasse semelhante a G482 pode ser delineada pelo resíduo de serina sublinhada em sua presente posição aqui e na sequência de consenso das Figuras 10B-10C. Mais genericamente, a classe não semelhante a LEC1 é distinguida por um domínio B compreendendo:
Asn- (Xaa) 4-Lys- (Xaa) 33-34-Asn-Gly;
e a subclasse G482 é distinguida por um domínio B compreendendo:
Ser- (Xaa) 9-Asn- (Xaa) 4-Lys- (Xaa) 33-34-Asn-Gly.
[0171] A superexpressão desses polipeptídeos confere tolerância aumentada ao estresse abiótico em uma planta transgênica, quando comparado a uma planta não transformada, que não superexpressa o polipeptídeo.
Os elementos da família CCAAT em estudo [0172] G481, G482 e G485 (SEQs ID NoS: 87, 89 e
102/726
2009 de polinucleotídeo) foram escolhidas para estudo com base nas observações de que as plantas Arabidopsis superexpressando esses genes possuíam resistência ao estresse abiótico, tais como, estresse osmótico e incluindo estresse relacionado a estiagem (vide Exemplo VIII, abaixo). G481, G482 e G485 são elementos da família CCAAT, proteínas que atuam em um complexo de múltiplas subunidades e acredita-se que liguem as caixas CCAAT nos promotores dos genes alvos como trímeros e tetrâmeros.
[0173] No Arabidopsis, existem três tipos de proteínas de ligação de CCAAT: HAP2, HAP3 e HAP5. Os polipeptídeos G481, G482 e G485, bem como várias outras proteínas no proteoma da Arabidopsis, pertencem a classe HAP3. Conforme reportado na literatura científica, apenas dois genes da classe HAP3 foram funcionalmente analisados a um grau substancial. Esses são LEAFY COTYLEDON1 (LEC1) e sua subunidade mais proximamente correlata, SEMELHANTE A LEC1 (L1L). LEC1 e L1L são expressadas primariamente durante o desenvolvimento da semente. Ambas parecem ser essenciais para a sobrevivência do embrião de dissecação durante maturação da semente (Kwong e outros (2003) Plant Cell 15: 5-18). LEC1 é um regulador importante necessário para o desenvolvimento normal durante as fases precoce e tardia da embriogenese, que é suficiente para induzir o desenvolvimento embriônico nas células vegetativas. Kwong e
103/726 outros mostraram que dez subunidades de Arabidopsis HAP3 podem ser divididas em duas classes com base na identidade da sequência em seu domínio B conservado, central. LEC1 e L1L constituem as subunidades HAP3 do tipo LEC1, considerando-se que as subunidades HAP3 restantes foram designadas do tipo não LEC1.
[0174] Árvores filogenéticas com base na relação sequencial dos genes HAP3 são mostradas nas Figuras 6 e 7. Conforme pode ser visto nessas Figuras que mostram a família do fator de transcrição CCAAT relacionado a L1L, G1364 e G2345 estão proximamente relacionados ao G481, e G482 e G485 estão mais relacionados ao G481 que em LEC1 ou L1L, as duas últimas sequências sendo encontradas em nodos algo mais distantes. A presente invenção engloba a subunidade G482 dessa classe não semelhante a LEC1 das proteínas da família do fator de transcrição CCAAT relacionado a L1L, para a qual um número representativo de espécies monocoto e dicoto, incluindo elementos das espécies dicoto e monocoto (por exemplo, sequências de Arabidopsis G481, G482, G485, G1364 e G2345, sequências de soja G3472, G3475, G3476, sequências de arroz G3395, G3397, G3398 e sequências de milho G3434 e G3436) foram mostradas como conferindo tolerância ao estresse abiótico aperfeiçoada nas plantas quando superexpressas.
[0175] A tabela 1 mostra os polipeptídeos
104/726 identificados pela SEQ ID NO; Gene ID (GID) No.; a família do fator de transcrição a qual o polipeptídeo pertence e domínios B conservados do polipeptídeo. A primeira coluna mostra a SEQ ID NO do polipeptídeo; a segunda coluna as espécies (abreviadas) e o identificador (GID ou Identificador Genético); a terceira coluna mostra o domínio B; a quarta coluna mostra as coordenadas de aminoácido do domínio conservado que foram usadas para determinar a porcentagem de identidade em relação ao G481; e a quinta coluna mostra a porcentagem de identidade em relação ao G481. As sequências são dispostas em ordem ascendente de porcentagem de identidade com relação ao G481.
[0176] Para as tabelas 1 e 2, a homologia foi determinada após alinhamento das sequências usando os processos de Smíth and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489. Após alinhamento, as comparações de sequência entre os polipeptídeos foram realizadas por comparação em relação a uma janela de comparação para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequência. Uma descrição do processo é provida em Ausubel e outros (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998, e suplementos através de 2001), Altschul e outros(1990). J. Mol. Biol. 215: 403-410; e Gish and States (1993) Nature Genetics 3: 266-72. A porcentagem de
105/726 identidade reportada nessas tabelas teve como base a comparação dentro dessas janelas.
Tabela 1. Famílias genéticas e domínios B
SEQ ID NO de polipeptídeo Espécies/No. GID, N° de acesso ou identificador Domínio B Coordenadas de aminoácido para determinação da porcentagem de identidade % ID em relação ao domínio conservado de ligação de caixa de CCAAT do G481 (SEQ ID N°: 88)
88 At/G481 REQDRYLPIANISRIMK KALPPNGKIGKDAKDTV QECVSEFISFITSEASD KCQKEKRKTVNGDDLLW AMATLGFEDYLEPLKIY LARYRE 20-110 100%
806 Zm/G3434 REQDRFLPIANISRIMK KAVPANGKIAKDAKETL QECVSEFISFVTSEASD KCQKEKRKTINGDDLLW AMATLGFEEYVEPLKIY LQKYKE 18-108 85%
2102 At/G1364 REQDRFLPIANISRIMK 29-119 85%
106/726
RGLPANGKIAKDAKEIV QECVSEFISFVTSEASD KCQREKRKTINGDDLLW AMATLGFEDYMEPLKVY LMRYRE
800 Gm/G34 75 REQDRFLPIANVSRIMK KAL PANAKISKDAKETV QECVSEFISFITGEASD KCQREKRKTINGDDLLW AMTTLGFEDYVEPLKGY LQRFRE 23-113 84%
2010 AL/G485 REQDRFLPIANVSRIMK KAL PANAKIS KDAKETV QECVSEFISFITGEASD KCQREKRKTINGDDLLW AMTTLGFEDYVEPLKVY LQKYRE 20-110 84%
798 Gm/G3476 REQDRFLPIANVSRIMK KAL PANAKIS KDAKETV QECVSEFISFITGEASD KCQREKRKTINGDDLLW AMTTLGFEEYVEPLKIY LQRFRE 26-116 84%
2172 AL/G2345 REQDRFLPIANISRIMK RGLPLNGKIAKDAKETM 28-118 84%
107/726
QECVSEFISFVTSEASD KCQREKRKTINGDDLLW AMATLGFEDYIDPLKVY LMRYRE
90 At/G482 REQDRFLPIANVSRIMK KAL PANAKIS KDAKETM QECVSEFISFVTGEASD KCQKEKRKTINGDDLLW AMTTLGFEDYVEPLKVY LQRFRE 26-116 83%
801 Gm/G3472 REQDRFLPIANVSRIMK KAL PΑΝAKIS KEΑΚΕTV QECVSEFISFITGEASD KCQKEKRKTINGDDLLW AMTTLGFEEYVEPLKVY LHKYRE 25-115 83%
805 Zm/G3436 REQDRFLPIANVSRIMK KAL PΑΝΑΚIS KDAKETV QECVSEFISFITGEASD KCQREKRKTINGDDLLW AMTTLGFEDYVEPLKLY LHKFRE 20-110 83%
794 Os/G3397 REQDRFLPIANVSRIMK KALPANAKISKDAKETV QECVSEFISFITGEASD 23-113 82%
108/726
KCQREKRKTINGDDLLW AMTTLGFEDYVDPLKHY LHKFRE
790 Os/G3395 REQDRFLPIANISRIMK KAVPANGKIAKDAKETL QECVSEFISFVTSEASD KCQKEKRKTINGEDLLF AMGTLGFEEYVDPLKIY LHKYRE 19-109 82%
796 Os/G3398 REQDRFLPIANVSRIMK RAL PANAKIS KDAKETV QECVSEFISFITGEASD KCQREKRKTINGDDLLW AMTTLGFEDYIDPLKLY LHKFRE 21-111 81%
At/G1821 L1L NP_199578 REQDRFMPIANVIRIMR RILPAHAKISDDSKETI QECVSEYISFITGEANE RCQREQRKTITAE DVLW AMSKLGFDDYIEPLTLY LHRYRE 28-118 62%
At/ AAC39488 LEC1 REQDQYMPIANVIRIMR KTLPSHAKISDDAKETI QECVSEYISFVTGEANE RCQREQRKTITAE DILW 28-118 62%
109/726
AMSKLGFDNYVDPLTVF INRYRE
Abreviaturas: At = Arabidopsis thaliana
Gm = Glycine max
Os = Oryza sativa
Zm = Zea mays
G682 e os fatores de transcrição relacionados a MYB [0177] G682 é um elemento do grupo de fatores de
transcrição relacionados a MYB. G682 e suas sequências
correlatas foram incluídos no programa para testar a
capacidade dessas sequências de conferir o mesmo estresse
abiótico relacionado a estiagem, previamente observado por nós, nas linhagens 35S::G82.
[0178] Nós identificamos primeiro o G682 como um fator de transcrição putativo do Arabidopsis BAC, AF007269, com base na similaridade de sequência com outros elementos da família relacionada a MYB dentro do domínio conservado. Atualmente, nenhum dado funcional está disponível para esse gene na literatura. O gene corresponde ao At4G01060, comentado pela iniciativa do Genoma de Arabidopsis. G682 é um de uma classe de 5 elementos de proteínas correlatas que variam de tamanho entre 75 a 112 aminoácidos. Essas proteínas contêm uma repetição simples de MYB, que não é incomum para os fatores de transcrição de planta MYB. Informações relacionadas à função genética foram publicadas
110/726 para dos genes nessa classe, CAPRICE (CPC/G225) E TRIPTYCHON (TRY/G1816) . Informações publicadas com relação a função genética não estão disponíveis para dois elementos adicionais da classe; G226 e G2718. Em nosso programa genômico inicial, foi verificado que os elementos da classe G682 promovem alterações do tipo celular epidérmica quando superexpressos no Arabidopsis. Essas alterações incluem números aumentados de pelos de raiz em comparação às plantas do tipo selvagem, bem como redução no número de tricomas. Além disso, as linhagens de superexpressão para todos os elementos da classe, mostraram uma redução no acúmulo de antocianina em resposta ao estresse, e melhorou a tolerância à tensão osmótica. No caso das linhagens transgênicas 35S::G682, uma tolerância aumentada para condições de aquecimento alto foi também observada. Em razão das respostas fenotípicas para G682 e seus elementos de classe, um número dimensionável de elementos de classe foi incluído no estudo de estresse por estiagem. A tabela 2 resume os dados genômicos funcionais encontrados em nossa investigação do G682 e seus elementos de classe.
Tabela 2: Observações experimentais da classe G682
GID
Observações G226 G682 TRY (G1816) G2718
Redução no número de tricomas X X X X
Número de pelos aumentado na X X X X
111/726
raiz
Tolerância N X X X
Tolerância ao calor X
Tolerância ao sal X
Resposta ao açúcar X
[0179] Existem aproximadamente 50 elementos dessa família no Arabidopsis. 0 domínio de ligação de DNA relacionado a MYB contém cerca de 50 aminoácidos com uma série de resíduos altamente conservados dispostos com um espaçamento característico. As proteínas MYB de repetição simples não contêm um domínio de ativação de transcrição típico e isso sugere que eles possam funcionar por interferência com a formação ou atividade dos fatores de transcrição ou complexos de fator de transcrição (Wada e outros (1997) Science 277: 1113-1116; Schellmann e outros (2002) EMBO J. 21: 5036-5046) . Além disso, para a classe G682, dois fatores de transcrição bem caracterizados, CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 (CCA1/G214) (RELÓGIO CIRCADIANO ASSOCIADO1) e LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY/G680) (HIPOCÓTILO ALONGADO TARDIO) representam duas proteínas relacionadas a MYB, adicionais, bem caracterizadas, que contêm repetições simples de MYB (Wang e outros (1997) Plant Cell 9: 491-507; Schaffer e outros (1998) Cell 93: 1219-1229) .
[0180] As diferenças nas respostas fenotípicas das
112/726 linhagens de superexpressão de classe G682 (Tabela 2) juntamente com as diferenças nos fenótipos mutantes CPC (G225) e TRY (G1816) (Schellmann e outros (2002) supra), sugerem que cada um dos cinco genes Arabidopsis na classe possui funções distintas, porém de sobreposição na planta. No caso das linhagens transgênicas 35S::G682, foi observada uma tolerância melhorada às altas condições de calor. O calor pode causar tensão osmótica e é portanto consistente que essas linhagens transgênicas fossem também mais tolerantes ao estresse por estiagem em um ensaio a base de solo. Outro aspecto comum para quatro dos cinco elementos dessa classe é que eles melhoram o desempenho sob condições de limitação de nitrogênio. As plantas 35S::G682 não tinham essa característica na primeira rodada da classificação, porém em razão da natureza de alta produtividade do programa de genômicos, é possível que esse fenótipo tivesse sido observado se um número maior de linhagens tivesse sido examinado.
[0181] Todos os genes na classe Arabidopsis G682 reduziram os tricomas e aumentaram os pelos da raiz quando superexpressos constitutivamente (Tabela 2). Contudo, não se sabe, se os fenótipos de tolerância a estiagem nessas linhagens estão relacionados ao aumento nos pelos da raiz na epiderme da raiz. A densidade aumentada dos pelos da raiz pode aumentar na área de superfície de absorção e
113/726 aumentar nos transportadores de nitrato que são normalmente encontrados lá. Alternativamente, as mutações wer, ttgl e gl2, todas as quais aumentam a frequência da raiz e também mostraram causar formação de estomato ectópico na epiderme dos hipocitilos. Assim, é possível que CPC e TRY estivessem possivelmente envolvidos no desenvolvimento ou regulação dos estomatos (Hung e outros (1998) Plant Physiol. 117: 7384, 1998; Berger e outros (1998) Curr. Biol. 8: 421-430; Lee and Schiefelbein (1999) Cell 99: 473-483). As proteínas CPC (G225) e TRY (G1816) não foram reportadas como alterando a fadiga celular epidérmica do hipocótilo; contudo, a expressão ectópica pode ter resultado em uma alteração na produção de estomato nesse tecido. Uma vez que as alterações na produção do estomato poderíam alterar o estado de água da planta, elas devem ser examinadas nos transgênicos que expressam os genes da classe G682, especificamente nas linhagens que mostram tolerância aumentada a estiagem.
[0182] De modo interessante, nossos dados também sugerem que as linhagens de superexpressão G1816 {TRY) tiveram um fenótipo sensor de açúcar de glicose. Vários mutantes sensores de açúcar foram examinados como sendo alélicos ao ABA e mutantes etileno. Isso implica potencialmente em G1816 na sinalização hormonal.
[0183] Conforme observado seguir,
114/726 superexpressão de vários Arabidopsis e não Arabidopsis da subclasse G682 dos fatores de transcrição relacionados a MYTB conferiu tolerância ao estresse abiótico aumentada às plantas transgênicas, em comparação às plantas não transgênicas das mesmas espécies (isto é, a planta não transformada não superexpressa esses polipeptídeos).
[0184] A tabela 3 mostra os polipeptídeos
identificados pela SEQ ID N°: Número de Identificação do
Gene (GID); a família do fator de transcrição a qual o
polipeptídeo pertence, e domínios relacionados a MYB do
polipeptídeo. A primeira coluna mostra a SEQ ID NO do
polipeptídeo; a segunda coluna as espécies e GID; a
terceira coluna mostra o domínio relacionado a MYB; a
quarta coluna mostra as coordenadas de aminoácido do
domínio conservado que foram usadas para determinar a identidade de porcentagem daquele domínio conservado para o domínio relacionado a MYB do G682; e a quinta coluna mostra a porcentagem de identidade em relação a G682. As sequências são dispostas em ordem ascendente de porcentagem de identidade com relação a G682.
Tabela 3. Famílias genéticas e domínios relacionados a MYB
SEQ ID N°: Espécies/N° Domínio Coordenadas % ID de
de GID, N° de relacionado a MYB de aminoácido domínio
polipeptídeo acesso ou para conservado
115/726
identificador determinação da porcentagem relacionado
a MYB G682 de
148 At/G682 EWEVVNMSQEEEDLVSR MHKLVGDRWELIAGRIP GRT 27-63 100%
559 Os/G3393 AQNFVHFTEEEEDLVFR MHRLVGNRWELIAGRIP GRT 31-63 78%
2192 At/G2718 EWEEIAMAQEEEDLICR MYKLVGERWDLIAGRIP GRT 28-64 75%
1082 OS/G3392 AQNFVHFTEEEEDIVFR MHRLVGNRWELIAGRIP GRT 32-64 75%
1089 Zm/G3431 AQHLVDFTEAEEDLVSR MHRLVGNRWEIIAGRIP GRT 30-63 73%
1084 Gm/G3450 EWKVIHMSEQEEDLIRR MYKLVGDKWNLIAGRIP GRK 16-51 72%
2142 At/G1816 EWEFINMTEQEEDLIFR MYRLVGDRWDLIAGRVP GRQ 26-61 69%
1088 Gm/G3449 GSSKVEFSEDEETLIIR 26-58 69%
116/726
MYKLVGERWSLIAGRIP GRT
1087 Gm/G3448 GSSKVEFSEDEETLIIR MYKLVGERWSIIAGRIP GRT 26-58 66%
38 At/G226 EWEFISMTEQEEDLISR MYRLVGNRWDLIAGRVV GRK 34-69 63%
1086 Gm/G3446 QVSDVEFSEAEEILIAM VYNLVGERWSLIAGRIP GRT 26-58 60%
1083 Gm/G3445 QVSDVEFSEAEEILIAM VYNLVGERWSLIAGRIP GRT 25-57 60%
Abreviaturas: At Arabidopsis thaliana
Gm Glycina max
Os Oryza sativa
Zm Zea mays [0185] G682 e seus parálogos e ortólogos são compostos (quase que inteiramente) de um domínio de ligação de DNA de repetição simples MYB que é altamente conservado através das espécies de planta. Um alinhamento das proteínas semelhantes a G682 de Arabidopsis, soja, arroz e milho que são sendo analisadas em seu módulo de traço é mostrado nas Figuras 3A e 3B. Nenhuma função foi avaliada
117/726 para qualquer um desses genes relacionados a MYB fora do Arabidopsis.
[0186] Uma vez que os elementos da classe G682 são proteínas curtas que são compreendidas quase de exclusivamente de um motivo de ligação de DNA, é provável que eles funcionem como repressores. Isso é consistente nas análises de expressão indicando que CPC reprime sua própria transcrição, bem como as de WER e GL2 (Wada e outros (2002) supra; Lee and Schiefelbein (2002) supra). A repressão pode ocorrer em um nível de ligação de DNA através da competição com outros fatores em promotores alvo, embora a repressão através das interações de proteína-proteína não seja excluída.
A família AP2, incluindo as classes G47/G2133 e G1792 [0187] AP2 (APETALA2) e EREBPs (Ethylene-Responsive Element Binding Proteins) [Proteínas de Ligação de Elemento Sensível ao Etileno] são os elementos protótipos de uma família de fatores de transcrição única para as plantas, cuja característica de distinção é que eles contêm o assim chamado domínio de ligação de DNA AP2 (para uma revisão, vide Riechmann and Meyerowitz (1998) Biol. Chem. 379: 633646). O domínio AP2 foi primeiro reconhecido coo um motivo repetido dentro da proteína Arabidopsis thaliana AP2 (Jofuku e outros (1994) Plant Cell 6: 1211-1225). Pouco
118/726 após isso, quatro proteínas de ligação de DNA de tabaco foram identificadas, as quais interagiam com a sequência que é essencial para a resposta de alguns promotores ao etileno de hormônio da planta e foram denominadas como proteínas de ligação de elemento sensível ao etileno (EREBPs; Ohme-Takagi e outros (1995) Plant Cell 7: 173182) . 0 domínio de ligação de DNA de EREBP-2 foi mapeado para todas as quatro proteínas (Ohme-Takagi e outros (1995) supra}, e foi verificado que estava proximamente relacionado ao domínio AP2 (Weigel (1995) Plant Cell 7: 388-389) porém que não portava similaridade de sequência com relação aos motivos de ligação de DNA conhecidos anteriormente.
[0188] Os genes AP2/EREBP formam uma grande família, com muitos elementos conhecidos nas várias espécies de plantas (Okamuro e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 7076-7081; Riechmann and Meyerowitz (1998) supra). O número de genes de AP2/EREBP no genoma de Arabidopsis thaliana é de aproximadamente 145 (Riechmann e outros (2000) Science 290: 2105-2110). A classe APETALA2 é caracterizada pela presença de domínios de ligação de DNA AP2 e contém 14 genes. A AP2/ERF é a maior subfamília, e inclui 125 genes que estão envolvidos em respostas de estresse abiótico (subgrupo DREB) e biótico (subgrupo ERF) e o subgrupo RAV inclui 6 genes, onde todos possuem um
119/726 domínio de ligação de DNA B3 além do domínio de ligação de DNA AP2 (Kagaya e outros (1999) Nucleic Acids Res. 21: 470478) .
[0189] Arabidopsis AP2 está envolvido na especificação da identidade da sépala e da pétala através de sua atividade como um gene homeótico que faz parte do mecanismo genético combinatório da determinação da identidade do órgão floral e é também necessário para o desenvolvimento normal do óvulo e semente (Bowman e outros (1991) Development 112: 1-20; Jofuku e outros (1994) supra). Arabidopsis ANT é necessário para o desenvolvimento do óvulo e também desempenha um papel no crescimento do órgão floral (Elliott e outros (1996) Plant Cell 8: 155168; Klucher e outros (1996) Plant Cell 8: 137-153). Finalmente o milho G115 regula a identidade celular epidérmica da folha (Moose e outros (1996) Genes Dev. 10: 3018-3027) .
[0190] O ataque de uma planta por um agente patogênico pode induzir respostas de defesa que conduzem a resistência a invasão e essas respostas estão associadas à ativação de transcrição dos genes relacionados a defesa, entre eles aqueles codificando as proteínas relacionadas a patogênese (PR) . O envolvimento dos genes semelhantes a EREBP no controle da resposta de defesa da planta baseia-se na observação de que muitos promotores de gene PR contêm um
120/726 elemento de atuação cis curto que media sua resposta ao etileno (etileno parece ser uma das várias moléculas de sinal que controlam a ativação das respostas de defesa). As proteínas de tabaco EREBP-1, -2, -3, e -4, e de tomate Pti4, Pti5 e Pti6 mostraram reconhecer tais elementos de atuação cis (Ohme-Takagi (1995) supra; Zhou e outros (1997) EMBO J. 16: 3207-3218). Além disso, as proteínas Pti4, Pti5, e Pti6 mostraram interagir diretamente com Pto, uma proteínoquinase que confere resistência contra Pseudomonas syringae em tomates (Zhou e outros (1997) supra). Plantas que são desafiadas por condições ambientais adversas como frio e estiagem e proteínas semelhantes a EREBP parecem estar envolvidas nas respostas a esses estresses abióticos. A expressão genética COR (para regulada por frio) é induzida durante a aclimatação ao frio, o processo pelo qual as plantas aumentam sua resistência ao congelamento em resposta à temperaturas baixas não congelantes. O gene semelhante a EREBP CBF1 de Arabidopsis (Stockinger e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 1035-1040) é um regulador da resposta de aclimatização a frio, porque a expressão ectópica de CBF1 em plantas transgênicas Arabidopsis induziu a expressão genética de COR na ausência de um estímulo ao frio e a tolerância ao congelamento da planta foi aumentada (Jaglo-Ottosen e outros (1998) Science 280: 104-106). Finalmente, outro gene semelhante a EREBP de
121/726
Arabidopsis, ο ABI4, está envolvido na transdução do sinal do ácido abscísico (ABA), porque os mutantes abi4 são insensíveis ao ABA (ABA é um hormônio de planta que regular muitos aspectos agronomamente importantes do desenvolvimento da planta; Finkelstein e outros (1998) Plant Cell 10: 1043-1054).
A família SCR, incluindo a classe G922 [0191] O gene SCARECROW, que regula uma divisão celular assimétrica essencial à organização radial apropriada das camadas celulares da raiz, foi isolado do Arabidopsis thaliana por classificação de uma biblioteca genômica com sequências flanqueando uma inserção de T-DNA causando uma mutação scarecrow (Di Laurenzio e outros (1996) Cell 86, 423-433). O produto genético foi descrito, em uma tentativa, como um fator de transcrição com base na presença de estiramentos homopoliméricos de vários aminoácidos, a presença de um domínio básico semelhante aquele da família zipper leucina dos fatores de transcrição e a presença de repetições héptadas de leucina. A presença de vários ESTs de Arabidopsis com os produtos genéticos homólogos ao gene SCARECROW não foi observada. A capacidade do gene SCARECROW de complementar a mutação sacarecrow foi também demonstrada (Malamy e outros (1997) Plant J. 12, 957-963).
[0192] Mais recentemente,
RGA homólogo ao
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SCARECROW que codifica um regulador negativo da via de transdução de sinal de giberelina, foi isolado do Arabidopsis por subtração genômica (Silverstone e outros (1998) Plant Cell 10, 155-169) . O gene RGA mostrou ser expresso em muitos tecidos diferentes e a proteína RGA mostrou estar localizada no núcleo. O mesmo gene foi isolado por Truong (Truong e outros (1997) FEBS Lett. 410: 213-218) por identificação dos clones de cDNA que complementam um mutante de metabolismo de nitrogênio em levedura, sugerindo que RGA pode estar envolvido na regulação dos processos de metabolismo diverso. Outro homólogo de SCARECROW denominado GAI, que está também envolvido nos processos de sinalização de giberelina, foi isolado por Peng (Peng e outros (1997) Genes Dev. 11, 31943205). De forma interessante, GAI é gene que iniciou a Revolução Verde. Peng e outros (Peng e outros (1999) Nature 6741, 256-261) mostrou recentemente que os ortólogos de GAI do milho, quando mutados, resultam em plantas que são mais curtas, possuem produtividade de semente aumentada e são mais resistentes ao dano por chuva e vento que as plantas do tipo selvagem. Com base na inclusão dos genes GAI, RGA e SCR nessa família, ela também foi referida como a família GRAS (Pysh e outros (1999) Plant J 18, 111-19).
[0193] A família do gene scarecrow possui 32 elementos no genoma do Arabidopsis.
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A família NAC, incluindo a classe G2053 [0194] A família NAC é um grupo de fatores de transcrição que compartilham um domínio de terminal N altamente conservado de cerca de 150 aminoácidos, designados o domínio NAC (NAC substitui temporariamente Petúnia, NAM, e Arabidopsis, ATAF1, ATAF2 e CUC2). Acredita-se ser um novo domínio que está presente em ambas as plantas monocoto e dicoto, porém está ausente da levedura e proteínas animais. Cento e doze elementos da família NAC foram identificados no genoma de Arabidopsis. A classe NAC de proteínas pode ser dividida em pelo menos duas subfamílias com base nas similaridades da sequência de aminoácido dentro do domínio NAC. Uma subfamília é constituída ao redor das proteínas NAM e CUC2 (cotiledôneo em forma de taça), enquanto a outra subfamília contém fatores com um domínio NAC semelhante aquele de ATAF1 e ATAF2.
[0195] Assim, pouco é conhecido sobre a função dos diferentes elementos da família NAC. Isso é surpreendente, visto que existem 113 elementos no Arabidopsis. Contudo, pensa-se que NAM, CUC1 e CUC2 tenham papéis vitais na regulação do embrião e desenvolvimento da flor. Na Petúnia, os embriões de mutante NAN não desenvolvem um meristema apical de broto (SAM) e possuem cotilédones fundidos. Esses mutantes, algumas vezes, geram brotos escape que produzem
124/726 flores defeituosas com pétalas extras e órgãos fundidos. No Arabidopsis, as mutações cucl e cuc2 possuem efeitos algo semelhantes, causando defeitos na formação de SAM e a separação dos cotilédones, sépalas e estames.
[0196] Embora os mutantes nam e cuc exibam defeitos comparáveis durante a embriogênese, a penetração desses fenótipos é muito inferior nos mutantes cuc. A redundância dos genes CUC no Arabidopsis pode explicar essa observação. Em termos de fenótipo de flor, existem diferenças notáveis entre os mutantes nam e cuc. As flores dos mutantes cuc não contém órgãos órgãos adicionais e a formação das sépalas e estames é fortemente afetada. Nos mutantes nam, em contraste, as flores transportam órgãos adicionais e formação da pétala é mais notavelmente afetada que a dos outros órgãos florais. Essas diferenças aparentes podem ser explicadas de duas formas: as proteínas NAM e CUC foram recrutadas em dois papéis diferentes no desenvolvimento das flores de Arabidopsis e da Petúnia. Alternativamente, as proteínas compartilhariam uma função comum entre as duas espécies, com os fenótipos florais mutantes diferentes surgindo de variações no modo em que outros genes (que participam nos mesmos processos de desenvolvimento) são afetados por defeitos em NAM ou CUC.
[0197] Um gene adicional dessa família, NAP (ativado como NAC por AP3/PI) está também envolvido no
125/726 desenvolvimento da flor e pensa-se que influencie a transição entre a divisão da célula e a expansão da célula nos estames e pétalas. No total, então, as proteínas NAC parecem regular, principalmente, os processos de desenvolvimento.
Produção dos Polipeptideos [0198] Os polinucleotídeos da invenção incluem sequências que codificam fatores de transcrição e polipeptideos homólogos de fator de transcrição e sequências complementares aos mesmos, bem como fragmentos únicos de codificação de sequência ou sequência complementar aos mesmos. Tais polinucleotídeos podem ser, por exemplo, DNA ou RNA, por exemplo, mRNA, cRNA, RNA sintético, DNA genômico, DNA sintético de dDNA, oligonucleotídeos, etc. Os polinucleotídeos são tanto de filamento duplo ou filamento simples e incluem cada ou ambas sequências de sentido (isto é, codificação) e sequências de anti-sentido (isto é, não codificação, complementares). Os polinucleotídeos incluem a sequência de codificação de um fator de transcrição ou polipeptideo homólogo ao fator de transcrição, em isolamento, em combinação com sequências de codificação adicionais (por exemplo, um marcador de purificação, um sinal de localização, como uma proteína de fusão, como uma préproteína ou semelhante), em combinação com sequências de
126/726 não codificação (por exemplo, introns ou inteinas, elementos reguladores, tais como, promotores, melhoradores, terminadores e semelhantes) e/ou em um ambiente de vetor ou hospedeiro, onde o polinucleotideo codificando um fator de transcrição ou polipeptideo homólogo ao fator de transcrição é um gene endógeno ou exógeno.
[0199] Existem vários processos para produção de polinucleotideos da invenção. Os procedimentos para identificação e isolamento de clones de DNA, são bem conhecidos dos versados na técnica e são descritos, por exemplo, em Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 13, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros eds. , Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (suplementado através do ano de 2000) (Ausubel).
[0200] Alternativamente, os polinucleotideos da invenção, podem ser produzidos por uma variedade de processos de ampliação in vitro adaptados para a presente invenção, por seleção apropriada dos iniciadores específicos ou degenerados. Exemplos de protocolos suficientes para direcionar os versados na técnica nos
127/726 processos de ampliação in vitro, incluindo a reação da cadeia da polimerase (PCR), a reação da cadeia de ligase (LCR), a ampliação de Qbeta-replicase e outras técnicas mediadas por polimerase de RNA (por exemplo, NASBA), por exemplo, para produção de ácidos nucleicos homólogos da invenção, são encontradas em Berger (supra), Sambrook (supra), e Ausubel (supra), bem como em Mullis e outros (1987) PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis e outros eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis). Processos aperfeiçoados para clonagem in vitro de ácidos nucleicos ampliados são descritos em Wallace e outros, Patente US número 5,426,039. Processos aperfeiçoados para ampliação de ácidos nucleicos grandes por PCR são resumidos em Cheng e outros (1994) Nature 369: 684-685 e nas referências citadas aqui, nas quais os amplicons de PCR de até 40kb são gerados. Um versado na técnica apreciará que essencialmente, qualquer RNA pode ser convertido em um DNA de filamento duplo apropriado para digestão por restrição, expansão de PCR e sequenciamento usando transcriptase reversa e uma polimerase. Vide, por exemplo, Ausubel, Sambrook and Berger, todos supra.
[0201] Alternativamente, os polinucleotideos e oligonucleotideos da invenção podem ser montados de fragmentos produzidos por processos de síntese de fase sólida. Tipicamente, os fragmentos de até cerca de 100
128/726 bases são sintetizados individualmente e então enzimática ou quimicamente ligados para produzir uma sequência desejada, por exemplo, um polinucleotideo codificando todo ou parte do fator de transcrição. Por exemplo, a síntese química usando o processo de fosforamidita é descrita, por exemplo, por Beaucage e outros (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869; e Matthes e outros (1984) EMBO J. 3: 801805. De acordo com tais processos, os oligonucleotídeos são sintetizados, purificados, recombinados para os seus filamentos complementares, ligados e então opcionalmente clonados nos vetores apropriados. Também, se desejado, os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção podem ser solicitados a uma variedade de fornecedores comerciais.
Sequências Homólogas [0202] Sequências homólogas, isto é, que compartilham identidade ou similaridade de sequência significativa em relação aquelas providas na Listagem de Sequências, derivadas de Arabidopsis thaliana ou de outras plantas de escolha, são também um aspecto da invenção. Sequências homólogas podem ser derivadas de qualquer planta incluindo monocotos e dicotos e especificamente, espécies de plantas agricolamente importantes, incluindo, porém não limitado as colheitas, tais como, de soja, trigo, milho, batata, algodão, arroz, colza, óleo de semente de colza (incluindo canola), girassol, alfafa, trevo, cana de açúcar
129/726 e turfa; ou frutos e vegetais, tais como, banana, vacinio, morango e framboesa, cantalupo, cenoura, couve-flor, café, pepino, berinjela, uvas, espécie de melão, alface, manga, melão, cebola, mamão papaia, ervilhas, pimentas, abacaxi, abóbora, espinafre, espécie de abóbora, milho para pipoca, tabaco, tomate, tomatinho, melão, frutas rosáceas (tais como, maçã, pêssego, pêra, cereja e ameixa) e vegetais brassica (tais como, brócolis, repolho, couve-flor, couveflor de Bruxelas, e couve-rábano). Outras colheitas, incluindo frutos e vegetais, cujo fenótipo pode ser alterado e que compreendem sequências homólogas incluem: cevada, centeio, painço; sorgo, groselha, abacate, frutas cítricas, tais como, laranjas, limões, toranja e tangerinas, alcachofra, cerejas, tipos de nozes, tais como, noz e amendoim; endívia, alho-porro; raízes, tais como, araruta, beterraba, mandioca, nabo, rabanete, inhame e batata doce; e feijões. As sequências homólogas podem também ser derivadas de espécies lenhosas, tais como, pinho, álamo e eucalipto ou menta ou seus labiados. Além disso, sequências homólogas podem ser derivadas de plantas que estão evolucionariamente relacionadas às plantas de colheita, porém que podem não ter ainda uso usadas como plantas de colheita. Exemplos incluem [0203] beladona (Atropa belladona), relacionada ao tomate; estramônio (Datura strommium) relacionada ao
130/726 peiote; e teosinto (espécie de milho Zea), relacionado ao milho.
Ortólogos e Parólogos [0204] Sequências homólogas conforme descritas acima, podem compreender sequências ortólogas ou parálogas. Vários processos diferentes são conhecidos pelos versados na técnica para identificar e definir essas sequências funcionalmente homólogas. Três processos em geral para definição de ortólogos e parálogos são descritos; e ortólogo ou parálogo, incluindo equivalentes, podem ser
identificados por um versado nos processos descritos a
seguir.
[0205] Os ortólogos e parálogos são genes
evolucionariamente relacionados que possuem sequência e
funções semelhantes. Os ortólogos são genes estruturalmente relacionados em diferentes espécies que são derivados de um evento formação de espécies. Parálogos são genes estruturalmente relacionados dentro de espécie simples que são derivados de um evento de duplicação.
[0206] Dentro da espécie simples de planta, a duplicação do gene pode levar a duas cópias de um gene específico, dando surgimento a dois ou mais genes com sequência semelhante e frequentemente função semelhante, conhecidos como parálogos. Um parálogo, portanto, é um gene semelhante formado por duplicação dentro da mesma espécie.
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Parálogos tipicamente agrupam-se ou estão na mesma classe (um grupo de genes semelhantes) quando uma filogenia de família genética é analisada usando programas tais como, CLUSTAL (Thompson e outros (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680; Higgins e outros (1996) Methods Enzymol. 266: 383-402). Grupos de genes semelhantes podem também ser identificados com análise BLAST de paridade (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 25: 351-360). Por exemplo, uma classe de fatores de transcrição de domínio MADS muito semelhantes do Arabidopsis onde todos compartilham de uma função comum na época da floração (Ratcliffe e outros (2001) Plant Physiol. 126: 122-132), e um grupo de fatores de transcrição de domínio AP2 muito semelhante do Arabidopsis que estão envolvidos na tolerância das plantas ao congelamento (Gilmour e outros (1998) Plant J. 16: 433442). A análise dos grupos de genes semelhantes com função semelhante que encontram-se dentro de uma classe pode render subsequentes que são específicas à classe. Essas subsequências, conhecidas como sequências de consenso, podem não apenas ser usadas para definirem as sequências dentro de cada classe, porém definem as funções desses genes; genes dentro de uma classe podem conter sequências parálogas ou sequências ortólogas que compartilham a mesma função (vide também, por exemplo, Mount (2001), in Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring
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Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, página 543. ) [0207] Ά especificação, a produção de novas espécies de uma espécie parenteral pode também fornecer dois ou mais genes com sequência e função semelhantes. Esses genes, denominados ortólogos, frequentemente possuem uma função idêntica dentro de suas plantas hospedeiras e são frequentemente intercambiáveis entre espécies sem perder a função. Uma vez que as plantas possuem ancestrais comuns, muitos genes nas espécies de planta terão um gene ortólogos correspondente em outras espécies de planta. Uma vez que uma árvore filogênica para uma família de genes de uma espécie foi construída usando um programa tal como o CLUSTAL (Thompson e outros (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680; Higgins e outros (1996) supra) sequências ortólogas em potencial podem ser colocadas na árvore filogenética e seu relacionado com os genes da espécie de interesse pode ser determinado. Sequências ortólogas podem também ser identificadas por estratégia BLAST recíproca. Uma vez que a sequência ortóloga tiver sido identificada, a função do ortólogo pode ser deduzida da função identificada da sequência de referência.
[0208] As sequências genéticas de fator de transcrição são conservadas através de diversas linhagens da espécie eucariótica (Goodrich e outros (1993) Cell 75:
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519-530; Lin e outros (1991) Nature 353: 569-571; Sadowski e outros (1988) Nature 335: 563-564) e outros. As plantas não são exceção a essa observação; diversas espécies de planta possuem fatores de transcrição que possuem sequências e funções semelhantes.
[0209] Genes ortólogos de organismos diferentes possuem funções altamente conservadas e muito frequentemente funções essencialmente idênticas (Lee e outros (2002) Genome Res. 12: 493-502; Remm e outros (2001) J. Mol. Biol. 314: 1041-1052). Genes parálogos, que divergiram durante a duplicação genética, podem manter funções semelhantes das proteínas codificadas. Em tais casos, parálogos podem ser usados intercambiavelmente com relação a determinadas concretizações da presente invenção (por exemplo, expressão transgênica de uma sequência de codificação). Um exemplo de tais parálogos altamente relacionados é a família CBF, com três elementos bem definidos na Arabidopsis e pelo menos um ortólogo em Brassica napus (SEQ ID NoS: 1956, 1958, 1960, ou 2204, respectivamente), todos os quais controlam as vias envolvidas em estresses de congelamento e estiagem (Gilmour e outros (1998) Plant J. 16: 433-442; Jaglo e outros (1998) Plant Physiol. 127: 910-917).
[0210] As referências que se seguem representam uma pequena amostra dos muitos estudos que demonstram que os
134/726 genes de fator de transcrição conservados de espécies diversas provavelmente funcionam de modo semelhante (isto é, regulam sequências alvo semelhantes e controlam os mesmos traços) e estes fatores de transcrição podem ser transformados em diversas espécies para conferir ou aperfeiçoar os traços.
[0211] O gene NPR1 do Arabidopsis NPR1 regula a resistência sistêmica adquirida (SAR); a superexpressão de NPR1 leva à resistência melhorada no Arabidopsis. Quanto tanto o NPR1 do Arabidopsis ou o ortólogo de NPR1 do arroz for superexpresso no arroz (que, como um monocoto, é diverso do Arabidopsis), o desafio com o agente patogênico de pragas bacterianas em arroz Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, as plantas transgênicas mostraram resistência melhorada (Chern e outros (2001) Plant J. 27: 101-113). O NPR1 atua através da ativação da expressão dos genes do fator de transcrição, tais como TGA2 (Fan and Dong (2002) Plant Cell 14: 1377-1389).
[0212] Os genes E2F estão envolvidos na transcrição dos genes das plantas para proliferação do antigeno nuclear de célula (PCNA) . Os E2Fs de planta compartilham um alto grau de similaridade na sequência de aminoácido entre os monocotos e dicotos e são mesmo semelhantes aos domínios conservados do E2Fs do animal. Tal conservação indica que uma similaridade funcional entre os E2Fs de planta e de
135/726 animais. Os fatores de transcrição de E2Fs que regulam o desenvolvimento do meristema atuam através de elementos cis comuns e regularam os genes (PCNA) correlatos (Kosugi and Ohashi, (2002) Plant J. 29: 45-59).
[0213] O gene ABI5 (insensível ao ácido abscísico (ABA) 5) codifica um fator zipper de leucina básico necessário para resposta ABA nas sementes e tecidos vegetais. Experimentos de co-transformação com construções cDNA ABI5 em protoplastos de arroz resultaram em transativação específica de promotores do trigo, Arabidopsis, feijão e cevada induzidos por ABA. Esses resultados demonstram que fatores de transcrição de ABI5 seqüencialmente semelhantes são alvos chave de uma via de sinalização de ABA conservada em diversas plantas. (Gampala e outros (2001) J. Biol. Chem. 277: 1689-1694).
[0214] Sequências dos três genes semelhantes a GAMYB de Arabidopsis foram com base na similaridade da sequência para genes GAMYB de cevada, arroz e L. temulentum. Esses três genes de Arabidopsis foram determinados como codificando fatores de transcrição (AtMYB33, AtMYB65, e AtMYBlOl) e substituiríam GAMYB de cevada e expressão de alfa-amilase de controle (Gocal e outros (2001) Plant Physiol. 127: 1682-1693).
[0215] O gene LEAFY de controle floral do Arabidopsis pode acelerar dramaticamente a floração em
136/726 várias plantas dicotiledôneas . A expressão constitutiva de LEAFY do Arabidopsis também causaram floração precoce no arroz transgênico (um monocoto), com uma data principal que era de 26-34 dias precocemente em relação aquelas plantas do tipo selvagem. Essas observações indicam que os genes reguladores florais do Arabidopsis são ferramentas úteis para aperfeiçoar a data principal em colheitas de cereal (He e outros (2000) Transgenic Res. 9: 223-227).
[0216] Giberelinas bioativas (GAs) são reguladores endógenos essenciais do crescimento da planta. A sinalização de GA tende a ser conservada através do reino vegetal. A sinalização de GA é mediada através de GAI, um elemento nuclear da família GRAS dos fatores de transcrição de planta. GAI do Arabidopsis mostrou funcionar em arroz para inibir as vias de resposta de giberelina (Fu e outros (2001) Plant Cell 13: 1791-1802).
[0217] O gene SUPERMAN (SUP) do Arabidopsis, codifica um fator de transcrição putativa que mantém os limites entre estames e carpelos. Quando da superexpressão de SUP de Arabidopsis no arroz, o efeito da presença do gene nos limites do verticilo mostrou ser conservado. Isso demonstrou que SUP é um regulador conservado dos limites florais do verticilo e afeta a proliferação celular (Nandi e outros (2000) Curr. Biol. 10: 215-218).
[0218] Os fatores de transcrição myb de milho,
137/726 petúnia e Arabidopsis que regulam a biossíntese do flavonóide são geneticamente muito semelhantes e afetam os mesmos traços em suas espécies nativas, portanto, a sequência e função desses fatores de transcrição myb correlacionam-se nessas espécies diversas (Borevitz e outros (2000) Plant Cell 12: 2383-2394).
[0219] Os genes de altura-1 reduzida do trigo (RhtBl/Rht-Dl) e milho anão-8 (d8) são ortólogos do gene insensível a giberelina (GAI) do Arabidopsis. Ambos os genes foram usados para produzir variedades de grãos anões que possuem produtividade de grão aperfeiçoada. Esses genes codificam proteínas que lembram fatores de transcrição nucleares e contém um domínio semelhante a SH2, indicando que a fsfotirosina pode participar na sinalização de giberelina. As plantas de arroz transgênicas contendo um alelo de GAI mutante do Arabidopsis mostraram produzir respostas reduzidas à giberelina e são anãs, indicando que os ortólogos de GAI mutantes seriam usados para aumentar a produtividade em uma ampla faixa de espécies de colheita (Peng e outros (1999) Nature 400: 256-261).
[0220] Os fatores de transcrição que são homólogos às sequências listas tipicamente compartilharão, em pelo menos um domínio conservado, pelo menos cerca de 70% de identidade da sequência de aminoácido e com relação aos fatores de transcrição de dedo de zinco, pelo menos cerca
138/726 de 50% de identidade de sequência de aminoácido. Fatores de transcrição mais proximamente correlatos podem compartilhar pelo menos cerca de 70%, ou cerca de 75%, cerca de 80% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou cerca de 98% ou mais de identidade de sequência com as sequências listas ou com as sequências listadas, exceto uma sequência de consenso conhecida ou sitio de ligação de DNA de consenso, ou com as sequências listadas excluindo um ou todos os domínios conservados. Os fatores que estão mais proximamente correlatos às sequências listadas compartilham, por exemplo, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95% ou mais da identidade da sequência em relação as sequências listas ou em relação às sequências listadas, exceto a sequência de consenso conhecida ou sitio de ligação de DNA de consenso ou fora um ou todos os domínios conservados. No nível do nucleotídeo, as sequências tipicamente compartilharão pelo menos 40% de identidade da sequência de nucleotídeo, preferivelmente pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% da identidade da sequência e, mais preferivelmente, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 97% ou mais da identidade da sequência em relação a uma ou mais das sequências listadas, ou a uma sequência listada, exceto ou fora uma sequência de consenso conhecida ou sítio de ligação de DNA de consenso ou exceto um ou todos os domínios conservados. A
139/726 degeneração do código genético permite variações maiores na sequência de nucleotideo de um polinucleotideo embora mantendo a sequência de aminoácido da proteína codificada. Domínios conservados dentro de uma família de fator de transcrição podem exibir um fator maior de homologia de sequência, tais como, pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácido incluindo substituições de conservação e, preferivelmente, pelo menos 80% de identidade de sequência, e mais preferivelmente pelo menos
85%, ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de
87%, ou pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de
90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%
de identidade de sequência. Fatores de transcrição que são homólogos às sequências listadas compartilhariam, pelo menos 30%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência
de aminoácido em relação a todo o comprimento do
polipeptídeo ou o homólogo.
[0221] A porcentagem de identidade pode ser
determinada eletronicamente, por exemplo, usando um
programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.). O programa MEGALIGN pode criar alinhamentos entre duas ou mais sequências de acordo com os diferentes processos, por exemplo, o processo de grupamento. (Vide, por exemplo,
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Higgins and Sharp (1988) Gene 73: 237-244.). O algoritmo de agrupamento reúne as sequências em agrupamentos por exame das distâncias entre todos os pares. Os agrupamentos são alinhados em pares e então em grupos. Outros algoritmos de alinhamento ou programas podem ser usados, incluindo FASTA, BLAST, ou ENTREZ, FASTA e BLAST, e podem ser usados para calcular a porcentagem de similaridade. Esses encontram-se disponíveis com parte do pacote de análise de sequência GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), e podem ser usados com ou sem ajustes default. ENTREZ encontra-se disponível através do National Center for Biotechnology Information. Em outra concretização, a porcentagem de identidade de duas sequências pode ser determinada pelo programa GCG com um peso de fenda de 1, por exemplo, cada feda de aminoácido é pesada e se ela fosse um aminoácido simples ou combinação de nucleotídeo entre as duas sequências (vide Patente US número 6,262,333).
[0222] Outras técnicas para alinhamento são descritas em Doolittle, R. F. (1996) Methods in Enzymology: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis, vol. 266, Academic Press, Orlando, FL, USA. Preferivelmente, um programa de alinhamento que permita fendas na sequência é utilizado para alinhar as sequências. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite fendas nos alinhamentos de sequência (vide Shpaer (1997) Methods Mol. Biol. 70: 173
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187) . Também, o programa GAP usando o processo de alinhamento Needleman e Wunsch pode ser utilizado para alinhar sequências. Uma estratégia de pesquisa alternativa emprega o software MPSRCH, que opera em um computador MASPAR. O MPSRCH utiliza um algoritmo Smith-Waterman para classificar sequências em um computador massivamente paralelo. Essa abordagem aperfeiçoa a capacidade de recolher combinações relacionadas de forma distante e é especificamente tolerante as pequenas fendas e erros da sequência de nucleotideo. Sequências de aminoácido codificadas de ácido nucleico podem ser usadas para pesquisar ambas bases de dados da proteína e do DNA.
[0223] A porcentagem de similaridade entre duas sequências de polipeptideo, por exemplo, sequência A e sequência B, é calculada por divisão do comprimento da sequência A, menos o número de resíduos de fenda na sequência A, menos o número de resíduos de fenda na sequência B, na soma das combinações de resíduo entre a sequência A e a sequência B, vezes cem. As fendas de pouca ou nenhuma similaridade entre as duas sequências de aminoácido não estão incluídas na determinação da porcentagem de similaridade. O percentual de identidade entre as sequências de polinucleotídeo pode também ser contabilizado ou calculado por outros processos conhecidos na técnica, por exemplo, o processo Jutun Hein. (Vide, por
142/726 exemplo, Hein (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645.) A identidade entre as sequências pode também ser determinada por outros fatores conhecidos na técnica, por exemplo, por variação das condições de hibridização (vide, Pedido de Patente US número 20010010913).
[0224] A percentagem de identidade entre dois domínios conservados de uma sequência de polipeptídeo de consenso de domínio de ligação de DNA de fator de transcrição pode ser tão baixa quanto 16%, conforme exemplificado no caso da família GATA1 dos fatores de transcrição de dedo de zinco do tipo Cys2/Cys2 eucariótico. A sequência de polipeptídeo de consenso de domínio de ligação de DNA da família GATA1 é CX2CX17CX2C, onde X é o resíduo de aminoácido. (Vide, por exemplo, Takatsuji, supra). Outros exemplos de tais sequências de polipeptídeo de consenso conservadas com porcentagem baixa de identidade de sequência são bem conhecidos dos versados na técnica.
[0225] Assim, a invenção provê processos para identificação de uma sequência semelhante ou parálogos ou ortólogos ou homólogos a um ou mais polinucleotídeos conforme citados aqui, ou um ou mais polipeptídeos alvo codificados pelos polinucleotídeos, ou de outra forma observados aqui e podem incluir ligação ou associação a um dado fenótipo de planta ou função do gene com uma sequência. Nesses processos, a base de dados da sequência é
143/726 provida (localmente ou através da Internet ou intranet) e uma questão é formulada contra a base de dados da sequência usando sequências relevantes aqui e fenótipos de planta ou funções de gene associados.
[0226] Além disso, uma ou mais sequências de polinucleotideo ou um ou mais polipeptídeos codificados pelas sequências de polinucletídeo podem se usadas para pesquisa contra um BLOCKS (Bairoch e outros (1997) Nucleic Acids Res. 25: 217-221), PFAM, e outras bases de dados que contêm motivos anotados e identificados anteriormente, sequências e funções genéticas. Os processos que pesquisam o padrão da sequência primária com penalidades de fenda de estrutura secundária (Smith e outros (1992) Protein Engineering 5: 35-51), bem como algoritmos, tais como, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul e outros (1990) supra}, BLOCKS (Henikoff and Henikoff (1991) Nucleic Acids Res. 19: 6565-6572), Hidden Markov Models (HMM; Eddy (1996) Curr. Opin. Str. Biol. 6: 361-365; Sonnhammer e outros (1997) Proteins 28: 405-420), e semelhantes, podem se usados para manipular e analisar sequências de polinucleotideo e polipeptídeo codificadas por polinucleotideos. Essas bases de dados, algoritmos e outros processos são bem conhecidos na arte e são descritos em Ausubel e outros (1997; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New
144/726
York, NY, unit 7,7) e em Meyers (1995; Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York, NY, p 856-853).
[0227] Adicionalmente, os processos usando alinhamento manual de sequências semelhantes ou homólogas a uma ou mais sequências de polinucleotideo ou um ou mais polipeptideos codificados pelas sequências de polinucleotideo podem ser usados para identificar regiões de similaridade dos domínios conservados. Tais processos manuais são bem conhecidos dos versados na técnica e podem incluir, por exemplo, comparações de estrutura terciária entre uma sequência de polipeptídeo codificada por um polipeptídeo que compreende uma função conhecida com uma sequência de polipeptídeo codificada por uma sequência de polinucleotideo que possui uma função ainda não determinada. Exemplos de tal estrutura terciária podem compreender hélices alfa previstas, beta-lâminas, hélices antipáticas, motivos zipper leucina, motivos dedo de zinco, regiões ricas em prolina, motivos de repetição de cisteína e semelhantes.
[0228] Ortólogos e parálogos dos fatores de transcrição presentemente revelados podem ser clonados usando composições providas pela presente invenção, de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. cDNAs podem ser clonados usando mRNA de uma célula de planta ou tecido que expressa um dos presentes fatores de
145/726 transcrição. Fontes de mRNA apropriadas podem ser identificadas por interrogação de Northern blots com sondas designadas das sequências de fator de transcrição presentes, após o que, uma biblioteca é preparada do mRNA obtido de uma célula ou tecido positivo. 0 cDNA codificando o fator de transcrição é então isolado usando, por exemplo, PCR, usando iniciadores designados de uma sequência genética de fator de transcrição presentemente revelada ou por uso de sondas com um cDNA parcial ou completo ou com um ou mais conjuntos de sondas de degeneração com base nas sequências reveladas. A biblioteca de cDNA pode se usada para transformar células de plantas. A expressão dos cDNAs de interesse é detectada usando, por exemplo, processos revelados aqui, tais como, microfileiras, Northern blots, PCR quantitativo ou qualquer outra técnica para monitorar alterações na expressão. Os clones genômicos podem ser isolados suando técnicas semelhantes àquelas.
[0229] Além das Sequências listadas na Listagem de Sequências, a invenção engloba sequências de nucleotídeo isoladas que são sequencial e estruturalmente semelhantes a G481, G482, G485, e G682, SEQ ID N° : 87, 89, 2009, e 147, respectivamente, e funcionam em uma planta de modo semelhante a G481, G482, G485 e G867 regulando a tolerância ao estresse abiótico.
[0230] As sequências de nucleotídeo da subclasse
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G482 da classe não semelhante a LEC1 de proteínas da família do fator de transcrição CCAAT relacionado a L1L, incluindo G481, compartilham pelo menos 81% de identidade em seus domínios B com o domínio B de G481 (Tabela 1) . As sequências fora dessa subclasse, incluindo L1L (NP_199578) e LEC1 (AAC39488) compartilham significativamente menos identidade com G481 (Tabela 1), são filogeneticamente distintas dos elementos dessa subclasse (figuras 6 e 7) e parecem funcionar no desenvolvimento embriônico ao invés de na tolerância ao estresse abiótico, conforme citado acima.
[0231] Uma vez que os elementos dessa subclasse são filogeneticamente relacionados, semelhantes seqüencialmente e um número representativo de espécies de plantas diversas têm sido mostrado como regulando a tolerância abiótica, um versado na técnica preverá que outras sequências semelhantes, filogeneticamente correlatas também regulariam a tolerância ao estresse abiótico.
[0232] Semelhante à subclasse G481, G682 e sequências semelhantes na subclasse G682 dos fatores de transcrição relacionados a MYB são filogeneticamente correlatas, seqüencialmente semelhantes e um número representativo de diversas espécies de planta têm sido mostrado como regulando a tolerância ao estresse abiótico. Isso levaria um versado na técnica a delinear conclusões semelhantes com relação à regulação dessas sequências da
147/726 tolerância ao estresse abiótico. Um número representativo de elementos dessa classe, incluindo sequências derivadas de diversas espécies não Arabidopsis, mostrou conferir tolerância ao estresse abiótico quando superexpressa. Essas sequências mostraram compartilhar com 60% da identidade em seus domínios relacionados a MYB (Tabela 3).
Identificação de Polinucleotídeos ou Ácidos Nucleicos por Hibridização [0233] Polinucleotídeos homólogos às sequências ilustradas na Listagem de Sequências e tabelas podem ser identificados, por exemplo, por hibridização em relação um ao outro, sob condições estringentes ou altamente estringentes. Polinucleotídeos de filamento simples hibridizam quando associam-se com base em uma variedade de forças físico-químicas bem caracterizadas, tais como, ligação de hidrogênio, exclusão de solvente, empilhamento de base e semelhantes. A estringência de uma hibridização reflete o grau de identidade da sequência dos ácidos nucleicos envolvidos, tal que, quanto maior a estringência, mais semelhante são os dois filamentos de polinucleotideo. A estringência é influenciada por vários fatores, incluindo temperatura, concentração de sal e composição, aditivos orgânicos e não orgânicos, solventes, etc. presentes tanto nas soluções de hibridização quanto de lavagem e incubações (e vários destes), conforme descrito em maiores detalhes
148/726 nas referências citadas aqui acima.
[0234] As sequências de polinucleotídeo que são capazes de hibridizar com relação às sequências de polinucleotídeo reivindicadas são englobadas na presente invenção, incluindo quaisquer um dos polinucleotídeos de fator de transcrição dentro da Listagem de Sequências e fragmentos dos mesmos sob várias condições de estringência (Vide, por exemplo, Wahl and Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; and Kimmel (1987) Methods Enzymol. 152: 507511). Além das sequências de nucleotídeo listadas nas Tabelas 7 e 8, o cDNA de comprimento pleno, ortólogos e parálogos das presentes sequências de nucleotídeos podem ser identificados e isolados usando processos bem conhecidos. Os ortólogos de bibliotecas de cDNA e parálogos das presentes sequências de nucleotídeo podem ser classificados usando processos de hibridização para determinar sua utilidade como alvo de hibridização ou sondas de ampliação.
[0235] Com relação à hibridização, as condições que são altamente estringentes, e meios para obtenção das mesmas, são bem conhecidos na arte. Vide, por exemplo, Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory); Berger and Kimmel, eds., (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, In Methods in
149/726
Enzymology: 152 : 467-469; e Anderson and Young (1985) Quantitative Filter Hybridisation. In: Hames and Higgins, ed. , Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach. Oxford, IRL Press, 73-111.
[0236] A estabilidade dos duplexos de DNA é afetada por fatores, tais como, composição da base, comprimento e grau de combinação do par de base. As condições de hibridização podem ser ajustadas para permitir que DNAs de diferentes relações de sequências hibridizem. A temperatura de fusão (Tm) é definida como a temperatura quando 50% das moléculas de duplexo se dissociaram em seus filamentos de constituição simples. A temperatura de fusão de um duplexo perfeitamente combinado, quando o tampão de hibridização contém formamida como um agente desnaturante, pode ser estimada pela seguinte equação:
DNA-DNA: Tra(°C)=81,5 + 16,6(log [Na+])+0,41(% G+C)0,62(% formamida)-500/1
DNA-RNA: Tm (°C)=79,8+ 18,5(log [Na+])+0,58(% G+C) + 0,12(%G+C)2 - 0,5(% formamida) - 820/1
RNA-RNA: Tm (°C)=79,8 + 18,5(log [Na+])+0,58(% G+C) + 0,12(%G+C)2 - 0,35(% formamida) - 820/1 onde L é o comprimento do duplexo formado, [Na+] é a concentração molar de ion sódio na solução de hibridização ou lavagem e % G+C é a porcentagem de bases (guanina + citosina) no híbrido. Para híbridos
150/726 perfeitamente combinados, cerca de 1°C é necessário para reduzir a temperatura de fusão para cada l-% de combinação.
[0237] Experimentos de hibridização são geralmente conduzidos em um tampão de pH entre 6,8 a 7,4, embora a razão de hibridizaçaõ seja proximamente independente do pH em resistências iônicas provavelmente para ser usada no tampão de hibridização (Anderson e outros (1985) supra). Além disso, um ou mais dos que se seguem podem ser usados para reduzir a hibridização não específica: DNA de esperma de salmão sonicado ou outro DNA não complementar, albumina de soro humano, pirofosfato de sódio, dodecilssulfato de sódio (SDS) , polivinil-pirrolidona, solução de Ficoll e Denhardt. Sulfato de dextrano e polietileno glicol 6000 atuam para excluir DNA da solução, assim elevando a concentração eficaz de DNA da sonda e o sinal de hibridização dentro de uma dada unidade de tempo. Em alguns exemplos, condições de estringência mesmo maiores podem ser desejáveis ou necessárias para reduzir a hibridização não especifica e/ou de base. Essas condições podem se criadas com o uso de temperatura superior, resistência iônica inferior e concentração maior de um agente desnaturante, tal como, formamida.
[0238] Condições de estringência podem ser ajustadas para classificar fragmentos moderadamente semelhantes, tais como, sequências homólogas de organismos
151/726 distintamente correlates ou para fragmentos altamente semelhantes, tais como, genes que duplicam enzimas funcionais de organismos proximamente relacionados. A estringência pode ser ajustada tanto durante a etapa de hibridização quanto nas lavagens pós hibridização. A concentração de sal, concentração de formamida, temperatura de hibridização e comprimentos de sonda são varia'veis que podem ser usadas para alterar a estringência (conforme descrito pela fórmula acima). Como uma diretriz geral, a estringência alta é tipicamente realizada em Tra-5°C a Tm20°C, estringência moderada a Tm-20°C a Tm-35°C e baixa estringência a Tm-35°C a Tm-50°C para duplexos >150 pares de base. A hibridização pode ser realizada em estringência baixa a moderada (25-50°C abaixo de Tm) , seguido por lavagens de pós hibridização em estringências crescentes. Razões máximas de hibridização na solução são determinadas empiricamente para ocorrer a Tm-25°C para duplexo DNA-DNA e Tm-15°C para duplexo RNA-DNA. Opcionalmente, o grau de dissociação pode ser avaliado após cada etapa de lavagem para determinar a necessidade de etapas de lavagem de estringência maior, subsequentes.
[0239] Condições de estringência alta podem ser usadas para selecionar as sequências de ácido nucleico com altos graus de identidade em relação às sequências reveladas. Um exemplo de condições de hibridização
152/726 estringentes obtidas em um processo a base de filtro, tal como Southern ou Northern blot para hibridização de ácidos nucleicos complementares que possuem mais que 100 resíduos complementares é de cerca de 5°C a 20°C menor que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma resistência iônica definida e pH. As condições usadas para hibridização podem incluir cerca de 0,02 M a cerca de 0,15
M de cloreto de sódio, cerca de 0, 5% a cerca de 5% de
caseína, cerca de 0,02% SDS ou cerca de 0,1% N-
laurilsarcosina, cerca de 0,001M a cerca de 0,03 M de
citrato de sódio em temperaturas de hibridização entre cerca de 50°C e cerca de 70°C. Mais preferivelmente, as condições de estringência alta são cerca de 0,02 M de cloreto de sódio, cerca de 0,5% de caseína, cerca de 0,02% de SDS, cerca de 0,001 M de citrato de sódio, a uma temperatura de cerca de 50°C. Moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições estringentes tipicamente hibridizarão para uma sonda com base tanto na molécula de DNA total ou porções selecionadas, por exemplo, para uma subsequência única do DNA.
[0240] A concentração de sal estringente comumente será inferior a 750 mM de NaCl e 74 mM de citrato de sódio. Condições de estringência crescentes podem ser obtidas com menos que cerca de 500 mM NaCl e 50 mM citrato de trissódio, a uma estringência mesmo maior com menos que
153/726 cerca de 250 mM NaCl e 25 mM citrato de trissódio. Hibridização com estringência baixa pode ser obtida na ausência de solvente orgânico, for exemplo, formamida, considerando-se que a hibridização em estringência alta pode ser obtida em presença de pelo menos cerca de 35% formamida, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% formamida. Condições de temperatura estringente comumente incluirão temperaturas de pelo menos cerca de 30°C, mais preferivelmente de pelo menos cerca de 37°C, e mais preferivelmente de pelo menos cerca de 42 °C com formamida presente. Parâmetros adicionais variados, tais como, tempo de hibridização, a concentração do detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS) e resistência iônica, são bem conhecidos dos versados na técnica. Vários níveis de estringência são realizados por combinação dessas várias condições, conforme necessário. Em uma concretização preferida, a hibridização variará a 30°C em 750 mM NaCl, 75 mM citrato de trissódio, e 1% SDS. Em uma concretização mais preferida, a hibridização ocorrerá a 37 °C em 500 mM NaCl, 50 mM citrato de trissódio, 1% SDS, 35% formamida. Na concretização mais preferida, a hibridização ocorrerá a 42°C em 250 mM NaCl, 25 mM citrato de trissódio, 1% SDS, 50% formamida. Variações úteis dessas condições serão prontamente aparentes aos versados na técnica.
[0241] As etapas de lavagem que seguem a
154/726 hibridização podem também variar na estringência; as etapas de lavagem pós hibridização, primariamente, determinam a especificidade da hibridização, com os fatores mais críticos sendo temperatura e a resistência iônica da solução de lavagem final. A estringência da lavagem pode aumentar por diminuição da concentração de sal ou por aumento da temperatura. A concentração de sal estringente para as etapas de lavagem preferivelmente serão inferior a cerca de 30 mM NaCl e 3 mM citrato de trissódio, e mais preferivelmente menos que cerca de 15 mM NaCl e 1,5 mM citrato de trissódio. Por exemplo, as condições de lavagem podem estar em condições de 0,1 x SSC a 2,0 x SSC e 0,1% SDS a 50-65°C, com, por exemplo, duas etapas de 10 - 30 minutos. Um exemplo de condições de lavagem estringente inclui cerca de 2,0 x SSC, 0,1% a 65°C e lavagem dupla, cada etapa de lavagem sendo de cerca de 30 minutos. Uma lavagem de estringência maior será de 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 65°C e lavagem dupla por 30 minutos. Uma lavagem de estringência ainda alta será de cerca de 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 65 °C e lavagem dupla por 30 minutos. A temperatura para as soluções de lavagem comumente serão de pelo menos cerca de 25°C e para estringência maior pelo menos 42°C. A estringência de hibridização pode ser aumentada adicionalmente por uso das mesmas condições como nas etapas de hibridização, com a temperatura de lavagem elevada de
155/726 cerca de 3°C a cerca de 5°C e a estringência pode ser aumentada, mesmo adicionalmente, por uso das mesmas condições, exceto que a temperatura de lavagem é elevada cerca de 6°C a cerca de 9°C. Para identificação de homólogo menos proximamente relacionado, as etapas de lavagem podem ser realizadas a uma temperatura inferior, por exemplo, cerca de 50°C.
[0242] Um exemplo de uma etapa de lavagem de estringência baixa emprega uma solução e condições de pelo menos 25°C em 30 mM de NaCl, 3 mM de citrato de trissódio, e 0,1% SDS por mais de 30 minutos. Estringência maior pode ser obtida a 42 °C em 15 mM de NaCl, com 1,5 mM de citrato de trissódio, e 0,1% SDS por mais de 30 minutos. Mesmo condições de lavagem de estringência maiores são obtidas a 65°C -68 °C em uma solução de 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato de trissódio, e 0,1% SDS. Procedimentos de lavagem geralmente empregarão pelo menos duas etapas de lavagem final. Variações adicionais nessas condições prontamente serão aparentes aos versados na técnica (vide, por exemplo, Pedido de Patente US número 20010010913) .
[0243] Condições de estringência podem ser
selecionadas, tal que, um oligonucleotideo que é
perfeitamente complementar ao oligonucleotideo de
codificação hibridiza no oligonucleotideo de codificação com uma razão de sinal para ruído de pelo menos cerca de 6
156/726 vezes maior que a razão de hibridização do oligonucleotídeo perfeita e completamente para um aminoácido codificando um fator de transcrição conhecido desde a data de depósito do pedido. Pode ser desejável selecionar condições para um ensaio específico, tal que, uma razão de sinal para ruido maior, isto é, cerca de 15 vezes ou mais, seja obtida. Consequentemente, um ácido nucleico hibridizará em um único oligonucleotídeo de codificação com pelo menos duas vezes ou mais uma razão de sinal para ruído, quando comparado à hibridização do oligonucleotídeo de codificação em relação ao ácido nucleico codificando um polipeptídeo conhecido. O sinal específico dependerá do marcador usado no ensaio relevante, por exemplo, um marcador fluorescente, um marcador colorimétrico, um marcador radioativo ou semelhante. A hibridização marcada ou sondas de PCR para detectar sequências de polinucleotídeo correlatas pode ser produzida por oligomarcação, tradução curta, marcação de extremidade ou ampliação de PCR usando um nucleotídeo marcado.
Identificação de Polinucleotideos ou Ácidos Nucleicos com Bibliotecas de Expressão [0244] Além dos processos de hibridização, os polipeptídeos homólogos ao fator de transcrição podem ser obtidos por classificação de uma biblioteca de expressão usando anticorpos específicos para um ou mais fatores de
157/726 transcrição. Com a provisão aqui do fator de transcrição revelado e sequências de ácido nucleico homólogas ao fator de transcrição, o(s) polipeptideo(s) codificado(s) pode(m) ser expresso(s) e purificado(s) em um sistema de expressão heterólogo (por exemplo, E.coli} e usado(s) para elevar os anticorpos (monoclonal ou policlonal) específicos para o(s) polipeptideo(s) em questão. Os anticorpos podem também ser surgir contra os peptídeos sintéticos derivados do fator de transcrição ou homólogo ao fator de transcrição e sequências de aminoácido. Os processos para surgimento de anticorpos são bem conhecidos na técnica e são descritos em Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Tais anticorpos podem então ser usados para classificar uma biblioteca de expressão produzida da planta a partir da qual deseja-se clonar os homólogos de fator de transcrição adicionais, usando os processos descritos acima. Os cDNAs selecionados podem ser confirmados por sequenciamento e atividade enzimática.
Variações da Sequência [0245] Será prontamente apreciado pelos versados na técnica que qualquer das várias sequências de polinucleotídeo são capazes de codificar fatores de transcrição e polipeptideos homólogos ao fator de transcrição da invenção. Devido à degeneração do código
158/726 genético, muitos polinucleotideos diferentes podem codificar polipeptideos idênticos e/ou substancialmente semelhantes, além daquelas sequências ilustradas na Listagem de Sequências. Ácidos nucleicos possuindo uma sequência que difere das sequências mostradas na Listagem de Sequências ou sequências complementares, que codificam peptideos funcionalmente equivalentes (isto é, peptideos possuindo algum grau de equivalência ou atividade biológica) porém diferem na sequência da sequência mostrada na Listagem de Sequências, devido à degeneração no código genético, também encontram-se no escopo da invenção.
[0246] Sequências de polinucleotídeo alteradas codificando polipeptídeos incluem aquelas sequências com deleções, inserções ou substituições dos nucleotídeos diferentes, resultando em um polinucleotídeo codificando um polipeptideo com pelo menos uma característica funcional dos presentes polipeptídeos. Encontram-se dentro dessas definições os polimorfismos que podem ou não ser prontamente detectáveis usando uma sonda de oligonucleotídeo específica do polinucleotídeo codificando os presentes polipeptídeos e hibridização imprópria ou inesperada para variantes alélicas, com um local que não o local do cromossoma normal para a sequência de polinucleotídeo codificando os presentes polipeptídeos.
[0247] Variante alélica se refere a qualquer das
159/726 duas ou mais formas de um gene ocupando o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar no polimorfismo fenotipico nas populações. Mutações genéticas podem ser silenciosas (isto é, nenhuma alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptideos possuindo sequência de aminoácido alterada. 0 termo variante alélica é também usado aqui para indicar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. A variante de junção surge naturalmente através do uso de sítios de junção alternativos dentro de uma molécula de RNA transcrita, ou menos comumente entre moléculas RNA transcritas separadamente e pode resultar em vários mRNAs transcritos do mesmo gene. Variantes de junção podem codificar polipeptideos possuindo sequência de aminoácido alterada. 0 termo variante de junção é também usado aqui para indicar uma proteína codificada por uma variante de junção de um mRNA transcrito de um gene.
[0248] Os versados na técnica reconhecerão que, por exemplo, G481, SEQ ID N°: 88, representa um fator de transcrição simples; podem ocorrer junção de variação alélica e junção alternativa. As variantes alélicas da SEQ ID NO; 87 podem ser clonadas por sondagem de cDNA ou bibliotecas genômicas de organismos individuais diferentes, de acordo com os procedimentos padrão. As variantes alélicas da sequência de DNA mostradas na SEQ ID N° : 87,
160/726 incluindo aquelas contendo mutações silenciosas e aquelas nas quais as mutações resultam em alterações da sequência de aminoácido, estão dentro do escopo da presente invenção, como sendo proteínas que são variantes alélicas da SEQ ID N°: 88. CDNAs gerados de mRNAs alternativamente unidos, que mantêm as propriedades do fator de transcrição estão incluídos no escopo da invenção como sendo polipeptídeos codificados por tais cDNAs ou mRNAs. As variantes alélicas e variantes de junção dessas sequências podem ser clonadas por sondagem de cDNA ou bibliotecas genômicas de organismos individuais diferentes ou tecidos, de acordo com os procedimentos padrão conhecidos na técnica (Vide Patente US número 6,388,064).
[0249] Assim, além das sequências estabelecidas na Listagem de Sequências, a invenção também engloba moléculas de ácido nucleico correlatas que incluem variantes alélicas ou de junção da SEQ ID N°: 2N - 1, onde N = 1- 229, SEQ ID N°: 459-466; 468-487; 491-500; 504; 506-511; 516-520; 523524; 527; 529; 531-533; 538-539; 541-557; 560-568; 570-586; 595-596; 598-606; 610-620; 627-634; 640-664; 670-707; 714719; 722-735; 740-741; 743-779; 808-823; 825-834; 838-850; 855-864; 868-889; 892-902; 908-909; 914-921; 924-925; 927932; 935-942; 944-952; 961-965; 968-986; 989-993; 995-1010; 1012-1034; 1043-1063; 1074-1080; 1091-1104; 1111-1121; 1123-1128; 1134-1138; 1142-1156; 1159-1175; 1187-1190;
161/726
1192-1199; 1202-1220; 1249-1253; 1258-1262; 1264-1269;
1271-1287; 1292-1301; 1303-1309; 1315-1323; 1328-1337;
1340-1341; 1344-1361; 1365-1377; 1379-1390; 1393-1394;
1396-1398; 1419-1432; 1434-1452; 1455-1456; 1460-1465;
1468-1491; 1499; 1502; 1505-1521; 1523-1527; 1529-1532;
1536-1539; 1542-1562; 1567-1571; 1573-1582; 1587-1592;
1595-1620; 1625-1644; 1647-1654; 1659-1669; 1671-1673;
1675-1680; 1682-1686; 1688-1700; 1706-1709; 1714-1726;
1728-1734; 1738-1742; 1744-1753; 1757-1760; 1763-1764;
1766-1768; 1770-1780; 1782-1784; 1786-1789; 1791-1804;
1806-1812; 1814-1837; 1847-1856; 1858-1862; 1864-1873;
1876-1882; 1885-1896; 1902-1910; 1913-1916; 1921-1928;
1931-1936; 1940-1941; 1944-1946, 2907-2941, 2944, 2945,
2947, 2949, ou SEQ ID N°: 2N - 1, r onde N = 974- 1101 e
inclui sequências que são complementares a qualquer uma das sequências de nucleotídeo acima. Moléculas de ácido nucleico correlatas também incluem sequências de nucleotídeo codificando um polipeptideo compreendendo ou consistindo essencialmente em uma substituição, modificação, adição e/ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido, em comparação ao polpeptídeo conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID N°: 2N, onde N = 1229, SEQ ID N°: 467; 488-490; 501-503; 505; 512-515; 521522; 52 5-52 6; 52 8; 530; 534-537; 54 0; 558-559; 5 69; 587594; 597; 607-609; 621-626; 635-639; 665-669; 708-713; 720
162/726
721; 736-739; 742; 780-807; 824; 835-837; 851-854; 865-867; 890-891; 903-907; 910-913; 922-923; 926; 933-934; 943; 953960; 966-967; 987-988; 994; 1011; 1035-1042; 1064-1073; 1081-1090; 1105-1110; 1122; 1129-1133; 1139-1141; 11571158; 1176-1186; 1191; 1200-1201; 1221-1248; 1254-1257; 1263; 1270; 1288-1291; 1302; 1310-1314; 1324-1327; 13381339; 1342-1343; 1362-1364; 1378; 1391-1392; 1395; 13991418; 1433; 1453-1454; 1457-1459; 1466-1467; 1492-1498; 1500-1501; 1503-1504; 1522; 1528; 1533-1535; 1540-1541; 1563-1566; 1572; 1583-1586; 1593-1594; 1621-1624; 16451646; 1655-1658; 1670; 1674; 1681; 1687; 1701-1705; 17101713; 1727; 1735-1737; 1743; 1754-1756; 1761-1762; 1765; 1769; 1781; 1785; 1790; 1805; 1813; 1838-1846; 1857; 1863; 1874-1875; 1883-1884; 1897-1901; 1911-1912; 1917-1920; 1929-1930; 1937-1939; 1942-1943; 2942 ou 2943, 2945, 2947, 2949, ou SEQ ID N°: 2N, onde N = 974- 1101. Tais polipeptideos correlatos podem compreender, por exemplo, adições e/ou deleções de um ou mais sítios de glicosilação ligados em N ou ligados em 0, ou uma adição e/ou uma deleção de um ou mais resíduos de cisteína.
[0250] Por exemplo, a Tabela 4 ilustra aqueles códons AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, e TCT que codificam o mesmo aminoácido: serina. Consequentemente, em cada posição na sequência, onde existe uma serina codificando um códon, qualquer uma das sequências de trinucleotídeo acima podem
163/726 ser usadas, sem alterar o polipeptídeo codificado.
Tabela 4
Aminoácido Possíveis Códons
Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU
Cisteina Cys C TGC TGT
Ácido aspártico Asp D GAC GAT
Ácido glutâmico Glu E GAA GAG
Fenilalanina Phe F TTC TTT
Glicina Gly G GGA GGC GGG GGT
Histidina His H CAC CAT
Isoleucina Ile I ATA ATC ATT
Lisina Lys K AAA AAG
Leucina Leu L TTA TTG CTA CTC CTG CTT
Metionina Met M ATG
Asparagina Asn N AAC AAT
Prolina Pro P CCA CCC CCG CCT
Glutamina Gin Q CAA CAG
Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT
Serina Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT
Treonina Thr T ACA ACC ACG ACT
Valina Vai V GTA GTC GTG GTT
Triptofano Trp w TGG
Tirosina Tyr Y TAC TAT
[0251] Alterações da sequência que não mudam sequência de aminoácido codificada pelo polinucleotideo são
164/726 denominadas variações silenciosas. Com a exceção dos códons ATG e TGG, codificando a metionina e triptofano, respectivamente, quaisquer dos códons possíveis para o mesmo aminoácido podem ser substituídos por uma variedade de técnicas, por exemplo, mutagenese direcionada ao sítio, disponível na arte. Consequentemente, quaisquer e todas as variações de uma sequência selecionada da tabela acima são um aspecto da invenção.
[0252] Além das variações silenciosas, outras variações de conservação que alteram um ou alguns dos aminoácidos no polipeptídeo codificado, podem ser feitas, sem alterar a função do polipeptídeo, essas variantes de conservação são, provavelmente, um aspecto da invenção.
[0253] Por exemplo, substituições, deleções e inserções introduzidas nas sequências providas na Listagem de Sequências, são também previstas pela invenção. Tais modificações de sequência podem ser projetadas em uma sequência por mutagenese direcionada ao sítio (Wu (ed. ) Methods Enzymol. (1993) vol. 217, Academic Press) ou os outros processos citados abaixo. Substituições de aminoácido são tipicamente de resíduos simples; inserções geralmente serão da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácido; e deleções variarão de cerca de 1 a 30 resíduos. Nas concretizações preferidas, deleções ou inserções são feitas em pares adjacentes, por exemplo, uma
165/726 deleção de dois resíduos ou inserção de dois resíduos. Substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação das mesmas podem ser combinadas para surgir em uma sequência. As mutações que são feitas no polinucleotideo codificando o fator de transcrição não devem colocar a sequência fora do quatro de leitura e não devem criar regiões complementares que possam produzir estrutura de mRNA secundária. Preferivelmente, o polipeptideo codificado pelo DNA realiza a função desejada.
[0254] Substituições de conservação são aquelas nas quais pelo menos um resíduo em uma sequência de aminoácido foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Tais substituições geralmente são feitas de acordo com a Tabela 5, quando se deseja manter a atividade da proteína. A tabela 5 mostra aminoácidos que podem ser substituídos por um aminoácido em uma proteína e que são tipicamente considerados como substituições de conservação.
Tabela 5
Resíduo Substituições conservação de
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin; His
Asp Glu
Gin Asn
166/726
Cys Ser
Glu Asp
Gly Pro
His Asn; Gin
Ile Leu, Vai
Leu Ile; Vai
Lys Arg; Gin
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr; Gly
Thr Ser; Vai
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Vai Ile; Leu
[0255] Substituições semelhantes são aquelas nas quais pelo menos um resíduo na sequência de aminoácido foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Tais substituições geralmente são feitas de acordo com a Tabela 6, quando é desejado manter a atividade da proteína. A tabela 6 mostra aminoácidos que podem ser substituídos por um aminoácido em uma proteína e que são tipicamente considerados como substituições estruturais e funcionais. Por exemplo, um resíduo na coluna 1 da Tabela 6 pode ser substituído por um resíduo na coluna 2; além disso, um resíduo na coluna 2 da Tabela 6 pode ser substituído por um
167/726 resíduo da coluna 1.
Tabela 6
Resíduo Substituições semelhantes
Ala Ser; Thr; Gly; Vai; Leu; Ile
Arg Lys; His; Gly
Asn Gin; His; Gly; Ser; Thr
Asp Glu, Ser; Thr
Gin Asn; Ala
Cys Ser; Gly
Glu Asp
Gly Pro; Arg
His Asn; Gin; Tyr; Phe; Lys; Arg
Ile Ala; Leu; Vai; Gly; Met
Leu Ala; Ile; Vai; Gly; Met
Lys Arg; His; Gin; Gly; Pro
Met Leu; Ile; Phe
Phe Met; Leu; Tyr; Trp; His; Vai; Ala
Ser Thr; Gly; Asp; Ala; Vai; Ile; His
Thr Ser; Vai; Ala; Gly
Trp Tyr; Phe; His
168/726
Tyr Trp; Phe; His
Vai Ala; Ile; Leu; Gly; Thr; Ser; Glu
[0256] Substituições que são menos conservadoras que aquelas na Tabela 5 podem ser selecionadas por coleta de resíduos que diferem mais significativamente em seu efeito na manutenção de (a) a estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação de lâmina ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) o volume da corrente lateral. As substituições que, em geral, espera-se que produzam as maiores alterações nas propriedades das proteínas serão aquelas nas quais (a) um resíduo hidrófilo, por exemplo, serila ou treonila, é substituído por um resíduo hidrófobo, por exemplo, leucila, isoleucila, fenilalanila, valila ou alanila; (b) uma cisteína ou prolina é substituída por qualquer resíduo; (c) um resíduo possuindo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila ou histidila é substituído por um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou (d) um resíduo possuindo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído por um que não possui uma cadeia lateral, por exemplo, glicina. Modificações Adicionais das Sequências da Invenção Mutação/Evolução Forçada
169/726 [0257] Além de gerar substituições silenciosas ou de conservação conforme observado acima, a presente invenção inclui, opcionalmente, os processos para modificar as sequências da Listagem de Sequências. Nos processos, os métodos de modificação de ácido nucleico ou proteína são usados para alterar as sequências dadas de modo a produzir novas sequências e/ou modificar química ou enzimaticamente as sequências dadas para alterar as propriedades dos ácidos nucleicos ou proteínas.
[0258] Assim, em uma concretização, as dadas sequências de ácido nucleico são modificadas, por exemplo, de acordo com a mutagenese padrão ou processos de evolução artificial para produzir as sequências modificadas. As sequências modificadas podem ser criadas usando polinucleotideos naturais purificados isolados de qualquer organismo ou podem ser sintetizadas de composições purificadas e substâncias usando meios químicos bem conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, Ausubel, supra, provê detalhes adicionais aos processos de mutagênese. Processos de evolução forçada, artificial, são descritos, por exemplo, por Stemmer (1994) Nature 370: 389391, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 10747-10751, e Patentes US números 5.811.238, 5.837.500 e 6.242.568. Processos para projetar fatores de transcrição sintéticos e outros polipeptídeos são descritos, por exemplo, por Zhang
170/726 e outros (2000) J. Biol. Chem. 275: 33850-33860, Liu e outros (2001) J. Biol. Chem. 276: 11323-11334, e Isalan e outros (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660. Muitos outros processos de mutação e evolução são também disponíveis e espera-se que estejam dentro da prática de um versado.
[0259] Similarmente, a alteração química ou enzimática dos ácidos nucleicos expressos e polipeptideos pode ser realizada por processos padrão. Por exemplo, a sequência pode ser modificada por adição de lipídeos, açúcares, peptídeos, compostos orgânicos ou inorgânicos, por inclusão de nucleotídeos modificados ou aminoácidos ou semelhantes. Por exemplo, as técnicas de modificação de proteína são ilustradas em Ausubel, supra. Detalhes adicionais nas modificações químicas e enzimáticas podem ser encontrados aqui. Esses processos de modificação podem ser usados para modificar qualquer dada sequência, ou para modificar qualquer sequência produzida pelos vários processos de mutação e modificação por evolução artificial, citados aqui.
[0260] Consequentemente, a invenção provê modificação de qualquer dado ácido nucleico por mutação, evolução, modificação química ou enzimática, ou outros processos disponíveis, bem como para os produtos produzidos pela prática de tais processos, por exemplo, usando as sequências aqui como um substrato de partida para as várias
171/726 abordagens de modificação.
[0261] Por exemplo, códons contendo sequência de codificação otimizada preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico podem ser usados, por exemplo, para aumentar a razão de tradução ou para produzir transcritos de RNA recombinante possuindo propriedades desejadas, tais como, uma meia vida útil mais longa, em comparação aos transcritos produzidos usando uma sequência não otimizada. Os códons de parada de tradução podem também ser modificados para refletirem a preferência do hospedeiro. Por exemplo, códons de parada preferidos para Sacharomyces cerevisiae e mamíferos são TAA e TGA, respectivamente. O códon de parada preferido para plantas monocotiledôneas é TGA, considerando-se que os insetos e E.coli preferem usar TAA como o códon de parada.
[0262] As sequências de polinucleotídeo da presente invenção podem ser projetadas a fim de alterar a sequência de codificação por várias razões, incluindo, porém não limitado às alterações que modificam a sequência para facilitar a clonagem, processamento e/ou expressão do produto de gene. Por exemplo, alterações são opcionalmente introduzidas usando técnicas que são bem conhecidas na arte, por exemplo, mutagenese direcionada ao sítio, para inserir novos sítios de restrição, para alterar padrões de glicosilação, para alterar preferência de códon, para
172/726 introduzir sítios de junção, etc.
[0263] Adicionalmente, um fragmento ou domínio derivado de qualquer um dos polipeptídeos da invenção pode ser combinado com domínios derivados de outros fatores de transição ou domínios sintéticos, para modificar a atividade biológica de um fator de transcrição. Por exemplo, um domínio de ligação de DNA derivado de um fator de transcrição da invenção pode ser combinado com o domínio de ativação de outro fator de transcrição ou com um domínio de ativação sintética. Um domínio de ativação de transcrição ajuda a iniciar a transcrição de um sítio de ligação de DNA. Exemplos incluem a região de ativação de transcrição de VP16 ou GAL4 (Moore e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. 95: 376-381; Aoyama e outros (1995) Plant Cell 7: 1773-1785), peptídeos derivados de sequências bacterianas (Ma and Ptashne (1987) Cell 51: 113-119) e peptídeos sintéticos (Giniger and Ptashne (1987) Nature 330: 670-672).
Expressão e Modificação dos Polipeptídeos [0264] Tipicamente, as sequências de polinucleotídeo da invenção são incorporadas às moléculas de DNA recombinante (ou RNA) que direcionam a expressão dos polipeptídeos da invenção nas células hospedeiras apropriadas, plantas transgênicas, sistemas de tradução in vitro ou semelhantes. Em razão da degeneração inerente do
173/726 código genético, as sequências de ácido nucleico que codificam substancialmente a mesma sequência de aminoácido ou uma funcionalmente equivalente podem ser substituídas por qualquer sequência listada para prover clonagem e expressão do homólogo relevante.
[0265] As plantas transgênicas da presente invenção compreendendo sequências de polinucleotídeo recombinantes são geralmente derivadas de plantas de origem, que podem, propriamente, ser plantas não transformadas (ou não transgênicas). Essas plantas transgênicas podem tanto possuir um gene de fator de transcrição nocauteado (por exemplo, com uma inserção genômica por recombinação homóloga, uma construção de anti-sentido ou ribozima) ou expresso a uma extensão normal ou do tipo selvagem. Contudo, a superexpressão da progênie de plantas transgênicas exibirá níveis de mRNA maiores, onde o mRNA codifica um fator de transcrição, isto é, uma proteína de ligação de DNA que é capaz de ligar-se a uma sequência reguladora de DNA e induzir transcrição e, preferivelmente,
a expressão o nível de de um gene expressão de de traço de planta. Preferivelmente,
mRNA será pelo menos três vezes
maior que aquele da planta de origem ou mais
preferivelmente, pelo menos níveis de mRNA dez vezes
maiores que os da planta de origem e, mais preferivelmente, pelo menos cinqüenta vezes maiores em relação a planta de
174/726 origem.
Vetores, Promotores e Sistemas de Expressão [0266] A presente invenção inclui construções recombinantes compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico aqui. As construções tipicamente compreendem um vetor, tal como um plasmídeo, um cosmideo, um fago, um vírus (por exemplo, um vírus de planta) , um cromossoma artificial bacteriano (BAC), um cromossoma artificial de levedura (YAC), ou semelhante, dentro do qual uma sequência de ácido nucleico da invenção foi inserida, em uma orientação a frente ou reversa. Em um aspecto dessa concretização, a construção compreende, adicionalmente, sequências reguladoras, incluindo, por exemplo, um promotor, operativamente ligado à sequência. Números maiores de vetores e promotores apropriados são conhecidos dos versados na técnica e são comercialmente disponíveis.
[0267] Textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular úteis aqui, incluindo o uso e produção de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes, englobam Berger, Sambrook, supra e Ausubel, supra. Qualquer uma das sequências identificadas pode ser incorporada a um cassete ou vetor, por exemplo, para expressão em plantas. Vários fatores de expressão apropriados para transformação estável das células de planta ou para estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos incluindo aqueles
175/726 descritos em Weissbach e Weissbach (1989? Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, and Gelvin e outros (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers. Exemplos específicos incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, bem como aqueles revelados por Herrera-Estrella e outros (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12: 87118721, Klee (1985) Bio/Technology 3: 637-642, para plantas dicotiledôneas.
[0268] Alternativamente, vetores não Ti podem ser usados para transferir o DNA para as plantas monocotiledôneas e células usando técnicas de ligação de DNA livre. Tais processos podem envolver, por exemplo, o uso de lipossomas, eletroporação, bombardeamento de microprojetéis, fios de carboneto de silício e vírus. Utilizando-se esses processos, as plantas transgênicas, tais como, trigo, arroz (Christou (1991) Bio/Technology 9: 957-962) e milho (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618) podem ser produzidas. Um embrião imaturo pode também ser um bom tecido alvo para monocotos para técnicas de liberação de DNA direto por uso de pistola de partículas (Weeks e outros (1993) Plant Physiol. 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technology 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48, e para transferência de DNA mediada por Agrobacterium (Ishida outros (1996)
Nature
176/726
Biotechnol. 14: 745-750).
[0269] Tipicamente, os vetores de transformação de planta incluem uma ou mais sequência de codificação de planta clonada (genômica ou cDNA) sob o controle de transcrição de sequências reguladoras 5' e 3' e um marcador selecionável dominante. Tais vetores de transformação de planta tipicamente podem conter um promotor (por exemplo, uma região reguladora controlando expressão induzivel ou constitutiva, regulada ambientalmente ou de desenvolvimento ou específica de tecido ou célula), um sítio de partida de iniciação de transcrição, um sinal de processamento de RNA (tais como, sítios de junção de intron), um sítio de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.
[0270] Uma utilidade em potencial para os polinucleotideos de fator de transcrição revelados aqui é o isolamento dos elementos promotores desses genes que podem ser usados para programar a expressão de quaisquer genes nas plantas. Cada gene de fator de transcrição revelado aqui é expresso em um único modo, conforme determinado por elementos promotores localizados a montante do início da tradução e adicionalmente dentro de um intron do gene de fator de transcrição ou a jusante do códon de terminação do gene. Como é bem conhecido na técnica, para uma porção significativa de genes, as sequências promotoras estão localizadas totalmente na região diretamente a montante do
177/726 início da tradução. Em tais casos, tipicamente, as sequências promotoras estão localizadas dentro de 2,0 kb do
início da tradução ou dentro de 1,5 kb do início da
tradução, freqüentemente dentro de 1,0 kg do inicio da
tradução e algumas vezes dentro de 0,5 kb do início da
tradução.
[0271] As sequências promotoras podem ser isoladas de acordo com os processos bem conhecidos dos versados na técnica.
[0272] Exemplos de promotores constitutivos de planta que podem ser úteis para expressão da sequência de TF incluem: promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), que confere expressão constitutiva, de alto nível, na maioria dos tecidos de planta (vide, por exemplo, Odell e outros (1985) Nature 313: 810-812); o promotor de nopalina sintase (An e outros (1988) Plant Physiol. 88: 547-552); e o promotor de octopina sintase (Fromm e outros (1989) Plant Cell 1: 977-984).
[0273] Uma variedade de promotores de gene de planta que regulam a expressão genética em resposta aos sinais ambientais, hormonais, químicos e de desenvolvimento e em uma maneira ativa no tecido, podem ser usados para expressão de uma sequência de TF nas plantas. A escolha de um promotor tem base ampla no fenótipo de interesse e é determinado por fatores, tais como, tecido (por exemplo,
178/726 semente, fruto, raiz, pólen, tecido vascular, flores, carpelo, etc.) capacidade de indução (por exemplo, em resposta ao enrolamento, aquecimento, frio, estiagem, luz, agentes patogênicos, etc.), temporização, estágio de desenvolvimento e semelhantes. Vários promotores conhecidos foram caracterizados e podem ser empregados de modo favorável para promover a expressão de um polinucleotídeo da invenção em uma planta transgênica ou célula de interesse. Por exemplo, promotores específicos de tecido incluem: promotores específicos para plantas (tais como, o promotor napin, faseolin ou DC3 descrito na Patente US número 5.773.697), promotores específicos de frutos, que estão ativos durante o amadurecimento do fruto (tais como o promotor dru 1 (Patente US número 5.783.393) ou o promotor 2A11 (Patente US número 4.943.674) e o promotor de poligalacturonase de tomate (Bird e outros (1988) Plant Mol. Biol. 11: 651-662), promotores específicos de raiz, tais como aqueles revelados nas Patentes US números 5.618.988, 5.837.848 e 5.905.186, promotores ativos de pólen, tais como, PTA29, PTA26 e PTA13 (Patente US número 5.792.929), promotores ativos no tecido vascular (Ringli and Keller (1998) Plant Mol. Biol. 37: 977-988), específicos para flores (Kaiser e outros (1995) Plant Mol. Biol. 28: 231-243), pólen (Baerson e outros (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1947-1959), carpelos (Ohl e outros (1990)
179/726
Plant Cell 2: 837-848), pólen e óvulos (Baerson e outros (1993) Plant Mol. Biol. 22: 255-267), promotores indutores de auxina (tais como aqueles descritos em van der Kop e outros (1999) Plant Mol. Biol. 39: 979-990 ou Baumann e outros (1999) Plant Cell 11: 323-334), promotor induzivel de citocinina (Guevara-Garcia (1998) Plant Mol. Biol. 38: 743-753), promotores sensíveis a giberelina (Shi e outros (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1053-1060, Willmott e outros (1998) 38: 817-825) e semelhantes. Promotores adicionais são aqueles que promovem expressão em resposta ao aquecimento (Ainley e outros (1993) Plant Mol. Biol. 22: 13-23), luz, (por exemplo, o promotor de rbcS-3A de ervilha, Kuhlemeier e outros (1989) Plant Cell 1: 471-478, e o promotor de rbcS no milho, Schaffner and Sheen (1991) Plant Cell 3: 997-1012); enrolamento (por exemplo, wunl, Siebertz e outros (1989) Plant Cell 1: 961-968); agentes patogênicos (tais como, o promotor de PR-1 descrito em Buchel e outros (1999) Plant Mol. Biol. 40: 387-396, e o promotor de PDF1,2 descrito em Manners e outros (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1071-1080), e substâncias químicas, tais como, jasmonato de metila ou ácido salicílico (Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89108) . Além disso, a temporização da expressão pode ser controlada por uso de promotores, tais com, aqueles atuando na senescência (Gan and Amasino (1995) Science 270: 1986
180/726
1988); ou no desenvolvimento tardio da semente (Odell e outros (1994) Plant Physiol. 106: 447-458).
[0274] Os vetores de expressão de planta também podem incluir sinais de processamento de RNA que podem ser posicionados dentro, a montante ou a jusante da sequência e codificação. Além disso, os vetores de expressão podem incluir sequências reguladoras adicionais da região não traduzida 3' dos genes de plantas, por exemplo, uma região terminadora 3' para aumentar a estabilidade de mRNA do mRNA, tal coo, região terminadora PI-II da batata ou regiões terminadoras 3' de octopina ou nopalina sintase.
Elementos de Expressão Adicionais [0275] Sinais de iniciação específicos podem ajudar na tradução eficiente das sequências de codificação. Esses sinais podem incluir, por exemplo, o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos onde uma sequência de codificação, seu códon de iniciação e sequências a montante são inseridos no vetor de expressão apropriado, nenhum sinal de controle de translação adicional pode ser necessário. Contudo, nos casos onde apenas a sequência de codificação (por exemplo, uma sequência de codificação de proteína madura) ou uma porção da mesma é inserida, os sinais de controle de transcrição exógenos incluindo o códon de iniciação de ATG podem ser providos separadamente. O códon de iniciação é provido no quadro de leitura correto
181/726 para facilitar a transcrição. Elementos transcricionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, natural e sintética. A eficiência da expressão pode ser melhorada por inclusão dos melhoradores apropriados para o sistema de célula em uso.
Hospedeiros de Expressão [0276] A presente invenção também se refere às células hospedeiras que são transduzidas com vetores da invenção, e à produção de polipetideos da invenção (incluindo fragmentos dos mesmos) por técnicas de recombinação. As células hospedeiras são geneticamente projetadas (isto é, os ácidos nucleicos são introduzidos, por exemplo, transduzidos, transformados ou transfectados) com os vetores dessa invenção, que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão compreendendo os ácidos nucleicos relevantes aqui. O vetor é opcionalmente um plasmideo, partícula virótica, fago, um ácido nucleico nu, etc. As células hospedeiras projetadas podem ser cultivadas em meio de nutriente convencional, modificado conforme apropriado para ativação dos promotores, seleção dos transformantes ou ampliação do gene relevante. As condições de cultivo, tais como, temperatura, pH e semelhantes, são aquelas usadas previamente com a célula hospedeira selecionada para expressão e estarão claras aos versados na técnica e nas referências citadas
182/726 aqui, incluindo, Sambrook, supra e Ausubel, supra.
[0277] A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, tal como, célula de levedura ou célula de planta ou célula hospedeira que pode ser uma célula eucariótica, tal como, uma célula bacteriana. Os protoplastos de planta são também apropriados para algumas aplicações. Por exemplo, os fragmentos de DNA são introduzidos nos tecidos das plantas, células de planta cultivadas ou protoplastos de plantas por processos padrão incluindo eletroporação (Fromm e outros (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 5824-5828, infecção por vetores viróticos, tais como, virus mosaico da couve-flor (CaMV) (Hohn e outros (1982) Molecular Biology of Plant Tumors Academic Press, New York, NY, pp. 549-560; US 4,407,956), penetração balística de alta velocidade por partículas pequenas com o ácido nucleico dentro de cada matriz das microesferas ou partículas ou na superfície (Klein e outros (1987) Nature 327: 70-73), uso de pólen como vetor (WO 85/01856), ou uso de Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes transportando um plasmídeo de T-DNA, onde os fragmentos de DNA são clonados. O plasmídeo de T-DNA é transmitido às células de planta por infecção por Agrobacterium tumefaciens, e uma porção é estavelmente integrada ao genoma da planta (Horsch e outros (1984) Science 233: 496-498; Fraley e outros (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 4803-4807).
183/726 [0278] A célula pode incluir um ácido nucleico da invenção que codifica um polipeptídeo, onde a célula expressa um polipeptídeo da invenção. A célula pode incluir também sequências de vetor ou semelhante. Adicionalmente, as célula e plantas transgênicas que incluem qualquer polipeptídeo ou ácido nucleico acima ou através de todo o relatório descritivo, por exemplo, produzido por transdução de um vetor da invenção, são um aspecto adicional da invenção.
[0279] Pode ser usada expressão estável, por longo prazo, com produção de alta produtividade das proteínas recombinantes. As células hospedeiras transformadas com uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo da invenção são opcionalmente cultivadas sob condições apropriadas para expressão e recuperação da proteína codificada da cultura da célula. A proteína ou fragmento da mesma produzido por célula recombinante pode ser secretada, ligada em membrana ou contida intracelularmente, dependendo da sequência e/ou vetor usado. Conforme será entendido pelos versados na técnica, os vetores de expressão contendo proteínas maduras codificando polinucleotídeos da invenção podem ser projetados com sequências de sinal que direcionam a secreção dos polipeptídeos maduros através de uma membrana de célula procariótica ou eucariótica.
Resíduos de Aminoácido Modificados
184/726 [0280] Polipeptídeos da invenção podem conter um ou mais resíduos de aminoácido modificados. A presença de aminoácidos modificados pode ser vantajosa, por exemplo, para aumentar a meia vida útil do polipeptideo, reduzindo a antigenicidade ou toxicidade do polipeptideo, aumentando a estabilidade em armazenamento do polipeptideo ou semelhante. Resíduo(s) de aminoácido(s) são modificados, por exemplo, co-traducionalmente ou pós-traducionalmente durante produção recombinante ou modificada por meios sintéticos ou químicos.
[0281] Exemplos não limitantes de um resíduo de aminoácido modificado incluem incorporação ou outro uso de aminoácidos acetilados, aminoácidos glicosilados, aminoácidos sulfatados, aminoácidos prenilados (por exemplo, farnesilados, geranilgeranilados) , aminoácidos modificados com PEG (por exemplo, PEGilados) , aminoácidos biotinilados, aminoácidos carboxilados, aminoácidos fosforilados, etc. Referências adequadas para guiar um versado na técnica na modificação dos resíduos de aminoácido encontram-se na literatura.
[0282] Os resíduos de aminoácido modificados podem impedir ou aumentar a afinidade do polipeptideo a outra molécula, incluindo, porém não limitado ao polinucleotideo, proteínas, carboidratos, lipídeos e derivados de lipídeo e outros compostos orgânicos ou sintéticos.
185/726
Identificação dos Fatores Adicionais [0283] Um fator de transcrição provido pela presente invenção pode também ser usado para identificar moléculas endógenas e exógenas adicionais que podem afetar um fenótipo ou traço de interesse. Por um lado, tais moléculas incluem compostos orgânicos e/ou inorgânicos (moléculas pequenas u grandes) que afetam a expressão de um fator de transcrição específico (isto é, regulam). Alternativamente, tais moléculas incluem moléculas endógenas que são acionadas tanto em um nível de transcrição por um fator de transcrição da invenção para modificar um fenótipo conforme desejado. Por exemplo, os fatores de transcrição podem ser empregados para identificar um ou mais genes a jusante que estão sujeitos a um efeito regulador do fator de transcrição. Em uma abordagem, um fator de transcrição ou homólogo ao fator de transcrição da invenção é expresso em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula de planta transgênica, tecido ou explante e produtos de expressão, tanto RNA quanto proteína de alvos prováveis ou aleatórios são monitorados, por exemplo, por hibridização em uma microfileira de sondas de ácido nucleico correspondendo aos genes expressos em um tipo de tecido ou célula de interesse, por eletroforese de gel bidimensional dos produtos de proteína ou por qualquer outro processo
186/726 conhecido na técnica para avaliar a expressão dos produtos genéticos ao nível do RNA ou proteína. Alternativamente, um fator de transcrição da invenção pode ser usado para identificar sequências promotoras (tais como, sítios de ligação nas sequências de DNA) envolvidas na regulação de um alvo a jusante. Após identificação de uma sequência promotora, as interações entre o fator de transcrição e a sequência promotora podem ser modificados por alteração dos nucleotídeos específicos na sequência promotora ou aminoácidos específicos no fator de transcrição, que interagem com a sequência promotora para altear um traço de planta. Tipicamente, os sítios de ligação de DNA de fator de transcrição são identificados por ensaios de deslocamento de gel. Após identificação das regiões promotoras, as sequências da região promotora podem ser empregas em fileiras de DNA de filamento duplo para identificar as moléculas que afetam as interações dos fatores de transcrição com seus promotores (Bulyk e outros (1999) Nature Biotechnol. 17: 573-577).
[0284] Os fatores de transcrição identificados são também úteis para identificar proteínas que modificam a atividade do fator de transcrição. Tal modificação pode ocorrer por modificação covalente, tal como por fosforilação ou por interações de proteína-proteína (homo ou heteropolímero). Qualquer processo apropriado para
187/726 detectar as interações de proteína-proteína pode ser empregado. Entre os processos que podem ser empregados estão co-imunoprecipitação, ligação transversa e copurificação através de gradientes ou colunas cromatográficas, e o sistema de levedura de dois híbridos.
[0285] O sistema de dois híbridos detecta interações de proteína in vivo e é descrito em Chien e outros (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 9578-9582, e é comercialmente disponível na Clontech (Paio Alto, Calif.). Em tal sistema, são construídos plasmídeos que codificam duas proteínas híbridas: uma consiste no domínio de ligação de DNA de uma proteína ativadora de transcrição fundido ao polipeptídeo TF e a outra consiste no domínio de ativação de proteína ativadora de transcrição, fundido à proteína desconhecida que é codificada pelo cDNA que foi recombinado no plasmídeo, como parte de uma biblioteca de cDNA. O plasmídeo de fusão de domínio de ligação de DNA e uma biblioteca de cDNA são transformados em uma cepa da levedura Saccharomyces cerevisiae que contém um gene repórter (por exemplo, lacZ) cuja região reguladora contém o sítio de ligação do ativador de transcrição. Cada proteína híbrida, sozinha, não pode ativar a transcrição do gene repórter. A interação das duas proteínas híbridas reconstitui a proteína ativadora funcional e resulta na expressão do gene repórter, que é detectada por um ensaio
188/726 para o produto de gene repórter. Então, os plasmideos da biblioteca responsáveis pela expressão do gene repórter são isolados e sequenciados para identificar as proteínas codificadas pelos plasmideos da biblioteca. Após identificação das proteínas que interagem com os fatores de transcrição, os ensaios para os compostos que interferem com as interações proteína-proteína TF podem ser preformados.
Identificação dos Moduladores [0286] Além das moléculas intracelulares descritas acima, moléculas extracelulares que alteram a atividade ou expressão de um fator de transcrição, tanto direta quanto indiretamente, podem ser identificadas. Por exemplo, os processos podem consistir primeiro em contatar a molécula candidata com uma planta ou célula de planta. A molécula pode ser introduzida por administração tópica, tal como, aspersão ou encharcamento da planta, ou incubação da planta em uma solução contendo a molécula e então o efeito da molécula na expressão ou atividade do polipeptideo de TF ou a expressão do polinucleotideo monitorado. As alterações na expressão do polipeptideo de TF podem se monitoradas por uso dos anticorpos policlonais ou monoclonais, eletroforese de gel ou semelhantes. Alterações da expressão da sequência de polinucleotideo correspondente podem ser detectadas por uso de microfileiras, Northerns, PCR quantitativo ou
189/726 qualquer outra técnica para monitorar alterações na expressão de mRNA. Essas técnicas são exemplificadas em Ausubel e outros (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998, e suplementos através do ano de 2001) . Alterações na atividade do fator de transcrição podem ser monitoradas, direta ou indiretamente, por ensaio da função do fator de transcrição, por exemplo, por medição da expressão dos promotores conhecidos por serem controlados pelo fator de transcrição (usando construções promotor-repórter), medindo os níveis das transcrições usando microfileiras, Northern blots, PCR quantitativo, etc. Tais alterações nos níveis de expressão podem estar relacionadas aos traços de plantas modificadas e assim moléculas identificadas podem ser úteis para encharcamento ou aspersão nos frutos, colheitas de vegetais ou grãos para modificar os traços das plantas.
[0287] Essencialmente, qualquer composição disponível pode ser testada para atividade moduladora da expressão ou atividade de qualquer ácido nucleico ou polipeptídeo aqui. Assim, bibliotecas disponíveis dos compostos, tais como, substâncias químicas, polipeptídeos, ácidos nucleicos e semelhantes podem ser testadas quanto a atividade moduladora. Frequentemente, compostos moduladores em potencial podem ser dissolvidos nas soluções aquosas ou orgânicas (por exemplo, com base em DMSO) para liberação
190/726 fácil para a célula ou planta de interesse, onde a atividade do modulador deve ser testada. Opcionalmente, os ensaios são indicados para classificar as grandes bibliotecas de composição moduladora por automação das etapas do ensaio e provisão de compostos de qualquer fonte conveniente para os ensaios, que são tipicamente operados em paralelo (por exemplo, nos formatos de microtitulações sobre microplacas em ensaios robóticos).
[0288] Em uma concretização, os processos de classificação de alta produtividade envolvem provisão de uma biblioteca combinatória contendo um grande número de compostos em potencial (compostos moduladores em potencial). Tais bibliotecas químicas combinatórias são então classificadas em um ou mais ensaios, conforme descrito aqui, para identificar aqueles elementos da biblioteca (espécies químicas específicas ou subclasses) que revelam uma atividade característica desejada. Os compostos assim identificados podem servir como compostos alvo.
[0289] Uma biblioteca química combinatória pode ser, por exemplo, uma coleção de compostos químicos diversos gerados por síntese química ou síntese biológica. Por exemplo, uma biblioteca química combinatorial tal como, uma biblioteca de polipeptídeos é formada por combinação de um conjunto de blocos de construção química (como, em um
191/726 exemplo, aminoácidos) em cada maneira possível, por um dado comprimento do composto (isto é, o número de aminoácidos em um composto polipeptídeo de um comprimento estabelecido). Bibliotecas exemplares incluem bibliotecas de peptídeo, bibliotecas de ácido nucleico, bibliotecas de anticorpo (vide, por exemplo, Vaughn e outros (1996) Nature Biotechnol. 14: 309-314 e PCT/US96/10287), bibliotecas de carboidrato (vide, por exemplo, Liang e outros Science (1996) 274: 1520-1522 e Patente US número 5.593.853), bibliotecas de ácido nucleico de peptídeo (vide, por exemplo, Patente US 5.539.083), e pequenas bibliotecas de molécula orgânica (vide, por exemplo, benzodiazepinas, em Baum Chem. & Engineering News Jan 18, 1993, page 33; isoprenóides, Patente US 5.569.588; tiazolidinonas e metatiazanonas, Patente US 5.549.974; pirrolidinas, Patentes US 5.525.735 e 5.519.134; compostos morfolino, Patente US 5.506.337) e semelhantes.
[0290] A preparação e classificação de coletâneas combinatórias ou outras é bem conhecida dos versados na técnica. Tais bibliotecas químicas combinatórias incluem, porém não estão limitadas às bibliotecas de peptídeo (vide, por exemplo, Patente US 5.010.175; Furka, (1991) Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493; e Houghton e outros (1991) Nature 354: 84-88). Outras substâncias químicas para geração de bibliotecas de diversidade química podem também
192/726 ser usadas.
[0291] Além disso, conforme citado, o equipamento para classificação de composto e para classificação de alto desempenho encontra-se geralmente disponível, por exemplo, usando qualquer número de sistemas robóticos conhecidos que também foram desenvolvidos para substâncias químicas de fase de solução úteis nos sistemas de ensaio. Esses sistemas incluem estações de trabalho automatizadas incluindo aparelho de síntese automatizada e sistemas robóticos utilizando os braços robóticos. Qualquer um dos sistemas acima é apropriado para uso com a presente invenção, por exemplo, para classificação de alta produtividade de moduladores em potencial. A natureza e implementação das modificações a esses dispositivos (se houver) de modo que eles possam operar conforme discutido aqui, serão aparentes aos versados na técnica relevante.
[0292] Na realidade, sistemas de classificação de alta produtividade total são comercialmente disponíveis. Esses sistemas automatizam, tipicamente, o procedimento total incluindo pipetagem da amostra e reagente, dispensa do líquido, incubações cronometradas e leituras finais da microplaca no(s) detector(es) apropriado(s) para o ensaio. Esses sistemas configuráveis fornecem alta produtividade e partida rápida, bem como um alto grau de flexibilidade e customerização. De modo semelhante, as implementações
193/726 microfluídicas de classificação são também comercialmente disponíveis.
[0293] Os fabricantes de tais sistemas fornecem protocolos detalhados de várias produtividades altas. Assim, por exemplo, Zymark Corp. fornece boletins técnicos descrevendo sistemas de classificação para detectar a modulação da transcrição genética, ligação de ligante e semelhantes. Os sistemas integrados aqui, além de proverem o alinhamento de sequência e, opcionalmente, síntese dos ácidos nucleicos relevantes, podem incluir tais aparelhos de classificação para identificar moduladores que possuem um efeito em um ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos de acordo com a presente invenção.
[0294] Em alguns ensaios, é desejável ter-se controles positivos para assegurar que os componentes dos ensaios trabalhem apropriadamente. Pelo menos dois tipos de controles positivos são apropriados. Isto é, ativadores de transcrição conhecidos ou inibidores podem ser incubados com células ou plantas, por exemplo, em uma amostra do ensaio, e o aumento/diminuição resultante pode ser detectado por medição do aumento resultante nos níveis de RNA e/ou expressão da proteína, por exemplo, de acordo com os processos descritos aqui. Será apreciado que os moduladores podem também ser combinados com ativadores ou inibidores transcricionais para obter moduladores que
194/726 inibam a ativação de transcrição ou repressão de transcrição. Tanto a expressão dos ácidos nucleicos e das proteínas aqui ou quaisquer ácidos nucleicos adicionais ou proteínas ativadas por ácidos nucleicos ou proteínas, ou ambos, podem ser monitorados.
[0295] Em uma concretização, a invenção provê um processo para identificar composições que modulam a atividade ou expressão de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção. Por exemplo, um composto de teste, se uma molécula pequena ou grande, é colocado em contato com uma célula, planta (ou tecido de planta ou explante) ou composição compreendendo o polinucleotídeo ou polipeptídeo de interesse e um efeito resultante na célula, planta (ou tecido ou explante) ou composição é avaliado por monitoramento tanto direta quanto indiretamente, de um ou mais de: nível de expressão do polinucleotídeo ou polipeptídeo, atividade (ou modulação da atividade) do polinucleotídeo ou polipeptídeo. Em alguns casos, uma alteração em um fenótipo de planta pode ser detectada seguindo-se contato de uma planta (ou célula de planta ou tecido ou explante) com um modulador putativo, por exemplo, por modulação da expressão ou atividade de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção. A modulação de expressão ou atividade de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção pode também ser causada por
195/726 elementos moleculares em uma via de segundo mensageiro de transdução de sinal e tal modulação pode afetar elementos semelhantes na mesma ou em outra via de segundo mensageiro de transdução de sinal.
Subsequências [0296] O emprego de polinucleotídeos é também contemplado, também referidos aqui como oligonucleotídeos, possuindo tipicamente, pelo menos 12 bases, preferivelmente pelo menos 15, mais preferivelmente pelo menos 20, 30 ou 50 bases, que hibridizam sob condições pelo menos altamente estringentes (ou condições estringentes ultra altas ou ultra ultra altas) em relação a uma sequência de polinucleotídeo descrita acima. Os polinucleotídeos podem se usados como sondas, iniciadores, agentes de sentido e anti-sentido e semelhantes, de acordo com os processos citados acima.
[0297] Subsequências dos polinucleotídeos da invenção, incluindo fragmentos de polinucleotídeo e oligonucleotídeos são úteis como sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um oligonucleotídeo apropriado para uso como uma sonda ou iniciador possui, pelo menos, 15 nucleotídeos de comprimento, mais frequentemente pelo menos 18 nucleotídeos, freqüentemente pelo menos cerca de 21 nucleotídeos, frequentemente pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, ou cerca de 40 nucleotídeos, ou mais de
196/726 comprimento. Uma sonda de ácido nucleico é útil nos protocolos de hibridização, por exemplo, para identificar homólogos de polipeptídeo adicionais da invenção, incluindo protocolos para experimentos de microfileira. Os iniciadores podem ser recombinados em um filamento de DNA alvo complementar, por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, e então estendidos ao longo do filamento de DNA alvo por uma enzima DNA polimerase. Os pares de iniciador podem ser usados para ampliação de uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, por reação da cadeia de polimerase (PCR) ou outros processos de ampliação de ácido nucleico. Vide Sambrook, supra e Ausubel, supra.
[0298] Além disso, a invenção inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante incluindo uma sequência de pelo menos cerca de 15 aminoácidos contínuos, codificados pelos polinucleotídeos recombinantes ou isolados. Por exemplo, tais polipeptídeos ou domínios ou fragmentos dos mesmos, podem ser usados como imunogens, por exemplo, para produzir anticorpos específicos para a sequência de polipeptídeo, ou como sondas para detectar uma sequência de interesse. Uma subsequência pode variar de tamanho de cerca de 15 aminoácidos de comprimento até e incluindo o comprimento do polipeptídeo.
[0299] De modo a ser englobado pela presente
197/726 invenção, um polipeptídeo expresso que compreende tal sequência de polipeptídeo realiza pelo menos uma função biológica de polipeptídeo intacto substancialmente da mesma maneira, ou a uma extensão semelhante, como o faz o polipeptídeo intacto. Por exemplo, um fragmento de polipeptídeo pode compreender um motivo estrutura reconhecível ou domínio funcional, tal com um domínio de ligação de DNA que ativa a transcrição, por exemplo, por ligação a uma região promotora de DNA específica de um domínio de ativação ou um domínio para interações de proteína-proteína.
Produção de Plantas Transgênicas
Modificação dos Traços [0300] Os polinucleotideos da invenção são empregados, favoravelmente, para produzir plantas transgênicas com vários traços ou características, que foram modificadas de modo desejável, por exemplo, para aperfeiçoar as características da semente de uma planta. Por exemplo, alteração dos níveis de expressão ou padrão (por exemplo, padrão de expressão espacial ou temporal) de um ou mais dos fatores de transcrição (ou homólogos do fator de transcrição) da invenção, quando comparados aos níveis da mesma proteína encontrados em uma planta do tipo selvagem, podem ser usados para modificar os traços das plantas. Um exemplo ilustrativo de modificação de traço,
198/726 características aperfeiçoadas, por alteração dos níveis de expressão de um fator de transcrição específico, é descrito adicionalmente nos Exemplos e Listagem de Sequências.
Arabidopsis como um sistema modelo [0301] Arabidopsis thaliana é o objeto no qual se concentra uma atenção crescente como modelo para genética e metabolismo nas plantas. O Arabidopsis possui um genoma pequeno e estudos bem documentados encontram-se disponíveis. Ele cresce facilmente em grandes números e mutantes definindo mecanismos importantes controlados geneticamente são tanto disponíveis quanto prontamente obtidos. Vários processos para introduzir e expressar genes homólogos isolados estão disponíveis (vide [0302] Koncz e outros eds., e outros Methods in Arabidopsis Research (1992) World Scientific, New Jersey, NJ, no Prefácio) . Em razão de seu tamanho pequeno, ciclo de vida curto, autogamia obrigada e alta fertilidade, o Arabidopsis é também um organismo de escolha para isolamento de mutantes e estudos de morfogenética e vias de
desenvolvimento, além do controle dessas vias por fatores
de transcrição
[0303] ( Koncz supra, P· 72) . Vários estudos
introduzindo os fatores de transcrição em A. thaliana
demonstraram a utilidade dessa planta para entender os mecanismos de regulação genética e alteração de traço nas
199/726 plantas. (Vide, por exemplo, Koncz supra, e Patente US número 6.417.428).
Genes de Arabidopsis em plantas transgênicas [0304] A expressão de genes que codificam a expressão de modificação dos fatores de transcrição dos genes endógenos, os polinucleotídeos, e proteínas são bem conhecidos na técnica. Além disso, as plantas transgênicas compreendendo fatores de transcrição codificando polinucleotídeos isolados podem também modificar a expressão dos genes endógenos, polinucleotídeos e proteínas. Exemplos incluem Peng e outros (1997) Genes and Development 11: 3194-3205, e Peng e outros (1999) Nature 400: 256-261. Além disso, muitos outros demonstraram que um fato de transcrição de Arabidopsis em uma espécie de planta exógena promove a mesma resposta fenotípica ou semelhante. Vide, por exemplo, Fu e outros (2001) Plant Cell 13: 17911802; Nandi e outros (2000) Curr. Biol. 10: 215-218; Coupland (1995) Nature 377: 482-483; e Weigel and Nilsson (1995) Nature 377: 482-500.
Genes____homólogos____introduzidos____nas____plantas transgênicas [0305] Genes homólogos que podem ser derivados de qualquer planta ou de qualquer fonte se natural, sintética, semi-sintética ou recombinante e que compartilham identidade de sequência significativa ou similaridade com
200/726 relação aqueles providos pela presente invenção, podem ser introduzidos nas plantas, por exemplo, plantas de colheita, para conferir traços desejados ou aperfeiçoados. Consequentemente, as plantas transgênicas podem ser produzidas compreendendo um cassete ou vetor de expressão recombinante com um promotor operavelmente ligado a uma ou mais sequências homólogas em relação as sequências presentemente reveladas. 0 promotor pode ser, por exemplo, uma planta ou promotor virótico.
[0306] A invenção provê, assim, processos para preparação de plantas transgênicas, e para modificação dos traços das plantas. Esses processos incluem introdução em uma planta de um cassete ou vetor de expressão recombinante compreendendo um promotor funcional, operativamente ligado a uma ou mais sequências homólogas às sequências presentemente reveladas. As plantas e kits para produção dessas plantas que resultam da aplicação desses processos são também englobadas pela presente invenção.
Fatores de transcrição de interesse para modificação dos traços das plantas [0307] Concorrentemente, a existência de uma série de grupos de maturidade para diferentes latitudes representa uma barreira maior para introdução de novos traços de valor. Qualquer traço (por exemplo, resistência a doença) a ser reproduzido dentro de cada um dos diferentes
201/726 grupos de maturidade, separadamente, um exercício laborioso e caro. A disponibilidade de cepa simples, que seria desenvolvida em qualquer latitude, portanto, aumentaria em
muito o potencial para introdução de novos traços às
espécies de colheita como soja e algodão.
[0308] Para muitos dos efeitos específicos, os
traços e utilidades listados nas tabelas 7 e 9 que podem
ser conferidos as plantas, um ou mais genes de fator de transcrição podem ser usados para aumentar ou diminuir, avançar ou retardar, aperfeiçoar ou provar degeneração de cada um dos traços fornecidos. A superexpressão de um ou mais genes pode fornecer diferenças significativas na produção dos produtos de plantas, tais como, razões de ácido graxo diferentes. Por exemplo, a superexpressão de G720 fez com que a planta se tornasse mais tolerante ao congelamento, porém o nocauteamento do mesmo fator de transcrição forneceu suscetibilidade maior ao congelamento. Assim, a supressão de um gene que leva a planta a ser mais sensível ao frio pode aperfeiçoar a tolerância de uma planta ao frio.
[0309] Mais de um gene de fator de transcrição pode ser introduzido em uma planta, tanto por transformação da planta com um ou mais vetores compreendendo dois ou mais fatores de transcrição, ou por reprodução seletiva das plantas para render cruzamentos híbridos que compreendem
202/726 mais de um fator de transcrição introduzido. As plantas transgênicas podem ser cruzadas com outra planta ou propriamente, ou para produzir sementes; que podem ser usadas para gerar plantas de progênie possuindo tolerância aumentada ao estresse abiótico (propriamente se refere a auto-polinização, ou uso de pólen de uma planta para fertilizar a mesma planta ou outra planta na mesma linhagem, considerando-se que cruzamento se refere, geralmente, à polinização cruzada com planta de uma linhagem diferente, tal como uma planta não transformada ou do tipo selvagem ou outra planta transformada de uma linhagem transgênica diferente de plantas). O cruzamento provê a vantagem de se capaz de produzir novas variedades. A semente resultante pode então ser usada para desenvolver uma planta de progênie que é transgênica e possui tolerância aumentada ao estresse abiótico. De modo geral, as plantas de progênie expressarão mRNA que codifica uma proteína de ligação de DNA possuindo um domínio conservado (por exemplo, um domínio de ligação AP2, relacionado a MYB ou caixa CCAAT) que liga-se a uma molécula de DNA, regula sua expressão e induz a expressão dos genes e polipeptídeos o que confere à planta o traço desejável (por exemplo, tolerância ao estresse abiótico). Nessas plantas de progênie, o mRNA pode ser expresso em um nível maior que em uma planta não transformada que não superexpressa a
203/726 proteína de ligação de DNA.
[0310] Uma listagem de efeitos específicos e utilidades que os genes de fator de transcrição presentemente revelados possuem nas plantas, conforme determinado por observação direta e análise de ensaio, é provido na Tabela 7. A tabela 7 mostra os polinucleotídeos identificados pela SEQ ID N°: GID; e se o polinucleotídeo foi testado em um ensaio transgênico. A primeira coluna mostra a SEQ ID NO de polinucleotídeo; a segunda coluna mostra GID; a terceira coluna mostra se o gene foi superexpresso (OE) ou nocauteado (KO) nos estudos da planta; a quarta coluna mostra o(s) traço(s) resultantes do nocauteamento ou superexpressão do polinucleotídeo na planta transgênica e a quinta coluna (Observações) inclui observações experimentais específicas feitas quando a expressão do polinucleotídeo da primeira coluna foi alterada.
Tabela 7. Categorias de traços e efeitos dos genes de fator de transição que são superexpressos (OE) ou atenuados (KO).
SEQ ID NO do polinucleotídeo: GID. OE/ KO Alterações traços dos Observações
1 G8 OE Época de floração Floração tardia
alterada Sensibilidade C/N
Regulação do alterada
204/726
crescimento; absorção de nutriente
3 G19 ΟΕ Tolerância aumentada a doença Tolerância aumentada ao Erysiphe; reprimida pelo jasmonato de metila e induzida por ácido 1-aminociclopropano 1-carboxilico(ACC)
5 G22 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico Tolerância aumentada ao teor alto de sal
7 G24 ΟΕ Necrose aumentada Regulação do crescimento; absorção de nutriente Tamanho reduzido e manchas necróticas Sensibilidade C/N alterada
2217 G27 ΟΕ Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
9 G28 ΟΕ Tolerância aumentada a doença Tolerância aumentada ao Botrytis Tolerância aumentada
205/726
ao Sclerotinia Resistência aumentada ao Erysiphe
11 G47 ΟΕ Morfologia do caule Estrutura alterada
alterada dos tecidos
Tolerância vasculares
aumentada ao Melhor crescimento
estresse abiótico da raiz sob tensão
Época de floração osmótica
alterada Floração tardia
Arquitetura Arquitetura alterada
alterada e desenvolvimento de
Tolerância inflorescência
aumentada ao Dominância apical
estresse abiótico e reduzida
tensão osmótica Tolerância aumentada
a estiagem
13 G156 ΚΟ Semente alterada Alteração de cor da
Regulação do semente
crescimento; Sensibilidade C/N
absorção de alterada
nutriente
15 G157 ΟΕ Época de floração Época de floração
alterada alterada (nível
206/726
modesto de superexpressão desencadeia floração precoce, considerando-se que um aumento maior retarda a floração)
17 G162 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
Proteína alterada Teor de proteína da
na semente semente aumentado
19 G175 ΟΕ Tolerância Tolerância aumentada
aumentada ao a tensão osmótica
estresse abiótico Tolerância aumentada
a estiagem
21 G180 ΟΕ Óleo alterado na Óleo diminuído na
semente semente
Época de floração Floração precoce
alterada
23 G183 ΟΕ Época de floração Floração precoce
alterada Fotomorfogênese
Resposta a luz constitutiva
alterada e/ou Sensibilidade C/N
tolerância a sombra alterada
Regulação do
207/726
crescimento; absorção de nutriente
25 G188 ΚΟ Suscetibilidade aumentada a doença Tolerância aumentada ao estresse abiótico Suscetibilidade aumentada ao Fusarium Germinação melhor sob tensão osmótica Tolerância aumentada a estiagem
27 G189 ΟΕ Tamanho alterado Regulação do crescimento; absorção de nutriente Tamanho de folha aumentado Sensibilidade C/N alterada
29 G192 ΟΕ Época de floração alterada Óleo alterado na semente Floração tardia Teor de óleo da semente diminuído
31 G196 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico Tolerância aumentada ao teor alto de sal
33 G211 ΟΕ Bioquímica da folha alterada Arquitetura Aumento na xilose da folha Dominância apical
208/726
alterada Folha alterada reduzida Forma alterada da folha
35 G214 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada Ácidos graxos da
Bioquímica da folha folha aumentados
alterada Luteína da semente
Lipídeos de prenila aumentada
alterados na Clorofila da folha
semente aumentada e
Folha alterada carotenóides
lipídeos de prenila
37 G226 ΟΕ Proteína alterada Proteína da semente
na semente aumentada
Tricomas alterados Glabo, falta de
Raiz alterada tricomas
Tolerância Pêlos das raízes
aumentada ao aumentados
estresse abiótico Tolerância aumentada
Regulação do ao teor alto de sal
crescimento; Tolerância aumentada
absorção de ao meio limitado em
nutriente nitrogênio
Sensibilidade C/N
alterada
209/726
2267 G234 ΟΕ Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
2269 G237 ΟΕ Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
39 G241 ΚΟ Proteína alterada na semente Óleo alterado na semente Sensibilidade ao açúcar alterada Teor de proteína da semente aumentado Óleo diminuído na semente Germinação diminuída e crescimento em meio de glicose
41 G248 ΟΕ Suscetibilidade aumentada a doença Suscetibilidade aumentada ao Botrytis
43 G254 ΟΕ Sensibilidade ao açúcar alterada Germinação diminuída e crescimento em meio de glicose
45 G256 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico Germinação melhor e crescimento no frio
47 G278 ΟΕ Suscetibilidade Suscetibilidade
210/726
aumentada a doença aumentada Sclerotinia ao
49 G291 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
51 G303 ΟΕ Tolerância Germinação melhor em
aumentada ao alto teor de
estresse abiótico e sacarose e alto teor
tensão osmótica de NaCl
Tolerância aumentada
a estiagem
53 G312 ΟΕ Tolerância Germinação melhor em
aumentada ao alto teor de NaCl
estresse abiótico
55 G325 ΟΕ Tolerância Germinação melhor em
aumentada ao alto teor de
estresse abiótico e sacarose e NaCl
tensão osmótica Tolerância aumentada
a estiagem
57 G343 ΟΕ Sensibilidade Resistência
alterada ao aumentada ao
glifosato glifosato
Tamanho alterado Planta pequena
G2295 G347 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
211/726
nutriente
59 G353 ΟΕ Tolerância Vigor aumentado da
aumentada ao sementeira em
estresse abiótico e polietilenoglicol
tensão osmótica (PEG)
Tamanho alterado Tolerância aumentada
Folha alterada a estiagem
Flor alterada Tamanho reduzido
Desenvolvimento
alterado da folha
Pedúnculos menores,
siliquas apontando a
jusante
61 G354 ΟΕ Tamanho alterado Tamanho reduzido
Resposta a luz Fotomorfogênese
alterada e/ou constitutiva
tolerância a sombra Pedúnculos menores,
Flor siliquas apontando a
j usante
63 G361 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada
65 G362 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada Tamanho reduzido
Tamanho alterado Formação de tricoma
212/726
Tricomas alterados ectópico, número de
Morfologia: outra tricoma aumentado
Pigmentação
aumentada na semente
e embriões, e em
outros órgãos
67 G371 ΟΕ Suscetibilidade Suscetibilidade
aumentada a doença aumentada ao
Botrytis
69 G390 ΟΕ Arquitetura Desenvolvimento
alterada alterado do broto
71 G391 ΟΕ Arquitetura Desenvolvimento
alterada alterado do broto
73 G409 ΟΕ Tolerância Tolerância aumentada
aumentada a doença ao Erysiphe
75 G427 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo
semente aumentado
Proteína alterada Teor de proteína
na semente diminuído
Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento l alterada
absorção de
nutriente
77 G438 ΚΟ Morfologia do caule Lignina reduzida
alterada Ramificações
213/726
Arquitetura alterada reduzidas
79 G450 ΟΕ Semente alterada Tamanho da semente aumentado
81 G464 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico Germinação melhor e crescimento no calor
83 G470 ΟΕ Fertilidade alterada Filamentos de estame curtos
85 G477 ΟΕ Suscetibilidade aumentada a doença Tolerância aumentada ao estresse abiótico Suscetibilidade aumentada ao Sclerotinia Sensibilidade aumentada ao estresse oxidativo
87 G481 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Sensibilidade ao açúcar alterada: germinação melhor em meios de sacarose Tolerância aumentada a estiagem
89 G482 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Tolerância aumentada ao teor alto de sal
214/726
91 G484 ΚΟ Glicosinolatos da semente alterados Perfil alterado do glicosinolato
93 G489 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Tolerância aumentada a tensão osmótica Tolerância aumentada a estiagem
95 G490 ΟΕ Época de floração alterada Floração precoce
97 G504 ΟΕ Composição do óleo da semente alterada Composição e teor de óleo da semente alterados; aumento de 18:2 ácidos graxos e diminuição de 20:1 ácidos graxos
99 G509 ΚΟ Óleo alterado na semente Proteína alterada na semente Aumento do teor de proteína e óleo total na semente
101 G519 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
103 G545 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Suscetível ao teor alto de sal Suscetibilidade aumentada ao
215/726
Suscetibilidade aumentada a doença Regulação do crescimento; absorção de nutriente Erysiphe Suscetibilidade aumentada ao Pseudomonas Suscetibilidade aumentada ao Fusarium Tolerância aumentada ao meio isento de fosfato Sensibilidade C/N alterada
105 G546 ΟΕ Sensibilidade ao hormônio alterada Sensibilidade reduzida ao ácido abscisico (ABA)
107 G561 ΟΕ Óleo alterado na semente Tolerância ao estresse abiótico Teor de óleo da semente aumentado Tolerância aumentada ao meio isento de potássio
109 G562 ΟΕ Época de floração alterada Floração tardia
111 G567 ΟΕ Óleo alterado na semente Proteína alterada Aumento do teor de proteína/ óleo total na semente
216/726
na semente Aumento do teor de
Sensibilidade ao proteína/ óleo total
açúcar alterada na semente
Vigor diminuído da
sementeira em teor
de glicose alto
113 G568 ΟΕ Arquitetura Ramificação alterada
alterada
115 G584 ΟΕ Semente alterada Sementes grandes
117 G585 ΟΕ Tricomas alterados Densidade reduzida
do tricoma
119 G590 ΚΟ Óleo alterado na Teor de óleo da
ΟΕ semente semente aumentado
ΟΕ Época de floração Floração precoce
alterada Sensibilidade C/N
Regulação do alterada
crescimento;
absorção de
nutriente
121 G594 ΟΕ Suscetibilidade Suscetibilidade
aumentada a doença aumentada ao
Sclerotinia
123 G597 ΟΕ Proteína alterada Teor de proteína
na semente alterado na semente
125 G598 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo
217/726
semente aumentado na semente
127 G634 ΟΕ Tricomas alterados Resposta a luz alterada e/ou tolerância a sombra Tolerância aumentada ao estresse abiótico Densidade e tamanho aumentados do tricoma Tolerância a sombra aumentada; falta de fenótipo de esquivamento da sombra Tolerância a estiagem aumentada
129 G635 ΟΕ Matiz Regulação do crescimento; absorção de nutriente Coloração alterada Sensibilidade C/N alterada
131 G636 ΟΕ Senescência alterada Senescência prematura
133 G638 ΟΕ Flor alterada Desenvolvimento alterado da flor
135 G652 ΚΟ Lipideos de prenila alterados na semente Aumento de alfa- tocoferol
2391 G657 ΟΕ Regulação do crescimento; Sensibilidade C/N alterada
218/726
absorção de nutriente
137 G663 ΟΕ Pigmento alterado Teor aumentado de antocianinas na folha, raiz, semente
139 G664 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico Germinação melhor e crescimento no frio
141 G674 ΟΕ Folha alterada Folhas verde escuro, orientadas a montante
143 G676 ΟΕ Tricomas alterados Número reduzido de tricomas, formação de tricoma ectópico
145 G680 ΟΕ Sensibilidade ao açúcar alterada Germinação reduzida no meio de glicose
147 G682 ΟΕ Tricomas alterados Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Raiz alterada Regulação do crescimento; absorção de Glabo, falta de tricomas Germinação melhor e crescimento no calor Pêlos das raízes aumentados Tolerância aumentada a estiagem Sensibilidade C/N
219/726
nutriente alterada
149 G715 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
151 G720 ΟΕ Tolerância Mais tolerância ao
ΚΟ aumentada ao congelamento
estresse abiótico e Suscetibilidade
tensão osmótica aumentada ao
Suscetibilidade congelamento
aumentada ao
estresse abiótico e
tensão osmótica
153 G736 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada Forma alterada da
Folha alterada folha
155 G748 ΟΕ Lipideos de prenila Teor de luteina
alterados na aumentado
semente Mais feixes
Morfologia do caule vasculares no caule
alterada Floração tardia
Época de floração
alterada
2413 G760 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
220/726
157 G779 ΟΕ Fertilidade alterada Flor alterada Fertilidade reduzida Transformações homeotipicas
159 G789 ΟΕ Época de floração Floração precoce
alterada
161 G801 ΟΕ Tolerância Germinação melhor em
aumentada ao alto teor de NaCl
estresse abiótico
163 G849 ΚΟ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
Proteína alterada Teor de proteína
na semente alterado na semente
165 G859 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada
167 G864 ΟΕ Tolerância Germinação melhor no
aumentada ao calor
estresse abiótico Tolerância aumentada
a estiagem
169 G867 ΟΕ Tolerância Vigor melhor da
aumentada ao sementeira em teor
estresse abiótico e alto de sal
tensão osmótica Vigor melhor da
Sensibilidade ao sementeira em alto
açúcar alterada teor de sacarose
171 G869 ΟΕ Composição do óleo Composição de ácidos
221/726
da semente alterada graxos da semente alterada
2437 G872 OE Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
173 G877 KO Letal ao embrião Fenótipo letal ao embrião; alvo herbicida em potencial
175 G881 OE Suscetibilidade aumentada a doença Suscetibilidade aumentada ao Erysiphe
177 G892 KO Proteína alterada na semente Óleo alterado na semente Teor de proteína alterado na semente Teor de óleo alterado na semente
179 G896 KO Suscetibilidade aumentada a doença Suscetibilidade aumentada ao Fusarium
2451 G904 OE Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
181 G910 OE Época de floração Floração tardia
222/726
alterada
183 G911 ΟΕ Tolerância ao Crescimento
estresse abiótico aumentado no meio
isento de potássio
185 G912 ΟΕ Tolerância Tolerante ao
aumentada ao congelamento
estresse abiótico Sobrevivência
Pigmento alterado aumentada em
Sensibilidade ao condições de
açúcar alterada estiagem
Cor verde escuro
Expansão reduzida do
cotilédone em
glicose
187 G913 ΟΕ Tolerância Tolerância aumentada
aumentada ao ao congelamento
estresse abiótico Floração tardia
Época de floração Tolerância aumentada
alterada a estiagem
189 G922 ΟΕ Tolerância Germinação melhor em
aumentada ao alto teor de
estresse abiótico e sacarose
tensão osmótica Germinação melhor,
crescimento da raiz
aumentado em teor
223/726
alto de sal Tolerância aumentada a estiagem
191 G926 ΚΟ Sensibilidade ao Sensibilidade
hormônio alterada reduzida ao ABA
Tolerância Tolerância aumentada
aumentada ao ao teor alto de sal
estresse abiótico e e sacarose
tensão osmótica
2065 G932 ΟΕ Regulação do Sensibilidade ao
crescimento; C/N: tolerância
absorção de aumentada ao teor
nutriente baixo de nitrogênio
2461 G937 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
2471 G958 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
193 G961 ΚΟ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
2479 G964 ΚΟ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
224/726
absorção de nutriente
195 G971 ΟΕ Época de floração alterada Floração tardia
197 G974 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo alterado na semente
199 G975 ΟΕ Bioquímica da folha alterada Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Regulação do crescimento; absorção de nutriente Teor aumentado de ácidos graxos e cera nas folhas Tolerância aumentada a estiagem Sensibilidade C/N alterada
201 G979 ΚΟ Semente alterada Regulação do crescimento; absorção de nutriente Desenvolvimento, amadurecimento e germinação alterados da semente Sensibilidade C/N alterada
203 G987 ΚΟ Ácidos graxos alterados na folha Bioquímica da folha Redução de 16:3 nos ácidos graxos Lipídeos de prenila
225/726
alterada alterados: clorofila, tocoferol, carotenóide
205 G988 ΟΕ Proteína alterada Teor de proteína da
na semente semente aumentado
Flor alterada Órgãos florais
Arquitetura aumentados,
alterada pedúnculos menores
Morfologia do caule Ramificação lateral
alterada reduzida
Regulação do Caule mais grosso,
crescimento; distribuição
absorção de alterada dos feixes
nutriente vasculares
Sensibilidade C/N
alterada
207 G1040 ΟΕ Semente alterada Sementes menores e
mais redondas
209 G1047 ΟΕ Tolerância Tolerância aumentada
aumentada a doença ao Fusarium
2515 G1048 ΟΕ Resposta a luz Tolerância a sombra
alterada e/ou aumentada; falta de
tolerância a sombra fenótipo de
esquivamento da
226/726
sombra
2517 G1049 ΟΕ Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
211 G1051 ΟΕ Época de floração alterada Floração tardia
213 G1052 ΟΕ Época de floração alterada Floração tardia
215 G1062 ΚΟ Semente alterada Forma alterada da semente
217 G1063 ΟΕ Folha alterada Inflorescência alterada Flor alterada Forma alterada da folha, cor verde escuro Desenvolvimento alterado de inflorescência Desenvolvimento alterado da flor, tecido ectópico do carpelo
219 G1064 ΟΕ Suscetibilidade aumentada a doença Sensibilidade aumentada ao Botrytis
221 G1069 ΟΕ Sensibilidade ao Sensibilidade
227/726
hormônio alterada reduzida ao ABA
Tolerância Germinação melhor
aumentada ao sob tensão osmótica
estresse abiótico e Tolerância aumentada
tensão osmótica a estiagem
Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
223 G1073 ΟΕ Tamanho alterado Tamanho da planta
Semente alterada substancialmente
Tolerância aumentado
aumentada ao Rendimento aumentado
estresse abiótico da semente
Tolerância aumentada
a estiagem
225 G1075 ΟΕ Flor alterada Pétalas, sépalas e
estames reduzidos ou
ausentes
227 G1084 ΟΕ Suscetibilidade Suscetibilidade
aumentada a doença aumentada ao
Botrytis
229 G1089 ΚΟ Tolerância Germinação melhor
aumentada a tensão sob tensão osmótica
osmótica
228/726
231 G1134 ΟΕ Sensibilidade ao hormônio alterada Resposta alterada ao etileno: hipocótilos mais longos e falta de gancho apical
233 G1140 ΟΕ Flor alterada Desenvolvimento alterado da flor
235 G1143 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo alterado na semente
237 G1146 ΟΕ Folha alterada Desenvolvimento alterado da folha
239 G1196 ΚΟ Suscetibilidade aumentada a doença Suscetibilidade aumentada ao Botrytis
241 G1198 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
243 G1225 ΟΕ Época de floração alterada Sensibilidade ao açúcar alterada Floração precoce Germinação melhor em meios de sacarose e glicose
245 G1226 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
247 G1229 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente diminuído
2555 G1246 ΟΕ Regulação do crescimento; Sensibilidade C/N alterada
229/726
absorção nutriente de
249 G1255 ΟΕ Suscetibilidade Suscetibilidade
aumentada a doença aumentada ao
Semente alterada Botrytis
Arquitetura Tamanho da semente
alterada aumentado
Regulação do Dominância apical
crescimento; reduzida
absorção de Sensibilidade C/N
nutriente alterada
251 G1266 ΟΕ Tolerância Tolerância aumentada
aumentada a doença ao Erysiphe
Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
253 G1275 ΟΕ Arquitetura Dominância apical
alterada reduzida
255 G1305 ΟΕ Tolerância Clorose reduzida no
aumentada ao calor
estresse abiótico
257 G1322 ΟΕ Tolerância Vigor aumentado da
aumentada ao sementeira no frio
estresse abiótico Tamanho reduzido
230/726
Tamanho alterado Aumento de M39480
dos glicosinolatos Fotomorfogênese
da folha constitutiva
Resposta a luz Sensibilidade C/N
alterada e/ou alterada: tolerância
tolerância a sombra aumentada ao teor
Regulação do baixo de nitrogênio
crescimento r
absorção de
nutriente
259 G1323 ΟΕ Óleo alterado na Óleo diminuído na
semente semente
Proteína alterada Proteína da semente
na semente aumentada
261 G1330 ΟΕ Sensibilidade ao Insensível ao
hormônio alterada etileno quando
germinada no escuro
em ACC
263 G1331 ΟΕ Resposta a luz Fotomorfogênese
alterada e/ou constitutiva
tolerância a sombra Sensibilidade C/N
Regulação do alterada
crescimento
absorção de
nutriente
231/726
265 G1332 ΟΕ Tricomas alterados Regulação do crescimento; absorção de nutriente Densidade reduzida do tricoma Sensibilidade C/N alterada
267 G1363 ΟΕ Tolerância aumentada a doença Tolerância aumentada ao Fusarium
269 G1411 ΟΕ Arquitetura alterada Perda do domínio apical
2607 G1412 ΚΟ Resposta a luz alterada e/ou tolerância a sombra Tolerância a sombra aumentada; falta de fenótipo de esquivamento da sombra
271 G1417 ΚΟ Óleo alterado na semente Aumento de 18:2, diminuição de 18:3 ácidos graxos
273 G1419 ΟΕ Proteína alterada na semente Proteína da semente aumentada
275 G1449 ΟΕ Flor alterada Estrutura alterada da flor
277 G1451 ΟΕ ΟΕ ΚΟ Tamanho alterado Folha alterada Óleo alterado na semente Tamanho da flor aumentado Tamanho maior da folha
232/726
Teor de óleo alterado na semente
279 G1452 ΟΕ Tricomas alterados Densidade reduzida
Folha alterada do tricoma
Sensibilidade ao Forma alterada da
hormônio alterada folha, cor verde
Época de floração escuro
alterada Sensibilidade
Tolerância reduzida ao ABA
aumentada ao Germinação melhor em
estresse abiótico e sacarose, sal
tensão osmótica Floração tardia
Tolerância aumentada
a estiagem
281 G1463 ΟΕ Senescência Senescência
alterada prematura
283 G1471 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
285 G1478 ΟΕ Proteína alterada Teor de proteína da
na semente semente diminuído
Época de floração Floração tardia
alterada Teor de óleo da
Óleo alterado na semente aumentado
semente
287 G1482 ΚΟ Pigmento alterado Antocianinas
233/726
ΟΕ Raiz alterada aumentadas Crescimento da raiz aumentado
289 G1488 ΟΕ Proteína alterada Teor de proteína
na semente alterado na semente
Resposta a luz Fotomorfogênese
alterada e/ou constitutiva
tolerância a sombra Dominância apical
Arquitetura reduzida, caules
alterada mais curtos
291 G1494 ΟΕ Época de floração Floração precoce
alterada Hipocótilos longos,
Resposta a luz forma alterada da
alterada e/ou folha
tolerância a sombra Folhas verde pálido,
Folha alterada forma alterada da
Regulação do folha
crescimento; Sensibilidade C/N
absorção de alterada
nutriente
293 G1496 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo
semente alterado na semente
295 G1499 ΟΕ Pigmento alterado Cor verde escuro
Arquitetura Arquitetura da
alterada planta alterada
234/726
Flor alterada Identidade do órgão
floral desenvolvimento alterados e
297 G1519 ΚΟ Letal ao embrião Fenótipo letal ao
embrião: ilvo
herbicida em
potencial
299 G1526 ΚΟ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
301 G1540 ΟΕ Diferenciação Diferenciação
celular alterada celular reduzida no
meristema
303 G1543 ΟΕ Arquitetura Arquitetura
alterada alterada, planta
Morfologia: outra compacta
Óleo alterado na Cor verde escuro
semente Óleo diminuído na
Folha alterada semente
lipideos de prenila Aumento de clorofila
a e b
2667 G1587 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
235/726
305 G1634 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
Proteína alterada Teor de proteína da
na semente semente diminuído
307 G1637 ΟΕ Proteína alterada Teor de proteína
na semente alterado na semente
309 G1640 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo
semente aumentado na semente
311 G1645 ΟΕ Inflorescência Estrutura alterada
alterada da inflorescência
313 G1646 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
2685 G1649 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
315 G1652 ΟΕ Proteína alterada Teor de proteína da
na semente semente aumentado
G1666 ΚΟ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
317 G1672 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo
semente alterado na semente
319 G1677 ΟΕ Proteína alterada Teor de proteína
236/726
na semente alterado na semente Teor de óleo alterado na semente
Óleo alterado semente na
321 G1749 ΟΕ Necrose aumentada Formação de lesões
necróticas
323 G1750 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
325 G1756 ΟΕ Suscetibilidade Suscetibilidade
aumentada a doença aumentada ao
Botrytis
327 G1765 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
329 G1777 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
Proteína alterada Teor de proteína da
na semente semente diminuído
331 G1792 ΟΕ Folha alterada Folhas brilhantes,
Tolerância verde escuro
aumentada a doença Resistência
Tolerância aumentada ao
aumentada ao Erysiphe
237/726
estresse abiótico e tensão osmótica Resistência aumentada ao Botrytis Resistência aumentada ao Fusarium Tolerância aumentada ao meio limitado em nitrogênio Tolerância aumentada a estiagem
333 G1793 OE Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
335 G1794 OE Arquitetura alterada Resposta a luz alterada e/ou tolerância a sombra Tolerância aumentada a tensão osmótica e estresse abiótico Arquitetura alterada, planta com mais arbustos Dominância apical reduzida Fotomorfogênese constitutiva Sensibilidade aumentada ao PEG alto Crescimento reduzido da raiz
238/726
337 G1804 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada Sensibilidade ao
Sensibilidade ao açúcar alterada:
açúcar alterada mais sensível a
glicose nos ensaios
de germinação
339 G1818 ΟΕ Proteína alterada Teor aumentado de
na semente proteína
341 G1820 ΟΕ Época de floração Floração precoce
alterada Sensibilidade
Sensibilidade ao reduzida ao ABA
hormônio alterada Teor de proteína da
Proteína alterada semente aumentado
na semente Germinação melhor em
Tolerância alto teor de NaCl
aumentada ao Tolerância aumentada
estresse abiótico e a estiagem
tensão osmótica
2733 G1835 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
343 G1836 ΟΕ Tolerância Germinação melhor em
aumentada ao teor alto de sal
estresse abiótico e Tolerância aumentada
239/726
tensão osmótica a estiagem
345 G1838 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
347 G1841 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Época de floração alterada Germinação melhor sob estresse térmico Floração precoce
349 G1842 ΟΕ Época de floração alterada Floração precoce
351 G1843 ΟΕ Época de floração alterada Floração precoce
353 G1852 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Melhor crescimento da raiz sob tensão osmótica
355 G1863 ΟΕ Folha alterada Forma e coloração alteradas da folha
357 G1880 ΚΟ Tolerância aumentada a doença Resistência aumentada ao Botrytis
359 G1895 ΟΕ Época de floração alterada Floração tardia
361 G1902 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
240/726
semente semente aumentado
363 G1903 ΟΕ Proteína alterada na semente Teor de proteína da semente diminuído
365 G1919 ΟΕ Tolerância aumentada a doença Tolerância aumentada ao Botrytis
367 G1927 ΟΕ Tolerância aumentada a doença Tolerância aumentada ao Sclerotinia
369 G1930 ΟΕ Tolerância aumentada a tensão osmótica Regulação do crescimento; absorção de nutriente Germinação melhor sob tensão osmótica Sensibilidade C/N alterada
371 G1936 ΚΟ Suscetibilidade aumentada a doença Suscetibilidade aumentada ao Sclerotinia Suscetibilidade aumentada ao Botrytis
373 G1944 ΟΕ Senescência alterada Senescência precoce
375 G1946 ΟΕ Óleo alterado na semente Proteína alterada Teor de óleo da semente aumentado Teor de proteína da
241/726
na semente Época de floração alterada semente diminuído Floração precoce Crescimento da raiz aumentado em meios isentos de fosfato
Regulação crescimento; absorção nutriente do de
377 G1947 ΚΟ Fertilidade Fertilidade reduzi da
alterada
379 G1948 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
381 G1950 ΟΕ Tolerância Tolerância aumentada
aumentada a doença ao Botrytis
383 G1958 ΚΟ Tamanho alterado Tamanho e massa de
Óleo alterado na raiz reduzidos
semente Teor de óleo da
Proteína alterada semente aumentado
na semente Teor de proteína da
semente aumentado
2157 G1995 ΟΕ Resposta a luz Tolerância a sombra
alterada e/ou aumentada; falta de
tolerância a sombra fenótipo de
esquivamento da
sombra
242/726
385 G2007 ΟΕ Época de floração alterada Floração tardia
387 G2010 ΟΕ Época de floração alterada Floração precoce
389 G2053 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Regulação do crescimento; absorção de nutriente Crescimento da raiz aumentado sob tensão osmótica Tolerância aumentada a estiagem Sensibilidade C/N alterada
2797 G2057 ΟΕ Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
391 G2059 ΟΕ Óleo alterado na semente Proteína alterada na semente Teor de óleo alterado na semente Teor de proteína alterado na semente
393 G2085 ΟΕ Semente alterada Tamanho da semente aumentado e cor alterada semente
395 G2105 ΟΕ Semente alterada Sementes pálidas, maiores
243/726
397 G2110 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Tolerância aumentada ao teor alto de sal Tolerância aumentada a estiagem
399 G2114 ΟΕ Semente alterada Tamanho da semente aumentado
401 G2117 ΟΕ Proteína alterada na semente Teor de proteína da semente aumentado Sensibilidade C/N alterada
403 G2123 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
405 G2130 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico Germinação melhor no calor
2163 G2131 ΟΕ Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
407 G2133 ΟΕ Sensibilidade ao herbicida alterada Época de floração alterada Tolerância aumentada ao Tolerância aumentada ao glifosato Floração tardia Tolerância a estiagem aumentada Sensibilidade C/N
244/726
estresse abiótico e tensão osmótica Regulação do crescimento; absorção de nutriente alterada
409 G2138 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
411 G2140 ΟΕ Sensibilidade ao hormônio alterada Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Sensibilidade ao ABA diminuída Germinação melhor em alto teor de NaCl e sacarose Tolerância aumentada a estiagem
413 G2143 ΟΕ Inflorescência alterada Folha alterada Flor alterada Desenvolvimento alterado de inflorescência Forma alterada da folha, cor verde escuro Desenvolvimento alterado da flor, tecido ectópico do carpelo
245/726
415 G2144 ΟΕ Época de floração Floração precoce
alterada Folhas verde pálido,
Folha alterada forma alterada da
Resposta a luz folha
Regulação do Hipocótilos longos,
crescimento; forma alterada da
absorção de folha
nutriente Sensibilidade C/N
alterada
2827 G2145 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
417 G2153 ΟΕ Tolerância Germinação melhor
aumentada a tensão sob tensão osmótica
osmótica
419 G2155 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada
421 G2192 ΟΕ Óleo alterado na Composição de ácidos
semente graxos da semente
alterada
423 G2295 ΟΕ Época de floração Floração precoce
alterada
425 G2340 ΟΕ Glicosinolatos da Perfil alterado do
semente alterados glicosinolato
246/726
427 G2343 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente aumentado
429 G2346 ΟΕ Tamanho alterado Sementeiras aumentadas
431 G2347 ΟΕ Época de floração alterada Floração precoce
433 G2379 ΟΕ Tolerância aumentada a tensão osmótica Vigor aumentado da sementeira em meios com alto teor de sacarose
435 G2430 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Tamanho alterado Tolerância aumentada ao calor Tamanho de folha aumentado, desenvolvimento mais rápido
437 G2505 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Resposta a luz alterada e/ou tolerância a sombra Tolerância aumentada a estiagem Tolerância a sombra aumentada; falta de fenótipo de esquivamento da sombra
439 G2509 ΟΕ Óleo alterado na semente Teor de óleo da semente diminuído
247/726
Proteína alterada Teor de proteína da
na semente semente aumentado
Lipídeos de prenila Aumento de alfa-
alterados na tocoferol
semente Dominância apical
Arquitetura reduzida
alterada Floração precoce
Época de floração
alterada
2875 G2512 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento, alterada
absorção de
nutriente
441 G2517 ΟΕ Sensibilidade ao Tolerância aumentada
herbicida alterada ao glifosato
443 G2520 ΟΕ Lipídeos de prenila Composição de
alterados na tocoferol alterada
semente Sensibilidade C/N
Regulação do alterada
crescimento,
absorção de
nutriente
2185 G2535 ΟΕ Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento, alterada
absorção de
248/726
nutriente
445 G2555 ΟΕ Resposta a luz alterada e/ou tolerância a sombra Suscetibilidade aumentada a doença Fotomorfogênese constitutiva Suscetibilidade aumentada ao Botrytis
447 G2557 ΟΕ Folha alterada Flor alterada Forma alterada da folha, cor verde escuro Desenvolvimento alterado da flor, tecido ectópico do carpelo
449 G2583 ΟΕ Folha alterada Folhas com mais brilho
451 G2701 ΟΕ Tolerância aumentada ao estresse abiótico e tensão osmótica Germinação melhor em alto teor de NaCl e sacarose Tolerância aumentada a estiagem
2191 G2718 ΟΕ Regulação do crescimento; absorção de nutriente Sensibilidade C/N alterada
453 G2719 ΟΕ Tolerância Vigor aumentado da
249/726
aumentada a tensão sementeira em alto
osmótica teor de sacarose
Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada
absorção de
nutriente
2193 G2776 ΟΕ Tolerância Tolerância aumentada
aumentada ao a estiagem
estresse abiótico e
tensão osmótica
455 G2789 ΟΕ Sensibilidade ao Germinação melhor em
hormônio alterada alto teor de
Tolerância sacarose
aumentada ao Sensibilidade
estresse abiótico e reduzida ao ABA
tensão osmótica Tolerância aumentada
Resposta a luz a estiagem
alterada e/ou Tolerância a sombra
tolerância a sombra aumentada; falta de
Regulação do fenótipo de
crescimento; esquivamento da
absorção de sombra
nutriente Sensibilidade C/N
alterada
457 G2830 ΚΟ Óleo alterado na Teor de óleo da
250/726
semente semente aumentado
1951 G12 ΚΟ ΟΕ Sensibilidade ao hormônio alterada Necrose aumentada Sensibilidade aumentada ao ACC Necrose da folha e hipocótilo
1953 G30 ΟΕ Folha alterada Resposta a luz alterada e/ou tolerância a sombra Folhas verdes brilhantes Tolerância a sombra aumentada; falta de fenótipo de esquivamento da sombra
1975 G231 ΟΕ Bioquímica da folha alterada Óleo alterado na semente Proteína alterada na semente Teor de ácidos graxos insaturados na folha aumentado Teor de óleo da semente aumentado Teor de proteína da semente diminuído
1979 G247 ΟΕ Tricomas alterados Distribuição de tricomas alterada, densidade reduzida do tricoma
1991 G370 ΚΟ ΟΕ Tamanho alterado Tricoma alterado Folhas brilhantes, de tamanho reduzido,
251/726
formação de tricoma ectópico
2009 G485 ΟΕ Época de floração Floração precoce
ΚΟ alterada Floração tardia
Época de floração
alterada
2061 G839 ΟΕ Regulação do Tolerância aumentada
crescimento; ao meio limitado em
absorção de nitrogênio
nutriente
2099 G1357 ΟΕ Folha alterada Forma alterada da
Tolerância folha, folhas verde
aumentada ao escuro
estresse abiótico e Tolerância aumentada
tensão osmótica ao frio
Sensibilidade ao Insensível ao ABA
hormônio alterada Floração tardia
Época de floração
alterada
2126 G1646 ΟΕ Óleo alterado na Teor de óleo da
semente semente aumentado
2142 G1816 ΟΕ Sensibilidade ao Tolerância aumentada
açúcar alterada a glicose
Regulação do Sensibilidade C/N
crescimento; alterada; menos
252/726
absorção de antocianina no meio
nutriente limitado em
Tolerância nitrogênio
aumentada ao Tolerância aumentada
estresse abiótico e a tensão osmótica
tensão osmótica Pêlos das raizes
Raiz alterada aumentados
Tricomas alterados Folhas glabo
Tolerância aumentada
ao meio limitado em
nitrogênio
2147 G1888 ΟΕ Tamanho alterado Tamanho reduzido,
folhas verde escuro
2153 G1945 ΟΕ Época de floração Floração tardia
alterada Forma alterada da
Folha alterada folha
2195 G2826 ΟΕ Flor alterada Rosetes aéreas
Tricomas alterados Formação de tricoma
ectópico
2197 G2838 ΟΕ Tricomas alterados Densidade aumentada
Época de floração do tricoma
alterada Floração tardia
Flor alterada Flor: alterações
Folhas múltiplas
Tamanho alterado Rosetes aéreas
253/726
Folhas verde escuro Tamanho da semente aumentado
2199 G2839 OE Tolerância Germinação melhor em
aumentada ao alto teor de
estresse abiótico e sacarose
tensão osmótica Tolerância aumentada
Inflorescência a estiagem
alterada Pedúnculos a jusante
Tamanho alterado Tamanho reduzido
[0311] A tabela 8 mostra os polinucleotídeos identificados pela SEQ ID N°: Gene ID (GID) ; a família do fator de transcrição a qual o polipeptídeo pertence; e os domínios conservados do polipeptídeo. A primeira coluna mostra a SEQ ID NO de polinucleotídeo; a terceira coluna mostra a família do fator de transcrição a qual o polipeptídeo pertence e a quarta coluna mostra as posições dos resíduos de aminoácido do domínio conservado nas coordenadas do aminoácido (AA).
Tabela 8. Famílias genéticas e domínios conservados
SEQ ID NO do polipeptídeo: No.GID Família Domínios conservados nas coordenadas de aminoácido
4 G19 AP2 76-145
6 G22 AP2 89-157
10 G28 AP2 145-213
254/726
12 G47 ΑΡ2 11-80
38 G226 Relacionada a MYB 34-69
60 G353 Z-C2H2 41-61, 84-104
62 G354 Z-C2H2 42-62, 88-109
88 G481 CAAT 20-110
90 G482 CAAT 26-116
2010 G485 CAAT 20-110
94 G489 CAAT 57-156
128 G634 TH 62-147, 189-245
148 G682 Relacionada a MYB 27-63
168 G864 AP2 119-186
170 G867 AP2 59-124
186 G912 AP2 51-118
188 G913 AP2 62-128
190 G922 SCR 225-242
192 G926 CAAT 131-225
200 G975 AP2 4-71
2516 G1048 BZIP 138-190
222 G1069 AT-gancho 67-74
224 G1073 AT-gancho 33-42, 78-175
226 G1075 AT-gancho 78-85
2102 G1364 CAAT 29-119
270 G1411 AP2 87-154
278 G1451 ARF 22-357
304 G1543 HB 135-195
255/726
332 G1792 AP 2 17-85
2142 G1816 Relacionada a MYB 26-61
342 G1820 CAAT 70-133
344 G1836 CAAT 30-164
370 G1930 AP2 59-124
2608 G1995 Z-C2H2 93-113
408 G2133 AP2 11-83
418 G2153 AT-gancho 75-94, 162-206
420 G2155 AT-gancho 18-38
2172 G2345 CAAT . 28-118
440 G2509 AP2 89-156
450 G2583 AP2 4-71
G2718 Relacionada a MYB 28-64
[0312] Exemplos de algumas das utilidades que podem ser desejáveis nas plantas e que podem ser providas por transformação das plantas com as sequências presentemente reveladas, são listados na Tabela 9. Muitos dos fatores de transcrição listados na Tabela 9 podem ser operavelmente ligados a um promotor específico que faz com que o fator de transcrição seja expresso em resposta aos sinais ambientais, específicos para tecido ou temporais. Por exemplo, G362 induz tricomas ectópicos nas flores, porém também produz plantas pequenas. O primeiro pode ser desejável para produzir resistência ao inseto ou herbívoro ou rendimento aumentado do algodão, porém o último pode ser
256/726 indesejável pelo fato de que reduz a biomassa. Contudo, ligando-se operavelmente G362 com um promotor específico para flor, pode-se obter os benefícios desejáveis do gene, sem afetar a biomassa total a um grau significativo. Para exemplos de promotores específicos para flores, vide Kaiser e outros, {supra). Para exemplos de outros promotores específicos para tecido, temporais ou induzíveis, vide a discussão acima sob o cabeçalho Vetores, Promotores e Sistemas de Expressão.
Tabela 9. Genes, traços e utilidades que afetam as características das plantas
Categoria do Fenótipo(s) Genes de fator de Utilidade
traço transcrição que
impactam os traços
Estresse Efeito do Germinação, razão
abiótico resfriamento G256; G664; G1322 de crescimento,
nas plantas plantio precoce
Tolerância rendimento
aumentada: aperfeiçoados
Germinação no
frio G256; G664 Plantio precoce;
Tolerância sobrevivência
aumentada: melhorada,
rendimento
Tolerância ao G720 (G720 KO é Plantio precoce;
257/726
congelamento mais G912; suscetível); G913 qualidade aperfeiçoada, sobrevivência, rendimento
Estiagem Sobrevivência
Tolerância G4 7; G175; G188; melhorada, vigor,
aumentada: G303; G325; G353; aparência,
G4 81; G489; G634; rendimento
G682; G864; G912;
G913; G922; G975;
G1069; G1452;
G1792; G1820;
G1836; G2053;
G2110; G2133;
G2140; G2505;
G2701; G2776;
G2789; G2839
Calor
Tolerância G4 64; G682; G864; Germinação, razão
aumentada: G1305; G1841; de crescimento,
G2130; G2430 plantio tardio,
rendimento
aperfeiçoados
Tensão
osmótica G1794 Manipulação de
258/726
Sensibilidade G4 7; G17 5; G188; resposta ao
aumentada: G303; G32 5; G353; estresse abiót ico
Tolerância G489; G922; G926; Razão de
aumentada: G1069; G1089; germinação, vigor
G1452; G1816; da sementeira,
G1820; G1852; sobrevivência,
G1930; G2053; rendimento
G2140; G2153; aperfeiçoados
G2379; G2701;
G2719; G2789; G2839
Tolerância ao
sal G545 Manipulação da
Mais G22; G196; G226; resposta as
suscetível: G312; G482; G801; condições de alto
Tolerância G8 67; G922; G1836; teor de sal
aumentada: G2110 razão de
germinação,
sobrevivência,
rendimento
aperfeiçoados;
faixa de
crescimento
estendida
Estresse ao
nitrogênio G1794 Manipulação da
259/726
Sensibilidade G225; G226; G839; resposta
à limitação de G1792; G1816 relacionada às
N: condições baixas
Tolerância à de nutrientes
limitação de Rendimento
N: aperfeiçoado e
tolerância ao
estresse de
nutriente, menos
USO de
fertilizante
Estresse por
fosfato G54 5; G5 61; G911; Rendimento
Tolerância a G1946 aperfeiçoado e
limitação de tolerância ao
P: estresse de
nutriente, menos
USO de
fertilizante
Estresse G477 Rendimento
Oxidativo aperfeiçoado,
qualidade,
tolerância ao
estresse químico e
ultravioleta
260/726
Herbicida Glifosato G343; G2133; G2517 Geração de plantas resistentes ao glifosato para aperfeiçoar o controle de ervas daninhas
Sensibilidade ao hormônio Sensibilidade ao ácido abscisico (ABA) Sensibilidade reduzida ao ABA: G546; G926; G1069; G1357; G1452; G1820; G2140; G2789 Modificação do desenvolvimento da semente, dormência aperfeiçoada da semente, tolerância ao frio e desidratação
Sensibilidade ao etileno Resposta alterada: Insensível ao etileno: G1134 G1330 Manipulação do amadurecimento do fruto
Doença Botrytis: Sensibilidade G248; G371; G1064; Manipulação da
261/726
aumentada : Resistência aumentada ou tolerância: G1084; G1255; G1936; G2555 G28; G1792; G1919; G1950 G1196; G1756; G1880; resposta organismo doença Rendimento aperfeiçoado, aparecimento, sobrevivência, faixa estendida ao da
Fusarium
Sensibilidade G188; G545; G896 Manipulação da
aumentada ao: G1047; G1792 resposta ao
Resistência organismo da
aumentada ou doença
tolerância: Rendimento
aperfeiçoado,
aparecimento,
sobrevivência,
faixa estendida
Erysiphe
Suscetibilidad G545; G881 Manipulação da
e aumentada G19; G28; G409; resposta ao
ao: G1266; G1363 ; G1792 organismo da
Resistência doença
aumentada ou Rendimento
tolerância: aperfeiçoado,
262/726
aparecimento, sobrevivência, faixa estendida
Pseudomonas
Suscetibilidad G545 Manipulação da
e aumentada resposta ao
ao: organismo da
doença
Sclerotinia
Suscetibilidad G27 8; G477 ; G594; Manipulação da
e aumentada G1936 resposta ao
ao: G28; G1927 organismo da
Resistência doença
aumentada ou Rendimento
tolerância: aperfeiçoado,
aparecimento,
sobrevivência,
faixa estendida
Regulador do Sensibilidade Alteração do
crescimento ao açúcar G241; G254 ; G567; equilíbrio de
alterada G680; G912; G1804 energia, razão
Tolerância aos G481; G8 67; G1225; fotossintética,
açúcares G1816 acúmulo de
diminuída: carboidrato,
263/726
Tolerância produção de
aumentada aos biomassa, relações
açúcares: de fonte-
escoadouro,
senescência;
alteração do
acúmulo de
armazenamento do
composto nas
sementes
Sensibilidade G682; G226; G1816;
alterada ao G2718; G2 4; G54 5;
C/N G7 60; G937; G971;
G988; G1069; G1322;
G1587; G1666;
G2117; G2131;
G2520; G2789 ; G8;
G27; G156; G183;
G189; G234; G237;
G347; G427; G5 90;
G635; G657; G872;
G904; G912; G932;
G958; G964 ; G975;
G97 9; G1049; G1246;
264/726
G1255; G1266; G1331; G1332; G1494; G1649; G1750; G1816;G1835; G1930; G2053; G2057; G2133; G2144; G2145; G2295; G2512; G2535; G2719
Época de florescência Florescimento precoce G157; G180; G183; G485 (OE); G490; G590; G789; G1225; G1494; G1820; G1841; G1842; G1843; G1946; G2010; G2144; G2295; G2347; G2509 Tempo de geração mais rápido; sincronia de florescência; colheitas adicionais dentro da estação de crescimento, encurtamento dos programas de reprodução
Florescimento tardio G8; G47; G157; G192; G214; G231; G361; G362; G485 Rendimento ou biomassa aumentada, ameniza
265/726
(KO); G562; G736; G748; G859; G910; G913; G971; G1051; G1052; G1357; G1452; G1478; G1804; G1895; G1945; G2007; G2133; G2155; G2838 risco de escape de pólen transgênico, sincronia de florescimento
Desenvolviment o geral e morfologia Estrutura da flor alterada Estame: Sépala: Pétala: Pedúnculo: Carpelo: Múltiplas alterações: Órgãos florais aumentados: Siliquas: Fertilidade reduzida: Rosetas aéreas G988; G1075; G1140; G1499; G2557 G1075; G1140; G2557 G638; G1075; G1140; G1449; G1499; G2557 G353; G354; G988 G1063; G1140; G2143; G2143; G2557 G638; G988; G1063; G1140; G1449; G1499; G2143; G2557 G988; G1449; G2838 G353; G354 G470; G779; G988; G1075; G1140; Modificação ornamental da arquitetura da planta, fertilidade aperfeiçoada ou reduzida para aliviar escape de pólen transgênico, tamanho do fruto aperfeiçoado, forma, número ou rendimento
266/726
G1499; G1947; G2143; G2557 G638; G779; G1140; G1499 G1995; G2826; G2838
Alteração da arquitetura da inflorescência Padrão de ramificação alterado: Internotos curtos/inflore scência de arbustos: Alongamento do internodo: Falta de inflorescência G47; G1063; G1645; G2143 G47 G1063 G1499; G2143 Modificação ornamental da arquitetura da flor; época de floração; hábitos da planta alterados para render ou beneficio de capacidade de colheita; redução na produção do pólen de plantas geneticamente modificadas; manipulação da sazonalidade e hábitos anuais ou
267/726
pereniais;
manipulação determinante crescimento indeterminado de X
Desenvolviment Modificação
o do meristema G390; G391 ornamental da
do broto arquitetura da
alterado planta,
Bifurcações do manipulação do
caule: crescimento e
desenvolvimento,
aumento no número
de folhas,
modulação do
padrão de
ramificações para
prover rendimento
ou biomassa
aperfeiçoada
Padrão de G427; G568; G988; Modificação
ramificação G1543; G1794 ornamental da
alterado arquitetura da
planta,
268/726
resistência espalhamento vento ou aperfeiçoado ao pelo chuva
Dominância Modificação
apical G47; G211; G1255; ornamental da
Dominância G1275; G1411; arquitetura da
apical G1488; G1794; G2509 planta
reduzida:
Densidade do Modificação
tricoma G225; G226; G24 7; ornamental da
alterada; G585; G67 6; G682; arquitetura da
Desenvolviment G1332; G1452; G1816 planta,
o ou estrutura G247; G362; G37 0; produtividade da
Tricomas G67 6; G2826 planta aumentada
reduzidos ou G362; G634; G838; (por exemplo,
ausentes: G2838 diterpenos,
Tricomas algodão),
ectópicos/dese resistência aos
nvolvimento do insetos e
tricoma herbívoros
alterado/esmae
cimento da
célula :
Aumento no
269/726
número, tamanho ou densidade dos tricomas:
Morfologia do G47; G438; G748; Modulação do teor
caule e G988; G1488 de lignina;
estrutura do melhora da
tecido madeira,
vascular palatabilidade dos
alteradas frutos e vegetais
Aperfeiçoament
o da raiz G1482 Rendimento
Crescimento e G225; G226; G1816 aperfeiçoado,
proliferação tolerância ao
da raiz estresse;
aumentados: ancoramento
Pêlos na raiz
aumentados:
Desenvolviment G979
o da semente,
amadurecimento
e germinação
alterados
Diferenciação G1540 Aumento no carpelo
e proliferação ou desenvolvimento
270/726
celular do fruto; regeneração melhorada dos brotos do calo em sistemas de transformação ou micro-propagação
Desenvolviment o rápido G2430 Promove desenvolvimento mais rápido e a reprodução nas plantas
Senescência Senescência prematura: G636; G1463; G1944 Aperfeiçoamento na resposta a doença, amadurecimento do fruto
Letalidade, quando superexpressa G877; G1519 Alvo herbicida; ablação dos tecidos ou órgãos específicos, tais como, estame para impedir escape de pólen
Necrose G12, G24 Resistência a
271/726
doença
Tamanho da Tamanho da G1073; G1451 Rendimento
planta planta aperfeiçoado,
aumentado biomassa,
aparecimento
Sementeiras G2346; G2838 Sobrevivência,
maiores vigor das
sementeiras e
rendimento
aperfeiçoado,
Plantas mais G24; G343; G353; Raquitismo,
compactas ou G354; G362; G37 0; resistência ao
anãs G1008; G1277; espalhamento pelo
G1543; G1794; G1958 vento ou chuva,
manipulação das
respostas de
giberelina
Morfologia das Folhas verde G674; G912; G1063; Fotossintese,
folhas escuro G1357; G1452; biomassa,
G1482; G1499; aparência e
G1792; G1863; rendimento
G1888; G2143; melhorados
G2557; G2838
272/726
Alteração forma da f na olha G211; G736; G1357 G1494 G1863 G353; G1063; / r ; G2143; G67 4; G1146; G1452; G1543; G2144 Aplicações ornamentais
Tamanho da
folha G18 9; G214; G1451; Rendimento
aumentado: G2430 aumentado,
Tamanho, aplicações
número ou ornamentais
massa da folha
aumentados
Folhas verde G1494 ; G2144 Aplicações
claro ornamentais
Matização G635 Aplicações
ornamentais
Folhas G30; G1792; G2583 Aplicações
brilhantes ornamentais,
manipulação da
composição.
quantidade ou
distribuição da
cera
Morfologia da Coloraçao G156; G2105; G2085 Aparecimento
273/726
semente alterada semente da
Tamanho e
forma da G450; G584; G1255; rendimento,
semente G2085; G2105; G2114 aparecimento
Tamanho G1040 Aparecimento
aumentado da G1040; G1062 Aparecimento
semente
Tamanho
diminuído da
semente:
Forma alterada
da semente
Bioquímica da Cera da folha G975; G1792; G2583 Resistência ao
folha aumentada inseto, agente
patogênico
Lipídeos de
prenila da G987
folha G652; G987; G2509
Clorofila G748
reduzida: G214; G1543
Aumento nos
tocoferóis
Teor de
274/726
luteina
aumentado
Aumento na
clorofila ou
carotenóides
Açúcares
insolúveis na G211
folha
Aumento de
xilose na
folha
Teor de G663; G1482; G1888
antocianina
aumentado na
folha
Ácidos graxos
na folha G987
Redução no G214
teor de ácidos
graxos na
folha:
Aumento no
teor de ácidos
graxos na
folha:
275/726
Bioquímica da semente Teor de óleo da semente Teor de óleo aumentado: Teor de óleo diminuído: Teor de óleo alterado: Teor de ácido graxo alterado: G162; G291; G427; G509; G519; G561; G590; G598; G62 9; G715; G849; G961; G1198; G1226; G1471; G1478; G1526; G1640; G1646; G1750; G1765; G1777; G1793; G1838; G1902; G1946; G1948; G1958, G2123; G2138; G2343; G2830 G180; G192; G241; G504; G1143; G1229; G1323; G1543; G2509 G567; G892; G974; G1451; G1496; G1646; G1672; G1677 G869; G1417; G2192 Rendimento de óleo aperfeiçoado Teor calórico reduzido
Teor de
276/726
proteína da G162; G22 6; G241; Rendimento da
semente G509; G98 8; G1323; proteína, valor
Teor de G1419; G1652; nutricional
proteína G1818; G1820; aperfeiçoados
aumentado: G1958; G2117; G2509 Teor calórico
Teor de G427; G1478; G1777; reduzido
proteína G1903; G1946
diminuído: G162; G5 67; G597;
Teor de G84 9; G8 92; G1634;
proteína G1637; G1677
aumentado:
Teor ou G652; G2509; G2520 Antioxidante e
composição de teor de vitamina E
lipideo de aperfeiçoados
prenila
alterada
Glucosinolato
da semente G484; G2340
Perfil
alterado:
Teor de G362; G663
antocianina
aumentado na
semente
277/726
Bioquímica da raiz Teor de antocianina aumentado na raiz G663
Resposta a luz/tolerância a sombra Cotilédone alterado, hipocotilo, desenvolviment o do pecíolo; orientação da flor, fotomorfogenes e constitutiva; fotomorfogenes e em pouca luz alteradas G183; G354; G634; G1048; G1322; G1331; G1412; G1488; G1494; G1794; G1995, G2144; G2505; G2555; G2789; Tolerância a sombra aperfeiçoada: potencial para densidades de plantio aumentadas e melhora do rendimento
Pigmento Nivel de antocianina aumentado G362; G663; G1482 Benéficos de saúde melhorados, aparência ornamental aperfeiçoada,
278/726
resistência ao estresse aumentada, atração de animais de polinização e dispersão de sementes
Abreviaturas: N = nitrogênio, P = fosfato, ABA = ácido abscísico, C/N = equilíbrio de carbono/nitrogênio
Descrição detalhada dos genes, traços e utilidades que afetam as características da planta [0313] As descrições que se seguem dos traços e utilidades associados aos presentes fatores de transcrição oferecem uma descrição mais compreensiva que aquela provida na Tabela 9.
Estresse abiótico, considerações gerais [0314] Fatores de transcrição das plantas podem modular a expressão genética e, por sua ser, ser modulados pela experiência ambiental de uma planta. Alterações significativas em um ambiente de planta invariavelmente resultam em uma alteração do padrão de expressão genética do fator de transcrição da planta. O padrão de expressão de fator de transcrição alterado geralmente resulta em alterações fenotípicas na planta. O(s) produto(s) genéticos
279/726 do fator de transcrição nas plantas transgênicas então difere(m) em quantidades ou proporções daquelas que se encontram nas plantas do tipo selvagem ou não transformadas e aqueles fatores de transcrição provavelmente representam polipeptídeos que são usados para alterar a resposta à alteração ambiental. Por meio de exemplo, é bem aceito na técnica que os processos analíticos com base em padrão de expressão alterado possam ser usados para classificar alterações fenotípicas em uma planta, mais eficazmente que o que se pode obter pelos processos tradicionais.
[0315] Estresse abiótico: resfriamento em estágio adulto. A tolerância ao resfriamento melhorada pode estender a faixa de desenvolvimento eficaz das espécies de colheita sensíveis ao resfriamento por permitir plantio precoce ou colheita tardia. A tolerância ao resfriamento aperfeiçoada pode ser conferida por expressão aumentada de glicerol-3-fosfato acetiltransferase em cloroplastos (vide, por exemplo, Wolter e outros, (1992) e outros, EMBO J. 4685-4692, e Murata e outros, (1992) Nature 356: 710-713).
[0316] A tolerância ao resfriamento também serviría como um modelo para o entendimento de como as plantas adaptam-se à escassez de água. Os estresses por resfriamento e falta de água compartilham vias de transdução de sinal semelhantes e mecanismos de tolerância/adaptação.
Por exemplo, aclimação às
280/726 temperaturas de resfriamento pode ser induzida por estresse por água ou tratamento com ácido abscisico. Os genes induzido por temperatura baixa incluem deidrinas (ou proteínas LEA). As deidrinas são também induzidas por salinidade, ácido abscisico, estresse por água e durante os estágios finais da embriogênese.
[0317] Outro impacto grande de resfriamento ocorre durante o armazenamento pós colheita. Por exemplo, alguns frutos e vegetais não são bem armazenadas em temperaturas baixas (por exemplo, bananas, abacates, melões e tomates). O processo de amadurecimento normal do tomate é prejudicado se ele for exposto à temperaturas de resfriamento. Os genes de fator de transcrição que conferem resistência à temperaturas de resfriamento, incluindo G256, G664 e G1322 podem assim melhorar a tolerância durante o armazenamento pós colheita.
[0318] Estresse abiótico: germinação no frio. Vários dos genes de fator de transcrição presentemente revelados conferem germinação melhor e crescimento em condições frias. Por exemplo, a germinação aperfeiçoada em condições frias vista com G256 e G664 indica um papel na regulação de respostas ao frio por esses genes e seus equivalentes. Esses genes podem ser projetados para manipular a resposta ao estresse em temperatura baixa. Os genes que permitiríam germinação e vigor da sementeira n
281/726 frio feriam utilidade altamente significativa permitindo que as sementes sejam plantadas mais cedo na estação com uma razão de sobrevivência maior. Os genes de fator de transcrição que conferem melhor sobrevivência em climas mais frios permitem que um plantador modifique a época de plantio na primavera e estenda a estação de crescimento adicionalmente para o outono para rendimentos de colheita maiores. A germinação das sementes e sobrevivência em temperaturas significativamente abaixo da temperatura média necessária para germinação das sementes e sobrevivência de plantas não transformadas, aumentaria a faixa em potencial de uma planta de colheita nas regiões onde isso por outro lado não florescería.
[0319] Estresse_____abiótico:______tolerância_____ao congelamento e tensão osmótica. Genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G47, G175, G188, G303, G325, G353, G489, G922, G926, G1069, G1089, G1452, G1820, G1852, G1930, G2053, G2140, G2153, G2379, G2701, G2719, G2789, G2839 e seus equivalentes, que aumentam a razão de germinação e/ou crescimento sob condições osmóticas adversas, impactariam a sobrevivência e rendimento de sementes e plantas. As tensões osmóticas podem ser reguladas por mecanismos de controle molecular específicos que incluem genes que controlam água em movimentos de íon, proteínas induzidas por estresse
282/726 funcional ou estrutural, percepção e transdução de sinal e limpeza do radical livre e muitos outros (Wang e outros, (2001) Acta Hort. (ISHS) 560: 285-292). Instigadores de tensão osmótica incluem congelamento, estiagem e alta salinidade, cada um sendo discutido e maiores detalhes a seguir.
[0320] Em muitos modos, o congelamento, teor alto de sal e estiagem possuem efeitos semelhantes nas plantas, não o último dos mesmos, que é uma indicação de polipeptídeos comuns que respondem a esses estresses diferentes. Por exemplo, o congelamento é semelhante ao déficit de água pelo que, o congelamento reduz a quantidade de água disponível para uma planta. A exposição às temperaturas de congelamento pode conduzir à desidratação celular, conforme a água deixa as folhas e forma cristais de gelo nos espaços intercelulares (Buchanan, supra). Como com a alta concentração de sal e congelamento, os problemas para as plantas causados por baixa disponibilidade de água incluem estresses mecânicos causados pela retirada de água celular. Assim, a incorporação dos fatores de transcrição que modificam uma resposta da célula à tensão osmótica ou aperfeiçoam a tolerância em (por exemplo, por G720, G912, G913 ou seus equivalentes), por exemplo, plantas de colheita e ornamentais, podem ser úteis na redução de dano ou perda. Efeitos específicos causados pelo congelamento,
283/726 alto teor de sal e estiagem são [0321] Estresse abiótico:____estiagem e baixa tolerância a umidade. Exposição a desidratação invoca estratégias de sobrevivência semelhantes nas plantas assim como o estresse ao congelamento (vide, por exemplo, Yelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) e estresse por estiagem, induz a tolerância ao congelamento (vide, por exemplo, Siminovitch e outros, (1982) Plant Physiol 69: 250-255; e Guy e outros, (1992) Planta 188: 265-270) . Além da indução de proteínas de aclimatação ao frio, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em condições de pouca água podem incluir, por exemplo área de superfície reduzida ou produção de óleo ou cera na superfície. Vários genes de fator de transcrição presentemente revelados, por exemplo, G912, G913, G1820, G1836e G2505 aumentam a tolerância da planta em condições de pouca água e juntamente com seus equivalentes funcionais, forneceríam os
benefícios de sobrevivência aperfeiçoada, rendimento
aumentado e faixa de plantio temporal e geográfica
estendidas.
[0322] Estresse abiótico: tolerância ao estresse
por aquecimento. A germinação de muitas colheitas é também sensível as altas temperaturas. Genes de fator de transcrição presentemente revelados que fornecem tolerância aumentada ao aquecimento, incluindo G464, G682, G864,
284/726
G1305, G1841, G2130, G2430 e seus equivalentes, seriam geralmente úteis nas plantas de produção que germinam e desenvolvem-se em condições quentes, podem encontrar uso específico para colheitas que são plantadas tardiamente na estação, ou estendem a faixa de uma planta por permitir o crescimento em climas relativamente quentes.
[0323] Estresse abiótico: sal. Os genes na Tabela 9 que fornecem tolerância ao sal podem ser usados para projetar colheitas tolerantes ao sal e árvores que podem florescer em solos com alto teor de salmoura ou sob condições de estiagem. Especificamente, a tolerância ao sal aumentada durante o estágio de germinação de uma planta melhora a sobrevivência e rendimento. Os genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G22, G196, G226, G312, G482, G801, G867, G922, G1836, G2110, e seus equivalentes que fornecem tolerância ao sal aumentada durante germinação, o estágio de sementeira e através de todo o ciclo de vida da planta, encontrariam valor específico para fornecer sobrevivência e rendimento em áreas onde a colheita específica normalmente não prospera.
[0324] Absorção de nutriente e utilização: nitrogênio e fósforo. Os genes de fator de transcrição presentemente revelados introduzidos nas plantas fornecem um meio para aperfeiçoar a absorção de nutrientes essenciais, incluindo compostos de nitrogênio, fosfatos,
285/726 potássio e traços de minerais. 0 desempenho melhorado, por exemplo, de G225, G226, G839, G1792 e outras linhagens de superexpressão sob baixo teor de nitrogênio e G545, G561, G911, G1946 sob condições de fósforo baias indicam que esses genes e seus equivalentes podem ser usados para projetar colheitas que poderíam prosperar sob condições de disponibilidade reduzida de nutrientes. Fósforos, especificamente, tendem a ser um nutriente limitado nos solos e geralmente adicionados como um componente nos fertilizadores. Plantas jovens possuem uma absorção rápida de fosfato e fosfato suficiente é importante para render colheitas de raiz, tais como, cenoura, batata e painço.
[0325] O efeito dessas modificações é aumentar a germinação de semeadura e faixa de plantas de colheita e ornamentais. As utilidades dos genes de fator de transcrição presentemente revelados que conferem tolerância as condições de baixos nutrientes também incluem economia de custo para o plantador reduzindo as quantidades de fertilizante necessárias, benefícios ambientais de escorrimento de fertilizante reduzido em vertentes de água; um rendimento aperfeiçoado e tolerância ao estresse. Além disso, em razão de fornecerem capacidade de absorção de nitrogênio aperfeiçoada, esses genes podem ser usados para alterar as quantidades de proteína das sementes e/ou composição, de tal modo que podería impactar no rendimento,
286/726 bem como no valor nutricional e produção de vários produtos alimentícios.
[0326] Várias linhagens de superexpressão de fator de transcrição, fabricam menos antocianina em sacarose alta mais glutamina indicam que esses genes podem ser usados para modificar estado de carbono e nitrogênio e, consequentemente, assimilam a divisão (assimilam a divisão se refere a maneira pela qual um elemento essencial, tal como nitrogênio, é distribuído entre grupos diferentes dentro de uma planta, geralmente em uma forma reduzida, com a finalidade de transporte para vários tecidos).
[0327] Tolerância aumentada das plantas ao estresse oxidativo. Nas plantas, como em todas coisas vivas, os estresses abiótico e biótico induzem a formação de radicais de oxigênio incluindo radicais de superóxido e peróxido. Isso possui o efeito de acelerar a senescência, especificamente nas folhas, com a resultante perda de rendimento e efeito adverso na aparência. De modo geral, as plantas que possuem nível maior de mecanismos de defesa, tais como, por exemplo, porções poliinsaturadas de lipídeos de membrana são mais prováveis de prosperar sob condições que introduzem estresse oxidativo (por exemplo, luz forte, ozônio, déficit de água, especificamente em combinação). Introdução dos genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G477 e seus equivalentes, que aumentam
287/726 o nível de mecanismos de defesa ao estresse oxidativo forneceríam efeitos benéficos no rendimento e aparência das plantas. Um agente de oxidação específico, o ozônio, mostrou causar dano foliar significativo, que impacta o rendimento e aparência de plantas de colheita e ornamentais. Além do dano foliar reduzido, que seria encontrado na planta resistente ao ozônio, criado pela transformação das plantas com alguns dos genes de fator de transcrição presentemente revelados, os últimos têm sido mostrados como possuindo fluorescência em clorofila aumentada (Yu-Sen Chang e outros, (2001) Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 265-272).
[0328] Sensibilidade ao herbicida diminuída. O s genes do fator de transcrição revelado, incluindo G343, G2133, G2517 e seus equivalentes, que conferem resistência ou tolerância aos herbicidas (por exemplo, glifosato) encontrarão uso na provisão de dispositivos para aumentar as aplicações herbicidas, sem prejuízo às plantas desejáveis. Isso permitiría aumentar o uso de um herbicida específico em um ambiente local, com o efeito de prejuízo aumentado às espécies indesejadas e menos perigo aos cultivos desejáveis, transgênicos.
[0329] Os nocauteamentos de vários genes de fator de transcrição revelados presentemente foram mostrados como sendo letais aos embriões em desenvolvimento. Assim, esses
288/726 genes são potencialmente úteis como alvos herbicidas.
[0330] Sensibilidade ao hormônio. ABA desempenha papéis reguladores em um hospedeiro dos processos fisiológicos em todas as plantas superiores, bem como nas inferiores (Davies e outros, (1991) Abscisic Acid: Physiology and Biochemistry. Bios Scientific Publishers, Oxford, UK; Zeevaart e outros, (1988) Ann Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 439-473; Shimizu-Sato e outros, (2001) Plant Physiol 127: 1405-1413). ABA media respostas de tolerância ao estresse em plantas superiores, é um composto de sinal chave que regula a abertura estomacal e, em conjunto com outros compostos de sinalização de planta, está implicado nas respostas de mediação relacionadas aos agentes patogênicos e enrolamento ou dano oxidativo (por exemplo, vide Larkindale e outros, (2002) Plant Physiol. 128: 682-695). Nas sementes, o ABA promove o desenvolvimento da semente, maturação dos embriões, síntese de produtos de armazenamento (proteínas e lipídeos), tolerância a dissecação e está envolvido na manutenção da dormência (inibição de germinação) e apoptose (Zeevaart e outros, (1988) Ann Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 439-473; Davies (1991), supra; Thomas (1993) Plant Cell 5: 1401-1410; e Bethke e outros, (1999) Plant Cell 11: 1033-1046). Aba também afeta a arquitetura da planta, incluindo crescimento da raiz e morfologia e razões
289/726 de raiz-para-broto. A ação ABA e o metabolismo são modulados não apenas por sinais ambientais, porém, também, por sinais endógenos gerados por retroalimentação metabólica, transporte, intercâmbio hormonal e estágio de desenvolvimento. A manipulação dos níveis de ABA e consequentemente por extensão da sensibilidade ao ABA, foi descrita como um dispositivo muito promissor para aperfeiçoar a produtividade, desempenho e arquitetura nas plantas, Zeevaart (1999) em: Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Hooykaas e outros, eds, Elsevier Science pp 189-207; and Cutler e outros, (1999) Trends Plant Sei. 4: 472-478).
[0331] Vários genes de fator de transcrição revelados presentemente afetam a sensibilidade ao ácido abscísico da planta (ABA), incluindo G546, G926, 1069, G1357, G1452, G1820, G2140, G2789. Assim, afetando a sensibilidade a ABA, esses genes de fator de transcrição introduzidos e seus equivalentes afetariam as sensibilidades ao frio, estiagem, oxidativa e outros estresses, arquitetura da planta e rendimento.
[0332] Vários outros genes de fator de transcrição presentes foram usados para manipular a transdução do sinal de etileno e vias de resposta. Esses genes podem assim ser usados para manipular o processo influenciado por etileno, tais como, germinação da semente ou amadurecimento do fruto
290/726 e para aperfeiçoar a qualidade do fruto.
[0333] Doenças, agentes patogênicos e pragas. Vários dos genes de fator de transcrição revelados presentemente foram mostrados ou são prováveis de afetar a resposta das plantas às várias doenças das plantas, agentes patogênicos e pragas. Os organismos de prejudiciais incluem fungos Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum e Erysiphe orontii. Os agentes patogênicos bacterianos aos quais pode ser oferecida resistência incluem Pseudomonas syringae. Outros organismos problemáticos podem incluir potencialmente nematóides, mollicutes, parasitas ou artrópodes herbívoros. Em cada caso, um ou mais genes de fator de transcrição transformados podem prover algum benefício à planta para ajudar a prevenir ou superar infestação ou serem usados para manipular qualquer uma das várias respostas da planta a doença. Esses mecanismos pelos quais os fatores de transcrição trabalham incluiríam aumento das ceras ou óleos da superfície, espessura da superfície ou a ativação das vias de transdução de sinal que regulam a defesa da planta em resposta aos ataques por pragas herbívoras (incluindo, por exemplo, inibidores de protease). Outros dispositivos para combater fungos e outros agentes patogênicos são aceleração da morte da célula local ou senescência, mecanismos usados para prover a difusão dos microorganismos
291/726 patogênicos através da planta. Por exemplo, o melhor exemplo conhecido de acelerar a morte da célula é a resposta hipersensivel mediada por gene de resistência, que causa a morte localizada da célula em um sítio de infecção e inicia uma resposta de defesa sistêmica. Uma vez que muitas defesas, moléculas de sinalização e vias de transdução de sinal são comuns para defender contra agentes patogênicos diferentes e pragas, tais como, fungos, bactérias, oomicete, nematóide e isento, os fatores de transcrição que estão implicados nas respostas de defesa contra os agentes patogênicos de fungos testados podem também funcionar em defesa contra outros agentes patogênicos e pragas. Esses fatores de transcrição incluem, por exemplo, G28, G1792, G1880, G1919, G1950 (resistência ou tolerância aperfeiçoada ao Botrytis), G1047, G1792 (resistência ou tolerância aperfeiçoada ao Fusarium), G19, G28, G409, G1266, G1363, G1792 (resistência ou tolerância aperfeiçoada ao Erysiphe), G545 (resistência ou tolerância aperfeiçoada ao Pseudomonas), G28, G1927 (resistência ou tolerância aperfeiçoada ao Sclerotinia), e seus equivalentes.
[0334] Regulador do crescimento: sensibilidade ao açúcar. Além de seu papel importante como uma fonte de energia e componente estrutural da célula da planta, os açúcares são moléculas reguladoras centrais que controlam
2Ύ2/726 vários aspectos da fisiologia, metabolismo e desenvolvimento da planta (Hsieh e outros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. 95: 13965-13970). Pensa-se que esse controle é obtido por regulação da expressão genética e, nas plantas superiores, os açúcares mostraram expressar ou ativar os genes de plantas envolvidos em muitos processos essenciais, tais como, fotossintese, metabolismo de glioxilato, respiração, síntese e degradação de amido e sacarose, resposta ao agente patogênico, resposta ao enrolamento, regulação do ciclo de célula, pigmentação, florescimento e senescência. Os mecanismos pelos quais a expressão genética controla o açúcar não são entendidos.
[0335] Uma vez que os açúcares são moléculas de sinalização importantes, a capacidade de controlar sua concentração de um açúcar de sinalização ou como a planta percebe ou responde a um açúcar de sinalização poderia ser usada para controlar o desenvolvimento, fisiológica ou metabolismo da planta. Por exemplo, o fluxo da sacarose (um açúcar dissacarídeo usado para transportar sistemicamente o carbono e energia na maioria das plantas) mostrou afetar a expressão genética e alterar o acúmulo do composto de armazenamento em sementes. Manipulação da via de sinalização da sacarose em sementes pode, portanto, fazer com que as sementes tenham mais proteína, óleo ou carboidrato, dependendo do tipo de manipulação. De modo
293/726 semelhante, nos tubérculos, a sacarose é convertida em amido que é usado como um armazenamento de energia. Acredita-se que as vias de sinalização de açúcar possam determinar, parcialmente, os níveis de amido sintetizado nos tubérculos. A manipulação da sinalização de açúcar nos tubérculos levaria aos tubérculos com um teor maior de amido.
[0336] Assim, os genes de fator de transcrição revelados presentemente que manipulam a via de transdução de sinal de açúcar, incluindo G241, G254, G567, G680, G912, G1804, G481, G867, G1225, juntamente com seus equivalentes, pode conduzir a expressão genética alterada para produzir
plantas com traços desej áveis. Especificamente, a
manipulação das vias de transdução de sinal de açúcar seria
usada para alterar as relações de fonte-escoadouro em
sementes, tubérculos, raízes e outros órgãos de
armazenamento, conduzindo ao aumento do rendimento.
[0337] Regulador do crescimento: sensibilidade ao C/N. O metabolismo de nitrogênio e carbono é hermeticamente ligado na maioria das passagens bioquímicas na planta. Os metabolitos de carbono regulam os genes envolvidos na aquisição e metabolismo de N, e são conhecidos por afetarem a germinação e a expressão dos genes fotossintéticos (Coruzzi e outros, (2001) Plant Physiol. 125: 61-64) e consequente crescimento. Estudos anteriores em nitrato
294/726 reductase (NR) em 197 6 mostraram que a atividade de NR seria afetada por Glc/Suc (Crawford (1995) Plant Cell 7: 859-886; Daniel-Vedele e outros, (1996) CR Acad Sei Paris 319: 961-968). Essas observações foram suportadas por experimentos posteriores que mostraram que os açúcares induzem mRNA de NR em sementeiras verdes, adaptadas ao escuro (Cheng CL, e outros, (1992) Proc Natl Acad Sei USA 89: 1861-1864). C e N podem ter relações antagonisticas como moléculas de sinalização; indução de luz ou atividade NR e níveis de mRNA podem ser mimetizados por metabolitos C e metabolitos N causando repressão da indução de NR no tabaco (Vincentz e outros, (1992) Plant J 3: 315-324). A regulação do gene por estado C/S foi demonstrada por vários genes N-metabólicos (Stitt (1999) Curr. Opin. Plant. Biol. 2: 178-186); Coruzzi e outros, (2001) supra). Assim, os genes de fator de transcrição que afetam a sensibilidade a C/N, tais como, G1816, podem ser usados para alterar ou aperfeiçoar a germinação e crescimento sob condições de limitação de nitrogênio.
[0338] Época de floração: floração precoce e tardia. Os genes de fator de transcrição revelados presentemente que aceleram o florescimento, que incluem G157, G180, G183, G485, G490, G590, G789, G1225, G1494, G1820, G1841, G1842, G1843, G1946, G2010, G2144, G2295, G2347, G2509, e seus equivalentes funcionais, poderíam ter
295/726 aplicações valiosas em tais programas, uma vez que eles permitem tempos de geração mais rápidos. Em várias espécies, por exemplo, brócolis, couve-flor, onde as partes reprodutivas das plantas constituem a colheita e os tecidos vegetativos são descartados, seria vantajoso acelerar a época de floração. A aceleração da floração encurtaria os programas de colheita e reprodução da planta. Adicionalmente, em alguns exemplos, um tempo de geração mais rápido permitiría que colheitas adicionais fossem feitas, dentro de uma dada estação de crescimento. Vários genes do Arabidopsis já mostraram acelerar o florescimento, quando expressos constitutivamente. Esses incluem, LEAFY, APETALA1 e CONSTANS (Mandei e outros, (1995) Nature 377: 522-524; Weigel and Nilsson (1995) Nature 377:e outros, 495-500; Simon e outros, (1996) Nature 384: 59-62).
[0339] Regulando-se a expressão do florescimento em potencial por uso de promotores induzíveis, o florescimento podería ser desencadeado por aplicação de uma substância química indutora. Isso permitiría que o florescimento fosse sincronizado através de uma colheita e facilitaria o processo de colheita eficiente. Tais sistemas induzíveis poderíam também ser usados para sintonizar a floração de variedades de colheitas as diferentes latitudes. No presente, espécies tais como, soja e algodão encontram-se disponíveis como uma série de grupos de maturidade que são
296/726 apropriados para diferentes latitudes com base em sua época de florescimento (que é governada pelo comprimento do dia). Um sistema no qual o florescimento pudesse ser controlado quimicamente permitiría que um grupo de maturidade do norte, de alto rendimento, simples, fosse desenvolvido em qualquer latitude. Nas regiões do sul, tais plantas podería desenvolver-se por períodos mais longos, antes da florescência ser induzida, dessa forma aumentando os rendimentos. Nas áreas mais ao norte, a indução seria usada para assegurar que a colheita floresça antes dos primeiros sinais de frio do inverno.
[0340] Em várias espécies dimensionáveis, por exemplo, colheitas de raízes, onde as partes vegetativas das plantas constituem a colheita e os tecidos reprodutivos são descartados, é vantajoso identificar e incorporar os genes de fator de transcrição que retardam ou impedem o florescimento, a fim de impedir que os recursos sejam desviados para o desenvolvimento reprodutivo. Por exemplo, G8, G47, G157, G192, G214, G231; G361, G362, G562, G736, G748, G859, G910, G913, G971, G1051, G1052, G1357, G1452, G1478, G1804, G1895, G1945, G2007, G2133, G2155, G2838 e equivalentes, retardam a época de florescimento nas plantas transgênicas. O desenvolvimento vegetativo estendido com os genes de fator de transcrição revelados presentemente poderíam assim trazer grandes aumentos nos rendimentos. A
297/726 prevenção da floração pode ajudar a maximizar os rendimentos vegetativos e impedir a saída do pólen de organismo geneticamente modificado (GMO).
[0341] Os fatores de transcrição presentemente revelados que estendem a época de floração possuem utilidade nas plantas projetadas com flores que duram mais para a indústria de horticultura, e estendendo o tempo no qual a planta é fértil.
[0342] O número de fatores de transcrição revelados presentemente pode estender a época de floração e retardar o corte da flor, o que teria utilidade nas planas projetadas com flores de duração maior para a indústria de horticultura. Isso forneceria um benefício significativo para a indústria ornamental, para ambos flores de corte e variedades de planta lenhosas (por exemplo, milho), bem como teria o potencial de distender o período fértil da planta, o que possivelmente impactaria o rendimento e programas de reprodução.
[0343] Desenvolvimento____geral____e____morf ologia : estrutura da flor e inflorescência: arquitetura, órgãos de
flor alterados, fertilidade reduzida, alterações múltiplas,
rosetes aéreas, ramos, distância internodo, flores
terminais e mudança de fase. Fatores de transcrição transgênica presentemente revelados, tais como, G353; G354,
G638; G779; G988; G1063; G1075; G1140; G1449; G1499; G2143;
298/726
G2557, G2838, G2839 e seus equivalentes, podem ser usados para criar plantas com flores maiores ou disposições de flores que são distintas dos cultivos do tipo selvagem ou não transformado. Isso provavelmente teria o maior valor para industria de horticultura ornamental, onde flores maiores ou configurações florais de interesse são geralmente preferidas e comandam os preços mais altos.
[0344] A estrutura da flor pode ter efeitos vantajosos e prejudiciais na fertilidade, e seria usada, por exemplo, para diminuir a fertilidade pela ausência, redução ou classificação dos componentes reprodutivos. De fato, as plantas que superexpressam um número dimensionável dos genes de fator de transcrição presentemente revelados, por exemplo, G470, G779, G988, G1075, G1140, G1499, G1947, G2143, G2557 e seus equivalentes funcionais possuem fertilidade reduzida; as flores não são férteis e não produzem sementes. Esses seriam traços desejáveis, como a fertilidade baixa podería ser explorada para prevenir ou minimizar o escape do pólen de organismos geneticamente modificados (GMOs) para o ambiente.
[0345] As alterações na arquitetura do broto vistas nas linhagens transformadas com G47, G1063, G1645, G2143, com seus equivalentes funcionais indicam que esses genes e seus equivalentes podem se usados para manipular padrão de ramificação de inflorescência. Isto podería influenciar o
299/726 rendimento e oferecer potencial para técnicas de colheita mais eficazes. Por exemplo, uma mutação auto desbaste do tomate resulta em um determinado padrão de crescimento e facilitaria a colheita (Pnueli e outros, (2001) Plant Cell 13 (12) : 2687-702) .
[0346] Uma aplicação interessante para manipulação da estrutura da flor, por exemplo, por fatores de transcrição introduzidos seria na produção aumentada de flores ou partes de flores comestíveis, incluindo açafrão, que é derivado dos estigmas de Crocus sativus.
[0347] Genes que conformam-se mais tarde em siliquas nas brassicates podem ser usados para modificar os processos de amadurecimento de frutos nas brassicates e outras plantas, que podem afetar positivamente a qualidade da semente ou fruto.
[0348] Vários fatores de transcrição revelados presentemente podem afetar o tempo de mudança de fase nas plantas. Uma vez que o tempo ou mudança de fase geralmente afeta o tamanho eventual da planta, esses genes podem ser benéficos pela provisão de dispositivos para aperfeiçoar o rendimento e biomassa.
[0349] Desenvolvimento____geral____e____morf ologia : meristema do broto e padrão de ramificação. Vários dos genes de fator de transcrição presentemente revelados incluindo G390 e G391, e G1794, quando introduzidos nas
300/726 plantas, mostraram causar bifurcações no caule no desenvolvimento de brotos, onde os meristemas dos brotos dividem para formar dois ou três brotos separados. Esses fatores de transcrição com seus equivalentes funcionais podem assim ser usados para manipular as ramificações. Isso fornecería uma aparência única que pode ser desejável em aplicações ornamentais, e pode ser usado para modificar ramificação lateral para uso na indústria florestal. Uma redução na formação de ramos laterais reduziría a formação de nós. De modo contrário, o aumento no número de ramos laterais fornecería utilidade quando uma planta for usada como tela para janelas ou divisória.
[0350] Desenvolvimento____geral____e____morfologia : dominância apical: A expressão modificada dos fatores de transcrição revelados presentemente (por exemplo, G47, G211, G1255, G1275, G1411, G1488, G1794, G2509 e seus equivalentes) que reduzem a dominância apical, poderíam ser usados na horticultura ornamental, por exemplo, para modificar a arquitetura da planta, por exemplo, para produzir uma estatura mais curta, com mais arbustos que a do tipo selvagem. A última forma teria utilidade ornamental, bem como proveria resistência aumentada ao espalhamento por chuva ou vento.
[0351] Desenvolvimento____geral____e____morfologia : densidade do tricoma, desenvolvimento ou estrutura. Vários
301/726 dos genes de fator de transcrição revelados presentemente foram usados para modificar o número de tricomas, densidade, esmaecimento da célula de tricoma, quantidade de produtos de tricoma produzidos pela planta, ou produzir formação de tricoma ectópico. Esses incluem G225; G226, G247; G362, G370; G585, G634, G676, G682, G1332, G1452, G1995, G2826 e G2838. Na maioria dos casos, onde as vias metabólicas são impossíveis de serem projetadas, a densidade crescente do tricoma ou tamanho nas folhas pode ser o único modo de aumentar a produtividade da planta. Assim, aumentando-se a densidade do tricoma, tamanho ou tipo, esses genes que afetam o tricoma com seus equivalentes funcionais teriam utilidade profunda nas práticas de agricultura molecular, por uso dos tricomas como um sistema de fabricação para metabolitos secundários complexos.
[0352] As glândulas de tricoma na superfície de muitas plantas superiores produzem e secretam exsudados que fornecem proteção dos elementos e pragas, tais como, insetos, micróbios e herbívoros. Esses exsudados podem imobilizar fisicamente os insetos e esporos, podem ser inseticidas ou antimicrobianos ou eles podem atuar como alergenos ou irritantes para proteger contra herbívoros. Modificando-se a localização do tricoma, a densidade ou atividade com os fatores de transcrição revelados
302/726 presentemente que modificam essas características da planta, plantas que são melhor protegidas e de rendimento mais alto podem resultar.
[0353] Uma aplicação em potencial para esses genes que afetam o tricoma e seus equivalentes também existe no algodão: fibras de algodão são tricomas unicelulares modificados que desenvolvem-se da epiderme do óvulo externo. De fato, apenas 30% dessas células epidérmicas desenvolvem-se em tricomas, porém possuem o potencial para desenvolver-se em um tricoma. Genes que afetam o tricoma podem desencadear um número aumentado dessas células que desenvolvem-se como tricomas e dessa forma, aumentar o rendimento das fibras de algodão. Uma vez que a família da malva está fortemente relacionada a família Brassica, os genes envolvidos na formação do tricoma da mesma forma possuem homólogos no algodão ou funcionam no algodão.
[0354] Se os efeitos no padrão do tricoma refletem uma alteração geral nos processos heterocrônicos, os fatores de transcrição afetando o tricoma ou seus equivalentes podem ser usados para modificar o modo pelo qual os meristemas e/ou células desenvolvem-se durante as diferentes fases do ciclo de vida da planta. Especificamente, alterando-se a regulagem das mudanças de fase, isto fornecería efeitos positivos no rendimento e produção de biomassa.
303/726 [0355] Desenvolvimento____geral____e____morf ologia : morfologia do caule e estrutura de tecido vascular alterada. As plantas transformadas com os genes do fator de transcrição que modificam a morfologia do caule ou teor de lignina podem ser usadas para afetar a arquitetura total da planta e a distribuição de células de fibra lignificadas dentro do caule.
[0356] A modulação do teor de lignina pode permitir que a qualidade da madeira usada para móveis ou construção seja aperfeiçoada. A lignina é rica em energia; aumentandose a composição da lignina isso seria valioso na elevação do teor de energia da madeira usada para combustível. De modo contrário, as indústrias de polpa e papel buscam madeira com um teor reduzido de lignina. Correntemente, a lignina deve ser removida em um processo caro que envolve o uso de muitas substâncias químicas poluentes. Consequentemente, a lignina é uma barreira séria à produção de papel e polpa eficaz (Tzfira e outros, (1998) TIBTECH 16: 439-446; Robinson (1999) Nature Biotechnology 17: 2730). Além das aplicações da biotecnologia florestal, a alteração do teor da lignina por expressar ou reprimir seletivamente os fatores de transcrição nos frutos e vegetais podem aumentar sua palatabilidade.
[0357] Os fatores de transcrição que modificam a estrutura do caule, incluindo G47, G438, G748, G988, G1488
304/726 e seus equivalentes, podem também ser usados para obter redução do desenvolvimento do broto em ordem maior, resultando em modificação significativa da arquitetura da planta. A superexpressão dos genes que codificam esses fatores de transcrição nas madeiras lenhosas pode resultar em árvores que não possuem ramos laterais, e possuem alguns nós na madeira. Alterando-se o padrão de ramos, isso podería ser aplicações nas colheitas ornamentais e agrícolas. Por exemplo, podem existir aplicações em algumas espécies onde os brotos secundários atualmente deve ser removidos manualmente, ou onde alterações no padrão de ramificação pudessem aumentar ou facilitar colheita mais eficiente.
[0358] Desenvolvimento____geral____e____morf ologia : desenvolvimento alterado da raiz. Modificando-se a estrutura ou desenvolvimento das raízes por transformação em uma planta de um ou mais dos genes de fator de transcrição revelados presentemente, incluindo G225, G226, G1482, e seus equivalentes, podem ser produzidas plantas que possuem a capacidade de prosperar em solos de outra forma improdutivos. Por exemplo, as raízes das parreiras estendendo-se adicionalmente em solos rochosos forneceriam melhor ancoramento, cobertura maior com ramos aumentados, ou permanecería viável em solos alagados, assim aumentando a faixa de plantio eficaz da colheita e/ou aumento do
305/726 rendimento e sobrevivência. Pode ser vantajoso manipular-se uma planta para produzir raízes mais curtas, como quando um solo no qual a planta crescerá está ocasionalmente inundado ou quando fungos patogênicos ou nematóides que causam doenças estão presentes.
[0359] Desenvolvimento____geral____e____morf ologia : desenvolvimento da semente, amadurecimento e razão de germinação. Vários genes de fator de transcrição revelados presentemente (por exemplo, G97 9) mostraram modificar o desenvolvimento da semente e razão de germinação, incluindo quando as sementes estão em condições normalmente desfavoráveis para germinação (por exemplo, frio, calor ou estresse por sal ou em presença de ABA) e podem, juntamente com equivalentes funcionais, assim ser usados para mpdificar e aperfeiçoar as razões de germinação sob condições adversas.
[0360] Desenvolvimento____geral____e____morf ologia : diferenciação da célula e proliferação da célula. Vários fatores de transcrição revelados regulam a proliferação da célula e/ou diferenciação, incluindo G1540 e seus equivalentes funcionais. 0 controle desses processos teria aplicações valiosas na transformação da planta, cultura da célula ou sistemas de micropropagação, bem como no controle da proliferação de tecidos ou tipos de células úteis e específicos. Os fatores de transcrição que induzem a
306/726 proliferação das células não diferenciadas podem ser operavelmente ligados a um promotor induzível, para promover a formação de calos que podem ser usados para transformação ou produção de culturas de suspensão de célula. Os fatores de transcrição que impedem as células de diferenciação, tais como, G1540 ou seus equivalentes, seriam usados para conferir identidade de célula ao caule para células cultivadas. Os fatores de transcrição que promovem diferenciação de brotos poderíam ser usados na transformação ou sistemas de micropropagação, onde a regeneração dos brotos dos calos é correntemente problemática. Além disso, os fatores de transcrição que regulam a diferenciação dos tecidos específicos seriam usados para aumentar a proporção desses tecidos em uma planta. Os genes que promovem a diferenciação do tecido do carpelo seriam introduzidos nas espécies comerciais para induzir formação de números aumentados de carpelos ou frutos. Uma aplicação específica podem existir em açafrão, um dos temperos mais caros do mundo. Os filamentos do açafrão, ou roscas, são na realidade os estigmas secos da flor do açafrão, Crocus sativus Linneaus. Cada flor contém, apenas, três estigmas e mais de 75.000 dessas flores são necessárias para produzir apenas 454 g de filamentos de açafrão. Um aumento no número de carpelos aumentaria a quantidade de tecido estigmático e aperfeiçoaria o
307/726 rendimento .
[0361] Desenvolvimento geral e morfologia: expansão da célula. O crescimento da planta resulta de uma combinação de divisão da célula e expansão da célula. Os fatores de transcrição podem ser úteis na regulação da expansão da célula. A regulação alterada da expansão da célula afetaria o comprimento do caule, uma característica agronômica importante. Por exemplo, cultivos curtos de trigo contribuíram para a Revolução Verde, porque as plantas que colocaram alguns recursos no alongamento do caule alocaram mais recursos no desenvolvimento da semente e produziram rendimento maior. Essas plantas são também menos vulneráveis aos danos por vento e chuva. Verificou-se que esses cultivos poderíam ser alterados em sua sensibilidade às giberelinas, hormônios que regulam o alongamento do caule através do controle da expansão da célula e divisão da célula. A expansão da célula alterada nas folhas podería também produzir formas de plantas novas e ornamentais.
[0362] Desenvolvimento geral e morfologia: mudança de fase e reversão floral. Os fatores de transcrição que regulam a alteração de fase podem modular os programas de desenvolvimento das plantas e regular a plasticidade de desenvolvimento do meristema do broto. Especificamente, esses genes podem ser usados para manipular a sazonalidade
308/726 e influenciar se as plantas revelam um hábito perenial ou anual.
[0363] Desenvolvimento____geral____e____morfologia : desenvolvimento rápido. Vários dos genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G2430, mostraram ter efeitos significativos na razão de crescimento da planta e desenvolvimento. Essas observações incluíram, por exemplo, crescimento mais rápido ou retardado e desenvolvimento dos órgãos reprodutivos. Assim, causando desenvolvimento mais rápido, G2430 e seus equivalentes funcionais provariam ser úteis para regiões com razões de crescimento curtas; outros fatores de transcrição que retardam desenvolvimento podem ser úteis para regiões com estações de crescimento mais longas. A aceleração do crescimento da planta também aperfeiçoaria o rendimento precoce ou aumento da biomassa em um estágio anterior, quando tal é desejável (por exemplo, na produção de produtos florestais ou brotos vegetais para consumo). Os fatores de transcrição que promovem desenvolvimento mais rápido, tais como, G2430 e seus equivalentes funcionais podem também ser usados para modificar o ciclo reprodutivo das plantas.
[0364] Desenvolvimento geral e morfologia: razão de crescimento lento. Vários dos genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G652 e G1335, mostraram
309/726 ter efeitos significativos no retardo da razão de crescimento da planta e desenvolvimento. Essas observações incluíram, por exemplo, crescimento e desenvolvimento atrasados dos órgãos reprodutivos. Plantas de crescimento lento podem ser altamente desejáveis para horticulturistas ornamentais, para provisão de plantas para dentro de casa, que revelam pouca mudança em sua aparência com o tempo ou plantas para áreas externas para as quais o tipo selvagem ou de crescimento rápido é indesejável (por exemplo, palmeiras ornamentais). O crescimento lento também pode prover um período de frutificação prolongado, estendendo assim a estação de colheita, especificamente em regiões com estações longas de crescimento. O crescimento lento também fornecería um período prolongado no qual o pólen está disponível para auto fertilização ou fertilização cruzada, ou fertilização cruzada de cultivos que normalmente florescem por períodos de tempo de não sobreposição. O último aspecto pode ser especificamente útil para plantas compreendendo dois ou mais cultivos enxertados distintos (por exemplo, árvores frutíferas) com períodos de florescimento de não sobreposição.
[0365] Desenvolvimento____geral____e____morf ologia : senescência. Genes de fator de transcrição presentemente revelados podem ser usados para alterar respostas de senescência nas plantas. Embora, acredite-se que
310/726 senescência da folha seja uma adaptação evolucionária para reciclar os nutrientes, em um cenário agrícola, possui valor significativo. Por exemplo, um retardo na senescência da folha em alguns híbridos de milho está associado a um aumento significativo nos rendimentos e um retardo de alguns dias na senescência das plantas de soja pode ter um grande impacto no rendimento. Em um cenário experimental, plantas de tabaco projetadas para inibir a senescência da folha tinham um intervalo de vida fotossintética maior e produziram um aumento de 50% no peso seco e rendimento da semente (Gan and Amasino (1995) Science 270: 1986-1988). A senescência retardada da flor por superexpressão de fatores de transcrição pode gerar plantas que mantêm suas flores por mais tempo e isso pode ser de interesse em potencial para a indústria de horticultura ornamental e a senescência foliar e dos frutos retardada aperfeiçoaria a vida útil em prateleira pós colheita do produto.
[0366] A senescência prematura causada, por exemplo, por G636, G1463, G1944 e seus equivalentes pode ser usada para aperfeiçoar a resposta da planta a doença e amadurecimento acelerado do fruto.
[0367] Razão de crescimento e desenvolvimento: letalidade e necrose [0368] A superexpressão dos fatores de transcrição, por exemplo, G12, G24, G877, G1519 e seus equivalentes que
311/726 possuem um papel na regulação da morte da célula pode ser usada para induzir a letalidade nos tecidos específicos ou necrose, em resposta ao ataque do agente patogênico. Por exemplo, se um gene de fator de transcrição induzindo letalidade ou necrose for especificamente ativo em gametas ou órgãos reprodutivos, sua expressão nesses tecidos conduziría a ablação e subsequente esterilidade do macho ou fêmea. Alternativamente, sob expressão regulada por agente patogênico, um fator de transcrição induzindo necrose pode restringir a dispersão de uma infecção por agente patogênico através de uma planta.
[0369] Tamanho da planta: plantas grandes. As plantas superexpressando G1073 e G1451, por exemplo, mostraram ser maiores que os controles. Para algumas plantas ornamentais, a capacidade de prover variedades maiores com esses genes ou seus equivalentes pode se altamente desejável. Para muitas plantas, incluindo árvores que contêm frutos, as árvores que são usadas para produção de lenha ou árvores e arbustos que servem como telas de janela ou de visualização, a estatura aumentada provê benefícios nas formas de rendimento maior e área de tela aumentada. Espécies de colheita podem também produzir rendimentos maiores em cultivos maiores, especificamente aqueles nos quais a porção vegetativa da planta é comestível.
312/726 [0370] Tamanho da planta: sementeiras grandes. Genes de fator de transcrição presentemente revelados, que produzem sementeiras grandes podem ser usados para produzir colheitas que se estabelecem mais rapidamente. As sementeiras grandes são geralmente mais resistentes, menos vulneráveis ao estresse e mais capazes de competir com as ervas daninhas. As sementeiras transformadas com fatores de transcrição presentemente revelados, incluindo G2346 e G2838, por exemplo, mostraram possuir cotilédones maiores e eram mais avançadas em desenvolvimento que as plantas de controle. O rápido desenvolvimento da sementeira que tornou-se possível por manipulação da expressão desses genes ou seus equivalentes sendo plausível a redução da perda devido a doenças, que prevalecem especificamente no estágio de sementeira (por exemplo, apodrecimento) e é assim importante para sobrevivência das plantas que germinam no campo ou em ambientes controlados.
[0371] Tamanho da planta: plantas anãs. Genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G24; G343, G353, G354, G362, G370; G1008, G1277, G1543, G1794, G1958 e seus equivalentes, por exemplo, que podem ser usados para diminuir a estatura da planta são prováveis de produzirem plantas que são mais resistentes ao dano por vento e chuva, possuem resistência ao espalhamento por vento ou chuva, ou são mais resistentes ao aquecimento ou
313/726 baixa umidade ou deficiência de água. As plantas anãs são também de interesse significativo para a indústria de horticultura ornamental e, especificamente para aplicações em jardins domésticos para os quais a disponibilidade de espaço pode ser limitada.
[0372] Tamanho da planta: tamanho e número dos frutos. A introdução dos genes de fator de transcrição presentemente revelados que afetam o tamanho dos frutos terá impactos desejáveis no tamanho e número de frutos, o que pode compreender aumentos no rendimento das colheitas de frutos ou rendimento reduzido do fruto, tais como, quando o crescimento vegetativo é preferido (por exemplo, com arbustos ornamentais ou onde o fruto é indesejável, como com as oliveiras ornamentais).
[0373] Morfologia das folhas: folhas escuras. O s componentes que afetam a cor nas folhas incluem clorofilas (geralmente verdes), antocianinas (geralmente vermelhas a azuis) e carotenóides (geralmente amarelos a vermelhos). Os genes de fator de transcrição que aumentam esses pigmentos nas folhas, incluindo G674, G912, G1063, G1357, G1452, G1482, G1499, G1792, G1863, G1888, G2143, G2557, G2838 e seus equivalentes, podem afetar positivamente o valor das plantas para a industria de horticultura ornamental. Variedades matizadas, especificamente, mostrariam contraste aperfeiçoado. Outros usos que resultam da superexpressão
314/726 dos genes de fator de transcrição incluem aperfeiçoamentos no valor nutricional dos gêneros alimentícios. Por exemplo, a luteína é um nutracêutico importante; dietas ricas em luteína mostraram ajudar a prevenir a degeneração macular relacionada a idade (ARMD), a causa principal da cegueira nas pessoas mais velhas. 0 consumo de vegetais com a cor verde escuro mostrou nos estudos clínicos, reduzir o risco de ARMD.
[0374] Os níveis de clorofila e carotenóide melhorados poderíam aperfeiçoar também o rendimento nas plantas de colheita. A luteína, como outras xantofilas, tais como, zeaxantina e violaxantina, é um componente essencial na proteção da planta contra os efeitos prejudiciais da luz excessiva. Especificamente, a luteína contribui, direta ou indiretamente, para o rápido aumento da saturação não fotoquímica nas plantas expostas a luz forte. As plantas de colheita projetadas para conter níveis maiores de luteína portanto, teriam foto proteção aperfeiçoada, levando ao menos dano oxidativo e melhor crescimento sob luz forte (por exemplo, durante dias longos de verão ou em altitudes maiores ou latitudes menores que aquelas nas quais uma planta não transformada sobrevivería). Adicionalmente, níveis de clorofila elevados aumentam a capacidade fotossintética.
[0375] Morfologia das folhas: alterações na forma
315/726 da folha. Fatores de transcrição presentemente revelados produzem efeitos marcantes e diversos no desenvolvimento e forma da folha. Os fatores de transcrição incluem G211, G353, G674, G736, G1063, G1146, G1357, G1452, G1494, G1543, G1863, G2143, G2144, e seus equivalentes. Nos estágios anteriores de crescimento, as sementeiras transgênicas desenvolveram folhas estreitas, apontando a montante com peciolos longos, possivelmente indicando uma interrupção no processo controlado pelo relógio circadiano ou movimentos nictinásticos. Outros genes de fator de transcrição podem ser usados para alterar a forma da folha de modo significativo em relação ao tipo selvagem, alguns dos quais podem encontrar uso em aplicações ornamentais.
[0376] Morfologia das folhas: tamanho da folha aumentado. Folhas grandes, tais como aquelas produzidas nas plantas que superexpressam G189, G1451, G2430 com seus equivalentes funcionais, geralmente aumentam a biomassa da planta. Isso provê beneficio para colheitas, onde a porção vegetativa da planta é uma porção comercializável.
[0377] Morfologia das folhas: folhas verde claro e matizadas. Genes de fator de transcrição, tais como, G635, G1494, G2144 e seus equivalentes que fornecem aparência alterada podem afetar positivamente o valor da planta na indústria de horticultura ornamental.
[0378] Morfologia das folhas: folhas brilhantes.
316/726
Genes de fator de transcrição tais como, G30, G1792, G2583 e seus equivalentes que induzem a formação de folhas brilhantes geralmente agem assim por elevação dos níveis de cera da epiderme. Assim, os genes seriam usados para projetar alterações na composição e quantidade dos componentes da superfície da folha, incluindo as ceras. A capacidade de manipular a composição da cera, quantidade ou distribuição podería modificar a tolerância a estiagem e baixa umidade ou resistência aos insetos e agentes patogênicos. Adicionalmente, a cera pode ser um artigo de mercado valioso em algumas espécies e a alteração de seu acúmulo e/ou composição poderia melhorar o rendimento.
[0379] Morfologia da semente: coloração alterada da semente. Os genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G156, G2105, G2085 também foram usados para modificar a cor da semente, que, juntamente com os equivalentes desses genes, forneceríam um apelo adicional às sementes ou produtos de sementes.
[0380] Morfologia da semente: tamanho e forma alterados da semente. A introdução dos genes de fator de transcrição presentemente revelados nas plantas que aumentam (por exemplo, G450; G584; G1255; G2085; G2105; G2114) ou diminuem (por exemplo, G1040) o tamanho das sementes que tem um impacto significativo no rendimento e aparência, especificamente quando o produto é a semente
317/726 propriamente (por exemplo, no caso dos grãos, legumes, nozes, etc.). 0 tamanho da semente, além da integridade de revestimento da semente, espessura e permeabilidade, teor de água da semente e vários outros componentes incluindo antioxidantes e oligossacarideos, também afeta a longevidade da semente em armazenamento, com sementes maiores frequentemente sendo mais desejáveis para armazenamento prolongado.
[0381] Genes de fator de transcrição que alteram a forma da semente, incluindo G1040, G1062, G1255 e seus equivalentes podem ter aplicações ornamentais e aperfeiçoar ou aumentar o apelo dos produtos de sementes.
[0382] Bioquímica da folha: cera da folha aumentada. A superexpressão dos fatores de transcrição genes, incluindo G975, G1792 e G2085 e seus equivalentes, que resulta no aumento da cera da folha podería ser usada para manipular a composição, quantidade ou distribuição da cera. Esses fatores de transição podem aperfeiçoar o rendimento naquelas plantas e colheitas, das quais a cera é um produto valioso. Os genes podem também ser usados para modificar a tolerância da planta a estiagem e/ou baixa umidade ou resistência aos insetos, bem como a aparência da planta (folhas brilhantes). O efeito da deposição aumentada da cera nas folhas de uma planta, da mesma forma pode aperfeiçoar a eficiência do uso de água. A manipulação
318/726 desses genes pode reduzir o revestimento da cera sobre as sementes do girassol; essa cera polui o sistema de extração de óleo durante o processamento da semente de girassol no óleo. Para a última finalidade ou qualquer outra onde a redução da cera seja valiosa, o anti-sentido ou cosupressão dos genes de fator de transcrição em uma maneira específica para tecido seria valiosa.
[0383] Bioquímica da folha: lipídeos de prenila da folha, incluindo tocoferol. Os lipídeos de prenila desempenham um papel importante no ancoramento das proteínas nas membranas ou organelos das membranas. Assim, a modificação do teor do lipídeo de prenila das sementes e folhas afetaria a integridade e função da membrana. Um grupo importante de lipídeos de prenila, os tocoferóis, possui atividade antioxidante e de vitamina E. Vários genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G214, G652, G748, G987, G1543, e G2509, mostraram modificar a composição de tocoferol das folhas nas plantas, e esses genes e seus equivalentes podem, assim, ser usados para alterar o teor de lipídeo de prenila das folhas.
[0384] Bioquímica da folha: teor de açúcares insolúveis aumentado na folha. A superexpressão de vários fatores de transcrição presentemente revelados, incluindo G211, resultou nas plantas com teor de açúcar insolúvel na folha alterado. Esse fator de transcrição e seus
319/726 equivalentes que alteram a composição da parede da célula da planta possuem várias aplicações em potencial, incluindo alteração da capacidade de digestão do alimento, resistência da planta a tensão, qualidade da madeira, resistência ao agente patogênico e na produção da polpa. Especificamente, a hemicelulose não é desejável nas polpas de papel, em virtude de sua falta de resistência em comparação à celulose. Assim, a modulação das quantidades de celulose x hemicelulose na parede de célula da planta é desejável para a industria de papel/madeira. 0 aumento do teor de carboidrato insolúvel nos vários frutos, vegetais e outros produtos comestíveis resultará no teor aumentado da fibra. 0 teor aumentado da fibra não apenas fornecerá benefícios de saúde aos produtos alimentícios, porém pode também aumentar a capacidade de digestão nas colheitas de forragem. Além disso, o teor de hemicelulose e de pectina dos frutos e bagas afeta a qualidade da geléia e ketchup feitos dos mesmos. Alterações no teor de hemicelulose e pectina resultariam em um produto superior para o consumidor.
[0385] Bioquímica da folha: teor de antocianina aumentado na folha. Vários genes de fator de transcrição presentemente revelados podem ser usados para alterar a produção de antocianina nas várias espécies de planta. A expressão dos genes de fator de transcrição presentemente
320/726 revelados que aumenta a produção de flavonóides nas plantas, incluindo antocianinas e taninas condensadas, pode ser usada para alterar a produção do pigmento para fins de horticultura e aumentar possivelmente a resistência ao estresse. G362, G663, G1482 e G1888 ou seus equivalentes, por exemplo, seria usada para alterar a produção ou acúmulo de antocianina. Vários compostos flavonóides mostraram ter atividade antimicrobiana e seriam usados para resistência ao agente patogênico projetado. Vários compostos flavonóides possuem efeitos de promoção de saúde, tais como, inibição do crescimento do tumor, prevenção da perda óssea e prevenção da oxidação dos lipideos. Níveis aumentados de taninas condensadas, em legumes para forragem, seriam um traço agronômico importante porque eles impedem a timpanite de pastagem por ruptura das espumas de proteína dentro do rúmen. Para uma revisão das utilidades dos flanovóides e seus derivados, vide Dixon e outros (1999) Trends Plant Sei. 4: 394-400.
[0386] Bioquímica da folha e semente: teor de ácido graxo alterado. Vários dos genes de fator de transcrição presentemente revelados mostraram alterar a composição do ácido graxo nas plantas, e nas sementes e folhas, especificamente. Essa modificação sugere várias utilidades incluindo aperfeiçoamento do valor nutricional das sementes ou plantas integrais. Razões de ácidos graxos de dieta
321/726 mostraram ter um efeito, por exemplo, na integridade óssea e remodelagem (vide, por exemplo, Weiler (2000) Pediatr. Res. 47:5 692-697). A razão dos ácidos graxos de dieta pode alterar os agrupamentos de precursor dos ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, que servem como precursores para síntese de prostaglandina. No tecido conjuntivo de mamíferos, as prostaglandinas servem como sinais importantes para regulação do equilíbrio entre ressorção e formação em ossos e cartilagem. Assim, as razões de ácidos graxos alteradas nas dietas podem afetar a etiologia e consequência de perda óssea.
[0387] Os fatores de transcrição que reduzem ácidos graxos na folha, por exemplo, ácidos graxos 16:3, podem ser usados para controlar o desenvolvimento da membrana tilacóide, incluindo desenvolvimento de proplastídeo em cloroplasto. Os genes que codificam esses fatores de transcrição podem assim, ser úteis para controlar a transição do proplastídeo em clomoplasto nos frutos e vegetais. Pode também ser desejável alterar a expressão desses genes para impedir a coloração verde em Brassica napus ou B. campestris para evitar óleo verde devido ao congelamento precoce.
[0388] Vários genes de fator de transcrição estão envolvidos na mediação de um aspecto da resposta reguladora para temperatura. Esses genes podem ser usados para alterar
322/726 a expressão das desaturases que leva a produção de ácidos graxos 18:3 e 16:3, o equilíbrio dos mesmos afeta a fluidez da membrana e atenua o dano às membranas de célula e estruturas fotossintéticas em temperaturas altas e baixas.
[0389] Bioquímica da semente: teor de óleo e ácido graxo da semente modificados. A composição das sementes, especificamente com relação às quantidades de óleo da semente e/ou composição é muito importante para o valor nutricional e calórico e produção de vários produtos alimentícios e de alimentação. Vários genes de fator de transcrição presentemente revelados na saturação de lipídeos de sementes que alteram o teor de óleo da semente poderíam ser usados para aperfeiçoar a estabilidade térmica dos óleos ou aperfeiçoar a qualidade nutricional do óleo de semente, por exemplo, reduzindo o número de calorias na semente, por diminuição do teor de óleo ou ácido graxo (por exemplo, G180; G192; G241; G1229; G1323; G1543), aumentando o número de calorias nos alimentos animais por aumento do teor de óleo ou ácidos graxos (por exemplo, G162; G291; G427; G590; G598; G629, G715; G849; G1198, G1471; G1526; G1640; G1646, G1750; G1777; G1793; G1838; G1902; G1946; G1948; G2123;
G2138; G2830) , alterando o teor de óleo da semente (G504; G509; G519; G561; G567; G892; G961; G974; G1143; G1226; G1451; G1478; G1496; G1672; G1677; G1765; G2509; G2343), ou alterando a razão de lipídeos saturados para insaturados
323/726 compreendendo os óleos (por exemplo, G869; G1417; G2192).
[0390] Bioquímica da semente: teor de proteína da semente modificado. Assim como com os óleos de sementes, a composição das sementes, especificamente com relação às quantidades de proteína e/ou composição, é muito importante para o valor nutricional e produção de vários produtos alimentícios e de alimento. Vários genes de fator de transcrição presentemente revelados modificam as concentrações de proteína nas sementes, incluindo G162; G226; G1323; G1419; G1818, que aumentam a proteína na semente, G427; G1777; G1903; G1946, que diminuem a proteína na semente e G162; G241; G509; G567; G597; G849; G892; G988; G1478; G1634; G1637; G1652; G1677; G1820; G1958; G2509; G2117; G2509, que alteram o teor de proteína da semente, forneceríam benefícios nutricionais e podem ser usados para prolongar o armazenamento, aumentar a resistência da semente às pratas ou doenças ou modificar as razões de germinação.
[0391] Bioquímica da semente: lipideos de prenila da semente. Os lipideos de prenila desenvolvem um papel no ancoramento das proteínas nas membranas ou organelas membranosas. Assim, a modificação do teor de lipídeo de prenila das sementes e folhas afetaria a integridade e função da membrana. Vários genes de fator de transcrição presentemente revelados mostraram modificar a composição de
324/726 tocoferol das plantas. a-Tocolferol é melhor conhecido como vitamina E. Os tocoferóis, tais como, oc e γ-tocoferol possuem ambos atividade antioxidante.
[0392] Bioquímica da semente: glucosinolatos de sementes. Vários glucosinolatos mostraram possuir atividade anticâncer; assim aumentando os níveis ou composição desses compostos por introdução de vários fatores de transcrição presentemente revelados, incluindo G484 e G2340, podendo ter efeito benéfico na dieta humana.
[0393] Os glicosinolatos são componentes indesejados das sementes oleosas usadas na alimentação para animais, uma vez que eles produzem efeitos tóxicos. Variedades de canola contendo glicosinolato baixo, por exemplo, foram desenvolvidas para combater esse problema. Os glicosinolatos fazem parte de uma defesa natural das plantas contra os insetos. Ά modificação da composição de glicosinolato ou quantidade por introdução de fatores de transcrição que afetam essas características pode, portanto, fornecer proteção melhorada dos herbívoros. Adicionalmente, nas colheitas comestíveis, os promotores específicos de tecido podem ser usados para garantir que esses compostos acumulem-se especialmente nos tecidos, tais como, epiderme, que não são consumidos.
[0394] Bioquímica da semente: teor de antocianina aumentado na semente. Vários genes de fator de transcrição
325/726 presentemente revelados podem ser usados para alterar a produção de antocianina nas sementes das plantas. Como com as antocianinas das folhas, a expressão dos genes de fator de transcrição presentemente revelados que aumenta a produção de flavonóide (antocianinas e taninas condensadas) nas sementes, incluindo G663 e seus equivalentes, pode ser usada para alterar a produção do pigmento para fins horticulturas e possivelmente aumentar a resistência ao estresse, atividade antimicrobiana e promover efeitos na saúde, tais como, inibição do crescimento de tumores, prevenção de perda óssea e prevenção de oxidação dos lipideos.
[0395] Bioquímica da folha e semente: produção de fitoesteróis da semente e da folha: Genes de fator de transcrição presentemente revelados que modificam os níveis de fitoesteróis nas plantas podem ter pelo menos duas utilidades. Primeiro, os fitoesteróis são uma fonte importante de precursores para a fabricação de hormônios esteróides humanos. Assim, a regulação do da expressão do fator de transcrição ou atividade conduziría a níveis elevados de precursores de esteróide humano importantes para a semi-síntese de esteróides. Por exemplo, fatores de transcrição que causam níveis elevados de campesterol nas folhas, ou sitoesteróis e estigmaesterois nas colheitas de sementes, seriam úteis para essa finalidade. Os
326/726 fitoesteróis e seus derivados hidrogenados os fitoestanóis também provaram ter propriedades de redução do colesterol e genes de fator de transcrição que modificam a expressão desses compostos em plantas forneceríam, assim, benefícios a saúde.
[0396] Bioquímica da raiz: teor de antocianina aumentado na raiz. Genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G663, podem ser usados para alterar a produção de antocianina na raiz das plantas. Conforme descrito acima para antocianinas de semente, a expressão dos genes de fator de transcrição presentemente revelados que aumenta a produção de flavonóides (antocianinas e taninas condensadas) nas sementes, incluindo G663 e seus equivalentes, pode ser usada para alterar a produção de pigmentos para fins horticulturas e possivelmente aumentar a resistência ao estresse, atividade antimicrobiana e efeitos de promoção da saúde, tais como, inibição de crescimento de tumor, prevenção de perda óssea e prevenção de oxidação dos lipídeos.
[0397] Resposta a luz/esquivamento da sombra: o desenvolvimento alterado do cotilédone, hipocotilo, pecíolo, orientação alterada da folha, fotomorfogenese constitutiva, fotomorfogenese em pouca luz. Genes de fator de transcrição presentemente revelados, incluindo G183; G354; G1322; G1331; G1488; G1494; G1794; G2144; e G2555,
327/726 que modificam a resposta da planta à luz podem ser úteis para modificar o crescimento ou desenvolvimento da planta, por exemplo, fotomorfogenese em pouca luz, ou tempo de floração aumentado, em respostas às várias intensidades de luz, qualidade ou duração aos quais a planta não transformada não respondería de modo semelhante. Exemplos de tais respostas que foram demonstradas incluem número e disposição das folhas e aparecimento precoce de botões de flor. A eliminação das respostas a sombra pode conduzir à densidades de plantio aumentadas com subsequente melhora do rendimento. Como esses genes podem alterar também a arquitetura da planta, eles podem se usados na indústria de horticultura ornamental.
[0398] Pigmento: nivel de antocianina aumentado em vários órgãos e tecidos de planta: Além de sementes, folhas e raízes, conforme mencionado acima, vários genes de fator de transcrição presentemente revelados podem ser usados para alterar os níveis de antocianina em ou mais tecidos. As utilidades em potencial desses genes incluem alterações na produção de pigmentos para fins horticulturas e possibilidade de aumento de resistência ao estresse, atividade antimicrobiana e efeitos de promoção de saúde, tais como, inibição do desenvolvimento de tumores, prevenção de perda óssea e prevenção de oxidação dos lipídeos.
328/726 [0399] Bioquímica diversa: diterpenos em folhas e outras partes da planta. Dependendo da espécie da planta, quantidades variadas de diversas substâncias bioquímicas secundárias (frequentemente terpenos lipofílicos) são produzidas e exsudadas ou volatilizadas por tricomas. As substâncias bioquímicas secundárias, exóticas, que são relativamente fáceis de serem extraídas, porque estão na superfície da folha, têm sido amplamente usadas em produtos, tais como, aromatizantes, medicamentos, pesticidas e cosméticos. Assim, a superexpressão dos genes que são usados para produzir os diterpenos nas plantas pode ser realizada por introdução dos genes de fator de transcrição que induzem a superexpressão. Uma classe de metabolitos secundários, os diterpenos, pode afetar vários sitemas biológicos, tais como, progressão de tumor, síntese de prostaglandina e inflamação do tecido. Além disso, os diterpenos podem atuar como feromonas para insetos, alomonas para cupins e podem exibir atividades neurotóxicas, citotóxicas e antimicóticas. Como resultado dessa diversidade funcional, os diterpenos têm sido alvo de várias especulações farmacêuticas. Na maioria dos casos, onde as vias metabólicas são impossíveis de serem projetadas, o aumento na densidade do tricoma ou tamanho nas folhas pode se o único modo de aumentar a produtividade da planta.
329/726 [0400] Bioquímica diversa: produção de diversos metabolitos secundários: Os dados de microdisposição sugerem que o fluxo através das vias biossintéticas de aminoácido aromático e vias biossintéticas de aminoácido e vias biossintéticas de metabolito primário e secundário são suprareguladas. Fatores de transcrição presentemente revelados mostraram estar envolvidos na regulação da biossíntese de alcalóides, em parte por supraregulação das enzimas indol-3-glicerol fosfatase e estrictosidina sintase. A fenilalanina amônia liase, calcona sintase e trans-cinamato mono-oxigenase são também induzidas e estão envolvidas na biossíntese de fenilpropenóide.
[0401] Anti-sentido e co-supressão [0402] Além da expressão dos ácidos nucleicos da invenção como substituição genética ou ácidos nucleicos de modificação de fenótipo de planta, os ácidos nucleicos são também úteis para supressão de anti-sentido da expressão, por exemplo, para infraregular a expressão de um ácido nucleico da invenção, por exemplo, como um mecanismo adicional para modulação do fenótipo de planta. Isto é, os ácidos nucleicos da invenção ou subsequências ou sequências de anti-sentido dos mesmos, podem ser usados para bloquear a expressão dos ácidos nucleicos homólogos que ocorrem naturalmente. Uma variedade de tecnologias de anti-sentido são conhecidas na técnica, por exemplo, conforme
330/726 estabelecido em Lichtenstein and Nellen (1997) Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press at Oxford University Press, Oxford, U.K. A regulação de anti-sentido é também descrita em Crowley e outros, (1985) Cell 43: 633641; Rosenberg e outros, (1985) Nature 313: 703-706; Preiss e outros, (1985) Nature 313: 27-32; Melton (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 144-148; Izant and Weintraub (1985) Science 229: 345-352; e Kim and Wold (1985) Cell 42: 129138. Processos adicionais para regulação de anti-sentido são conhecidos na técnica. A regulação de anti-sentido foi usada para reduzir ou inibir a expressão dos genes de plantas, por exemplo, na Publicação de Patente Européia número 271988. O RNA de anti-sentido pode ser usado para reduzir a expressão genética para produzir uma alteração fenotípica visível ou bioquímica em uma planta (Smith e outros, (1988) Nature, 334: 724-726; Smith e outros, (1990) Plant Mol. Biol. 14: 369-379). Em geral, as sequências de sentido e anti-sentido são introduzidas em uma célula, onde elas são opcionalmente ampliadas, por exemplo, por transcrição. Tais sequências incluem ambas sequências de oligonucleotídeo e sequências catalíticas, tais como, ribozimas.
[0403] Por exemplo, uma redução ou eliminação da
expressão (isto é , um nocauteamento) de um fator de
transcrição ou polipeptídeo homólogo ao fator de
331/726 transcrição em uma planta, por exemplo para modificar o traço da planta, pode ser obtida por introdução de uma construção de anti-sentido correspondendo ao polipeptídeo de interesse como um cDNA. Para supressão de anti-sentido, o fator de transcrição ou cDNA homólogo é disposto em orientação inversa (com relação à sequência de codificação) em relação à sequência promotora do vetor de expressão. A sequência introduzida não precisa ser o cDNA ou gene de comprimento pleno e não precisa ser idêntica a do cDNA ou gene encontrado no tipo de planta a ser transformada. Tipicamente, a sequência de anti-sentido precisa apenas ser capaz de hibridizar com relação ao gene alvo ou RNA de interesse. Assim, quando a sequência introduzida for de comprimento menor, um grau maior de homologia com relação a sequência de fator de transcrição endógeno será necessária para supressão de anti-sentido eficaz. Embora sequências de anti-sentido de vários comprimentos possam ser usadas, preferivelmente, a sequência de anti-sentido introduzida no vetor possuirá, pelo menos, 30 nucleotídeos de comprimento e supressão de anti-sentido aperfeiçoada tipicamente será observada conforme o comprimento da sequência de antisentido diminui. Preferivelmente, o comprimento da sequência de anti-sentido no vetor será maior que 100 nucleotídeos. A transcrição de uma construção de antisentido, conforme descrita, resulta na produção de
332/726 moléculas de RNA que são o complemento reverso das moléculas de mRNA transcritas do gene de fator de transcrição endógeno na célula de planta.
[0404] A supressão da expressão de gene do fator de transcrição endógeno pode também ser obtida usando uma ribozima. As ribozimas são moléculas de RNA que possuem atividade endoribonuclease altamente específica. A produção e uso das ribozimas são revelados nas Patentes US números 4.987.071 e 5.543.508. As sequências de ribozima sintéticas incluindo RNAs de anti-sentido podem se usadas para conferir atividade de divagem de RNA no RNA de antisentido, tal como, moléculas de mRNA endógenas que hibridizam no RNA de anti-sentido são clivadas, o que por sua vez leva a uma inibição de anti-sentido melhorada da expressão do gene endógeno.
[0405] Os vetores nos quais RNA codificado por um fator de transcrição cDNA homólogo ao fator de transcrição é superexpresso podem também ser usados para obter cosupressão de um gene endógeno correspondente, por exemplo, na maneira descrita na Patente US número 5.231.020 de Jorgensen. Tal co-supressão (também denominada supressão de sentido) não requer que todo o cDNA do fator de transcrição seja introduzido nas células das plantas, nem requer que a sequência introduzida seja exatamente idêntica ao gene de fator de transcrição endógeno de interesse. Contudo, como
333/726 com a supressão de anti-sentido, a eficiência de supressão será melhorada conforme a especificidade da hibridização for aumentada, por exemplo, conforme a sequência introduzida for aumentada em tamanho e/ou conforme a similaridade da sequência entre a sequência introduzida e o gene de fator de transcrição endógeno for aumentada.
[0406] Vetores expressando uma forma que não pode ser traduzida do mRNA de fator de transcrição, por exemplo, sequências compreendendo um ou mais códons de perda ou mutação de não sentido podem também ser usados para suprimir expressão de um fator de transcrição endógeno, pelo que, reduzindo ou eliminando sua atividade e modificando um ou mais traços. Os processos para produção de tais construções são descritos na Patente US número 5.583.021. Preferivelmente, tais construções são feitas por introdução de um códon de parada prematuro no gene de fator de transcrição. Alternativamente, um traço de planta pode ser modificado por silenciamento do gene usando RNA de filamento duplo (Sharp (1999) Genes e desenvolvimento 13: 139-141). Outro processo para abolir a expressão de um gene é por inserção de mutagenese usando o T-DNA de Agrobacterium tumefaciens. Após geração dos mutantes de inserção, os mutantes podem ser classificados para identificar aqueles contendo a inserção em um gene de fator de transcrição ou gene homólogo de fator de transcrição. As
334/726 plantas contendo um evento de inserção de transgene simples, no gene desejado, podem ser cruzadas para gerar plantas homozigotas para a mutação. Tais processos são bem conhecidos dos versados na técnica (Vide, por exemplo Koncz e outros, (1992) Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., River Edge, NJ).
[0407] Alternativamente, um fenótipo de planta pode ser alterado por eliminação de um gene endógeno, tal como, um fator de transcrição u homólogo de fator de transcrição, por exemplo, recombinação homóloga (Kempin e outros, (1997) Nature 389: 802-803).
[0408] Um traço de planta pode também ser modificado por uso do sistema Cre-lox (por exemplo, conforme descrito na Patente US número 5.658.772). Um genoma de planta pode ser modificado para incluir primeiro e segundo sítios lox que são contatados com uma Cre recombinase. Se os sítios lox estiverem na mesma orientação, a sequência de DNA de intervenção entre os dois sítios será excisada. Se os sítios lox estiverem na orientação oposta, a sequência de intervenção será invertida.
[0409] Os polinucleotídeos e polipeptídeos dessa invenção podem também ser expressos em uma planta na ausência de um cassete de expressão, por manipulação da atividade ou nível de expressão do gene endógeno por outros
335/726 meios, tais como, por exemplo, por expressão ectópica de um gene por marcação de ativação de T-DNA (Ichikawa e outros, (1997) Nãture 390 698-701; Kakimoto e outros, (1996) Science 274: 982-985). Esse processo permite transformação de uma planta com um marcador genético contendo múltiplos melhoradores transcricionais e uma vez que o marcador tiver sido inserido dentro do genoma, a expressão de uma sequência de codificação genética de flanqueamento torna-se desregulada. Em outro exemplo, a maquinaria transcricional em uma planta pode ser modificada, de modo a aumentar os níveis de transcrição de um polinucleotídeo da invenção (vide, por exemplo, Publicações PCT WO 96/06166 e WO 98/53057 que descrevem a modificação da especificidade das proteínas de dedo de zinco por alteração dos aminoácidos específicos no motivo de ligação ode DNA).
[0410] A planta transgênica também pode incluir maquinaria necessária para expressão ou alteração da atividade de um polipeptídeo codificado por um gene
endógeno, por exemplo, por alteração do estado de
fosforilação do polipeptídeo para manter o mesmo em um
estado ativado.
[0411] As plantas transgênicas i (ou células de
plantas, ou explantes de plantas ou tecidos de plantas) incorporando os polinucleotídeos da invenção e/ou expressando os polipeptídeos da invenção podem ser
336/726 produzidas por uma variedade de técnicas bem estabelecidas conforme descrito acima. Seguindo-se a construção de um vetor, mais tipicamente um cassete de expressão, incluindo um polinucleotídeo, por exemplo, codificando um fator de transcrição ou homólogo ao fator de transcrição, da invenção, técnicas padrão podem ser usadas para introduzir o polinucleotídeo dentro da planta, uma célula de planta, um explante de planta ou tecido de planta de interesse. Opcionalmente, a célula de planta, explante ou tecido pode ser regenerado para produzir uma planta transgênica.
[0412] A planta pode ser qualquer planta superior, incluindo gimnospermas, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Protocolos apropriados são disponíveis para Leguminosae (alfalfa, soja, trevo, etc.), Umbelliferae (cenoura, aipo, pastinaga), Cruciferae (repolho, rabanete, semente de colza, brocólis, etc.), Curcurbitaceae (melões e pepino), Gramineae (trigo, milho, arroz, cevada, painço, etc.), Solanaceae (batata, tomate, tabaco, pimentas, etc.), e várias outras colheitas. Vide os protocolos descritos em Ammirato e outros, Eds., (1984) Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species, Macmillan Publ. Co., New York, NY; Shimamoto e outros, (1989) Nature 338: 274-276; Fromm e outros, (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; e Vasil e outros, (1990) Bio/Technol. 8: 429-434.
[0413] A transformação e regeneração das células
337/726 das plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas são agora rotina e a seleção da técnica de transformação mais apropriada será determinada pelo praticante. A escolha do processo variará com o tipo de planta a ser transformado; os versados na técnica reconhecerão a adequabilidade de processos específicos para dados tipos de planta. Processos apropriados podem incluir, porém não estão limitados a eletroporação de protoplastos de planta; transformação mediada por lipossoma; transformação mediada por polietilenoglicol (PEG); transformação usando vírus; microinjeção de células de planta; bombardeamento de microprojéteis das células de planta; infiltração a vácuo; e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. A transformação significa a introdução de uma sequência de nucleotídeo em uma planta, de maneira a causar expressão estável ou transiente da sequência.
[0414] Exemplos de sucesso de modificação das características da planta por transformação com sequências clonadas que servem para ilustrar o conhecimento atual
nesse campo da tecnologia e que são incorporados aqui como
referência incluem: Patentes US números 5.571.706;
5.677.175; 5.510.471; 5.750.386; 5.597.945; 5.589.615;
5.750.871; 5.268.526; 5.780.708; 5.538.880; 5.773.269;
5.736.369 e 5.610.042.
[0415] Seguindo-se a transformação, as plantas sao
338/726 preferivelmente selecionadas usando um marcador selecionável, dominante, incorporado ao vetor de transformação. Tipicamente, tal marcador conferirá resistência antibiótica ou herbicida às plantas transformadas e a seleção de transformadores pode ser realizada por exposição das plantas às concentrações apropriadas de antibiótico ou herbicida.
[0416] Após as plantas transformadas serem selecionadas e desenvolverem até a maturidade, aquelas plantas mostrando um traço modificado são identificadas. O traço modificado pode ser qualquer um dos traços descritos acima. Adicionalmente, para confirmar que o traço modificado se deve à alterações nos níveis de expressão ou atividade, o polipeptídeo ou polinucleotídeo da invenção pode ser determinado por análise da expressão de mRNA usando Northern blots, RT-PCR ou microfileiras ou expressão de proteína usando imunoblots ou Western blots ou ensaios de deslocamento de gel.
Sistemas Integrados - Identidade da Sequência [0417] Adicionalmente, a presente invenção pode ser um sistema integrado, computador ou meio que pode ser lido por computador que compreende um conjunto de instruções para determinar a identidade de uma ou mais sequências em uma base de dados. Além disso, o conjunto de instruções pode ser usado para gerar ou identificar sequências que
339/726 satisfazem quaisquer critérios específicos. Adicionalmente, o conjunto de instruções pode ser usado para associar ou ligar determinados benefícios funcionais, tais como, características aperfeiçoadas, com uma ou mais sequência identificada.
[0418] Por exemplo, o conjunto de instruções inclui, uma comparação sequência ou outro programa de alinhamento, por exemplo, um programa disponível, tal como, por exemplo, Pacote Wisconsin versão 10,0 tal como, BLAST, FASTA, PILEUP, FINDPATTERNS ou semelhante (GCG, Madison, WI) . Bases de dados de sequência públicas, tais como, GenBank, EMBL, Swiss-Prot e PIR ou bases de dados de sequência particulares, tais como, base de sequência de dados PHYTOSEQ (Incyte Genomics, Paio Alto, CA) podem ser pesquisadas.
[0419] O alinhamento das sequências para comparação pode ser conduzido por algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, pela pesquisa de similaridade de processo de Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-2448, por implementações computadorizadas desses algoritmos. Após alinhamento, as comparações de sequência entre dois (ou mais) polinucleotideos ou polipeptideos são tipicamente
340/726 realizadas por comparação das sequências das duas sequências em uma janela de comparação, para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequência. A janela de comparação pode ser um segmento de pelo menos 20 posições continuas, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais geralmente cerca de 100 a 150 posições continuas. Uma descrição do processo é fornecida em Ausubel e outros, supra.
[0420] Uma variedade de processos para determinar as relações da sequência pode ser usada, incluindo alinhamento manual e alinhamento e análise de sequência ajudados por computador. Essa última abordagem é uma abordagem preferida na presente invenção, devido ao rendimento aumentado fornecido pelos processos auxiliados por computador. Conforme observado acima, vários programas de computador para realizar o alinhamento da sequência encontram-se disponíveis ou podem ser produzidos por um versado na técnica.
[0421] Um exemplo de algoritmo que é apropriado para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade da sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul e outros, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. O software para realizar análises BLAST encontrase disponível publicamente, por exemplo, através do National Library of Medicine'' s National Center for
341/726
Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih; vide o site da web (www) National Institutes of Health US government (gov)). Esse algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequência de classificação alta (HSPs) para identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência em questão, que tanto combine ou que satisfaça alguma classificação T limite de valor positivo, quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. 0 T é referido como o limite de classificação de palavra vizinha (Altschul e outros, supra). Esses acertos de palavras vizinhas iniciais atuam como sementes para iniciar as pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência para o mais distante que a classificação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As classificações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (recompensa de classificação para um par de resíduos combinantes; sempre > 0) e N (penalidade de classificação para resíduos não combinantes; sempre < 0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de classificação é usada para calcular a classificação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direção cessa quando: a classificação de alinhamento cumulativa falha pela quantidade X de seu valor
342/726 máximo obtido; a classificação cumulativa para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou o final de cada sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade de alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências de nucleotideo) utiliza como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10), um corte de 100, M = 5, N = -4, e uma comparação de ambos filamentos. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP utiliza como defaults um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de classificação BLOSUM62 (vide Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89: 10915-10919). A menos que de outra forma indicado, identidade da sequência aqui se refere à porcentagem de identidade da sequência gerada de um tblastx usando a versão NCBI do algoritmo nos ajustes de default usando alinhamentos fendidos com o filtro off (vide, por exemplo, site da web NIH NLM NCBI nebi.nlm.nih, supra).
[0422] Além de calcular a porcentagem de identidade da sequência, o algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (vide, por exemplo, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 5873-5787). Uma medida da similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma
343/726 (P(N)), que provê uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre dois nucleotídeos ou sequências de aminoácido ocorreríam por chance. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência (e, portanto, nesse contexto, homólogo) se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste para o ácido nucleico de referência for inferior a cerca de 0,1, ou inferior a cerca de 0,01, e mesmo inferior a cerca de 0,001. Um exemplo adicional de um algoritmo de alinhamento de sequência útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de sequência múltiplo de um grupo de sequências correlatas usando alinhamentos progressivos, emparelhados. O programa pode alinhar, por exemplo, até 300 sequências de um comprimento máximo de 5.000 letras.
[0423] O sistema integrado ou computador inclui, tipicamente, uma interface de entrada do usuário permitindo que o usuário visualize, seletivamente, um ou mais registros de sequência correspondendo a um ou mais cordões de caracter, bem como, um conjunto de instruções que alinha um ou mais cordões propriamente ou com um cordão de caráter adicional para identificar uma ou mais região de similaridade de sequência. O sistema pode incluir um elo de um ou mais cordões de caracter com um fenótipo específico ou função genética. Tipicamente, o sistema inclui um elemento de saída que pode ser lido pelo usuário que revela
344/726 um alinhamento produto pelo conjunto de instruções de alinhamento.
[0424] Os processos dessa invenção podem ser implementados em um ambiente de computação localizado ou distribuído. Em um ambiente distribuído, os processos podem ser implementados em um computador simples compreendendo múltiplos processadores ou em vários computadores. Os computadores podem ser ligados, por exemplo, através de uma barra de conexão comum, porém mais preferivelmente o(s) computador(es) são nodos em uma rede. Uma rede pode ser uma rede generalizada ou local dedicada ou de área ampla, e em determinadas concretizações, os computadores podem ser componentes de uma intra-net ou Internet.
[0425] Assim, a invenção provê processos para identificação de uma sequência semelhante ou homólogos a um ou mais polinucleotideos conforme citados aqui, ou um ou mais polipeptídeos alvo codificados pelos polinucleotideos ou, de outra forma, citados aqui e podem incluir ligação ou associação de um dado fenótipo de planta ou função genética como uma sequência. Nos processos, é provida uma base de dados de sequência (localmente ou através de inter ou intranet) e uma questão é formulada à base de dados de sequência usando as sequências relevantes aqui e genótipos de plantas ou funções genéticas associados.
[0426] Qualquer sequência aqui pode dar entrada na
345/726 base de dados, antes ou após o questionamento à base de dados. Isto provê expansão da base de dados e, caso realizado antes da etapa de questionamento, inserção das sequências na base de dados. As sequências de controle podem ser detectadas por questionamento para assegurar a integridade geral da base de dados e questão. Conforme observado, a questão pode ser formulada usando uma interface com base em browser da web. Por exemplo, a base de dados pode ser uma base de dados pública, centralizada, tal como, citado aqui e o questionamento pode ser feito de um terminal remoto ou computador através da Internet ou intranet.
[0427] Qualquer sequência aqui pode ser usada para identificar uma sequência semelhante, homóloga, paráloga ou ortóloga em outra plantas. Isso provê dispositivos para identificar sequências endógenas em outras plantas que podem ser úteis para alterar um traço das plantas progênie, o que resulta do cruzamento de duas plantas de linhagens diferentes. Por exemplo, as sequências que codificam um ortólogo de qualquer uma das sequências aqui, que naturalmente ocorrem em uma planta com um traço desejado podem ser identificadas usando as sequências reveladas aqui. A planta é então cruzada com uma segunda planta da mesma espécie, porém não possui o traço desejado para produzir progênie que possa então ser usado para
346/726 experimentos de cruzamento para produzir o traço desejado na segunda planta. Portanto, a planta de progênie diferente não contém transgenes; a expressão da sequência endógena pode também ser regulada por tratamento com uma substância química específica ou outro dispositivo, tal como, EMR. Alguns exemplos de tais compostos bem conhecidos na técnica incluem: etileno; citoquininas; compostos fenólicos, que estimulam a transcrição dos genes necessários para infecção; monossacarídeos específicos e ambientes ácidos que potencializam a indução do gene vir; polissacarídeos ácidos que induzem um ou mais genes cromossômicos; e opinas; outros mecanismos incluem tratamento na luz ou escuro (para uma revisão dos exemplos de tais tratamentos,
vide, Winans (1992) Microbiol. Rev. 56: 12-31; Eyal e
outros, (1992) Plant Mol. Biol. 19: 589-599; Chrispeels e
outros, (2000) Plant Mol. Biol . 42: 279-290; Piazza e
outros, (2002) Plant Physiol. 128: 1077-1086).
[0428] A tabela 10 lista as sequências descobertas como sendo ortólogas aos vários fatores representativos de transcrição da presente invenção. Os cabeçalhos das colunas incluem os fatores de transcrição listados pela SEQ ID NO; números de ID do gene (GID) ; as espécies das quais os ortólogos aos fatores de transcrição derivam-se; o tipo de sequência (isto é, DNA ou proteína) revelado como sendo ortólogo aos fatores de transcrição; e a SEQ ID NO dos
347/726 ortólogos, a última correspondendo aos SEQ ID NOs listados na Listagem de Sequência.
Tabela 10. Ortólogos dos Genes de Fator de
Transcrição Representativos de Arabidopsis
SEQ ID N°: de ortólogo ou nucleotídeo codificando ortólogo NO GID do ortólogo Espécies das quais o ortólogo deriva Tipo de sequência usada para determinação (DNA ou proteína) NO GID do Fator de Transcrição de Arabidopsis ortólogo SEQ ID N°: do Nucleotídeo Codificando Fator de Transcrição de Arabidopsis ortólogo
468 Glycine max DNA G19 3
469 Glycine max DNA G19 3
470 Glycine max DNA G19 3
471 Glycine max DNA G19 3
472 Oryza sa tiva DNA G19 3
473 Oryza sativa DNA G19 3
348/726
474 Oryza sativa DNA G19 3
475 Zea mays DNA G19 3
476 Zea mays DNA G19 3
477 Glycine max DNA G22 5
478 Glycine max DNA G22 5
491 Glycine max DNA G28 9
492 Glycine max DNA G28 9
493 Glycine max DNA G28 9
494 Glycine max DNA G28 9
495 Glycine max DNA G28 9
496 Glycine max DNA G28 9
497 Glycine max DNA G28 9
498 Glycine max DNA G28 9
499 Oryza DNA G28 9
349/726
sativa
500 Zea mays DNA G28 9
501 Oryza sativa PRT G28 9
502 Oryza sativa PRT G28 9
503 Mesembry anthemum crystall inum PRT G28 9
504 G3643 Glycine max DNA G47, G2133 11, 407
505 Oryza sativa PRT G47, G2133 11, 407
550 G3450 Glycine max DNA G226, G682 37, 147
551 Glycine max DNA G226, G682 37
552 Glycine max DNA G226, G682 37, 147
553 G3448 Glycine max DNA G226, G682 37, 147
554 G3449 Glycine max DNA G226, G682 37, 147
555 Oryza DNA G226, G682 37, 147
350/726
sa ti va
556 G3431 Zea mays DNA G226, G682 37, 147
557 Zea mays DNA G226, G682 37, 147
558 Oryza sativa PRT G226, G682 37, 147
559 G3393 Oryza sativa PRT G226, G682 37, 147
610 Glycine max DNA G353, G354 59, 61
611 Glycine max DNA G353, G354 59, 61
612 Glycine max DNA G353, G354 59, 61
613 Oryza sativa DNA G353, G354 59, 61
614 Zea mays DNA G353, G354 59, 61
615 Zea mays DNA G353, G354 59, 61
616 Zea mays DNA G353, G354 59, 61
617 Zea mays DNA G353, G354 59, 61
618 Zea mays DNA G353, G354 59, 61
619 Zea mays DNA G353, G354 59, 61
620 Zea mays DNA G353, G354 59, 61
621 Oryza sativa PRT G353, G354 59, 61
622 Oryza PRT G353, G354 59, 61
351/726
sativa
623 Oryza sativa PRT G353, G354 59, 61
624 Oryza sativa PRT G353, G354 59, 61
625 Oryza sativa PRT G353, G354 59, 61
626 Oryza sativa PRT G353, G354 59, 61
746 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
747 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
748 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
749 G3476 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
750 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
751 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
752 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
753 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
352/726
754 Glycine max DNA G481, G482 87
755 Glycine max DNA G481, G482 87
756 Oryza sativa DNA G481, G482 87
757 Oryza sativa DNA G481, G482 87, 89
758 Zea mays DNA G481, G482 87
759 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
760 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
761 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
762 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
763 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
764 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
765 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
766 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
767 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
768 Gossypiu m arboreum DNA G481, G482 87, 89
769 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
770 Gossypiu m DNA G481, G482 87, 89
353/726
hirsutum
771 Lycopers icon esculent um DNA G481, G482 87, 89
772 Lycopers icon esculent um DNA G481, G482 87, 89
773 Medicago truncatu la DNA G481, G482 87, 89
774 Lycopers icon esculent um DNA G481, G482 87, 89
775 Solanum tuberosu m DNA G481, G482 87, 89
776 Triticum aestivum DNA G481, G482 87, 89
777 Hordeum vulgare DNA G481, G482 87, 89
778 Triticum monococc DNA G481, G482 87, 89
354/726
um
779 Glycine max DNA G481, G482 89
780 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
781 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
782 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
783 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
784 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
785 Zea mays PRT G481, G482 87, 89
786 Zea mays PRT G481, G482 87, 89
787 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
788 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
789 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
790 G3395 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
791 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
355/726
792 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
793 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
794 G3397 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
795 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
796 G3398 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
797 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
798 G3476 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
799 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
800 G3475 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
801 G3472 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
802 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
803 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
804 Zea mays PRT G481, G482 87, 89
356/726
805 G3436 Zea mays PRT G481, G482 87, 89
806 G3434 Zea mays PRT G481, G482 87, 89
807 Zea mays PRT G481, G482 87, 89
825 Glycine max DNA G489 93
826 Glycine max DNA G489 93
827 Glycine max DNA G489 93
828 Glycine max DNA G489 93
829 Glycine max DNA G489 93
830 Glycine max DNA G489 93
831 Glycine max DNA G489 93
832 Oryza sativa DNA G489 93
833 Oryza sativa DNA G489 93
834 Zea mays DNA G489 93
835 Oryza sativa PRT G489 93
836 Oryza PRT G4 8 9 93
357/726
sativa
837 Oryza sativa PRT G489 93
981 Oryza sativa DNA G634 127
982 Oryza sativa DNA G634 127
983 Oryza sativa DNA G634 127
984 Zea mays DNA G634 127
985 Zea mays DNA G634 127
986 Zea mays DNA G634 127
987 Oryza sativa PRT G634 127
988 Oryza sativa PRT G634 127
1076 G3450 Glycine max DNA G682 147
1077 Hordeum vulgare subsp. vulgare DNA G682 147
1078 Populus tremula X DNA G682 147
358/726
Populus tremulai des
1079 Triticum aestivum DNA G682 147
1080 Gossypiu m arboreum DNA G682 147
1081 Oryza sativa PRT G682 147
1082 G3392 Oryza sativa PRT G682 147
1083 G3445 Glycine max PRT G682 147
1084 G3450 Glycine max PRT G682 147
1085 Glycine max PRT G682 147
1086 G3446 Glycine max PRT G682 147
1087 G3448 Glycine max PRT G682 147
1088 G3449 Glycine max PRT G682 147
1089 G3431 Zea mays PRT G682 147
359/726
1090 Zea mays PRT G682 147
1154 Glycine max DNA G864 167
1155 Glycine max DNA G864 167
1156 Zea mays DNA G864 167
1157 Oryza sativa PRT G864 167
1158 Oryza sativa PRT G864 167
1159 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
1160 G3451 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
1161 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
1162 G3452 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
1163 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
1164 Glycine max DNA G867, G1930 169
1165 Oryza sativa DNA G867, G1930 169
1166 Oryza DNA G867, G1930 169, 369
360/726
sa ti va
1167 Zea mays DNA G867, G1930 169, 369
1168 Zea mays DNA G867, G1930 169, 369
1169 Zea mays DNA G867, G1930 169, 369
1170 Zea mays DNA G867, G1930 169, 369
1171 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
1172 Mesembry anthemum crystall inum DNA G867, G1930 169, 369
1173 Lycopers icon esculent um DNA G867, G1930 169, 369
1174 Solanum tuberosu m DNA G867, G1930 169, 369
1175 Hordeum vulgare DNA G867, G1930 169, 369
1176 G3388 Oryza sativa PRT G867, G1930 169, 369
1177 G3389 Oryza sativa PRT G867, G1930 169, 369
1178 Oryza PRT G867, G1930 169, 369
361/726
sativa
1179 G3390 Oryza sativa PRT G867, G1930 169, 369
1180 Oryza sativa PRT G867, G1930 169, 369
1181 Oryza sativa PRT G867, G1930 169, 369
1182 G3451 Glycine max PRT G867, G1930 169, 369
1183 G3452 Glycine max PRT G867, G1930 169, 369
1184 G3453 Glycine max PRT G867, G1930 169, 369
1185 G3433 Zea mays PRT G867, G1930 169, 369
1186 Zea mays PRT G867, G1930 169, 369
1204 Glycine max DNA G912 185
1205 Glycine max DNA G912 185
1206 Glycine max DNA G912 185
1207 Glycine max DNA G912 185
1208 Glycine max DNA G912 185
362/726
1209 Glycine max DNA G912 185
1210 Glycine max DNA G912 185
1211 Oryza sativa DNA G912 185
1212 Oryza sativa DNA G912, G913 185, 187
1213 G3440 Zea mays DNA G912 185
1214 Zea mays DNA G912 185
1215 Zea mays DNA G912, G913 185, 187
1216 Zea mays DNA G912 185
1217 Zea mays DNA G912 185
1218 Brassica napus DNA G912, G913 185, 187
1219 Solanum tuberosu m DNA G912 185
1220 Descurai nia sophia DNA G912 185
1221 G3377 Oryza sativa PRT G912 185
1222 G3373 Oryza sativa PRT G912, G913 185, 187
363/726
1223 G3375 Oryza sativa PRT G912, G913 185, 187
1224 G3372 Oryza sativa PRT G912 185
1225 Brassica napus PRT G912 185
1226 Nicotian a tabacum PRT G912 185
1227 Oryza sativa PRT G912 185
1228 Oryza sativa PRT G912 185
1229 Oryza sativa PRT G912 185
1230 G3379 Oryza sativa PRT G912 185
1231 Oryza sativa PRT G912 185
1232 G3376 Oryza sativa PRT G912 185
1233 Oryza sativa PRT G912 185
1234 Oryza sativa PRT G912 185
364/726
1235 Oryza sativa PRT G912 185
1236 Oryza sativa PRT G912 185
1237 Glycine max PRT G912 185
1238 Glycine max PRT G912 185
1239 Glycine max PRT G912 185
1240 Glycine max PRT G912 185
1241 Glycine max PRT G912 185
1242 Glycine max PRT G912 185
1243 Glycine max PRT G912 185
1244 Zea mays PRT G912 185
1245 Zea mays PRT G912 185
1246 G3440 Zea mays PRT G912 185
1247 Zea mays PRT G912 185
1248 Zea mays PRT G912 185
1249 Glycine max DNA G922 189
365/726
1250 G3811 Glycine max DNA G922 189
1251 Glycine max DNA G922 189
1252 Oryza sativa DNA G922 189
1253 Oryza sa tiva DNA G922 189
1254 Oryza sativa PRT G922 189
1255 Oryza sativa PRT G922 189
1256 Oryza sativa PRT G922 189
1257 G3813 Oryza sativa PRT G922 189
1258 Glycine max DNA G926 191
1259 Glycine max DNA G926 191
1260 Oryza sativa DNA G926 191
1261 Oryza sativa DNA G926 191
1262 Zea mays DNA G926 191
366/726
1263 Brassica napus PRT G926 191
1292 Glycine max DNA G975, G2583 199, 449
1293 Glycine max DNA G975, G2583 199, 449
1294 Glycine max DNA G975, G2583 199, 449
1295 Glycine max DNA G975, G2583 199, 449
1296 Glycine max DNA G975, G2583 199, 449
1297 Oryza sativa DNA G975 199
1298 Oryza sativa DNA G975, G2583 199, 449
1299 Zea mays DNA G975, G2583 199, 449
1300 Zea mays DNA G975, G2583 199, 449
1301 Brassica rapa DNA G975, G2583 199, 449
1302 Oryza sativa PRT G975, G2583 199, 449
1393 Glycine max DNA G1069, G2153 221, 417
1394 Glycine DNA G1069, G2153 221, 417
367/726
max
1395 Oryza sativa PRT G1069, G1073, G2153 221, 223, 417
1396 Zea mays DNA G1069, G2153 221, 417
1397 Lotus j aponicu s DNA G1069, G2153 221, 417
1398 Lycopers icon esculent um DNA G1073 223
1399 G3399 Oryza sativa PRT G1073 223
1400 Oryza sativa PRT G1073 223
1401 G3400 Oryza sativa PRT G1073 223
1402 Oryza sativa PRT G1073 223
1403 Oryza sativa PRT G1073 223
1404 Oryza sativa PRT G1073 223
1405 Oryza sativa PRT G1073 223
368/726
1406 Oryza sativa PRT G1073 223
1407 Oryza sa tiva PRT G1073 223
1408 Oryza sativa PRT G1073 223
1409 Oryza sativa PRT G1073 223
1410 Oryza sativa PRT G1073 223
1411 Glycine max PRT G1073 223
1412 Glycine max PRT G1073 223
1413 Glycine max PRT G1073 223
1414 Glycine max PRT G1073 223
1415 Glycine max PRT G1073 223
1416 Glycine max PRT G1073 223
1417 Glycine max PRT G1073 223
1418 Zea mays PRT G1073 223
369/726
1419 Glycine max DNA G1075 225
1420 Glycine max DNA G1075 225
1421 Glycine max DNA G1075 225
1422 Glycine max DNA G1075 225
1423 Glycine max DNA G1075 225
1424 Oryza sativa DNA G1075 225
1425 Oryza sativa DNA G1075 225
1426 Oryza sativa DNA G1075 225
1587 Glycine max DNA G1411, G2509 269, 439
1588 Glycine max DNA G1411, G2509 269, 439
1589 Glycine max DNA G1411, G2509 269, 439
1590 Glycine max DNA G1411, G2509 269, 439
1591 Zea mays DNA G1411, G2509 269, 439
370/726
1604 Glycine max DNA G1451 277
1605 Glycine max DNA G1451 277
1606 Oryza sativa DNA G1451 277
1607 Oryza sativa DNA G1451 277
1608 Oryza sativa DNA G1451 277
1609 Zea mays DNA G1451 277
1610 Zea mays DNA G1451 277
1611 Zea mays DNA G1451 277
1612 Zea mays DNA G1451 277
1613 Medicago truncatu la DNA G1451 277
1614 Solanum tuberosu m DNA G1451 277
1615 Zea mays DNA G1451 277
1616 Sorghum propinqu um DNA G1451 277
1617 Glycine DNA G1451 277
371/726
max
1618 Sorghum bicolor DNA G1451 277
1619 Hordeum vulgare DNA G1451 277
1620 Lycopers icon esculent um DNA G1451 277
1621 Oryza sativa PRT G1451 277
1622 Oryza sativa PRT G1451 277
1623 Oryza sativa PRT G1451 277
1624 Oryza sativa PRT G1451 277
1671 Glycine max DNA G1543 303
1672 Oryza sativa DNA G1543 303
1673 Zea mays DNA G1543 303
1674 Oryza sativa PRT G1543 303
1728 Glycine DNA G1792 331
372/726
max
1729 Glycine max DNA G1792 331
1730 Glycine max DNA G1792 331
1731 Glycine max DNA G1792 331
1732 Glycine max DNA G1792 331
1733 Zea mays DNA G1792 331
1734 Lycopers icon esculent um DNA G1792 331
1735 G3380 Oryza sa tiva PRT G1792 331
1736 G3381 Oryza sativa indica PRT G1792 331
1737 G3383 Oryza sativa j aponica PRT G1792 331
1795 Oryza sativa DNA G1930 369
1908 Medicago DNA G2155 419
373/726
trnncatu la
1909 Medi cago truncatu la DNA G2155 419
1910 Glycine max DNA G2155 419
2907 G3472 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
2908 G3475 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
2909 G3476 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
2910 G3395 Oryza sativa DNA G481, G482 87, 89
2911 G3397 Oryza sativa DNA G481, G482 87, 89
2912 G3398 Oryza sativa DNA G481, G482 87, 89
2913 G3434 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
2914 G3436 Zea mays DNA G481, G482 87, 89
2915 G3445 Glycine max DNA G682 147
2916 G3446 Glycine max DNA G682 147
374/726
2917 G3448 Glycine max DNA G682 147
2918 G3449 Glycine max DNA G682 147
2919 G3450 Glycine max DNA G682 147
2920 G3392 Oryza sativa DNA G682 147
2921 G3393 Oryza sa tiva DNA G226, G682 37, 147
2922 G3431 Zea mays DNA G682 147
2923 G3451 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
2924 G3452 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
2925 G3453 Glycine max DNA G867, G1930 169, 369
2926 G3388 Oryza sativa DNA G867, G1930 169, 369
2927 G3389 Oryza sativa DNA G867, G1930 169, 369
2928 G3390 Oryza sativa DNA G867, G1930 169, 369
2929 G3433 Zea mays DNA G867, G1930 169, 369
2930 G3376 Oryza DNA G912 185
375/726
sa ti va
2931 G3372 Oryza sativa DNA G912 185
2932 G3373 Oryza sativa DNA G912, G913 185, 187
2933 G3375 Oryza sativa DNA G912, G913 185, 187
2934 G3377 Oryza sativa DNA G912 185
2935 G3379 Oryza sativa DNA G912 185
2936 G3440 Zea mays DNA G912 185
2937 G3399 Oryza sativa DNA G1073 223
2938 G3400 Oryza sativa DNA G1073 223
2939 G3380 Oryza sativa DNA G1792 331
2940 G3381 Oryza sativa indica DNA G1792 331
2941 G3383 Oryza sa tiva japonica DNA G1792 331
2942 G3643 Glycine PRT G47, G2133 11, 407
376/726
max
2943 G3811 Glycine max PRT G922 189
2944 G3813 Oryza sativa DNA G922 189
2945 G3429 Oryza sativa DNA G481, G482 87, 89
2946 G3429 Oryza sativa PRT G481, G482 87, 89
2947 G3470 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
2948 G3470 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
2949 G3471 Glycine max DNA G481, G482 87, 89
2950 G3471 Glycine max PRT G481, G482 87, 89
[0429] A tabela 11 relaciona um resumo das sequências homólogas identificadas usando BLAST (programa tblastx). A primeira coluna mostra o identificador de sequência de polinucleotideo (SEQ ID NO) , a segunda coluna mostra o identificador de cDNA correspondente (ID de gene), a terceira coluna mostra o Número de Acesso ao GenBank do polinucleotideo ortólogo ou homólogo (ID da Sequência de Teste), a quarta coluna mostra o valor de probabilidade
377/726 calculado que a identidade de sequência deterá ter (Probabilidade de Soma Menor), a quinta coluna mostra as espécies de planta para as quais a sequência de teste foi isolada (Espécies de Sequência de Teste) e a sexta coluna mostra a observação do GenBank da sequência de teste ortóloga ou homóloga (Observação do GenBank para a Sequência de Teste).
Tabela 11. Resumo das sequências representativas que são homólogas aos fatores de transcrição presentemente revelados
SEQ ID GID ID de Menor Espécies de Observação do
N° : sequência de probabilida sequência de GenBank para
teste de de soma teste sequência de
teste
3 G19 BG321358 1.00E-101 Descurainia Ds01_07d03_ _R
sophia Ds 0l_AAFC_ECOR_es
tresse frio
3 G19 BH444831 1.00E-77 Brassica BOHPW42TR BOHP
oleracea genômico de
Brassica oleracea
3 G19 BM412184 2.00E-43 Lycopersicon EST586511 Lyco
esculentum fruto que rompe
tomate
3 G19 BU837697 3.00E-43 Populus T104G02 Populus
tremula X apica
378/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
Populus tremuloides
3 G19 CA784650 6.00E-43 Glycine max sat87al0.yl GmC1062 SOY clone de cDNA de Glycine max
3 G19 BU819833 3.00E-41 Populus tremula UA48BPB07 Biblioteca de clone de cDNA Populus tremula cambium
3 G19 BU870388 4.00E-41 Populus balsamifera subsp. trichocarpa Fluxo de Q011H05 Populus
3 G19 CA797119 1.00E-38 Theobroma ca ca o Cac_BL_4204 Cac__BL (Feijão e folha da Amei
3 G19 BI436183 2.00E-38 Solanum tuberosum EST538944 cSTE Clone cDNA de Solanum tuberosum
379/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
3 G19 BQ989448 2.00E-36 Lactuca sativa QGF17L05.yg.abl QG_EFGHJ alface serrilhada La
3 G19 gil0798644 5.70E-36 Nicotiana tabacum Fator de transcrição contendo domínio AP2
3 G19 gi6176534 2.40E-35 Oryza sativa Proteína semelhante ao EREBP.
3 G19 gil688233 7.50E-34 Solanum tuberosum Homólogo da proteína de ligação de DNA.
3 G19 gi22074046 1.50E-33 Lycopersicon esculentum Fator de transcrição JERF1.
3 G19 gil8496063 4.90E-33 Fagus syl va ti ca Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
3 G19 gi20805105 2.10E-32 Oryza sativa Contém ESTs AU06
380/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
(grupo de cultivo japonês)
3 G19 gi24940524 2.30E-31 Triticum aestívum Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
3 G19 gil8266198 2.30E-31 Narcissus pseudonarcissu s Proteína contendo domínio AP-2
3 G19 gi3264767 1.30E-30 Prunus ãrmeniaca Proteína contendo domínio AP2.
3 G19 gi24817250 4.00E-28 Cicer arietinum Proteína semelhante ao fator de transcrição EREBP.
5 G22 AB016264 9.00E-48 Nicotiana sylvestris Gene nserf2 para el sensível ao
381/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
etileno
5 G22 ΊΌΒΒΥ4Α 1.00E-47 Nicotiana tabacum mRNA para ERF1, cds. Completo
5 G22 AP004533 4.OOE-47 Lotus j aponicus DNA genômico, cromossoma 3, clone:LjT14G02,
5 G22 LEU89255 6.00E-47 Lycopersicon esculentum Pti4 mRNA de proteína de ligação de DNA, comp
5 G22 BQ517082 6.00E-46 Solanum tuberosum EST624497 Geração de um conjunto de batata c
5 G22 BE449392 1.00E-45 Lycopersicon hirsutum EST356151 L. hirsutum tricoma, Corne
5 G22 AF245119 5.00E-45 Me sembryanthem um crystallinum Fator de transcrição relacionado a AP2
5 G22 BQ165291 7.00E-45 Medicago EST611160 KVKC
382/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
truncatula cDNA de Medicago truncatula
5 G22 AW618245 8.00E-38 Lycopersicon pennellii Tricoma EST314295 L. pennellii, Cor
5 G22 BG444654 2.00E-36 Gossypium arboreum GA__Ea0025Bllf Gossypium arboreum 7-10 d
5 G22 gil208495 6.10E-48 Nicotiana tabacum ERF1.
5 G22 gi3342211 3.30E-47 Lycopersicon esculentum Pti4 .
5 G22 gi8809571 8.90E-47 Nicotiana sylvestris ligação de elemento sensível ao etileno
5 G22 gil7385636 2.70E-36 Ma tricaria chamomilla ligação de elemento sensível ao etileno
5 G22 gi8980313 2.50E-33 Catharanthus roseus Proteína de ligação de DNA de domínio AP2.
383/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
5 G22 gi7528276 8.60E-33 Mesembryanthem um crystallinum Fator de transcrição relacionado a AP2
5 G22 gi21304712 3.10E-28 Glycine max Proteína 1 de ligação de elemento sensível ao etileno
5 G22 gi!4140141 1.50E-26 Oryza sativa Fator de transcrição relacionado a AP2 putativo.
5 G22 gi!5623863 1.30E-22 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Contém EST~hypot
5 G22 gi4099914 3.10E-21 Stylosanthes hamata Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
9 G28 AF245119 2.00E-72 Mesembryanthem Fator de
384/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
um crystallinum transcrição relacionado a AP2ac
9 G28 BQ165291 1.00E-68 Medicago truncatula EST611160 KVKC cDNA Medicago truncatula
9 G28 AB016264 1.00E-57 Nicotiana sylves tris Gene nserf2 para el sensível ao etileno
9 G28 T0BBY4D 2.00E-57 Nicotiana tabacum MRNA de Tabaco para EREBP-2, cds completo.
9 G28 BQ047502 2.00E-57 Solanum tuberosum Batata desafiada com EST596620 P. infestans
9 G28 LEU89255 2.00E-56 Lycopersícon esculentum Proteína de ligação de DNA Pti4 mRNA, comp
9 G28 BH454277 2.00E-54 Brassica oleracea BOGSI45TR BOGS genômico Brassica oleracea
385/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
9 G28 BE449392 1.00E-53 Lycopersicon hirsutum Tricoma EST356151 L. hirsutum, Corne
9 G28 AB035270 2.00E-50 Ma tricaria chamomilla MRNA de McEREBPl mRNA para sensível a etileno
9 G28 AW233956 5.00E-50 Glycine max sf32e02.yl GmC1028 clone GENO de Glycine max cDNA
9 G28 gi7528276 6.10E-71 Mesembryanthem um crystallinum Fator de transcrição relacionado a AP2
9 G28 gi8809571 3.30E-56 Nicotiana sylvestris Ligação de elemento sensível ao etileno
9 G28 gi3342211 4.20E-56 Lycopersicon esculentum Pti4 .
9 G28 gi!208498 8.70E-56 Nicotiana tabacum EREBP-2.
386/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
9 G28 gil4140141 4.20E-49 Oryza sativa Fator de transcrição relacionado a AP2 putativo.
9 G28 gil7385636 3.00E-46 Ma tricaria chamomilla Ligação de elemento sensível ao etileno
9 G28 gi21304712 2.90E-31 Glycine max Proteína 1 de ligação de elemento sensível ao etileno
9 G28 gil5623863 5.60E-29 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Contém EST~hypot
9 G28 gi8980313 1.20E-26 Catharanthus roseus Proteína de ligação de DNA de domínio AP2.
9 G28 gi4099921 3.10E-21 Stylosanthes hamata Homólogo de EREBP-3.
387/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
11 G47 BG543936 1.00E-60 Brassica rapa subsp. pekinensis E1686 Repolho chinês etiol
11 G47 BH420519 3.00E-43 Brassica oleracea BOGUH88TF BOGU Genômico Brassica oleracea
11 G47 AU292603 3.00E-30 Zinnia elegans AU292603 zinnia equa de célula de mesófilo cultivada
11 G47 BE320193 1.00E-24 Medicago truncatula NF024B04RT1F1029 Desenvolvimento da raiz de Medicago
11 G47 AAAA01000718 1.00E-22 Oryza sativa ( indica cultivargroup) ( ) scaffoldO00718
11 G47 AP003379 2.00E-22 Oryza sativa Clone de cromossoma 1 P0408G07, ***
388/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
SEQUENCING IN
11 G47 AC124836 8.00E-21 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Clone de ( ) cromossoma 5
11 G47 BZ403609 2.00E-20 Zea mays OGABN17TM ZM_0.7_1.5_KB Zea mays clone genômico ZMM
11 G47 BM112772 6.00E-17 Solanum tuberosum EST560308 raízes de batata Solanum tuberosum
11 G47 BQ698717 1.00E-16 Pinus taeda NXPV_148_C06_F NXPV (Nsf Xylem Planings wood Ve
11 G47 gi20161239 6.90E-24 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Prote hipotética
11 G47 gil4140155 6.80E-17 Oryza sativa fator de transcrição de
389/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
domínio AP2 putativo.
11 G47 gi21908034 7.00E-15 Zea mays Fator de ligação DRE 2.
11 G47 gi20303011 1.90E-14 Brassica napus CBF5 proteína semelhante a CBF.
11 G47 gi8571476 3.00E-14 Atriplex hortensis proteína contendo domínio apetala2.
11 G47 gi8980313 2.10E-13 Catharanthus roseus Proteína de ligação de DNA de domínio AP2.
11 G47 gil9071243 4.40E-13 Hordeum vulgare Fator de ligação 1 CRT/DRE
11 G47 gi!8650662 5.60E-13 Lycope rsicon esculentum fator 1 de resposta ao etileno.
11 G47 gil7385636 1.20E-12 Ma tricaria chamomilla ligação de elemento sensível ao etileno
11 G47 gi!208498 1.50E-12 Nicotiana EREBP-2.
390/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
tabacum
37 G226 BU872107 2.00E-21 Populus balsamifera subsp. trichocarpa Fluxo de Q039C07 Populus
37 G226 BU831849 2.00E-21 Populus tremula x Populus tremuloides T026E01 Populus apica
37 G226 BM437313 9.00E-21 Vi tis vinifera VVA017F06_54121 Um marcador de seqüencia expressa da
37 G226 BI699876 1.00E-19 Glycine max sag49b09.yl GmC1081 Clone GEN de DNA de Glycine max
37 G226 AL750151 4.00E-16 Pinus pinaster Clone de cDNA de AS06C1 AL750151 AS Pinus pinaster
391/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
37 G226 CA744013 2.00E-12 Triticum aestivum wrils.pk006.m22 wrils Triticum aestivum c
37 G226 BH961028 3.00E-12 Brassica oleracea odj 30d06.gl B.oleracea002 Brassica olerac
37 G226 BJ472717 8.00E-12 Hordeum vulgare subsp. vulgare BJ472717 K. Sato não publicado
37 G226 BF617445 8.00E-12 Hordeum vulgare HVSMEc0017G08f Hordeum vulgare sementeira sho
37 G226 CA762299 2.00E-11 Oryza sativa (indica cultivargroup) BR060003B10F03.ab 1 IRR
37 G226 gi9954118 2.20E-11 Solanum tuberosum Específico de tubérculo e sensível a sacarose e
37 G226 gil4269333 2.50E-10 Gossypium Fator de
392/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
raimondii transcrição Myb 3 semelhante a myb.
37 G226 gil4269335 2.50E-10 Gossypium herbaceum Fator de transcrição Myb3 semelhante a myb.
37 G226 gil4269337 2.50E-10 Gossypium hirsutum Fator de transcrição Myb3 semelhante a myb.
37 G226 gi23476297 2.50E-10 Gossypioides kirkii Fator de transcrição 3 semelhante a myb.
37 G226 gil5082210 8.50E-10 Fragaria x ananassa Fator de transcrição MYB1.
37 G226 gil9072770 8.50E-10 Oryza sativa Proteína Myb típica P-tipo R2R3
37 G226 gil5042108 1.40E-09 Zea mays subsp. parviglumis Proteína Cl.
37 G226 gil5042124 1.40E-09 Zea luxurians Proteína Cl.
37 G226 gi20514371 1.40E-09 Cucumis Werewolf.
393/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
sativus
59 G353 BQ790831 5.00E-68 Brassica rapa subsp. pekinensis E4675 repolho chinês etiol
59 G353 BZ019752 1.00E-67 Brassica oleracea oed85c06.gl B.oleracea002 Brassica olerac
59 G353 L46574 6.00E-40 Brassica rapa BNAF1975 Botões de flor de mustarda Brassica rapa cD
59 G353 AB006601 7.00E-26 Petunia x hybrida mRNA para ZPT2- 14, cds completo.
59 G353 BM437146 2.00E-25 Vi tis vinifera VVA015A06_53787 Um marcador de seqüencia expressa da
59 G353 BI422808 1.00E-24 Lycopers icon esculentum EST533474 calo de tomate, TAMU Lycop
394/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
59 G353 BU867080 1.00E-24 Populus tremula x Populus tremuloides S074B01 Populus imbib
59 G353 BM527789 3.00E-23 Glycine max sal65h07.yl GmC1061 SOY clone de cDNA de Glycine max
59 G353 BQ980246 5.00E-23 Lactuca sativa QGE10I12.yg.abl QG_EFGHJ alface serrilhada La
59 G353 BQ121106 2.00E-22 Solanum tuberosum EST606682 tecidos de batata misturados Solanum tu
59 G353 gi2346976 6.50E-28 Petunia x hybrida ZPT2-13.
59 G353 gil5623820 4.40E-25 Oryza sativa Proteína hipotética.
59 G353 gi21104613 1.40E-18 Oryza sativa (grupo de Contém ESTs AU07
395/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cultivo japonês)
59 G353 gi485814 3.10E-13 Triticum aestivum WZF1.
59 G353 gi7228329 4.00E-12 Medicago sativa Dedo de zinco semelhante a TFIIIA putativo (ou kruppel)
59 G353 gil763063 1.70E-11 Glycine max SCOF-1.
59 G353 gi2981169 2.60E-11 Nicotiana tabacum Proteína de dedo de zinco induzida por tensão osmótica
59 G353 gi4666360 1.10E-10 Datisca glomerata Proteína 1 de dedo de zinco.
59 G353 gi2129892 2.30E-08 Pisum sativum Proteína de dedo provável Pszfl ervilha de jardim.
59 G353 gi2058504 0.00018 Brassica rapa Proteína-1 de dedo de zinco.
396/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
61 G354 BZ083260 5.00E-49 Brassica oleracea He29f02.gl B.oleracea002 Brassica olerac
61 G354 BQ790831 8.00E-45 Brassica rapa subsp. pekinensis E4675 Repolho chinês etiol
61 G354 AB006600 6.00E-27 Petunia x hybrida mRNA for ZPT2- 13, cds. Completo
61 G354 L46574 1.00E-26 Brassica rapa BNAF1975 Botões de flor de mustarda Brassica rapa cD
61 G354 BM437146 3.00E-24 Vitis vinifera VVA015A06_53787 Um marcador de seqüencia expressa da
61 G354 BQ121105 6.00E-24 Solanum tuberosum EST606681 tecidos de batata mistos Solanum tu
61 G354 BM527789 2.00E-23 Glycine max sal65h07.yl Gm-
397/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cl061 SOY clone de cDNA de Glycine max
61 G354 AI898309 2.00E-23 Lycopersicon esculentum EST267752 ovário de tomateiro, TAMU Lycope
61 G354 BU867080 5.00E-22 Populus tremula x Populus tremuloides S074B01 Populus imbib
61 G354 BQ980246 1.00E-21 Lactuca sativa QGE10I12.yg.abl QG_EFGHJ alface serrilhada La
61 G354 gi2346976 5.60E-29 Petunia x hybrida ZPT2-13.
61 G354 gil5623820 1.90E-22 Oryza sativa Proteína hipotética.
61 G354 gi21104613 4.00E-19 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) contém ESTs AU07
398/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
61 G354 gi2981169 1.80E-17 Nicotiana tabacum Proteína de dedo de zinco induzida por tensão osmótica
61 G354 gil763063 4.10E-16 Glycine max SCOF-1.
61 G354 gi4666360 8.90E-15 Da tisca glomerata Proteína 1 de dedo de zinco.
61 G354 gi2058504 1.00E-14 Brassica rapa Proteína-1 de dedo de zinco.
61 G354 gi7228329 4.90E-14 Medicago sativa Dedo de zinco semelhante a TFIIIA putativo (ou kruppel)
61 G354 gi485814 3.20E-13 Triticum aestivum WZF1.
61 G354 gi2129892 1.20E-06 Pisum sativum Provável proteína de dedo Pszf1-ervilha de j ardim.
87 G481 BU238020 9.00E-71 Descurainia Ds01 14al2 A
399/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
sophia Ds 0l_AAFC_ECORC_e stresse frio
87 G481 BG440251 2.00E-56 Gossypium arboreum GA__Ea0006K20f Gossypium arboreum 7-10 dias
87 G481 BF071234 1.00E-54 Glycine max st06h05.yl GmC1065 GENO clone de cDNA de Glycine max
87 G481 BQ799965 2.00E-54 Vitis vinifera EST 2134 Uvas verdes Lambda Zap II L
87 G481 BQ488908 5.00E-53 Beta vulgaris 95-E9134-006- 006-M23-T3 beterraba MPIZ- ADIS-
87 G481 BU499457 1.00E-52 Zea mays 946175D02.yl 946 - tassel primordium preparado por S
400/726
SEQ ID GID ID de Menor Espécies de Observação do
N° : sequência de probabilida sequência de GenBank para
teste de de soma teste sequência de
teste
87 G481 AI728916 2.00E-52 Gossypium BNLGHÍ12022
hirsutum fibra de algodão
de seis dias
Gossypi
87 G481 BG642751 3.00E-52 Lycopersicon EST510945 broto
esculentum de
tomate/meri st ema
Lyc
87 G481 BQ857127 3.00E-51 Lactuca sativa QGB6K24. yg . abl
QG_ABCDI alface
salinas Lact
87 G481 BE413647 6.00E-51 Triticum
aestivum SCU001.E10. R99071
4 ITEC SCU Wheat
Endospe
87 G481 gill5840 1.90E-51 Zea mays SUBUNIDADE DE
FATOR DE
TRANSCRIÇÃO DE
LIGAÇÃO DE CCAAT
A (CB
87 G481 gi20160792 2.60E-47 Oryza sativa caixa CAAT
401/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
(grupo de cultivo japonês) putativa
87 G481 gil5408794 7.10E-38 Oryza sativa fator de transcrição de ligação de CCAAT putativa
89 G482 BQ5 057 0 6 7.00E-59 Solanum tuberosum Geração de EST613121 de um conjunto de batata c
89 G482 AC122165 6.00E-57 Medicago truncatula Clone mth2- 32m22, WORKING DRAFT SEQUENC
89 G482 BQ104671 2.00E-55 Rosa hybrid cultivar fc0546.e Pétalas de Rosa (Fragrant Cloud)
89 G482 BI469382 4.00E-55 Glycine max saillblO.yl Gm- C1053 clone GEN de cDNA de
402/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
Glycine max
89 G482 AAAA01003638 1.00E-54 Oryza sativa (indi ca cultivargroup) ( ) scaffoldO03638
89 G482 AP005193 1.00E-54 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) cromossoma 7 cio
89 G482 BU880488 1.00E-53 Populus balsamifera subsp. trichocarpa UM49TG09 Populus fio
89 G482 BJ248969 2.00E-53 Triticum aestivum Biblioteca de cDNA não publicada BJ248969 Y. Ogihara
89 G482 AC120529 4.00E-53 Oryza sativa Clone de cromossoma 3 OSJNBa0039N21,
403/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
*** SEQUENCI
89 G482 BU896236 7.00E-53 Populus tremula x Populus tremuloides Madeira X037F04 Populus
89 G482 gill5840 1.40E-46 Zea mays SUBUNIDADE DE FATOR DE TRANSCRIÇÃO DE LIGAÇÃO DE CCAAT A (CB
89 G482 gi20160792 2.30E-41 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) caixa CAAT putativa
93 G489 BH679015 1.00E-111 Brassica oleracea BOHXO96TF BO_2_3_KB Brassica oleracea gen
93 G489 AC136503 1.00E-75 Medicago truncatula clone mth2-15nl, WORKING DRAFT
404/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
SEQUENCE
93 G489 BQ118033 8.00E-73 Solanum tuberosum EST603609 tecidos de batata mistos Solanum tu
93 G489 BU873518 4.00E-68 Populus balsamífera subsp. trichocarpa Fluxo Q056D09 Populus
93 G489 BI934205 2.00E-67 Lycopersicon esculentum EST554094 flor de tomateiro, anthesis L
93 G489 BQ797616 1.00E-66 Vitls vinifera EST 6554 bagos de uva amadurecendo Lambda Zap I
93 G489 BM064398 4.00E-63 Capsicum annuum KS01066E11 KS01 cDNA, mRNA de Capsicum annuum
93 G489 BU927107 4.00E-60 Glycine max sas95fl2.yl Gmcl036 SOY clone de cDNA de
405/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
Glycine max
93 G489 BQ993879 6.00E-59 Lactuca sativa QGF5L12.yg.abl QG-EFGHJ alface serrilhada Lac
93 G489 AP004113 1.00E-58 Oryza sativa Clone de cromossoma 2 OJ1116_A06, *** SEQUENCING
93 G489 gi5257260 6.20E-46 Oryza sativa Semelhante a squencia de F7G19 de Arabid
93 G489 gi20804442 6.60E-19 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Proteína hipotética
93 G489 gil8481626 3.90E-09 Zea mays Proteína repressora
93 G489 gil808688 0.051 Sporobolus stapfianus Proteína hipotética.
93 G489 gi8096192 0.21 Lilium longiflorum gH2A.1.
406/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
93 G489 gi2130105 0.25 Triticum aestivum Histona H2A.4 trigo.
93 G489 gi297871 0.27 Picea abies Histona H2A.
93 G489 gi297887 0.31 Daucus carota Proteína rica em glicina.
93 G489 gil5214035 0.75 Cicer arietinum HISTONA H2A.
93 G489 gi2317760 0.75 Pinus taeda H2A homolólogo.
127 G634 OSGT2 2.00E-47 Oryza sativa Gene de 0.sativa gt-2
127 G634 BU049946 1.00E-46 Zea mays 1111017E09.yl 1111 - Unigene III de genoma de milho
127 G634 AF372499 6.00E-38 Glycine max mRNA de fator GT- 2, cds parcial.
127 G634 AB052729 4.00E-37 Pisum sativum mRNA para proteína de ligação de DNA DF1, cd completa
407/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
127 G634 BU889446 4.00E-36 Populus tremula Biblioteca de cDNA de peciolos de P021A05 Populus
127 G634 BH436958 2.00E-35 Brassica olera cea BOHBE67TF BOHB Genômico Brassica oleracea
127 G634 AI777252 3.00E-35 Lycope rsicon esculentum EST258217 tomate resistente, Cornell
127 G634 AW 68 67 5 4 1.00E-33 Medi cago truncatula NF042C08NR1F1000 Medicag de raiz nodulada
127 G634 AV410715 4.00E-33 Lotus j aponicus AV410715 plantas jovens Lotus japonicus (two-
127 G634 AI730933 8.00E-30 Gossypium hirsutum BNLGHÍ8208 fibra de algodão de seis dias Gossypium
127 G634 gil3786451 3.20E-78 Oryza sativa Fator de
408/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
transcrição putativo
127 G634 gil3646986 3.50E-66 Pis um sativum Proteína de ligação de DNA DF1.
127 G634 gil8182311 2.70E-38 Glycine max Fator GT-2.
127 G634 gi20161567 8.90E-11 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Proteína hipotética
127 G634 gil70271 4.70E-08 Nicotiana tabacum Proteína de ligação de DNA.
127 G634 gil8349 0.0027 Daucus carota Proteína rica em glicina (AA 1 96) .
127 G634 gi21388658 0.027 Physcomitrella patens Proteína de ligação de RNA rica em glicina
127 G634 gi21322752 0.052 Triticum aestivum Proteína-1 de choque ao frio.
127 G634 gi3126963 0.057 Elaeagnus Quitinase ácida.
409/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
umbellata
127 G634 gill66450 0.087 Lycopersicon esculentum Tfm5 .
147 G682 BU831849 8.00E-25 Populus tremula x Populus tremuloid.es T026E01 Populus apica
147 G682 BU872107 8.00E-25 Populus balsamifera subsp. trichocarpa Fluxo de Q039C07 Populus
147 G682 BM437313 1.00E-20 Vitis vinifera WA017F06_54121 Um marcador de seqüencia expressa da
147 G682 BI699876 4.00E-19 Glycine max sag49b09.yl Gm- C1081 GEN de clone de cDNA de Glycine max
147 G682 BH961028 1.00E-16 Brassica odj 30d06.gl
410/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
oleracea B.oleracea002 Brassica olerac
147 G682 AL750151 2.00E-14 Pinus pinaster AL750151 AS clone de cDNA de Pinus pinaster AS06C1
147 G682 BJ476463 1.00E-13 Hordeum vulgare subsp. vulgare BJ476463 K. Sato não publicado
147 G682 AJ485557 1.00E-13 Hordeum vulgare AJ485557 S00011 clone de cDNA de Hordeum vulgare
147 G682 CA762299 2.00E-13 Oryza sativa ( indica cultivargroup) BR060003B10F03.ab 1 IRR
147 G682 CA736777 2.00E-12 Triticum aestivum wpils.pk008.nl2 wpils Triticum aestivum c
147 G682 gi23476287 8.30E-12 Gossypium hirsutum fator de transcrição 2
411/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
semelhante a myb.
147 G682 gi23476291 8.30E-12 Gossypium raimondii fator de transcrição 2 semelhante a myb.
147 G682 gi23476293 8.30E-12 Gossypium herbaceum fator de transcrição 2 semelhante a myb.
147 G682 gi23476295 8.30E-12 Gossypioides kirkii fator de transcrição 2 semelhante a myb.
147 G682 gil5042120 2.20E-11 Zea luxurians Proteína Cl.
147 G682 gil9548449 2.20E-11 Zea mays Proteína P-tipo R2R3 Myb.
147 G682 gi9954118 2.80E-11 Solanum tuberosum E sensível a sacarose e específico de tubérculo
147 G682 gil5042108 4.60E-11 Zea mays subsp. parviglum is Proteína Cl.
147 G682 gil5082210 1.50E-10 Fragaria x Fator de
412/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
ananassa transcrição MYB1.
147 G682 gi22266669 1.50E-10 Vitis labrusca x Vitis vinifera Transcrição relacionada a myb
167 G864 BH472654 1.00E-105 Brassica oleracea BOHPF07TF BOHP Genômico Brassica oleracea
167 G864 AP004902 2.00E-44 Lotus j aponicus DNA genômico, cromossomo 2, clone:Lj T04G24,
167 G864 BM886518 5.00E-40 Glycine max saml7f08.yl Gmcl068 SOY clone de cDNA de Glycine max
167 G864 AW 685524 5.00E-39 Medicago truncatula NF031C12NR1F1000 Medicag de raiz nodulada
167 G864 AP001800 6.00E-36 Oryza sativa DNA genômico, cromossoma 1, PAC clone:P0443E05.
413/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
167 G864 LEU89257 6.00E-32 Lycopersicon esculentum Proteína de ligação de DNA Pti6 mRNA, comp
167 G864 AAAA01000263 7.00E-31 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffold000263
167 G864 BQ873772 8.00E-30 Lactuca sativa QGI2I03.yg.abl QG_ABCDI alface salinas Lact
167 G864 AF058827 7.00E-29 Nicotiana tabacum TSI1 (Tsil) mRNA, cds. Completo
167 G864 BZ419846 3.00E-25 Zea mays if61a07.bl WGSZmaysF (DH5a filtrado de metil) Zea m
167 G864 gi80964 69 1.60E-38 Oryza sativa Semelhante ao cromossoma 4 de Arabidopsis thaliana
414/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
167 G864 gi2213785 1.00E-34 Lycopersicon esculentum Pti6.
167 G864 gi23617235 3.70E-25 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Contém ESTs AU16
167 G864 gi3065895 7.60E-25 Nicotiana tabacum TSI1.
167 G864 gi3264767 1.90E-21 Prunus armeniaca Proteína contendo domínio AP2 .
167 G864 gi8571476 4.30E-21 Atriplex hortensis Proteína contendo domínio apetala2.
167 G864 gil7385636 2.80E-20 Ma tricaria chamomilla Ligação de elemento sensível ao etileno
167 G864 gi8809571 4.50E-20 Nicotiana sylvestris Ligação de elemento sensível ao etileno
167 G864 gi7528276 5.70E-20 Mesembryanthem Fator de
415/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
um crystallinum transcrição relacionado a AP2
167 G864 gi21908036 9.30E-20 Zea mays Fator de ligação 1 DRE.
169 G867 BQ971511 2.00E-94 Helianthus annuus QHB7E05.yg.abl QH_ABCDI girassol RHA801
169 G867 AP003450 6.00E-85 Oryza sativa Clone de cromossoma 1 P0034C09, *** SEQUENCING IN
169 G867 AC135925 1.00E-80 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 5
169 G867 AAAA01000997 1.00E-79 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffold000997
169 G867 BQ405698 2.00E-77 Gossypium GA Ed0085H02f
416/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
arboreum Gossypium arboreum 7-10 d
169 G867 BZ015521 4.00E-69 Brassica oleracea Oeg8 6a05.gl B.oleracea002 Brassica olerac
169 G867 BF520598 2.00E-66 Medicago truncatula EST458071 DSIL cDNA de Medicago truncatula
169 G867 BU994579 4.00E-64 Hordeum vulgare subsp. vulgare HM07I08r HM Hordeum vulgare
169 G867 BF424857 2.00E-62 Glycine max su59h03.yl Gmcl069 GENO clone de cDNA de Glycine max
169 G867 BU871082 1.00E-61 Populus balsamifera subsp. trichocarpa Fluxo Q026F06 Populus
169 G867 gil8565433 2.40E-85 Oryza sativa (grupo de Proteína de ligação de DNA
417/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cultivo japonês)
169 G867 gil2328560 2.90E-73 Oryza sativa Proteína de ligação de DNA putativa RAV2.
169 G867 gil0798644 7.30E-13 Nicotiana tabacum Fator de transcrição contendo domínio AP2
169 G867 gil8266198 2.50E-10 Narcissus pseudonarcissu s Proteína contendo domínio AP-2 .
169 G867 gi20340233 2.50E-10 Thellungiella halophila Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
169 G867 gi22074046 1.50E-09 Lycopersicon esculentum Fator de transcrição JERF1.
169 G867 gi3264767 6.90E-09 Prunus armeniaca Proteína contendo domínio
418/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
AP2 .
169 G867 gil8496063 7.10E-09 Fagus syl va ti ca Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
169 G867 gil3173164 8.30E-09 Pis um sativum Proteína semelhante a APETAL2.
169 G867 gil730475 8.70E-09 Hordeum vulgare Viviparous-1.
185 G912 BH498662 2.00E-93 Brassica oleracea BOGTO66TR BOGT Genômico Brassica oleracea
185 G912 AF084185 2.00E-75 Brassica napus Proteína de ligação de elemento sensível a desidratação
185 G912 AF211531 1.00E-59 Nicotiana tabacum Avr9/Cf-9 proteína rapidamente
419/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
extraída 111B
185 G912 AY034473 1.00E-55 Lycopersicon esculentum Ativador transcricional putativo
185 G912 BG321601 4.00E-53 Descurainia sophia Ds01_01h03_R Ds 0l_AAFC_ECORC_e stresse frio
185 G912 AB080965 9.00E-53 Prunus avium Gene semelhante a DREB1 para elemento sensível a desidratação
185 G912 BG590659 4.00E-51 Solanum tuberosum Folha desafiada com EST498501 P. infestans
185 G912 BG644969 1.00E-50 Medicago truncatula EST506588 KV3 cDNA de Medicago truncatula
185 G912 BU016783 2.00E-49 Helianthus annuus QHE14A02.yg.abl QH_EFGHJ girassol RHA2 8 0
185 G912 BU871514 1.00E-47 Populus Fluxo de Q031D09
420/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
balsamifera subsp. trichocarpa Populus
185 G912 gi5616086 5.90E-73 Brassica napus Proteína de ligação de elemento sensível a desidratação
185 G912 gil2003384 5.20E-58 Nicotiana tabacum Avr9/Cf-9 proteína rapidamente extraída 111B
185 G912 gi23495458 3.90E-53 Prunus avium Proteína de ligação de elemento sensível a desidrataçãot
185 G912 gil8535580 2.00E-49 Lycopersicon esculentum Ativador transcricional putativo
185 G912 gil9071243 1.30E-45 Hordeum vulgare Fator de ligação 1 de CRT/DRE.
185 G912 gi24474328 8.20E-44 Oryza sativa Co-domínio de
421/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
(grupo de cultivo japonês) apetala2
185 G912 gi6983877 9.00E-38 Oryza sativa Semelhante ao mRNA para DREB1A (AB007787).
185 G912 gil7148651 3.90E-35 Secale cereale Proteína semelhante a CBF.
185 G912 gi20152903 1.40E-32 Hordeum vulgare subsp. vulgare Fator de ligação 2 de CRT/DRE.
185 G912 gil7226801 2.10E-31 Triticum aestivum Fator de ligação de CRT/DRE putativo
187 G913 AI352878 4.00E-87 Brassica napus MB72-11D PZ204.BNlib clone de cDNA de Brassica napus
187 G913 BH536782 1.00E-59 Brassica oleracea BOGCX29TR BOGC Genômico Brassica
422/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
oleracea
187 G913 AW033835 2.00E-46 Lycopers i con esculentum EST277406 calo de tomate, TAMU Lycop
187 G913 BQ411166 1.00E-43 Gossypium arboreum GA__Ed0037B05f Gossypium arboreum 7-10 d
187 G913 BQ165313 5.00E-43 Medicago truncatula EST611182 KVKC cDNA de Medicago truncatula
187 G913 AP006060 5.00E-43 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 2
187 G913 AAAA01000810 2.00E-42 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffoldO00810
187 G913 QSJN00128 2.00E-38 Oryza sativa Clone de cromossoma 4 OSJNBA0088I22,
423/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
*** SEQUENC
187 G913 BQ976989 3.00E-31 Helianthus annuus QHI23I22.yg.abl QH_ABCDI girassol RHA8 01
187 G913 BQ592028 6.00E-30 Beta vulgaris Desenvolvimento de E012695-024021-K17-SP6 MPIZADIS-024
187 G913 gil4140155 1.60E-32 Oryza sativa Fator de transcrição de domínio AP2 putativo.
187 G913 gi!2003382 1.40E-30 Nicotiana tabacum Avr9/Cf-9 proteína rapidamente extraída 111A
187 G913 gi20303570 1.40E-30 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Transcrição putativa
187 G913 gil8535580 3.80E-30 Lycopersicon Ativador
424/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
esculentum transcricional putativo
187 G913 gi23495460 4.40E-29 Prunus aviuiu Proteína de ligação de elemento sensível a desidratação
187 G913 gi5616086 6.50E-28 Brassica napus Proteína de ligação de elemento sensível a desidratação
187 G913 gi21908034 1.40E-25 Zea mays Fator de ligação 2 de DRE.
187 G913 gil9071243 1.20E-21 Hordeum vulgare Fator de ligação 1 de CRT/DRE
187 G913 gil7148649 2.30E-17 Secale cereale Proteína semelhante a CBF.
187 G913 gi8571476 2.30E-17 Atriplex hortensis Proteína contendo domínio apetala2.
189 G922 AP004485 1.0e-999 Lotus DNA genômico,
425/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
j aponicus cromossoma 2, clone:Lj TO8Dl4,
189 G922 AP003259 1.00E-130 Oryza sativa Clone de cromossoma 1 P0466H10, *** SEQUENCING IN
189 G922 AAAA01000374 1.00E-130 Oryza sativa ( indica cultivargroup) scaffold000374
189 G922 BH493536 1.00E-121 Brassica oleracea BQGXB10TR BOGX Genômico Brassica oleracea
189 G922 CNS08CCP 1.00E-92 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 12
189 G922 BG643567 6.00E-82 Lycopersicon esculentum EST511761 broto de tomate/meristema Lyc
426/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
189 G922 BQ124898 2.00E-81 Medicago truncatula EST610474 GLSD cDNA de Medicago truncatula
189 G922 BU764181 2.00E-71 Glycine max Sas53f07.yl GmC1023 SOY clone de cDNA de Glycine max
189 G922 BG595716 3.00E-62 Solanum tuberosum EST494394 cSTS clone de cDNA de Solanum tuberosum
189 G922 AF378125 6.00E-55 Vitis vinifera Gene de proteína 1 semelhante a GAI 1 (GAI1), cds completa
189 G922 gi22830925 6.30E-127 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Giberelina putativa
189 G922 gil3365610 3.00E-57 Pisum sativum SCARECROW.
189 G922 gil3170126 5.20E-55 Brassica napus Produto de proteína não
427/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
denominado
189 G922 gil0178637 6.30E-51 Zea mays SCARECROW.
189 G922 gil3937306 2.30E-50 Oryza sativa OsGAI proteína insensível a giberelina.
189 G922 gil8254373 9.20E-50 Hordeum vulgare Fator de transcrição nuclear SLN1.
189 G922 gi5640157 2.60E-49 Triticum aestivum Modulador de resposta de giberelina.
189 G922 gi20257451 3.10E-49 Calycadenia multiglandulos a Resposta de giberelina semelhante a GIA/RGA
189 G922 gil3620224 1.30E-46 Lycopersicon esculentum Supressor lateral.
189 G922 gil3620166 2.20E-41 Capsella rubella Proteína hipotética.
191 G926 BU573158 1.00E-56 Prunus dulcis PA Ea0003A12f
428/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
semente de amêndoa em desenvolvimento Prunus
191 G926 BI310587 2.00E-55 Medicago truncatula EST5312337 GESD cDNA de Medicago truncatula
191 G926 BQ624240 1.00E-47 Citrus sinensis USDA-FP_01331 laranja doce Ridge pineapple
191 G926 BH443554 3.00E-44 Brassica oleracea BOHGN12TR BOHG Genômico Brassica oleracea
191 G926 BNU33884 2.00E-39 Brassica napus Subunidade B de fator de ligação de clone bncbf-bl CCAAT
191 G926 BF113081 8.00E-38 Lycopersicon esculentum EST440591 fruto que rompe tomate Lyco
191 G926 BG886494 2.00E-36 Solanum EST512345 cSTD
429/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
tuberosum clone de cDNA de Solanum tuberosum
191 G926 AW472517 3.00E-36 Glycine max si26cl2.yl Gmrl030 GENO clone de cDNA de Glycine max
191 G926 BQ407583 6.00E-36 Gossypium arboreum GA__Ed0108F07f Gossypium arboreum 7-10 d
191 G926 BG343051 7.00E-34 Hordeum vulgare HVSMEg0001N16f Hordeum vulgare pre-anthesis
191 G926 gill73616 9.70E-41 Brassica napus Homólogo de subunidadde B de de fator de ligação CCAAT
191 G926 gi2826786 1.10E-27 Oryza sativa Proteína RAPB.
191 G926 gi7141243 5.80E-27 Vitis riparia Fator de transcrição.
191 G926 gi4731314 4.00E-19 Nicotiana tabacum Subunidade de fator de
430/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
transcrição de ligação de CCAAT
191 G926 gi2104675 0.0061 Vicia faba Fator de transcrição.
191 G926 gi21667471 0.64 Hordeum vulgare Proteína semelhante a CONSTANS
191 G926 gil3775107 0.67 Phaseolus vulgaris Fator de transição de 2 de bZIP.
191 G926 gil096930 0.69 Solanum tuberosum Inibidor de H ATPase.
191 G926 gi24413952 0.72 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Supe ferro putativo
191 G926 gil839593 0.78 Zea mays Homólogo de proteína de choque térmico 70 {clone CHEM 3} [Ze
431/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
199 G975 BH477624 1.00E-69 Brassica oleracea BOGNBIOTF BOGN Genômico Brassica oleracea
199 G975 CA486875 3.00E-64 Triticum aestivum WHE4337_A02_A03ZS antera meiótica do trigo cD
199 G975 BI978981 2.00E-60 Rosa chinensis zD09 Old Blush petal SMART library Rosa chin
199 G975 AP004869 9.00E-60 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 2
199 G975 BU978490 1.00E-58 Hordeum vulgare subsp. vulgare HA13G05r HA Hordeum vulgare
199 G975 BG642554 8.00E-57 Lycopers icon esculentum EST356031 botões de flor de tomateiro, anthe
432/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
199 G975 BI958226 2.00E-54 Hordeum vulgare HVSMEn0013P17f Hordeum vulgare rachis EST 1
199 G975 BQ104740 1.00E-52 Rosa hybrid cultivar fc0212.e Pétalas de rosa (Fragrant Cloud)
199 G975 AW705973 3.00E-51 Glycine max sk64c02.yl GmC1016 GENO clone de cDNA de Glycine max
199 G975 AP003615 1.00E-47 Oryza sativa Clone de cromossoma 6 P0486H12, *** SEQUENCING IN
199 G975 gil8650662 1.80E-25 Lycopersicon esculentum Fator 1 de resposta ao etileno.
199 G975 gil31754 2.10E-22 Lupinus polyphyllus PROTEÍNA PPLZ02.
199 G975 gi3065895 9.20E-20 Nicotiana tabacum TSI1.
433/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
199 G975 gi8571476 9.30E-20 Atriplex hortensis Proteína contendo domínio apetala2.
199 G975 gil9920190 1.90E-19 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Domínio AP2 putativo
199 G975 gi21908036 8.40E-19 Zea mays Fator de ligação 1 DRE.
199 G975 gi4099914 1.10E-18 Stylosanthes hamata Ligação de elemento sensível ao etileno p
199 G975 gil0567106 1.60E-18 Oryza sativa OsERF3.
199 G975 gi8809573 9.60E-18 Nicotiana sylvestris Ligação de elemento sensível ao etileno
199 G975 gi7528276 1.20E-17 Mesembryanthem um crystallinum Fator de transcrição relacionado a AP2
221 G1069 BZ025139 1.00E-111 Brassica Oeh63dl2.gl
434/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
oleracea B.oleracea002 Brassica olerac
221 G1069 AP004971 1.00E-93 Lotus japonicus DNA genômico, cromossoma 5, clone:LjT45G21,
221 G1069 AP004020 2.00E-79 Oryza sativa Clone de cromossoma 2 OJ1119_A01, *** SEQUENCING
221 G1069 AAAA01017331 2.00E-70 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffoldO17331
221 G1069 BQ165495 2.00E-62 Medicago truncatula EST611364 KVKC cDNA de Medicago truncatula
221 G1069 AC135209 2.00E-61 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 3
221 G1069 AW621455 4.00E-59 Lycopersicon EST312253 raiz de
435/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
esculentum tomateiro durante/após
221 G1069 BM110212 4.00E-58 Solanum tuberosum EST557748 raizes de tomateiro Solanum tuberosum
221 G1069 BQ785950 7.00E-58 Glycine max saq61f09.yl Gm- C1076 SOY clone de cDNA de Glycine max
221 G1069 BQ863249 1.00E-57 Lactuca sativa QGC23G02.yg.abl QG_ABCDI alface salinas Lac
221 G1069 gi24059979 2.10E-38 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Semelhante ao DNA-bin
221 G1069 gil5528814 4.50E-36 Oryza sativa Proteína hipotética ~semelhante ao Arabidopsis
221 G1069 gi4165183 7.60E-25 Antirrhinum Proteína SAP1.
436/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
maj us
221 G1069 gi2213534 1.20E-19 Pisum sativum Proteína semelhante PD1 de ligação de DNA
221 G1069 gi2459999 1 Ch1amydomonas reinhardtii Tubulin Uni3.
221 G1069 gil00872 1 Zea mays Proteína MFS18 milho.
221 G1069 gil362165 1 Hordeum vulgare Proteína hipotética 2 (clone ES1A) bar
223 G1073 AAAA01000486 4.00E-74 Oryza sativa ( indica cultivargroup) ( ) scaffoldO00486
223 G1073 AP004165 4.00E-74 Oryza sativa Clone de cromossoma 2 OJ1479B12, *** SEQUENCING
437/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
223 G1073 AP005477 2.00E-67 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 6
223 G1073 BZ412041 3.00E-65 Zea mays OGACG56TC ZM_0.7_1.5_KB clone genômico de Zea mays ZMM
223 G1073 AJ502190 3.00E-64 Medi cago truncatula AJ502190 MTAMP cDNA de Medicago truncatula
223 G1073 BQ865858 4.00E-63 Lactuca sativa QGC6B08.yg.abl QG_ABCDI alface salinas Lact
223 G1073 BH975957 5.00E-63 Brassica oleracea Odh67ell.gl B.oleracea002 Brassica olerac
223 G1073 BG134451 8.00E-62 Lycopersicon esculentum EST467343 Lycoper crista de galo em tomateiro
223 G1073 AP004971 3.00E-60 Lotus DNA genômico.
438/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
j aponicus cromossoma 5, clone:LjT45G21,
223 G1073 BM110212 7.00E-58 Solanum tuberosum EST557748 raizes de tomateiro Solanum tuberosum
223 G1073 gil5528814 5.50E-38 Oryza sativa Proteína hipotética~semelh ante ao Arabidopsis
223 G1073 gi24059979 1.30E-29 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Semelhante ao DNA-bin
223 G1073 gi2213536 1.20E-21 Pisum sativum Proteína de ligação de DNA PD1.
223 G1073 gi4165183 5.70E-20 Antirrhinum maj us Proteína SAP1.
223 G1073 gi!166450 0.00059 Lycopersicon esculentum Tfm5.
223 G1073 gi!1545668 0.0051 Chlamydomonas CIA5.
439/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
reinhardtii
223 G1073 gi4755087 0.0054 Zea mays Proteína induzida por alumínio; proteína induzida por Al.
223 G1073 gi395147 0.0068 Nicotiana tabacum proteína rica em glicina.
223 G1073 gi21068672 0.017 Cicer arietinum proteína rica em glicina putativa.
223 G1073 gil346181 0.017 Sinapis alba PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE RNA RICA EM GLICINA GRP2A.
225 G1075 BH596283 1.00E-108 Brassica oleracea BOGBL42TR BOGB Genômico Brassica oleracea
225 G1075 BQ165495 5.00E-88 Medicago truncatula EST611364 KVKC cDNA de Medicago truncatula
440/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
225 G1075 AAAA01003389 3.00E-84 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffold003389
225 G1075 OSJN00182 3.OOE-84 Oryza sativa Clone de cromossoma 4 OSJNBa0086006, *** SEQUENC
225 G1075 BZ412041 1.00E-76 Zea mays OGACG56TC ZM_0.7_1.5_KB clone genômico de Zea mays ZMM
225 G1075 AP005 653 1.00E-68 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 2
225 G1075 BQ863249 3.00E-65 Lactuca sativa QGC23G02.yg.abl QG_ABCDI alface salinas Lac
225 G1075 BM110212 2.00E-63 Solanum tuberosum EST557748 raízes de batata Solanum
441/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
tuberosum
225 G1075 BQ838600 8.00E-63 Triticum aestivum WHE2912_D12_H24ZS Trigo estressado por alumínio
225 G1075 AP004971 4.00E-62 Lotus j aponicus DNA genômico, cromossoma 5, clone:LjT45G21,
225 G1075 gil5528814 3.80E-39 Oryza sativa Proteína hipotética~semelh ante ao Arabidopsis
225 G1075 gi24059979 6.60E-35 Oryza sativa (grupo de cultivo japonônico) Semelhante ao DNA-bin
225 G1075 gi4165183 7.30E-20 Antirrhinum maj us Proteína SAP1.
225 G1075 gi2213534 2.50E-19 Pisum sativum Proteína semelhante a PD1 de ligação de DNA
442/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
225 G1075 gi3810890 3.70E-05 Cucumis sativus proteína 2 rica em glicina.
225 G1075 gi7489009 0.0001 Lycopersicon esculentum proteína rica em glicina (clone wlO-l
225 G1075 gi4115615 0.0018 Zea mays Proteína específica de cap de raiz rica em glicina.
225 G1075 gil628463 0.004 Silene lati folia Men-4.
225 G1075 gi395147 0.005 Nicotiana tabacum proteína rica em glicina.
225 G1075 gil21631 0.0056 Nicotiana sylvestris PR ESTRUTURAL DE PAREDE DE CÉLULA RICA EM GLICINA
269 G1411 BZ017225 3.00E-51 Brassica oleracea oei67e03.bl B.oleracea002 Brassica olerac
269 G1411 BQ138607 8.00E-44 Medicago NF005C01PH1F1004
443/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
truncatula Medicago infectado com Phoma
269 G1411 BQ786702 5.00E-36 Glycine max saq72b07.yl GmC1076 SOY clone de cDNA de Glycine max
269 G1411 BM062508 7.00E-32 Capsicum annuum KS01043F09 KS01 cDNA, mRNA de Capsicum annuum
269 G1411 AAAA01000832 2.00E-30 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffoldO00832
269 G1411 OSJN00240 2.00E-30 Oryza sativa DNA genômico, cromossoma 4, BAC clone: OSJNBaO
269 G1411 BE419451 2.00E-29 Triticum aestivum WWS012.C2R000101 ITEC WWS Wheat Scutellum
269 G1411 CA014817 6.00E-29 Hordeum HT12H01r HT
444/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
vulgare subsp. vulgare Hordeum vulgare
269 G1411 BE642320 1.00E-28 Ceratopteris richardii Cri2_5_L17_SP6 Ceratopteris Spore Li
269 G1411 BE494041 2.00E-27 Secale cereale WHE1277_B09_D17ZS cDNA de antera de Secale cereale
269 G1411 gi20160854 1.40E-29 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) proteína hipotética
269 G1411 gil4140141 1.50E-24 Oryza sativa Fator de transcrição relacionado a AP2 putativo.
269 G1411 gi3342211 1.40E-23 Lycope rsicon esculentum Pti4 .
269 G1411 gil0798644 2.30E-23 Nicotiana tabacum Fator de transcrição
445/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
contendo domínio AP2
269 G1411 gi8809571 2.30E-23 Nicotiana sylvestris Ligação de elemento sensível ao etileno
269 G1411 gi24817250 3.00E-23 Cicer arietinum Proteína semelhante a fator de transcrição EREBP
269 G1411 gi3264767 3.00E-23 Prunus armeniaca Proteína contendo domínio AP2.
269 G1411 gil688233 3.80E-23 Solanum tuberosum Homólogo de proteína de ligação de DNA.
269 G1411 gi7528276 3.80E-23 Mesembryanthem um crystallinum Fator de transcrição relacionado a AP2
269 G1411 gi21304712 6.20E-23 Glycine max Proteína de ligação 1 de de elemento sensível ao etileno
446/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
277 G1451 AB071298 1.0e-999 Oryza sativa mRNA de OsARF8 para fator 8 de resposta a auxina, parti
277 G1451 AY105215 1.00E-157 Zea mays Sequência de mRNA de PCO121637
277 G1451 AW690130 1.00E-109 Medicago truncatula NF028B12ST1F1000 Desenvolvimento de caule de Medica
277 G1451 BQ862285 1.00E-108 Lactuca sativa QGC20K23.yg.abl QG_ABCDI alface salinas Lac
277 G1451 BG597435 1.00E-107 Solanum tuberosum EST496113 clone de cDNA de cSTS Solanum tuberosum
277 G1451 BJ303602 1.00E-104 Triticum aestivum Biblioteca não publicada de cDNA BJ303602 Y. Ogihara
447/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
277 G1451 OSA306306 1.00E-103 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Oryza sativa subsp.
277 G1451 BQ595269 1.00E-89 Beta vulgaris Desenvolvimento de E012710-024023-D13-SP6 MPIZADIS-024
277 G1451 CA801218 1.00E-86 Glycine max sau02f06.y2 Gmcl062 SOY clone de cDNA de Glycine max
277 G1451 BG159611 8.00E-79 Sorghum bicolor OV2_6_G07.bl_A002 Ovary 2 (OV2) Sorghum bic
277 G1451 gil9352049 3.70E-247 Oryza sativa Fator 8 de resposta de auxina.
277 G1451 gi20805236 3.10E-126 Oryza sativa (grupo de Fator de resposta a auxina
448/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cultivo japonês)
277 G1451 gi24785191 4.10E-55 Nicotiana tabacum Proteína hipotética.
277 G1451 gi23343944 2.40E-28 Mirabilis j a lapa proteína de fator sensível a auxina.
277 G1451 gi20269053 7.00E-10 Populus tremula x Populus tremuloides Proteína aux/IAA.
277 G1451 gi287566 3.10E-06 Vigna radiata ORE.
277 G1451 gill4733 1.10E-05 Glycine max PROTEÍNA INDUZIDA POR AUXINA AUX22.
277 G1451 gi871511 2.40E-05 Pisum sativum proteína induzida por auxina.
277 G1451 gil8697008 0.00027 Zea mays Produto de proteína não denominado.
277 G1451 gi!7976835 0.00068 Pinus pinaster Fator de
449/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
transcrição induzido por auxina putativa
303 G1543 AF145727 4.00E-51 Oryza sativa mRNA de proteína leucina zipper de homeoboxee (hox3)
303 G1543 CA030381 6.00E-41 Hordeum vulgare subsp. vulgare HX06007r HX Hordeum vulgare
303 G1543 BQ741095 6.00E-39 Glycine max saql4cl0.yl Gmcl045 SOY clone de cDNA de Glycine max
303 G1543 AT002118 1.00E-38 Brassica rapa subsp. pekinensis AT002118 cDNA Br de botão de flor
303 G1543 BQ857226 2.00E-37 Lactuca sativa QGB6P03.yg.abl QG_ABCDI alface salinas Lact
303 G1543 AB028075 4.00E-37 Physcomitrella mRNA para
450/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
patens proteína homeoboxe PpHB4, comp
303 G1543 PBPHZ4GEN 4.00E-37 Pimpinella brachycarpa MRNA de P.brachycarpa para homeoboxeleu
303 G1543 LEHDZIPP 5.00E-37 Lycopersicon esculentum MRNA de L.esculentum para proteína HD-ZIP
303 G1543 AF443619 1.00E-36 Craterostigma plantagineum Proteína leucina zipper de homeoboxee
303 G1543 AJ498394 2.00E-36 Medicago truncatula AJ498394 MTPOSE cDN de Medicago truncatula
303 G1543 gi5006851 8.30E-51 Oryza sativa Homeoboxe de proteína leucina zipper.
303 G1543 gi20161555 1.70E-50 Oryza sativa (grupo de Homeoboxe putativo
451/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cultivo japonês)
303 G1543 gil8034437 1.60E-38 Craterostigma plantagineum Homeoboxe de proteína leucina zipper
303 G1543 gill49535 4.30E-38 Pimpinella brachycarpa Homeoboxeproteína leucina zipper.
303 G1543 gi992598 1.20E-37 Lycopersicon esculentum Proteína HD-ZIP.
303 G1543 gi7415620 1.50E-37 Physcomitrella patens Proteína de homeoboxe PpHB4.
303 G1543 gil234900 3.10E-37 Glycine max Homeoboxeproteína leucina zipper.
303 G1543 gi3868847 1.90E-35 Ceratopteris richardii CRHB10.
303 G1543 gi8919876 1.90E-35 Capsella rubella Proteína hipotética.
303 G1543 gi!032372 3.20E-35 Helianthus annuus Proteína de homeobox.
452/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
331 G1792 AI776626 5.00E-35 Lycopersicon esculentum Tomate resistente a EST257726, Cornell
331 G1792 BQ045702 1.00E-32 Solanum tuberosum Batata desafiada com EST594820 P. infestans
331 G1792 BM178875 7.00E-32 Glycine max saj60f01.yl Gm- cl072 SOY clone de cDNA de Glycine max
331 G1792 BF649790 1.00E-31 Medi cago truncatula NF084C07EC1F1052 cultura de célula promovida
331 G1792 BZ020356 1.00E-30 Brassica oleracea oeg04al0.gl B.oleracea002 Brassica olerac
331 G1792 BZ337899 3.00E-30 Sorghum bicolor ia91fll.bl WGS- SbicolorF (JM107 adapted met
331 G1792 AC025907 3.00E-30 Oryza sativa Clone de
453/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cromossoma 10 nbxb0094K20, *** SEQUENCIN
331 G1792 AAAA01002491 3.00E-30 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffold002491
331 G1792 BZ359367 8.00E-30 Zea mays Id72fll.bl WGSZmaysF (JM107 filtro de metila adaptado)
331 G1792 AC137635 2.00E-27 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Seqüencia genômica para
331 G1792 gi23452024 4.00E-26 Lycopersicon esculentum Fator de transcrição TSRF1.
331 G1792 gil732406 2.10E-25 Nicotiana tabacum Proteína de ligação de DNA S25-XP1.
454/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
331 G1792 gil2597874 3.70E-25 Oryza sativa ligação de elemento sensível ao etileno putativo
331 G1792 gi7528276 7.60E-25 Me sembryanthem um crystallinum Fator de transcrição relacionado a AP2
331 G1792 gi24060081 1.30E-23 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Etileno putativo
331 G1792 gi8980313 1.80E-23 Catharanthus roseus Proteína de ligação de DNA de domínio AP2.
331 G1792 gi8809571 1.80E-23 Nicotiana sylvestris ligação de elemento sensível ao etileno
331 G1792 gil7385636 1.20E-21 Matricaria chamomilla ligação de elemento sensível ao etileno
331 G1792 gi21304712 3.10E-21 Glycine max Proteína 1 de
455/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
ligação de elemento sensível ao etileno
331 G1792 gi8571476 1.10E-20 Atriplex hortensis proteína contendo domínio apetala2.
341 G1820 AW776719 1.00E-43 Medi cago truncatula EST335784 DSIL cDNA de Medicago truncatul
341 G1820 BM065544 3.00E-40 Capsicum annuum KS07004F12 KS07 cDNA, mRNA de Capsicum annuum
341 G1820 BG591677 4.00E-40 Solanum tuberosum Folha desafiada com EST499519 P.infestans So
341 G1820 BI701620 1.00E-38 Glycine max Sail8a04.yl Gmcl053 clone GEN de cDNA de Glycine max
341 G1820 BQ411597 3.00E-37 Gossypium GA Ed0041B06f
456/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
arboreum Gossypium arboreum 7-10 d
341 G1820 BE208917 6.00E-37 Citrus x paradisi GF-FV-P3F5 Marsh amarelamento de toranja jovem
341 G1820 BH725354 1.00E-36 Brassica oleracea BOHVO37TF BO_2_3_KB Brassica oleracea gen
341 G1820 AW093662 9.00E-36 Lycopersicon esculentum EST286842 elicitador misturado de tomate, BT
341 G1820 BU819346 4.00E-35 Populus tremula Biblioteca de cDNA de UA42BPF01 Populus tremula cambium
341 G1820 AAAA01002977 3.00E-34 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffold002977
457/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
341 G1820 gi5257260 1.40E-34 Oryza sativa Semelhante a Sequência de BAC F7G19 de Arabid
341 G1820 gi20804442 1.70E-15 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Proteína hipotética
341 G1820 gil8481626 6.30E-08 Zea mays Proteína repressora.
341 G1820 gi297871 0.39 Picea abies Histona H2A.
341 G1820 gi297887 0.41 Daucus carota Proteína rica em glicina.
341 G1820 gi2130105 0.54 Triticum aestivum Histona H2A.4 trigo.
341 G1820 gi6782438 0.74 Nicotiana glauca Proteína rica em glicina.
341 G1820 gil5214035 0.98 Cicer arietinum HISTONA H2A.
341 G1820 gi2317760 0.98 Pinus taeda Homólogo H2A.
341 G1820 gill73628 0.99 Phalaenopsis sp. SM9108 Proteína rica em glicina.
458/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
343 G1836 BI701620 7.00E-35 Glycine max sail8a04.yl GmC1053 clone GEN cDNA de Glycine max
343 G1836 AW776719 2.00E-33 Medicago truncatula EST335784 DSIL Medicago truncatula cDNA
343 G1836 BQ411597 2.00E-33 Gossypium arboreum GA__Ed0041B06f Gossypium arboreum 7-10 d
343 G1836 BMO 655 44 2.00E-32 Capsicum annuum KS07004F12 KS07 cDNA, mRNA de Capsicum annuum
343 G1836 BG591677 3.00E-31 Solanum tuberosum Folha So desafiada com EST499519 P. infestans
343 G1836 BU819346 6.00E-31 Populus tremula Biblioteca de cDNA de UA42BPF01 Populus tremula
459/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cambium
343 G1836 BH725354 4.00E-30 Brassica oleracea BOHVO37TF BO_2_3_KB Brassica oleracea gen
343 G1836 BE208917 6.00E-30 Citrus x paradisi GF-FV-P3F5 Marsh amarelamento de toranja jovem
343 G1836 AAAA01024926 5.00E-29 Oryza sativa ( indica cultivargroup) ( ) scaffold024926
343 G1836 AW093662 9.00E-29 Lycopersicon esculentum EST286842 elicitador misto de tomateiro, BT
343 G1836 gi5257260 2.10E-29 Oryza sativa Semelhante a Sequência de BAC F7G19 de Arabid
343 G1836 gi20804442 6.30E-16 Oryza sativa (grupo de cultivo Proteína hipotética
460/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
japonês)
343 G1836 gil8481626 2.00E-06 Zea mays Proteína repressora.
343 G1836 gil8539425 0.84 Pinus sylves tris Malato desidrogenase putativa.
343 G1836 gil22084 1 Hordeum vulgare Histona H3.
343 G1836 gi225348 1 Hordeum vulgare subsp. vulgare Histona H3.
369 G1930 BU025988 5.00E-88 Helianthus annuus QHG12J17.yg.abl QH_EFGHJ girassol RHA2 8 0
369 G1930 AP003450 8.00E-80 Oryza sativa Clone de cromossoma 1 P0034C09, *** SEQUENCING IN
369 G1930 AC135925 7.00E-79 Oryza sativa (grupo de ( ) clone de cromossoma 5
461/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cultivo japonês)
369 G1930 AAAA01000997 3.00E-78 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffold000997
369 G1930 BU994579 1.00E-65 Hordeum vulgare subsp. vulgare HM07I08r HM Hordeum vulgare
369 G1930 BQ405698 1.00E-65 Gossypium arboreum GA__Ed0085H02f Gossypium arboreum 7-10 d
369 G1930 BF520598 1.00E-64 Medicago truncatula EST458071 DSIL cDNA de Medicago truncatula
369 G1930 BZ015521 1.00E-64 Brassica oleracea oeg86a05.gl B.oleracea002 Brassica olerac
369 G1930 BF424857 2.00E-58 Glycine max su59h03.yl Gmcl069 GENO clone de cDNA de
462/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
Glycine max
369 G1930 BU870896 1.00E-56 Populus balsamifera subsp. trichocarpa Fluxo Q019F06 Populus
369 G1930 gil8565433 4.10E-74 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Proteína de ligação de DNA
369 G1930 gil2328560 1.80E-71 Oryza sativa Proteína de ligação de DNA putativa RAV2 .
369 G1930 gil0798644 1.40E-13 Nicotiana tabacum Fator de transcrição contendo domínio AP2
369 G1930 gi20340233 5.10E-11 Thellungiella halophila Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
369 G1930 gi4099921 1.30E-10 Stylosanthes Homólogo ao
463/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
hamata EREBP-3.
369 G1930 gil8496063 1.60E-10 Fagus sylvatica proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
369 G1930 gi22074046 2.10E-10 Lycopersicon esculentum fator de transcrição JERF1.
369 G1930 gi3264767 2.30E-10 Prunus armeniaca Proteína contendo domínio AP2 .
369 G1930 gil8266198 1.10E-09 Narcissus pseudonarcissu s Proteína contendo domínio AP-2.
369 G1930 gi24940524 1.10E-09 Triticum aestivum Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
407 G2133 BH420519 1.00E-53 Brassica oleracea BOGUH88TF BOGU Genômico de
464/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
Brassica oleracea
407 G2133 BG543936 6.00E-43 Brassica rapa subsp. pekinensis E1686 Repolho chinês etiol
407 G2133 AU292603 2.00E-28 Zinnia elegans Equa de célula mesófila cultivada em zínia AU292603
407 G2133 BE320193 6.00E-24 Medicago truncatula NF024B04RT1F102 Desenvolvimento da raiz de Medicago
407 G2133 AP003346 3.00E-22 Oryza sativa Clone de cromossoma 1 P0434C04, *** SEQUENCING IN
407 G2133 AAAA01000718 3.00E-22 Oryza sativa (indica cultivargro up ) scaffold000718
407 G2133 AC124836 6.00E-22 Oryza sativa ( ) clone de
465/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
(grupo de cultivo japonês) cromossoma 5
407 G2133 BZ403609 2.00E-20 Zea mays OGABN17TM ZM_0.7_1.5_KB clone genômico de Zea mays ZMM
407 G2133 BM985484 6.00E-19 Thellungiella halophila 10_C12_T Ath Thellungiella halophil
407 G2133 BM403179 3.00E-17 Selaginella lepidophylla SLA012F10_35741 Uma seqüencia expressa
407 G2133 gi20161239 6.90E-24 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) proteína hipotética
407 G2133 gi8571476 6.00E-17 Atriplex hortensis proteína contendo domínio apetala2.
407 G2133 gi!4140155 7.80E-16 Oryza sativa fator de
466/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
transcrição de domínio AP2 putativo.
407 G2133 gi5616086 7.00E-15 Brassica napus proteína de ligação de elemento sensível a desidratação
407 G2133 gi21908034 8.90E-15 Zea mays Fator de ligação 2 de DRE.
407 G2133 gil9071243 6.30E-14 Hordeum vulgare Fator de ligação 1 de CRT/DRE.
407 G2133 gil8535580 2.10E-13 Lycopersicon esculentum Ativador transcricional putativo
407 G2133 gil208496 3.30E-13 Nicotiana tabacum EREBP-3.
407 G2133 gi8980313 4.40E-13 Catharanthus roseus Proteína de ligação de DNA de domínio AP2.
407 G2133 gi!5488459 2.20E-12 Triticum aestivum Proteína contendo AP2.
467/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
417 G2153 BH566718 1.00E-127 Brassica oleracea BOHCV23TR BOHC Genômico de Brassica oleracea
417 G2153 AP004971 2.00E-90 Lotus japonicus DNA genômico, cromossoma 5, clone:Lj T45G21,
417 G2153 AP004020 1.00E-79 Oryza sativa Clone de cromossoma 2 OJ1119_A01, *** SEQUENCING
417 G2153 AAAA01017331 2.00E-72 Oryza sativa (indica cultivargroup) ( ) scaffold017331
417 G2153 BQ165495 2.00E-67 Medi cago truncatula EST611364 KVKC cDNA de Medicago truncatula
417 G2153 AP005653 1.00E-66 Oryza sativa (grupo de cultivo ( ) clone de cromossoma 2
468/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
japonês)
417 G2153 BQ785950 8.00E-64 Glycine max saq61f09.yl Gmcl076 SOY clone de cDNA de Glycine max
417 G2153 BZ412041 3.00E-63 Zea mays OGACG56TC ZM_0.7_1.5_KB clone genômico de Zea mays ZMM
417 G2153 BM110212 3.00E-63 Solanum tuberosum EST557748 raizes de batata Solanum tuberosum
417 G2153 BQ865858 7.00E-63 Lactuca sativa QGC6B08.yg.abl QG__ABCDI alface salinas Lact
417 G2153 gi24059979 3.80E-39 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Semelhante a DNA-bin
417 G2153 gil5528814 1.70E-36 Oryza sativa Proteína hipotética~semelh
469/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
ante ao Arabidopsis
417 G2153 gi4165183 5.00E-21 Antirrhinum majus Proteína SAP1.
417 G2153 gi2213534 1.30E-19 Pisum sativum Proteína semelhante a PD1 de ligação de DNA.
417 G2153 gi7439981 2.60E-08 Triticum aestivum Proteína de ligação GRP1 - de RNA rica em glicina
417 G2153 gi21623 1.90E-06 Sorghum bicolor Proteína de ligação de RNA rica em glicina
417 G2153 gill545668 3.50E-06 Ch1amydomonas reinhardtii CIA5.
417 G2153 gi21068672 6.60E-06 Cicer arietinum Proteína rica em glicina putativa.
417 G2153 gi7489714 6.60E-06 Zea mays Proteína all- milho induzida
470/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
por alumínio.
417 G2153 gi395147 1.60E-05 Nicotiana tabacum Proteína rica em glicina.
419 G2155 BG543096 2.00E-69 Brassica rapa subsp. pekinensis E0571 Repolho chinês etiol
419 G2155 BH480897 7.00E-66 Brassica oleracea BOGRA01TF BOGR Genômico de Brassica oleracea
419 G2155 BG646893 2.00E-53 Medicago truncatula EST508512 HOGA cDNA de Medicago truncatula
419 G2155 BU023570 3.00E-44 Helianthus annuus QHF11M19.yg.abl QH_EFGHJ girassol RHA280
419 G2155 AP004020 2.00E-41 Oryza sativa Clone de cromossoma 2 QJ1119_A01, *** SEQUENCING
419 G2155 BI426899 4.00E-41 Glycine max sag08gl2.yl Gm-
471/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
cl080 clone GEN de cDNA de Glycine max
419 G2155 ΆΑΑΑ01000383 2.00E-40 Oryza sativa (indica cul tivargroup) ( ) scaffold000383
419 G2155 AP004971 2.00E-40 Lotus japonicus DNA genômico, cromossoma 5, clone:LjT45G21,
419 G2155 AP005755 2.00E-40 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 9
419 G2155 BZ412041 8.00E-39 Zea mays OGACG56TC ZM_0.7_1.5_KB clone genômico de Zea mays ZMM
419 G2155 gil5528814 3.70E-32 Oryza sativa Proteína hipotética-semelh ante ao
472/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
Arabidopsis
419 G2155 gi24059979 1.20E-21 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Semelhante a DNA-bin
419 G2155 gi4165183 3.50E-20 Antirrhinum majus Proteína SAP1.
419 G2155 gi2213534 1.60E-16 Pisum sativum DNA-binding PD1like protein.
419 G2155 gi2224911 0.98 Daucus carota Cinase semelhante a receptor embriogênico somático.
419 G2155 gi454279 1 Avena sativa Proteína de ligação de DNA.
439 G2509 BH989379 8.00E-66 Brassica olera cea oed22b05.bl B.oleracea002 Brassica olerac
439 G2509 BQ138607 4.00E-41 Medi cago NF005C01PH1F1004
473/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
truncatula Phoma-infected Medicag
439 G2509 BQ786702 4.00E-36 Glycine max saq72b07.yl Gmcl076 SOY clone de cDNA de Glycine max
439 G2509 OSJN00240 7.00E-31 Oryza sativa DNA genômico, cromossoma 4, BAC clone: OSJNBaO
439 G2509 AAAA01000832 7.00E-31 Oryza sativa (indica cultivar- group) ( ) scaffold000832
439 G2509 BE419451 2.00E-29 Triticum aestivum WWS012.C2R000101 ITEC WWS Escutelo de Trigo
439 G2509 BM062508 5.00E-29 Capsicum annuum KS01043F09 KS01 cDNA, mRNA de Capsicum annuum
439 G2509 AI771755 2.00E-28 Lycopersicon esculentum EST252855 ovário de tomateiro,
474/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
TAMU Lycope
439 G2509 CA015575 7.00E-28 Hordeum vulgare subsp. vulgare HT14L19r HT Hordeum vulgare
439 G2509 BE642320 2.00E-27 Ceratopteris richardii Cri2_5_L17_SP6 Ceratopteris Spore Li
439 G2509 gi20160854 2.10E-29 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) Proteína hipotética
439 G2509 gi3264767 8.40E-28 Prunus armeniãcã Proteína contendo domínio AP2 .
439 G2509 gi24817250 1.10E-25 Cicer arietinum Proteína semelhante ao fator de transcrição EREBP.
439 G2509 gi!5217291 7.10E-25 Oryza sativa Proteína contendo domínio
475/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
AP2 putativo.
439 G2509 gil208498 1.60E-24 Nicotiana tabacum EREBP-2.
439 G2509 gi8809571 1.60E-24 Nicotiana sylves tris Ligação de elemento sensível ao etileno
439 G2509 gi7528276 3.00E-24 Mesembryanthem um crystallinum Fator de transcrição relacionado a AP2
439 G2509 gil688233 1.10E-23 Solanum tuberosum Homólogo de proteína de ligação de DNA.
439 G2509 gi4099921 1.60E-23 Stylosanthes hamata Homólogo EREBP- 3.
439 G2509 gil8496063 2.40E-23 Fagus sylvatica Proteína de ligação de elemento sensível ao etileno
449 G2583 BH658452 1.00E-59 Brassica olera cea BOMCP74TF BO 2 3 KB
476/726
SEQ ID GID ID de Menor Espécies de Observação do
N° : sequência de probabilida sequência de GenBank para
teste de de soma teste sequência de
teste
Brassica oleracea
gen
449 G2583 BE023297 5.00E-54 Glycine max sm80el0.yl Gm-
C1015 GENO clone
de cDNA de
Glycine max
449 G2583 CA486875 1.00E-50 Triticum
aestivum WHE4337_A02 _A03ZS
cD de antera
meiótica de trigo
449 G2583 BG642554 8.00E-48 Lycopersicon EST356031 botões
esculentum de flor de
tomateiro, anthe
449 G2583 BI978981 2.00E-47 Rosa chinensis zD09 Old Blush
petal SMART
library Ros a chin
449 G2583 BU978490 4.00E-47 Hordeum HA13G05r HA
vulgare subsp. Hordeum vulgare
vulgare
449 G2583 BQ106328 4.00E-46 Rosa hybrid ggl388.e Rose
cultivar Petals ( Golden
477/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
Gate) Lam
449 G2583 BI958226 1.00E-44 Horde um vulgare HVSMEn0013P17f Hordeum vulgare rachis EST 1
449 G2583 AP004869 1.00E-43 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) ( ) clone de cromossoma 2
449 G2583 BU832200 6.00E-43 Populus tremula x Populus tremuloides T030G01 Populus apica
449 G2583 gil8650662 2.30E-23 Lycopersicon esculentum fator 1 de resposta ao etileno.
449 G2583 gil31754 7.30E-20 Lupinus polyphyllus PPLZ02 PROTEIN.
449 G2583 gi20160854 2.80E-18 Oryza sativa (grupo de cultivo japonês) proteína hipotética
478/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
449 G2583 gil0798644 2.80E-18 Nicotiana tabacum Fator de transcrição contendo domínio AP2
449 G2583 gi8571476 2.80E-18 Atriplex hortensis proteína contendo domínio apetala2.
449 G2583 gil4018047 3.30E-17 Oryza sativa Proteína putativa contendo ligação de DNA AP2
449 G2583 gil2225884 1.10E-16 Zea mays Produto de proteína não denominado.
449 G2583 gi3264767 1.10E-16 Prunus armeniaca Proteína contendo domínio AP2 .
449 G2583 gi4099914 1.10E-16 Stylosanthes hamata ligação de elemento sensível ao etileno p
449 G2583 gi8809573 1.40E-16 Nicotiana ligação de
479/726
SEQ ID N° : GID ID de sequência de teste Menor probabilida de de soma Espécies de sequência de teste Observação do GenBank para sequência de teste
sylvestris elemento sensível ao etileno
[0430] A tabela 12 lista as sequências descobertas como sendo parálogas ao número dos fatores de transcrição da presente invenção. Os cabeçalhos das colunas incluem, da esquerda para direita, a SEQ ID NO do Arabidopsis; correspondendo aos números ID do Gene (GID) de Arabidopsis; os números GID dos parálogos descobertos em uma pesquisa na base de dados; e SEQ ID NOs dos parálogos (um parálogo com aparecimento em qualquer célula da quarta coluna é também parálogo em relação às outras sequências naquela célula).
Tabela 12. Fatores de Transcrição de Arabidopsis e Parálogos
SEQ ID N° . SEQ ID NO dos N°. GID dos Parálogos
N° : GID. Parálogos:
10 G28 6, 2074 G6, G1006
12 G47 408 G2133
60 G353 62, 2150, 2156, 2200 G354, G1889, G1974, G2839
88 G481 90, 2010, 2102, 2172 G482, G485, G1364, G2345
94 G489 2054 G714
480/726
148 G682 38, 1972, 2142, 2192 G225, G226, G1816, G2718
170 G8 67 1950, 2072, 370 G9,G993, G1930
186 G912 1958, 1960, 1962, 2162, 2184 G40, G41, G42, G2107, G2513
188 G913 2162 G2107
200 G975 2106, 450 G1387, G2583
224 G1073 2078, 2166 G1067, G2156
226 G1075 2080 G1076
270 G1411 440 G2509
278 G1451 2070 G990
332 G1792 1954, 2134, 2136 G30, G1791, G1795
344 G1836 340 G1818
2158 G1995 64, 66, 2198 G361, G362, G2838
420 G2155 2154 G1945
[0431] A tabela 13 lista o número de indicação genético (GID) e relações homólogas encontradas usando análises de acordo com o Exemplo VIII para as sequências da Listagem de Sequências.
Tabela 13. Relações homólogas encontradas dentro da
Listagem de Sequências
SEQ ID GID DNA ou Espécies das Relação da SEQ ID N°: com
N° : Proteína quais deriva a outros Genes
(PRT) Sequência
Homóloga
468 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo
481/726
predita é ortóloga ao G19
469 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
470 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
471 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
472 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
473 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
474 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
475 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
476 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G19
477 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
478 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
491 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos
482/726
G22, G28, G1006
492 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
493 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
494 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
495 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
496 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
497 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
498 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
499 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
483/726
500 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G22, G28, G1006
501 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G22, G28, G1006
502 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G22, G28, G1006
503 PRT Mesembryanthemum crystallinum Ortóloga aos G22, G28, G1006
504 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G47, G2133
505 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G47, G2133
550 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
551 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
552 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
553 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
484/726
554 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
555 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
556 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
557 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
558 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
559 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
610 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
611 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
612 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo
485/726
predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
613 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
614 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
615 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
616 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
617 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
618 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos
486/726
G353, G354, G1974, G1889, G2839
619 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
620 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
621 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
622 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
623 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
624 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
625 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
626 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
746 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364,
487/726
G2345
747 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
748 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
749 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
750 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
751 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
752 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
488/726
753 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
754 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
755 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
756 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
757 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
758 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
759 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo
489/726
predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
760 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
761 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
762 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
763 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
764 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
765 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos
490/726
G481, G482, G485, G1364, G2345
766 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
767 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
768 DNA Gossypium arboreum Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
769 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
770 DNA Gossypium hirsutum Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
771 DNA Lycopersicon esculentum Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364,
491/726
G2345
772 DNA Lycopersicon Sequência de polipeptídeo
esculentum predita é ortóloga aos
G481, G482, G485, G1364,
G2345
773 DNA Medi cago Sequência de polipeptídeo
truncatula predita é ortóloga aos
G481, G482, G485, G1364,
G2345
774 DNA Lycopersicon Sequência de polipeptídeo
esculentum predita é ortóloga aos
G481, G482, G485, G1364,
G2345
775 DNA Solanum Sequência de polipeptídeo
tuberosum predita é ortóloga aos
G481, G482, G485, G1364,
G2345
776 DNA Triticum Sequência de polipeptídeo
aestivum predita é ortóloga aos
G481, G482, G485, G1364,
G2345
777 DNA Hordeum vulgare Sequência de polipeptídeo
predita é ortóloga aos
G481, G482, G485, G1364,
G2345
492/726
778 DNA Triticum monococcum Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
779 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
780 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
781 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
782 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
783 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
784 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
785 PRT Zea mays Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
786 PRT Zea mays Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
787 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
788 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482,
493/726
G485, G1364, G2345
789 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
790 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
791 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
792 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
793 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
794 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
795 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
796 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
797 PRT Glycine max Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
798 PRT Glycine max Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
799 PRT Glycine max Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
800 PRT Glycine max Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
494/726
801 PRT Glycine max Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
802 PRT Glycine max Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
803 PRT Glycine max Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
804 PRT Zea mays Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
805 PRT Zea mays Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
806 PRT Zea mays Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
807 PRT Zea mays Ortóloga aos G481, G482, G485, G1364, G2345
825 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G489, G714
826 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G489, G714
827 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G489, G714
828 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos
495/726
G489, G714
829 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G489, G714
830 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G489, G714
831 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G489, G714
832 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G489, G714
833 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G489, G714
834 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G489, G714
835 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G489, G714
836 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G489, G714
837 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G489, G714
981 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G634
982 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo
496/726
predita é ortóloga ao G634
983 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G634
984 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G634
985 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G634
986 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G634
987 PRT Oryza sativa Ortóloga ao G634
988 PRT Oryza sativa Ortóloga ao G634
1076 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1077 DNA Vulgare, subespécie Hordeum vulgare Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1078 DNA Populus tremula x Populus tremuloides Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1079 DNA Triticum aestivum Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1080 DNA Gossypium arboreum Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos
497/726
G226, G682, G1816, G2718
1081 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1082 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1083 PRT Glycine max Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1084 PRT Glycine max Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1085 PRT Glycine max Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1086 PRT Glycine max Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1087 PRT Glycine max Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1088 PRT Glycine max Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1089 PRT Zea mays Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1090 PRT Zea mays Ortóloga aos G226, G682, G1816, G2718
1159 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1160 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo
498/726
predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1161 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1162 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1163 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1164 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1165 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1166 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1167 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1168 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G9,
499/726
G867, G993, G1930
1169 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1170 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1171 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1172 DNA Mesembryanthemum crystallinum Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1173 DNA Lycopersicon esculentum Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1174 DNA Solanum tuberosum Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1175 DNA Hordeum vulgare Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1176 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1177 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G9, G867,
500/726
G993, G1930
1178 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1179 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1180 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1181 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1182 PRT Glycine max Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1183 PRT Glycine max Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1184 PRT Glycine max Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1185 PRT Zea mays Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1186 PRT Zea mays Ortóloga aos G993, G1930 G9, G867,
1204 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1205 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
501/726
1206 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1207 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1208 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1209 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1210 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1211 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1212 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G913
1213 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1214 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo
502/726
predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1215 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G913
1216 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1217 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1218 DNA Brassica napus Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G913
1219 DNA Solanum tuberosum Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1220 DNA Descurainia sophia Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G912, G2107, G2513
1221 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1222 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G913
1223 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G913
1224 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107,
503/726
G2513
1225 PRT Brassica napus Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1226 PRT Nicotiana tabacum Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1227 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1228 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1229 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1230 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1231 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1232 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1233 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1234 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1235 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1236 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G912, G2107, G2513
504/726
1237 PRT Glycine max Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1238 PRT Glycine max Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1239 PRT Glycine max Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1240 PRT Glycine max Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1241 PRT Glycine max Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1242 PRT Glycine max Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1243 PRT Glycine max Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1244 PRT Zea mays Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1245 PRT Zea mays Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1246 PRT Zea mays Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1247 PRT Zea mays Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1248 PRT Zea mays Ortóloga aos G912, G2107, G2513
1249 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo
505/726
predita é ortóloga ao G922
1250 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G922
1251 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G922
1252 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G922
1253 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G922
1254 PRT Oryza sativa Ortóloga ao G922
1255 PRT Oryza sativa Ortóloga ao G922
1256 PRT Oryza sativa Ortóloga ao G922
1257 PRT Oryza sativa Ortóloga ao G922
1258 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G926
1259 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G926
1260 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G926
1261 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G926
1262 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga ao G926
1263 PRT Brassica napus Ortóloga ao G926
1292 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo
506/726
predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1293 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1294 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1295 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1296 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1297 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1298 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1299 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1300 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos
507/726
G975, G1387, G2583
1301 DNA Brassica rapa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G975, G1387, G2583
1302 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G975, G1387, G2583
1393 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1069, G2153
1394 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1069, G2153
1395 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1069, G2153
1396 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1069, G2153
1397 DNA Lotus japonicus Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1069, G2153
1398 DNA Lycopersicon esculentum Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1399 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1400 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073,
508/726
G2156
1401 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1402 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1403 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1404 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1405 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1406 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1407 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1408 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1409 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1410 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1411 PRT Glycine max Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1412 PRT Glycine max Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
509/726
1413 PRT Glycine max Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1414 PRT Glycine max Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1415 PRT Glycine max Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1416 PRT Glycine max Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1417 PRT Glycine max Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1418 PRT Zea mays Ortóloga aos G1067, G1073, G2156
1419 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1075, G1076
1420 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1075, G1076
1421 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1075, G1076s
1422 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1075, G1076
1423 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo
510/726
predita é ortóloga aos G1075, G1076
1424 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1075, G1076
1425 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1075, G1076
1426 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1075, G1076
1587 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1411, G2509
1588 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1411, G2509
1589 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1411, G2509
1590 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1411, G2509
1591 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos
511/726
G1411, G2509
1604 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1605 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1606 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1607 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1608 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1609 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1610 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1611 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
512/726
1612 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1613 DNA Medicago truncatula Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1614 DNA Solanum tuberosum Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1615 DNA Zea mays Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1616 DNA Sorghum propinquum Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1617 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1618 DNA Sorghum bicolor Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1619 DNA Hordeum vulgare Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G990, G1451
1620 DNA Lycopersicon Sequência de polipeptídeo
513/726
esculentum predita é ortóloga aos G990, G1451
1621 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G990, G1451
1622 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G990, G1451
1623 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G990, G1451
1624 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G990, G1451
1671 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G1543
1672 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G1543
1673 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga ao G1543
1674 PRT Oryza sativa Ortóloga ao G1543
1728 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1729 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1730 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
514/726
1731 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1732 DNA Glycine max Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1733 DNA Zea mays Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1734 DNA Lycopersicon esculentum Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1735 G3380 PRT Oryza sativa Ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1736 G3381 PRT Oryza sativa indica Ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1737 G3383 PRT Oryza sativa japonica Ortóloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1795 DNA Oryza sativa Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G9, G867, G993, G1930
1908 DNA Medicago truncatula Sequência de polipeptideo predita é ortóloga aos G1945, G2155
1909 DNA Medicago Sequência de polipeptideo
515/726
truncatula predita é ortóloga aos G1945, G2155
1910 DNA Glycine max Sequência de polipeptídeo predita é ortóloga aos G1945, G2155
1949 G9 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G9, G867, G993, G1930
1950 G9 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G9, G867, G993, G1930
1953 G30 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1954 G30 PRT Arabidopsis thaliana início paráloga aos G30, G1791, G1792, G1795
1955 G40 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G912, G2107, G2513
1956 G40 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G912, G2107, G2513
1957 G41 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G912, G2107, G2513
1958 G41 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G912, G2107, G2513
516/726
1959 G42 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptideo
thaliana predita é paráloga aos
G912, G2107, G2513
1960 G42 PRT Arabidopsis Paráloga aos G912, G2107,
thaliana G2513
1971 G225 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptideo
thaliana predita é paráloga aos
G226, G682, G1816, G2718
1972 G225 PRT Arabidopsis Paráloga aos G226, G682,
thaliana G1816, G2718
1991 G370 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptideo
thaliana predita é paráloga aos
G361, G362, G370, G1995,
G2826, G2838
1992 G370 PRT Arabidopsis Paráloga aos G361, G362,
thaliana G370, G1995, G2826, G2838
2009 G485 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptideo
thaliana predita é paráloga aos
481, G482, G485, G1364,
G2345
2010 G485 PRT Arabidopsis Paráloga aos 481, G482,
thaliana G485, G1364, G2345
2053 G714 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptideo
thaliana predita é paráloga aos
G489, G714
517/726
2054 G714 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G489, G714
2069 G990 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G990, G1451
2070 G990 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G990, G1451
2071 G993 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G9, G867, G993, G1930
2072 G993 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G9, G867, G993, G1930
2073 G1006 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G22, G28, G1006
2074 G1006 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G22, G28, G1006
2077 G1067 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G1067, G1073, G2156
2078 G1067 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G1067, G1073, G2156
2079 G1076 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G1075, G1076
518/726
2080 G1076 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G1075, G1076
2101 G1364 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptideo predita é paráloga aos 481, G482, G485, G1364, G2345
2102 G1364 PRT Arabidopsis thaliana Parálogas aos 481, G482, G485, G1364, G2345
2105 G1387 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptideo predita é paráloga aos G975, G1387, G2583
2106 G1387 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G975, G1387, G2583
2133 G1791 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptideo predita é paráloga aos G30, G1791, G1792, G1795
2134 G1791 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G30,' G1791, G1792, G1795
2135 G1795 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptideo predita é paráloga aos G30, G1791, G1792, G1795
2136 G1795 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G30, G1791, G1792, G1795
2141 G1816 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptideo predita é paráloga aos
519/726
G226, G682, G1816, G2718
2142 G1816 PRT Arabidopsis Paráloga aos G226, G682,
thaliana G1816, G2718
2149 G1889 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G353, G354, G1974, G1889,
G2839
2150 G1889 PRT Arabidopsis Paráloga aos G353, G354,
thaliana G1974, G1889, G2839
2153 G1945 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G1945, G2155
2154 G1945 PRT Arabidopsis Paráloga aos G1945, G2155
thaliana
2155 G1974 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G353, G354, G1974, G1889,
G2839
2156 G1974 PRT Arabidopsis Paráloga aos G353, G354,
thaliana G1974, G1889, G2839
2157 G1995 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G361, G362, G1995, G2826,
G2838
2158 G1995 PRT Arabidopsis Paráloga aos G361, G362,
520/726
thaliana G1995, G2826, G2838
2161 G2107 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G912, G2107, G2513
2162 G2107 PRT Arabidopsis Paráloga aos G912, G2107,
thaliana G2513
2165 G2156 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G1067, G1073, G2156
2166 G2156 PRT Arabidopsis Paráloga aos G1067, G1073,
thaliana G2156
2171 G2345 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
481, G482, G485, G1364,
G2345
2172 G2345 PRT Arabidopsis Paralóga aos 481, G482,
thaliana G485, G1364, G2345
2183 G2513 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G912, G2107, G2513
2184 G2513 PRT Arabidopsis Paráloga aos G912, G2107,
thaliana G2513
2191 G2718 DNA Arabidopsis Sequência de polipeptídeo
thaliana predita é paráloga aos
G226, G682, G1816, G2718
521/726
2192 G2718 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G226, G682, G1816, G2718
2199 G2839 DNA Arabidopsis thaliana Sequência de polipeptídeo predita é paráloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
2200 G2839 PRT Arabidopsis thaliana Paráloga aos G353, G354, G1974, G1889, G2839
Modelagem Molecular [0432] Outro meio que pode ser usado para confirmar a utilidade das sequências de fator de transcrição que são ortólogas aos fatores de transcrição presentemente revelados é através do uso de software de modelagem molecular. A modelagem molecular é rotineiramente usada para predizer a estrutura do polipeptídeo e uma variedade de programas de modelagem de estrutura de proteína, tais como, Insight II (Accelrys, Inc.) estão disponíveis comercialmente para essa finalidade. Assim, a modelagem pode ser usada para prever que resíduos de um polipeptídeo possam ser trocados sem alterar a função (Crameri e outros, (2003) Patente US número 6.521.453). Assim, os polipeptídeos que são seqüencialmente semelhantes podem mostrar uma alta probabilidade de função semelhante por sua similaridade estrutural, o que, por exemplo, pode ser estabelecido por comparação das regiões de superestrutura.
522/726
As tendências relativas dos aminoácidos de formarem regiões de superestrutura (por exemplo, hélices e β-folhas) são bem estabelecidas. Por exemplo, O'Neil e outros, (1990) Science 250: 646-651) discutiram, em detalhes, as tendências de formação de hélice dos aminoácidos. As tabelas de atividade de formação de estrutura relativa para os aminoácidos podem ser usadas como abelas de substituição para predizer quais resíduos podem ser funcionatlmente substituídos em uma dada região, por exemplo, nos domínios de ligação de DNA de fatores de transcrição conhecidos ou equivalentes. Homólogos que provavelmente funcionem de modo semelhante podem então ser identificados.
[0433] É de interesse específico a estrutura de um fator de transcrição na região de seu domínio conservado, tal como aquele identificado na Tabela 8. As análises estruturais podem ser realizadas por comparação da estrutura do fator de transcrição conhecido ao redor de seu domínio conservado com aquelas dos ortólogos e parálogos. A análise de vários polipeptídeos dentro de um grupo ou classe de fator de transcrição, incluindo a funcionalidade ou polipeptídeos seqüencialmente semelhantes fornecida na Listagem de Sequências, pode também prover um entendimento dos elementos estruturais necessários para regular a transcrição dentro de uma dada família.
Exemplos
523/726 [0434] A invenção, sendo agora descrita de modo geral, será mais prontamente entendida com relação aos exemplos que se seguem, que são incluídos meramente para fins de ilustração de determinados aspectos e concretizações da presente invenção e não se destinam a limitar a invenção. Será reconhecido pelos versados na técnica que um fator de transcrição que está associado a um primeiro traço específico pode também estar associado a pelo menos um outro segundo traço não correlato e inerente, que não foi previsto pelo primeiro traço.
[0435] As descrições completas dos traços associados a tal polinucleotídeo da invenção são completamente reveladas nas Tabelas 7 e 9. A descrição completa da família genética do fator de transcrição e domínios conservados identificados do polipeptideo codificado pelo polinucleotídeo é revelada de modo completo na Tabela 8.
Exemplo I: Identificação Genética de Comprimento Pleno e Clonagem [0436] As sequências de fator de transcrição putativo (genômicas ou ESTs) relacionadas aos fatores de transcrição conhecidos foram identificadas na base de dados do GenBank de Arabidopsis thaliana usando o programa de análise de sequência tblastn empregando parâmetros default e limite de corte de valor P de -4 ou -5 ou inferior,
524/726 dependendo do comprimento da sequência em questão. Os hits da sequência de fator de transcrição putativo foram então analisados para identificar aqueles contendo cordões de sequência específica. Se os hits de sequência contivessem tais cordões de sequência, as sequências eram confirmadas como fatores de transcrição.
[0437] Alternativamente, as bibliotecas de cDNA de Arabidopsis Thaliana derivadas de diferentes tecidos ou tratamentos, ou bibliotecas genômicas foram classificados para identificar novos elementos de uma família de transcrição usando uma abordagem de hibridização de baixa estringência. As sondas foram sintetizadas usando iniciadores específicos para gene em uma reação de PCR padrão (temperatura de recombinação de 60°C) e rotuladas com 33P dCTP usando o Kit para Marcação de DNA High Prime (Boehringer Mannheim Corp. (agora Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). As sondas radiomarcadas purificadas foram adicionadas aos filtros imersos em meio de hibridização Church (0,5 M NaPCN pH 7,0, 7% SDS, 1% peso/volume de albumina de soro bovino) e hibridizadas por toda a noite a 60°C com agitação. Os filtros foram lavados duas vezes por 45 a 60 minutos com 1 x SCC, 1% SDS a 60° C.
[0438] Para identificar a sequência adicional 5' ou 3' de uma sequência de cDNA parcial em uma biblioteca de cDNA, a ampliação rápida de 5' e 3' das terminações de cDNA
525/726 (RACE) foi realizada usando o kit de ampliação de cDNA MARATHON (Clontech, Paio Alto, CA). De modo geral, o processo consistiu primeiro no isolamento de mRNA de poli(A), realizando primeira e segunda sínteses de cDNA de filamento para gerar cDNA de filamento duplo, cegando as extremidades do cDNA, seguido por ligação do Adaptador MARATHON ao cDNA para formar uma biblioteca de cDNA ds ligados ao adaptador.
[0439] Os iniciadores específicos para gene foram projetados para serem usados juntamente com os iniciadores específicos de adaptador para ambas reações RACE 5' e 3'. Os iniciadores aninhados, ao invés de iniciadores simples, foram usados para aumentar a especificidade de PCR. Utilizando-se as reações RACE 5' e 3', fragmentos RACE 5' e 3' foram obtidos, sequenciados e clonados. O processo pode ser repetido até as extremidades 5’ e ' do gene de comprimento pleno terem sido identificadas. Então, o cDNA de comprimento pleno é gerado por PCR usando iniciadores específicos para as extremidades 5' e 3' do gene por PCR de extremidade-a-extremidade.
Exemplo II: Construção de Vetores de Expressão [0440] Para os experimentos no Exemplo XIII, dois tipos de construções foram usados para modular a atividade dos fatores de transcrição de derivação e testar a atividade dos ortólogos e parálogos nas plantas
526/726
transgênicas. Esses incluíram construções de fusão de
promotor direta e sistemas de transformação de dois
componentes.
[0441] Para a fusão de promotor direta, a expressão
de uma versão do tipo selvagem de comprimento pleno de uma
sequência de polinucleotídeo de fator de transcrição foi
direcionada por fusão do polinucleotídeo diretamente em um promotor. Vários promotores diferentes podem ser usados, tal como, o promotor nativo ou aquele gene, ou um promotor que direciona tecido específico ou expressão condicional. Nos ensaios de fusão de promotor diretos encontrados no Exemplo XIII, o promotor constitutivo CaMV 35S foi empregado. Para clonar a sequência no vetor, ambos pMEM20, derivado de pMON316 (Sanders e outros, (1987) Nucleic Acids Res. 15:1543-1558), e o fragmento de DNA ampliado (a sequência foi ampliada de uma biblioteca genômica ou de cDNA usando iniciadores específicos para as sequências a montante e a jusante da região de codificação) foram digeridos separadamente com enzimas de restrição Sall e Notl a 37 °C por 2 horas. Os produtos de digestão foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 0,8% e visualizado por coloração com brometo de etídio. Os fragmentos de DNA contendo a sequência e o plasmídeo linearizado foram excisados e purificados por uso de um kit de extração de gel QIAQUICK (Qiagen, Valencia, CA) . Os
527/726 fragmentos de interesse foram ligados em uma razão de 3:1 (vetor para inserção). As reações de ligação usando T4 DNA ligase (New England Biolabs, Beverly MA) foram realizadas a 16°C por 16 horas. Os DNAs ligados foram transformados em células competentes da cepa DH5alfa de E.coli usando o processo de choque térmico. As transformações foram colocadas em chapa, em chapas de LB contendo 50 mg/L de canamicina (Sigma Chemical Co. St. Louis MO). Colônias individuais foram desenvolvidas por toda a noite em cinco mililitros de caldo LB contendo 50 mg/L de canamicina a 37 °C. DNA de plasmideo foi purificado por emprego de kits Qiaquick Mini Prep (Qiagen).
[0442] Para supertransformação de dois componentes (2 comp. supTfn), foram usadas duas construções separadas: Promotor::LexA-GAL4TA e opLexA::TF. A primeira delas (Promotor::LexA-GAL4TA) compreendia um promotor desejado clonado na frente de um domínio de ligação de DNA LexA fundido a um domínio de ativação GAL4. O esqueleto do vetor de construção (pMEN48; P5375) também portava um marcador de resistência de canamicina, juntamente com um repórter opLexA::GFP. As linhagens transgênicas foram obtidas contendo o primeiro componente e uma linhagem foi selecionada, a qual mostrou expressão reproduzível do gene repórter no padrão desejado, através de várias gerações. Uma população homozigota foi estabelecida para aquela
528/726 linhagem e a população foi supertransformada com a segunda construção (opLexA::TF) portando o fator de transcrição de interesse clonado atrás de um sitio operador LexA. Esse segundo esqueleto de vetor de construção (pMEN53; P5381) também continha um marcador de resistência de sulfonamida.
Exemplo III: Transformação de Agrobacterium com o Vetor de Expressão [0443] Após o vetor de plasmídeo contendo o gene ter sido construído, o vetor foi usado para transformar células de Agrobacterium tumefaciens expressando os produtos do gene. O estoque de células de Agrobacterium tumefaciens para a transformação foi feito conforme descrito por Nagel e outros, (1990) FEMS Microbiol Letts. 67: 325-328. ABI da cepa de Agrobacterium foi desenvolvido em 250 mL de meio LB (Sigma) por toda a noite a 28 °C com agitação, até uma absorvência superior a 1 cm a 600 nm (A6oo) de 0,5 - 1,0 ser alcançada. As células foram colhidas por centrifugação a 4.000 x g por 15 minutos a 4o C. As células foram então suspensas em 250 μΐ de tampão resfriado (1 mM HEPES, pH ajustado para 7,0 com KOH) . As células foram centrifugadas novamente, conforme descrito acima, e ressuspensas em 125 μΕ de tampão resfriado. As células foram então centrifugadas e ressuspensas duas vezes mais no mesmo tampão HEPES, conforme descrito acima, a um volume de 100 μΕ e 750 μΕ, respectivamente. As células ressuspensas
529/726 foram então distribuídas em alíquotas de 40 μΐ, rapidamente congeladas em nitrogênio liquido e armazenadas a -80°C.
[0444] As células de Agrobacterium foram transformadas com plasmideos preparados conforme descrito acima, seguindo o protocolo descrito por Nagel e outros, (supra). Para cada construção de DNA a ser transformada, 50 - 100 ng de DNA (geralmente ressuspensos em 10 mM Tris-HCl,
I mM EDTA, pH 8, 0) eram misturados com 40 μΐ de células de Agrobacterium. A mistura de DNA/células foi então transferida para uma cuveta resfriada com uma fenda de eletrodo de 2 mm e submetida a uma carga de 2,5 kV dissipada a 25 μΡ e 200 μΕ usando um aparelho Gene Pulser
II (Bio-Rad, Hercules, CA). Após a eletroporação, as células foram imediatamente ressuspensas em 1,0 mL de LB e deixadas recuperar, sem seleção antibiótica por 2 a 4 horas a 28 °C em um incubador com agitação. Após recuperação, as células foram colocadas em placa em meio seletivo de caldo LB contendo 100 μρ/ιηΕ de espectinomicina (Sigma) e incubadas por 24-48 horas a 28°C. As colônias simples foram então coletadas e incubadas em meio fresco. A presença da construção de plasmideo foi verificada por ampliação de PCR e análise de sequência.
Exemplo IV: Transformação de Plantas de Arabidopsis com Agrobacterium tumefaciens empregando Vetor de Expressão [0445] Após transformação de
Agrobacterium
530/726 tumefaciens com vetores de plasmideo contendo o gene, colônias simples de Agrobacterium foram identificadas, propagadas e usadas para transformar plantas de Arabidopsis. Em resumo, 500 culturas de meio LB contendo 50 mg/L de canamicina foram inoculadas com as colônias e desenvolveram a 28 °C com agitação por dois dias, até uma absorvência óptica a 600 nm de comprimento de onda por 1 cm (A6oo) de > 2,0 ser alcançada. As células foram então colhidas por centrifugação a 4.000 x g por 10 minutos e ressuspensas em meio de infiltração (1/2 X sais Murashige and Skoog (Sigma), 1 X vitaminas B-5 de Gamborg (Sigma), 5,0% (peso/volume) sacarose (Sigma), 0,044 μΜ purina benzilamino (Sigma), 200 μΐ/ΐ de Silwet L-77 (Lehle Seeds) até uma Agoo de 0,8 ser alacnçada.
[0446] Após a transformação, as sementes de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) foram semeadas a uma densidade de ~10 plantas por pote de 10,16 cm em meio para pote Pro-Mix BX (Hummert International) cobertas com malha de fibra de vidro (18 mm x 16 mm) . As plantas foram desenvolvidas sob iluminação continua (50-75 μΕ/ιη2/3οο) a 22-23°C com 65-70% de umidade relativa. Após cerca de 4 semanas, caules de inflorescência primária (botões) são cortados para encorajar o crescimento de múltiplos botões secundários. Após o florescimento de botões secundários maduros, as plantas foram preparadas para transformação por
531/726 remoção de todas as siliquas e flores abertas.
[0447] Os potes foram então imersos de cabeça para baixo na mistura de meio de infiltração de Agrobacterium, conforme descrita acima por 30 segundos e colocados de lado para permitir drenagem em uma superfície plana de 30,48 cm x 60,96 cm coberta com envoltório plástico. Após 24 horas, o envoltório plástico foi removido e os potes foram colocados em pé. O procedimento de imersão foi repetido por mais uma semana, para um total de duas imersões por pote. As sementes foram então coletadas de cada pote de transformação e analisadas seguindo o protocolo descrito acima.
Exemplo V: Identificação de Transformantes de Arabidopsis Primária [0448] Sementes coletadas dos potes de transformação foram esterilizadas essencialmente como se segue. As sementes foram dispersas em uma solução contendo 0,1% (v/v) de Triton X-100 (Sigma) e água estéril e lavadas com agitação da suspensão por 20 minutos. A solução de lavagem foi então drenada e substituída com solução de água fresca para lavar as sementes por 20 minutos com agitação. Após remoção da solução de etanol/detergente, uma solução contendo 0,1% (v/v) de Triton X-100 e 30% (v/v) de alvejante (CLOROX; Clorox Corp. Oakland CA) foi adicionada as sementes, e a suspensão foi agitada por 10 minutos. Após
532/726 remoção da solução de alvejante/detergente, as sementes foram então lavadas cinco vezes em água destilada estéril. As sementes foram armazenadas na última água de lavagem a 4°C por dois dias no escuro, antes de serem colocadas na placa em meio de seleção antibiótico (1 X Sais Murashige and Skoog (pH ajustado para 5,7 com 1M KOH), 1 X vitaminas B-5 de Gamborg, 0,9% ftagar (Life Technologies), e 50 mg/L de canamicina). As sementes germinaram sob iluminação contínua (50-75 μΕ/ιη2/36θ) a 22-23°C. Após 7-10 dias de crescimento nessas condições, os transformantes primários resistentes a canamicina (geração Ti) foram visíveis e obtidos. Essas sementeiras foram transferidas primeiro para placas de seleção frescas onde as sementeiras continuaram a crescer por 3-5 dias mais e então para o solo (meio para pote Pro-Mix BX).
[0449] Os transformantes primários foram cruzados e as sementes de progênie (T2) coletadas; sementeiras resistentes a canamicina foram selecionadas e analisadas. Os níveis de expressão dos polinucleotídeos recombinantes nos transformantes variaram de cerca de um aumento de 5% no nível de expressão para pelo menos 100% de aumento no nível de expressão. Observações semelhantes foram feitas com relação a expressão do nível de polipeptideo.
Exemplo VI: Identificação de Plantas de Arabidopsis com Nocauteamentos Genéticos do Fator de Transcrição
533/726 [0450] A classificação de coleções de Arabidopsis mutagenizadas de inserção para mutantes nulos em um gene alvo conhecido foi essencialmente conforme descrita em Krysan e outros, (1999) Plant Cell 11: 2283-2290. Em resumo, iniciadores específicos para gene, aninhados por 5250 partes de base uns aos outros, foram designados das regiões 5' e 3' de um gene alvo conhecido. De modo semelhante, conjuntos aninhados de iniciadores foram também criados especificamente para cada uma das extremidades de T-DNA ou transposon (os limites direito e esquerdo). Todas combinações possíveis de gene especifico para iniciadores T-DN/transposon foram usadas para detectar, por PCR, um evento de inserção dentro ou próximo ao gene alvo. Os fragmentos de DNA ampliados foram então sequenciados, o que permite a determinação precisa do ponto de inserção de T-DNA/transposon em relação ao gene alvo. Eventos de inserção dentro da sequência de codificação ou intervenção dos genes foram desenrolados de um grupo compreendendo vários eventos de inserção para uma planta mutante única e simples para caracterização funcional. O processo é descrito em maiores detalhes em Yu e Adam, Pedido US número 09/177.733, depositado em 23 de outubro de 1998.
Exemplo VII: Identificação de Fenótipos Modificados em Plantas de Superexpressão ou Nocauteamento Genético [0451] Foram realizados experimentos para
534/726 identificar aqueles transformantes ou nocauteamentos que exibiram características bioquímicas modificadas. Entre os bioquímicos que foram analisados, estavam açúcares insolúveis, tais como, arabinose, fucose, galactose, manose, ramnose ou xilose ou semelhantes; lipídeos de prenila, tais como, luteína, betacaroteno, xantofil-1, xantofil-2, clorofilas A e B ou alfa, delta ou gamatocoferol ou semelhantes; ácidos graxos, tais como, 16:0 (ácido palmítico), 16:1 (ácido palmitoléico), 18; 0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido olêico), 18:2 (ácido linolêico), 20:0, 18:3 (ácido linolênico), 20:1 (ácido eicosenóico), 20:2, 22:1 (ácido erucíclico) ou semelhantes, ceras, tais coo, por alteração dos níveis de C29, C31 ou C33; esteróis, tais como, brassicaesterol, campesterol, estigmaesterol, sitoesterol ou estigmaestanol ou semelhantes, glicosinolatos, proteínas ou níveis de óleo.
[0452] Ácidos graxos foram medidos usando dois processos, defendendo se o tecido era de folhas ou sementes. Para as folhas, os lipídeos foram extraídos e esterifiçados com H2SO4 metanólico aquecido e divididos em hexano de salmoura metanólica. Para ácidos graxos de sementes, as sementes foram pulverizadas e extraídas em metanol:heptano:tolueno: 2,2-dimetoxipropano: H2SO4 (39:34:20:5:2) por 90 minutos a 80°C. Após resfriamento para temperatura ambiente, a fase superior, contendo os
535/726 ésteres de ácido graxo de semente, foi submetida a análise CG. Ésteres de ácido graxo de ambos sementes e tecidos de folha foram analisados com uma coluna SUPELCO SP-2330 (Supelco, Bellefonte, PA).
[0453] Os glicosinolatos foram purificados de sementes ou folhas primeiro por aquecimento do tecido a 95°C por 10 minutos. Etanol:água pré-aquecidos (50:50) são adicionados e após aquecido a 95°C por um adicional de 10 minutos, o solvente de extração é aplicado a uma coluna DEAE Sephadex (Pharmacia) que havia sido anteriormente equilibrada com 0,5 M de acetato de piridina. Os dessulf©glicosinolatos foram eluídos com 30 pL de água e analisados por HPLC de fase reversa monitorando a 226 nm.
[0454] Para alcanos de cera, as amostras foram extraídas usando um processo idêntico ao dos ácidos graxos e os extratos foram analisados em um HP 5890 GC acoplado com um 5973 MSD. As amostras foram isoladas cromatograficamente em um espectrômetro de massa J&W DB35 (J&W Scientific Agilent Technologies, Folsom, CA).
[0455] Para medir os níveis de prenila, as sementes ou folhas foram pulverizadas com pirogalol 1 a 2% como um antoxidante. Para as sementes, as amostras extraídas foram filtradas e uma porção removida para análise de tocoferol e carotenóide/clorofila por HPLC. O material restante foi saponificado para determinação de esterol. Para as folhas,
536/726 uma alíquota foi removida e diluída co.m metanol e clorofila A, clorofila B, e carotenóides totais medidos por espectrofotometria por determinação da absorvência óptica em 665,2 nm, 652,5 nm e 470 nm. Uma alíquota foi removida por composição de tocoferol e carotenóide/clorofila por PHLC usando uma coluna Waters μBondapak C18 (4,6 mm x 150 mm). A solução metanólica restante foi saponificada com KOH a 10% a 80°C por uma hora. As amostras foram resfriadas e diluídas com uma mistura de metanol e água. Uma solução de cloreto de metileno a 2% em hexano foi combinada e as amostras foram centrifugadas. A fase de metanol aquosa foi novamente re-extraída com cloreto de metileno a 2% em hexano e, após centrifugação, as duas fases superiores foram combinadas e evaporadas. Cloreto de metileno a 2% em hexano foi adicionado aos tubos e as amostras foram então extraídas com 1 mL de água. A fase superior foi removida, seca e ressuspensa em 400 μύ de cloreto de metileno a 2% em hexano e analisadas quanto a cromatografia de gás usando um 50 m DB-5 ms (0,25 mm ID, 0,25 um fase, J&W Scientific).
[0456] Níveis de açúcar insolúveis foram medidos pelo processo essencialmente descrito por Reiter e outros (1999), Plant J. 12:335-345. Esses processo analise a composição de açúcar neutra dos polímeros da parede da célula encontrados nas folhas de Arabidopsis. Açúcares solúveis foram separados dos polímeros de açúcar por
537/726 extração das folhas com etanol quente a 70%. O resíduos restante contendo os polissacarídeos insolúveis era então ácido hidrolizado com alose adicionada como um padrão interno. Os monômeros de açúcar gerados pela hidrose foram então reduzidos aos alditois correspondentes por tratamento com NaBH4, então foram acetilados para gerar os acetatos de alditol voláteis que foram então analisados por GC-FID. A identidade dos picos foi determinada por comparação dos tempos de reação de açúcares conhecidos convertidos nos acetatos alditol correspondentes, com os tempos de retenção de picos dos extratos de planta do tipo selvagem. Os acetatos de alditol foram analisados em uma coluna Supelco SP-2330 capilar (30 m x 250 μιη x 0,2 μιη) usando um programa de temperatura começando em 180°C por 2 minutos, seguido por um aumento para 220°C em 4 minutos. Após ser mantida em 220°C por 10 minutos, a temperatura do forno é aumentada para 240°C em 2 minutos e mantida nessa temperatura por 10 minutos e trazida de volta para a temperatura ambiente.
[0457] Para identificar as plantas com alterações no teor de proteína ou óleo total da semente, 150 mg de sementes de plantas de progênie T2 foram submetidas a análise por Espectroscopia de Refletância Perto do Infravermelho (NIRS) usando um Foss NirSystem Modelo 6500 com um sistema de transporte de taça por rotação. NIRS é um processo analítico, não destrutivo, usado para determinar a
538/726 composição da proteína e do óleo da semente. 0 infravermelho é a região do espectro eletromagnético localizada após a região visível na direção dos comprimentos de onda mais longos. Perto do infravermelho ganhou esse nome por ser a região do infravermelho próxima da região visível do espectro eletromagnético. Para fins práticos, perto do infravermelho compreende comprimentos de onda entre 800 e 2.500 nm. MIRS é apropriado para compostos orgânicos ricos em ligações O-H (tais como, umidade, carboidratos e gorduras). As ligações C-H (tais como, compostos orgânicos e derivados de petróleo) e ligações N-H (tais como, proteínas e aminoácidos). Os instrumentos analíticos de NIRS operam por sinais de NIS estatisticamente relacionados aos vários comprimentos de onda com a característica ou propriedade pretendida a ser medida. Todas as substâncias biológicas contêm milhares de ligações C-H, O-H e N-H. Portanto, a exposição perto da radiação infravermelho de uma amostra biológica, tal como, uma semente, resulta em um espectro completo que contém informações qualitativas e quantitativas com relação a composição física e química daquela amostra.
[0458] O valor numérico de um analito específico na amostra, tal como teor de proteína ou teor de óleo, é mediado por abordagem de calibração conhecida como quimiométricos. Os quimiométricos aplicam os processos
539/726 estatísticos, tais como, regressão linear múltipla (MLR), quadrados mínimos parciais (PLS) e análise de componente de princípio (PCA) aos dados espectrais e correlacionam os mesmos com uma propriedade física ou outro fator, aquela propriedade ou fator é diretamente determinada ao invés da concentração do analito propriamente. 0 processo provê, primeiro dados de química úmida das amostras, necessários para o desenvolvimento da calibração.
[0459] A calibração da resposta NIRS foi realizada usando dados obtidos por análise química úmida de uma população de ecotipos de Arabidopsis que esperava-se representassem a diversidade dos níveis de óleo e proteína.
[0460] A composição de óleo exata de cada ecotipo usada no experimento de calibração foi realizada usando análise gravimétrica de óleos extraídas de amostras de semente (0,5 g ou 1,0 g) por processo de extração de solvente acelerado (ASE; Dionex Corp, Sunnyvale, CA) . O processo de extração foi validado contra amostras de canola certificadas (Community Bureau of Reference, Bélgica). As amostras de semente de cada ecotipo (0,5 g ou 1 g) foram submetidas a extração de solvente acelerada e os pesos do óleo extraído resultante comparados ao peso do óleo recuperado de semente de canola que foi certificado para teor de óleo (Community Bureau of Reference). A equação de calibração do óleo teve como base 57 amostras com uma faixa
540/726 de teor de óleo de 27,0% a 50,8%. Para verificar a validade da curva de calibração, um conjunto adicional de amostras foi extraído por ASE e previsto usando a equação de calibração de óleo. Esse conjunto de validação contou 46 amostras, variando de 27,9% a 47,5% de óleo e tinha um erro padrão previsto de desempenho de 0,63%. O processo químico úmido para proteína era análise elementar (% N x 6,0) usando a média de 3 amostras representativas de 5 mg cada validadas contra milho moinho certificado (NIST). A instrumentação era um analisador elementar, Elementar Vario-EL III, operado em modo de operação CNS (Elementar Analysen systeme GmbH, Hanau, Alemanha).
[0461] A equação de calibração de proteína teve como base uma biblioteca de 63 amostras com uma faixa de conteúdo de proteína de 17,4% a 31,2%. Um conjunto adicional de amostras foi analisado quanto a proteína por análise elementar (n = 57) e escaneado por NIRS, a fim de validar a equação de previsão de proteína. A faixa de proteína para conjunto de validação foi de 16,8% a 31,2% e o erro padrão de previsão foi de 0,468%.
[0462] Análise NIRS de semente de Arabidopsis foi realizada entre 40-300 mg de amostra experimental. O teor de óleo de proteína foi previsto usando as respectivas equações de calibração.
[0463] Os dados obtidos da análise NIRS foram
541/726 analisados estatisticamente usando uma análise de vizinho mais próximo (N-N) . A análise N-N permite a remoção da variabilidade espacial dentro do bloco em um modo fracamente flexível, que não requer conhecimento anterior do padrão de variabilidade na câmara. De modo ideal, todos os híbridos desenvolvem-se sob condições experimentais idênticas dentro de um bloco (rep). Na realidade, mesmo em muitos projetos de bloco, existe variabilidade dentro de bloco significativa. Os procedimentos de vizinho mais próximo têm como base a presunção de que o efeito ambiental de um lote está proximamente relacionado aquele de seus vizinhos. Os processos de vizinho mais próximo usam informações de lotes adjacentes para ajustar a heterogeneidade dentro do bloco e prover assim estimativas mais precisas de meios de tratamento e diferenças. Se existe heterogeneidade dentro do lote em uma escala espacial que seja maior que o lote simples e menor que todo o bloco, então os rendimentos dos lotes adjacentes serão positivamente correlatos. As informações dos lotes vizinhos podem ser usadas para reduzir ou remover o efeito indesejado de heterogeneidade espacial e consequentemente, aperfeiçoar a estimativa de efeito do tratamento. Os dados dos lotes vizinhos podem também ser usados para reduzir a influência da competição entre lotes adjacentes. A análise Papadakis N-N pode ser usada com projetos para remoção de
542/726 variabilidade dentro do bloco que não seria removida com a análise de divisão de lote padrão (Papadakis (1973) Inst. d'Amelior. Plantes Thessaloniki (Grécia) Bull. Scientif. No. 23; Papadakis (1984) Proc. Acad. Athens 59: 326-342.
[0464] Foram realizados experimentos para identificar os transformantes ou nocauteamentos que exibiram sensibilidade ao açúcar modificada. Para tais estudos, as sementes dos transformantes foram germinadas em meio contendo glicose a 5% ou sacarose a 9,4%, o que normal e parcialmente restringe o alongamento do hipocótilo. As plantas com sensibilidade ao açúcar alterada podem ter hipocótilos tanto mais longos quanto mais curtos em relação as plantas normais, quando desenvolvidas nesse meio. Adicionalmente, outros traços de planta podem variar, tal como massa da raiz.
[0465] Podem ser realizados experimentos para identificar aqueles transformantes ou nocauteamentos que exibiram uma tolerância ao agente patogênico aperfeiçoada. Para tais estudos, os transformantes foram expostos aos agentes patogênicos de fungos biotrópicos, tais como , Erysiphe orontii, e agentes patogênicos de fungos necrotópicos, tais como, Fusarium oxysporum. Os isolados de Fusarium oxysporum causam murchas vasculares e apodrecimento de vários vegetais anuais, pereninais e ervas daninhas (Mauch-Mani and Slusarenko (1994) Molec Plant
543/726
Microbe Interact. 7: 378-383). Para experimentos com Fusarium oxysporum, as plantas são desenvolvidas em placas de Petri e aspergidas com uma suspensão de esporos fresca de F. oxysporum. A suspensão de esporos é preparada como se segue: um tampão de fungos hyphae de uma cultura de placa é colocada em uma placa de ágar de dextrose de batata fresca e deixada dispersar por uma semana. 5 mL de água estéril são então adicionados à placa, agitados e pipetados em 50 mL de meio Armstrong Fusarium. Os esporos se desenvolvem por toda a noite em meio Fusarium e então são aspergidos em plantas usando um aspersor para tinta Preval. O tecido da planta é colhido e congelado em nitrogênio líquido por 48 horas após a infecção.
[0466] Erysiphe orontii é o agente que causa o míldio pulverulento. Para experimentos de Erysiphe orontii as plantas crescem cerca de 4 semanas em uma estufa sob 12 horas de luz (20°C, cerca de 30% de umidade relativa (rh)). As folhas individuais são infectadas com esporos de E. orontii de plantas infectada usando uma escova de pelos de camelo e as plantas são transferidas para uma câmara de crescimento Percival (20°C, 80% de umidade relativa). O tecido da planta é colhido e congelado em nitrogênio líquido, 7 dias após a infecção.
[0467] Botrytis cinerea é um agente patogênico necrotrófico. Botrytis cinerea é desenvolvido em ágar de
544/726 dextrose de batata, sob 12 horas de luz (20°C, ~30% de umidade relativa). Uma cultura de esporo é realizada por aspersão de 10 mL de água estéril na placa de fungos, agitando e transferindo os esporos para 10 mL de água estéril. O inócuo de esporo (aproximadamente 105 esporos/mL) é então usado para aspergir sementeiras de 10 dias sob condições estéreis em meio MS (menos sacarose). Os sintomas são avaliados a cada dia até aproximadamente uma semana.
[0468] Culturas hyphal de Sclerotinia sclerotiorum são desenvolvidas em caldo de dextrose de batata. Um grama de hypahe é moldo, filtrado, girado para baixo e resusspenso em água estéril. Uma diluição de 1:10 é usada para aspergir sementeiras de 10 dias de idade, crescendo assepticamente sob um regime de 12 horas de luz/escuridão em meios MS (menos sacarose). Os sintomas são avaliados diariamente por aproximadamente uma semana.
[0469] Cepa de Pseudomonas syringae pv maculicola (Psm) 4326 e cepa pv maculicola 4326 foram inoculadas manualmente em duas doses. Duas doses de inoculação permitem a diferenciação entre as plantas com susceptibilidade aumentada e plantas com resistência melhorada ao agente patogênico. As plantas foram desenvolvidas por três semanas na estufa e então transferidas para uma câmara de crescimento para o restante
545/726 de seu desenvolvimento. Psm ES4326 pode ser manuseado inoculado com 1 mL de syringe em 3 folhas completamente expandidas por planta (4 e 1/2 semanas de idade), usando pelo menos 9 plantas por linhagem de superexpressão em duas doses de inoculação, OD = 0,005 e OD = 0,0005. A classificação da doença é realizada no dia 3 após inoculação com fotos de plantas e folhas tomadas em paralelo.
[0470] Em alguns exemplos, o padrão de expressão dos genes induzidos por agente patogênico (tais como, genes de defesa) pode ser monitorado por experimentos de microdisposições. Nesses experimentos, os cDNAs são gerados por PCR e ressuspensos a uma concentração final de ~100 ng/μΕ em 3 X SSC ou 150 mM de fosfato de Na (Eisen and Brown (1999) Methods Enzymol. 303: 179-205). Os cDNAs são manchados em lâminas de vidro de microscópio revestidas com polilisina. Os cDNAs preparados são aliquotados em placas de 384 poços e manchados nas lâminas usando, por exemplo, um canteiro x-y-z (OmniGrid) que foi adquirido na GeneMachines (Menlo Park, CA) ajustado com pinos do tipo bobina que podem ser adquiridos na Telechem International (Sunnyvale, CA). Após o manchamento, as fileiras são curadas em um mínimo de uma semana a temperatura ambiente, reidratadas e bloqueadas usando o protocolo recomendado por Eisen and Brown (1999; supra).
546/726 [0471] Amostras de RNA total de amostra (10 μρ) são marcadas usando corantes Cy3 e Cy5 fluorescentes. As amostras marcadas são ressuspensas em 4X SSC/0,03% SDS/4 μς de DNA de esperma de salmão/2 μρ tRNA/50 mM de pirofosfato de Na, aquecidas para 95°C por dois minutos e meio, giradas para baixo e colocadas na fileira. A fileira é então coberta com um revestimento de vidro e colocada em uma câmara fechada. A câmara é então mantida em um banho de água a 62 °C por toda a noite. As fileiras são lavadas conforme descrito em Eisen and Brown (1999, supra) e escaneadas no scaner a laser General Scanning 3000. Os arquivos resultantes são subsequentemente quantificados usando software IMAGENE (BioDiscovery, Los Angeles, CA).
[0472] Experimentos de RT-PCR podem ser realizados para identificar aqueles genes induzidos após exposição aos agentes patogênicos de fungos biotrópicos, tais como, Erysiphe orontii, agentes patogênicos de fungos necrotrópicos, tais como, bactérias Fusarium oxysporum, bactéria, virus e ácido salicílico, o último sendo estando envolvido em uma resposta de resistência não especifica em Arabidopsis thaliana. Genericamente, o padrão de expressão do gene do tecido de folha de planta moldo é examinado.
[0473] PCR transcriptase reversa foi conduzida usando iniciadores específicos para gene dentro da região de codificação para cada sequência identificada. Os
547/726 iniciadores foram designados próximo a região 3' de cada sequência de ligação de DNA inicialmente identificada.
[0474] RNA total desses tecidos de folha moida foi isolado usando protocolo de extração de CTAB. Uma vez extraído, o RNA total foi normalizado em concentração através de todos os tipos de tecido, para garantir que a reação de PCR para cada tecido recebesse a mesma quantidade de gabarito de cDNA usando a faixa 28S como referência. Poli(A+) RNA foi purificado usando um protocolo modificado do protocolo de batelada do kit de purificação Qiagen OLIGOTEX. cDNA foi sintetizado usando protocolos padrão. Após a primeira síntese de cDNA de filamento, os iniciadores para Actina 2 foram usados para normalizar a concentração de cDNA através dos tipos de tecido. Foi verificado que Actina 2 expressou-se constitutivamente em
níveis fracamente iguais através dos tipos de tecido que
foram investigados.
[0475] Para RT PCR, o gabarito de cDNA foi
misturado com iniciadores correspondentes e Taq DNA
polimerase. Cada reação consistia em 0,2 μΐ de gabarito de cDNA, 2 μΐ de tampão 10X Tricina, 2 μΐ de tampão 10X Tricina e 16,8 μΐ de água, 0,05 μΒ de Iniciador 1, 0,05 μΒ de Iniciador 2, 0,3 μΒ de Taq DNA polimerase e 8,6 μΐ de água.
[0476] A placa de 96 poços é coberta com
548/726 micropelícula e ajustada no termociclador para iniciar o ciclo de reação. Como ilustração, o ciclo de reação pode
compreender as seguintes etapas:
Etapa 1: 93°C POR 3 MIN;
Etapa 2 : 93°C por 3C ) sec;
Etapa 3: 65°C por 1 min;
Etapa 4 : 72°C por 2 min;
Etapas 2, 3 e 4 são repetidas por 28 ciclos;
Etapa 5: 72°C por 5 min; e
Etapa 6: 4°C.
[0477] Para ampliar mais os produtos, por exemplo, para identificar genes que possuem expressão muito baixa, etapas adicionais podem ser realizadas: o processo que se segue ilustra um método que pode ser usado com relação a isso. A placa PCR é colocada de volta no termociclador por mais 8 ciclos das etapas 2-4.
Etapa 2 93°C por 30 sec;
Etapa 3 65°C por 1 min;
Etapa 4 72°C por 2 min, repetida por 8 ciclos; e
Etapa 5 4°C.
[0478] Oito microlitros de produto de PCR e 1,5 μΕ
de corante de carregamento são colocados em um gel de agarose a 1,2% para análise após 28 ciclos e 36 ciclos. Os níveis de expressão de transcrições específicas são considerados baixos se eles forem apenas detectáveis após
549/726 ciclos de PCR. Os níveis de expressão são considerados médios ou altos dependendo dos níveis de transcrição comparados com os níveis de transcrição observados para o controle interno, tal como, actina2. Os níveis de transcrição são determinados em experimentos repetidos e comparados aos níveis de transcrição nas plantas de controle (por exemplo, não transformadas).
Exemplo VIII: Identificação de Sequências Homólogas [0479] Esse exemplo descreve a identificação dos genes que são ortólogos dos fatores de transcrição de Arabidopsis thaliana a partir de uma pesquisa de homologia por computador.
[0480] Sequências homólogas, incluindo aquelas de parálogos e ortólogos de Arabidopsis e outras espécies de plantas, foram identificadas usando ferramentas de pesquisa de sequência de base de dados, tais como, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul e outros, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; r Altschul e outros, (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402). Os programas de análise de sequência tblastx foram empregados usando a matriz de classificação BLOSUM-62 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc .Natl. Acad. Sei. 89: 10915-10919). Toda a base de dados do NCBI GenBank foi filtrada para sequências de todas as plantas, exceto Arabidopsis thaliana por seleção de todas as entradas na base de dados do NCBI GenBank associadas a
550/726
ID 33090 taxonômica de NCBI (Viridiplantae; todas as plantas) e excluindo as entradas associadas a ID 3701 taxonômica (Arabidopsis thaliana) .
[0481] Essas sequências são comparadas às sequências representando genes da SEQ ID N°: 2N - 1, onde N = 1- 229, usando o algoritmo da Washington University TBLASTX (versão 2.0al9MP) nos ajustes de default empregando alinhamentos fendidos com o filtro off. Para cada gene da SEQ ID N° : 2N - 1, onde N = 1- 229, comparações individuais foram ordenadas por classificação de probabilidade (valor de P), onde a classificação reflete a probabilidade de que um alinhamento especifico tenha ocorrido por chance. Por exemplo, uma classificação de 3, 6e-40 é 3,6 x 10-40. Além dos valores de P, as comparações foram também classificadas por porcentagem de identidade. A porcentagem de identidade reflete o grau ao qual os dois segmentos de DNA ou proteína são idênticos em um comprimento específico. Exemplos de sequências assim identificadas são apresentados na Tabela 10 e Tabela 12. Sequências parálogas ou ortólogas foram prontamente identificadas e disponíveis no GenBank sob número de acesso (Tabela 10; ID de sequência de teste). Ά porcentagem de identidade da sequência dentre essas sequências pode ser tão baixa quanto 47% ou mesmo identidade de sequência inferior.
[0482] As sequências parálogas candidatas foram
551/726 identificadas entre os fatores de transcrição de Arabidopsis através de alinhamento, identidade e relações filogênicas. Uma lista de parálogos é mostarda na tabela 12. Sequências ortólogas candidatas foram identificadas de conjuntos de unigene proprietários de sequências de gene de planta em Zea mays, Glycine max e Oryza sativa com base na homologia significante em relação aos fatores de transcrição de Arabidopsis. Essas candidatas foram reciprocamente comparadas ao conjunto de fatores de transcrição de Arabidopsis. Se a candidata mostrasse similaridade máxima no domínio de proteína com relação ao fator de transcrição de promoção ou a um parálogo do fator de transcrição de promoção, então ela seria considerada como sendo ortóloga. As sequências de não Arabidopsis identificadas que foram mostradas dessa maneira como sendo ortólogas às sequências de Arabidopsis são fornecidas na tabela 10.
Exemplo IX: Identificação de Sequências Ortólogas e Parálogas [0483] Ortólogos dos genes de Arabidopsis podem ser identificados por vários processos, incluindo processos experimentais, tais como, hibridização e/ou ampliação. Esse exemplo descreve como podem ser identificados equivalentes ao fator de descrição da família AP2 de Arabidopsis CBF1 (SEQ ID N° : 1955 de polinucleotideo, SED ID NO: 1956 de
552/726 polipeptídeo codificado) que confere tolerância ao estresse abiótico (Thomashow e outros, (2002) Patente US número 6.417.428), e um exemplo para confirmar a função das sequências homólogas. Nesse exemplo, os ortólogos do CBF1 foram encontrados em canola (Brassica napus) usando reação da cadeia da polimerase (PCR).
[0484] Iniciadores degenerados foram designados para regiões de domínio de ligação de AP2 e fora de ΆΡ2 (domínio de terminal carboxila) :
Mol 368 (reverso) 5’- CAY CCN ATH TAY MGN GGN GT -3' (SEQ ID N°: 2205)
Mol 378 (a frente) 5'- GGN ARN ARC ATN CCY TCN
GCC -3' (SEQ ID N°: 2206) (Y: C/T, N: A/C/G/T, H: A/C/T, M: A/C, R: A/G ) [0485] O iniciador Mol 368 é um domínio de ligação de AP2 de CBF1 (sequência de aminoácido: His-Pro-Ile-TyrArg-Gly-Val) enquanto o iniciador Mol 378 está fora do domínio AP2 (domínio de terminal carboxila) (sequência de aminoácido: Met-Ala-Glu-Gly-Met-Leu-Leu-Pro).
[0486] O DNA genômico isolado de B. napus foi ampliado por PCR usando esses iniciadores seguindo as condições: uma etapa de desnaturação inicial de 2 minutos a 93°C; 35 ciclos de 93°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto; e uma incubação final de 17 minutos a 72°C ao final do ciclo.
553/726 [0487] Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em um gel de agarose a 1,2% e transferidos para um membrana de náilon e hibridizados com sonda AT CBF1 preparada de DNA genômico de Arabidopsis por ampliação por PCR. Os produtos hibridizados foram visualizados por sistema de detecção colorimétrico (Boehringer Mannheim) e as faixas correspondentes de um gel de agarose semelhante foram isoladas usando Qiagen Extraction Kit (Qiagen). Os fragmentos de DNA foram ligados no vetor de clone TA do Kit TOPO TA Cloning (Invitrogen) e transformados na cepa E.coli TOPIO (Invitrogen).
[0488] Sete colônias foram coletadas e as inserções foram sequenciadas em uma máquina ABI 377 de ambos filamentos de sentido e de anti-sentido após isolamento do DNA do plasmideo. A sequência de DNA foi editada por sequenciador e alinhada com AtCBFl por software GCG e pesquisa de NCBI blast.
[0489] A sequência de ácido nucleico e sequência de aminoácido de um ortólogo de canola encontrada dessa maneira (bnCBFl; SEQW ID NO: 2203 de polinucleotídeo e SEQ ID N°: 2204 de polipeptídeo) identificada por esse processo é mostrada na Listagem de Sequências.
[0490] As sequências de aminoácido alinhadas mostram que o gene bnCBFl possui 88% de identidade com a sequência de Arabidopsis na região de domínio AP2 e 85% de
554/726 identificação com a sequência de Arabidopsis fora do domínio AP2 quando alinhadas para duas sequências de inserção que estão fora do domínio AP2.
[0491] De modo semelhante, as sequências parálogas aos genes de Arabidopsis, tais como, CBF1, podem também ser identificadas.
[0492] Dois parálogos de CBF1 de Arabidopsis thaliana: CBF2 e CBF3. CBF2 e CBF3 foram clonados e sequenciados conforme descrito a seguir. As sequências de DNA da SEQ ID N°: 1957 e 1959 e SEQ ID N°: 1958 e 1960 de proteínas codificadas são estabelecidas na Listagem de Sequências.
[0493] Uma biblioteca de lambda cDNA preparada de RNA isolado de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia Lin and Thomashow (1992) Plant Physiol. 99: 519-525) foi classificada quanto aos clones recombinantes que portavam inserções relacionadas ao gene CBF1 (Stockinger e outros, (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. 94:1035-1040). CBF1 foi 32Pradiomarcado por iniciação aleatória (Sambrook e outros,(1998) supra) e usado para classificar a biblioteca por técnica de elevação de placa usando hibridização estringente e condições de lavagem (Hajela e outros, (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252; Sambrook e outros,(1998) supra) tampão 6 X SSPE, 60° C para hibridização e tampão 0,1 X SSPE e 60° C para lavagens) . Doze clones hibridizando
555/726 positivamente foram obtidos e as sequências de DNA e inserções de cDNA foram determinadas. Os resultados indicaram que os clones encontram-se em três classes. Uma classe portando inserções correspondendo ao CBF1. As outras duas classes portando sequências correspondendo aos dos homólogos diferentes de CBF1, designados CBF2 e CBF3. As sequências de ácido nucleico e sequências codificando proteína preditas para Arabidopsis CBF1, CBF2 e CBF3 são listadas na Listagem de Sequências (SEQ ID NoS: 1955, 1957, 1959 e SEQ ID napus CBF são listadas na Listagem NoS: 1956, 1958, 1960, respectivamente). As sequências de ácido nucleico e sequências de codificação de proteína preditas para ortólogo de Brassica de Sequências (SEQ ID NoS: 2203 e 2204, respectivamente).
[0494] Uma comparação das sequências de ácido nucleico de Arabidopsis CBF1, CBF2 e CBF3 indicam que elas são 83 a 85% idênticas, conforme mostrado na Tabela 14.
Tabela 14
Porcentagem de identidade3
DNAb Polipepetídeo
cbfl/cbf2 85 86
cbf1/cbf3 83 84
cbf2/cbf3 84 85
a Porcentagem de identidade foi determinada usando o algoritmo Clustal do programa Megalign (DNASTAR, Inc.).
556/726 b São mostradas comparações das sequências de ácido nucleico dos quadros abertos de leitura [0495] De modo semelhante, as sequências de aminoácido dos três polipeptideos de CBF variam de 84 a 86% de identidade. Um alinhamento das três sequências de aminoácido revela que a maior parte das diferenças na sequência de aminoácido ocorrem na metade do terminal C ácido do polipeptideo. Essa região de CBF1 serve como um domínio de ativação em ambos levedura e Arabidopsis (não mostrado).
[0496] Os resíduos 47 a 106 de CBF1 correspondem ao domínio AP2 da proteína, um motivo de ligação de DNA que, atualmente, apenas é encontrado nas proteínas de plantas. Uma comparação dos domínios AP2 de CBF1, CBF2 e CBF3 indica que existem algumas diferenças na sequência de aminoácido. Essas diferenças na sequência de aminoácido podem ter um efeito na especificidade de ligação do DNA.
Exemplo X: Classificação de biblioteca de cDNA de planta para sequência codificando um domínio de ligação de
DNA de fator de transcrição que liga-se a um elemento
promotor de ligação de fator de transcrição e demonstração
de atividade de regulação de transcrição de proteína [0497] A estratégia um-híbrido (Li and Herskowitz (1993) Science 262: 1870-1874) é usada para classificar clones de cDNA de planta codificando um polipeptideo
557/726 compreendendo um domínio de ligação de DNA de fator de transcrição, um domínio conservado. Em resumo, as cepas de levedura são construções, contendo um gene repórter lacZ com sequências de elemento de promotor de ligação de fator de transcrição do tipo selvagem ou mutante, no lugar de UAS normais (sequência ativadora a montante) do promotor GALL. As cepas repórter de levedura são construídas, portando sequências de elemento de promotor de ligação de fator de transcrição conforme os elementos UAS são operativamente ligados a montante (5') de um gene repórter lacZ com um promotor GAL1 mínimo. As cepas são transformadas com uma biblioteca de expressão de planta que contém inserções de cDNA aleatórias fundidas ao domínio de ativação de GAL4 (GAL4-ACT) e classificadas quanto a formação de colônia azul nos filtros tratados com X-gal (X-gal: 5-bromo-4cloro-3-indolil-p-D-galactosido; Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) . Alternativamente, as cepas são transformadas com um polinucleotídeo de cDNA codificando uma sequência de polipeptideo de domínio de ligação de DNA de fator de transcrição conhecido.
[0498] As cepas de levedura portando essas construções repórter produzem baixos níveis de betagalactosidase e formam colônias brancas nos filtros contendo X-gal. As cepas repórter portando sequências de elemento promotor de ligação de fator de transcrição do tipo
558/726 selvagem são transformada com um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo compreendendo um domínio de ligação de DNA de fator de transcrição de planta operativamente ligado ao domínio ativador ácido do fator de transcrição GAL4 de levedura, GAL4-AACT. Os clones que contêm um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação de DNA de fator de transcrição operativamente ligado ao GLA4-ACT podem ligar a montante dos genes repórter lacZ portando a sequência de elemento promotor de ligação de fator de transcrição do tipo selvagem, nas colônias azuis de formação de levedura nos filtros tratados com X-gal.
[0499] Mediante classificação de cerca de 2 x 106 transformantes de levedura, os clones cDNA positivos são isolados; isto é, clones que fazem com que cepas de levedura portando repórteres lacZ operativamente ligados aos elementos promotores de ligação de fator de transcrição do tipo selvagem formem colônias azuis nos filtros tratados com X-gal. Os clones de cDNA não fazem com que uma cepa de levedura portando elementos promotores de ligação de fator de transcrição do tipo mutante fundida a LacZ se torne azul. Assim, um domínio de ligação de DNA de fator de transcrição codificando um polinucleotídeo, um domínio conservado, é mostrado como ativando a transcrição de um gene.
Exemplo XI: Ensaios de Deslocamento de Gel
559/726 [0500] A presença de um fator de transcrição compreendendo um domínio de ligação de DNA que liga-se a um elemento de ligação de fator de transcrição de DNA é avaliada usando o ensaio de deslocamento de gel a seguir. O fator de transcrição é expresso recombinantemente de E.colí ou isolado de material de planta. A proteína solúvel total, incluindo o fator de transcrição, (40 ng) é incubada a temperatura ambiente em 10 μύ de 1 x tampão de ligação (15 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 30 mM KC1, 5% de glicerol, 5% albumina de soro bovino, 1 mM DTT) mais 50 ng de poli(dldC) :poli (dl-dC) (Pharmacia, Piscataway NJ) com ou sem 100 ng de DNA competidor. Após 10 minutos de incubação, DNA de sonda compreendendo um elemento de ligação de fator de transcrição de DNA (1 ng) que foi marcado com 32P por enchimento de extremidade (Sambrook e outros, (1989) supra) é adicionado e a mistura incubada por mais 10 minutos. As amostras são carregadas em géis de poliacrilamida (4% peso/volume) e fracionadas por eletroforese a 150V por duas horas (Sambrook e outros, (1998) supra). O grau de ligação de DNA de sonda-fator de transcrição é visualizado usando autoradiografia. Os DNAs de sonda e competidor são preparados por inserções de oligonucleotídeo ligadas em um sítio de BamHI de pUC118 (Vieira e outros, (1987) Methods Enzymol. 153: 3-11). A orientação e o número de concatenação das inserções são determinados por análise de
560/726 sequência de DNA de dideóxi (Sambrook e outros, (1998) supra). As inserções são recuperadas após digestão com EcoRI e HindIII e fracionamento em géis de poliacrilamida (12% peso/volume) (Sambrook e outros, (1998) supra).
Exemplo XII. Introdução de Polinucleotídeos em Plantas Dicotiledôneas [0501] As sequências de fator de transcrição listadas na Listagem de Sequências recombinadas nos vetores de expressão pMEM20 ou pMEM65 são transformadas em uma planta com a finalidade de modificar os traços da planta. O vetor de clonagem pode ser introduzido em várias plantas de cereal por meio bem conhecido na técnica, tal como, por exemplo, transferência direta de DNA ou transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Agora é rotina a produção de plantas transgênicas usando a maior parte das plantas dicoto (vide Weissbach and Weissbach, (1989) supra; Gelvin e outros, (1990) supra; Herrera-Estrella e outros, (1983) supra; Bevan (1984) supra; e Klee (1985) supra). Os processos para análise dos traços são rotina na técnica e os exemplos são revelados acima.
Exemplo XIII: Exemplos de Genes que Conferem Aperfeiçoamentos Significativos às Plantas [0502] Foram realizados experimentos para identificar aqueles transformantes ou nocauteamentos que exibiram diferença morfológica em relação às plantas de
561/726 controle do tipo selvagem, isto é, uma estrutura modificada e/ou características de desenvolvimento. Para tais estudos os transformantes foram observados visualmente para identificar novas características estruturais ou de desenvolvimento associadas à expressão ectópica dos polinucleotídeos ou polipeptideos da invenção. Exemplos de genes e equivalentes que conferem aperfeiçoamentos significativos as plantas de superexpressão são citados a seguir. Observações experimentais feitas com relação aos genes específicos cuja expressão foi modificada nas plantas de superexpressão e aplicações em potencial com base nessas observações, são também apresentadas.
[0503] Fenótipos modificados observados para superexpressor específico ou plantas de nocauteamento são providos na Tabela 7. Para um superexpressor específico que mostra uma característica menos benéfica, pode ser mais útil selecionar uma planta com uma expressão reduzida do fator de transcrição específico. Para um nocauteamento específico que mostra uma característica menos específica, pode ser mais útil selecionar uma planta com uma expressão aumentada do fator de transcrição específico.
[0504] A tabela 7 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptideo exemplares da invenção. As sequências da Listagem de Sequências ou aquelas nas Tabelas 7-11, ou aquelas reveladas aqui, podem ser usadas para
562/726 preparar plantas transgênicas e plantas com traços alterados. As plantas transgênicas especificas listas a seguir são produzidas das sequências da Listagem de Sequências conforme citada. Vários genes e homólogos que conferem aperfeiçoamentos significativos para nocauteamento ou superexpressão de plantas foram observados a seguir. Observações experimentais realizadas com relação aos genes específicos cuja expressão foi modificada por plantas de superexpressão ou nocauteamento, e aplicações em potencial com base nessas observações, foram também apresentadas. Conforme observado nos resultados dos ensaios de fisiologia a base de placa apresentados nas tabelas desse Exemplo, um número representativos de sequências de diversas espécies de planta conferiram vários níveis de tolerância aumentada ao estresse em uma faixa de ensaios de estresse abiótico, conforme observado a seguir. Os efeitos constatados de superexpressão na época de floração são também observados no texto a seguir. Esses efeitos comparáveis indicam que as sequências encontradas dentro de classes ou subclasses especificas são funcionalmente relacionadas e podem ser usadas para conferir vários tipos de estresse abiótico nas plantas. Vários desses genes conferem, concorrentemente, tolerância aos múltiplos estresses abióticos.
[0505] Os ensaios de estresse por sal destinam-se a encontrar genes que conferem melhor germinação, vigor de
563/726 sementeira ou crescimento em alto teor de sal. A evaporação da superfície do solo causa movimento de água a montante e acúmulo de sal na amada superior do solo, onde as sementes são colocadas. Assim, a germinação normalmente acontece em uma concentração de sal muito maior que a concentração de sal média no perfil de solo total. As plantas diferente em sua tolerância ao NaCl, dependendo de seu estágio de desenvolvimento, portanto, a germinação da semente, vigor da sementeira e respostas de crescimento da planta são avaliadas.
[0506] Os ensaios de tensão osmótica (incluindo ensaios de NaCl e manitol) destinam-se a determinar se um fenótipo de tensão osmótica é especifico para NaCl ou se ele é um fenótipo relacionado a tensão osmótica em geral. As plantas tolerantes à tensão osmótica teriam também mais tolerância à estiagem e/ou congelamento.
[0507] Os ensaios de estiagem são destinados a encontrar os genes que mediam melhor sobrevivência da planta após privação de água severa, de curto prazo. Vazamento de íon será medido, conforme necessário. A tolerância à tensão
osmótica também suportaria um fenótipo de tolerância a
estiagem.
[0508] Os ensaios de estresse por temperatura
destinam-se a encontrar genes que confiram melhor
germinação, vigor de sementeira ou crescimento de planta
564/726 sob estresse de temperatura (frio, congelamento e calor).
[0509] Os ensaios de estresse por açúcar destinamse a encontrar genes envolvidos na sensibilidade ao açúcar por germinação das sementes em altas concentrações de sacarose e glicose e procurando graus de alongamento de hipocótilo. O ensaio de germinação em manitol controla as respostas relacionadas à tensão osmótica. Os açúcares são moléculas reguladoras chave que afetam os diversos processos em plantas superiores incluindo germinação, crescimento, florescimento, senescência, metabolismo do açúcar e fotossintese. A sacarose é a forma de transporte principal do fotossintato e seu fluxo através das células mostrou afetar a expressão genética e alterar o armazenamento de acúmulo de composto nas sementes (relações fonte-escoadouro). A sensibilidade a hexose especifica de glicose foi descrita nas plantas e está implicada na divisão celular e repressão de genes famintos (ciclos fotossintéticos ou de glioxilato).
[0510] Os ensaios de germinação seguiram as modificações do mesmo protocolo básico. As sementes estéreis foram semeadas nos meios condicionais listados a seguir. As placas foram incubadas a 22C sob luz por 24 horas (120-130 pEin/m2/s) em uma câmara de desenvolvimento. A avaliação da germinação e vigor das sementeiras foi conduzida 3 a 15 dias após o plantio. Os meios basais eram
565/726
80% de meio Murashige-Skoog (M) + vitaminas.
[0511] Para os experimentos de germinação em tensão osmótica e estresse por sal, o meio foi suplementado com 150 mM de NaCl ou 300 mM de manitol. Os ensaios de sensibilidade ao regulador de crescimento foram realizados em meios MS, vitaminas e tanto 0,3 μΜ de ABA, 9,4% de sacarose ou 5% de glicose.
[0512] Os experimentos de germinação a frio de estresse por temperatura foram realizados a 8°C. Os experimentos de germinação de estresse por calor foram conduzidos a 32°C a 37°C por 6 horas de exposição.
[0513] Para experimentos de estresse conduzidos com plantas mais maduras, sementes germinaram e cresceram por sete dias em MS + vitaminas + 1% de sacarose a 22°C e então foram transferidas para condições de estresse por resfriamento e calor. As plantas foram expostas ao estresse por resfriamento (6 horas de exposição a 4-8C), ou estresse por aquecimento (32°C foram aplicados por cinco dias, após o que as plantas foram transferidas de volta para 22°C para recuperação e avaliadas após 5 dias em relação aos controles não expostos à temperatura abaixada ou elevada).
[0514] Classificações de estiagem com base no solo foram realizadas com plantas Arabidopsis superexpressando os fatores de transcrição listados na Listagem de Sequências, citada a seguir. As sementes das plantas
566/726
Arabidopsis do tipo selvagem ou plantas superexpressando um polipeptídeo da invenção, foram estratifiçadas por três dais a 4°C em agarose a 0,1%. Quatorze sementes de cada superexpressor ou tipo selvagem foram então semeadas em potes de argila de 7,62 cm contendo uma mistura 50:50 de vermiculita:perlita coberta com uma pequena camada de MetroMix 200 e cresceram por quinze dias com luz por 24 horas. Os potes contendo sementeiras do tipo selvagem e de superexpressão foram colocados no plano em ordem aleatória. O estresse por estiagem foi iniciado por colocação dos potes sobre papel absorvente por sete a oito dias. As sementeiras foram consideradas como estando suficientemente estressadas quando a maior parte dos potes contendo sementeiras do tipo selvagem dentro de um plano tinham murchado muito. Os potes foram então regadas novamente e a sobrevivência foi classificada quatro a sete dias mais tarde. As plantas foram classificadas contra controles do tipo selvagem para cada um de dois critérios: tolerância às condições de estiagem e recuperação (sobrevivência) seguindo a nova rega.
[0515] Ao final do período de estiagem inicial, cada pote recebeu uma classificação numérica dependendo dos critérios acima. Um valor baixo foi designado para as planas com uma aparência extremamente fraca (isto é, as plantas tinham um marrom uniforme) e um valor alto
567/726 fornecido às plantas que tinham aparência muito saudável (isto é, as plantas totalmente verdes). Após as plantas serem regadas novamente e incubadas um adicional de quatro a sete dias, as plantas foram reavaliadas para indicar o grau de recuperação após tratamento de privação de água.
[0516] Uma análise foi então conduzida para determinar quais plantas sobreviveram melhor a privação de água, identificação dos transgenes que conferiram consistentemente fenótipos de tolerância a estiagem e sua capacidade de recuperarem-se desse tratamento. A análise foi realizada por comparação total e dentro de tabulações planas com um conjunto de modelos estatísticos para responsabilizarem-se pelas variações entre as bateladas. Várias medidas de sobrevivência foram tabuladas, incluindo: (a) a proporção média de sobrevivência das plantas em relação a sobrevivência do tipo selvagem dentro do mesmo plano; (b) a proporção de sobrevivência média em relação à sobrevivência do tipo selvagem dentro do mesmo plano; (c) a sobrevivência média total (tomada em relação a todas as bateladas, planos e potes); (d) a sobrevivência média total em relação à sobrevivência média total; e (e) a
classificação visual média da saúde da planta antes da nova
rega.
[0517] A época de florescimento foi medida pelo
número de folhas de roseta presentes quando uma
568/726 inflorescência visível de cerca de 3 cm é aparente. A roseta e o número total de folhas na haste de progênie estão muito relacionadas com a época de floração (Koornneef e outros, (1991) Mol. Gen. Genet. 229: 57-66). A resposta de vernalização foi também medida. Para tratamentos de vernalização, as sementes foram semeadas em placas ágar MS, seladas com fita de microporos e colocadas em um ambiente frio a 4°C com níveis de luz altos por 6 a 8 semanas. As placas foram então transferidas para os ambientes de crescimento ao longo de placas contendo controles não vernalizados semeados. As folhas de roseta foram contadas quando uma inflorescência visível de cerca de 3 cm era aparente.
Resultados:
[0518] Células vazias encontradas nas tabelas desse Exemplo indicam que os resultados não foram ainda obtidos para aquele experimento de estresse especifico. As abreviaturas usadas nas tabelas nesse exemplo incluem:
(++) Desempenho substancialmente melhorado em comparação aos controles. O fenótipo foi muito consistente e o desenvolvimento foi muito melhor que os níveis normais de variabilidade observados para aquele ensaio.
(+) Desempenho melhorado em comparação aos controles. A resposta estava consistentemente acima dos níveis normais de variabilidade observados para aquele ensaio.
569/726 (wt) responsa semelhante ao tipo selvagem; e (germ.) germinação.
G9 (SEQ ID NoS: 1949 e 1950) [0519] G9 é um parálogo putativo de G867, e foi referido na literatura pública como RAP2.8 e RAV2 (Okamuro e outros, (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 7076-7081; Kagaya e outros, (1999) Nucleic Acids Res. 27: 470-478). Nenhuma análise genética do local foi ainda publicada.
Observações Experimentais [0520] Observou-se anteriormente que a superexpressão de G9 melhorou o crescimento da raiz. O objetivo do presente estudo foi o de reavaliar as linhagens 35S::G9 e determinar se a superexpressão do gene conferiría tolerância ao estresse melhorada de um modo comparável ao G867. Nós também buscamos testar se o uso do sistema de superexpressão de dois componentes produziría qualquer resistência do fenótipo em relação ao uso de uma fusão de promotor direta de 35S.
[0521] Novas linhagens de superexpressão foram obtidas usando ambos uma construção de fusão de promotor direta e um sistema de expressão de dois componentes. As linhagens geradas por esses processos exibiu fenótipos semelhantes e revelou vários efeitos morfológicos que não haviam sido observados durante nossas avaliações genômicas anteriores. Essas incluíram uma redução no tamanho total,
570/726 alterações na orientação da folha (o que indicou
potencialmente um rompimento no controle circadiano),
crescimento lento e anormalidades florais em relação aos
controles.
[0522] Nós testamos as linhagens de dois
componentes 35S::G9 e de fusão direta sob uma variedade de tratamentos com base em placa. Todas as linhagens de fusão direta e a maior parte das linhagens de dois componentes realizaram controles em um ensaio de germinação nas placas de cloreto de sódio. Além disso, muitas dessas linhagens também mostraram fenótipos positivos quando germinadas em sacarose e ABA, bem como sob condições frias.
[0523] Deve ser enfatizado que nós obtivemos efeitos de desenvolvimento comparáveis, bem como uma forte melhora da tolerância relacionada a estiagem nas linhagens 35S::G867 e nas linhagens de superexpressão para dois parálogos putativos G1930 e G993. Os efeitos fenotipicos quase idênticos observaram para os quatro genes sugerem, fortemente, que eles são funcionalmente equivalentes.
Tabela 15. G9 35S, Fusão de promotor direta e supTfn de dois componentes
Transforma- Germina Germina Germi- Crescí
Germina-
Linha- çâo ção em ção em Saca nação mento Res-
ABA ção no Estiagem
gem alto alto rose no no friamento
frio
teor de teor de calor calor
571/726
NaCl manitol
302 Fusão direta + wt + wt wt wt wt wt +
304 Fusão direta + wt wt wt wt wt wt wt wt
305 Fusão direta ++ Wt + wt wt wt wt wt +
306 Fusão direta + Wt wt wt wt wt wt wt wt
307 Fusão direta + Wt wt wt wt wt wt wt wt
310 Fusão direta + wt + ++ wt wt wt wt +
311 Fusão direta ++ wt + wt wt wt wt wt +
312 Fusão direta ++ wt wt + wt wt wt wt +
313 Fusão direta + wt + + wt wt wt wt +
318 Fusão direta ++ wt + wt wt wt wt wt wt
483 2-comp wt wt + + wt
485 2-comp + wt wt wt wt
486 2-comp wt wt wt wt wt
488 2-comp + wt + ++ wt
572/726
489 2-comp + wt wt ++ wt
490 2-comp wt wt + ++ wt
491 2-comp wt wt + ++ wt
493 2-comp wt wt + ++ wt
494 2-comp + wt wt ++ wt
498 2-comp + wt + ++ wt
Aplicações em potencial [0524] Com base nos resultados desses ensaios de estresse abiótico, G867 e genes correlatos, tais como G9 são excelentes genes candidatos para aperfeiçoamento da tolerância ao estresse relacionado ao frio nas espécies comerciais. Os efeitos morfológicos associados a sua superexpressão sugerem que tecido específico ou promotores condicionais podem ser usados para otimizar a utilidade desses genes.
[0525] G19 (SEQ ID NoS: 3 e 5)
Informações Publicadas [0526] G19 pertence à subfamília EREBP de fatores de transcrição e contém apenas um domínio AP2. G19 corresponde ao gene RAP2.3 descrito (Okamuro e outros, (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. 94:7076-7081). Inspeção de perto das sequências de cDNA de Arabidopsis de RAP2.2 (AF003096; Okamuro e outros, (1997) supra), AtEBP (Y09942; Buttner e outros, (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. 94:59615966), e ATCADINP (Z37504) sugere que eles correspondem ao
573/726 mesmo gene (Riechmann e outros, (1998) Biol. Chem. 379:633646). G19/RAP2.3 é expresso ubiquamente (Okamuro e outros, (1997) supra). AtEBP foi isolado em virtude da interação proteina-protéina entre AtEBP e OBF4, um fator de transcrição zipper de leucina de região básica (Buttner e outros, (1997) supra). Os níveis de expressão de AtEBP nas sementeiras foram aumentados após tratamento com etileno (etefon) (Buttner e outros, (1997) supra). Foi verificado que AtEBP liga-se às sequências contendo caixa GCC, como aquelas do promotor PRB-lb (Buttner e outros, (1997) supra) . Foi sugerido que a interação entre AtEBP e OBF4 reflete acoplamento cruzado entre EREBP e fatores de transcrição bZIP que podem ser importantes para regular a expressão genética durante a resposta de defesa da planta (Buttner e outros, (1997) supra).
Observações Experimentais [0527] As plantas transgênicas nas quais G19 é expresso sob o controle do promotor 35S eram morfologicamente semelhantes às plantas de controle G19 é constitutivamente expresso nos diferentes tecidos examinados; contudo a expressão de G19 foi significativamente reprimida por jasmonato de metila (MeJ) e induzida por ACC (esse último resultado correlaciona-se ao aumento descrito anteriormente nos níveis de expressão de G19 nas sementeiras após tratamento com etileno
574/726 (etefon); Buttner e outros, (1997) supra). G19 foi significativamente induzido pelo agente patogênico de fungos Erysiphe orontii. Além disso, plantas superexpressando G19 foram mais tolerantes a infecção com uma dose moderada de Erysiphe orontii. As plantas superexpressando G19 também foram testadas quanto a sua tolerância aos dois outros agentes patogênicos, o agente patogênico de fungo necrotrófico Fusarium oxysporum e o agente patogênico bacteriano Pseudomonas syringae; não foi verificado que as plantas tivessem suscetibilidade alterada aos agentes patogênicos.
[0528] O ácido jasmônico e as vias de transdução de sinal de etileno estavam envolvidas na regulação da resposta de defesa e resposta ao enrolamento, e foi verificado que as duas vias interagem sinergisticamente. A regulação da expressão de G19 em ambos hormônios, sua indução por infecção com Erysiphe orontii, bem como os dados preliminares indicando que a tolerância aumentada àquele agente patogênico foi conferida por superexpressão de G19, sugerem que G19 desempenha um papel no controle da defesa e/ou resposta ao enrolamento. Seria de interesse testar as plantas superexpressando G19 nos experimentos de interação de inseto-planta. 0 aumento na tolerância ao Erysiphe orontii que é conferido por superexpressão de G19 pode ser testado usando outras linhagens de agente
575/726 patogênico. Também seria de interesse testar outros agentes patogênicos além do Erysiphe orontii, Fusarium oxysporum e Pseudomonas syringae.
[0529] Uma vez que G19 foi expresso em níveis significativos em um modo constitutivo, experimentos semelhantes aqueles descritos aqui podem ser realizados com plantas mutantes de nocauteamento G19 para elucidar adicionalmente a função desse gene.
Aplicações em potencial [0530] G19 ou seus equivalentes podem ser usados para manipular a resposta ao inseto ou enrolamento da planta como defesa, bem como as vias de transdução de sinal de ácido jasmônico e etileno propriamente.
[0531] G22 (SEQ ID NoS: 5 e 6)
Informações publicadas [0532] G22 foi identificado na sequência de BAC
T13E15 (gene T13E15.5) pelo The Institute of Genomic Research (TIGR) como um isólogo de fator de transcrição TINY (diminuto). G22 pertence a subfamília de EREBP e contém apenas um domínio AP2, e análise filogenética coloca o G22 relativamente próximo a outros genes da subfamília de EREBP, tais como, TINY e ATDL4400C (Riechmann e outros, (1998) Biol. Chem. 379:633-646).
Observações experimentais [0533] G22 foi constitutivamente expresso em níveis
576/726 médios. Parece não haver alteração na morfologia da planta quando da superexpressão de G22. As plantas que expressam G22 ectopicamente não foram tolerantes aos meios contendo NaCl em um ensaio de crescimento de raiz, em comparação aos controles do tipo selvagem.
Aplicações em potencial [0534] G22 ou seus equivalentes podem ser usados para aumentar a tolerância da planta à salinidade do solo durante germinação, no estágio de sementeira ou através de todo o ciclo de vida da planta. Ά tolerância ao sal é um fenótipo especificamente desejável durante o estágio de germinação em uma planta de colheita, o que impactaria a capacidade de sobrevivência e rendimento.
[0535] G28 (SEQ ID NoS: 9 e 10)
Informações publicadas [0536] G28 corresponde ao AtERFl (Número de acesso ao GenBank AB008103) (Fujimoto e outros, (2000) Plant Cell 12:393-404) . G28 se parece com o gene AT4gl7500 na sequência anotada do cromossomo 4 de Arabidopsis (AL161546.2) .
[0537] AtERFl mostrou possuir atividade de ligação a caixa GCC [foi verificado que alguns genes relacionados a defesa que foram induzidos por etileno, contêm um elemento de ação cis curta conhecido como caixa-CGG: AGCCGCC (Ohme e outros, (1990)
Plant Mol.
Biol.
15:941-946)].
Foi
577/726 verificado que usando os ensaios transientes nas folhas de Arabidopsis, AtERFl é capaz de agir como um transativador específico de sequência da caixa GCC (Fujimoto e outros, (2000) supra).
[0538] A expressão de AtERFl foi descrita para ser induzida por etileno (duas a três vezes o aumento nos níveis de transcrição de AtERFl, 12 horas após o tratamento com etileno (Fujimoto e outros, (2000) supra). No mutante ein2, a expressão de AtERFl não foi induzida por etileno, sugerindo que a indução de etileno de AtERFl é regulada sob a via de sinalização de etileno (Fujimoto e outros, (2000) supra). A expressão de AtERFl também foi induzida por enrolamento, porém não por outros estresses abióticos (tais como, frio, salinidade ou estiagem) (Fujimoto e outros, (2000) supra).
[0539] Foi sugerido que AtERFs, em geral, podem atuar como fatores de transcrição para genes sensíveis ao estresse e que a caixa GCC pode atuar como um elemento regulador de cis para tradução de sinal de estresse biótico e abiótico, além do seu papel como elemento sensível ao etileno (ERE) (Fujimoto e outros, (2000) supra), porém não existem dados disponíveis nas funções fisiológicas de AtERFl.
Observações experimentais [0540] A função de G28 foi analisada por uso de
578/726 plantas transgênicas, nas quais o gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. As linhagens superexpressando G28 não eram tolerantes a infecção com uma dose moderada do agente patogênico de fungos Erysiphe orontii. A superexpressão de G28 não parece ter efeitos prejudiciais em relação ao crescimento ou vigor da planta, uma vez que as plantas da maior parte das linhagens eram morf ologicamente do tipo selvagem. Além disso, não foi detectada diferença entre aquelas linhagens e os controles do tipo selvagem correspondentes em todos os ensaios bioquímicos que foram realizados.
[0541] G28 foi expresso de forma ubíqua.
[0542] Linhagens superexpressando G28 foram também mais tolerantes ao [0543] Sclerotinia sclerotiorum e ao Botrytis cinerea. Em um experimento de repetição usando linhagens individuais, todas as três linhagens analisadas mostraram tolerância ao S. sclerotiorum, e duas das três linhagens testadas não foram tolerantes ao B cinerea.
Aplicações em potencial [0544] As plantas transgênicas de G28 tinham uma resposta alterada aos agentes patogênicos de fungos, pelo que, aquelas plantas eram mais tolerantes aos agentes patogênicos. Portanto, G28 ou seus equivalentes podem ser usados para manipular a resposta de defesa, a fim de gerar
579/726 plantas resistentes aos agentes patogênicos.
[0545] G47 (SEQ ID N°s: 11 e 12)
Informações publicadas [0546] G47 corresponde ao gene T22J18.2 (AAC25505).
Observações experimentais [0547] Os níveis de expressão de G47 podem ser alterados por condições ambientais, especificamente com estresse por sal e tensão osmótica reduzidos.
[0548] A função de G47 foi estudada usando plantas transgênicas nas quais o gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. As plantas 35S::G47 mostraram tolerância melhorada à tensão osmótica. Em um ensaio de desenvolvimento de raiz em meios contendo PEG, as sementeiras transgênicas superexpressando G47 eram maiores e tiveram mais crescimento de raiz em comparação aos controles do tipo selvagem. Os superexpressores G47 também foram significativamente mais tolerantes à estiagem que as plantas de controle do tipo selvagem em um ensaio a base de solo.
[0549] A superexpressão de G47 também produziu um retardo substancial na época de floração e causou uma alteração marcante na arquitetura do broto. Os transformantes 35S::G47 eram pequenos nos estágios precoces e mudaram para floração mais de uma semana mais tarde que os controles do tipo selvagem (condições de luz contínuas).
580/726
As inflorescências dessas plantas pareceram mais espessas e carnudas, tinham dominância apical reduzida e exibiram alongamento do internodo reduzido conduzindo a uma estatura pequena e compacta. O padrão de ramificação dos caules também pareceu anormal, com o broto primário tornando-se torcido em cada nodo de co-florescência. Adicionalmente, as plantas mostraram fertilidade reduzida e formaram siliquas menores que nasceram em pedúnculos curtos e mantiveram-se verticalmente, em oposição próxima ao caule.
[0550] Alterações adicionais foram detectadas nos caules de inflorescência das plantas 35S::G47. As seções de caule das plantas T2-21 e T2-24 eram de diâmetro mais largo e tinham feixes vasculares irregulares maiores contendo um número muito maior de vasos de xilema que o tipo selvagem. Adicionalmente, alguns dos vasos de xilema dentro dos feixes pareceram estreitos e eram possivelmente mais dignificados que aqueles dos controles.
[0551] G47 foi expresso em níveis maiores em folhas de roseta e as transcrições foram detectadas em outros tecidos (flor, embrião, silíqua e sementeira de germinação), porém não nas raizes.
Aplicações em potencial [0552] G47 ou seus equivalentes podem ser usados para manipular época de floração, modificar a arquitetura da planta e estrutura da haste (incluindo desenvolvimento
581/726 de tecidos vasculares e teor de lignina) e para aperfeiçoar o desenvolvimento de plantas sob tensões osmóticas e condições de estiagem.
[0553] Os equivalentes de fator de transcrição que modulam o teor de lignina podem ser valiosos. Essa modulação pode permitir que a qualidade da madeira usada para móveis ou construção seja melhorada. A lignina é rica em energia; o aumento da composição de lignina é valioso no
aumento do teor de energia da madeira usada para
combustível. De modo contrário, as indústrias de polpa e
papel buscam madeiras com um teor reduzido de lignina.
Correntemente, a lignina deve ser removida em um processo caro que envolve o uso de muitas substâncias químicas poluentes. Consequentemente, a lignina é uma barreira séria para a produção eficiente de papel e polpa. Além das aplicações de biotecnologia florestal, a alteração do teor de lignina pode aumentar a palatabilidade de vários frutos e vegetais.
[0554] G226 (SEQ ID N°s: 37 e 38)
Informações publicadas [0555] G226 foi identificado da sequência BAC de Arabidopsis, AC002338, com base em sua similaridade de sequência dentro do domínio conservado para outros elementos da família Myb em Arabidopsis. Atualmente, não existem informações publicadas com relação a função desse
582/726 gene .
Observações experimentais [0556] A função do G226 foi analisada através de sua superexpressão ectópica nas plantas. Os superexpressores de G226 eram mais tolerantes ao teor baixo de nitrogênio e estresse por sal alto. Eles mostraram mais crescimento de raiz e possivelmente mais pelos na raiz sob condições de limitação de nitrogênio, em comparação aos controles do tipo selvagem. Muitas plantas eram imberbes e não possuíam produção de antocianina, quando sob estresse, tal como, condições de crescimento em baixo teor de nitrogênio e alto teor de sal. Vários superexpressores de G226 eram imberbes e produziam menos antocianina sob estresse; esses efeitos podem ser devidos a competição do sítio de ligação com outros fatores de transcrição da família Myb, envolvidos nessas funções e não diretamente relacionados à função primária desse gene.
[0557] Resultados da análise bioquímica de superexpressores de G226 sugeriram que uma linhagem possuía quantidades maiores de proteína de semente, que teriam sido resultado de absorção aumentada de nitrogênio por essas plantas.
[0558] Um experimento de microdisposições foi realizado em uma linhagem superexpressando G226 em separado. A sequência G226 propriamente foi expressa 16
583/726 vezes acima do tipo selvagem, contudo, muito pouca alteração em outra expressão genética foi observada nessa linhagem. Na disposição, uma sequência de DNA transportador de clorato/nitrato foi induzida 2,7 vezes em relação ao tipo selvagem, o que podería explicar o fenótipo das plantas tolerante ao baixo teor de nitrogênio e quantidades aumentadas de proteína de semente em uma das linhagens. A mesma sequência de DNA esteve presente várias vezes na disposição e em todos os casos, a sequência de DNA mostrou indução, aumentando a validade dos dados. Cinco outras sequências de gene/DNA induziram, porém tinha função desconhecida. Uma metiltransferase, uma proteína especifica do pólen e sequências codificando proteína de membrana peroxisomática de ligação de zinco foram também induzidas, contudo seu papel com relação ao fenótipo das plantas não é conhecido.
Tabela 16. G226 35S, supTfn de dois componentes
Linhagem Germinaçã o em alto teor de NaCl Germinação em alto teor de manitol Saca rose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Es ti agem Resfriamento Morfologia da raiz semelhante ao G682
308 wt wt ++ + wt wt wt wt wt +
309 wt wt wt wt + wt wt + +
313 wt wt ++ ++ wt + wt wt + +
584/726
316 wt wt ++ ++ wt wt wt wt wt +
318 wt wt wt ++ wt wt wt wt wt +
381 wt wt + wt wt wt wt wt wt +
383 wt wt + + wt wt wt wt wt +
583 wt wt wt + wt wt wt wt +
585 wt wt wt + wt wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0559] Os resultados desses ensaios de tolerância ao estresse abiótico indicam que G682 e os genes correlatos, tais como, G226, podem ser usados para aperfeiçoar tolerância aos estresses por estiagem e relacionados ao frio nas plantas.
[0560] As utilidades de um gene e seus equivalentes que conferem tolerâncias as condições de baixo teor de nitrogênio incluem: (1) economia para o fazendeiro reduzindo a quantidade necessária de fertilizantes; (2) benefícios ao ambiente em razão de escorrimento reduzido do fertilizante; (3) rendimento e tolerância ao estresse aumentados. Além disso, G226 pode ser usado para aumentar as quantidades de proteína na semente e/ou composição, o que pode impactar o rendimento, bem como o valor nutricional e produção de vários gêneros alimentícios.
[0561] G682 e os genes correlatos, tais como, G226, podem ser usados para alterar o número de tricomas e distribuição nas plantas. As glândulas de tricoma na
585/726 superfície de muitas plantas superiores produzem e secretam exsudados, que fornecem proteção aos elementos e pragas, tais como, insetos, micróbios e herbívoros. Esses exsudados podem imobilizar fisicamente os insetos e esporos, podendo ser inseticidas ou antimicrobianos ou eles podem ser alergenos ou irritantes de modo a proteger as plantas contra herbívoros. Também foi sugerido que os tricomas podem diminuir a transpiração por diminuição do fluxo de ar na superfície da folha e por exsudando substâncias químicas que protegem a folha do sol.
[0562] A redução no tamanho que era aparente nessas linhagens sugere que a utilidade do G226 pode ser otimizada por uso de promotores diferentes ou modificações de proteína.
[0563] G353 (SEQ ID NoS: 59 e 60)
Informações publicadas [0564] G353 foi identificado na sequência de MMN10 clone Pl, Número de acesso ao GenBank AB0154751, liberado pela Iniciativa do Genoma de Arabidopsis. G353 corresponde ao RHL41 (Kazuoka e outros, (2000) Plant J. 24:191-203) e Zatl2 (Meissner e outros, (1997) Plant Mol. Biol. 33:615624). As plantas de Arabidopsis transgênicas superexpressando o gene RHL41 mostraram uma tolerância aumentada à luz de alta intensidade e também alterações morfológicas de folhas mais espessas e verde escuro. O
586/726 parenquima paliçada foi altamente desenvolvido nas folhas de plantas transgênicas. 0 teor de antocianina, bem como o teor de clorofila também aumentaram. As plantas transgênicas de anti-sentido exibiram tolerância aumentada à alta irrigação. A proteína RHL41 pode desempenhar um papel chave na aclimatação, em resposta às alterações na intensidade da luz.
Observações experimentais [0565] G353 foi uniformemente expresso em todos os tecidos e sob todas condições testadas nos experimentos de RT-PCR. O nível mais alto de expressão foi observado nas folhas de rosetes, embriões e siliquas.
[0566] A função desse gene foi analisada usando plantas transgênicas nas quais G353 foi expresso sob o controle do promotor 35S. A superexpressão de G353 resultou na tolerância melhorada à tensão osmótica e tolerância a estiagem em um ensaio a base de solo.
[0567] A superexpressão também afetou a morfologia da flor a um grau significativo. Plantas 35S::G353 tiveram uma redução no comprimento do pedúnculo floral e siliquas apontando a jusante. Esse fenótipo era muito semelhante ao descrito para mutante de brevipedicellus (bp) (Koornneef e outros, (1983) J. Hered. 74:265-272) e na superexpressão de um gene correlato, o G354. Outras alterações morfológicas nos brotos foram também observadas nas plantas 35S::G353.
587/726
As folhas tinham peciolos curtos, eram preferivelmente planas, redondas e algumas vezes mostraram alterações de cor. Esses efeitos foram observados em graus variados na maioria dos transformantes. Plantas afetadas gravemente eram diminutas, tinham folhas contorcidas, fertilidade fraca e produziram algumas sementes. A superexpressão de G353 em Arabidopsis resultou em um aumento no glicosinolato de semente M39494 em duas linhagens de T2.
Aplicações em potencial [0568] G353 ou seus equivalentes podem ser usados para alterar a estrutura da inflorescência, o que pode ser valioso na produção de novas plantas ornamentais.
[0569] G353 ou seus equivalentes pode ser usado para alterar a resposta das plantas às condições de déficit de água e, portanto, pode ser usado para projetar plantas com tolerância melhorada a estiagem, estresse por sal e congelamento.
[0570] Aumentos ou diminuições nos glicosinolatos específicos ou teor de glicosinolato total podem ser desejáveis, dependendo da aplicação específica. Por exemplo: (1) Glicosinolatos são componentes indesejáveis de sementes oleosas usados nos alimentos para animais, uma vez que eles produzem efeitos tóxicos. Variedades de canola com teor inferior de glicosinolato foram desenvolvidas para combater esse problema; (2) Alguns glicosinolatos possuem
588/726 atividade anticâncer; assim o aumento dos níveis ou composição desses compostos pode ser de interesse do ponto de vista dos nutracêuticos; (3) Glicosinolatos fazem parte de uma defesa natural da planta contra insetos; a modificação da composição ou quantidade do glicosinolato podería, portanto, fornecer proteção aumentada contra predadores; adicionalmente, os promotores específicos de
tecido podem ser usados em colheitas comestíveis para
garantir que esses compostos acumulem-se especificamente nos tecidos, tais como, epiderme, que não são retirados para consumo humano.
[0571] G354 (SEQ ID NoS: 61 e 62)
Informações publicadas [0572] G354 foi identificado na sequência do clone BAC F12M12, Número de acesso ao GenBank AL355775, liberado pela Iniciativa de Genoma de Arabidopsis. G354 corresponde ao ZAT7 (Meissner e outros, Plant Mol. Biol. 33:615-624).
Observações experimentais [0573] Os maiores níveis de expressão de G354 foram observados em folhas de roseta, embriões e silíquas. Alguma expressão de G354 também foi observada nas flores.
[0574] A função desse gene foi analisada empregando plantas transgênicas nas quais G353 foi superexpresso sob o controle do promotor 35S. Plantas 35S::G354 tiveram uma redução no crescimento do pedúnculo da flor, e silíquas
589/726 apontando a jusante. Esse fenótipo era muito semelhante ao descrito para mutante de brevipedicellus (bp) (Koornneef e outros, (1983) J. Hered. 74:265-272) e na superexpressão de um gene correlato, o G353. Outras alterações morfológicas nos brotos foram também observadas nas plantas 35S::G354. Muitas sementeiras 25S::G354 possuíam cotilédones anormais, alongados, hipocótilos espessados e raízes curtas. A maior parte das planta TI tinham um fenótipo muito extremo, muito diminuto, e desenvolvimento suspenso, sem formação de inflorescências. As plantas TI mostrando efeitos mais moderados tinham rendimento fraco de sementes.
[0575] A superexpressão de G354 no Arabidopsis resultou em sementeiras com uma resposta à luz alterada. No escuro, as sementeiras de G354 falharam ao estiolarem-se. O fenótico foi mais grave nas sementeiras de uma linhagem onde a superexpressão do transgene resultou em cotilédones abertos reduzidos e esverdeados.
Aplicações em potencial [0576] G354 ou seus equivalentes podem ser usados para alterar a estrutura da inflorescência, o que pode ser valioso na produção de novas plantas ornamentais.
[0577] G354 modifica a resposta a luz e assim G354 ou seus equivalentes podem ser úteis para modificar o crescimento ou desenvolvimento da planta, por exemplo, fotomorfogenese em luz fraca ou aceleração do tempo de
590/726 florescimento, em resposta às várias intensidades de luz, qualidade ou duração a qual a planta não transformada não respondería de forma semelhante. Eliminação das respostas a sombra podem conduzir a densidades de plantio aumentadas com subsequente melhora do rendimento.
[0578] G481 (SEQ ID NoS: 87 e 88)
Informações publicadas [0579] G481 é um elemento do subgrupo HAP3 da família de fator de transcrição de ligação da caixa CCAAT, e é equivalente ao AtHAP3a que foi identificado por Edwards e outros, ((1998) Plant Physiol. 117:1015-1022) como um EST com homologia de sequência extensiva à levedura HAP3. Dados de Northern blot de cinco amostras de tecido diferentes, indicaram que G481 foi expresso primariamente na flor e/ou silíqua e tecido de raiz.
Observações experimentais [0580] Nós geramos agora conjuntos adicionais de linhagens 35S para G481 empregando o sistema de dois componentes. Duas bateladas de linhagens 35S de dois componentes foram obtidas (linhagens 301-320 e 741-751). A maior parte das plantas desses conjuntos TI não revelaram diferenças consistentes na morfologia em relação aos controles do tipo selvagem. Contudo, vários indivíduos foram observados como possuindo floração tardia (#305, 310, 315, 744, 748) sob condições de luz contínua.
591/726 [0581] Para confirmar o fenótipo acima, uma seleção de linhagens T2 foi examinada sob condições de luz de 24 horas; a floração tardia foi também observada naquela geração em um número significativo dessas plantas, conforme detalhado abaixo:
[0582] T2-303: 6/6 plantas tiverem floração levemente tardia (aproximadamente 2-3 dias após os controles).
[0583] T2-307: 4/6 plantas tiverem floração levemente tardia (aproximadamente 2-3 dias após os controles), 2/6 revelaram-se do tipo selvagem.
[0584] T2-309: 4/6 plantas tiverem floração levemente tardia (aproximadamente 2-3 dias após os controles), 2/6 revelaram-se do tipo selvagem.
[0585] T2-310: 6/6 plantas tiverem floração moderadamente tardia (1-2 semanas após os controles).
[0586] T2-312: 6/6 plantas tiverem floração moderadamente tardia (aproximadamente 1 semana após os controles) .
[0587] T2-741: 6/6 plantas revelaram-se do tipo
selvagem.
[0588] T2-742: 6/6 plantas revelaram-se do tipo
selvagem.
[0589] T2-744 : 6/6 plantas revelaram-se do tipo
selvagem.
592/726 [0590] Além de analisar essas linhagens de dois componentes, nós também reexaminamos algumas das linhagens 35S::G481 que nós geramos durante nossas classificações genômicas. A linhagem 3 35S::G481 foi retro-cruzada em relação ao tipo selvagem e plantas F1 foram examinadas. 18/18 dessas plantas F1 mostraram um retardo moderado no início da floração de cerca de 1-2 semanas.
[0591] Das dez linhagens de dois componentes submetidas aos ensaios fisiológicos, o que se segue mostrou uma segregação nas placas de seleção na geração de TI que era compatível com o transgene presente em um local simples: 304, 309, 312, 317, 741, 748. As linhagens 305, 315, 318, 742 mostraram segregações que eram compatíveis com inserções em múltiplos locais.
[0592] Nos ensaios fisiológicos a base de placa, foi vista uma tolerância com relação ao estresse por estiagem: quatro de dez linhagens de dois componentes testadas foram menos sensíveis no ensaio de germinação em ABA e duas dessas linhagens também revelaram tolerância ao frio em um ensaio de germinação.
[0593] Plantas superexpressando G481 mostraram ser mais tolerantes a estiagem em um ensaio a base de solo.
Tabela 17. G481 35S, supertransformação de 2componentes (supTfn)
Linha- Germi- Germinação Saca- ABA Germina- Germina Crescimen Estia Resfriamento
593/726
gem nação em alto teor de NaCl em alto teor de manitol rose ção no calor ção no frio to no calor gem
304 wt Wt wt + wt wt wt wt wt
305 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt Wt wt wt wt wt wt wt wt
312 wt wt wt + wt wt wt wt wt
315 wt wt wt + wt + wt wt wt
317 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
318 wt wt wt + wt + wt wt wt
741 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
744 wt wt wt wt wt Wt wt wt wt
748 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0594] Os resultados desses últimos estudos de superexpressão confirmam nossa conclusão anterior de que G481 e seus equivalentes são excelentes candidatos ao aperfeiçoamento da tolerância ao estresse relacionada a estiagem em espécies comerciais. Adicionalmente, os genes relacionados ao G481 também poderíam ser usados para manipular tempo de florescimento.
[0595] G482 (SEQ ID NoS: 89 e 90)
Informações publicadas [0596] G482 é um elemento do subgrupo HAP3 da família de fator de transcrição de ligação da caixa CCAAT,
594/726 e é equivalente ao AtHAP3a que foi identificado por Edwards e outros, ((1998) Plant Physiol. 117:1015-1022) como um EST com homologia de sequência em relação ao gene de levedura HAP3. Dados de Northern blot de Edwards sugerem que AtHAP3b é expresso primariamente nas raizes. Nenhuma outra informação funcional com relação a G482 encontra-se publicamente disponível.
Observações experimentais [0597] Análise RT-PCR de níveis endógenos de transcrições G482 indicaram que esse gene foi constitutivamente expresso em todos os tecidos testados. Um experimento de disposição de cDNA sustentou os dados de distribuição de tecido derivados de RT-PCR. G482 não foi induzido acima dos níveis basais em resposta a quaisquer tratamentos de tensão ambiental testados.
[0598] Nós agora geramos linhagens 35S para G482 usando o sistema de dois componentes; duas bateladas de linhagens TI (321-341 e 341-360) foram examinadas e muitas plantas mostraram uma aceleração notável do florescimento (1-2 semanas mais cedo que a do tipo selvagem) sob condições de 24 horas de luz.
[0599] O efeito do florescimento precoce foi visto em 10/20 linhagens do conjunto 321-341 (# 323, 325, 326, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336) e 7/20 linhagens do conjunto 341-360 (#341, 351, 355, 356, 357, 358, 360) .
595/726
Efeitos comparáveis na época de florescimento foram também vistos em cada uma das três populações de T2 (329, 330, 333) que foram morfologicamente examinadas. Além do florescimento acelerado, a maioria das linhagens de 35S::G482 também mostrou uma leve redução no tamanho total; de fato, várias linhagens eram muito menores (#321, 328, 331, 338, 339, 340 e #342, 344, 345, 349, 350) e não sobreviveram até a maturidade.
[0600] Todas as linhagens de dois componentes mostraram segregação nas placas de seleção na geração T2 que era compatível com o transgene presente em um local simples.
[0601] A função do G482 foi analisada através de sua superexpressão ectópica nas plantas sob o controle de um promotor 35S empregando o sistema de dois componentes.
[0602] Nos ensaios fisiologicamente com base na placa, metade das linhagens de dois componentes testadas mostrou vigor aumentado nos meios de manitol e três linhagens tiveram melhor desempenho que as do tipo selvagem no ensaio de germinação por calor.
[0603] Deve ser enfatizado que nós observamos fenótipos de tolerância relacionados ao estresse para vários outros genes relacionados ao G481, incluindo G485 e G1820. Os efeitos semelhantes vistos quando esses genes são superexpressos sugerem fortemente uma relação funcional entre
596/726 os mesmos.
Tabela 18. G482 35S, supTfn de dois componentes
Linhagem Germinação em alto teor de NaCI Germinação em alto teor de manitol Sacarose ABA Germina ção no calor Germina ção no frio Crescim ento no calor Estiagem Resfriamento
324 wt Wt wt wt wt Wt wt wt Wt
327 wt wt wt wt wt Wt wt wt wt
330 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
333 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
343 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
346 wt + wt wt wt wt + wt wt
347 wt + wt wt wt wt wt wt wt
351 wt + wt wt wt wt + wt wt
353 wt + wt wt wt wt wt wt wt
354 wt + wt wt wt wt + wt wt
Aplicações em potencial [0604] Os resultados desse estudo sustentam nossa conclusão de que G481 e os genes correlatos, incluindo G482, são excelentes candidatos ao aperfeiçoamento de tolerância relacionada a estiagem em espécies comerciais.
[0605] Adicionalmente, G482 seria útil para manipular a época de floração.
[0606] Arabidopsis G485 (SEQ ID NoS: 2009 e 2010) [0607] G485 é parálogo ao G481, e é um elemento do
597/726 subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação da caixa CCAAT. Ele foi referido como sequência 1042 do Pedido de Patente WO0216655 nos genes regulados por estresse, plantas transgênicas e processos de uso. G485 foi reportado aqui para ser sensível ao frio em uma análise de microdisposição (Harper e outros, (2002) Pedido de Patente WO 0216655-A 1042 28-FEB-2002). Nenhuma informação adicional com relação ao G485 encontra-se publicamente disponível.
[0608] Durante nosso programa de genômicos anterior, nós determinamos que plantas superexpressando G485 tinham floração acelerada, brotando em até 1 semana mais tarde que as plantas do tipo selvagem ou plantas não transformadas crescendo em luz por 24 horas. Esses estudos, combinados com os estudos correlatos em plantas não possuindo expressão de G485 implicaram no G485 como suficiente para atuar como um ativador floral, quanto também necessário naquele papel dentro da planta.
Observações experimentais [0609] O objetivo desse estudo foi de reavaliar os efeitos da superexpressão de G485 empregando um sistema de dois componentes e determinando se esse gene pode conferir tolerância ao estresse melhorada em um modo comparável ao G481.
[0610] Nós agora geramos linhagens 35S para G485
598/726 empregando o sistema de dois componentes. Essas plantas mostraram um fenótipo de floração precoce comparável aquele observado para as linhagens de fusão de promotor direta 35S em nosso programa de genômicos precedente.
[0611] Muitas das linhagens de dois componentes 35S::G485 exibiram uma aceleração marcante no início da floração e geralmente formaram botões de flor 1-2 semanas mais cedo do que o tipo selvagem sob condições de luz contínua. Muitas das linhagens também mostraram redução da biomassa da roseta em comparação ao tipo selvagem. De fato, três das vinte linhagens (308, 312, 320) mostraram um fenótipo anão e não sobreviveram a maturidade. A floração precoce foi exibida por 11/20 das linhagens TI (#301, 302, 303, 304, 306, 307, 309, 313, 315, 317, 319). As linhagens restantes revelaram-se do tipo selvagem, fora as linhagens 310 e 314, que foram observadas como sendo ligeiramente retardadas no início da floração. A linhagem 14 era também não fértil e falhou em render sementes.
[0612] A época de floração foi também avaliada em várias populações de T2:
[0613] plantas de T2-302, T2-305, T2-307, e T2-309 todas revelaram floração precoce com relação aquela vista nas linhagens parenterais. As plantas das populações T2-310 e T2-311 floresceram ao mesmo tempo que os controles.
599/726 [0614] Todas as dez linhagens de dois componentes submetidas aos ensaios fisiológicos mostraram segregação nas placas de seleção na geração T2 que era compatível com o transgene presente em um local simples.
[0615] Nos ensaios fisiológicos a base de placa, as
linhagens de dois componentes 35S::G485 não foram
tolerantes ao estresse por sal em um ensaio de germinação,
comparado as sementeiras do tipo selvagem ou não
transformadas. Várias linhagens tolerantes ao sal foram
também menos sensíveis a sacarose, ABA e tensão ao frio em ensaios de germinação separados.
Tabela 19. G485 35S, supTfn de dois componentes
Linha gem Germinação Germinação em alto teor de manitol Sacarose ABA Germina ção no calor Germina ção no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriamento
em teor NaCl alto de
302 4- wt wt + Wt wt Wt wt wt
305 + wt wt 4- wt + wt wt wt
307 + wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
310 + wt wt wt wt + wt wt wt
311 4- wt 4- wt wt + wt wt wt
316 + wt + + wt + wt wt wt
317 + wt wt wt wt wt wt wt wt
318 wt wt wt 4- wt 4- wt wt wt
600/726
319 + wt + wt wt + wt wt wt
Aplicações em potencial [0616] Com base nos resultados desses estresses abióticos, os ensaios indicam que os genes G481 e correlatos, incluindo G485, são candidatos excelentes para aperfeiçoamento da tolerância ao estresse relacionado a estiagem em espécies comerciais.
[0617] Adicionalmente, o G485 seria usado para manipular a época da floração.
[0618] G489 (SEQ ID NoS: 93 e 94)
Informações publicadas [0619] G489 foi identificado de uma sequência BAC que mostrou alta homologia de sequência em relação aos fatores de transcrição semelhantes a AtHAP5 em Arabidopsis. Durante nosso programa de genômicos precedente, nós observamos que as plantas superexpressando G489 foram tolerantes ao NaCl e manitol em ensaios de germinação separados. Morfologicamente, as plantas eram semelhantes às plantas do tipo selvagem ou não transformadas.
Observações experimentais [0620] Dois conjuntos de linhagens 35S::G489 (301— 320 e 421-440) foram gerados. As linhagens 301-320 abrigaram a construção de fusão de promotor direta 35S (P51) . A segunda batelada de plantas (421-440) superexpressou G489 via o sistema de dois componentes.
601/726
Nenhum dos dois conjuntos de plantas 35S::G489 mostrou quaisquer diferenças consistentes na morfologia dos controles do tipo selvagem.
[0621] A função do G489 foi analisada através de sua superexpressão ectópica nas plantas. Os superexpressores G489 foram mais tolerantes ao estresse por NaCl, mostrando mais crescimento de raiz e expansão da folha, em comparação aos controles na cultura. Dois modos bem caracterizados nos quais a toxicidade de NaCl é manifestada na planta é através da tensão osmótica geral e deficiente de potássio devido a inibição do seu transportes. Essas linhagens de superexpressor de G489 foram mais tolerantes à tensão osmótica no gel, mostrando mais crescimento na raiz em meios contendo manitol. Os superexpressores de G489 foram também mais tolerantes a estiagem que as plantas de controle do tipo selvagem nos ensaios a base de solo.
[0622] Análises RT-PCR dos níveis endógenos de
transcrições de G489 indicaram que esse gene foi expresso
constitutivamente em todos os tecidos testados. 0
experimento de disposição de cDNA confirmou os dados de
distribuição de tecidos derivados de RT-PCR. G489 não foi
induzido acima dos níveis basais em resposta aos
tratamentos de estresse testados.
[0623] Várias linhagens 35S::G489 derivadas de
602/726 fusões de promotor diretas foram criadas e caracterizadas morfologicamente. Essas planta não mostraram diferenças consistentes na morfologia dos controles do tipo selvagem. Conforme mostrado na tabela 20, cinco das dez linhagens superexpressando G489 testadas foram mais capazes de germinar em condições frias. As três linhagens de plantas maduras foram também mais capazes de tolerar as condições frias.
Tabela 20. G489 35S, fusão de promotor direta e supTfn de dois componentes
Linha- gem Transforma- ção Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor de manitol Saca rose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Esti agem Resfriamento
301 Fusão direta wt Wt wt wt wt wt wt wt +
302 Fusão direta wt wt wt wt wt + wt wt wt
303 Fusão direta wt wt wt Wt wt + wt wt wt
304 Fusão direta wt wt wt Wt wt wt wt + +
305 Fusão direta wt wt wt Wt wt + wt + +
603/726
308 Fusão direta wt wt wt wt wt + wt wt wt
310 Fusão direta wt wt wt Wt wt + wt wt wt
314 Fusão direta wt wt wt wt wt wt wt wt wt
316 Fusão direta wt wt wt Wt wt wt wt wt wt
317 Fusão direta wt wt wt wt wt wt wt wt wt
421 2-comp wt wt wt wt wt wt +
422 2-comp wt wt wt wt wt wt wt
423 2-comp wt wt wt wt wt wt wt
424 2-comp wt wt wt wt wt wt wt
425 2-comp wt wt wt wt wt wt wt
426 2-comp wt wt. wt wt wt wt wt
430 2-comp wt wt wt wt wt wt wt
434 2-comp wt wt wt wt wt wt wt
437 2-comp wt wt wt wt wt wt +
440 2-comp wt wt wt wt wt + wt wt
Aplicações em potencial [0624] Os resultados desse estudo reforçam nossa conclusão de que G481 e os genes correlatos, incluindo G489, são excelentes candidatos para aperfeiçoar a tolerância ao estresse relacionada a estiagem em espécies
604/726 comerciais .
[0625] G634 (SEQ ID NoS: 127 e 128)
Informações publicadas [0626] G634 foi inicialmente identificado como sequências de cDNAs parciais, públicas para GTL1 e GTL2 que são variantes de união do mesmo gene (Small e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:3318-3322) . O padrão de expressão publicado de GTL1 mostra que G634 é altamente expresso em silíquas e não expresso em folhas, caules, flores ou raízes. Não existem informações publicadas sobre a função de G634.
Genes Proximamente Relacionados de Outras Espécies [0627] O não Arabidopsis mais próximo em relação ao G634 é o gene O. sativa gt-2 (EMBO J. (1992) 11:4131-4144), que é proposto para ligar e regular o promotor phyA. Além disso, a proteína de ligação de DNA de ervilha DF1 (13786451) mostra forte homologia em relação ao G634. A homologia dessas proteínas ao G634 estende-se à parte externa dos domínios conservados e assim esses genes são prováveis de serem ortólogos do G634.
Observações experimentais [0628] Os limites de G634 foram experimentalmente determinados e uma função de G634 foi investigada por expressão constitutiva de G634 empregando o promotor CaMV 35S.
605/726 [0629] Essas construções foram realizadas para G634: P324, P1374 e P1717. Foi verificado que P324 codifica uma proteína truncada. P1374 e P1717 representam variantes de união de comprimento pleno de G634; P1374, a mais curta das duas variantes de união foi usada para os experimentos descritos aqui. O cDNA disponível mais longo (P1717), confirmado por RACE, possui o mesmo ATG e códons de parada que a sequência genômica.
[0630] As plantas superexpressando G634 da construção P1374 mostraram um aumento dramático na densidade dos tricomas, que adicionalmente parecem de tamanho maior. O aumento na densidade do tricoma foi mais claro nas folhas de roseta que surgiram mais tarde, folhas cauline, hastes de inflorescência e sépalas com os tricomas de caule sendo mais ramificados que os controles. Aproximadamente metade dos transformantes primários e duas das três linhagens de T2 mostraram o fenótipo. Fora a ligeira pequinês, não pareceu haver qualquer outro fenótipo claro associado à superexpressão de G634. Contudo, uma redução na germinação foi observada nas sementes T2 crescimento na cultura. Não está claro se esse defeito foi devido a qualidade do lote de semente testado ou se essa característica está relacionada à superexpressão do transgene.
[0631] Os dados de RT PCR mostraram que G634 é
606/726 potencial e preferivelmente expresso em flores e sementes de germinação, e induzido por auxina. 0 papel da auxina na iniciação do tricoma e desenvolvimento não foi estabelecido na literatura publicada.
[0632] O aumento na densidade de tricoma observado nos superexpressores de G634 sugeriu um possível papel para esse gene na tolerância ao estresse a estiagem, uma presunção subsequentemente confirmada nos ensaios de estiagem a base de solo. Nós testamos linhagens superexpressando G634 em um ensaio de estiagem de solo e verificamos que elas mostraram um desempenho aperfeiçoado versus o tipo selvagem; os superexpressores de G634 recuperaram dos efeitos de um tratamento de estiagem significativamente melhor que as plantas de controle do tipo selvagem. Adicionalmente, nossos experimentos de disposição recentes nas plantas sofrendo experimento de estiagem de solo indicaram que G634 mostra uma supra regulação pequena, porém significante, especialmente na fase de recuperação após nova rega.
[0633] As linhagens superexpressando G634 não exibiram um fenótipo de esquivamento de sombra quando cresceram sob deficiência de luz na região vermelha do espectro visível. Quando o ensaio foi repetido em linhagens individuais, todas as três linhagens analisadas mostraram o fenótipo e tinham hipocótilos curtos em comparação as
607/726 sementeiras do tipo selvagem. Nas placas de controle, as sementeiras da linhagem 5 eram pequenas, enquanto as linhagens 6 e 8 eram comparáveis em tamanho às sementeiras do tipo selvagem.
Aplicações em potencial [0634] As glândulas de tricoma na superfície de muitas plantas superiores produzem e secretam exsudados, que fornecem proteção aos elementos e pragas, tais como, insetos, micróbios e herbívoros. Esses exsudados podem imobilizar fisicamente os insetos e esporos, podendo ser inseticidas ou antimicrobianos ou eles podem ser alergenos ou irritantes de modo a proteger as plantas contra herbívoros. Também foi sugerido que os tricomas podem diminuir a transpiração por diminuição do fluxo de ar na superfície da folha e por exsudarem substâncias químicas que protegem a folha do sol.
[0635] Dependendo da espécie da planta, quantidades variadas de diversas substâncias bioquímicas secundárias (freqüentemente terpenos lipofílicos) são produzidas e exsudadas ou volatilizadas por tricomas. Essas substâncias bioquímicas secundárias, exóticas, que são relativamente fáceis de serem extraídas, porque estão na superfície da folha, têm sido amplamente usadas em produtos, tais como, aromatizantes, medicamentos, pesticidas e cosméticos. Uma classe de metabolitos secundários, os diterpenos, pode
608/726 afetar vários sistemas biológicos, tais como, progressão de tumor, síntese de prostaglandina e inflamação do tecido. Além disso, os diterpenos podem atuar como feromonas para insetos, alomonas para cupins e podem exibir atividades neurotóxicas, citotóxicas e antimicóticas. Como resultado dessa diversidade funcional, os diterpenos têm sido alvo de várias especulações farmacêuticas. Na maioria dos casos, onde as vias metabólicas são impossíveis de serem projetadas, o aumento na densidade do tricoma ou tamanho nas folhas pode ser o único modo de aumentar a produtividade da planta.
[0636] Assim, o uso de G634 e seus equivalentes para aumentar a densidade, tamanho ou tipo do tricoma pode, portanto, ter utilidade profunda nas assim chamadas práticas de agricultura molecular (isto é, o uso de tricomas como um sistema de fabricação para metabolitos secundários complexos) e na produção de plantas resistentes aos insetos e herbívoros.
[0637] De significação específica, G634 e seus equivalentes podem também ser usados para aumentar a tolerância das plantas à tensão osmótica, tolerância a estiagem e sombra.
[0638] G682 (SEQ ID NoS: 147 e 148)
Informações publicadas [0639] G682 foi identificado de Arabidopsis BAC,
609/726
AF007269, com base na similaridade da sequência aos outros elementos da família Myb dentro do domínio conservado.
Observações experimentais [0640] A análise RT-PCR dos níveis endógenos das transcrições de G682 indicaram que esse gene foi expresso em todos os tecidos testados, contudo, um nível muito baixo de transcrições foi detectado nas raízes e brotos. Os dados de impressão do tecido de disposição indicaram que G682 foi expresso primária, porém não exclusivamente, no tecido da flor.
[0641] Um experimento de disposição foi realizado em uma linha superexpressando G682. Os dados desse experimento indicaram que esse gene seria um regulador negativo do desenvolvimento do cloroplasto e/ou desenvolvimento dependente de luz, em razão do gene Albino3 e muitos genes de cloroplasto são reprimidos. O Albino3 funciona para regular o desenvolvimento do cloroplasto (Sundberg e outros (1997/ Plant Cell 9:717-730). O gene G682 foi propriamente induzido vinte vezes. Pouco mais que poucos fatores de transcrição adicionais, muito poucos
genes são induzidos como resultado da expressão ectópica de
G682.
[0642] A função de G682 foi analisada através de
sua superexpressão ectópica nas plantas. Os
superexpressores de G682 eram imberbes, tinham mais tufos
610/726 de pelos na raiz e germinaram melhor sob condições de estresse ao calor. Plantas velhas não foram mais tolerantes ao estresse por calor em comparação aos controles do tipo selvagem. Na época em que esses experimentos foram realizados, foi sugerido que experimentos adicionais seriam necessários para discernir se ou não o fenótipo de germinação em calor dos superexpressores de G682 estava relacionado a tolerância ao estresse por falta de água na sementeira germinando e correlacionado ao possível fenótipo de tolerância a estiagem. Experimentos mais recentes mostraram que os superexpressores de G682 não foram tolerantes as condições de privação de água nos ensaios de estiagem a base de solo que as plantas do tipo selvagem e duas das três linhagens testadas foram significativamente mais tolerantes a estiagem que os controles do tipo selvagem.
[0643] Além da adição às sequências parálogas reveladas acima, as sequências ortólogas de outras espécies de plantas foram também identificadas usando análise BLAST. Tais sequências ortólogas em combinação com as sequências parálogas foram determinadas para serem elementos da família G682 TF de proteínas relacionadas a Myb (equivalentes). As sequências parálogas e ortólogas foram alinhadas empregando software MACVECOR (Accelrys, Inc.). O programa de software também gerou uma sequência de resíduo
611/726 de aminoácido de consenso exemplar de sequências alinhadas.
[0644] Conforme mostrado nas Figuras 3A e 3B, as sequências ortólogas compartilharam uma sequência de consenso com o domínio conservado de G682 (resíduos de aminoácido 27-63 da SEQ ID N°:148) e também compartilharam identidade com regiões flanqueando o domínio conservado (regiões de flanqueamento). Especificamente, G682 compartilhou uma região de domínio conservado com as sequências da soja {Glycine max; SEQ ID NoS: 1084, 1085, 1086, 1083, 1087 e 1088), arroz {Oryza sativa; SEQ ID NoS: 559, 1082, e 1081), e milho {Zea mays; SEQ ID NoS: 1089 e 1090) .
[0645] Um consenso exemplar de domínio conservado da família G682 TF de proteínas relacionadas a Myb é ValXaa-Met/Phe-Ser/Thr-Gln/Glu-Xaa-Glu-Glu-Asp-Leu-Val-XaaArg-Met-His/Tyr-Lys/Arg-Leu-Val-Gly-Asp/Glu-Arg/Lys-TrpGlu/Asp-Leu/Ile-Ile-Ala-Gly-Arg-Ile/Val-Pro-Gly-Arg, onde Xaa é qualquer resíduo de aminoácido. Um consenso exemplar alternativo do domínio conservado é Val-Xaa-Met/PheSer/Thr-Gln/Glu-Xaa-Glu-Glu-Asp-Leu-Val-Ser-Arg-Met-HisArg-Leu-Val-Gly-Asn-Arg-Trp-Glu-Leu-Ile-Ala-Gly-Arg-IleXaa-Gly-Arg, onde Xaa é qualquer resíduo de aminoácido. Um consenso exemplar alternativo do domínio conservado é ValXaa-Met/Phe-Ser/Thr-Gln/Glu-Xaa-Glu-Glu-Asp-Leu-Val-SerArg-Met-Tyr-Xaa-Leu-Val-Gly-Asn/Glu-Arg-Trp-Ser-Leu-Ile612/726
Ala-Gly-Arg-Ile-Pro-Gly-Arg, onde Xaa é qualquer resíduo de aminoácido.
Aplicações em potencial [0646] A utilidade em potencial desse gene ou seus equivalentes é conferir tolerância ao calor às sementes germinando.
[0647] G682 e seus equivalentes seriam usados para alterar o número de tricomas e distribuição nas plantas. As glândulas de tricoma na superfície de muitas plantas superiores produzem e secretam exsudados, que fornecem proteção aos elementos e pragas, tais como, insetos, micróbios e herbívoros. Esses exsudados podem imobilizar fisicamente os insetos e esporos, podendo ser inseticidas ou antimicrobianos ou eles podem ser alergenos ou irritantes de modo a proteger as plantas contra herbívoros. Também foi sugerido que os tricomas podem diminuir a transpiração por diminuição do fluxo de ar na superfície da folha e por exsudação de substâncias químicas que protegem a folha do sol.
[0648] G864 (SEQ ID NoS: 167 e 168)
Informações publicadas [0649] G864 foi identificado no Arabidopsis EST (H37693). G864 aparece como gene AT4g23750 na sequência anotada do cromossoma 4 de Arabidopsis (AL161560).
Observações experimentais
613/726 [0650] G864 foi descoberto e inicialmente identificado como um Arabidopsis EST público. G864 foi ubiquamente expresso e não foi significativamente induzido sob quaisquer das condições testadas.
[0651] A sequência completa de G864 foi determinada e foi verificado que G864 estava relacionado aos genes adicionais Arabidopsis AP2/EREBP, G1421 e G1755. A função de G864 foi analisada empregando plantas transgênicas nas quais esse gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. Plantas superexpressando G864 exibiram uma variedade de alterações fenotipicas. Elas eram menores que as plantas do tipo selvagem e aquelas com fenótipos mais fortes foram classificadas como anãs. Contudo as linhagens superexpressando o G864 foram também algo mais sensíveis ao resfriamento. Uma das três linhagens T2 analisada mostrou aumento significativo nos níveis de fucose e arabionose nas folhas.
[0652] Nos ensaios a base de solo, as plantas superexpressando G864 foram significativamente mais tolerantes a estiagem que as plantas de controle do tipo selvagem.
Aplicações em potencial [0653] A germinação dessas colheitas é muito sensível à temperatura. Um gene que melhoraria a germinação em condições de calor, tal como G8 64 ou seus equivalentes
614/726 seria útil para colheitas que são plantadas mais tarde na estação ou em climas quentes. G864 e seus equivalentes podem também ser usados para aperfeiçoar a tolerância a estiagem ou outra tolerância a tensão osmótica das plantas.
[0654] G867 (SEQ ID N°s: 169 e 170)
Informações publicadas [0655] G867 corresponde ao RAV1 (Kagaya e outros (1999) Nucleic Acids Res. 27: 470-478). G867/RAV1 pertence a um subgrupo pequeno dentro da família de AP2/EREBP dos fatores de transcrição, cuja característica de distinção é que seus elementos contêm um segundo domínio de ligação de DNA, além do domínio conservado AP2, que está relacionado ao domínio B3 de VP1/ABI3 (Kagaya e outros (1999) supra). Foi demonstrado que os dois domínios de ligação de DNA de RAV1 podem reconhecer, separadamente, cada um dos dois motivos que constituem uma sequência de ligação bipartiste e em conjunto e cooperativamente melhoram sua afinidade de ligação de DNA e especificidade (Kagaya e outros (1999) supra) .
Observações experimentais [0656] G867 foi descoberto e inicialmente identificado como um Arabidopsis EST. público. G867 parece ser constitutivamente expresso em níveis médios.
[0657] G867 foi primeiro caracterizado empregando uma linhagem que continha uma inserção de DNA-T no gene. A
615/726 inserção naquela linhagem residiu imediatamente a jusante do domínio AP2 conservado, e portanto, seria esperado que resultasse em uma mutação grave ou nula. As plantas mutantes nocauteadas com G867 não mostraram alterações significativas na morfologia total da planta, diferenças significantes entre essas plantas e as plantas de controle não foram detectadas em qualquer um dos ensaios que foram realizados até agora.
[0658] Subsequentemente, a função de G867 foi analisada empregando plantas transgênicas nas quais esse gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. As linhagens superexpressando G867 eram morfologicamente do tipo selvagem e nenhuma alteração fenotipica nas linhagens superexpressando G867 foi detectada nos ensaios bioquímicos que foram realizados. Contudo, as linhagens superexpressando G867 mostraram vigor de sementeira crescente (manifestado por expansão aumentada dos cotilédones) nos ensaios de germinação em ambos meios contendo teor de sal e sacarose altos, em comparação aos controles do tipo selvagem.
[0659] Os parálogos G1930 de Arabidopsis (SEQ ID N°: 369) e G9 (SEQ ID N°: 1949) também mostraram fenótipos relacionados a tensão. G9 exibiu biomassa de raiz aumentada e assim seria usado para produzir melhor crescimento de planta sob condições osmóticas adversas. Evidências
616/726 genéticas e fisiológicas indicam que as raízes submetidas aos vários estresses, incluindo déficit de água, alteram a exportação de compostos específicos, tais como ACC e ABA, para o broto, através do xilema, Bradford e outros (1980) Plant Physiol. 65: 322-326; Schurr e outros (1992) Plant Cell Environ. 15, 561-567).
[0660] Plantas G1930 responderam ao alto teor de NaCl e sacarose em placas com mais vigor de sementeira e biomassa de raiz em comparação as plantas de controle do tipo selvagem; esse fenótipo era idêntico aquele das plantas de controle do tipo selvagem; esse fenótipo era idêntico aquele nas linhagens 35S::G867. Esses resultados indicam um envolvimento geral dessa classe nas respostas de estresse abiótico:
[0661] As sequências de polipeptideo de G1930 e G9 compartilham 72% (resíduos 249/345) e 64% (resíduos 233/364) com G867, respectivamente. Os domínios conservados de G1930 e G9 são 86% (resíduos 56/65) e 86% (resíduo 56/65) idênticos ao domínio conservado de G867, respectivamente.
[0662] Além das sequências parálogas reveladas acima, as sequências ortólogas de outras espécies de planta foram também identificadas empregando análise BLAST. Tais sequências ortólogas, em conjunto com as sequências parálogas, foram determinadas como sendo os elementos da
617/726 família G867 TF de proteínas AP2 (equivalentes) . As sequências parálogas e as sequências ortólogas foram alinhadas empregando software MACVETOR (Accelrys, Inc.). O programa de software também gerou uma sequência de resíduo de aminoácido de consenso exemplar das sequências alinhadas.
[0663] Conforme mostrado nas Figuras 4A, 4B, 4C e 4D, as sequências ortólogas compartilharam uma sequência de consenso com o domínio conservado de G867 (resíduos de aminoácido 59-116 da SEQ ID N°:170) e também compartilham identidade com as regiões flanqueando o domínio conservado (regiões de flanqueamento). Especificamente, G867 compartilhou uma região de domínio conservado com as sequências da soja {Glycine max; SEQ
ID NoS: 1184, 1183 e 1182), arroz {Oryza sativa; SEQ ID NoS: 1176, 1177 e 1178), e milho {Zea mays; SEQ ID NoS: 1186 e 1185).
[0664] Um consenso exemplar do domínio conservado da família G867 TF das proteínas AP é Ser-Ser-Lys/ArgTyr/Phe-Gly-Val-Val-Pro-Gln-Pro-Asn-Gly-Arg-Typ-Gly-AlaGln-Ile-Tyr-Glu-Lys/Arg-His-Gln-Arg-Val-Trp-Leu-Gly-ThrPhe-Xaa-Glu/Asp-Glu-Glu/Asp-Glu/Asp-Ala-Ala/Val-ArgAla/Ser-Tyr-Asp-Val/Ile-Ala/Val-Val/Ala-Xaa-Arg-Phe/TyrArg-Arg/Gly-Arg-Asp-Ala-Val-Thr/Val-Asn-Phe-Lys/Arg, onde Xaa é um resíduo de aminoácido. Um consenso exemplar
618/726 alternativo do domínio conservado é Ser-Ser-Lys/ArgTyr/Phe-Gly-Val-Val-Pro-Gln-Pro-Asn-Gly-Arg-Typ-Gly-AlaGln-Ile-Tyr-Glu-Lys/Arg-His-Gln-Arg-Val-Trp-Leu-Gly-ThrPhe-Xaa-Glu/Asp-Glu-Glu/Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Ala-Tyr-AspVal/Ile-Ala/Val-Val/Ala-Xaa-Arg-Phe/Tyr-Arg-Arg/Gly-ArgAsp-Ala-Val-Thr/Val-Asn, onde Xaa é um resíduo de aminoácido. Um consenso exemplar alternativo adicional do domínio conservado é Ser-Ser-Lys/Arg-Tyr/Phe-Gly-Val-ValPro-Gln-Pro-Asn-Gly-Arg-Typ-Gly-Ala-Gln-Ile-Tyr-GluLys/Arg-His-Gln-Arg-Val-Trp-Leu-Gly-Thr-Phe-Xaa-Gly-GluAla/Asp-Glu/Asp-Ala-Ala/Val-Arg-Ala-Tyr-Asp-Val-Ala-AlaGln-Arg-Phe/Tyr-Arg-Arg/Gly-Arg-Asp-Ala-Val-Thr/Val-AsnPhe-Arg, onde Xaa é qualquer resíduo de aminoácido.
Aplicações em potencial [0665] G867 ou seus equivalentes seriam usados para aumentar ou facilitar a germinação de sementes e crescimento de sementeira sob condições ambientais adversas, especificamente estresse por sal.
[0666] G867 ou seus equivalentes podem também ser usados para modificar a sensibilidade ao açúcar.
[0667] G912 (SEQ ID NoS: 185 e 186)
Informações publicadas [0668] G912 foi identificado na sequência do clone
PI MSG15 (Número de acesso ao GenBank AB015478; gene MSG15.6).
619/726
Observações experimentais [0669] G912 foi reconhecido como o gene AP2/EREBP mais proximamente relacionado ao CBF1, CBF2 e CBF3 de Arabidopsis (Stockinger e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:1035-1040; Gilmour e outros (1998) Plant J.16:433-442) . De fato, o G912 é o único outro fator de transcrição AP2/EREBP para o qual a similaridade da sequência com CBF1, CBF 2 e CBF3 estende-se além do domínio AP2 conservado.
[0670] A função de G912 foi estudada empregando plantas transgênicas nas quais esse gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. As plantas superexpressando G912 foram mais tolerantes ao congelamento e estiagem que os controles do tipo selvagem, porém eram também pequenas, verde escuro e tiveram florescência tardia. Houve uma correlação positiva entre o grau de prejuízo de crescimento e tolerância ao congelamento. Além disso, a expressão do G912 pareceu ser induzida por estresse ao frio, estiagem e tensão osmótica.
[0671] Além disso, as plantas superexpressando G912 também exibiram um fenótipo sensível ao açúcar: vigor de sementeira reduzido e expansão de cotilédone mediante germinação nos meios com alto teor de glicose.
[0672] Esses resultados espelham o corpo de trabalho extensivo que demostrou que CBF1, CBF2 e CBF3
620/726 estão envolvidos no controle da resposta de baixa temperatura em Arabidopsis, e que aqueles genes podem ser usados para aperfeiçoar o congelamento, estiagem e tolerância ao sal nas plantas (Stockinger e outros, (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:1035-1040; Gilmour e outros (1998) Plant J.16:433-442; Jaglo-Ottosen e outros (1998) Science. 280:104-106; Liu e outros (1998) Plant Cell. 10:1391-1406, Kasuga e outros (1999) Nat. Biotechnol. 17:287-291) .
[0673] As sequências de polipeptideo de G40, G41, e G42 compartilham 71% (140 de 195 resíduos), 68% (144 de 211 resíduos), e 65% (147 de 224 resíduos) de identidade com G912, respectivamente. Os domínios conservados de G40, G41, e G42 compartilham 94% (64 de 68 resíduos), 92% (63 de 68 resíduos), e 94% (64 de 68 resíduos) de identidade com G912, respectivamente.
[0674] Além das sequências parálogas reveladas acima, sequências ortólogas de outras espécies de planta foram também identificadas empregando análise BLAST. Tais sequências ortólogas, em conjunto com as sequências parálogas foram determinadas como sendo elementos da família G912 TF das proteínas AP2/EREBP (equivalentes). As sequências parálogas e as sequências ortólogas foram alinhadas empregando software MACVECTOR (Accelrys, Inc.). O programa de software também gerou sequência de resíduo de
621/726 aminoácido de consenso exemplar das sequências alinhadas.
[0675] Conforme mostrado nas Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, e 5F, as sequências ortólogas compartilharam uma sequência de consenso com o domínio conservado de G912 (sequências de aminoácido 51-118 da SEQ ID N°: 186) e também compartilharam de identidade com regiões flanqueando o domínio conservado (regiões de flanqueamento). Especificamente, G912 compartilharam uma região do domínio conservado com sequências de soja {Glycine max; SEQ ID NoS:
1238, 1242, 1240, 1241, e 1243), arroz (Oryza sativa; SEQ
ID No£ 1222 , 1223, 1232, 1221, 1231, 1227, 1235, 1230,
1229, e 1228 ) , e milho {Zea mays; SEQ ID NoS: 1246, 1247,
1244, e 1245) •
[ )0676] Um consenso exemplar do domínio conservado
da família G912 TF das proteínas AP2/EREBP é His-ProIle/Val-Tyr/Phe-Arg/Lys-Gly-Val-Arg-Gln/Arg-Arg-Gly/AsnXaa (i-3) -Lys/Arg-Trp-Val-Cys/Ser-Glu-Val/Leu-Arg-Glu/ValPro-Asn-Lys-Xaa (2) -Arg-Ile/Leu-Trp-Leu-Gly-Thr-Phe/TyrXaa (2) -Ala/Pro-Glu-Met-Ala-Ala-Arg-Ala-His-Asp-Val-AlaAla/Met-Leu/Met-Ala-Leu-Arg-Gly-Xaa d-8) -Ala-Cys-Leu-AsnPhe-Ala-Asp-Ser-Xaa (i_5)-Val/Ile-Pro/Asp, onde Xaa é qualquer resíduo de aminoácido. Um consenso exemplar alternativo do domínio conservado é His-Pro-Ile/ValTyr/Phe-Arg/Lys-Gly-Val-Arg-Xaa-Arg-Gly/Asn-Xaa (i-3) Lys/Arg-Trp-Val-Cys/Ser-Glu-Val/Leu-Arg-Glu/Val-Pro-Xaa d
622/726
5) -Arg-Ile/Leu/Phe-Trp-Leu-Gly-Thr-Phe/Tyr-Xaa (2)-Ala/ProGlu-Xaa-Ala-Ala-Arg-Ala-His-Asp-Val-Ala-Ala/Met-Leu/MetAla-Leu-Arg-Gly-Xaa (i_8) -Ala-Cys/Ser-Leu-Asn-Phe-Ala-AspSer-Xaa(i_5)-Val/Ile-Pro/Asp, onde Xaa é qualquer resíduo de aminoácido.
[0677] Uma sequência de consenso da região de flanqueamento exemplar da família G912 TF das proteínas AP2/EREBP é Pro-Lys-Xaa-Xaa-Ala-Gly-Arg (aminoácidos 37-43 da SEQ ID N°: 186), ou Ala-Gly-Arg-Xaa-Lys-Phe (aminoácidos 41-46 da SEQ ID N°: 186) ou Glu-Thr-Arg-His-Pro (aminoácidos 48-52 of SEQ ID N°: 186), onde Xaa é qualquer resíduo de aminoácido.
Aplicações em potencial [0678] G912 ou seus equivalentes poderia ser usado para aperfeiçoar a tolerância da planta ao estresse por resfriamento, congelamento, estiagem e sal. Além disso, G912 ou seus equivalentes seriam suados para alterar a época de floração da planta e tamanho.
[0679] G913 (SEQ ID NoS: 187 e 188)
Informações publicadas [0680] G913 foi identificado na sequência de clone
MSG15; ele corresponde ao gene MSG15.10 (GenBank PID BAB11050).
Observações experimentais [0681] A sequência de cDNA de G913 foi determinada.
623/726
Para investigar a(s) função (oes) de G913, esse gene foi expresso sob o controle do promotor 35S nas plantas transgênicas. Plantas superexpressando o G913 tinham folhas verde escuro que ocasionalmente enrolaram a jusante. Essas plantas mostraram um retardo na floração e tiveram senescência tardia. Linhagens superexpressando G913 eram mais tolerantes ao congelamento e mais tolerantes a estiagem que os controles do tipo selvagem.
[0682] Em um ensaio de sensibilidade ao etileno onde as plantas foram testadas quanto ao fenótipo de resposta tripla nas placas contendo ACC, as plantas superexpressando o G913 mostraram interrupção no crescimento e enrolamento na região do hipocótilo que era mais exagerado que na resposta tripla de plantas do tipo selvagem.
Aplicações em potencial [0683] G913 ou seus equivalentes poderíam ser usados para aperfeiçoar a tolerância das plantas ao congelamento e estiagem. G913 também poderia ser usado para manipular a resposta ao etileno.
[0684] G913 ou seus equivalentes pode ser usado para retardar a floração ou senescência nas plantas. Desenvolvimento vegetativo extensivo traria grandes aumentos nos rendimentos.
[0685] Adicionalmente, uma questão maior é o escape
624/726 de pólen transgênico de GMOs para espécies selvagens ou colheitas orgânicas assim denominadas. Os sistemas que impedem colheitas transgênicas vegetativas do florescimento eliminariam essa preocupação.
[0686] G922 (SEQ ID NoS: 189 e 190)
Informações publicadas [0687] G922 corresponde ao 3 (SCL3) semelhante a Scarecrow foi primeiro descrito por Pysh e outros (Número de acesso ao GenBank AF036301; (1999) Plant J. 18:111-119). Os resultados da análise Northern blot mostraram que G922 é expresso nas siliquas, raízes e a uma menor extensão no tecido do broto em sementeiras com 14 dias de vida. Pysh e outros não testaram quaisquer outros tecidos quanto a expressão de G922. Os resultados de hibridização in situ mostraram que G922 foi expresso predominantemente na endoderme do tecido de raiz. Esse padrão de expressão era muito semelhante aquele de SCARECROW (SCR), G306. Evidência experimental indicou que a co-localização da expressão não se deve à hibridização cruzada da sonda de G922 com G306. Pysh e outros propuseram que G922 pode desempenhar um papel na especificação da célula epidérmica e que G922 pode tanto regular quanto ser regulado por G306.
[0688] A sequência para G922 pode também se encontrada no clone F11F12 BAC anotado do cromossoma 1 (Número de acesso ao GenBank AC012561). A sequência para
625/726
F11F12 foi submetida ao GenBank pelo DNA Sequencing and
Technology Center na Universidade de Stanford.
Observações experimentais
[0689] A função desse gene foi analisada
empregando-se plantas transgênicas nas quais G922 foi
expresso sob o controle do promotor 35S. As plantas
transgênicas superexpressando G922 eram mais tolerantes ao sal que as plantas do tipo selvagem, conforme determinado pelo ensaio de crescimento da raiz em meios MS suplementados com 150 mM NaCl. As plantas superexpressando G922 eram também mais tolerantes à tensão osmótica, conforme determinado pelos ensaios de germinação em meios contendo sal (150 mM NaCl) e contendo sacarose (9,4%). Morfologicamente, as plantas superexpressando G922 tinham morfologia de planta alterada, coloração, fertilidade e tamanho de planta total. Nas plantas do tipo selvagem, a expressão de G922 foi induzida por auxina, ABA, tratamentos térmicos e de estiagem. Nas plantas selvagens do tipo não induzido, G922 foi expresso constitutivamente em níveis baixos.
[0690] Os ensaios de sal alto sugeriram que esse
gene conferiría tolerância a estiagem, uma suposição
confirmada por ensaios a base de solo, nos quais as plantas
superexpressando G922 eram significativamente mais saudáveis após o tratamento com privação de água que as
626/726 plantas de controle do tipo selvagem.
Aplicações em potencial [0691] Os resultados de base observados nas plantas superexpressando G922 ou seus equivalentes poderíam ser usados para alterar tolerância ao sal, tolerância a tensão osmótica e estresse por estiagem e morfologia da folha em outras espécies de planta.
[0692] G926 (SEQ ID NoS: 191 e 192)
Informações publicadas [0693] G926 é equivalente ao Hap2a (Y13720), um elemento da família do fator de transcrição de ligação da caixa CCAAT. O gene foi identificado por Edwards e outros ((1998) Plant Physiol. 117: 1015-1022), que demonstrou que G926 ou AtHap2a foram capazes de complementar funcionalmente um mutante deficiente de Hap2 de levedura, sugerindo que existe uma conservação funcional entre essas proteínas de diversos organismos. Além disso, o gene AtHap2a mostrou ser ubiquamente expresso em Arabidopsis.
Observações experimentais [0694] Consistente com o padrão de expressão publicado (Edwards e outros (1998) Plant Physiol. 117: 1015-1022), G926 foi determinado como sendo ubiquamente expresso e os níveis de transcrição pareceram não ser alterados por qualquer condição testada, relacionada ao estresse ambiental. Uma linhagem homozigota para uma
627/726 inserção de T-DNA em G926 foi usada para determinar a função desse gene.
[0695] A linhagem mutante de nocauteamento de G926 era morfologicamente do tipo selvagem. Análise fisiológica revelou que na ausência presumida da função de G926, as plantas tornaram-se mais tolerantes às condições osmóticas altas durante a germinação. Essa tolerância a tensão osmótica podería estar relacionada a insensibilidade aparente das plantas ao hormônio de crescimento ABA. Esse foi o segundo momento onde um elemento de um complexo de proteína de caixa CCAAT alterou a resposta a tensão osmótica e sensibilidade ao ABA durante germinação.
[0696] ABA desempenha um papel regulador importante na iniciação e manutenção da dormência da semente. LopezMolina, L. e outros, ((2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 4782-4787) descreveram um fator de transcrição bZIP, ABI5, que está envolvido na manutenção das sementes em um estado quiescente, impedindo a germinação sob condições adversas, tais como, estresse por estiagem. É possível também que G926 funcione como parte desse ponto de referência para a germinação das sementes e a perda de função de G926 promova a germinação independente do estado osmótico do ambiente.
Aplicações em potencial [0697] G926 ou seus equivalentes seria usado para aperfeiçoar a tolerância da planta aos estresses por
628/726 estiagem e sal.
[0698] A evaporação da superfície do solo causa movimento a montante de água e acúmulo de sal na camada de solo superior onde as sementes são colocadas. Assim, a germinação normalmente acontece em uma concentração de sal muito maior que a concentração média de sal no perfil integral do solo. A tolerância ao sal aumentada, durante o estágio de germinação de uma planta de colheita impactaria a capacidade de sobrevivência e rendimento.
[0699] G975 (SEQ ID NoS: 199 e 200)
Informações publicadas [0700] G975 apareceu nas sequências liberadas pela
Iniciativa de Genoma de Arabidopsis (BAC F9L1, número de acesso ao GenBank AC007591).
Observações experimentais [0701] G975 foi expresso em flores, em níveis baixos, nos brotos, folhas e silíquas. Análise GC-FID e GCMS das folhas de plantas superexpressando G975 mostrou que os níveis dos alcanos C29, C31 e C33 foram substancialmente aumentados (até dez vezes) em comparação as plantas de controle. Um número de compostos adicionais de peso molecular semelhante, presumivelmente também componentes de cera, também acumularam níveis significativamente altos nas plantas superexpressando o G975. Alcanos C29 constituíram perto de 50% do teor de cera nas plantas do tipo selvagem
629/726 (Millar e outros, (1998) Plant Cell 11:1889-1902), sugerindo que um aumento maior no teor de cera total ocorreu nas plantas transgênicas G975. Contudo, as plantas transgênicas tinham um fenótipo quase normal (embora algumas diferenças morfológicas tivessem sido detectadas na aparência da folha) indicando que a superexpressão de G975 não foi prejudicial à planta. A superexpressão de G975 não causou as alterações dramáticas na morfologia da folha que foram reportadas nas plantas Arabidopsis nas quais o gene FATTY ACID ELONGATION1 (ALONAGMENTO DO ÁCIDO GRAXO1) foi superexpresso (Millar e outros, 1998, Plant Cell 11:18891902). G975 pode regular a expressão de alguns dos genes envolvidos no metabolismo da cera. Uma sequência de [0702] Arabidopsis AP2 (G1387) que está significativamente mais proximamente relacionada ao G975 que o restante dos elementos da família AP2/EREBP foi prevista como possuindo função e uso relacionados aqueles do G975.
[0703] As plantas superexpressando o G975 foram significativamente mais tolerantes a estiagem que as plantas de controle do tipo selvagem nos ensaios de estiagem a base de solo.
Aplicações em potencial [0704] G975 ou seus equivalentes podem ser usados para manipular a composição da cera, quantidade ou
630/726 distribuição, o que, por sua vez, pode modificar a tolerância da planta à estiagem e/ou baixa umidade ou resistência aos insetos, bem como aparência da planta (folhas brilhantes).
[0705] G975 ou seus equivalentes podem também ser usados para alterar, especificamente, a composição da cera, quantidade ou distribuição naquelas plantas e colheitas das quais a cera é um produto valioso.
[0706] G993 (SEQ ID NoS: 2071 e 2072) [0707] G993 é um parálogo putativo do G867. Nenhuma análise genética do local foi publicada.
[0708] Durante nosso programa genômicos precedente, nós observamos que as linhagens superexpressando G993 exibiram várias anormalidades morfológicas. O objetivo desse estudo era o de reavaliar os transformantes 35S::G933 (usando um número maior de linhagens) e determinar se a superexpressão do gene conferiría tolerância ao estresse melhorada de modo comparável ao G867.
[0709] Novas linhagens de superexpressão foram obtidas usando uma construção de fusão de promotor direta. Essas linhagens exibiram fenótipos semelhantes aqueles observados durante nossos estudos genômicos de fase I e eram geralmente menores, de desenvolvimento lento e fracamente férteis. Algumas linhagens também mostraram aspectos que sugeriram uma interrupção no desenvolvimento
631/726 regulado pela luz, tais como, hipocótilos longos e alterações na orientação das folhas.
[0710] Nós testamos dez das linhagens de fusão direta 35S::G933 de acordo com uma variedade de tratamentos a base de placa. Oito dessas linhagens supra desempenharam controles em um ou mais ensaios de estresse com base em placa incluindo germinação em sal, germinação em sacarose, germinação no frio ou crescimento sob condições de resfriamento. De modo interessante, duas linhagens 35S::G933 mostraram um aumento dramático na densidade de pelos na raiz quando cresceram em placas MS regulares (esse fenótipo era comparável aquele observado nas linhagens 35S::G9 durante nosso programa genômicos fase I). De modo interessante, assim, as duas linhagens que exibiram aumento no desenvolvimento de pelos na raiz não mostraram um resultado positivo nos ensaios em estresse. Deve ser enfatizado que nós obtivemos efeitos de desenvolvimento comparáveis, bem como forte melhora da tolerância ao estresse relacionado a estiagem em todos os quatro genes de Arabidopsis no grupo de estudo de G867 (G9, G867, G993 e G1930). Os efeitos fenotipicos quase idênticos produzidos por esses genes sugeriram fortemente que eles eram funcionalmente equivalentes.
Tabela 21. G993 35S, Fusão de promotor direta
Linha- Germina- Germina- Saca- ABA Germi- Germina- Crescime Estia- Res-
632/726
gem ção em alto teor de NaCI ção em alto teor de manitol rose nação no calor ção no frio nto no calor gem f riamento
321 + wt Wt wt wt wt Wt wt +
322 wt wt + wt wt + Wt wt +
324 wt wt wt wt wt wt wt wt +
326 + wt wt wt wt wt wt wt +
330 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
331 + wt + wt wt wt wt wt +
334 -l- wt ++ wt wt ++ wt wt wt
335 + wt ++ wt wt + wt wt wt
337 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
340 + wt + wt wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0711] Com base nos resultados de nossos estudos de superexpressão, G867 e sequências correlatas, tais como, G993 são excelentes candidatos ao aperfeiçoamento de tolerância ao estresse relacionado a estiagem e ao frio nas espécies comerciais. Os efeitos morfológicos associados com sua superexpressão sugerem que os promotores específicos para tecido ou condicionais podem ser usados para otimizar a utilidade desses genes.
[0712] A produção de pelos de raiz aumentada, vista nas linhagens 35S::G993 indica que o gene pode ser usado
633/726 para melhorar o crescimento da raiz e diferenciação e pode, dessa forma, aperfeiçoar o desempenho sob outros estresses, tais como, baixa disponibilidade de nutriente.
[0713] G1048 (SEQ ID NoS: 2515 e 2516)
Informações publicadas [0714] G1048 (AT1G42990) foi identificado inicialmente como EST T88194 parcial, público e no BAC F13A11 (acesso ao GenBank AC068324) liberado pela liberado pela Iniciativa de Genoma de Arabidopsis. Não existem informações publicadas com relação a(s) função(ões) de G1048 .
Observações experimentais.
[0715] Análises de expressão de RT-PCR indicaram que G1048 foi constitutivamente expresso e não foi induzido por qualquer condição testada. Nesse momento, a função de G1048 foi investigada por expressão constitutiva de G1048 usando o promotor 35S. As plantas superexpressando G1048 não eram significativamente diferentes dos controles em qualquer ensaio realizado.
[0716] Nos experimentos iniciais, as linhagens superexpressando G1048 não exibiram um fenótipo de esquivamento de sombra quando cresceram sob deficiência de luz na região vermelha do espectro visível. Esse efeito foi visto em dois experimentos repetidos em uma batelada de sementes mistas dessas três linhagens independentes.
634/726 [0717] Em experimentos repetidos, as linhagens 35S::G1048 cresceram sob luz branca versus deficiência de luz em luz vermelha foram analisadas. Um fenótipo de tolerância a sombra significativo foi observado, indicando que G1048 pode estar envolvido na regulação transcricional da resposta à sombra ou qualidade da luz. G1048 está potencialmente relacionado ao HY5 (Oyama e outros, (1997) Genes Dev. 11:2983-2995), um gene que está bem estabelecido para estar envolvido no desenvolvimento regulado em luz.
[0718] G1069 (SEQ ID NoS: 221 e 222)
Informações publicadas [0719] A sequência de G1069 foi observada do projeto de sequenciamento de Arabidopsis EU, número de acesso ao GenBank Z97336, com base em sua similaridade de sequência dentro do domínio conservado, em relação as outras proteínas relacionadas a AT-Hook em Arabidopsis.
Observações experimentais [0720] A sequência do G1069 foi determinada experimentalmente e a função de G1069 foi analisada usando plantas transgênicas nas quais G1069 foi expresso sob o controle do promotor 35S.
[0721] As plantas superexpressando G1069 mostraram mudanças na arquitetura da folha, tamanho de planta total reduzido e progressão retardada através do ciclo de vida. Esse é um fenômeno comum para a maioria das plantas
635/726 transgênicas, onde as proteínas AT-HOOK são superexpressas se o gene for predominantemente expresso na raiz na base de tipo selvagem. 0 G1069 foi predominantemente expresso nas raízes, com base na análise dos resultados da RT-PCR. Para minimizar esses efeitos prejudiciais, G1069 pode ser superexpresso sob um promotor específico de tecido, tal como, promotor específico de raiz ou de folha ou sob promotor induzível.
[0722] Uma das linhagens superexpressando G1069 mostrou mais tolerância a tensão osmótica que quando foi germinada em placas contendo alto teor de sacarose. Essa linhagem também mostrou insensibilidade ao ABA em um ensaio de germinação.
Aplicações em potencial [0723] Os resultados da tensão osmótica indicam que G1069 seria usado para alterar a resposta da planta às condições de déficit de água e, portanto, o gene ou seus equivalentes seriam usados para projetar plantas com tolerância aperfeiçoada a estiagem, estresse por sal e congelamento.
[0724] G1069 afeta a sensibilidade ao ABA e assim, quando transformado dentro de uma planta, o gene ou seus equivalentes podem diminuir a sensibilidade ao estresse por frio, estiagem, oxidativo e outros e também ser usados para alterar a arquitetura da planta e rendimento.
636/726 [0725] G1073 (SEQ ID NoS: 223 e 224)
Informações publicadas [0726] G1073 foi identificado na sequência de um clone BAC do cromossoma 4 (clone BAC F23E12, gene F23E12.50, número de acesso ao GenBank AL022604), liberada pelo Projeto de Sequenciamento EU Arabidopsis.
Observações experimentais [0727] A função do G1073 foi analisada usando plantas transgênicas nas quais G1073 foi expresso sob o controle do promotor 35S. As plantas transgênicas superexpressando G1073 eram substancialmente maiores que os controles do tipo selvagem, com um aumento de pelo menos 60% na biomassa. A massa aumentada das plantas transgênicas 35S::G1073 foi atribuída ao aumento dos múltiplos tipos de órgãos incluindo folhas, caules, raízes e órgãos florais. O tamanho da pétala nas linhagens [0728] 35S::G1073 aumentou em 40-50% em comparação aos controles do tipo selvagem. As células da epiderme da pétala naquelas linhagens eram aproximadamente 25-30% maiores que aquelas das plantas de controle. Adicionalmente, 15-20% mais células de epiderme por pétala foram produzidas em comparação ao tipo selvagem. Assim, pelo menos nas pétalas, o aumento no tamanho estava associado ao aumento no tamanho da célula, bem como no número de células. Adicionalmente, imagens das seções
637/726 transversais do caule das plantas 35S::G1073 revelaram que as células corticais eram maiores e que os feixes vasculares continham mais células no floema e xilema em relação ao tipo selvagem.
[0729] O rendimento da semente aumentou em comparação às plantas de controle. Linhagens 5S::G1073 mostraram um aumento de pelo menos 70% no rendimento da semente. Essa produção de semente aumentada foi associada a um número aumentado de siliquas por planta, ao invés de sementes por siliqua.
[0730] A floração das plantas superexpressando G1073 foi retardada. As folhas das plantas superexpressando G1073 eram geralmente mais serrilhadas que aquelas das plantas do tipo selvagem. Tolerância aperfeiçoada a estiagem foi observada nas linhagens transgênicas 35S::G1073.
Aplicações em potencial [0731] Plantas transgênicas superexpressando G1073 são grandes e florescem mais tarde com folhas serrilhadas. 0 tamanho grande e a floração tardia produzidos como resultado da superexpressão do G1073 ou equivalentes seriam extremamente úteis nas colheitas onde a porção vegetativa da planta é a porção comercializável (frequentemente o crescimento vegetativo pára quando as plantas fazem a transição para floração). Nesse caso, seria vantajoso
638/726 impedir ou retardar a floração com o uso desse gene ou seus equivalentes a fim de aumentar o rendimento (biomassa). A prevenção da floração por esse gene ou seus equivalentes seria útil nessas mesmas colheitas, a fim de prevenir a dispersão de pólen transgênico e/ou impedir agrupamento da semente. Esse gene ou seus equivalentes também poderíam ser usados para manipular a forma da folha e tolerância a estiagem.
G1075 (SEQ ID NoS: 225 e 226)
Informações publicadas [0732] A sequência de G1075 foi obtida do projeto de sequenciamento do genoma de Arabidopsis, número de acesso ao GenBank AC004667, com base em sua similaridade de sequência dentro do domínio conservado em relação as outras proteínas relacionadas ao AT-Hook no Arabidopsis.
Observações experimentais [0733] A função do G1075 foi analisada usando plantas transgênicas nas quais o G1075 foi expresso sob o controle do promotor 35S. A superexpressão do G1075 produziu plantas muito pequenas, estéreis. Folhas pontiagudas foram observadas em algumas sementeiras e folhas torcidas ou enroladas e serrações de folha anormais foram observadas nas plantas em estágio de roseta. Os botões eram curtos e dentro de internodos curtos. As flores de plantas gravemente afetadas tinham pétalas reduzidas ou
639/726 ausentes e filamentos de estame que parcial ou completamente não se alongaram. Em razão dos fenótipos severos dessas plantas Tl, nenhuma semente T2 foi produzida para análise fisiológica e bioquímica.
[0734] A análise de RT-PCR indicou que as transcrições de G1075 são encontradas primariamente nas raízes. A expressão de G1075 pareceu ser induzida por estresses ao frio e calor.
Aplicações em potencial [0735] G1075 ou seus equivalentes seriam usados para modificar a arquitetura e desenvolvimento da planta, incluindo a estrutura da flor. Se expresso sor um promotor específico de flor, o gene ou seus equivalentes podem também ser úteis para projetar-se a esterilidade do macho. Em razão da expressão de G1075 ser específica para raiz, seu promotor seria útil para expressão de gene alvo nesse tecido.
Arabidopsis G1364 (SEQ ID NoS: 2101 e 2102) [0736] O G1364, um parálogo putativo de G481, é um elemento do subgrupo HAP3 da família de fator de transcrição de ligação da caixa CCAAT.
Observações experimentais [0737] O objetivo do presente estudo foi reavaliar os efeitos da superexpressão de G1364 e determinar se o gene confere efeitos semelhantes ao G481. Nós obtivemos
640/726 agora dois conjuntos de linhagens 35S::G1364 usando uma abordagem de dois componentes. Um número significativo desses transformantes mostrou floração tardia, indicando que G1364 pode agir como um repressor da transição floral. As plantas desse conjunto também senesceram mais tarde que as do tipo selvagem. Em outros aspectos, esses transformantes mostraram morfologia do tipo selvagem.
[0738] Conforme mostrado na Tabela 22, duas linhagens superexpressando G1364 foram menos sensíveis ao
ABA que as plantas do tipo selvagem ou não transformadas.
Tabela 22. G1364 35S, supTfn de dois componentes
Linhagem Germinação Germinação em alto teor de manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Esti agem Resfriamento
em de alto teor NaCl
341 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
342 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
343 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
344 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
345 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
346 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
423 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
431 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
432 wt wt wt + wt wt wt wt wt
435 wt wt wt + wt wt wt wt wt
641/726
Aplicações em potencial [0739] Com base nos resultados do ensaio de germinação com ABA, G481 e sequências correlatas, tais como, G1364, podem ser usados para aperfeiçoar a tolerância ao estresse nas plantas.
[0740] G1364 pode também ser usado para modificar os traços relacionados ao tempo de floração.
G1411 (SEQ ID NoS: 269 e 270)
Informações publicadas [0741] G1411 foi identificado na sequência do clone
TAC clone K22G18 (número de acesso ao GenBank AB022212).
Observações experimentais [0742] A sequência completa de G1411 foi determinada. A função de G1411 foi analisada usando plantas transgênicas nas quais esse gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. Plantas superexpressando G1411 eram menores que os controles do tipo selvagem e mostraram dominância apical reduzida: brotos axilares desenvolvem-se prematuramente entre as folhas de roseta primária, resultando em uma planta tipo arbusto. As plantas superexpressando G1411 comportaram-se como os controles do tipo selvagem correspondente em todos os ensaios fisiológicos e bioquímicos que foram realizados.
Aplicações em potencial [0743] G1411 ou seus equivalentes poderíam ser
642/726 usados para manipular a arquitetura da planta.
G1451 (SEQ ID NoS: 277 e 278)
Informações publicadas [0744] G1451 é ARF8, um elemento da classe ARF das proteínas com um domínio de término N semelhante a VP1 e um domínio de término C com homologia as proteínas Aux/IAA. ARF8, como vários outros ARFs, contém um domínio central rico em glutamina que pode funcionar como um domínio de ativação transcricional (1). ARF8 mostrou ligar-se a um elemento de resposta (2) de auxina. Foi também mostrado que uma versão truncada do ARF8 não possuindo domínio de ligação de DNA, porém contendo domínio de ativação e domínio de término C ativaria a transcrição em um promotor sensível a auxina, presumivelmente através de interações com outro fator ligando ao elemento de resposta (1) de auxina. ARF8 está proximamente relacionado na sequência ao ARF6 (2).
Observações experimentais [0745] G1451 foi expresso através de toda a planta, com a expressão mais alta nas flores. As transcrições de G1451 foram induzidas nas folhas por uma variedade de condições de estresse. Uma linhagem homozigota para uma inserção de T-DNA em G1451 foi usada para determinar a função desse gene. A inserção de T-DNA de G1451 está aproximadamente a um quinto do caminho na sequência de
643/726 codificação do gene e, portanto, é provável que resulte em uma mutação nula.
[0746] Conforme medido por NIR, os mutantes de nocauteamento G1451 aumentaram o óleo de semente combinado total e teor de proteína da semente em comparação às plantas do tipo selvagem.
Aplicações em potencial [0747] G1451 ou seus equivalentes podem ser usados para alterar o teor de óleo e proteína nas sementes, o que pode ser muito importante para o valor nutricional e produção de vários gêneros alimentícios.
[0748] G1451 ou seus equivalentes também poderíam ser usados para aumentar a biomassa da planta. Um tamanho grande é útil em colheitas onde a porção vegetativa da planta é a porção comercializável, uma vez que o crescimento vegetativo frequentemente pára quando as plantas fazem a transição para a floração.
G1543 (SEQ ID NoS: 303 e 304)
Informações publicadas [0749] G1543 foi identificado como um novo gene homeobox dentro da seção 2 de 255 a partir da sequência completa do Cromossoma II (número de acesso ao GenBank AC005560, liberado pela Iniciativa de Genoma de Arabidopsis}.
Observações experimentais
644/726 [0750] As extremidades do G1543 foram determinadas por RACE e um cDNA de comprimento pleno foi isolado do PCR a partir de cDNA misto. Foi verificado que o produto de 275 aminoácidos codificado era um elemento do grupo classe II HD-ZIP das proteínas HD. A anotação pública para esse gene estava incorreta; a proteína predita no repórter BAC tinha apenas 162 aminoácidos de comprimento.
[0751] A análise RT-PCR revelou que o G1543 foi expresso ubiquamente, porém foi supraregulado em resposta as aplicações da auxina.
[0752] A função do G1543 foi analisada usando plantas transgênicas onde o gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. Plantas de Arabidopsis 35S::G1543 exibiram uma faixa de fenótipos; mais consistentemente, contudo, as plantas possuíam folhas verde escuro e um padrão de ramificação alterado que levou a uma estatura menor e mais compacta. Esses fenótipos morfológicos, juntamente com os dados de expressão implicam em G1543 como um componente de uma resposta de crescimento ou desenvolvimento à auxina.
[0753] Ensaios bioquímicos refletiram as alterações na cor da folha observadas durante análise morfológica. Todas as três linhagens de T2 examinadas mostraram níveis aumentados de clorofilas e carotenóides nas folhas. Adicionalmente, uma das três linhagens teve uma diminuição
645/726 no óleo da semente, combinada com um aumento na proteína da semente. Um experimento repetido verificou óleo de semente e composição de proteína alterados nas duas linhagens.
[0754] Ensaios fisiológicos não identificaram diferenças claras entre 35S::G1543 e plantas do tipo selvagem.
Aplicações em potencial [0755] Os níveis alterados de clorofilas, carotenóides, óleo das sementes e proteínas que resultaram da superexpressão do gene em Arabidopsis indicaram que G1543 ou seus equivalentes podem ser usados para manipular a composição dessas substâncias na semente, com aplicações dirigidas ao aperfeiçoamento do valor nutricional dos gêneros alimentícios (por exemplo, por aumento da luteína).
[0756] Os níveis de clorofila e carotenóide melhorados poderíam aperfeiçoar também o rendimento nas plantas de colheita. Por exemplo, a luteína, como outras xantofilas, tais como, zeaxantina e violaxantina, é um componente essencial na proteção da planta contra os efeitos prejudiciais da luz excessiva. Especificamente, a luteína contribui, direta ou indiretamente, para o rápido aumento da saturação não fotoquímica nas plantas expostas a luz forte. As plantas de colheita projetadas para conter níveis maiores de luteína portanto, teriam foto proteção aperfeiçoada, possivelmente levando ao dano oxidativo menor
646/726 e melhor crescimento sob luz forte. Adicionalmente, níveis de clorofila elevados aumentam a capacidade fotossintética.
[0757] O G1543 ou seus equivalentes podem ser aplicados para modificar a estatura da planta. Isso seria usado para produzir colheitas que são mais resistentes ao dano pelo vento e chuva ou mais receptivas para colheita. As plantas com estatura alterada podem também ser de interesse para o mercado de plantas ornamentais.
[0758] Esse gene ou seus equivalentes podem também ser usados para alterar a produção de óleo nas sementes, o que pode ser muito importante para a qualidade nutricional e teor calórico dos alimentos.
G1792 (SEQ ID NoS: 331 e 332)
Informações publicadas [0759] G1792 foi identificado na sequência do clone
BAC K14B15 (AB025608, gene K14B15.14).
Observações experimentais [0760] G1792 (SEQ ID N°: 331) foi estudado usando plantas transgênicas nas quais o gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. As plantas do 25S::G1792 eram mais tolerantes aos agentes patogênicos de fungos Fusarium oxysporum e Botrytis cinerea e mostraram alguns sintomas após inoculação com uma dose baixa de cada agente patogênico. Esse resultado foi confirmado nas linhagens de T2. O efeito da superexpressão de G17 92 no aumento da
647/726 tolerância aos agentes patogênicos recebeu adicionalmente, confirmação incidental. As plantas T2 de duas linhagens de 35S::G1792 desenvolveram-se em um ambiente que sofreu um séria infestação por míldio pulverulento. Para cada linhagem, um pote de seis plantas estava presente em um plano contendo nove outros potes de linhagens de genes não relacionados. Em cada um dos dois planos diferentes, as únicas plantas que estavam livres da infestação foram aquelas da linhagem 35S::G1792. Essa observação indicou que a superexpressão de G1792 pode ser usada para aumentar a resistência ao míldio pulverulento. Experimentos adicionais confirmaram que as plantas de 35S::G1792 mostraram tolerância aumentada ao Erysiphe. G1792 foi expresso ubiquamente, porém pareceu ser induzido por ácido salicílico.
[0761] As plantas superexpressando 35S::G1792 também mostrou mais tolerância ao crescimento sob condições limitantes de nitrogênio. Em um ensaio de crescimento de raiz sob condições de limitação de N, as linhagens de 35S::G1792 foram ligeiramente menos tolhidas no desenvolvimento. Em um ensaio de germinação que monitorou o efeito da sinalização de C em N através da produção de antocianina em alto teor de sacarose mais e menos glutamina, as linhagens de 35S::G1792 fabricaram menos antocianina em alto teor de sacarose mais glutamina,
648/726 sugerindo que o gene pode estar envolvido na capacidade das plantas de monitorar seu estado de carbono e nitrogênio.
[0762] Os superexpressores G1792 eram mais tolerantes as condições de estiagem que as plantas do tipo selvagem em ensaios a base de solo.
[0763] As plantas superexpressando G1792 mostraram várias alterações morfológicas brandas: as folhas eram de um verde escuro e brilhante e as plantas brotaram e subsequentemente senesceram, ligeiramente mais tarde que os controles do tipo selvagem. Entre as plantas Tl, a variação morfológica adicional (não reproduzida mais tarde nas plantas de T2) foi observada: muitas mostraram reduções no tamanho, bem como alterações na forma da folha, filotaxia e desenvolvimento da flor.
Aplicações em potencial [0764] G1792 ou seus equivalentes podem ser usados para projetar plantas resistentes aos agentes patogênicos. Além disso, ele também pode ser usado para aperfeiçoar a germinação de sementeira e desempenho sob condições limitadas de nitrogênio.
[0765] Utilidades em potencial desse gene ou seus equivalentes também incluem aumento no teor de clorofila, o que permite mais crescimento e produtividade em condições de pouca luz. Com uma razão fotossintética potencialmente mais alta, os frutos teriam maior teor de açúcar. O teor de
649/726 carotenóide aumentado poderia ser usado como um nutracêutico para produzir alimentos com capacidade antioxidante maior.
[0766] G1792 ou seus equivalentes seriam usados para manipular o consumo de cera, quantidade ou distribuição, o que por sua vez poderia modificar a tolerância da planta a estiagem e/ou pouca umidade ou resistência aos insetos, bem como a aparência da planta (folhas brilhantes). Especificamente, seria interessante ver qual efeito a deposição de cera aumentada sobre as folhas de uma planta como algodão teria para resistência a estiagem ou eficiência de uso da água. Uma aplicação possível para esse gene pode ser na redução do revestimento de cera em sementes de girassol (a cera suja o sistema de extração de óleo durante o processamento da semente de girassol para extração do óleo). Para essa finalidade, anti-sentido ou co-supressão do gene em uma maneira específica para tecido poderia ser útil.
G1816 (SEQ ID NoS: 2142 e 2143) [0767] G1816 corresponde ao TRIPTYCHON (TRY) , um gene que regula a especificação celular epidérmica na folha e raiz (Schnittger e outros, 1998; 1999; Schellmann e outros, 2002). O gene foi incluído em nossos estudos anteriores como um parálogo putativo do G682 e com base na resistência aumentada das linhagens de 35S::G1816 para
650/726 condições de tensão osmótica, tais como, níveis elevados de glicose.
[0768] O objetivo desse estudo foi o de reavaliar as linhagens 35S::G1816 e determinar se a superexpressão do gene conferiría tolerância ao estresse melhorada em uma maneira comparável ao G682. Nós também buscamos examinar se o uso de um sistema de superexpressão de dois componentes produziría qualquer resistência do fenótipo em relação ao uso de uma fusão de promotor direta 35S.
[0769] Nós geramos agora linhagens de 35S::G1816 usando o sistema de dois componentes. Essas linhagens mostraram um fenótipo imberbe forte, semelhante aquele que foi observado durante a fase I do estudo e semelhante ao efeito produzido pela superexpressão de G682. Contudo, foi
observado que muitas das linhagens de 35S::G1816 eram
menores que os controles, um efeito que não foi reconhecido
anteriormente.
[0770] Dez das duas linhagens de componente foram
testadas em ensaios fisiológicos com base em placa e todas as dez linhagens mostraram uma forte resistência à tensão osmótica quando germinaram em placas de sacarose. Todas as linhagens examinadas também mostraram densidade aumentada dos pelos da raiz. Esses efeitos são amplamente comparáveis aos observados nas linhagens G682, sugerindo que dois genes provavelmente possuem funções muito correlatas. Contudo, as
651/726 linhagens 35S::G682 mostraram resultados positivos em um número maior de ensaios que as linhagens 35S::G1816 (vide relatório 35S::G682), talvez indicando que G682 pode proteger contra uma faia maior de estresses relacionados a estiagem que o G1816.
Tabela 23. G1816 35S, supTfn de dois componentes
Linha- Germina- Germinação em alto teor Saca- ΑΒΆ Germinação no Germi- nação Crescimen- Estia Resfria- Morfologia de raiz semelhante
ção alto em
gem rose no to no gem
teor de de calor mento ao G682
frio calor
NaCl manitol
304 wt wt ++ wt wt wt wt wt wt +
306 wt wt + wt wt wt wt wt wt +
311 wt wt ++ wt wt wt wt wt wt +
313 wt wt + wt wt wt wt wt wt +
325 wt wt ++ wt wt wt wt wt wt +
327 wt wt + wt wt wt wt wt wt +
345 wt wt ++ wt wt wt wt wt wt +
350 wt wt + wt wt wt wt wt wt +
351 wt wt + wt wt wt wt wt wt +
353 wt wt ++ wt wt wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0771] Com base na tolerância das linhagens de
35S::G1816 a tensão osmótica, G682 e sequências correlatas, tais como, G1816 são bons candidatos para uso no alívio do
652/726 estresse relacionado a estiagem. 0 forte desempenho das linhagens de 35S::G1816 nas placas contendo altos níveis de açúcar, sugere especificamente que o gene pode também ser aplicado para manipular respostas de sensibilidade ao açúcar. A diminuição no tamanho vista em algumas das linhagens, sugere que a otimização do gene de tolerância ao estresse pode beneficiar-se do uso de diferentes promotores ou modificações de proteína.
[0772] Os fenótipos epidérmicos vistos nas linhagens de 35S::G1816 indicam que o gene também podería ser usado para modificar características de desenvolvimento, tais como, a formação de tricomas ou pelos da raiz.
G1820 (SEQ ID NoS: 341 e 342)
Informações publicadas [0773] O G1820 é um elemento da subfamília Hap5 dos fatores de transcrição de ligação de caixa CCAAT. G1820 foi identificado como parte do clone BAC MBA10, número de acesso AB025619 liberado pelo projeto de sequenciamento de Genoma de Arabidopsis.
Observações experimentais
[0774] A sequência completa do G1820 foi
determinada.
[0775] Nos ensaios a base de solo, as plantas
superexpressando a fusão direta de 35S::G1792 foram
653/726 significativamente mais tolerantes a estiagem que as plantas de controle do tipo selvagem.
[0776] A função desse gene foi também analisada usando plantas transgênicas nas quais G1820 foi expresso sob o controle do promotor 35S com o sistema de transformação de dois componentes. Uma ampla faixa de alterações morfológicas foi observada, semelhante aquela vista em nossos estudos anteriores.
[0777] Nos ensaios fisiológicos a base de placa nas linhagens de dois componentes, muitos dos nossos fenótipos relacionados ao estresse por estiagem observados foram confirmados. A maioria das linhagens eram tolerantes, em vários graus, ao sal, manitol, sacarose, ABA ou frio em ensaios de germinação.
[0778] Deve ser enfatizado que nós observamos fenótipos de tolerância ao estresse para vários outros genes relacionados ao G481 incluindo G482, G485, G1836 e sequências não Arabidopsis. Os efeitos semelhantes vistos quando esses genes são superexpressos, sugerem fortemente que provavelmente são funcionalmente correlatos, pelo menos com relação a esse fenótipo.
[0779] A superexpressão de G1820 também reduziu consistentemente o tempo para floração. Sob condições de luz contínua a 20-25°C, os transformantes 35S::G1820 revelaram botões de flor visíveis vários dias antes das
654/726 plantas de controle. Os brotos primários dessas plantas tipicamente deram início a flor 1-4 plastocronos de folha mais cedo que aquelas do tipo selvagem. Tais efeitos foram observados em todas as três populações de T2 e em um número substancial de transformantes primários.
[0780] Quando os ensaios bioquímicos foram realizados, algumas alterações nas bordas da folha foram detectadas. Em uma linhagem um aumento na porcentagem de 18:3 e uma diminuição de 16:1 foram observados. Conforme determinado por T-PCR< G1820 foi altamente expresso nos embriões e silíquas. Nenhuma expressão de G1820 foi detectada em outros tecidos testados. A expressão de G1820 pareceu ser induzida nas folhas de roseta por tratamentos de estresse ao frio e estiagem, e as linhagens de superexpressão mostraram tolerância ao déficit de água e condições de alto teor de sal.
[0781] Uma explicação possível para a complexidade do fenótipo de superexpressão G1820 é que o gene está envolvido na conversa cruzada entre ABA e as vias de transdução de sinal GA. É bem conhecido que a dormência da semente e germinação são reguladas pelos hormônios da planta, o ácido abscísico(ABA) e giberelina (GA) . Esses dois hormônios atuam antagonisticamente entre si. ABA induz a dormência da semente nos embriões maduros e inibe a germinação das mesmas. GA rompe a dormência da semente e
655/726 promove a germinação. É concebível que a época de floração e fenótipos insensíveis a ABA observados nos superexpressores de G1820 estejam relacionados a uma sensibilidade melhorada a GA, ou um aumento no nível de GA e que o fenótipo dos superexpressores não esteja relacionado a ABA. Em Arabidopsis, acredita-se que GA seja necessário para promover floração nos fotoperíodos não indutivos. Contudo, os fenótipos de estiagem e tolerância ao sal indicaram que a transdução do sinal de ABA é também perturbada nessas plantas. Parece ser contra-intuitivo para a planta com tolerância ao sal e estiagem ser insensível ao ABA, uma vez que ABA parece ativar as vias de transdução de sinal envolvidas na tolerância aos estresses por sal e desidratação. Uma explicação é que os níveis de ABA nos superexpressores de G1820 também sejam altos, porém que a planta seja incapaz de perceber ou transduzir o sinal.
[0782] Os superexpressores de G1820 também tiverem teor de óleo de semente diminuído ou teor de proteína de semente aumentado em comparação as plantas do tipo selvagem.
Tabela 24. G1820 35S, supTfn de dois componentes
Germina- Germina- Crescí-
Germina Germina
Linha- ção em ção em Saca- mento Estia- Resfria
ABA ção no ção no
gem alto teor alto teor rose no gem -mento
calor frio
de NaCl de manitol calor
656/726
305 wt wt + ++ wt + wt wt +
310 wt wt wt + wt wt wt wt wt
321 wt wt + + wt + wt wt wt
323 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
325 wt wt wt + wt wt wt wt +
326 wt wt + + wt wt wt wt wt
327 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
341 ++ + + ++ wt + wt wt wt
343 ++ + + ++ wt wt wt wt wt
352 ++ + + + wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0783] G1820 afeta a sensibilidade ao ABA e, assim, quanto transformado dentro de uma planta, esse fator de transcrição ou seus equivalentes pode diminuir a sensibilidade ao frio, estiagem, oxidativa e outras sensibilidades ao estresse, e também ser usado para alterar a arquitetura da planta e rendimento.
[0784] Os resultados do ensaio de tensão osmótica e estresse por frio indicam que G481 e sequências correlatas, incluindo G1820, seriam usados para alterar a resposta da planta ao déficit de água e podem ser usados para projetar plantas com tolerância melhorada a estiagem, tensão por sal e congelamento.
[0785] G1820 ou seus equivalentes podem também ser usados para aumentar a tolerância da planta ao frio.
657/726 [0786] G1820 ou seus equivalentes também poderíam ser usados para acelerar o tempo de floração.
[0787] G1820 ou seus equivalentes podem ser usados para modificar os níveis de saturação nos óleos.
[0788] G1820 ou seus equivalentes podem ser usados para o teor de proteína da semente.
[0789] O promotor de G1820 seria usado para direcionar a expressão genética específica da semente.
Aplicações em potencial [0790] G1820 ou superexpressão equivalente pode ser usado para alterar o teor de proteína da semente, que pode ser muito importante para o valor nutricional e produção de vários produtos alimentícios.
G1836 (SEQ ID NoS: 343 e 344)
Informações publicadas [0791] G1836 foi identificado na sequência de BAC
F14I23, número de acesso ao GenBank AC007399, liberado pela Iniciativa de Genoma de Arabidopsis.
Observações experimentais [0792] A sequência completa de G1836 foi determinada. A função desse gene foi analisada usando plantas transgênicas nas quais G1836 foi expresso sob o controle do promotor 35S. Morfologicamente, as plantas eram algo mais pálidas que os controles do tipo selvagem. Essa observação não traduz-se em uma diferença detectável no
658/726 teor de clorofila a ou clorofila b nesses transgênicos (vide dados de bioquímica). A superexpressão de G1836 afetou a capacidade das plantas de tolerar altas concentrações de sal no ensaio de germinação. Todas as linhagens mostraram expansão maior dos cotilédones quando as sementes são germinadas em meios MS contendo altas concentrações de NaCl, indicando que elas tinham mais tolerância ao estresse por sal em comparação aos controles do tipo selvagem. Não houve tolerância melhorada ao alto teor de sal em sementeiras mais velhas em um ensaio de crescimento de raiz. Isso não foi inesperado, uma vez que a tolerância ao sal nos dois estágios de desenvolvimento é frequentemente de natureza desencontrada, indicando diferenças mecânicas.
[0793] A superexpressão de G1836 também resultou em plantas que eram mais tolerantes a estiagem que as plantas de controle do tipo selvagem.
[0794] A expressão de G1836 também foi reprimida por infecção por Erysiphe orontii.
[0795] Sete de dez linhagens testadas em uma série recente de ensaios a base de placa mostraram tolerância ao estresse abiótico melhorada, conforme indicado na Tabela 25. Esses resultados incluiram seis linhagens com tolerância ao sal aperfeiçoada e várias linhagens mostraram sensibilidade ao açúcar alterada nos ensaios a base de
659/726 sacarose e manitol, menos sensibilidade ao ABA e tolerância aperfeiçoada ao frio em ensaios de germinação e resfriamento.
Tabela 25. G1836 35S, supTfn de dois componentes
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor de manitol Sacarose ABA Germina ção no calor Germina ção no frio Crescim ento no calor Estia- gem Resfria -mento
306 + wt + ++ wt Wt wt wt +
362 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
363 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
365 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
367 wt wt wt wt wt ++ wt wt +
381 + wt + + wt wt wt wt +
383 + wt wt wt wt wt wt wt +
384 + wt + + wt wt wt wt wt
385 + + + wt wt wt wt wt wt
386 + wt + + wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0796] Os resultados desses ensaios de estresse abiótico indicam que G1836 pode ser usado para aumentar a tolerância da planta a estiagem, salinidade do solo e condições frias durante a germinação ou no estágio de sementeira. Os resultados desse estudo confirmaram nossas conclusões anteriores de que G481 e seus genes correlatos,
660/726 incluindo G1836, são excelentes candidatos para aperfeiçoamento da tolerância ao estresse por estiagem e relacionado ao frio nas plantas.
G1930 (SEQ ID NoS: 369 e 370)
Informações publicadas [0797] G1930 foi identificado na sequência do clone PI K13N2 (gene K13N2.7, número de acesso da proteína ao GenBank BAA95760).
Observações experimentais [0798] G1930 foi expresso ubiquamente e não pareceu ser induzido por quaisquer das condições testadas.
[0799] Nós geramos linhagens 35S::G1930 através de processos de fusão de promotor direta e de dois componentes. Ambos os tipos de linhagem exibiram uma variedade de fenótipos morfológicos incluindo tamanho reduzido, crescimento lento e alterações na orientação da folha. Em algumas linhagens, alterações na forma da folha, comprimento do hipocótilo, densidade do tricoma, época de floração e anormalidades florais não específicas que reduziram a fertilidade foram também observadas.
[0800] Nós testamos ambas as linhagens de dois componentes e de fusão de promotor direta sob uma variedade de tratamentos a base de placa. Os resultados comparáveis foram obtidos com ambos os tipos de linhagem, porém as linhagens de dois componentes mostraram fenótipos mais
661/726 fortes, sugerindo, talvez, que esse sistema forneceu uma ampliação da atividade de G1930 em relação a fusão de promotor direta. Todas as vinte linhagens testadas mostraram resultados positivos em um ou mais dos tratamentos por estresse, incluindo, sacarose, NaCl, ABA, germinação a frio e crescimento no frio. Resistência especificamente forte foi vista nos ensaios de germinação de NaCl e sacarose.
[0801] Um aumento nos teores de clorofila a e b nas sementes de duas linhagens T2 foi detectado.
[0802] Nós obtivemos efeitos de desenvolvimento comparáveis, bem como uma forte melhora da tolerância ao estresse relacionado a estiagem, de todos os quatro genes de Arabidopsis no grupo de estudo G867 (G9, G867, G993 e G1930). Os efeitos fenotipicos quase idênticos produzidos por esses genes sugerem fortemente que eles são funcionalmente equivalentes.
Tabela 26. G1930 35S, supTfn de fusão de promotor direta e de dois componentes
Transforma- Germina- Germina Germi- Crescí-
Li- ção ção em ção em Saca Germina nação mento Es ti Resfria-
nha- alto teor alto - ABA ção no no no a- mento
gem de NaCl teor de rose calor frio calor gem
manitol
304 Fusão + wt wt wt Wt wt wt wt wt
662/726
direta
305 Fusão direta wt wt ++ wt wt + wt wt wt
306 Fusão direta 4- wt wt wt Wt wt wt wt +
308 Fusão direta wt wt ++ wt Wt wt wt wt +
309 Fusão direta wt wt wt wt Wt wt wt wt +
311 Fusão direta wt wt + wt Wt + wt wt +
365 Fusão direta + wt ++ wt Wt wt wt wt wt
3 67 Fusão direta + wt ++ wt wt wt wt wt +
369 Fusão direta + wt wt wt Wt wt wt wt +
370 Fusão direta + wt wt wt Wt wt wt wt +
321 2-comp + wt ++ wt wt wt wt wt +
322 2-comp + wt + + wt wt wt wt +
324 2-comp + wt + + wt wt wt wt +
327 2-comp + wt + wt wt wt wt wt wt
329 2-comp + wt + wt wt wt wt wt +
331 2-comp + wt ++ + wt wt wt +
663/726
332 2-comp + wt + + Wt wt wt wt wt
334 2-comp + wt wt wt Wt wt wt wt wt
336 2-comp + wt ++ + wt wt wt wt +
339 2-comp + wt wt wt wt wt wt wt wt
331 2-comp +
Aplicações em potencial [0803] Com base nos resultados dos nossos estudos de superexpressão, G867 e genes correlatos, tais como G1930 são excelentes genes candidatos para aperfeiçoamento da tolerância ao estresse abiótico nas espécies comerciais. Os efeitos morfológicos associados a sua superexpressão sugerem que tecido específico ou promotores condicionais podem ser usados para otimizar a utilidade desses genes.
[0804] Esse gene também podería ser usado para regular os níveis de clorofila nas sementes.
[0805] G2053 (SEQ ID NoS: 389 e 390)
Informações publicadas [0806] G2053 foi identificado na sequência de BAC
T27C4, número de acesso ao GenBank AC022287, liberado pela Iniciativa de Genoma de Arabidopsis.
Observações experimentais [0807] A função de G2053 foi analisada usando plantas transgênicas nas quais o gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. Em um ensaio de crescimento de
664/726 raiz em meios contendo altas concentrações de PEG, Superexpressores de G2053 mostraram mais crescimento de raiz em comparação aos controles do tipo selvagem. Superexpressores de G2053 também eram significativamente mais tolerantes a estiagem que as plantas de controle do tipo selvagem.
Aplicações em potencial
[0808 ] G2053 ou seus equivalentes poderíam ser
usados para alterar a resposta da planta as condições de
déficit de água e, portanto, poderíam ser usados para
projetar plantas com tolerância melhorada ao estresse por
estiagem, sal e congelamento.
G2133 (SEQ ID NoS: 407 e 408) [0809] G2133 corresponde ao gene F26A9.il (AAF23336).
Observações experimentais [0810] A função de G2133 foi estudada usando plantas transgênicas nas quais o gene foi expresso sob o controle do promotor 35S.
[0811] A expressão de G2133 foi detectada em uma variedade de tecidos: flor, folha, embrião, e amostras de silíquas. Sua expressão pode ser alterada por várias condições, incluindo tratamento com auxina, tensão osmótica, e infecção por Fusarium. Superexpressão de G2133 causou uma variedade de alterações no crescimento e
665/726 desenvolvimento da planta: florescência retardada, arquitetura de inflorescência alterada, e uma diminuição no tamanho total e fertilidade. Plantas de G2133 eram mais tolerantes ao glifosato que as plantas de controle do tipo selvagem.
[0812] Nos estágios anteriores, transformantes 35S::G2133 eram marcantemente menores que os controles e revelaram folhas enroladas, verde escuro. A maior parte dessas plantas permaneceu em uma fase vegetativa de desenvolvimento substancialmente mais longa que os controles e produziu um número aumentado de folhas antes de brotar. Na maioria das plantas mais gravemente afetadas, o brotamento ocorreu mais que um mês mais tarde que no tipo selvagem (24 horas de luz) . Além disso, as plantas mostraram uma redução na dominância apical e formaram números maiores de brotos, simultaneamente, das axilas das folhas de rosete. Esses caules em inflorescência tinham internodos curtos e transportavam números aumentados de nodos de folha cauline, o que forneceu uma aparência muito folhosa. A fertilidade das plantas de 35S::G2133 era de modo geral muito baixa. Além disso, foi verificado que as linhagens superexpressando G2133 eram muito mais resistentes ao glifosato de herbicida nos experimentos iniciais e repetidos.
[0813] O G2133 é um parálogo do G47, o último sendo
666/726 conhecido de estudos anteriores por conferir um fenótipo de tolerância a estiagem quando superexpresso. Assim, não foi surpreendente quando G2133 mostrou também induzir tolerância a estiagem em várias linhagens de 35S::G2133, desafiadas nos ensaios de estiagem a base de solo. Após nova rega, todas as plantas de linhagens de superexpressor de G2133 tornaram-se revigoradas e todas as plantas de controle morreram ou foram gravemente afetadas pelo tratamento de estiagem.
Aplicações em potencial [0814] G2133 e seus equivalentes podem ser usados para aumentar a tolerância das plantas a estiagem e a outras tensões osmóticas. G2133 poderia também ser usado para geração de plantas resistentes ao glifosato e para aumentar a resistência da planta ao estresse oxidativo e por glifosato.
G2153 (SEQ ID NoS: 417 e 418)
Informações publicadas [0815] A sequência de G2153 foi obtida do projeto de sequenciamento genômico de Arabidopsis, número de acesso ao GenBank AC011437, com base em sua similaridade de sequência dentro do dominio conservado em relação a outras proteínas relacionadas a AT-Hook em Arabidopsis. G2153 corresponde ao gene F7O18.4 (AAF04888).
Observações experimentais
667/726 [0816] A sequência completa de G2153 foi determinada. G2153 foi fortemente expresso em raízes, embriões, siliquas, e sementes em germinação, porém em níveis baixos ou indetectáveis em brotos, flores, e folhas de roseta. Isso não foi significativamente induzido ou reprimido por qualquer condição testada.
[0817] A função desse gene foi analisada usando plantas transgênicas nas quais G2153 foi expresso sob o controle do promotor 35S. Superexpressão de G2153 em Arabidopsis resultou em sementeiras com uma resposta alterada a tensão osmótica. Em um ensaio de germinação em meios contendo alto teor de sacarose, superexpressores de G2153 tinham cotilédones mais expandidos e raízes mais longas que os controles do tipo selvagem. Esse fenótipo foi confirmado em experimentos repetidos em linhagens individuais, e todas as três linhagens mostraram tolerância osmótica. Tolerância aumentada ao alto teor de sacarose também seria indicativa dos efeitos de sensibilidade ao açúcar. Superexpressão de G2153 não produziu efeitos consistentes na morfologia de Arabidopsis e nenhum fenótipo alterado foi observado em qualquer um dos ensaios bioquímicos.
Aplicações em potencial [0818] G2153 ou seus equivalentes podem aperfeiçoar uma resposta da planta a estiagem, estresse por sal e
668/726 congelamento.
[0819] G2153 ou seus equivalentes podem também ser úteis para alterar uma resposta de planta aos açúcares.
G2155 (SEQ ID NoS: 419 e 420)
Informações publicadas [0820] A sequência de G2155 foi obtida do projeto de sequenciamento genômico de Arabidopsis, número de acesso ao GenBank AC012188.
Observações experimentais [0821] A sequência completa de G2155 foi determinada. A expressão de G2155 foi detectada em niveis baixos apenas em flores e embriões. Isso não foi induzido em folhas de roseta por qualquer condição testada.
[0822] A função desse gene foi analisada usando plantas transgênicas nas quais G2155 foi expresso sob o controle do promotor 35S. Superexpressão de G2155 produziu um retardo marcante na época de floração. Sob conduções de luz continua, os transformantes de 35S::G2155 mostravam uma extensão considerável de desenvolvimento vegetativo, e tipicamente formaram botões de flor, porém duas semanas mais tarde que os controles do tipo selvagem. Nos estágios anteriores, as plantas eram ligeiramente menores e tinham folhas arredondadas em comparação ao tipo selvagem. Contudo, mais tarde no desenvolvimento, quando as folhas se expandiram completamente, as plantas de 35S::G2155 ficaram
669/726 muito grandes, de cor verde escuro e senesceram muito mais tarde que os controles.
[0823] Além disso, superexpressão de G2155 resultou em um aumento no glicosinolato da semente M39497 nas duas linhagens de T2. Nenhuma outra alteração fenotípica foi observada em qualquer um dos ensaios bioquímicos ou fisiológicos.
Aplicações em potencial [0824] G2155 ou expressão eguivalente pode ser usado para retardar a floração.
[0825] G2155 ou seus equivalentes também poderíam ser usados para alterar a composição de glicosinolato da semente.
G2345 (SEQ ID NoS: 2171 e 2172) [0826] G2345 é um parálogo putativo de G481, e é um elemento do subgrupo HAP3 da família de fator de transcrição CCAAT. Durante nosso programa mais antigo, nós verificamos que as plantas superexpressando G2345 eram semelhantes as plantas do tipo selvagem em todos os ensaios realizados. O objetivo desse estudo foi reavaliar o papel de G2345 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão de dois componentes.
[0827] Nós agora geramos linhagens de 35S para G2345 usando o sistema de dois componentes; três bateladas de linhagens TI foram obtidas, incluindo linhagens 301-302,
670/726
341-347, e 381-400. Alguma variação no tamanho foi aparente na segunda batelada de plantas (341-347), porém, de outro modo, nenhuma diferença consistente na morfologia foi observada em comparação aos controles do tipo selvagem.
[0828] Duas de duas linhagens de superexpressores testados mostraram germinação melhor em condições frias que as plantas de controle do tipo selvagem.
Tabela 27. G2345 35S, supTfn de dois componentes
Linha- gem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ΑΒΆ Germina ção no calor Germina ção no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriame nto
em teor NaCl alto de
301 wt Wt wt wt wt wt wt
302 wt Wt wt wt wt wt wt
341 wt Wt wt wt wt wt wt
386 wt wt wt wt wt wt wt
387 wt wt wt wt wt wt wt
389 wt wt wt wt wt wt wt
390 wt wt wt wt wt . wt wt
392 wt wt wt wt wt wt wt
393 wt wt wt wt wt + wt wt
400 wt wt wt wt wt + wt wt
Aplicações em potencial [0829] Os resultados do ensaio de germinação no frio confirmam que G481 e suas sequências correlatas,
671/726 incluindo G2345, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G2509 (SEQ ID NoS: 439 e 440)
Informações publicadas [0830] G2509 corresponde ao gene T2I1_2O (CAB87920).
Observações experimentais [0831] G2509 (SEQ ID N°: 439) foi estudado usando plantas transgênicas nas quais o gene foi expresso sob o controle do promotor 35S. Superexpressão de G2509 causou múltiplas alterações no crescimento e desenvolvimento da planta, mais notavelmente, padrão de ramificação alterado, e uma redução na dominância apical, fornecendo as plantas uma estatura menor e em forma de arbusto que o tipo selvagem. Vinte transformantes primários de 35S::G2509 foram examinados; nos estágios anteriores de desenvolvimento de roseta, essas plantas revelaram um fenótipo do tipo selvagem. Contudo, na mudança para floração, quase todas linhagens TI mostraram uma perda marcante de dominância apical e um grande número de brotos secundários desenvolveram-se das axilas das folhas de roseta primárias. Nos casos mais extremos, os brotos tinham internodos muito curtos, fornecendo a inflorescência como uma aparência de arbusto. Tais brotos eram freqüentemente muito finos e as flores eram relativamente pequenas e pouco
672/726 férteis. Nos estágios posteriores, muitas plantas pareceram muito pequenas e tinham um rendimento baixo de semente em comparação to tipo selvagem. Além dos efeitos na ramificação, um número substancial de transformantes primários de 35S::G2509 também floresceram precocemente e tinham botões visíveis vários dias antes do tipo selvagem. Efeitos semelhantes no desenvolvimento de inflorescência foram observados em cada uma das três populações de T2 examinadas. Os fenótipos de ramificação e arquitetura da planta observados nas linhas de 35S::G2509 lembram os fenótipos observados para os três outros genes AP2/EREBP: G865, G1411, e G1794, G2509, G865, e G1411 formam uma classe pequena dentro da família grande de AP2/EREBP, e G17 94, embora não pertencendo a classe, é um dos genes de AP2/EREBP mais próximo a esse na árvore filogenética. Assim é provável que todos esses genes compartilhem uma função correlata, tal como afetando o equilíbrio hormonal.
[0832] Plantas superexpressando G2509 tiveram teor de proteína aumentado em comparação as plantas de controle do tipo selvagem.
[0833] Superexpressão de G2509 em Arabidopsis
resultou em um aumento no teor de alfa-tocoferol nas
sementes nas duas linhagens de T2. G2509 foi expresso
ubiquamente em tecido de planta de Arabidopsis. Os níveis de expressão de G2509 foram alterados por várias condições
673/726 ambientais ou fisiológicas.
Aplicações em potencial [0834] G2509 ou seus equivalentes podem ser usados para manipular a arquitetura e desenvolvimento da planta, alterar a composição de tocoferol e época de floração.
G2583 (SEQ ID NoS: 449 e 450)
Informações publicadas [0835] G2583 corresponde ao gene F2I11_8O (CAB96654).
Observações experimentais [0836] As plantas de 35S::G2583 exibiram folhas extremamente brilhantes. Nos estágios anteriores, as sementeiras de 35S::G2583 pareceram normais, porém em cerca de duas semanas após a semeadura, essas plantas exibiram folhas muito brilhantes, que eram aparentes até um estágio posterior de desenvolvimento. Muitas linhagens revelaram uma variedade de outros efeitos, tais como, redução no tamanho total, folhas estreitas enroladas ou várias anormalidades florais não específicas, que reduziram a fertilidade. Esses efeitos na aparência da flor foram observados nos 18 dos 20 transformantes primários e em todas essas plantas de 4 das 6 linhagens de T2. A natureza lustrosa das folhas pode ser uma consequência de alterações no teor ou composição de cera epicuticular. G2583 pertence a uma pequena classe dentro da grande família AP2/EREBP de
674/726
Arabidopsis que também contém G975, G1387, e G977. A superexpressão de G975 causa um aumento substancial na cera da folha e uma morfologia que lembra aquela das plantas de 35S::G2583. G2583 foi expresso ubiquamente em níveis maiores na raiz, flor, embrião e silíquas.
Aplicações em potencial [0837] G2583 ou seus equivalentes podem ser usados para modificar a aparência da planta por produção de folhas brilhantes. Além disso ele ou seus equivalentes podem ser usados para manipular a composição, quantidade ou distribuição da cera, que por sua vez, pode modificar a tolerância da planta a estiagem e/ou baixa umidade ou resistência aos insetos.
G2718 (SEQ ID N° : 2191 and 2192) [0838] G2718 foi incluído em nossos estudos anteriores como um parálogo putativo de G682. Uma análise genética da função de G2718 ainda não foi publicada. O objetivo desse estudo foi o de reavaliar as linhagens 35S::G2718 e determinar se a superexpressão do gene conferiría tolerância ao estresse melhorado de um modo comparável ao G682. Nós também buscamos examinar se o uso do sistema de superexpressão de dois componentes produziría qualquer reforço do fenótipo em relação ao uso de uma fusão de promotor direta de 35S.
[0839] Nós agora geramos linhagens 35S::G2718
675/726 usando o sistema de dois componentes. Essas linhagens mostraram um forte fenótipo imberbe, semelhante aquele que foi observado durante nossos estudos precedentes, e semelhante ao efeito produzido por superexpressão de G682. Quase todas as linhagens testadas eram mais tolerantes ao alto teor de sacarose em um ensaio de tensão osmótica, e foi verificado que duas linhagens eram insensíveis ao ABA.
Tabela 28. G1816 35S, supTfn de dois componentes
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Saca rose ABA Germinaç âo no calor Germinação no frio Crescimento no calor Esti a- gem Resfria mento Morfologia da raiz semelhante a G682
341 wt Wt wt + wt wt wt wt
342 wt wt + + wt wt wt +
425 wt wt + wt wt wt wt +
427 wt wt + wt wt wt wt +
428 wt wt wt wt wt wt wt +
429 wt wt + wt wt wt wt +
431 wt wt + wt wt wt wt +
432 wt wt 4- wt wt wt wt ++
433 wt wt + wt wt wt wt wt
439 wt wt + wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0840] Com base na tolerância das linhagens
35S::G1816 a tensão osmótica, G682 e sequências correlatas,
676/726 tais como G1816 são ótimos candidatos para uso no alívio do estresse relacionado a estiagem. 0 forte desempenho das linhagens 35S::G1816 linhagens nas placas contendo altos níveis de açúcar sugere especificamente que o gene pode também ser aplicado para manipular respostas de sensibilidade ao açúcar. Contudo, a diminuição no tamanho visto em algumas das linhagens, sugere que o gene pode precisar de otimização por uso de diferentes promotores ou modificações de proteína, antes do desenvolvimento do produto.
[0841] Os fenótipos epidérmicos vistos nas linhagens 35S::G1816 indicam que o gene também podería ser usado para modificar características de desenvolvimento, tais como, a formação de tricomas ou pelos da raiz.
[0842] G3377 de arroz (SEQ ID NoS: 1221 e 2934) [0843] G3377 é um gene de arroz que foi identificado como sendo um ortólogo putativo do G912. O objetivo desse projeto foi determinar se G3377 possui uma função equivalente ao G912 através da análise das linhagens de Arabidopsis de 35S::G3377.
[0844] Superexpressores de 35S::G3377 foram obtidos em frequência relativamente baixa. As linhagens que foram recuperadas mostraram vários efeitos morfológicos admiráveis incluindo uma redução no tamanho, coloração escura e florescência retardada. Tais aspectos eram algo
677/726 comparáveis aos mostrados pelas linhagens 35S::G912, indicando que os dois genes, provavelmente, possuem uma função semelhante.
[0845] Linhagens de plantas superexpressando essas sequências de arroz mostraram ter germinação aumentada em alto teor de sal, manitol, sacarose e condições de aquecimento, conforme visto na tabela que se segue.
Tabela 29. G3377 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Cresci- Estia -gem Resfriamento
em teor NaCI alto de
mento calor no
382 + + + wt wt
383 wt + + wt wt
384 wt wt Wt wt +
385 wt wt wt wt wt
386 wt wt + wt wt
388 wt wt wt wt wt
389 wt wt wt wt +
390 wt wt wt wt wt
391 wt wt wt wt wt
392 wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0846] Em razão dos efeitos morfológicos comparáveis da superexpressão de G3377 e G912, é provável que os genes
678/726 tenham papéis comparáveis.
[0847] A florescência retardada exibida pelas linhagens de 35S::G3377 sugere que o gene pode também ser aplicado para modificar a época de floração; especificamente, uma extensão do crescimento vegetativo pode aumentar significativamente a biomassa e resultar em aumentos de rendimento substanciais. Em algumas espécies (por exemplo, beterraba) , onde as parte vegetativas da planta constituem a colheita, seria vantajoso retardar ou suprimir a floração, a fim de impedir que os recursos fossem dirigidos ao desenvolvimento reprodutivo. Adicionalmente, o retardo da floração além da época normal de colheita aliviaria o risco de escape de pólen transgênico de tais colheitas.
[0848] Os resultados dos ensaios de estresse abiótico confirmam que G912 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de arroz G3377, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0849] G3392 de arroz (SEQ ID NoS: 1082 e 2920) [0850] G3392 é um gene de arroz que foi identificado como sendo um ortólogo putativo de G682. O objetivo desse projeto foi determinar se G3392 possui uma função equivalente a dos genes relacionados ao G682 de Arabidopsis através da análise das linhagens de Arabidopsis de 35S::G3392.
679/726 [0851] Nós agora geramos linhagens de 35S::G3392; essas plantas mostraram efeitos morfológicos comparáveis as linhagens de 35S::G682 e exibiram um fenótipo imberbe combinado com uma redução no tamanho total. Tais semelhanças nos fenótipos sugerem que os genes possuem funções semelhantes. De modo interessante, muitas das linhagens de 35S::G3392 também produziram sementes amarelo pálido, que indicaram, provavelmente, uma redução nos níveis de antocianina no revestimento da semente. Tal efeito não foi observado na semente de 35S::G682, porém foi verificado, durante nossos estudos genômicos, que G682 e seus parálogos inibiram a produção de antocianina.
Tabela 30. G3392 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescí men-to no calor Es tia -gem Res- friamento Morfologia de raiz semelhante a do G682
301 wt wt wt wt wt + wt + + +
305 wt wt + wt wt + wt + + +
306 + wt + wt wt - + + +
321 wt wt + wt wt + wt + + +
322 + wt wt wt wt + - ND + +
341 wt + + wt wt + wt + + +
342 + + ++ wt wt + wt + + +
346 wt + + wt wt + wt + + +
680/726
347 wt wt wt wt wt + wt + + +
348 wt wt + wt wt + wt + + +
Aplicações em potencial [0852] Os resultados desses ensaios de estresse abiótico confirmam que G682 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de arroz G3392, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0853] O efeito de G3392 no padrão epidérmico indica que o gene podería ser aplicado para manipular desenvolvimento de tricoma; em algumas espécies os tricomas acumulam metabolitos secundários valiosos e em outros exemplos acredita-se que forneçam proteção contra predação. A coloração mais fraca das plantas de 35S:: G3392 podería indicar que G3392 pode ser usado para regular a produção de compostos relacionados ao flavonóide, que contribuem com o valor nutrucional dos gêneros alimentícios.
G3393 de arroz (SEQ ID NoS: 559 e 2921) [0854] G3393 é um ortólogo de arroz putativo de G682. Plantas de linhagens 35S::G3393 mostraram efeitos morfológicos comparáveis às linhagens 35S::G682 e exibiram um fenótipo imberbe combinado com uma redução no tamanho total. Essas semelhanças nos fenótipos sugerem que os genes possuem funções semelhantes. Muitas das linhagens de 35S::G3393 também produziram sementes amarelo pálido, que
681/726 indicaram, provavelmente, uma redução nos níveis de antocianina no revestimento da semente. Tal efeito não foi observado na semente de 35S::G682, porém nós verificamos que G682 e seus parálogos inibiram a produção de antocianina.
Tabela 31. G3393 35S, Fusão de promotor direta
Linha- gem Germina Germina ção em alto teor manitol Sacarose ABA Germina ção no calor Germina ção no frio Crescimento no calor Estia -gem Resfriamento Morfologia de raiz semelhante ao G682
ção alto teor NaCl em de
305 wt wt + wt wt wt wt ++ +
307 wt wt Wt wt wt wt wt + +
308 wt wt Wt wt wt wt wt ++ +
323 wt wt wt wt wt wt wt wt + +
324 wt wt wt wt wt wt wt wt + +
326 wt wt wt wt wt wt wt wt + +
327 wt wt wt wt wt wt wt wt ++ +
328 wt wt wt wt wt wt wt wt ++ +
331 wt wt wt wt wt wt wt wt wt 4-
333 wt wt wt wt wt wt wt wt + +
Aplicações em potencial [0855] Os resultados dos ensaios de germinação no frio e em sacarose confirmam que G682 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de arroz G3393, são
682/726 excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0856] 0 efeito de G3393 no padrão epidérmico indica que o gene podería ser aplicado para manipular desenvolvimento de tricoma; em algumas espécies os tricomas acumulam metabolitos secundários valiosos e em outros exemplos acredita-se que forneçam proteção contra predação. Ά coloração mais fraca das plantas de 035S:: G3393 podería indicar que G3393 pode ser usado para regular a produção de compostos relacionados ao flavonóide, que contribuem com o valor nutrucional dos gêneros alimentícios.
G3395 de arroz (SEQ ID NoS: 790 e 2910) [0857] G3395 é um ortólogo do G481 de Oryza sativa.
G3395 é um elemento do subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT e corresponde ao OsHAP3A e recentemente mostrou influenciar a biogenese do cloroplasto (Miyoshi e outros, (2003) Plant J. 36: 532540) . Nós indicamos anteriormente que a superexpressão de G3395 conferi um fenótipo de tolerância ao sal às plantas de Arabidopsis (Pedido de Patente US número 10/675.852, depositado em 30 de setembro de 2003).
Observações experimentais [0858] O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel de G3395 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão, e comparar os efeitos com
683/726 aqueles dos outros ortólogos e parálogos de G481.
[0859] A maior parte das plantas de 35S::G3395 mostraram uma aceleração muito leve na época de floração, porém uma linhagem simples mostrou floração levemente tardia. Uma linhagem superexpressando G3395 mostrou possuir tolerância aperfeiçoada a estiagem em um ensaio a base de placa. A mesma linhagem também mostrou tolerância aumentada a alta concentração de sal em relação aos controles do tipo selvagem ou não transformados, confirmando o resultado observado anteriormente.
Tabela 32. G3395 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ΑΒΆ Germina ção no calor Germina ção no frio Crescim ento no calor Estia- gem Resfriamento
em teor NaCl alto de
301 wt wt Wt wt wt wt wt wt wt
302 + wt Wt wt wt wt wt + wt
303 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
304 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
684/726
305 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
306 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
307 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
308 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
310 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0860] Os resultados desse ensaio de estiagem confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de arroz G3395, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3397 de arroz (SEQ ID NoS: 794 e 2911) [0861] G3397, um ortólogo de G481 de Oryza sativa, é um elemento do subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT. Esse gene está filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G485, outro elemento do subgrupo ΗΆΡ3. G3397 corresponde ao
685/726
OsHAP3C e mostrou recentemente influenciar a biogenese do cloroplasto (Miyoshi e outros, (2003) supra).
Observações experimentais [0862] O objetivo desse estudo foi avaliar o papel de G3397 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão, e comparar os efeitos com aqueles dos outros ortólogos e parálogos do G481.
[0863] Plantas de 35S::G3397 mostraram uma aceleração de 1-2 semanas na época de floração, em comparação as plantas não transformadas ou do tipo selvagem. Esse mesmo fenótipo foi também observado para o gene G485 de Arabidopsis mais proximamente relacionado. Essas linhagens de floração precoce também eram menores que os controles. Dez linhagens foram testadas em ensaios fisiológicos a base de placa. Uma dessas linhagens mostrou insensibilidade ao ABA, e a outra germinou melhor que as plantas do tipo selvagem ou não transformadas em condições aquecidas.
Tabela 33. G3397 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germina ção no calor Germina ção no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriame nto
322 Wt wt wt wt wt
323 wt Wt wt Wt wt
686/726
324 Wt wt wt wt wt
326 wt wt wt + wt
328 wt wt wt wt wt
330 wt wt wt wt wt
334 wt wt wt wt wt
335 wt wt wt wt wt
338 wt wt wt wt wt
339 wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0864] Os resultados dos ensaios em aquecimento e de germinação em ABA confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de arroz G3397, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3398 de arroz (SEQ ID NoS: 796 e 2912) [0865] G3398 de Oryza sativa está relacionado ao G481, e filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G485. Como o G481 e G485, G3398 é um elemento do subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT.
Observações experimentais [0866] O objetivo desse estudo foi avaliar o papel de G3398 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão, e comparar os efeitos com aqueles dos outros ortólogos e parálogos do G481.
687/726 [0867] As plantas 35S::G3398 mostraram uma aceleração de 1-2 semanas na época de floração, em comparação as plantas não transformadas ou do tipo selvagem. Esse mesmo fenótipo foi também observado para o gene G485 de Arabidopsis mais proximamente relacionado. Essas linhagens de floração precoce também eram menores que os controles.
[0868] No estudo mais recente, seis linhagens superexpressando G3398 foram assim testadas nos ensaios fisiológicos. Uma linhagem mostrou germinar melhor no calor que controles do tipo selvagem ou não transformados.
Tabela 34. G3398 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germina ção no calor Germinação no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriame nto
303 wt wt Wt wt +
323 wt wt Wt wt wt
324 wt wt wt wt wt
329 wt wt Wt wt wt
332 wt wt wt wt wt
335 wt wt Wt wt wt
Aplicações em potencial [0869] Os resultados do ensaio de germinação em calor confirmam que G481 e suas sequências correlatas
688/726 incluindo a sequência de arroz G3398, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3399 de arroz (SEQ ID NoS: 1399 e 2937) [0870] G3399 foi identificada como um ortólogo de arroz putativo de G1073. Análise filogenética identifica G3399 juntamente com G3400 como sendo os ortólogos mais proximamente correlatos do G1073. O objetivo desse projeto é determinar se superexpressão de G3399 em Arabidopsis produz efeitos comparáveis aos da superexpressão de G1073.
[0871] As linhagens de 35S::G3399 foram obtidas contendo cada uma de duas construções diferentes. Ambas construções produziram fenótipos morfológicos semelhantes; muitas das linhagens eram pequenas nos estágios anteriores, mostraram mostraram alterações na forma da folha, e tiveram florescência levemente retardada. Contudo um número significativo de linhagens desenvolveu órgãos laterais aumentados (folhas e flores), especificamente nos estágios posteriores.
[0872] É digno de nota que uma das construções (P21269) continha uma conversão de aminoácido (prolina em glutamina no resíduo 198, no domínio conservado) em relação a proteína nativa. Linhagens para essa proteína mutada mostraram algumas morfologias indesejáveis em relação a versão do tipo selvagem.
689/726 [0873] Os efeitos morfologicamente semelhantes causados pela superexpressão desse gene de arroz versus G1073 e os parálogos de Arabidopsis, sugerem que eles provavelmente possuem funções correlatas.
Tabela 35. G3399 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Estia -gem Resfriamento
321 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
322 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
323 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
325 wt wt wt wt ++ wt wt wt wt
330 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
331 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
332 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
336 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
338 wt wt wt wt + wt wt wt wt
340 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
347 wt wt wt wt wt wt wt wt +
348 wt wt wt wt wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0874] O fenótipo morfológico induzido por G3399 indica que o gene podería ser usado para modificar traços
690/726 tais como, tamanho do órgão e época de floração. Esse estudo também identificou uma região específica da proteína de G3399 que pode ser modificada, a fim de otimizar a aquisição de fenótipos desejáveis. Nos casos onde o tamanho aumentado conferido pela superexpressão de G3399 seria indesejado, as alterações causadas pela superexpressão de G3440 podem ser otimizadas pelo uso, por exemplo, promotores induzíveis ou específicos de tecido.
[0875] Os resultados dos ensaios de germinação no calor e em resfriamento confirmam que G1073 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de arroz G3399, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3429 de arroz (SEQ ID NoS: 2945 e 2946) [0876] G3429 de Oryza sativa é um gene relacionado ao G481. Ά partir de nossa análise filogenética, G3429 parece estar mais distantemente relacionado ao G481 que os outros genes não Arabidopsis nesse estudo (Figura 3) . O gene codifica uma proteína correspondendo a OsNF-YBl e mostrou que forma um complexo ternário com a proteína de MADS OsMADS18 (Masiero e outros, (2002) J. Biol. Chem. 277: 26429-26435).
Observações experimentais [0877] O objetivo desse projeto foi avaliar o papel de G3429 na tolerância relacionada ao estresse por
691/726 estiagem, e comparar os efeitos com aqueles dos genes relacionados ao G481.
[0878] Seis das vinte plantas de 35S::G3429 TI examinadas floresceram notavelmente mais tarde e tinham folhas estreitas em comparação as plantas não transformadas ou do tipo selvagem.
[0879] Seis das dez linhagens superexpressando G3429 eram mais tolerantes as condições de alto teor de sal que as plantas do tipo selvagem ou não transformadas.
Tabela 36. G3429 35S, Fusão de promotor direta
Linha- gem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ΑΒΆ Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriamento
301 wt Wt wt wt wt wt wt wt wt
302 + wt wt wt - wt wt wt wt
304 + wt wt wt wt wt wt wt wt
305 + wt wt wt wt wt wt wt wt
308 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
310 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
311 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
312 + wt wt wt wt wt wt wt wt
313 + wt wt wt wt wt wt wt wt
319 Wt wt wt wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial
692/726 [0880] Os resultados de dos ensaios de germinação no calor e em resfriamento confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência G3429 de arroz, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3431 de milho (SEQ ID NoS: 1089, 556 e 2922) [0881] G3431 é um gene de milho que foi identificado como sendo um ortólogo putativo de G682. O objetivo desse projeto foi determinar se G3431 possui uma função equivalente aos genes relacionados ao G682 de Arabidopsis através da análise das linhagens 35S::G3431 de Arabidopsis.
[0882] Nós agora geramos linhagens de 35S::G3431; essas plantas mostraram efeitos morfológicos comparáveis as linhagens 35S::G682 e exibiram um fenótipo imberbe combinado com uma redução no tamanho total. Essas semelhanças nos fenótipos sugerem que os genes possuem funções semelhantes. De modo interessante, algumas das linhagens 35S::G3431 também produziram sementes amarelo pálido, o que indicou, provavelmente, uma redução nos níveis de antocianina no revestimento da semente. Tal efeito não foi observado na semente de 35S::G682, porém foi verificado durante estudos de genômicos anteriores, que G682 e seus parálogos inibem a produção de antocianina.
Tabela 37. G3431 35S, Fusão de promotor direta
693/726
Linhagem Germinação em alto teor de NaCI Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio cresci mento no calor Esti a- gem Resfri amento Morfologia de raiz semelhante ao G682
303 wt wt wt wt + wt wt wt ++ +
306 wt wt wt wt + wt wt wt wt -
321 wt wt + wt wt wt wt wt + +
322 wt wt wt wt wt wt wt wt + +
325 wt wt + wt wt wt wt wt + +
327 wt wt + wt wt wt wt wt wt +
328 wt wt + wt wt wt wt wt + +
331 wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
333 wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
340 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0883] Os resultados desses ensaios de estresse abiótico confirmam que G682 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de milho G3431, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0884] O efeito de G3431 no padrão epidérmico indica que o gene podería ser aplicado para manipular desenvolvimento de tricoma; em algumas espécies os tricomas acumulam metabolitos secundários valiosos e em outros exemplos acredita-se que forneçam proteção contra predação.
694/726
A coloração mais fraca das plantas 35S::G3431 poderia indicar que G3431 pode ser usado para regular a produção de compostos relacionados ao flavonóide, que contribuem com o valor nutrucional dos gêneros alimentícios.
G3434 do milho (SEQ ID NoS: 806, e 2913) [0885] G3434 é um ortólogo dos G481 e G482 de Zea mays, e é um elemento do subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT. Entre os parálogos de Arabidopsis no grupo de estudo de G481/G482 G3434 está filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G481.
Observações experimentais [0886] O objetivo desse estudo é avaliar o papel de G3434 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão, e comparar o efeito com aquele dos outros ortólogos e parálogos de G481/ G482. Conforme visto na Tabela 38, as linhagens 35S:G3434 mostraram tolerância ao sal aperfeiçoada e sensibilidade ao açúcar aperfeiçoada em comparação as plantas não transformadas ou do tipo selvagem.
Tabela 38. G3434 35S, Fusão de promotor direta
Germinação Germinação Germi-
Germina- Crescime
Linha- em alto em alto Saca- nação Estia-
ΑΒΆ ção no nto no Resfriamento
gem teor de teor rose no gem
calor calor
NaCl manitol frio
695/726
421 wt wt wt wt wt
422 + wt wt wt wt
423 wt wt wt wt wt
424 wt wt wt wt wt
426 wt wt wt wt wt
429 + + + wt wt
432 wt wt wt wt wt
434 + + + wt wt
435 wt wt wt wt wt
436 wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0887] Os resultados desses ensaios de estresse por sal, manitol e sacarose confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência do milho G3434, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3436 do milho (SEQ ID NoS: 805 e 2914) [0888] G3436 de Zea mays é um ortólogo putativo de
G481, e é um elemento do subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT. Entre os parálogos de Arabidopsis no grupo de estudo de G481, esse gene está filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G485.
Observações experimentais [0889] O objetivo desse estudo foi avaliar o papel de G3436 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem
696/726 através da superexpressão, e comparar os efeitos com aqueles dos outros ortólogos e parálogos de G481.
[0890] Vinte linhagens de plantas 35S::G3436 mostraram uma época de floração acelerada por cerca de 1 semana em comparação as plantas não transformadas ou do tipo selvagem. Esse mesmo fenótipo foi também observado para o gene de Arabidopsis mais proximamente relacionado, G485. Muitas dessas linhagens de florescimento precoce também eram menores que os controles.
[0891] Conforme visto na Tabela 39, os superexpressores de G3436 tiveram melhor desempenho que controles em um número significativo de condições de ensaio, incluindo alto teor de sal, germinação no calor, germinação no frio e crescimento no frio.
Tabela 39. G3436 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriamento
301 wt wt wt Wt + + wt wt +
302 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
304 wt wt wt wt + wt wt wt +
305 wt wt wt wt + wt wt wt wt
308 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt wt wt wt + + wt wt wt
697/726
312 wt wt wt wt + wt wt wt wt
313 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
314 + wt wt wt wt wt wt wt wt
315 wt wt wt wt + wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0892] Os resultados dos ensaios de sal, calor, germinação do frio e resfriamento confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência do milho G3436, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3440 do milho (SEQ ID NoS: 1246, 1213 e 2936) [0893] G3440 é um gene de milho que foi identificado como sendo um ortólogo putativo do G912. O objetivo desse projeto foi determinar se G3440 possui uma função equivalente ao G912 através da análise das linhagens 35S::G3440 de Arabidopsis.
[0894] As linhagens 35S::G3440 eram pequenas, de coloração escura, e floresceram mais tarde em relação ao as linhagens de controle. Esses efeitos foram muito semelhantes aqueles produzidos por superexpressão de G912 em Arabidopsis.
Tabela 40. G3440 35S, Fusão de promotor direta
Germinação Germinação Germina- Germi- Cresci- Estia Res-
Linha- Saca-
em alto em alto ΆΒΆ ção no nação mento no - fria-
gem rose
teor de teor calor no calor gem mento
698/726
NaCl manitol frio
302 wt Wt wt wt wt wt wt wt wt
306 wt Wt wt wt wt wt wt wt wt
308 wt Wt wt wt wt wt wt wt +
309 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
310 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
311 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
312 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
314 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
317 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
320 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0895] Dado aos efeitos morfológicos comparáveis da superexpressão de G3440 e G912, é provável que o genes possuam papéis comparáveis. As alterações no desenvolvimento, causadas por superexpressão de G3440, sugerem que o gene podería se beneficiar da otimização com, por exemplo, uso de promotores induzíveis ou específicos de tecido.
[0896] Os resultados do ensaio em resfriamento confirmam que G912 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência do milho G3440, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3445 da soja (SEQ ID NoS: 1083 e 2915) [0897] G3445 é um gene de soja que foi identificado
699/726 como um ortólogo putativo de G682.
[0898] Nós agora geramos linhagens 35S::G3445; essas plantas mostraram efeitos morfológicos comparáveis as linhagens 35S::G682 e exibiram um fenótipo imberbe combinado com uma leve redução no tamanho total. Essas semelhanças nos fenótipos sugerem que os genes possuem funções semelhantes.
Tabela 41. G3445 35S, Fusão de promotor direta
Linha gem Germina Germina ção em alto teor manitol Sacarose ABA Germi nação no calor Germi nação no frio Crescimento no calor Estia gem Res- Friamento Morfologia de raiz semelhante ao G682
ção alto teor NaCl em de
301 Wt wt wt + wt wt Wt wt wt Wt
302 wt wt wt + wt wt wt wt wt +
303 wt wt wt + wt wt wt wt wt Wt
321 wt wt wt wt wt wt wt wt wt -
323 wt wt wt + wt wt wt wt wt wt
341 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
342 wt wt wt wt wt wt wt + wt wt
344 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
345 wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
347 wt wt wt wt wt wt wt + wt wt
Aplicações em potencial [0899] Os resultados dos ensaios em ABA e de
700/726 estiagem, confirmam que G682 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência G3445 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0900] O efeito de G3445 no padrão epidérmico indica que o gene podería ser aplicado para manipular desenvolvimento de tricoma; em algumas espécies os tricomas acumulam metabolitos secundários valiosos e em outros exemplos acredita-se que forneçam proteção contra predação.
G3448 de soja (SEQ ID NoS: 1087, 553 e 2917) [0901] G3448 é um gene de soja que foi identificado como sendo um ortólogo putativo de G682. O objetivo desse projeto foi determinar se G3448 possui uma função equivalente a dos genes relacionados ao G682 de Arabidopsis através da análise das linhagens 35S::G3448 de Arabidopsis.
[0902] Nós agora geramos linhagens de 35S::G3448; essas plantas mostraram efeitos morfológicos comparáveis as linhagens 35S::G682 e exibiram um fenótipo imberbe combinado com uma redução no tamanho total. Essas semelhanças nos fenótipos sugerem que os genes possuem funções semelhantes. Adicionalmente, as linhagens 35S::G3448 mostraram uma coloração algo mais leve que a dos controles, talvez indicando que os níveis de pigmentos, tais como, antocianinas, tivessem reduzido no tecido da folha.
701/726
Tabela 42. G3448 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação em alto teor de NaCl Germinaç ão em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescí mento no calor Esti a gem Resfriamento Morfologia de raiz semelhante ao G682
302 wt wt wt wt wt wt wt wt 4- 4-
303 wt wt wt wt wt wt wt wt wt 4-
305 wt wt wt wt wt wt wt wt 4- 4-
308 wt wt wt wt wt wt wt + wt 4-
309 wt wt wt wt wt wt wt wt wt 4-
310 wt wt wt wt wt wt wt wt wt 4·
313 wt wt wt wt wt wt wt wt wt 4-
314 wt wt wt wt wt wt wt wt wt 4-
315 wt wt wt wt wt wt wt wt 4- 4·
317 wt wt wt wt wt wt wt wt wt 4-
Aplicações em potencial [0903] Os resultados desses ensaios de estresse por estiagem e resfriamento confirmam que G682 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de soja G3448, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0904] O efeito de G3448 no padrão epidérmico indica que o gene podería ser aplicado para manipular desenvolvimento de tricoma; em algumas espécies os tricomas
702/726 acumulam metabolitos secundários valiosos e em outros exemplos acredita-se que forneçam proteção contra predação. A coloração mais fraca de plantas de 35S::G3488 podería indicar que G3448 pode ser usado para regular a produção de compostos relacionados ao flavonóide, que contribuem com o valor nutrucional dos gêneros alimentícios.
G3449 de soja (SEQ ID NoS: 1088, 554 e 2918) [0905] G3449 é um gene de soja que foi identificado como sendo um ortólogo putativo de G682. 0 objetivo desse projeto foi determinar se G3449 possui uma função equivalente a dos genes relacionados ao G682 de Arabidopsis através da análise das linhagens 35S::G3449 de Arabidopsis.
[0906] Nós agora geramos linhagens 35S::G3449; essas plantas mostraram efeitos morfológicos comparáveis as linhagens 35S::G682 e exibiram um fenótipo imberbe combinado com uma leve redução no tamanho total. Essas semelhanças nos fenótipos sugerem que os genes possuem funções semelhantes. Além disso, os transformantes de 35S::G3449 eram distintamente mais pálidos que os do tipo selvagem no estágio de sementeira, talvez indicando uma redução nos níveis de pigmentos, tais como antocianinas.
Tabela 43. G3449 35S, Fusão de promotor direta
Germinação Germinação Germi- Germi- Crescí Esti Res- Morfologia
Linha- Saca-
em alto em alto ABA nação nação mento a- fria- de raiz
gem rose
teor teor no no no gem mento semelhante
703/726
de NaCl manitol calor frio calor HO G682
303 wt wt wt wt + + wt wt wt +
304 wt wt wt wt wt wt wt wt wt wt
305 wt wt wt wt wt + wt wt wt +
306 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
307 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
310 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
311 wt wt wt wt wt + wt wt + +
312 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
313 + wt wt wt wt wt wt wt wt +
Aplicações em potencial [0907] Os resultados de ensaio de germinação em sal e no frio confirmam que G682 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de soja G3449, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0908] O efeito de G3449 no padrão epidérmico indica que o gene podería ser aplicado para manipular desenvolvimento de tricoma; em algumas espécies os tricomas acumulam metabolitos secundários valiosos e em outros exemplos acredita-se que forneçam proteção contra predação. A coloração mais fraca das plantas 35S::G3449 podería indicar que G3449 pode ser usado para regular a produção de compostos relacionados ao flavonóide, que contribuem com o
704/726 valor nutrucional dos gêneros alimentícios.
G3450 de soja (SEQ ID NoS: 1084, 550, 1076 e 2919) [0909] G3450 é um gene de soja que foi identificado como sendo um ortólogo putativo de G682. Com base em uma construção da árvore filogenética usando domínios de MYB conservados, a proteína G3450 parece ser mais proximamente relacionada à classe de G582 dos genes de Arabidopsis que qualquer dos ortólogos putativos incluídos no estudo. O objetivo desse projeto foi determinar se G3450 possui uma função equivalente a dos genes relacionados ao G682 de Arabidopsis através da análise das linhagens 35S::G3450 de Arabidopsis.
[0910] Nós agora geramos linhagens 35S::G3450; essas plantas mostraram efeitos morfológicos comparáveis aos das linhagens 35S::G682 e exibiram um fenótipo imberbe combinado com uma leve redução no tamanho total. Essas semelhanças nos fenótipos sugerem que os genes possuem funções semelhantes. De modo interessante, as linhagens 35S::G3450 eram ligeiramente pálidas e algumas das linhagens produziram sementes amarelo pálido, o que indicou, provavelmente, uma redução nos níveis de antocianina no revestimento da semente. Tal efeito não foi observado na semente de 35S::G682, porém foi verificado durante nossos estudos genômicos que G682 e seus parálogos inibem a produção de antocianina.
705/726 [0911] As linhagens 35S::G3450 foram recentemente testadas nos ensaios relacionados a estiagem; todas essas linhagens exibiram um aumento na densidade do pelo da raiz e sete das dez linhagens mostraram um desempenho melhorado em um ou mais dos ensaios de estresse relacionado a estiagem com base em placa.
[0912] Efeitos morfológicos e fisiológicos comparáveis obtidos nas linhagens de 35S::G3450 versus linhagens de superexpressão para os genes relacionados a G682 de Arabidopsis, indicam que a proteína G3450 possui uma atividade muito semelhante ou equivalente a das proteínas de Arabidopsis.
Tabela 44. G3450 35S, Fusão de promotor direta
Linha- gem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Cresci mento no calor Esti agem Resfriamento Morfologia da raiz semelhante ao G682
301 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
302 wt wt wt wt + + wt wt wt +
303 wt wt wt wt wt + wt wt + +
304 wt wt wt wt wt + + wt wt +
305 wt wt wt wt wt wt wt wt wt +
306 wt wt wt wt wt wt wt + wt +
307 wt wt wt wt wt + + wt + +
706/726
313 wt wt wt wt wt wt wt wt + +
315 + wt wt wt wt + + + + +
317 + wt wt wt wt + wt wt + +
Aplicações em potencial [0913] Os resultados dos ensaios de germinação e crescimento no frio, calor e sal confirmam que G682 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de soja G3450, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0914] O efeito de G3450 no padrão epidérmico indica que o gene podería ser aplicado para manipular desenvolvimento de tricoma; em algumas espécies os tricomas acumulam metabolitos secundários valiosos e em outros exemplos acredita-se que forneçam proteção contra predação. A coloração mais fraca de plantas 35S::G3450 podería indicar que G3450 pode ser usado para regular a produção de compostos relacionados ao flavonóide, que contribuem com o valor nutrucional dos gêneros alimentícios.
G3452 de soja (SEQ ID NoS: 1183, 1162 e 2924) [0915] G3452 é um gene de soja que foi identificado como sendo um ortólogo putativo de G867. O objetivo desse projeto foi determinar se G3452 possui uma função equivalente ao G867 através da análise das linhagens 35S::G3452 de Arabidopsis.
[0916] As linhagens 35S::G3452 revelaram várias
707/726 semelhanças morfológicas, tais como, tamanho reduzido e alterações de cor, em relação aquelas vistas nos estudos anteriores com as linhagens 35S::G867. Várias linhagens 35S::G3452 tiveram também florescimento levemente precoce.
Tabela 45. G3452 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriamento
em teor NaCl alto de
304 + 4- + wt Wt + 4- +
305 + wt + wt wt + wt wt
310 wt wt wt wt wt wt wt +
314 + wt + wt wt wt wt 4-
316 4- wt 4- wt wt wt wt 4-
318 wt wt 4- wt wt wt wt 4-
Aplicações em potencial [0917] Os resultados desses ensaios de estresse abiótico confirmam que G867 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência G3452 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
[0918] O florescimento acelerado visto nas plantas 35S::G3452 indica que o gene podería ser usado para manipular época de floração. Especificamente, tempos de
708/726 geração mais curtos também ajudariam a agilizar os programas de reprodução, especificamente nas espécies, tais como, árvores, que tipicamente crescem por muitos anos antes de florescer. De modo contrário, pode ser possível modificar a atividade do G3452 (ou seus ortólogos) para retardar a floração, a fim de obter um aumento na biomassa e rendimento.
G3465 de soja (SEQ ID NoS: 1206 e 1242) [0919] G3465 é um gene de soja que foi identificado como sendo um ortólogo putativo do G912. Em uma árvore filogenética, esse gene parece ser mais proximamente relacionado ao G912 e CBF1-3, que os dois genes relacionados ao Arabidopsis, G2107 e G2513. O objetivo desse projeto foi determinar se G3465 possui uma função equivalente a do G912 através da análise das linhagens 35S::G3465 de Arabidopsis.
[0920] A superexpressão de G3465 produziu efeitos prejudiciais em Arabidopsis; as linhagens 35S::G3465 eram pequenas, de coloração escura e desenvolvimento lento. Tais aspectos eram comparáveis, e possivelmente mesmo mais graves que aqueles mostrados pelas linhagens 35S::G912, indicando que os dois genes provavelmente possuem uma função semelhante. Uma linhagem de superexpressão mostrou possuir germinação aumentada em alto teor de manitol em relação as plantas de controle do tipo selvagem e outra linhagem foi insensível ao ABA.
709/726
Tabela 46. G3465 35S, Fusão de promotor direta
Linha- gem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Estia- gem Resfriamento
em teor NaCl alto de
321 Wt wt wt wt wt
322 wt wt wt wt wt
323 wt wt wt wt wt
324 wt wt wt wt wt
341 wt wt wt wt wt
343 wt wt wt wt wt
344 wt wt wt wt wt
346 wt + wt wt wt
347 wt wt wt wt wt
348 wt wt wt + wt
Aplicações em potencial [0921] Em razão dos efeitos morfológicos semelhantes da superexpressão de G3465 e G912, é provável que os genes tenham papéis comparáveis. Os efeitos morfológicos que foram aparentes nessas linhagens sugerem que a utilização do G3465 possa beneficiar-se da otimização por uso de promotores diferentes ou modificações de proteína.
[0922] Os resultados dos ensaios de germinação em ABA e manitol confirmam que G912 e suas sequências
710/726 correlatas, incluindo a sequência de G3465 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3469 de soja (SEQ ID NoS: 1210 e 1237) [0923] G3469 é um gene de soja que foi identificado como sendo um ortólogo putativo do G912. Morfologicamente, os superexpressores do G3469 variaram de serem um pouco pequenos no tamanho em relação as plantas sem diferentes consistentes com relação ao controle.
[0924] Resultados dos ensaios a base de placa mostram que G3469 é, semelhante ao seu ortólogo G912, capaz de conferir tolerância ao estresse abiótico nas plantas, conforme indicado pela tolerância maior que as plantas de controle do tipo selvagem dos superexpressores de G3469 em relação as condições de resfriamento e germinação em alto teor de sal.
Tabela 47. G3469 35S, Fusão de promotor direta
Linha- gem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Esti agem Resfriamento
em teor NaCl alto de
302 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
303 + wt wt wt wt wt wt wt wt
305 + wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
711/726
310 + wt wt wt wt wt wt wt wt
311 + wt wt wt wt wt wt wt wt
312 + wt wt wt wt wt wt wt wt
314 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
315 wt wt wt wt wt wt wt wt +
319 + wt wt wt wt wt wt +
304 wt wt wt wt wt wt wt wt +
307 wt wt wt wt wt wt wt wt +
317 wt wt wt wt wt wt wt wt +
318 wt wt wt wt wt wt wt + wt
Aplicações em potencial [0925] Os resultados dos ensaios de sal, estiagem e resfriamento confirmam que G912 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência de G3469 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3470 de soja (SEQ ID NoS: 2947 e 2948) [0926] G3470 é ortólogo do G481 e G482 de Glycine max. Entre os parálogos de Arabidopsis no grupo de estudo de G481, G3470 está filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G481 propriamente.
Observações experimentais [0927] O objetivo desse estudo foi avaliar o papel de G3470 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão, e comparar os efeitos com
712/726 aqueles dos outros ortólogos e parálogos do G481.
[0928] Vinte linhagens 35S::G3470 foram examinadas.
Metade dos transformantes exibiram um retardo marcado no florescimento, cerca de 1 semana e tinham folhas mais estreitas e escuras em comparação aos controles do tipo selvagem ou não transformados. Esse mesmo fenótipo foi observado para G481 e alguns de seus ortólogos putativos.
[0929] As linhagens 35S::G3470 agora foram testadas nos ensaios fisiológicos a base de placa; sete das dez linhagens mostraram germinação melhorada, em relação ao tipo selvagem, quando testadas em ensaios de germinação de NaCl. Adicionalmente, duas linhagens 35S::G3470 mostraram um desempenho aperfeiçoado em um ensaio de crescimento em calor.
Tabela 48. G3470 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ΑΒΆ Germinação no calor Germinação no frio Crescimento no calor Estiagem Resfriamento
em teor NaCl alto de
301 wt wt wt wt wt wt + wt wt
302 + wt wt wt wt wt wt wt wt
303 + wt wt wt wt wt + wt wt
305 + wt wt wt wt wt wt wt wt
306 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt wt wt wt wt wt wt wt
713/726
310 + wt wt wt wt wt wt wt wt
316 + wt wt wt wt wt wt wt wt
317 Wt wt wt wt wt wt wt wt wt
318 4- wt wt wt wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0930] Os resultados do ensaio de germinação em sal confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência G3470 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3471 de soja (SEQ ID NoS: 2949 e 2950) [0931] G3471 de Glycine max é um ortólogo dos G481 e G482. Entre os parálogos de Arabidopsis no grupo de estudo de G481, G3471 está filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G481.
Observações experimentais [0932] O objetivo desse estudo foi avaliar o papel de G3471 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão, e comparar os efeitos com aqueles dos outros ortólogos e parálogos do G481.
[0933] Alterações na época de floração foram observadas entre as linhagens 35S::G3471. Várias linhagens mostraram florescimento tardio, enquanto outras mostraram uma aceleração marginal na floração. Algumas das linhagens
35S::G3471 também mostraram alterações na forma da folha.
[0934] Várias linhagens tiveram desempenho melhor
714/726 que os controles nos ensaios de estresse abiótico, incluindo germinação no calor, crescimento em condições frias e melhor tolerância a estiagem em um ensaio a base de placa.
Tabela 49. G3471 35S, Fusão de promotor direta
Linha- gem Germinação em alto teor de NaCl Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germinação no calor Germinação no frio Cresci mento no calor Estia- gem Resfriamento
303 Wt wt wt wt + wt Wt wt +
306 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
307 wt wt wt wt + wt wt wt wt
308 wt wt wt wt wt wt wt + wt
312 wt wt wt wt + wt wt wt wt
328 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
329 wt wt wt wt wt wt wt wt
330 wt wt wt wt wt wt wt wt
337 wt wt wt wt wt wt wt wt
338 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
Aplicações em potencial [0935] Os resultados do ensaio de germinação em sal confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência G3472 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
Aplicações em potencial
715/726 [0936] Os resultados do ensaio de germinação em sal confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência G3472 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3472 da soja (SEQ ID NoS: 801 e 2907) [0937] G3472 é um ortólogo dos G481 e G482 de Glycine max, e é um elemento do subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT. Entre os parálogos de Arabidopsis no grupo de estudo de G481, esse gene está filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G485.
Observações experimentais [0938] O objetivo desse estudo foi avaliar o papel de G3472 na tolerância relacionada ao estresse por estiagem através da superexpressão. As linhagens 35S::G3472 não mostraram diferenças consistentes na morfologia em relação aos controles do tipo selvagem ou não transformados. G3472 não produziu florescimento acelerado da mesma maneira que os outros genes relacionados ao G485, tais como G3474, G3475 e G3476.
[0939] Três linhagens 35S::G3472 eram mais tolerantes ao sal que controles do tipo selvagem ou não transformados em um ensaio a base de placa.
Tabela 50. G3472 35S, Fusão de promotor direta
Linha- Germinação Germinação em Saca- Germi- Germi- Crescime Estia-
ABA Resfriamento
gem em alto alto teor rose nação nação nto no gem
716/726
teor de NaCl manitol no calor no frio calor
303 wt wt wt wt wt wt Wt wt wt
304 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
305 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
306 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
307 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
308 + wt wt wt wt wt wt wt wt
311 + wt wt wt wt wt wt wt wt
313 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
314 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
318 + wt wt wt wt wt wt wt -
Aplicações em potencial [0940] Os resultados do ensaio de germinação em sal confirmam que G481 e suas sequências correlatas, incluindo a sequência G3472 da soja, são excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao estresse abiótico nas plantas.
G3475 de soja (SEQ ID NoS: 800 e 2908) [0941] G3475 é de Glycine max e é um ortólogo putativo de G481, e é um elemento do subgrupo HAP3 da família do fator de transcrição de ligação de caixa CCAAT. Entre os parálogos de Arabidopsis no grupo de estudo de G481, esse gene está filogeneticamente mais proximamente relacionado ao G485.
Observações experimentais
717/726 [0942] As linhagens de 35S::G3475 mostraram uma floração acelerada em cerca de duas semanas, em comparação aos controles do tipo selvagem ou não transformados. Esse mesmo fenótipo foi também observado para o gene de Arabidopsis mais proximamente relacionado, G485. Muitas dessas linhagens de florescimento precoce também eram menores que os controles.
[0943] Crescimento de quatro linhagens 35S::G3475 foi mais tolerante as condições de frio que controles do tipo selvagem ou não transformados.
Tabela 51. G3475 35S, Fusão de promotor direta
Linhagem Germinação Germinação em alto teor manitol Sacarose ABA Germina çâo no calor Germinaçã o no frio Crescimento no calor Estia gem Resfriamento
em teor NaCl alto de
301 wt wt wt wt wt wt Wt wt wt
302 wt wt wt wt wt wt wt wt +
303 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
304 wt wt wt wt wt wt wt wt +
306 wt wt wt wt wt wt wt wt +
307 wt wt wt wt wt wt wt wt +
308 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
309 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
310 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
311 wt wt wt wt wt wt wt wt wt
718/726
Aplicações em potencial [0944] Os resultados os resultados do ensaio em resfriamento confirmam que G481 e suas sequências
correlatas, incluindo a sequência G3475 da soj a, são
excelentes candidatos para aperfeiçoar tolerância ao
estresse abiótico nas plantas.
Exemplo XIV: Transformação de Plantas de Cereais com
um Vetor de Expressão
[0945] Plantas de cereais, tais como, porém não
limitadas ao milho, trigo, arroz, sorgo ou cevada podem também ser transformadas com as presentes sequências de polinucleotideo em vetores de expressão pMEN20 ou pMEN65 com o fim de modificar os traços das plantas. Por exemplo, pMENOlO pode ser modificado por substituição da região de codificação de NptII com um gene BAR de Streptomyces hygroscopicus que confere resistência a fosfinotricina. Os sítios Kpnl e BglII do gene Bar são removidos por mutagenese direcionada ao sítio quando o códon de silêncio modifica.
[0946] O vetor de clonagem pode ser introduzido dentro de uma variedade de plantas de cereais por meios bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, transferência direta de DNA ou transformação mediada por [0947] Agrobacterium tumefaciens. Agora é rotina produzir plantas transgênicas da maior parte das colheitas
719/726 de cereais (Vasil (1994) Plant Mol. Biol. 25: 925-937) tais como, milho, trigo, arroz, sorgo (Cassas e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 11212-11216, e cevada (Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104:37-48. Os métodos de transferência de DNA, tais como, os microprojéteis, podem ser usados para o milho (Fromm e outros, (1990) Bio/Technol. 8: 833-839); Gordon-Kamm e outros, (1990) Plant Cell 2: 603-618; Ishida (1990) Nature Biotechnol. 14:745-750), trigo (Vasil e outros, (1992) Bio/Technol. 10:667-674; Vasil e outros, (1993) Bio/Technol. 11:15531558; Weeks e outros, (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084), arroz (Christou (1991) Bio/Technol. 9:957-962; Hiei e outros, (1994) Plant J. 6:271-282; Aldemita and Hodges (1996) Planta 199:612-617; and Hiei e outros, (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218). Para a maioria das plantas de cereal, as célula embriogênicas derivadas de tecidos de escutelo imaturo são os alvos celulares preferidos para transformação (Hiei e outros, (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218; Vasil (1994) Plant Mol. Biol. 25: 925-937).
[0948] Vetores de acordo com a presente invenção podem ser transformados em células embriogênicas de milho, derivadas do tecido escutelar imaturo, por uso de bombardeamento de microprojéteis, com o genótipo A18 8XB7 3 como o genótipo preferido (Fromm e outros, (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; Gordon-Kamm e outros, (1990) Plant
720/726
Cell 2: 603-618). Após o bombardeamento, os tecidos são separados em fosfinotricina para identificar as células embriogênicas transgênicas (Gordon-Kamm e outros, (1990) Plant Cell 2: 603-618). As plantas transgênicas são regeneradas por técnicas de regeneração de milho padrão (Fromm e outros, (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; GordonKamm e outros, (1990) Plant Cell 2: 603-618).
[0949] Os plasmideos preparados conforme descrito acima, podem também ser usados para produzir plantas de trigo e arroz transgênicas (Christou (1991) Bio/Technol. 9:957-962; Hiei e outros, (1994) Plant J. 6:271-282; Aldemita and Hodges (1996) Planta 199:612-617; and Hiei e outros, (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218) que expressam coordenadamente os genes de interesse seguindo-se os protocolos de transformação padrão conhecidos dos versados na técnica para arroz e trigo (Vasil e outros, (1992) Bio/Technol. 10:667-674; Vasil e outros, (1993) Bio/Technol. 11:1553-1558; and Weeks e outros, (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084), onde o gene bar é usado como marcador selecionável.
Exemplo XV: Transformação de Canola com um Plasmideo contendo CBF1, CBF2, ou CBF3 [0950] Após identificar os genes homólogos ao CBF1, a canola foi transformada com um plasmideo contendo os genes CBF1, CBF2 e CBF3 de Arabidopsis clonados no vetor
721/726 pGA643 (An (1987) Methods Enzymol. 253: 292). Nessas construções, os genes CBF foram expressos constitutivamente sob o promotor CaMV 35S. Além disso, o gene CBF1 foi clonado sob o controle do promotor de Arabidopsis COR15 no mesmo vetor pGA643. Cada construção foi transformada na cepa de Agrobacterium [0951] GV3101. As agrobactérias transformadas cresceram por dois dias em meio AB mínimo contendo antibióticos apropriados.
[0952] Canola da primavera (B. napus cv. Westar) foi transformada usando protocolo de Moloney e outros, (1989) Plant Cell Reports 8: 238, com algumas modificações, conforme descrito. Em resumo, as sementes foram esterilizadas e colocadas em placa em meio MS de meia resistência, contendo sacarose a 1%. As placas foram incubadas a 24 °C sob 60-80 μΕ/ιη23 de luz usando um fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro. Os cotilédones de sementeiras de 4-5 dias de vida foram coletados, os peciolos cortados e imersos em solução de Agrobacterium. Os cotilédones imersos foram colocados em meio de co-cultivo em uma densidade de 20 cotilédones/placa e incubados conforme descrito acima por 3 dias. Os explantes foram transferidos para os mesmos meio, porém contendo 300 mg/L de timentina (SmithKline Beecham, PA) e reduzidos para 10 cotilédones/placa. Após 7 dias, os
722/726 explantes foram transferidos para o meio de Seleção/Regeneração. As transferências continuaram a cada 2-3 semanas (2 ou 3 vezes) até os brotos estarem desenvolvidos. Os brotos foram transferidos para o meio Alongamento de Broto a cada 2-3 semanas. Os brotos que pareceram saudáveis foram transferidos para meio de enraizamento. Quando boas raízes se desenvolveram, as plantas foram colocadas em solo de potes úmido.
[0953] As plantas transformadas foram então analisadas quanto a presença do gene NPTII/resistência a canamicina por ELISA, usando um kit ELISA NPTII, da 5Prime3Prime Inc. (Boulder, CO) . Aproximadamente 70% das plantas classificadas eram positivas quanto a NPTII. Apenas aquelas plantas foram adicionalmente analisadas.
[0954] A partir da análise Northern blot as plantas que foram tarnsforamdas com as construções que expressam constituição, mostraram expressão dos genes de CBF e todos os genes CBF eram capazes de induzir o gene BN115 regulado em frio Brassica napus (homólogo do gene Arabidopsis COR15). A maior parte das plantas transgências parece exibir um fenótipo de crescimento normal. Conforme esperado, as plantas transg~enicas são mais tolerantes ao congelamento que as plantas do tipo selvagem. Usando o vazamento de elétrodo do teste de folhas, o controle mostrou um vazamento de 50% em -2 a -3°C. A canola de
723/726 primavera transformada com CBF1 ou CBF2 mostrou um vazamento de 50% em -6 a -7°C. A canola de primavera transformada com CBF3 mostrou um vazamento em cerca de -10 a -15°C. A canola de inverno transformada com CBF3 mostrou um vazamento de 50% em cerca de -16 a -20 °C. Adicionalmente, se a canola de primavera ou inverso forem aclimatadas ao frio, as plantas transfrmadas podem exibir um aumento adicional na tolerância ao congelamento de pelo menos -2°C.
[0955] Para testar a tolerância a salinidade das plantas transforamdas, as plantas foram aguadas com 150 mM de NaCl. As plantas superexpressando CBF1, CBF2 ou CBF3 cresceram melhor em comparação as plantas que não foram transforamdas com CBF1, CBF2 ou CBF3.
[0956] Esses resulatdos demonstram que os equivalentes dos fatores de transcrição de Arabidopsis podem ser identificados e mostraram conferir funções semelhantes nas espécies de plantas que não Arabidopsis.
Exemplo XVI: Clonagem de promotores de fator de transcrição [0957] Os promotores são isolados dos genes de fator de transcrição que possuem padrões de expressão de gene úteis para uma faixa de aplicações, conforme determinado pelos processos bem conhecidos na arte (incluindo análise do perfil de transcrição com cDNA ou
724/726 microdisposições de oligonucleotídeo, análise Northern blot, RT-PCR semiquantitativa ou quantitativa). Os perfis de expressão de gene interessantes são revelados por determinação da abundância de transcrição para um gene de fator de transcrição selecionado, após exposição das plantas a uma faixa de diferentes condições experimentais e em uma faixa de tecido diferente ou tipos de órgãos, ou estágios de desnvolvimento. Condições experimentais as quais as plantas são expostas para essa finalidade icnluem, frio, calor, estiagem, desafio osmótico, concentrações variadas de hormônios (ABA, GA, auxina, citoquinina, ácido salicílico, brassinoesteróide), agente patogênico e desafio de praga. Os tipos de tecido e estágios de desenvolvimento incluem caule, raiz, flor, folhas de roseta, folhas de cauline, silíquas, germinação da semente e tecido meristemático. 0 conjunto de níveis de expressão provê um padrão que é determinado pelos elementos reguladores do promotor de gene.
[0958] Os promotores de fator de transcrição para os genes revelados aqui são obtidos por clonagem de 1,5 kb a 2,0 kb de sequência genômica imediatamente a montante do códon de partida de radução para a sequência de codificação da proteína de fator de transcrição codificada. Essa região inclui a 5'-UTR do gene de fator de transcrição, que pode compreender elementos reguladores. A região 1,5 kb a 2,0 kb
725/726 é clonada através de métodos de PCR usando iniciadores que incluem um na direção 3' localizada no códon de partida de tradução (incluindo a sequência adaptadora aprorpiada) e um na direção 5' localizada de 1,5 kb a 2,0 kb a montante do códon de partida de tradução (incluindo sequência adaptadora apropriada). Os fragmentos desejados são ampliados por PCR do DNA genômico Col-0 de Arabidopsis usando polimerase de Taq DNA de alta fidelidade para minimizar a incorporação de mutação(ões) de ponto. Os iniciadores de cloangem incorporam dois sítios de restrição raros, tais como Notl e Sfil, encontrados em baixa frequência através do genma de Arabidopsis. Sítios de restrição adicionais são usados nos momentos onde um sítio de restrição Notl ou Sfil está presente dentro do promotor.
[0959] O fragmento de 1,5-2,0 kb a montante do códon de partida de tradução, incuindo a região 5' não traduzida do fator de transcrição, é clonado em um vetor de transformação binário, imediatamente a montante do gene repórter apropriado, ou um gene transativador que é capaz de programar a expressão de um gene repórter em uma segunda construção de gene. Os genes repórteres usados incluem proteína fluorescente verde (e variantes de cor de proteína fluorescentes correlatas), beta-glucuronidase e luciferase. Genes transativadores apropriados incluem LexA-GAL4, juntamente com um repórter transativável em um segundo
726/726 plasmideo binário (conforme revelado no Pedido de Patente 09/958.131, incororado aqui como referência). O(s) plasmideo(s) binário(s) é(são) transferidos para o Agrobacterium e a estrutura do plasmideo confirmada pr PCR. As cepas são introduzidas nas plantas Arabidopsis conforme descrito em outros exemplos e padrão de expressão genética determinado de acordo com os processos padrão conhecidos dos versados na técnica para monitorar fluorescência GFP, atividade beta-glucuronidase ou luminescência.
[0960] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo são incorporados aqui como referência, no mesmo grau em que uma publicação ou pedido de patente individual seria específica e individualmente indicado como sendo incorporado como referência.
[0961] A presente invenção não está limitada às concretizações específicas descritas aqui. A invenção foi descrita na integra e, ficará claro ao versado na técnica que muitas alterações e modificações podem ser feitas a mesma, sem com isso fugir do espírito e escopo das reivindicações apensas. As modificações que ficaram claras da descrição anterior e Figuras anexas encontram-se dentro do escopo das reivindicações.

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para produção de uma planta transgênica possuindo tolerância aumentada ao estresse abiótico caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
    (a) fornecer um vetor de expressão compreendendo:
    (i) uma sequência de polinucleotídeo como definida pela SEQ ID NO: 2919; e (ii) um promotor constitutivo, induzível ou tecido específico operativamente ligado à sequência de nucleotídeo;
    (b) introduzir o vetor de expressão na célula da planta; e (c) identificar uma ou mais plantas tolerantes ao estresse abiótico produzidas dessa forma, comparando-se uma ou mais plantas tolerantes ao estresse abiótico com uma ou mais das plantas não transgênicas da mesma espécie.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a tolerância ao estresse abiótico é selecionada do grupo consistindo em tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância ao estresse da estiagem e tolerância ao estresse por sal.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente as etapas de:
    (e) cruzar uma das plantas tolerantes ao estresse abiótico com ela mesma ou outra planta;
    2/2 (f) selecionar sementes que se desenvolvem como resultado do cruzamento; e desenvolver uma planta de progênie da semente, produzindo, assim, uma planta de progênie transgênica que codifica uma proteína como definida na SEQ ID NO: 10 4.
  4. 4. Método para aumentar a tolerância da planta ao estresse abiótico caracterizado pelo fato de compreender:
    (a) fornecer um vetor compreendendo:
    (i) uma sequência de polinucleotídeo como definida pela SEQ ID NO: 2919; e (ii) um promotor constitutivo, induzível ou tecido específico operativamente ligado à sequência de nucleotídeo; e (b) transformar a planta alvo com o vetor para gerar uma planta transformada com tolerância aumentada ao estresse abiótico em comparação às plantas não transgênicas da mesma espécie.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a tolerância ao estresse abiótico é selecionada do grupo consistindo em tolerância ao calor, germinação no frio, tolerância ao estresse da estiagem e tolerância ao estresse por sal.
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