CN116555333B - 中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用 - Google Patents

中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。本发明的目的在于提高水稻种子花青素含量，本发明提供中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用，所述ZlMYB1基因序列如SEQ ID No:1所示，ZlMYB2基因序列如SEQ ID No:2所示。本发明能够有效在水稻中过表达ZlMYB1和ZlMYB2基因。在与对照植株生长环境一致的情况下，过表达ZlMYB1和ZlMYB2基因的水稻与对照组相比，水稻种子的颜色变为黑色，水稻种子花青素含量显著提高。

Description

中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的 应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，特别是涉及中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用。
背景技术
类黄酮化合物，如花青素、黄酮醇和原花青素，是植物的主要次生代谢产物。有色稻米主要因富含不同类型的类黄酮化合物而呈现出不同的颜色，如棕色、红色、紫色和黑色等。其中紫色、黑色种皮一般是由花青素积累形成，而棕色、红色种皮是由于原花青素的积累形成的。花青素是一种水溶性类黄酮色素，基本结构是C6-C3-C6，在此基础上与不同取代基结合生成天竺葵素、矢车菊素、芍药花素、矮牵牛素、飞燕草素和锦葵花素等六大类花青素，这些花青素决定了植物的花色、果色、叶色等色彩表型，赋予给植物丰富多彩的颜色，起到吸引昆虫传粉、提高植物抵御不良环境能力的作用，同时，这些花青素也是强有效的自由基清除剂，具有清除自由基、保护植物免受强光照射等作用。此外，花青素对人类健康有重要促进作用，研究证明花青素能减少体内活性氧；降低糖尿病、炎症、过敏、肥胖、心脏病等发病率；抑制肿瘤的增长速度，改善消化系统，甚至具有一定的抗衰老和延长寿命的功能。目前已被广泛地应用于食品着色、医药和化妆品等领域。
目前大多数栽培稻的种皮颜色为白色，但黑米因其感官特性和高营养价值及其保健特性而倍受关注。遗传学研究表明，黑米起源于一个bHLH类转录因子kala4(又名OsB2)的获得性突变，该突变使原本几乎不表达的kala4在种皮和叶片中显著上调表达，从而激活相应的花青素合成基因的表达。花青素的合成途径中存在很多控制着其合成关键基因时空表达的调控蛋白，其中MYB、bHLH和WD40重复蛋白3类转录因子是调控类黄酮合成的主要转录因子，MYB类转录因子可以单独调控花青素合成基因，也可以与bHLH和WD40组成MYB-bHLH-WD40(MBW)复合体来激活结构基因的表达。在紫色叶片水稻中，玉米中ZmC1的同源基因OsC1，是一个R2R3-MYB转录因子；OsB1和OsB2与玉米中bHLH类转录因子booster 1同源；OsWD40是一个WD40转录因子。研究人员证实OsC1、OsB1/OsB2和OsWD40可以组成MBW复合体来激活水稻叶片中花青素合成基因的表达。值得关注的是，最近研究发现OsMYB3是水稻种子中控制花青素合成的关键R2R3-MYB转录因子；敲除“紫香糯1号”黑米品种的OsMYB3会导致其种皮由黑色变为棕色，种子花青素含量显著降低，且降低到检测限以下。因此，复杂的花青素的合成途径涉及了一系列代谢产物形成及修饰和运输的基因和蛋白，所以更多的MYB转录因子或者MBW复合体有待研究人员去挖掘。
中国菰(Zizania latifolia)起源于中国，与水稻同属禾本科(Gramineae)，在中国、日本、韩国和东南亚均有分布。中国菰资源在中国十分丰富，尤其是长江中下游地区和淮河流域的一些水面分布最为广泛。研究表明，来自长江中下游地区的野生中国菰是一种良好的禾谷类作物驯化候选品种。中国菰的颖果称为中国菰米(Chinese wild rice)，其在我国作为粮食食用已经有3000多年的历史。中国菰米是一种全谷物，其所含的酚酸、类黄酮和其它植物化学物质具有优异的抗氧化特性，是一种很有潜力的功能性食品原料。中国菰米中的类黄酮化合物有159个，与稻米相比，中国菰米中上调和下调的类黄酮化合物分别有72个、6个，72个上调类黄酮化合物可能与中国菰米种子的棕黑色种皮有关。据报道，中国菰米中的花青素含量高达258.00±17.31mg/100g。因此，中国菰中花青素生物合成相关调控基因的发掘，对创新富含花青素的功能型稻米品种、改善居民膳食结构和降低造成慢性疾病的膳食风险因素都具有重要的现实意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提高水稻种子花青素含量，提供中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用。本发明分离和应用两种分别包含ZlMYB1和ZlMYB2基因的DNA片段，利用组成型启动子分别驱动两段DNA片段超量转录ZlMYB1和ZlMYB2基因后时，水稻种子的花青素含量显著增加。
本发明的技术方案如下：
中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用，所述ZlMYB1基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，共762个核苷酸；所述ZlMYB2基因的核苷酸序列如SEQID No:2所示，共774个核苷酸。
进一步的，所述ZlMYB1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，共253个氨基酸；所述ZlMYB2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，共257个氨基酸。
进一步的，将ZlMYB1和ZlMYB2基因编码蛋白的过表达载体分别转入对照水稻中，分别得到能够过表达ZlMYB1和ZlMYB2的转基因水稻。
进一步的，将ZlMYB1和ZlMYB2基因序列分别构建到PC2300S过表达载体上，将所述过表达载体分别转入对照水稻中，通过提高该基因mRNA的表达量而获得种子花青素含量显著提高的转基因水稻植株。
进一步的，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，得到所述转基因水稻。
有益效果：
本发明采用PCR技术，从中国菰基因组DNA中分别扩增得到含有ZlMYB1和ZlMYB2基因编码序列的基因组DNA片段，将这两段序列分别构建到PC2300S过表达载体上，利用该载体转化水稻，可通过提高该基因mRNA的表达量而获得种子花青素含量显著提高的转基因水稻植株。
本发明提供了过表达ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用。本发明能够有效在水稻中过表达ZlMYB1和ZlMYB2基因。在与对照植株生长环境一致的情况下，过表达ZlMYB1或ZlMYB2基因的水稻所收获的种子与对照组相比，具有更高的总酚、总黄酮和总花青素含量以及更高的DPPH自由基清除能力和ABTS·+自由基吸收能力。这说明ZlMYB1和ZlMYB2基因过表达对水稻中花青素类化合物的合成途径具有有效调控作用，提高了转基因水稻种子中的花青素含量，进而导致水稻种子由棕色变为黑色。
本发明基于中国菰基因组测序结果，通过与水稻基因组比对和共线性分析，在中国菰中克隆得到两个控制花青素合成的基因ZlMYB1和ZlMYB2。生物学功能验证表明，过表达ZlMYB1和ZlMYB2基因引起转基因水稻种子花青素含量显著提升，本发明证实了ZlMYB1和ZlMYB2基因的生物学功能及其应用途径和方法。
附图说明
图1为实施例1采用ClustalΩ软件(公开使用软件)将ZlMYB1和ZlMYB2基因推导的蛋白序列与水稻中的同源基因序列进行比对的结果。从图1可以看出，ZlMYB1和ZlMYB2与OsMYB3蛋白序列具有一定的相似度，且其若干位点是保守的。附图标记说明：在图1中OsMYB3为水稻中与本发明同源的基因，ZlMYB1和ZlMYB2基因为本发明克隆的基因。
图2为实施例1ZlMYB1阳性克隆测序峰图和测序结果与ZlMYB1基因序列比对结果。
图3为实施例1ZlMYB2阳性克隆测序峰图和测序结果与ZlMYB2基因序列比对结果。
图4为实施例2过表达载体的物理图谱。(A)为ZlMYB1过表达载体的物理图谱；(B)为ZlMYB2过表达载体的物理图谱。
图5为实施例2转基因水稻阳性植株鉴定的琼脂糖电泳胶图。(A)为ZlMYB1过表达载体转化植株鉴定的琼脂糖电泳胶图；(B)为ZlMYB2过表达载体转化植株鉴定的琼脂糖电泳胶图。M代表DL2000 marker，B代表空白对照，N代表阴性对照，P代表阳性对照。
图6为实施例3转基因水稻出苗时期的表型观察。附图标记说明：(A)为敲除OsMYB3基因的紫香糯1号所得种子经培养得到的对照水稻，(B)为对照水稻种子经转ZlMYB1基因后培养所得的水稻，(C)为对照水稻种子经转ZlMYB2基因后培养所得的水稻。
图7为实施例3单株转基因水稻出苗时期的表型观察。附图标记说明：(A)为敲除OsMYB3基因的紫香糯1号所得种子经培养得到的水稻，(B)为对照水稻种子经转ZlMYB1基因后培养所得的水稻，(C)为对照水稻种子经转ZlMYB2基因后培养所得的水稻。
图8为实施例3中ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子表型观察。附图标记说明：(A)为敲除OsMYB3基因的紫香糯1号所得种子经培养得到的对照水稻种子，(B)为对照水稻种子经转ZlMYB1基因后培养所得的水稻种子，(C)为对照水稻种子经转ZlMYB2基因后培养所得的水稻种子。
图9为实施例4的1个对照(CK)、3个ZlMYB1(ZlMYB1-1、ZlMYB1-2、ZlMYB1-3)和3个ZlMYB2(ZlMYB2-1、ZlMYB2-2、ZlMYB2-3)转基因水稻种子的总酚含量比较结果，测试结果为三次重复的均值，误差线代表标准偏差(SD)。
图10为实施例4的1个对照(CK)、3个ZlMYB1(ZlMYB1-1、ZlMYB1-2、ZlMYB1-3)和3个ZlMYB2(ZlMYB2-1、ZlMYB2-2、ZlMYB2-3)转基因水稻种子的总黄酮含量比较结果。测试结果为三次重复的均值，误差线代表标准偏差(SD)。
图11为实施例4的1个对照(CK)、3个ZlMYB1(ZlMYB1-1、ZlMYB1-2、ZlMYB1-3)和3个ZlMYB2(ZlMYB2-1、ZlMYB2-2、ZlMYB2-3)转基因水稻种子的总花青素含量比较结果，测试结果为三次重复的均值，误差线代表标准偏差(SD)。
图12为实施例5的1个对照(CK)、3个ZlMYB1(ZlMYB1-1、ZlMYB1-2、ZlMYB1-3)和3个ZlMYB2(ZlMYB2-1、ZlMYB2-2、ZlMYB2-3)转基因水稻种子DPPH自由基清除能力比较结果。测试结果为三次重复的均值，误差线代表标准偏差(SD)。
图13为实施例5的1个对照(CK)、3个ZlMYB1(ZlMYB1-1、ZlMYB1-2、ZlMYB1-3)和3个ZlMYB2(ZlMYB2-1、ZlMYB2-2、ZlMYB2-3)转基因水稻种子的ABTS·+自由基吸收能力。测试结果为三次重复的均值，误差线代表标准偏差(SD)。
具体实施方式
以下实施例采用的生物材料中国菰采集于中国江苏省淮安市；对照水稻为敲除OsMYB3基因的紫香糯1号水稻，种子来源于中国湖北省武汉市。
实施例1：ZlMYB1和ZlMYB2基因的获得
1.1提取中国菰总RNA和制备cDNA
(1)提取中国菰总RNA：
使用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取中国菰叶片RNA，并反转录为cDNA。中国菰叶片RNA提取参考植物RNA提取试剂盒说明书进行，具体实验方法如下：
步骤1、中国菰叶片样本在液氮中迅速研磨成粉末，称取50mg液氨研磨的样本，加入65℃预热的500μL Bufer PRL，立即剧烈涡旋震荡60s。
步骤2、将裂解物在65℃水浴5min，期间颠倒2次，12000rpm离心10min，转移上清至新的1.5mL RNase-free离心管中，加入0.5倍上清体积的无水乙醇，立即吹打混匀。
步骤3、将上述混合液转移至FastPure gDNA-Filter Column II中，12000rpm离心2min，弃滤液。
步骤4、向FastPure gDNA-Filter Column II中加入500μL Buffer PRLPlus，12000rpm离心30s，收集滤液。
步骤5、向滤液中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇，立即吹打混匀。将上述混合液转移至FastPure RNA Column IV中，12000rpm离心2min，弃滤液。
步骤6、向FasiPure RNA Column IV中加入700μL Buffer PRW1，室温放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液。
步骤7、向FastPure RNA Column IV中加入500μL Buffer PRW2，12000rpm离心30s，弃滤液，重复本步骤一遍。
步骤8、将FastPure RNA Column IV吸附柱12000rpm空转离心2min，去掉FastPureRNA Column IV中残留的Buffer PRW2。
步骤9、将FastPure RNA Column IV转移至新的RNase-free 1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央悬空滴加40μL的RNase-free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(2)制备cDNA：
RNA提取后，测定RNA浓度，每个样品取2.0μg作为反转录的底物。使用反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA产物，-20℃冰箱保存备用。
表1反转录PCR体系及程序
1.2ZlMYB1和ZlMYB2基因的扩增
根据ZlMYB1基因序列设计的引物如下：
ZlMYB1-F：5’-TCGAGCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGAAGAGAGGGGCATGGAC-3’(SEQ IDNO:5)；
ZlMYB1-R：5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCTACTCCGCATGAGGTTGGG-3’(SEQ IDNO:6)。
以1.1制备得到ZlMYB1的cDNA作为模板，采用上述引物进行PCR扩增，获得目的片段ZlMYB1。
根据ZlMYB2基因序列设计的引物如下：
ZlMYB2-F：5’-TCGAGCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGGGAGGAGGGCGTGCTG-3’(SEQ IDNO:7)；
ZlMYB2-R：5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCTACTTCGCATGAAGCCGCT-3’(SEQ IDNO:8)。
以1.1制备得到ZlMYB2的cDNA作为模板，采用上述引物进行PCR扩增，获得目的片段ZlMYB2。
PCR扩增体系与反应程序如下：
表2PCR体系及程序
实施例2：ZlMYB1和ZlMYB2基因过表达载体的构建和遗传转化
2.1ZlMYB1和ZlMYB2基因过表达载体的构建
利用限制性内切酶SacI和BamHI酶切PC2300S载体，用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用胶回收试剂盒回收线性化的PC2300S大片段。与步骤1.2PCR扩增产物ZlMYB1和ZlMYB2分别进行重组，将目的基因连接到载体，转化到大肠杆菌感受态DH5α中，得到过表达载体ZLMYB1和ZLMYB2(过表达载体的物理图谱见图4)。
连接产物转化大肠杆菌DH5α，具体转化步骤：将-80℃冰箱保存的DH5α置于冰上10min左右进行冰浴冻融，在100μL DH5α中加入10μL连接产物，吹打混匀后冰浴30min；随后在42℃水浴锅中热激90s，迅速转移至冰上冰浴2min；在超净工作台内加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃下220rpm的摇床中复苏培养45-60min；复苏的菌液在6000rpm离心5min，用移液枪取出500μL上清液，保留500μL培养基重悬沉淀的菌体，重悬后涂平板，37℃培养箱中倒置过夜培养，挑取阳性克隆，于37℃下220rpm的摇床过夜培养。
设计菌液PCR引物PCB-seqE：5’-GCACCCCAGGCTTTACACTT-3’(SEQ ID NO:9)。引物PCB-seqE(SEQ ID NO:9)与ZlMYB1-F(SEQ ID NO:5)菌落PCR检测ZlMYB1单克隆阳性。引物PCB-seqE(SEQ ID NO:9)与ZlMYB2-F(SEQ ID NO:7)菌落PCR检测ZlMYB2单克隆阳性。菌落PCR产物经电泳后筛选出有目的条带的单菌落，并进行测序。测序结果见图2和图3，PCR产物的核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列一致。
抽提质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞。操作方法如下：
步骤1、取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
步骤2、每100μL农杆菌感EHA105受态细胞加入5μL抽提好的质粒，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。
步骤3、加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。
步骤4、6000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含有卡那霉素的抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3d。
2.2ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻的获得及鉴定
(1)愈伤组织准备
步骤1、水稻成熟种子灭菌。用合适的工具将成熟种子去壳，丢弃带霉斑和胚未发育好(干瘪、褐色)的种子，保证种子的完整度和净度。水稻种子去壳后先用75％乙醇清洗1min，再用0.15％ HgCl 2灭菌15-20min，最后用无菌ddH2O洗涤4-5次。最后一次过夜浸泡。
步骤2、水稻愈伤组织诱导。灭菌水清洗过夜的种子，用解剖刀沿糊粉层将胚剥下，接种于诱导培养基上，每瓶诱导培养基中接入8-12颗消毒处理后的水稻种子，设置温度30℃，暗培养40-45d诱导愈伤组织的产生。
步骤3、愈伤组织的继代。从诱导的愈伤中挑选淡黄色、颗粒状、干燥、活力强的愈伤组织转入继代培养基中暗培养20d；第一次继代时注意将愈伤组织上附着的其他组织(如胚乳、芽等)去除干净。继代一次的愈伤组织即可进行根癌农杆菌侵染，用于转化的愈伤最多继代两次，多次继代易使愈伤组织发生体细胞变异且降低转化效率。
步骤4、愈伤组织预培养。从继代后的愈伤组织中，挑选淡黄色、颗粒状、干燥、活力强的愈伤组织转入预培养基中，每个皿接种60-80块绿豆大小的愈伤颗粒，愈伤颗粒较大可用镊子夹碎，28℃黑暗条件预培养3-4d。预培养结束后，将状态良好的、分裂旺盛的小颗粒用小勺收集到250mL无菌三角瓶中，用于农杆菌侵染。
(2)农杆菌准备
步骤1、农杆菌活化。实验前2d，将含有目的基因的根癌农杆菌菌株在含有相应抗生素的LA平皿上划线，然后置于28℃培养2d。
步骤2、农杆菌重悬。取出根癌农杆菌划线平皿，用接种环接入大约一环农杆菌于100mL悬浮培养基中，加入100μL乙酰丁香酮储备液和2mL 50％葡萄糖，置于恒温摇床28℃，200rpm震荡培养30min，农杆菌悬液浓度约为OD600＝0.3即可。
(3)农杆菌侵染及液体共培养
步骤1、农杆菌侵染。将制备好的农杆菌悬液倒入装有愈伤组织的三角瓶中直至浸没所有愈伤组织，静置10min。倒去菌液。取装有吸水纸和滤纸的灭菌小平皿，打开小平皿将装有愈伤的三角瓶倒置于小平皿的滤纸上，尽量沥尽菌液，再把愈伤展铺在无菌大皿的滤纸上，上面盖一张灭菌滤纸，用镊子轻压滤纸以吸干愈伤表面菌液，再抽去吸湿后的滤纸，如此上下各换四次滤纸，最后在愈伤上盖上一张滤纸，盖好大平皿，自然干燥1-2h。
步骤2、共培养。用镊子将干燥的愈伤颗粒转移到共培养基上，封口胶封口。置于19℃黑暗条件下共培养3d。
步骤3、水洗。将共培养后的愈伤组织转移至水洗杯中，倒入灭菌蒸馏水至完全侵没愈伤组织，盖上盖子振荡20-30s，倒掉灭菌蒸馏水，如此水洗3-4次。进行观察，如果水洗杯内的蒸馏水澄清说明农杆菌已经基本清洗干净，否则需要继续水洗。最后倒掉灭菌蒸馏水，加入含500mg/L羧苄青霉素的灭菌蒸馏水，静置30min。倒去含500mg/L羧苄青霉素的灭菌蒸馏水。
步骤4、愈伤组织筛选。愈伤干燥后，用镊子将愈伤颗粒转移到筛选培养基，封口胶封口，置于暗培养室筛选培养20d(第一次筛选S1)。从S1培养基上挑选干燥的、没有农杆菌污染的愈伤，转移到S2培养基上。暗培养20d，观察是否长出新鲜嫩黄的抗性愈伤，如果还没有抗性愈伤继续转皿进行S3筛选培养。一般粳稻品种经筛选两次即S2阶段就能长出抗性愈伤。
步骤5、分化培养。挑取淡黄色、致密、干燥、生长旺盛的抗性愈伤小块，每一团只挑一个抗性愈伤，注意不要挑到长有农杆菌的愈伤。每瓶分化培养基中均匀放置3-4小块抗性愈伤，因为愈伤组织细胞在分化培养基上会继续生长，放得太密容易导致不同的愈伤块长到一起无法区别。28℃光培养30-40d，光照周期为16h光照/8h黑暗，待分化出幼苗有3-5cm高后即可进行生根培养，光培养期间要及时把污染长菌的材料清理掉。
步骤6、植株生根。用枪形镊将分化出的苗子从分化培养基中取出，置于灭过菌的空平皿中，一块愈伤只取1棵健壮的幼苗，用剪刀对幼苗进行清理，剪去死掉或发黄叶子以及分化培养基上长出的根，接入生根管内，每根管内接入1株幼苗。光培养室生根培养15-20d，待新根生长充分后，进行移栽。
步骤7、植株移栽。揭开生根管封口膜，加入一些自来水，光培养室中继续炼苗生长3-4d。炼苗期间可取叶片小样进行转基因阳性检测。将转化幼苗从生根管中取出，洗净根上的附着培养基，移栽到准备好土的盆或桶中。
(4)转化中所用试剂和培养基的配制：
1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BenzylaminoPurine(6-BA)，6-苄基腺嘌呤；Indole-3-acetic acid(IAA)，吲哚-3-乙酸；Napthalene acetic acid(NAA)，萘乙酸；2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)，2,4-二氯苯氧乙酸；Kinetin(KT)，6-糖基氨基嘌呤。
2)主要溶液配方：
1、MSmax储备液(10x)：16.5g NH4NO3、1.7g KH2PO4、19.0g KNO3、3.7g MgSO4·7H2O、3.32g CaCl2或者4.4g CaCl2·2H2O，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。
2、MSmin储备液(100x)：2.23g MnSO4·4H2O、0.86g ZnSO4·7H2O、0.083g KI、0.62gH3BO3、0.025g Na2MoO4·2H2O、0.0025g CoCl2·6H2O、0.0025g CuSO4·5H2O，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。
3、N6max储备液(10x)：28.3g KNO3、4.63g(NH4)SO4、4.0g KH2PO4、1.85g MgSO4·7H2O、1.25g CaCl2或者1.66g CaCl2·2H2O，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。
4、N6min储备液(100x)：0.08g KI、0.16g H3BO3、0.15g ZnSO4·7H2O、0.44g MnSO4·4H2O或者0.3335g MnSO4·H2O，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。
5、Fe2+-EDTA储备液(100x)：往一个试剂瓶中加入约300mL dH2O和2.78g FeSO4·7H2O；往另一试剂瓶中加入约300mL dH2O，并加热到70℃，然后加入3.73g Na2·EDTA·2H2O；都溶解好后，待溶液冷却至室温，将两个瓶中的溶液混合，然后加dH2O定容到1000mL，4℃避光保存。
6、Vitamin储备液(100x)：0.1g烟酸、0.1g烟碱硫胺素、1g盐酸吡哆醇、10g肌醇、0.2g甘氨酸，加dH2O定容到1000mL，4℃保存。
7、AAmax储备液(10x)：29.50g KCl、2.50g MgSO4·7H2O、1.50g NaH2PO4、1.50gCaCl2·2H2O，加dH2O定容到1000mL，室温避光保存。
8、AAmin储备液(100x)：1.0g MnSO4·H2O、0.2g ZnSO4·7H2O、0.0025g CuSO4·5H2O、0.3g H3BO3、0.075g KI、0.0025g CoCl2·6H2O、0.025g NaMoO4·2H2O，加dH2O定容到1000mL，室温避光保存。
9、6-BA储备液(1mg/mL)：100mg 6-BA，加入1.0mL 1N KOH振摇至6-BA溶解，然后加dH2O定容到100mL，室温保存。
10、KT储备液(1mg/mL)：100mg KT，加入1.0mL 1N KOH振摇至KT溶解，然后加dH2O定容到100mL，室温保存。
11、2,4-D储备液(1mg/mL)：100mg 2,4-D，加入1.0mL 1N KOH振摇5min，然后加10mL dH2O并振摇至2,4-D溶解，用dH2O定容到100mL，室温保存。
12、100mM乙酰丁香酮储备液：0.196g乙酰丁香酮、10mL二甲基亚砜，用1.5mL离心管分装，4℃保存。
13、IAA储备液(1mg/mL)：100mg IAA，加入1.0mL 1N KOH振摇至IAA溶解，然后用dH2O定容到100mL，室温避光保存。
14、NAA储备液(1mg/mL)：100mg NAA加入1.0mL 1N KOH振摇至NAA溶解，再用dH2O定容到100mL，室温避光保存。
15、1N KOH储备液：5.6g KOH，用100mL dH2O溶解，室温保存。
16、0.15％HgCl2：1.5g HgCl2，先用1mL无水乙醇部分或完全溶解再用dH2O定容至1000mL，搅拌4-8h，室温妥善保存。
3)用于水稻遗传转化的培养基配方：
1、诱导培养基：N6max储备液(10x)100mL、N6min储备液(100x)10mL、Vitamin储备液(100x)10mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)10mL、2,4-D储备液(1mg/mL)2.5mL、水解酪蛋白0.6g、脯氨酸0.3g、蔗糖30g、植物凝胶(Phytagel)3g，调pH值至5.9，补dH2O至1000mL。
2、继代培养基：N6max储备液(10x)100mL、N6min储备液(100x)10mL、Vitamin储备液(100x)10mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)10mL、2,4-D储备液(1mg/mL)2.0mL、水解酪蛋白0.6g、脯氨酸0.5g、蔗糖30g、植物凝胶(Phytagel)3g，调pH值至5.9，补dH2O至1000mL。
3、预培养基：N6max储备液(10x)12.5mL、N6min储备液(100x)1.25mL、Vitamin储备液(100x)2.5mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)25mL、2,4-D储备液(1mg/mL)0.75mL、乙酰丁香酮储备液300μL、50％葡萄糖溶液5mL、水解酪蛋白0.15g、蔗糖5g、琼脂糖1.75g，调pH值至5.4，补dH2O至250mL。
4、共培养基：N6max储备液(10x)12.5mL、N6min储备液(100x)1.25mL、Vitamin储备液(100x)2.5mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)25mL、2,4-D储备液(1mg/mL)0.75mL、乙酰丁香酮储备液300μL和50％葡萄糖溶液5mL、水解酪蛋白0.2g、蔗糖5g、琼脂糖1.75g，调pH值至5.4，补dH2O至250mL。
5、悬浮培养基：N6max储备液(10x)5mL、N6min储备液(100x)0.5mL、Vitamin储备液(100x)1mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)0.5mL、2,4-D储备液(1mg/mL)0.2mL、乙酰丁香酮储备液100μL和50％葡萄糖溶液2mL、水解酪蛋白0.08g、蔗糖2g，调pH值至5.4，补dH2O至100mL。
6、筛选培养基：N6max储备液(10x)25mL、N6min储备液(100x)2.5mL、Vitamin储备液(100x)2.5mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)2.5mL、2,4-D储备液(1mg/mL)0.625mL、含400mg/L羧苄青霉素400μL、50mg/L潮霉素B 250μL、50％葡萄糖溶液5mL、水解酪蛋白0.15g、蔗糖7.5g、琼脂糖1.75g，调pH值至6.0，补dH2O至250mL。
7、分化培养基：MSmax储备液(10x)100mL、MSmin储备液(100x)10mL、Vitamin储备液(100x)10mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)10mL、6-BA 2.0mL、KT 2.0mL、IAA 0.2mL、NAA 0.2mL、蔗糖30g、水解酪蛋白1g、植物凝胶(Phytagel)3g，调pH值至6.0，补dH2O至1000mL。
8、生根培养基：MSmax储备液(10x)50mL、MSmin储备液(100x)5mL、Vitamin储备液(100x)10mL、Fe2+-EDTA储备液(100x)10mL、蔗糖20g、植物凝胶(Phytagel)3g，调pH值至5.8，补dH2O至1000mL。
2.3过表达植株鉴定
剪取转化植株叶片，利用CTAB法抽提DNA，利用筛选标记基因特异引物进行PCR检测。
操作方法如下：(1)取1-2g新鲜转化水稻叶片，放入液氮预冷过的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，移入到2mL离心管中；(2)加入600μL CTAB分离缓冲液，上下颠倒离心管，混合均匀，将其置于65℃水浴中保温30min，其间每隔3-4min轻摇混匀；(3)加入等体积的体积比为24∶1的氯仿:异戊醇溶液，上下颠倒离心管，混合均匀，12000rpm离心15min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中；(4)加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，置于-20℃沉淀DNA1h，12000rpm离心15min，倒掉上清液；(5)向DNA沉淀中加入700μL 70％乙醇进行清洗，上下颠倒离心管，混合均匀，12000rpm离心5min，倒掉上清液，将DNA沉淀置于超净台中自然干燥；(6)将DNA溶于ddH2O中，-20℃保存待用。
跨启动子设计过表达载体转化阳性鉴定引物，NPTII-F68：5’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’(SEQ ID NO:10)，NPTII-R356：5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’(SEQ ID NO:11)，琼脂糖电泳胶图见图4。
实施例3：ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻及种子表型观察
ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻与对照水稻(敲除OsMYB3基因的紫香糯1号)相同温室条件下培养，并予以相同培养基、培养温度等再生条件。材料在正常再生条件下生长至开始出苗时拍照记录。
ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻与对照水稻(敲除OsMYB3基因的紫香糯1号)在相同的生长条件下，出苗速度大致相同。从图6和图7中可以看出，ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻植株及根系均呈淡紫色，对照水稻植株为绿色、根系为乳白色，即ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻植株及根系与对照水稻表现出显著颜色差异。
材料在正常水肥条件下生长至正常结实并黄熟，将谷粒与穗分开后晾干，手工去除谷粒颖壳。谷粒去除颖壳后，ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻植株的种子相对对照材料表现出显著种皮颜色差异，ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻植株的种子呈黑色，对照植株种子为棕色，如图8所示。
实施例4：ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子总酚、总黄酮和总花青素含量测定
谷粒去壳后得到的ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子和对照组种子冷冻干燥至恒重后磨粉过100目筛。
种子总酚类化合物提取方法以及种子总酚、总黄酮含量检测方法来源于文章Comparison of the contents of phenolic compounds including flavonoids andantioxidant activity of rice(Oryza sativa)and Chinese wild rice(Zizanialatifolia)。种子花青素的提取和总花青素含量测定方法来源于文章Measurement ofanthocyanins and other phytochemicals in purple wheat。
(1)种子总酚类化合物提取
分别称取ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子粉末和对照组种子粉末0.2g(精度为0.0001)，加入5mL甲醇后，50℃条件下超声提取80min。混合物在低速离心机中4℃、3000rpm离心10min。取上清液，过0.22μm极性滤膜，得到游离酚类提取物。向剩余滤渣中加入5mL4mol/L NaOH溶液，在30℃、220r/min恒温振荡器中水解4h。将混合物在4℃、3000rpm的条件下离心10min，收集上清于40mL的玻璃离心管中。用6mol/L HCl调节上清液pH至1.5-2.0，用30mL乙酸乙酯萃取结合酚3次。将3次得到的乙酸乙酯混合液于旋转蒸发仪上35℃旋转蒸干后，加入5mL甲醇超声复溶，过0.22μm极性滤膜得到结合酚提取物，4℃下保存。测量时将等量(1mL)的游离酚和结合酚提取液混合，得到总酚化合物溶液。
(2)种子总酚含量测定
总酚含量测定采用福林酚比色法。向250μL稀释三倍的folin-ciocalteu溶液中加入250μL样品溶液混匀，室温反应5min后加入1mL超纯水和250μL 20％ Na2CO3，充分混匀避光反应30min，4℃3000r/min离心10min。取200mL上清液于96孔板，在酶标仪中测量其在725nm处的吸光度。每个样品重复测定3次，实验以无水甲醇为空白对照，以没食子酸(GA)为标准品建立标准曲线。每个样品中的总酚含量以每100g水稻种子粉末的当量没食子酸毫克数(mg GAE/100g)的表示。
(3)种子总黄酮含量测定
反应在96孔板中进行。向10μL 5％NaNO2水溶液中加入50μL样品提取液，混匀后室温反应5min。加入10％ AlCl3水溶液10μL混匀，室温反应1min。加入100μL 0.5M NaOH溶液，反应10min，测定其在510nm处的吸光度。每个样品重复测定3次，实验以无水甲醇为空白对照，以儿茶素(C)为标准品建立标准曲线。每个样品中的总黄酮含量以每100g水稻种子粉末的当量儿茶素毫克数(mg CE/100g)表示。
(4)种子花青素的提取和总花青素含量测定
0.5g米粉用酸化甲醇提取三次，所得上清液即为黑米花青素提取物。在总花青素含量测定之前，需要准备两种溶液：A溶液：pH 1.0溶液(1.49％氯化钾水溶液,用HCl调pH)；B溶液：pH 4.5溶液(1.64％醋酸钠水溶液,用HCl调pH)。200μL样品分别加入1.8mL的A溶液和B溶液中，分别测定波长为520nm和700nm处的吸光值。总花青素含量以当量的矢车菊-3-O-葡糖苷(mg C3GE/100g)表示，其计算公式如下：
花青素单体含量(mg/L)＝A×MW×DF×1000/(ε×L)
其中，A指吸光值，计算方法为A＝(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5；MW指矢车菊-3-O-葡糖苷的分子质量(449.2g/mol)；DF指稀释倍数；ε指矢车菊-3-O-葡糖苷的摩尔吸光值(26900L/(cm×mol))；L指光的路径长度(1cm)；1000指体积从毫升转为升的转化因子。
检测结果如图9–图11所示，ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子总酚含量、总黄酮含量和总花青素含量均显著高于对照水稻种子。ZlMYB1转基因水稻种子的总酚含量、总黄酮含量为对照水稻种子的2.17倍和2.06倍。ZlMYB2转基因水稻种子的总酚含量、总黄酮含量为对照水稻种子的2.17倍和2.03倍。另外，对照水稻种子的花青素含量为0，而ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子的总花青素含量平均值分别为86.3和84.1mg C3GE/100g。
实施例5：ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子DPPH自由基清除能力、ABTS·+自由基吸收能力测定
种子DPPH自由基清除能力、ABTS·+自由基吸收能力检测方法来源于文章Comparison of the contents of phenolic compounds including flavonoids andantioxidant activity of rice(Oryza sativa)and Chinese wild rice(Zizanialatifolia)。
(1)种子DPPH自由基清除能力测定：反应在96孔板中进行，将50μL样品添加到150μL0.5mM DPPH甲醇溶液中。混合后30℃条件下暗反应30分钟，并使用酶标仪测量其在517nm处的吸光度。甲醇作空白对照，维生素E甲醇溶液为标准品。对每个样品重复测定3次，DPPH自由基清除能力表示为100g水稻种子粉末的当量维生素微摩尔数(μmol TE/100g)。
(2)种子ABTS·+自由基吸收能力测定：将以1.1mg/mL的ABTS甲醇溶液与0.68mg/mL过硫酸钾水溶液等量混合，于暗室中过夜得到ABTS·+试剂，甲醇稀释，调整吸光度为0.700±0.020。反应在96孔板中进行，将50μL样品添加到150μL ABTS·+溶液中。混30℃条件下暗反应30分钟，并使用酶标仪测量其在734nm处的吸光度。甲醇作空白对照，维生素E甲醇溶液为标准品。对每个样品重复测定3次，ABTS·+自由基吸收能力表示为100g水稻种子粉末的当量维生素微摩尔数(μmol TE/100g)。
检测结果如图12和图13所示，由此可以看出ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子DPPH自由基清除能力、ABTS·+自由基吸收能力显著高于对照水稻种子。ZlMYB1转基因水稻种子的DPPH自由基清除能力、ABTS·+自由基吸收能力平均为对照水稻种子的2.31倍和2.36倍。ZlMYB2转基因水稻种子的DPPH自由基清除能力、ABTS·+自由基吸收能力平均为对照水稻种子的2.21倍和2.38倍。
本发明ZlMYB1和ZlMYB2转基因水稻种子，其总酚含量、总黄酮含量和总花青素含量显著高于对照水稻种子，而且其DPPH自由基清除能力和ABTS·+自由基吸收能力显著高于对照水稻种子。过表达ZlMYB1和ZlMYB2基因对于对照水稻种子总花青素含量的提升作用最为突出，说明ZlMYB1和ZlMYB2基因在水稻中过表达对花青素类化合物的合成途径具有有效调控作用，有效提高了水稻种子中的花青素含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.中国菰ZlMYB1和ZlMYB2基因在提高水稻种子花青素含量中的应用，其特征在于，所述ZlMYB1基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，用于提高水稻种子花青素含量；所述ZlMYB2基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，用于提高水稻种子花青素含量。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZlMYB1基因编码的蛋白质序列如SEQID No:3所示；所述ZlMYB2基因编码的蛋白质序列如SEQ ID No:4所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将ZlMYB1和ZlMYB2基因编码蛋白的过表达载体分别转入水稻中，分别得到能够过表达ZlMYB1和ZlMYB2的转基因水稻。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将ZlMYB1和ZlMYB2基因序列分别构建到PC2300S过表达载体上，将所述过表达载体分别转入水稻中，通过提高该基因mRNA的表达量而获得种子花青素含量显著提高的转基因水稻植株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，得到所述转基因水稻。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101935663A (zh) * 2010-04-28 2011-01-05 中国科学院遗传与发育生物学研究所 调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB3
CN104894142A (zh) * 2015-06-11 2015-09-09 中国科学院西北高原生物研究所 调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D
KR20180106316A (ko) * 2017-03-20 2018-10-01 대한민국(농촌진흥청장) 안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼 유래 유전자 및 이의 용도
CN108795976A (zh) * 2018-07-05 2018-11-13 安徽袁粮水稻产业有限公司 一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法
CN110540582A (zh) * 2019-09-19 2019-12-06 中国农业科学院作物科学研究所 蛋白质OrC1在调控水稻稃尖和芒颜色中的应用
CN112251523A (zh) * 2020-08-27 2021-01-22 云南大学 水稻芽鞘紫线基因OsMYB76的应用及实现方法
CN114231540A (zh) * 2022-01-05 2022-03-25 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101935663A (zh) * 2010-04-28 2011-01-05 中国科学院遗传与发育生物学研究所 调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB3
CN104894142A (zh) * 2015-06-11 2015-09-09 中国科学院西北高原生物研究所 调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D
KR20180106316A (ko) * 2017-03-20 2018-10-01 대한민국(농촌진흥청장) 안토시아닌 생합성을 증진시키는 벼 유래 유전자 및 이의 용도
CN108795976A (zh) * 2018-07-05 2018-11-13 安徽袁粮水稻产业有限公司 一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法
CN110540582A (zh) * 2019-09-19 2019-12-06 中国农业科学院作物科学研究所 蛋白质OrC1在调控水稻稃尖和芒颜色中的应用
CN112251523A (zh) * 2020-08-27 2021-01-22 云南大学 水稻芽鞘紫线基因OsMYB76的应用及实现方法
CN114231540A (zh) * 2022-01-05 2022-03-25 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank登录号: XM_006655832.3;NCBI;NCBI GenBank;第1-1351位 *
GenBank登录号: XM_052303737.1;NCBI;NCBI GenBank;第1-1020位 *
Impact of melatonin application on lignification in water bamboo shoot during storage;Baiqi Yang等;Food Chemistry: X;第13卷;第1-9页 *
LsMYB15 Regulates Bolting in Leaf Lettuce (Lactuca sativa L.) Under High-Temperature Stress;Li Chen等;Frontiers in Plant Science;第13卷;第1-14页 *
中国菰米与稻米甲醇提取物体外酶抑制作用分析;于秀婷等;食品研究与开发;第43卷(第12期);第191-197页 *

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