ES2250173T3

ES2250173T3 - Nuevo metodo para la generacion y seleccion de plantas de linaza o lino transgenicas.

Info

Publication number: ES2250173T3
Application number: ES00954546T
Authority: ES
Inventors: Ernst Heinz; Jodi Scheffler; Hjordis Voss
Original assignee: GVS Gesellschaft fuer Verwertungssysteme GmbH
Current assignee: GVS Gesellschaft fuer Verwertungssysteme GmbH
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: US20030074686A1; EP1196024A1; DE60023006D1; DE60023006T2; AU6696700A; CA2375940A1; EP1196024B1; WO2001005221A1; DK1196024T3; AU778695B2; ATE305718T1

Abstract

Un método para la generación de plantas transgénicas de la familia Linaceae que comprende: (a) introducir una molécula de ADN recombinante que comprende al menos un gen marcador seleccionable que confiere resistencia a al menos dos antibióticos dentro de las células de la planta; (b) inducción de un callo transgénico a partir de las células de (a); y (c) regeneración de plantas transgénicas a partir del callo inducido, en el que (i) después de la inducción del callo y/o cultivo de callos en un medio que contiene un primer antibiótico (ii) los callos o brotes regenerados de los mismos se transfieren a un medio que contiene un segundo antibiótico que es diferente del primer antibiótico.

Description

Nuevo método para la generación y selección de plantas de linaza o lino transgénicas.

La presente invención se refiere a un método para la generación y selección de células y tejidos de plantas transgénicas así como a plantas del género Linum. Además, la presente invención se refiere a células de plantas transgénicas, tejidos y plantas obtenidas mediante un método de la invención y su uso en cultivo de tejidos y células de plantas en la reproducción de plantas.

La familia de plantas Linaceae comprende plantas tales como linaza o lino (Linum usitatissimum) una de las plantas cultivada desde la antigüedad. Las fibras de la corteza interna del tallo se usan para preparar lino y semilla para la preparación de aceite de linaza. Por ejemplo, el aceite de semilla de lino es rico en ácido linolénico, y se usa en la producción de productos para pintura y para la producción de linóleo. A pesar del amplio trabajo sobre protocolos para la transformación de linos, todos los intentos para producir plantas de lino transformadas por cultivo de segmentos de hipocótilo con Agrobacterium y cultivo de los segmentos de hipocótilo en placas que contienen combinaciones optimizadas de hormonas y opcionalmente en medios que contienen un antibiótico para la selección inicial de transformantes putativos siguen siendo insatisfactorios.

Para todos los protocolos excepto el de Bretagne-Sagnard et al. (Transgenic Research 5 (1996), 131-137), el gen npt II se usó como marcador seleccionable y el antibiótico fue kanamicina. En Bretagne-Sagnard, el gen resistente al marcador seleccionable fue el aad con espectinomicina usada como marcador seleccionable. Para algunos protocolos se llevaron a cabo pruebas adicionales en un intento de probar que las plantas seleccionadas no eran cimarrones, sino que eran verdaderamente transformadas. Desafortunadamente, normalmente fueron sólo pruebas adicionales para el marcador seleccionable usando el mismo antibiótico o amplificación PCR. A menudo no se llevó a cabo ningún análisis de transferencia Southern y no se produjo o analizó la progenie. El método de Lawrence et al. (6º Congreso Internacional de SABRAO (1989), 535-538), usó cotiledones como tejido diana. McHughen y Jordan (Plant Cells Report 7 (1989), 611-614), también evaluó el uso de cotiledones. Hasta ahora, éstas se han considerado menos eficientes que los hipocótilos como tejido diana. Otra variante es un método de protoplasto descrito por Ling (Versuche zur Entwicklungsbiologie und somatische Genetik in vitro Arten der Gattung Linum. Dissertation des Doktorgrades, in der Mathematisch- Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel (1997)). Comparado con el método de hipocótilo, el de protoplastos producía significativamente menos plantas transgénicas, y las que se producían a menudo exhibían anomalías morfológicas. Zhan et al., Plant Molecular Biology 11 (1988), 551-559, usó Agrobacterium rhizogenes en lugar de Agrobacterium tumefaciens como el portador plasmido-Ti. Se obtuvieron unas pocas plantas transformadas, pero todas tenían anomalías morfológicas y/o fisiológicas.

Dos grupos informaron sobre la producción de algunos transformantes. McHughen y sus colaboradores han producido la variedad de lino Triffid (herbicide resistance, McHughen et al., Canadian J. of Plant Science 77 (1997), 641-643) mientras que Ellis y sus colaboradores (Ellis et al., Theoretical and Applied Genetics 85 (1992), 46-54), han desarrollado líneas que contienen transposón e introducido genes resistentes a la raya. Sin embargo, los resultados solamente se presentan para una variedad y no se da la frecuencia de los transformantes putativos exitosos.

Por lo tanto, la producción de transformantes primarios de lino, si fuera del todo posible, parecería ser dependiente del genotipo, laboriosa y/o dando como resultado inicialmente a plantas con morfología aberrante.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es proveer un método fiable y eficiente para la generación y selección de plantas establemente transformadas del género Linum.

La solución a este problema técnico se logra proveyendo las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En consecuencia, la invención se refiere a un método para la generación de plantas transgénicas de Género Linum que comprende:

(a): introducir una molécula de ADN recombinante que comprende al menos un gen marcador seleccionable que confiere resistencia a al menos un antibiótico dentro de las células de la planta;

(b): inducción de callo transgénico de las células de (a); y

(c): regeneración de plantas transgénicas desde el callo inducido, en el que

(i): después de la inducción del callo y/o cultivar los callos en un medio que contiene un primer antibiótico

(ii): los callos o brotes regenerados del mismo se transfieren a un medio que contiene un segundo antibiótico que es diferente del primer antibiótico.

Aunque se han desarrollado técnicas para la transformación y regeneración de plantas transgénicas de la mayoría de las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, hasta ahora los intentos de aplicar estos protocolos a plantas de la familia Linaceae, en particular al lino, no han sido exitosos. De acuerdo con la presente invención, se ha desarrollado un nuevo método que se basa en el sorprendente hallazgo de que la aplicación de dos antibióticos diferentes para la selección de transformantes putativos de lino se puede utilizar para un nuevo y fiable proceso de transformación, regeneración y selección de una planta, que conduce a plantas transgénicas que son fenotípicamente normales y fértiles. En principio se puede usar cualquier medio básico conocido en la técnica en el método de la invención, por ejemplo, los descritos en Murashige y Skoog, Physiol. Plant 15 (1962), 473-497 y Gambor, Exp. Cell Res. 50 (1968), 151-158.

Uno de los aspectos más importantes del método de la invención es transferir los callos en crecimiento o brotes derivados de los mismos sucesivamente desde un medio que contiene un primer antibiótico a un medio que contiene un segundo antibiótico que es diferente del primero. Dicho primer y segundo antibiótico se pueden desintoxicar por el(los) producto(s) de gen(es) del mismo o gen(es) marcador(es) diferente(s) presente(s) en la molécula de ADN recombinante para ser introducidos en el método de la presente invención. Se entiende que la etapa crucial del método de la presente invención es la etapa (c). Por lo tanto, los métodos que empiezan con material de la planta en el que las células de la planta ya se han transformado con una molécula de ADN recombinante como en la etapa (a) y opcionalmente se ha inducido la formación del callo también están comprendidos en la presente invención siempre que se realice la etapa (c) descrita anteriormente y explicada en mayor detalle a continuación.

Dicho método es adecuado para introducir secuencias de ADN homólogas y heterólogas en las plantas anteriormente mencionadas. El método de la invención permite estudiar la función e interacción de genes que se expresan en dichas plantas. De esta forma, el método de la invención es particularmente adecuado y útil para la ingeniería de plantas transgénicas, tejido de plantas y células de plantas que preferiblemente muestran propiedades mejoradas en la transformación. El método de transformación de la presente invención tiene varias ventajas. Por ejemplo, no es necesario llevar a cabo ningún precultivo o quitar la epidermis de segmentos de hipocótilo individuales. Sendos procedimientos requieren más tiempo y esfuerzo y según las experiencias de Mlynarova et al. (Plant Cell Reports 13 (1994), 282-285), y tampoco es importante para producir suficiente número de transformantes. Además, no es necesario para transferir los hipocótilos con callo a nuevas placas de selección o subcultivar el callo en nuevas placas de selección. Esto se hizo de alguna forma para todos los otros procedimientos descritos en la técnica anterior y da como resultado un alargamiento de la fase de selección de tres a seis semanas. De acuerdo con el protocolo de la presente invención se pueden hacer cosechas múltiples de la misma placa empezando a las tres semanas hasta seis semanas después de poner en primer lugar los hipocótilos en las placas de selección.

Como se describe en detalle más adelante en el presente protocolo, los brotes que emergen desde el callo se transfirieron preferiblemente directamente hacia recipientes de cultivo que contienen un segundo antibiótico a seleccionar entre los brotes regenerados. Todos los otros protocolos usaron el mismo antibiótico para la selección durante el proceso de selección completo. En los ejemplos, se usó un proceso de dos etapas con kanamicina como el primer antibiótico durante el desarrollo del callo y la fase de iniciación del brote, y luego G-148 como el segundo antibiótico para la fase de selección del brote.

Además, se pueden usar pruebas preliminares para estudiar capacidad de los brotes para enraizar en un medio que contiene G-418 y luego para enraizar sobre kanamicina más carbenicilina. La capacidad para enraizar en kanamicina se describe como un indicador exitoso en algunas ocasiones. De acuerdo con la presente invención, se ha desarrollado como un indicador fiable.

Después de dos a tres semanas, el brote enraizado se puede transferir después al suelo y usar para producir semilla para la próxima generación, para de esta forma reducir más el tiempo desde el principio de la fase de transformación hasta la producción de semilla madura.

Finalmente se probó la capacidad de un segmento de 2 mm, del tallo del brote, para producir un callo verde proliferante. Esto se confirmó como un indicador fiable de una transformación exitosa. Estos callos verdes también podrían producir rápidamente más brotes que podrían luego ser enraizados y transferidos al suelo o usados para realizar pruebas adicionales tales como un ensayo ELISA o transferencia Southern.

Las anteriormente descritas "prueba de enraizamiento" y "prueba de proliferación verde" también representan aspectos importantes de la presente invención solas o en combinación.

En resumen, con el método de la presente invención, se han generado plantas enraizadas transformadas usando tres variedades diferentes de lino comercial. Estas plantas son capaces de florecer y han producido semilla. Las plantas son morfológicamente similares a su variedad testigo del tipo silvestre. Además, se usaron tres genes diferentes para crear varias combinaciones diferentes de gen promotor. Esto indica que el sistema es también robusto y no estrictamente dependiente del genotipo. En vista de su importancia económica, lino o linaza se usan preferiblemente para el método de la presente invención.

Los primer y segundo antibióticos preferidos incluyen kanamicina, paromicina, neomicina, gentamicina, G-418, estreptomicina, espectinomicina e imidazol. El término "imidazol" se usa aquí para abarcar compuestos antibióticos o herbicidas que contienen imidazol o imidazolinona como un grupo reactivo. Preferiblemente se emplean genes marcadores seleccionables que codifican neomicina fosfotransferasa, estreptomicina fosfotransferasa o aminoglicosido-3-adeniltransferasa o son genes que confieren resistencia al imidazol. Genes resistentes al imidazol útiles son por ejemplo descritos en Hill (Biochem J. 335 (1998), 653-661), Mourad (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 178-184), Zhu (Nat. Biotechnol. 18 (2000), 555-558), Burke (Mol. Gen. Genet 242 (1994), 169-176) y Doignon (Plasmid 30 (1993),
224-233). Otros genes marcadores adecuados y agentes correspondientes para la identificación y/o selección de células, callo y plantas transformadas se describen en la técnica; véase De Block, EMBO J. 6 (1987), 2513-2518; Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995 y, para revisión Gelvin y Schilperoot, Plant Molecular Biology Manual. Kluver Academic Publishers Dordrecht, Boston, Londres (1998).

En una realización particularmente preferida de la presente invención, dicho primer antibiótico es kanamicina y dicho segundo antibiótico es G-418.

En una realización del método de la presente invención, la concentración de dicho primer antibiótico está en el intervalo de 150 a 200 mg/l. La concentración óptima depende de la variedad de lino usada. Por ejemplo, con el cultivo McGregor se usan preferiblemente 200 mg/l.

En una realización adicional del método de la presente invención, la concentración de dicho segundo antibiótico es 40 a 100 mg/l. La cantidad óptima depende de la variedad y fase de selección. Por ejemplo, para la primera transferencia desde el primer antibiótico al segundo con la variedad McGregor se usan preferiblemente 80 mg/l.

Como se describe en los ejemplos adjuntos, el hipocótilo de plantas se usa preferiblemente para el método de la presente invención. El método de la presente invención se realiza preferentemente, en donde las células de la planta, por ejemplo, los hipocótilos de la etapa (a) son derivados de plantas que están substancialmente en el mismo estado de desarrollo. Esto se puede lograr por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo las plantas se pueden derivar de semillas en germinación sincronizada.

En otra realización preferida del método de las invenciones, la molécula de ADN se introduce por un método que comprende:

(a) inoculación con Agrobacterium tumefaciens;

(b) bombardeo de partículas; o

(c) microinyección.

Los métodos para la transformación que usan métodos biolisticos son bien conocidos por los expertos en la técnica; véase, por ejemplo, Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558 and Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423-431. Se puede realizar la micro inyección como se describe en Potrykus y Spangenberg (eds.), Gene Transfer to Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995).

Cepas adecuadas de Agrobacterium tumefaciens y vectores son conocidas por los expertos en la técnica y se describen en la técnica anterior (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan), Debleare, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12(1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467-8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963-976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies. En: Plant Molecular Biology Manual Vol 2, Gelvin y Schilperoort (Eds.), Dordrecht, Holanda: Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46; An, EMBO J. 4 (1985), 277-287).

Los métodos para la inoculación e incubación de los hipocótilos con Agrobacterium tumefaciens son bien conocidos en la técnica. En una realización preferida, la presente invención se refiere a uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente en los que la célula de la planta, el tejido de la planta, o la planta se inoculan con Agrobacterium tumefaciens en la presencia de un compuesto fenólico, preferiblemente acetosiringona. Preferiblemente, en particular cuando se usa Agrobacterium tumefaciens para la transformación, dicha molécula de ADN recombinante comprende un vector binario.

La regeneración de plantas transgénicas a partir de tejidos o células de plantas transformadas requiere cambios en la concentración y proporción de auxina y citoquinina con el fin de inducir el desarrollo del callo y brote. Esto se hace preferiblemente poniendo el tejido y las células o el tallo, respectivamente, sucesivamente en un medio sólido que contiene las hormonas apropiadas. En particular, se requiere la adición de citoquininas y auxinas o sustancias que tienen la misma función biológica para promover la división de células y, por ejemplo, para generar plantas a partir de una única célula. Además, las concentraciones de dos hormonas pueden tener que cambiarse durante las diferentes etapas de la división celular u organogénesis y varía para diferentes especies y variedades de plantas (Davis, (ed.) Plant Hormones. Physiology, Biochemistry and Molecular Biology Dordrecht: Kluwer Academic Publishers (1995)). El uso de concentraciones de hormona apropiadas se puede ajustar por los expertos en la técnica como, por ejemplo, se describe en las siguientes realizaciones o en los ejemplos.

En una realización preferida del método de la presente invención, el medio que contiene dicho primer antibiótico contiene al menos 0,05 mg/l de auxina y al menos 0,002 mg/l de citoquinina.

En una realización preferida adicional del método de la presente invención dicha auxina es NAA y/o dicha citoquinina es TDZ y/o BAP.

En una realización preferida adicional del método de la presente invención, la concentración de auxina y citoquinina es TDZ (0,002 mg/l) y NAA (0,05 mg/l) o BAP (2 mg/l) y NAA (0,1 mg/l)

En una realización preferida adicional del método de la presente invención, dicho medio que contiene dicho segundo antibiótico está sustancialmente exento de auxinas y/o citoquininas.

Las etapas de cultivo del método de la presente invención se pueden realizar de la siguiente manera.

Los hipocótilos se cultivan en un medio que contiene las hormonas mencionadas previamente y el primer antibiótico. Una combinación de antibióticos que puede incluir carbenicilina y cefotaxima o clavulanato de potasio/ticarcilina se agrega para eliminar la Agrobacterium. El medio es también complementado con vitaminas B5 de Gamborg.

Los brotes se cultivan en un medio con el segundo antibiótico y la misma combinación de antibióticos para eliminar la Agrobacterium. El medio se complementa también con las mismas vitaminas, pero a la mitad de la concentración.

Los brotes que permanecen verdes y crecen, se transfieren a un medio de enraizamiento con el antibiótico de selección solamente y a veces la auxina IBA (0,1 mg/l) para promover el enraizamiento.

Rápidamente se producen múltiples brotes del mismo brote original cortando la hoja o segmentos del tallo del brote original y poniendo los segmentos en un medio que es similar al que se usa para los hipocótilos. Los segmentos de brotes que son verdaderamente transformados y no son "cimarrones" forman callo que luego produce brotes. Estos brotes se ponen en un medio de enraizamiento.

El medio usado de acuerdo con el método de la presente invención comprende 2 a 10 g/l de agar, lo más preferiblemente 6 a 7 g/l. La cantidad apropiada de agar también puede depender del fabricante. Los resultados obtenidos de acuerdo con la presente invención revelan que, por ejemplo, se usa ventajosamente el agar de Duchefa.

El método de la invención como se describe anteriormente y se ilustra en los ejemplos adjuntos es generalmente aplicable para la generación de células de plantas transgénicas, tejido de plantas y plantas. Las condiciones óptimas para el crecimiento del callo y la regeneración de la planta de acuerdo con el método de la invención se pueden evaluar por cambios en la composición del medio dentro de las realizaciones anteriormente descritas. Debido a que cada cultivar o línea puede responder levemente diferente a cambios en la composición del medio, la transformación y regeneración de plantas transgénicas de acuerdo con el método de la invención se pueden acelerar probando las diferentes líneas/cultivares por el protocolo que se describe en los ejemplos.

En una realización preferida adicional de la invención descrita anteriormente, la molécula de ADN a ser introducida dentro de las plantas comprende una región no codificante de un gen y/o una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido, péptido ARN antisentido, ARN sentido, ARN viral o ribozima. Debido al método de la presente invención, ahora es posible estudiar e influir específicamente la expresión de un gen de desarrollo, regulador y/o estructural y su producto de gen en plantas de genero Linum, por ejemplo, las proteínas involucran el metabolismo de plantas que son derivadas de dicha familia de plantas o de cualquier otro organismo, tal como microorganismos, algas, animales, insectos, virus, etc. o por ejemplo de otras especies de plantas, preferiblemente de plantas monocotiledoneas o dicotiledoneas, en particular de cualquier planta de interés en agricultura, horticultura o cultivo de madera, tal como plantas de cultivo, concretamente aquellas de la familia Poaceae, cualesquiera otras plantas que producen almidón, tal como patata, mandioca o plantas leguminosas, plantas que producen aceite, tal como colza oleaginosa, linaza, etc., plantas que usan un polipéptido como sustancias de almacenamiento, tal como soja, plantas que usan sacarosa como sustancia de almacenamiento, tal como remolacha azucarera, caña de azúcar, árboles, plantas ornamentales, plantas que son de interés médico, por ejemplo plantas que contienen alcaloides, flavonoides y similares.

Algunos ejemplos para la sobre expresión de genes homólogos o heterólogos e inhibición antisentido y co-supresión que se consigue en la manipulación de ciertas rutas metabólicas en plantas transgénicas están revisados en Herbers (TIBTECH 14 (1996), 198-205).

Ribozimas de diferentes tipos que son capaces de cortar específicamente el (pre)-ARNm de un gen diana como se describen en, por ejemplo, EP 0 291 533 B1, EP 0 321 201 A1 y EP 0 360 257 A2. La selección de sitios diana apropiados y las correspondientes ribozimas se puede hacer como se describe por ejemplo en Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460. Un ejemplo de resistencia a virus mediada por ribozima se describe en Feyter (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-228). De esta forma, es inmediatamente evidente para los expertos en la técnica que el método de la presente invención se puede emplear para producir plantas transgénicas del genero Linum con cualquier rasgo deseado (véase el informe TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13 (1995), 312-397) y comprende (i) tolerancia a los herbicidas (DE 3.701.623 A; Stalker, Science 242 (1988), 419), (ii) resistencia a los insectos (Vaek, Plant Cell 5 (1987), 159-169), (iii) resistencia a los virus (Powell, Science 232 (1986), 738-743; Pappu, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11 (1995), 426-437; Lawson, Phytopathology 86 (1996), 56 suppl.), (iv) resistencia al ozono (Van Camp, BioTech. 12 (1994), 165-168), (v) mejora de la preservación de frutos (Oeller, Science 254 (1991), 437-439), (vi) mejora de la composición y/o producción de almidón (Stark, Science 242 (1992), 419; Visser, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296), (vii) alteración de la composición de lípidos (Voelker, Science 257 (1992), 72-74), (viii) producción de bio(polímeros) (Poirer, Science 256 (1992), 520-523), (ix) alteración del color de la flor, por ejemplo, manipulando la ruta biosintética de antocianina y flavonoide(Heidmann, Nature 330 (1987), 667-678, WO 90/12084), (x) resistencia a bacterias, insectos y hongos (Duering, Molecular Breeding 2 (1996), 297-305; Strittmatter, Bio/Technology 13 (1995), 1085-1089; Estruch, Nature Biotechnology 15 (1997), 137-141), (xi) alteración de una composición de glucósido cardiaco y/o alcaloide, (xii) inducción de mantenimiento de esterilidad masculina y/o femenina (EP 0 412 006 A1; EP 0 223 399 A1; W0 93/25695) y (xiii) mayor longevidad de inflorescencias/flores, (xiv) compuestos químicos de interés industrial tal como la modificación de la composición de fibras (Grima-Pettenati, Somatic cell genetics and molecular genetics of trees (1996), Kluwer, Boston), (xv) alteración de rutas para producir compuestos químicos específicos de interés industrial (John, PNAS 93 (1996), 12768) incluyendo aquellos que se pueden destinar a organelas específicas (Rooijen, Bio/technology 13 (1995), 72-77), o (xvi) producción de nuevos ácidos grasos poliinsaturados (AGP). Además, el método de la invención se puede usar para la inserción de mutagénesis usando, por ejemplo, vectores para la manipulación dirigida de genes conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hayashi, Science 258 (1992), 1350-1353; Fritze y Walden, Gene activation by T-DNA tagging. En Methods in Molecular biology 44 (Gartland, K.M.A. y Davey, MR., eds). Totowa: Human Press (1995), 281-294) o transposon tagging (Chandlee, Physiologia Plantarum 78 (1990), 105-115).

Las moléculas de ADN usadas en el método de la presente invención pueden contener elementos funcionales adicionales, por ejemplo secuencias "en el borde izquierdo"- y "borde derecho"- del T-ADN de Agrobacterium que permite la integración estable en el genoma de la planta. Además, los métodos y vectores son conocidos por los expertos en la técnica lo que permite la generación de plantas transgénicas exentas de marcador, por ejemplo, el gen marcador seleccionable o evaluable se pierde en una cierta etapa del desarrollo de la planta o reproducción de la planta. Esto se puede lograr por, por ejemplo, co-transformación (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151-161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91-104) y/o usando sistemas que utilizan enzimas capaces de promover la recombinación homóloga en plantas (véase, por ejemplo, WO 97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353-361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653-657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170-176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373-6378). Métodos para la preparación de moléculas de AND apropiadas se describen, por ejemplo, en Sambrook (Molecular Cloning; a Laboratory Manual, 2^{a} edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

En una realización preferida de la región no codificante mencionada o dicha secuencia nucleótida o la cadena complementaria de la misma contenida en la molécula de ADN recombinante a ser usada de acuerdo con el método de la presente invención se une operativamente a la trascripción y/o control de la expresión. Los elementos reguladores que aseguran la transcripción y expresión en células procariotas y/o eucariotas son bien conocidos por los expertos en la técnica y usualmente comprenden promotores que aseguran la iniciación de la transcripción y opcionalmente señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización de lo transcrito. Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como también translacionales. Tales elementos, por ejemplo, la región 3' del gen octopina sintasa de agrobacteria se describen en la técnica anterior (véase, por ejemplo, Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29).

Para la transcripción y/o expresión en células de planta, dicha región no codificante o dicha secuencia nucleótida o la cadena complementaria de la misma descritas, se ubica bajo el control de elementos reguladores que pueden ser heterólogos u homólogos con respecto a la región no codificante mencionada o dicha secuencia nucleótida a ser expresada, así como con respecto a las especies de planta a ser transformadas. En general, tales elementos reguladores comprenden un activo promotor en células de planta. Para obtener la expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, se usan preferiblemente promotores constitutivos, tales como el promotor 35 S de CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) o promotores de los genes de poliubiquitina de maíz (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Con el fin de lograr una expresión en tejidos específicos de una planta transgénica, es posible usar promotores específicos de tejido y célula (véase, por ejemplo, Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Son también conocidos los promotores que son específicamente activos en semillas de especies de planta diferentes, tales como maíz, haba, trigo, cebada, etc. También se han descrito elementos reguladores específicos de microspora y sus usos en WO 96/16182. Se pueden usar promotores inducibles con el fin de poder controlar exactamente la expresión. Un ejemplo de promotores inducibles son los promotores de genes que codifican las proteínas de shock térmico. Además, se puede emplear el sistema Tet químicamente inducible (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991), 229-237). Promotores adecuados adicionales son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361-366).

En caso que dicha secuencia nucleótida se exprese en orientación de sentido, en principio es posible modificar la secuencia codificante de modo que el polipéptido se ubique en cualquier compartimiento deseado de la célula de la planta. Estos incluyen el retículo endoplásmico, la vacuola, la mitocondria, los plástidos, el apoplasto, el citoplasma, etc. Los métodos sobre como llevar a cabo estas modificaciones y que las secuencias de señal aseguren la localización en un compartimiento deseado son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los promotores preferidos son promotores específicos de embrión tal como el promotor napina u oleosina. Esta realización es útil en la práctica para manipular la semilla, por ejemplo con el fin de mejorar y/o alterar el contenido de aceite de la planta.

Una estrategia que corresponde es la siguiente. Por ejemplo, se puede alterar la etapa de la ruta biosintética entre el ácido linoleico (18:2) y el ácido linolénico (18:3). El lino normal tiene aproximadamente 58% de ácido linolénico, de modo que ya se sabe que se prefiere esta reacción. Usando una segunda enzima muy expresada, debería ser posible incrementar el contenido de ácido de linolénico de 10% a 25%. Dicho segundo gen se puede derivar de colza oleaginosa que codifica la delta-15-desaturasa. Este gen puede estar totalmente bajo el control de un promotor específico fuerte de semilla y ser transformado en lino. En las semillas, el gen se debería sobreexpresar e incrementar el porcentaje de ácido linolénico. El análisis GC de semillas de lino, para ver el contenido de ácido graso, fue exitoso usando la técnica de la misma mitad de semilla desarrollada para la colza o embebiendo las semillas con agua y cortando la mitad del cotiledón. Las semillas embebidas luego se germinaron en papel de filtro y se transfirieron al suelo donde se desarrollaron como plantas normales. Los experimentos de transformación se realizaron usando el vector JH5 y la variedad de lino Flanders o McGregor. El vector JH5 contiene el promotor napina a partir del Brassica napus, la delta-15-desaturasa y el terminador tioesterasa.

En una realización preferida adicional, el método de la presente invención se emplea para modular, preferiblemente mejorar la calidad de fibras de la corteza interna en plantas de la familia Linaceae. Esto se puede lograr por ejemplo, por la expresión de enzimas involucradas en biosíntesis de celulosa o su inhibición, por ejemplo por la expresión de los correspondientes ARNs antisentido. Ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no están limitadas a \beta-Glucano-\beta-Glucosiltransferasa, sacarosa sintasa, xilanasa y otras enzimas involucradas en la biosíntesis de la pared de la célula de la planta y polisacáridos. Soluciones similares para plantas tratadas con ingeniería genética para fibras alteradas que se pueden adaptar a plantas de la familia Linaceae de acuerdo con la presente invención, se describen en la técnica anterior, por ejemplo para plantas de algodón en US 5.495.070 A, US 5.792.933 A y US 5.869.720 A. Los promotores que se expresan específicamente en células de fibras de la corteza interna se emplean preferiblemente y son conocidos por los expertos en la técnica o pueden ser fácilmente identificados y aislados por métodos bien establecidos. Por ejemplo, se puede emplear un cribado diferencial o el aislamiento de ADNc específicamente expresado en las fibras de la corteza interna. Tales ADNc pueden luego ser empleados para el cribado de una genoteca de ADN genómico para el aislamiento de secuencias reguladoras capaces de una expresión específica de tejido y célula de una secuencia de ADN heterólogo en células de fibra de la corteza interna. Una solución correspondiente se describe, por ejemplo, en John, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5769-5773.

Además, se puede imaginar modificar genéticamente plantas del Género Linum de acuerdo con el método de la presente invención tal que se intercalan pigmentos o colorante en las fibras de la corteza interna para (pre)teñir en cierto modo las fibras de la corteza interna.

En una realización particularmente preferida del método de la invención, la molécula de ADN descrita anteriormente comprende un marcador adicional seleccionable y/o evaluable. Los genes marcadores seleccionables útiles para la selección de células de planta transformada, callos, tejidos de planta y plantas son bien conocidos por los expertos en la técnica y comprenden por ejemplo resistencia a un antimetabolito como base de la selección para dhfr, la cual confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, la cual confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1993), 987-995), higro, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485), aad que confiere resistencia a la espectinomicina (Svab, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 197-205) y spt que confiere resistencia a la estreptomicina (Maliga, Mol. Gen. Genet. 214 (1988), 456-459). Se han descrito genes seleccionables adicionales, concretamente trp\beta, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptofano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomeraza que permite a las células utilizar manosa (WO 94/20627) y ODC (ornitina decarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina decarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a la Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

Los marcadores evaluables útiles también son conocidos por los expertos en la técnica y están comercialmente disponibles. Preferiblemente dicho marcador es un gen que codifica la luciferasa (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), green fluorescent protein (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o
\beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907).

Como se mencionó anteriormente, el método de la invención se puede usar para la transformación y regeneración de sustancialmente cualquier planta del género Linum. Preferiblemente, dicha planta es Linum usitatissimum, por ejemplo las variedades comerciales McGregor, Flanders o Ed 45.

El método de la invención es en particular útil para la manipulación genética de células de planta y tejidos de planta con el fin de obtener plantas con fenotipos modificados, preferiblemente mejorados o útiles.

De esta forma, la presente invención se refiere también a células de plantas transgénicas y un callo obtenible de acuerdo con el método de la invención que contienen una molécula de ADN establemente integrada dentro del genoma en donde dicha molécula de ADN es foránea a la célula de la planta transgénica. Por "foránea" se quiere decir que la molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula huésped, esto significa derivada de una célula u organismo con un origen genómico diferente, o es homóloga con respecto a la célula huésped, pero ubicada en un entorno genómico diferente al del homólogo de dicha molécula de ADN que ocurre naturalmente. Esto significa que, si la molécula de ADN es homóloga con respecto a la célula huésped, no se ubica en su ubicación natural en el genoma de dicha célula de la planta, en particular se rodea por genes diferentes u otras secuencias genómicas. En este caso, la molécula de ADN, es decir, la región no codificante o secuencia nucleótida comprendida dentro de ésta puede estar bajo el control de su propio promotor o bajo el control de un promotor heterólogo. El término "heterólogo" con respecto a la molécula de ADN, es decir, la región no codificante o secuencia nucleótida comprendida dentro de ésta que se une operativamente al promotor, significa que dicha región no codificante o secuencia nucleótida no se une naturalmente al promotor. Por otro lado, la región no codificante o secuencia nucleótida comprendida en la molécula de ADN a ser introducida en la planta de acuerdo con el método de la invención puede empezar a estar bajo el control de un promotor endógeno de dicha planta, por ejemplo, debido a la inserción aleatoria dentro del genoma de dicha célula de la planta lo suficientemente adyacente a secuencias capaces de conferir transcripción y opcionalmente la expresión de dicha región no codificante o secuencia nucleótida en dicha célula de planta. En este sentido, se entiende también que la molécula de ADN introducida dentro de la planta de acuerdo con el método de la invención se puede usar para restablecer un gen mutante a través de recombinación homóloga (Paszkowski (ed.), Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994)).

La presencia y opcionalmente expresión de la molécula de ADN, es decir, de la región no codificante o secuencia nucleótida comprendida en ésta en las células de plantas transgénicas y tejidos de planta, preferiblemente conducen a cambios fisiológicos y fenotípicos en plantas que contienen tales células, preferiblemente como las descritas anteriormente.

De esta forma, la presente invención también se refiere a plantas transgénicas que comprenden células de plantas transgénicas y tejido obtenidos de acuerdo con el método de la presente invención.

En otro aspecto más, la invención también se refiere a partes cosechables y a material de propagación de las plantas transgénicas obtenibles de acuerdo con el método de la invención o células de planta, tejidos o una planta derivada de los mismos. Las partes cosechables pueden ser en principio cualesquiera partes útiles de una planta, por ejemplo, hojas, tallos, fruto, semillas, raíces, etc. El material de propagación incluye, por ejemplo, semillas, frutos, esquejes, plántulas, tubérculos, rizomas, etc.

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de los componentes como se definen en el método descrito anteriormente, para la generación de plantas transgénicas del género Linum. El uso de la invención se puede emplear, por ejemplo, para promover la inducción del callo, organogénesis, inducción del brote y/o inducción de la raíz.

En una realización adicional la presente invención se refiere al uso de las células de planta transgénica, el tejido de planta y plantas obtenidas de acuerdo con el método de la invención para el cultivo del tejido de una planta y/o la reproducción. Por ejemplo, las células de plantas obtenidas de acuerdo con el método de la invención se pueden usar para experimentos de fusión de protoplasto. Además, las células de planta transgénica, el tejido de planta y plantas obtenidas de acuerdo con el método de la invención se pueden usar para un método para la identificación de compuestos químicos y/o biológicos, por ejemplo, poniendo en contacto dicha célula de planta transgénica, tejido o planta que preferiblemente exhiben un fenotipo evaluable y/o seleccionable debido a la presencia de una molécula de ADN descrita anteriormente e introducida dentro de dicha célula de planta transgénica, tejido o planta de acuerdo con el método de la presente invención con un(a) (pluralidad de) compuesto(s) y determinar aquellos compuestos que son capaces de alterar el fenotipo evaluable y/o seleccionable de dichas células de planta, tejido o planta. Dichos compuestos químicos o biológicos pueden ser (poli)péptidos, ácidos nucleicos, por ejemplo una genoteca de expresión de ADNc, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos, o PNAs (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198). Además, la presente invención se refiere al uso de células de plantas transgénicas, el tejido de una planta, plantas obtenidas de acuerdo con el método de la presente invención para la producción de esterilidad masculina y/o femenina y para la alteración o modificación de la interacción de una planta/patógeno, en particular para la ingeniería de plantas resistentes a enfermedades. Estas metas se pueden alcanzar con estrategias conocidas en la técnica, véase supra. El término "patógeno" incluye, por ejemplo, bacteria, virus, insectos, y hongos así como protozoos. El método de la invención es también útil para la producción de plantas con una composición de fibras modificada o con tejido producido específicamente con compuestos químicos o biológicos específicos.

El método de la invención se puede usar para la producción (mejorada) de todos los tipos de plantas transgénicas de las familias de plantas no, o menos, accesibles hasta ahora para la transformación y regeneración de plantas. El método de la presente invención se puede aplicar deseablemente a plantas del género Linum, preferiblemente lino, aunque otras variedades de planta están también englobadas en los métodos y usos descritos en la presente.

Las figuras muestran:

Figura 1. Muestra (superior izquierda) una placa con segmentos de callo de hipocótilos que fueron incubados sin Agrobacterium y regenerados sin kanamicina, (mitad izquierda) una placa con segmentos de callo de hipocótilos que se incubaron sin Agrobacterium, pero se regeneraron con kanamicina, (superior y mitad izquierda) son callos de hipocótilos que se incubaron con Agrobacterium que contiene el vector JH5 y se regeneraron con kanamicina. La fotografía inferior muestra brotes transformados cultivados durante 2 semanas en G-418 de 60 mg/l comparados con plantas del tipo silvestre cultivadas en 40 y 60 mg/l durante el mismo periodo de tiempo.

Figura 2. Muestra (superior derecha) brotes putativos en tubos de cultivo, (superior izquierda) brotes enraizados listos para ser transferidos al suelo, (inferior izquierda y derecha) plantas transgénicas confirmadas (etiquetas rosas) comparadas con Flanders de testigo del tipo silvestre (etiquetas blancas). Todas las plantas fueron fenotípicamente similares a las plantas de testigo del tipo silvestre.

Figura 3. Ilustra la estructura del vector binario JH5 descrito en el ejemplo 3.

Figura 4. Ilustra la estructura del vector binario pPZP111 descrito en el ejemplo 4.

Figura 5. Ilustra la estructura del vector binario pB1101.2 usado en el ejemplo 5.

Figura 6. Ilustra la estructura del vector binario pHL9000 usado en el ejemplo 6.

Figura 7. Da un mapa esquemático del casete de gen usado en el ejemplo 6.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Determinación de agentes de selección apropiados

Las pruebas hechas de acuerdo con la presente invención indicaron que los segmentos de hipocótilos usados para la inoculación de Agrobacterium tumefaciens, fueron sensibles a todos los antibióticos probados excepto kanamicina. Aún en bajas concentraciones, los hipocótilos se volvieron marrones y no produjeron callo o brotes. Otras pruebas preliminares indicaron que aunque no se produjo callo cuando se usó G-418 como el antibiótico selectivo para la transformación inicial, las pruebas usando brotes regenerados mostraron que tenían la ventaja de que el lino del tipo silvestre no tenía tolerancia natural al G-418. Las pruebas posteriores mostraron que el G-418 podría ser usado como el agente selectivo para detectar brotes transformados en series posteriores de selección (tabla 1). Preferiblemente, la prueba de dos sistemas de antibióticos en los experimentos de transformación se hizo usando kanamicina para la selección inicial y G-418 para la segunda y tercera series de selección (figura 1).

TABLA 1 Capacidad de brotes transgénicos y sus equivalentes del tipo silvestre para sobrevivir en un medio con concentraciones variables de G-418

G-418	Flanders^{a}	McGregor	Ed 45
mg/l	301^{b}	WT	324	WT	288	WT
0	4^{c}	4	4	4	4	4
	4	4	4	4	4	4
10	4	4	4	4	4	4
	4	4	4	4	4	4
20	4	3	4	4	4	1
	4	4	4	3	4	2
30	3	1	4	2	4	1
	4	3	4	2	4	2
40	4	0	4	1	4	0
	4	1	4	0	4	0
50	4	0	4	0	4	0
	4	0	4	0	3	0
70	4	0	4	0	4	0
	4	0	4	0	4	0
100	4	0	4	0	3	0
	3	0	4	0	4	0
150	2	0	4	0	2	0
	4	0	3	0	0	0
200	1	0	3	0	0	0
	2	0	1	0	1	0

a. \begin{minipage}[t]{105mm} Para cada combinación de variedad (Flanders, McGrecor o Ed 45) y concentración de G-418, se ubican cuatro brotes de testigo del tipo silvestre y cuatro brotes de un transformante en un recipiente estéril que se divide a la mitad. \end{minipage}
b. \begin{minipage}[t]{105mm} 301, 324 y 288 son todos transformados con el vector JH5 descrito en la figura 3. \end{minipage}
c. \begin{minipage}[t]{105mm} Número de brotes que sobrevivieron 24 días en un medio con G-418. \end{minipage}

Ejemplo 2 Sistema general de transformación de Linaza/Lino

Semillas esterilizadas de la variedad de lino deseada; por ejemplo: variedad de lino Flanders

Esterilización

50 min Etanol

25 min 9% Hipocloruro

4 enjuagues con H_{2}O bidestilado

IX 5 min en H_{2}O bidestilado

2X 15 min en H_{2}O bidestilado

Sembrar las semillas esterilizadas en un medio estéril, en recipientes de cultivo que se cubren para que la luz pase solamente a través de la parte superior del recipiente.

1 litro de medio de semillas
Medio MS	4,4 g
mio-inositol	400 mg
MES	500 mg
Sacarosa	5 g
Agar	7,8 g
pH 6,2 y autoclave

Germinación bajo poca luz, aproximadamente 500 Lux durante 6 a 7 días para obtener hipocótilos etiolados. El día antes de empezar la co-cultivación con el Agrobacterium, se inicia un cultivo nocturno inoculado con la combinación deseada de Agrobacterium-plásmido. Se debería usar un medio YEP con la combinación correcta de antibióticos. Por ejemplo, para el vector binario PRE1 usar 100 mg/l de espectinomicina, 200 mg/l de estreptomicina y 80 mg/l de rifampicina. Al día siguiente, medir OD_{600}, luego centrifugar el cultivo y quitar el sobrenadante. Resuspender el sedimento de Agrobacterium en un medio de lavado.

1 litro de medio de lavado
Medio MS	4,4 g
mio-inositol	400 mg
MES	500 mg
pH 5,8 y autoclave

Bajo condiciones estériles, recortar los hipocótilos en segmentos de 0,5 cm. Poner los segmentos de hipocótilo en la disolución de Agrobacterium e incubar dos horas. Transferir los segmentos de hipocótilo a placas Petri de co-cultivo de 94 x 16 mm (50 por placa) e incubar 4 días. Lavar los segmentos de hipocótilo en una disolución de antibióticos para destruir el Agrobacterium. Por ejemplo, usar un medio de lavado que contiene 400 mg/l de carbenicilina y 100 mg/l de cefotaxima. Lavar los segmentos 4 veces y durante 15 minutos cada vez. Transferir los segmentos lavados de hipocótilo a placas Petri de 145 x 20 mm (50 por placa) que contienen una combinación optimizada de hormonas, un antibiótico para seleccionar células transformadas y antibióticos para inhibir y destruir cualquier remanente de Agrobacterium. Por ejemplo:

Medio de Selección
Medio de Gamborg MS	4,4 g
mio-inositol	400 mg
MES	500 mg
Sacarosa	20 g
Agar	7,8 g
pH 5,8 y autoclave, después de esterilizar en autoclave, adicionar:
BAP	1 mg/l
NAA	0.075 mg/l
carbenicilina	400 mg/l
cefotaxima	200 mg/l
kanamicina	160 mg/l

\newpage

Poner las placas de selección en un ambiente de crecimiento con aproximadamente 1000 Lux y una temperatura de 230 a 26ºC. Es importante regular las condiciones para evitar tanto como sea posible una excesiva acumulación de condensación en la tapa de las placas de Petri. Dejar las placas de selección en el ambiente de crecimiento durante seis semanas y durante ese tiempo recortar y transferir brotes a medida que aparecen. Los brotes que emergen del callo se transfieren directamente a recipientes de cultivo que contienen un medio para los brotes.

Medios para los Brotes
Medio MS	4,4 g
mio-inositol	400 mg
MES	500 mg
Sacarosa	15 g
Agar	7,8 g
\begin{minipage}{157mm} pH 6,2 y autoclave, después de esterilizar en autoclave adicionar 60 mg/l de G-418, 400 mg/l de carbenicilina y 100 mg/l de cefotaxima. \end{minipage}

Para brotes que no producen raíces la primera vez en la selección de G-418, pero permanecen completamente verdes y crecen, se corta la punta y se transfiere a un segundo recipiente de cultivo con G-418. Los brotes que producen raíces bajo la selección G-418, se cortan y la punta se transfiere a un tubo que contiene 50 mg/l de kanamicina y 400 mg/l de carbenicilina. Dos segmentos de tallo de 2 mm se transfieren a una placa de selección (la misma usada previamente) y se prueben para ver la formación de un callo verde y posterior producción de brotes. Los brotes que dan positivo para estas tres pruebas se pueden plantar inmediatamente. Se pueden obtener rápidamente más brotes del tejido de prueba del callo y dentro de unas pocas semanas también se pueden plantar o usar para análisis adicionales mediante transferencia Southern (Sambrook, Molec. Cloning a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) ensayo ELISA NPT II (5 Prime - 3 Prime Inc., Boulder, Colorado, Estados Unidos).

Bajo las condiciones de crecimiento correctas, las plantas florecerán dentro de 4 a 6 semanas dependiendo de la variedad. Las semillas están totalmente maduras dentro de 8 a 10 semanas. Si las semillas no deben estar totalmente maduras, pueden germinar y crecer después de 6 semanas sin ningún problema y a menudo antes con una manipulación especial.

Ejemplo 3 Experimento usando la variedad de lino Flanders y el vector binario JH5

El vector binario JH5, usado en este ejemplo, se muestra en la figura 3 y se construyó de la siguiente manera.

El ADNc, que codifica una delta-15-desaturasa, se aisló originalmente a partir de Brassica napus por Arondel (Science 258 (1992), 1353-1355) y se obtuvo del Centro de Recursos Biológicos Arabidopsis (1060 Carmack Road, Columbus, Ohio, E.E.U.U.). El plásmido se identificó como pBNDES3. Un fragmento Xbal/Sall se extirpó del pBNDES3 y se clonó en el pTE200 digerido con BamHI y Xhol. El pTE200 es un derivado Bluescript (Martini, BioEngineering fuer Rapssorten nach Mass (1999), Vortraege fuer Pflanzenzuechtung Heft 45, pp. 133-154; Liddy Halm, Goettingen, Alemania) que contiene las regiones promotora y terminadora de una acil-ACP tioesterasa designada como FatB4. El PTE200 se digirió luego con Bsp1201 y Smal, y se insertó un fragmento 2200 bp Notl/Hind111 del promotor Napina (Scofield J., Biol. Chem. 262 (1987), 12202-12208). El plásmido resultante se nombró JH3.

El fragmento que contenía el promotor Napina, el ADNc delta-15 y el terminador FatB4 se extirpó digiriendo con Bsp1201 y Notl y se clonaron dentro del sitio Apal del vector binario pRE1 (Martini, BioEngineering fuer Rapssorten nach Mass (1999) Vortraege fuer Pflanzenzuechtung Heft 45, pp. 133-154; Liddy Halm, Goettingen, Alemania). El vector binario resultante se designó JH5.

Se produjeron plantas regeneradas como se describe en el ejemplo 2. Se incubaron segmentos de hipocótilo de hipocótilos decolorados de 6 días de la variedad Flanders, durante 1,5 horas en una disolución de Agrobacterium y luego se colocaron placas en un medio de co-cultivo y se dejaron durante 4 días. El vector JH5 estaba en la cepa de Agrobacterium C58 (Hood, J. Bacteriol. 168 (1986), 1291-1301). El testigo negativo fueron segmentos de hipocótilo incubados en un medio de lavado sin Agrobacterium. Después de 4 días, los segmentos de hipocótilo se transfirieron a placas de selección y se dejaron durante 6 semanas. Los primeros brotes se quitaron de las placas de selección 3 semanas más tarde y las últimas después de 6 semanas. Todos los brotes se transfirieron a recipientes esterilizados con un medio que contenía G-418. Aquellos brotes que produjeron raíces o callo verde en el tallo se transfirieron a tubos. Las pruebas de callo y enraizamiento se realizaron así como un ensayo ELISA NPT II. Los brotes enraizados se transfirieron al suelo y se dejó que produjeran semilla (tabla 2). Un total de 1200 segmentos de hipocótilo se inocularon con Agrobacterium y 26 transformantes putativos sobrevivieron a la selección en G-418. Después de sucesivas pruebas, 21 de los 26 originales probaron estar transformados (tabla 2).

TABLA 2 Brotes sobrevivientes después de la selección usando kanamicina seguida por G-418

101

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Experimento usando la variedad de lino Flanders y el vector binario pPZPHV5

El vector binario pPZPHV5 contiene un ADNc que codifica una lipoxigenasa de conejo bajo el control del promotor LeB4 y el terminador CaMV35S. La lipoxigenasa de los reticulocitos de conejo fueron originalmente aislados por Schewe et al. (Methods Enzymol. 71 (1981), 430-441). El plásmido pRL usado en este es un derivado del vector pBluescript II SK+. El ADNc que codifica la lipoxigenasa se extirpó usando las endonucleasas de restricción Sma I y Hind III, el extremo sobresaliente de la digestión con Hind III se redondeó y el fragmento así obtenido se clonó en el vector pRT103-42- 14 (Fiedler, 1996, Hochexpression rekombinanter Antikorperfragmente in transgenen Pflanzen; Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades, in der Mathematisch Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) portando el promotor LeB4 y el terminador CaMV35S, cortándose dicho vector usando Sma I. Del vector resultante pRTHV5, se extirpó el casete de gen completo usando Hind III y se ligó dentro del vector binario pPZP111 (figura 4; Hajdukiewicz et al., Plant. Mol. Biol. 25 (1994), 989-994). Esta construcción fue designada pPZPHV5.

Se produjeron plantas regeneradas como se describe en el ejemplo 3. Además de las pruebas de callo y raíz, las plantas también se analizaron por PCR con el fin de probar su transgenicidad.

TABLA 3 Brotes de un evento de transformación sobrevivientes después de la selección usando kanamicina seguida de G-418

102

Ejemplo 5 Experimento usando la variedad de lino Flanders y el vector binario pJH7

El vector binario pJH7 usado en este ejemplo se generó por clonación en el vector binario pBl 101.2 (figura 5), aguas arriba del gen GUS, el promotor KCS del gen que codifica la \beta-Cetoacil-Coa sintasa a partir del Brassica napus (Han, 1999, \beta-Ketoacyl-CoA Synthase from Brassica napus L.: Functional Characterization and Promoter Analysis; Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades am Fachbereich Biologie der Universität Hamburg). La etapa de clonación se ha llevado a cabo usando los dos sitios de restricción Sma I y Hind III. La construcción resultante se designo pJH7.

Se produjeron plantas regeneradas como se describe en el ejemplo 3. Además de pruebas de callo y raíz, las plantas también se probaron por PCR con el fin de mostrar su transgenicidad.

TABLA 4 Brotes de un evento de transformación sobrevivientes después de la selección usando kanamicina seguida por G-418

103

Ejemplo 6 Experimento usando la variedad de lino Flanders y el vector binario pHLHVO

El vector binario pHLHVO es un derivado del vector binario pHL9000 (figura 6; Martini, BioEngineering fur Rapssorten nach MaB (1999), Vorträge Pflanzenzülchtung Heft 45, 155-171, Liddy Halm, Göttingen) en el cual se clonó el casete de gen mostrado en la figura 7. El casete de gen se amplificó mediante PCR usando dos cebadores específicos y el vector pB121-LBLOX (Hause et al., Planta 210 (2000), 708-714) como plantilla. La secuencia de los oligonucleótidos cebadores es:

\vskip1.000000\baselineskip

Spe35: 5' act agt aga gga cct aac aga ac 3' (NRO IDENT SEC: 1); y

NoXho: 5' ctc gag cga tct agt aac ata gat gac 3' (NRO IDENT SEC: 2).

\vskip1.000000\baselineskip

En el extremo 5' el cebador Spe35 tiene un sitio Spe I y el cebador NoXho un sitio Xho I (ambos marcados con caracteres en negrita). Usando estos sitios de restricción, se clonó el casete de gen en pHL9000, el que había sido digerido con Spe I y Sal I. La construcción resultante se designó pHLHVO.

Se produjeron plantas regeneradas como se describe en el ejemplo 3. Además de pruebas de callo y raíz, las plantas también se probaron por PCR con el fin de probar su transgenicidad.

TABLA 5 Brotes de un evento de transformación sobrevivientes después de la selección con kanamicina seguida por G-418

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Leyendas de las tablas 2 a 5

Transform. Nro.: identifica el experimento desde el cual se originó el transformante.

Ident. Planta: es un número único dado a cada transformante putativo producido.

Régimen G-418 selecc.: describe cuantas veces se cultiva el brote en G-418 antes de ser transferido a un tubo para luego probarlo.

Raíz o callo verde: indica si el brote produjo una raíz o solamente un callo verde cuando se cultivó en G-418.

Prueba de callo: muestra si pequeñas secciones de tallo tomadas del brote pudieron agrandarse y producir un callo verde. pos indica que la prueba fue positiva y neg indica que la prueba fue negativa.

Prueba de raíz: prueba la capacidad del brote para producir raíces cuando se cultiva en kanamicina.

Prueba NPT II: indica los resultados de un ensayo ELISA NPT II llevado a cabo usando un conjunto de 5 Prime - 3 Prime, Inc. (Boulder Colorado, Estados Unidos).

Prueba PCR: muestra si una planta contiene el gen npt II debido a la presencia de un producto de PCR específico.

Transferencia al suelo: muestra cuales transformantes tenían brotes transferidos al suelo.

Semilla producida: indica cuales de los brotes que fueron transferidos al suelo produjeron semilla.

Testigos: WT1 y WT2 son las variedades Flanders que fueron regeneradas, pero no transformadas con Agrobacterium. 288 (Ed45), 301 (Flanders), 324 y 326 (McGregor) son transformantes obtenidos en experimentos anteriores y confirmados previamente por análisis de transferencia Southern que son transgénicos.

Todos los reactivos y recipientes usados para este método se pueden obtener en la empresa Duchefa (Haarlem, Holanda, e-mail DUCHEFA@WXS.NL)

Claims

1. Un método para la generación de plantas transgénicas de la familia Linaceae que comprende:

(a): introducir una molécula de ADN recombinante que comprende al menos un gen marcador seleccionable que confiere resistencia a al menos dos antibióticos dentro de las células de la planta;

(b): inducción de un callo transgénico a partir de las células de (a); y

(c): regeneración de plantas transgénicas a partir del callo inducido, en el que

(i): después de la inducción del callo y/o cultivo de callos en un medio que contiene un primer antibiótico

(ii): los callos o brotes regenerados de los mismos se transfieren a un medio que contiene un segundo antibiótico que es diferente del primer antibiótico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha planta es Linum usitatissimum.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha planta es lino o linaza.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos uno de dicho primer y segundo antibiótico se selecciona del grupo que consiste en kanamicina, paromicina, neomicina, gentamicina, G-418, estreptomicina y espectinomicina.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho gen marcador seleccionable codifica neomicina fosfotransferasa, estreptomicina fosfotransferasa o aminoglucósido-3-adeniltransferasa.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer antibiótico es kanamicina y dicho segundo antibiótico es G-418.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la concentración de dicho primer antibiótico está en el intervalo de 150 a 200 mg/l.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración de dicho segundo antibiótico es 40 a 100 mg/l.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichas células de la planta están comprendidas en el hipocótilo de las plantas.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dichas plantas se derivan de semillas en germinación sincronizada.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la molécula de ADN recombinante se introduce por un método que comprende:

(a): inoculación con Agrobacterium tumefaciens;

(b): bombardeo de partículas; o

(c): microinyección.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha inoculación con Agrobacterium tumefaciens se realiza en presencia de acetosiringona.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha molécula de ADN recombinante comprende un vector binario.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho medio que contiene dicho primer antibiótico contiene al menos 0,05 mg/l de auxina y al menos 0,002 mg/l de citoquinina.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicha auxina es NAA.

16. El método de la reivindicación 14 ó 15, en el que dicha citoquinina es TDZ y/o BAP.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que la concentración de auxina y citoquinina es TDZ (0,002 mg/l) y NAA (0,05 mg/l) o BAP (2 mg/l) y NAA (0,1 mg/l).

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18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho medio que contiene dicho segundo antibiótico está sustancialmente exento de auxinas y/o citoquininas.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la molécula de ADN recombinante además comprende una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido, péptido, ARN antisentido, ARN sentido, ARN viral o ribozima.

20. El método de la reivindicación 19, en el que dicha secuencia nucleótida está operativamente unida a secuencias de control de expresión y/o transcripción.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha molécula de ADN recombinante comprende al menos un gen marcador seleccionable y/o evaluable adicional.

22. Células de plantas transgénicas, tejido o una planta obtenibles por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o células de planta, tejido o una planta derivada de las mismas, que comprenden al menos una molécula de ADN recombinante que comprende al menos dos genes marcadores seleccionables que confieren resistencia a al menos dos antibióticos.

23. Partes cosechables o material de propagación de una planta de la reivindicación 22, que comprende células de la planta de la reivindicación 22.

24. Uso de una molécula de ADN recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, Agrobacterium tumefaciens, antibióticos u hormonas para el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

25. Uso de células de planta, tejido de planta o plantas de la reivindicación 22 para la reproducción de plantas, para un método para la identificación de compuestos químicos y/o biológicos, para la producción de plantas estériles masculinas y/o femeninas, plantas resistentes a enfermedades o para plantas con tejido producido específicamente con compuestos químicos o biológicos específicos.