ES2335947T3

ES2335947T3 - Transformacion de alta eficiencia del algodon mediada por agrobacteriun usando explantes de peciolo.

Info

Publication number: ES2335947T3
Application number: ES99931735T
Authority: ES
Inventors: Zhi Xian Chen; Lianhui Zhang
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2010-04-06
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: EP1194579B1; DE69941732D1; BR9917361A; CN100370031C; CN1352692A; WO2000077230A1; JP2003502050A; AU782198B2; MXPA01012750A; BR9917361B1; EP1194579A1; AU782198C; ATE449854T1; JP4463456B2; AU4817099A; US7592508B1; TR200103580T2

Abstract

Un procedimiento para producir una planta de algodón transgénica que comprende las etapas de: (a) obtener explantes de pecíolo de algodón, (b) exponer los explantes de pecíolo a un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que alberga un vector que comprende un gen exógeno y un gen marcador seleccionable, siendo el Agrobacterium capaz de efectuar la transferencia estable del gen exógeno y el gen marcador seleccionable al genoma de las células del explante de pecíolo, (c) cultivar los explantes de pecíolo en un medio que contiene ácido 2,4-diclorofenoxiacético a una concentración que varía de más de 0 a 0,5 mg/l y quinetina a una concentración que varía de más de 0 a 1 mg/l para inducir la formación de callos, (d) seleccionar el callo transformado que expresa el gen exógeno, (e) cultivar el callo seleccionado en cultivo de suspensión en medio de diferenciación que no contiene hormona vegetal durante menos de 20 días para inducir la formación de embrioides, (f) germinar los embrioides en un medio que tiene una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en asparagina, glutamina o tanto asparagina como glutamina y que no contiene hormona vegetal, para producir plantas de algodón transgénicas jóvenes, y (g) cultivar las plantas de algodón transgénicas jóvenes en un medio que tiene 10 g/l de glucosa y 10 g/l sacarosa como fuente de carbono y que no contiene hormona vegetal, para producir plantas de algodón transgénicas, en el que los medios de cultivo usados en las etapas (b)-(f) tienen glucosa como única fuente de carbono y en el que la etapa (e) se realiza a un pH entre 5,8 y 7,5.

Description

Transformación de alta eficiencia del algodón mediada por Agrobacterium usando explantes de pecíolo.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo general de la ingeniería genética de plantas, en particular a la introducción de material genético exógeno en el algodón por transformación con Agrobacterium de explantes de pecíolo de algodón seguido de regeneración de embriones somáticos.

Antecedentes

El algodón es uno de los cultivos industriales más valiosos y ampliamente cultivados internacionalmente. Su producción anual mundial es superior a 100 millones de fardos valuados en US\textdollar 45 mil millones. Asia es el área de producción de algodón más grande, con cuatro de los cinco productores líderes de algodón del mundo ubicados en esta región. El algodón no es sólo el principal sostén del la industria textil, sino que también proporciona un mercado enorme y rentable para los fabricantes de productos químicos para el control de malezas, enfermedades y plagas. Existen diversas oportunidades para la mejora molecular del algodón, que incluyen la mejora del rendimiento y calidad de fibra y la creación de nuevas variedades que son resistentes a los herbicidas, insectos, nematodos y enfermedades (Steward, 1991).

Cultivo de tejido de algodón: En 1935, Skovsted informó el primer cultivo de embriones de algodón. Beasley (1971) informó la formación de callos en el algodón como un crecimiento a partir del extremo micropilar de los óvulos fertilizados en el medio de Murashige & Skoog (MS). Se obtuvo la embriogénesis somática a partir de un cultivo en suspensión de G. klotzschianum (Price & Smith, 1979). En 1983, Davidonis & Hamilton fueron los primeros en tener éxito en la regeneración eficiente y repetible de plantas de algodón (G. hirsutum L.) a partir de callos después de dos años de cultivo. Desde entonces las plantas de algodón se regeneraron a través de la embriogénesis somática de diferentes explantes (Zhang & Feng, 1992; Zhang, 1994) que incluyen el cotiledón (Davidonis et al., 1987; Davidonis & Hamilton, 1983; Finer, 1988; Firoozabady et al., 1987), hipocótilo (Cousins et al., 1991; Rangan & Zavala, 1984; Rangan & Rajasekaran, 1996; Trolinder & Goodin, 1988; Umbeck et al., 1987, 1989), tallo (Altman et al., 1990; Bajaj et al., 1989; Chen, et al. 1987; Finer & Smith, 1984), brote apical (Bajaj et al., 1985; Gould et al., 1991; Turaev & Shamina, 1986), embrión inmaduro (Beasley, 1971; Stewart & Hsu, 1977, 1978), pecíolo (Finer & Smith, 1984; Gawel et al., 1986; Gawel & Robacker, 1990), hoja (Finer & Smith, 1984; Gawel & Robacker, 1986), raíz (Chen & Xia, 1991; Kuo et al., 1989), callo (Finer & McMullen, 1990; Trolinder et al., 1991) y protoplasto (Chen et al., 1989).

Transformación del algodón: La transformación del algodón mediada por Agrobacterium se informó por primera vez hace una década con hipocótilo y cotiledón como explantes (Firoozababy et al., 1987; Umbeck et al., 1987). Se han introducido varios genes útiles en el algodón por medio de la transformación mediada por Agrobacterium, incluyendo genes con resistencia a insectos y herbicidas (Perlak et al., 1990; Trolinder et al., 1991; Chen et al., 1994). Se han usado explantes (tales como hipocótilo, cotiledón, callo generado del hipocótilo y cotiledón, así como embriones inmaduros) para la transformación mediada por Agrobacterium y bombardeo de partículas (de Framond et al., 1983; Finer & McMullen, 1990; Firoozabady et al., 1987; Perlak et al., 1990; Rangan & Rajasekaran, 1996; Rajasekaran et al., 1996; Trolinder et al., 1991; Umbeck et al., 1987, 1989, 1992). Además, también se ha usado tejido meristemático de ejes embrionarios escindidos para la transformación del algodón por bombardeo de partículas (Chlan et al., 1995; John, 1996; John & Keller, 1996; McCabe & Martinell, 1993). Zhou et al. (1983) transformaron algodón inyectando ADN en la placenta axil un día después de la autopolinización.

Sin embargo, las tasas de transformación en general fueron bajas, variando de 20 a 30% cuando se usó el hipocótilo como explante (Firoozababy et al., 1987; Cousins et al., 1991; Rajasekaran et al., 1996). Se informó una eficiencia de transformación significativamente superior, de hasta 80%, cuando se usó el cotiledón como explante y el gen ocs que codifica la octopina sintetasa como gen indicador (Firoozababy et al., 1987). Sin embargo, la validez de la octopina como marcador de la transformación es cuestionable ya que se ha hallado octopina en varias especies de plantas ciertamente no transformadas por la infección con A. tumefaciens (Wendt-Gallitelli y Dobrigkeit, 1973). Un informe más reciente indicó que la eficiencia de transformación del cotiledón fue aproximadamente de 20 a 30% (Cousins et al., 1991). La eficiencia de transformación fue incluso menor cuando se usó el procedimiento de bombardeo de partículas (Keller et al., 1997). Una diferencia en el tipo de explantes usados para la transformación pudo haber tenido un efecto significativo sobre la eficiencia de transformación y regeneración. Se ha informado, por ejemplo, que para reducir los transformantes falsos positivos, el cotiledón fue un mejor explante que el hipocotiledón (Firoozabady et al., 1987).

La transformación del algodón es muy dependiente del genotipo (Trolinder, 1985a, 1986; Trolinder & Goodin, 1987, 1988a, 1988b; Trolinder & Chen, 1989). Además de unos pocos cultivares que son regenerables y transformables, tales como Gossypium hirsutum cv. Coker 312 y G. hirsutum Jin 7, la mayor parte de los otros cultivares comerciales de elite importantes, tales como G. hirsutum cv. D&P 5415 y G. hirsutum cv. Zhongmian 12, no son regenerables y transformables por esos procedimientos. La ausencia de un procedimiento de regeneración de plantas de alta eficiencia se ha considerado como el mayor obstáculo para la aplicación de la transformación mediada por Agrobacterium al algodón (Gawel et al., 1986; Firoozabady et al., 1987).

El documento WO97/12512 desvela un procedimiento para regenerar plantas de algodón a partir de tejido de explante, que permite la generación del callo embriogénico a partir de un explante de tejido de algodón que no se cultiva en el medio de iniciación del callo, que tiene hormonas vegetales exógenas. El procedimiento se puede utilizar en la transformación de plantas de algodón, cortando tejido de algodón para formar un explante, co-cultivando el tejido del explante de algodón con Agrobacterium que comprende una secuencia de ADN de interés, y cultivando el explante co-cultivado en medio de iniciación de algodón que comprende un agente selectivo pero que no tiene hormonas vegetales exógenas. De esta manera las células transformadas son inducidas para producir el callo embriogénico en el medio selectivo libre de hormonas.

Sumario de la invención

Para superar los problemas asociados con los procedimientos informados previamente, se ha desarrollado un eficiente procedimiento de transformación utilizando pecíolo como explante, junto con un conjunto de medios mejorados en forma correspondiente. Este procedimiento provee varias ventajas en comparación con los procedimientos del hipocótilo y cotiledón:

(1) los explantes son fáciles de obtener;

(2) la eficiencia de transformación es superior;

(3) la contaminación del Agrobacterium es muy rara;

(4) la eficiencia de la regeneración es mayor; y

(5) se reduce el tiempo desde la transformación a la regeneración de las plántulas.

Dos variedades de algodón, es decir, Coker 312 y Si-Mian 3, se han transformado con éxito con este procedimiento, y se han obtenido más de 30 líneas transgénicas independientes de Coker 312 que muestran fuerte actividad del transgén marcador. Este procedimiento es aplicable a otras variedades de algodón tales como Jin 7 y Ji 713 de China, Siokra 1-3 de Australia, T25, Coker 201 y Coker 310 de Estados Unidos.

Breve descripción de la figura

La Figura 1 muestra el plásmido pBI121GFP, que contiene GFP como gen indicador y el gen de NPT II (neomicina fosfotransferasa) como marcador seleccionable, usado para la transformación mediada por Agrobacterium del pecíolo del algodón de acuerdo con los procedimientos de la presente invención.

Descripción detallada

Se desvela un procedimiento eficiente para la transformación genética de plantas de algodón, que incluye líneas de elite, usando pecíolo de algodón como explante. El uso de explantes de pecíolo, más un conjunto de medios mejorados, aumenta significativamente la eficiencia de transformación y se acorta el tiempo requerido desde la transformación a la regeneración en comparación con los procedimientos informados previamente.

Utilizando los procedimientos de la presente invención, el proceso total desde la transformación del Agrobacterium hasta la regeneración de las plántulas transgénicas puede demandar aproximadamente 6-7 meses. Los procedimientos informados del hipocótilo y cotiledón usualmente requerían 7-9 meses o más para completar el mismo proceso (Cousins et al., 1991; Chen et al., observación no informada). Se requerían otros dos meses para el crecimiento de las pequeñas plántulas a un tamaño adecuado para plantarlas en el suelo.

Las técnicas para introducir genes exógenos en Agrobacterium de modo que se transfieran en forma estable a una planta o tejido de planta expuestos al Agrobacterium son bien conocidos en la técnica y no forman parte de la presente invención. Es ventajoso usar una cepa llamada "desarmada" del Agrobacterium o plásmido Ti, es decir, una cepa o plásmido en el que los genes responsables de la formación del tumor característico de la enfermedad del cuello causada por el Agrobacterium de tipo salvaje se han eliminado o desactivado. Se encuentran numerosos ejemplos de cepas de Agrobacterium desarmadas en la bibliografía (por ejemplo, pAL4404, pEHA101 y pEH 105 (Walkerpeach & Veltern, 1994)). También es ventajoso usar un sistema llamado de vector binario, tal como el que se describe en Schilperoort et al., 1990, 1995. Un sistema de vector binario permite la manipulación en E. coli del plásmido que porta el gen erógeno que se ha de introducir en la planta, los que hace mucho más fácil de llevar la cabo la construcción del vector.

De modo similar, la construcción del vector, que incluye la construcción de genes quiméricos que comprenden el gen exógeno que se desea introducir en la planta, se pueda realizar usando técnicas bien conocidas en la materia y no forma parte de la presente invención. Los genes quiméricos deben comprender promotores que tengan actividad en el huésped en el que se desea su expresión. Por ejemplo, es ventajoso tener una serie de marcadores seleccionables para la selección de las células transformadas en varias etapas del proceso de transformación. Un marcador seleccionable (por ejemplo un gen que confiere resistencia a un antibiótico tal cono kanamicina, cefotaxime o estreptomicina) ligado a un promotor activo de la bacteria permitiría la selección de bacterias que contienen el marcador (es decir, transformantes). Otro marcador detectable unido a un promotor activo de planta, tal como el promotor CaMV 35S o un promotor de ADN-T tal como el promotor NPT 1I NOS, permitiría la selección de células de plantas transformadas. El gen exógeno que se desea introducir en la célula de planta debe comprender un promotor activo de planta en relación funcional con la secuencia codificadora, de modo que el promotor dirija la expresión del gen en la planta transformada. Nuevamente, los promotores activos de planta, tal como el CaMV 355, el promotor NPT II NOS o cualquiera de los promotores específicos de tejido, son bien conocidos en la técnica y la selección de un promotor apropiado están dentro de la experiencia ordinaria de la técnica.

El presente procedimiento se puede usar para producir plantas transgénicas que expresan numerosos genes exógenos, y no se limita a la elección de dicho gen. La selección del gen exógeno deseado depende del objetivo del investigador y se conocen en la técnica numerosos ejemplos de genes deseables que se podrían usar con la presente invención (por ejemplo, la familia de los genes de la toxina de Bacillus thuringiensis, genes de resistencia a herbicidas tales los genes de shikimato sintasa que confieren resistencia al glifosato, Patente Estadounidense No. 5.188.642, o un gen de 2,4-D-monooxigenasa que confiere resistencia al ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), Bayley et al., Theoretical and Applied Genetics, vol. 82, pp. 645-49, genes de esterilidad masculina tales como los genes antisentido de la Patente Estadounidense No. 5.741.684 (Fabijanski, et al.), o inclusive los sistemas de protección de cultivo elaborados descritos en la Patente Estadounidense No. 5.723.765 (Oliver et al)).

La regeneración del algodón es considerada en la técnica como muy dependiente de la variedad. Se ha demostrado que la serie de variedades de algodón de Coker es relativamente fácil de transformar. Sin embargo, DP 5412, Zhongmain 12 y muchas otras variedades aún presentan dificultades asociadas con la regeneración. La situación es la misma para G. barbadense y otras especies diploides. Si bien la embriogénesis y regeneración somática de todas las plantas es un proceso muy dependiente del genotipo en el algodón, se ha demostrado la transformación y regeneración exitosa de dos variedades de algodón diferentes, es decir Coker 312 de U.S.A. y Si-Mian 3 de China, usando los procedimientos de la presente invención. En consecuencia se considera que la presente invención tiene amplia aplicabilidad para la transformación de una variedad de líneas del algodón.

Se confirmó la integración del transgén en el genoma del algodón producida por los procedimientos de la presente invención usando técnicas de hibridación Southern estándares, que puede identificar el número de copias del transgén insertado en cada línea transgénica (véase el Ejemplo 6, más adelante). La generación F1 del algodón transgénico se puede analizar para determinar la presencia del transgén, y el patrón de herencia del transgén de la generación F1 se puede analizar para confirmar la estabilidad y la capacidad de herencia.

En comparación con otros protocolos informados, el sistema de transformación del algodón de la presente invención tiene superior eficiencia de transformación y tasa de supervivencia. Esto se puede atribuir a varios factores. En la presente invención, se usó pecíolo como explante para la transformación. Diferentes tipos de explantes de algodón pueden tener efectos significativos sobre la eficiencia de la transformación y la regeneración de la planta (Firoozabady et al., 1987). La inducción de la embriogénesis somática del pecíolo se informó previamente. Pero la regeneración no fue exitosa o resultó muy pobre (Finer y Smith, 1904; Gawel et al., 1986). Con la presente invención, la eficiencia de regeneración fue significativamente mejorada utilizando el medio mejor que se describe a continuación. En una realización preferida, se obtuvieron callos de alta calidad cuando se cultivaron pecíolos tiernos ricos en células parenquimáticas en tejido del haz vascular primario en el medio MMSI (que se describe a más abajo) con concentraciones bajas de 2,4-D y Quinetina.

Con la presente invención, se puede acortar el tiempo de inducción del embrión en el cultivo en suspensión a 10-14 días, en comparación con las 3 semanas que se informaron previamente (Cousins et al., 1991). Se halló que un período acortado de tratamiento del cultivo en suspensión es importante para la alta frecuencia de inducción de la embriogenésis. También es importante para reducir la producción de embriones anormales, ya que se produce un porcentaje alto de embriones vítreos que son pobres para la regeneración cuando los callos de algodón se mantienen en cultivo en suspensión por demasiado tiempo (Chen et al, observación no publicada).

Para el máximo crecimiento celular en las diferentes etapas, excepto en la etapa de crecimiento de las plantas jóvenes, se usó glucosa como única fuente de carbono. La cantidad de glucosa en el medio puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 g/l, preferiblemente aproximadamente 30 g/l. En la etapa de crecimiento de la planta joven, se prefieren glucosa y sacarosa a aproximadamente 10 g/l respectivamente como fuentes de carbono para la promoción del crecimiento de las plántulas saludables.

Para el crecimiento del callo, la embriogénesis y la proliferación del callo, el pH varía de 5,8 a 7,5, preferentemente pH 6,2-7,0, más preferentemente a pH 6,5. Un medio de pH 7,0 es preferible para el crecimiento saludable de la raíz de las plántulas.

Para la iniciación del callo y la inducción de la potencia de embriogénesis efectivas, es importante que haya bajas concentraciones de 2,4-D y quinetina en la inducción del callo y el medio de selección. La cantidad de 2,4-D puede ser más de 0 a aproximadamente 0,5 mg/l, con preferencia aproximadamente 0,05 mg/l. La cantidad de quinetina puede ser de más de 0,0 mg/l a aproximadamente 1,0 mg/l, con preferencia aproximadamente 0,1 mg/l. En la etapa de diferenciación del callo y la etapa de germinación del embrioide, se obtuvieron los mejores resultados cuando no se añadió hormona vegetal a los medios.

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Los aminoácidos asparagina y glutamina son mejores fuentes de nitrógeno que el nitrógeno amoniacal inorgánico para sostener específicamente la germinación de los embrioides y el desarrollo de la raíz. En el medio de germinación del embrioide, la cantidad de asparagina puede ser de aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 mg/l, con preferencia aproximadamente 500 mg/l. La cantidad de glutamina puede ser de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000 mg/l, con preferencia aproximadamente 1000 mg/l. Con estas fuentes de nitrógeno optimizadas, se inhibió el crecimiento de los callos no embriogénicos mientras se promovió con preferencia la germinación, el crecimiento y el desarrollo de la raíz de los embrioides.

En diferentes etapas de la transformación excepto el co-cultivo con Agrobacterium, el tejido y callo de la planta se mantienen preferentemente a 28ºC pero se pueden variar desde 25-35ºC. Para la transformación efectiva, la temperatura en la etapa de co-cultivo no debería ser superior a 28ºC. Se prefieren condiciones de iluminación de 16 horas de luz (60-90, \muEm^{-2}S^{-1}) y 8 horas de oscuridad por día para todas las etapas de transformación y regeneración del algodón.

A diferencia de los protocolos de transformación y regeneración previamente informados (Umbeck et al., 1987; Firoozabady et al., 1987, Cousins et al.), los medios usados en la presente invención están optimizados en varios aspectos: (a) se usa glucosa como única fuente de carbono en todos los medios de cultivo excepto en el medio usado para cultivar plantas jóvenes antes de plantarlas en el invernadero; (b) los medios se ajustan a un valor de pH superior (6,5-7,0); (c) se usa menor concentración de 2,4-D (0,05 mg/l) y quinetina (0,1 mg/l) sólo en la etapa de iniciación del callo, no se usa hormona en otras etapas; (d) se usan asparagina y glutamina para reemplazar el nitrógeno amoniacal inorgánico en el medio usado para la germinación del embrioide. Estas modificaciones están adaptadas para el requerimiento fisiológico del desarrollo del embrioide del algodón y el crecimiento de las plántulas. Se ha hallado que el desarrollo del embrioide y el crecimiento de las plántulas, en especial el desarrollo del sistema de raíz, se pueden atribuir en gran parte a estos medios optimizados. Por ejemplo, se ha hallado que la asparagina y glutamina eran mejores fuentes de nitrógeno que el nitrógeno amoniacal inorgánico para sostener la germinación del embrioide y el desarrollo de la raíz. En el medio MMS3 (que se describe más abajo), que contiene asparagina y glutamina como fuente de nitrógeno, el crecimiento de los callos no embriogénicos se inhibió mientras se promovió con preferencia la germinación, el crecimiento y el desarrollo de la raíz de los embrioides. Debido al desarrollo de raíz saludable, la tasa de supervivencia de las plantas de algodón transgénicas en maceta obtenidas por los procedimientos de la presente invención es casi del 100%. Con los protocolos informados de hipocótilo y cotiledón (Umbeck et al., 1987; Firoozabady et al., 1987), el desarrollo pobre de la raíz se ha considerado la principal razón que explica la mala tasa de supervivencia de las plantas de algodón transgénicas en maceta.

Los siguientes son medios de cultivo de plantas preferidos usados en los Ejemplos:

(1): Medio de crecimiento de plántulas (por litro):

\quad: 1/2 mezcla de sales basales MS (Sigma M5524)

\quad: 0,9 g de MgCl_{2}-6H_{2}O

\quad: 2,0 g de goma de gelano (Phytagel^{TM}, Sigma)

\quad: pH 7,0

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(2): Medio de precultivo de pecíolo (por litro):

\quad: mezcla de sales basales MS

\quad: 0,9 g de MgCl_{2}-6H_{2}O

\quad: 2,0 g de goma de gelano (Phytagel^{TM}, Sigma)

\quad: pH 7,0

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(3): Medio de co-cultivo (por litro):

\quad: mezcla de sales basales MS

\quad: 10 mg de Tiamina-HCl

\quad: 1 mg de Piridoxina-HCl

\quad: 1 mg de Ácido nicotínico

\quad: 100 mg de Mio-inositol

\quad: 0,05 mg de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

\quad: 0,1 mg de quinetina

\quad: 30 g de glucosa

\quad: 0,9 g de MgCl_{2}-6H_{2}O

\quad: 2,0 g de goma de gelano (Phytagel^{TM}, Sigma)

\quad: pH 6,5

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(4): MMS1 - medio de inducción y selección del callo (por litro):

\quad: Medio de co-cultivo

\quad: 50 mg de kanamicina

\quad: 500 mg de cefotaxime

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(5): MMS2 - medio de diferenciación (por litro):

\quad: mezcla de sales basales MS

\quad: 10 mg de Tiamina-HCl

\quad: 1 mg de Piridoxina-HCl

\quad: 1 mg de Ácido nicotínico

\quad: 100 mg de Mio-inositol

\quad: 1,9 g de KNO_{3}

\quad: 30 g de Glucosa

\quad: 0,9 g de MgCl_{2}-6H_{2}O

\quad: 2,0 g goma de gelano (Phytagel^{TM}, Sigma)

\quad: pH 6,5

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(6): MMS3 - medio de germinación del embrioide (por litro):

\quad: 3,8 g de KNO_{3}

\quad: 440 mg de CaCl_{2}-H_{2}O

\quad: 375 mg de MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O

\quad: 170 mg de KH_{2}PO_{4}

\quad: 1 g de Glutamina

\quad: 500 mg de asparagina

\quad: 43 mg de EDTA sal férrica-Na

\quad: Micronutrientes MS (Murashige y Skoog, 1962)

\quad: 10 mg de Tiamina-HCl

\quad: 1 mg de Piridoxina-HCl

\quad: 1 mg de Ácido nicotínico

\quad: 100 mg de Mio-inositol

\quad: 30 g de Glucosa

\quad: 0,9 g de MgCl_{2}-6H_{2}O

\quad: 2,0 g de goma de gelano (Phytagel^{TM}, Sigma)

\quad: pH 6,5

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(7): Medio de crecimiento de plantas jóvenes

\quad: Macro y Microelementos del medio S&H (Strewart y Hsu, 1977)

\quad: 10 mg de Tiamina-HCl

\quad: 1 mg Piridoxina-HCl

\quad: 1 mg Ácido nicotínico

\quad: 100 mg de Mio-inositol

\quad: 10 g de Glucosa

\quad: 10 g de Sacarosa

\quad: 0,9 g de MgCl_{2}-6H_{2}O

\quad: 2,0 g goma de gelano (Phytagel^{TM}, Sigma)

\quad: pH 7,0

Los siguientes Ejemplos están destinados a ilustrar la presente invención, y de ningún modo limitan su alcance, que es definido únicamente por las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Cepa y plásmidos de Agrobacterium

Se usó la cepa de A. tumefaciens LBA 4404 (pBI121GFP) para la transformación del pecíolo y tallo joven de algodón. El mapa físico de pBI121GFP se muestra en la Fig. 1, que contiene GFP como gen indicador y el gen NPTII (que codifica la neomicina fosfotransferasa) como marcador seleccionable. Los genes de GFP y NPTTT están bajo el control del promotor de CaMV 35S y el promotor nos, respectivamente. Para la construcción de pBI121GFP, se clonó un fragmento de XbaI-SstI de 720 pb del gen de GFP del plásmido pGFP2 (del Dr. N. H. Chua, Rockefeller University, New York) en los mismos sitios del vector del plásmido pBI121 (Clontech) para reemplazar el gen de GUS. El plásmido pBI121GFP se introdujo en A. tumefaciens LBA 4404 por electroporación.

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Ejemplo 2 Material de planta

Se usaron en los experimentos las variedades de algodón de altiplanicie Coker 312 de Estados Unidos y Si-Mian 3 del Shanxi Cotton Research Institute de China.

Se recolectaron pecíolos tiernos de plantas de 8-12 semanas cultivadas en invernadero en condiciones de baja iluminación. Los pecíolos se esterilizaron superficialmente con etanol al 70% durante unos pocos segundos, seguido de solución blanqueadora al 20% (Clorox Co. USA, 1% de cloro disponible) durante 20 min. Después de lavar cinco veces en agua esterilizada, los pecíolos se pre-cultivaron en medio MS durante 3 días.

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Ejemplo 3 Transformación de plantas

Se inoculó una sola colonia de la cepa LBA 4404 (pBI121GFP) de A. tumefaciens en medio líquido LB con 50 mg/L de rifampicina, 50 mg/L de kanamicina y 100 mg/L de estreptomicina. Las bacterias se cultivaron toda la noche a 28ºC en un agitador de 200 rpm. Los cultivos de bacterias se diluyeron usando medio MS líquido MS hasta una D0600 = 0,3.

Se cortaron el pecíolo y el tallo joven en segmentos de aproximadamente 2 cm de largo. Los segmentos se sumergieron en una suspensión de bacterias diluida durante 5 min, luego se transfirieron a placas de plástico (100 x 25 mm) que contenían un papel de filtro impregnado en 50 ml de medio. Las placas se mantuvieron en un incubador de 24ºC en condiciones de luz continua durante 48 horas. Los explantes co-cultivados se transfirieron a medio MMS1 y se incubaron a 28ºC con 16 horas de luz (60-90 \muEm-2s^{-1}) y 8 horas de oscuridad por día. Después de 2-4 semanas se iniciaron los callos en los extremos cortados de los segmentos de pecíolo. Después de 4-6 semanas habían aparecido los callos resistentes a kanamicina, y se contaron los números de callos y se examinó la expresión del gen de GFP.

Bajo el microscopio de fluorescencia, el callo control no transformado apareció de color rojo, mientras que el callo transformado que expresa el gen GFP presentó fluorescencia verde diferente. Se examinó un total de 113 callos transformados putativos para determinar la actividad de GFP, la frecuencia de transformación del gen GFP fue del 39,8% (Tabla 1).

Cuando se usaron pecíolos de la variedad de algodón Si-Mian 3 para la transformación, se hallaron 11 callos positivos para GFP de los 26 callos examinados, la eficiencia de transformación fue del 42,3%.

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TABLA 1 Frecuencias de transformación de los pecíolos de algodón Coker 312 y Si-Main 3

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Ejemplo 4 Inducción de embriogénesis somática y regeneración de la planta

Se seleccionaron los callos con crecimiento vigoroso y fuerte expresión de GFP y se transfirieron al medio MMS2 líquido para el cultivo en suspensión durante 2 semanas. Se seleccionaron callos granulares de color crema friables y se transfirieron al medio diferencial semisólido, MMS2. Después de aproximadamente 2 meses se produjo una gran cantidad de embrioides. Se desarrollaron gradualmente estructuras densas citoplasmáticas y se produjeron embriones grandes en el medio dentro de los siguientes 1-2 meses. Un lapso corto de tratamiento del cultivo en suspensión fue muy importante, no sólo para las altas frecuencias de inducción de embriogénesis, sino también para la producción de embrioides de alta calidad. La expresión del gen de CFP se examinó nuevamente y todos eran positivos para GFP.

Los embrioides y los callos embriogénicos con fuerte actividad de GFP se transfirieron al medio MMS3. Después de 1-2 meses las plántulas que eran de aproximadamente 1-2 cm de altura con 1-2 hojas verdaderas y buen desarrollo de raíz se transfirieron al Medio de Crecimiento de Plantas Jóvenes durante aproximadamente un mes. Aproximadamente un mes después, las plantas jóvenes con 6-8 hojas y aproximadamente 10-15 cm de altura se plantaron en el suelo y se mudaron al invernadero. Las 30 plantas transgénicas en maceta sobrevivieron y se halló que expresan la proteína de GFP. El tiempo total necesario para obtener plántulas transgénicas usado fue menor que 7 meses, y se leyeron las plántulas para plantar en el invernadero en aproximadamente 2 meses adicionales (véase Tabla 2).

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TABLA 2 El marco de tiempo desde la transformación de los segmentos de pecíolo hasta la regeneración de la planta (Coker 312)

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Ejemplo 5 Detección de la actividad de la Proteína GFP

La expresión de la actividad de la proteína GFP se detectó usando un estereomicroscopio de fluorescencia Leica MZ FLIIT con un filtro de excitación de 480/40 nM y un filtro de barrera de 510 nM.

La fluorescencia verde del gen GFP se puede distinguir fácilmente en los callos, embrioides y plántulas jóvenes transformadas, el control no transformado apareció de color rojo bajo el estereomicroscopio de fluorescencia. Las excepciones fueron las raíces no transformadas, que aparecieron de color verde oscuro bajo el microscopio de fluorescencia, probablemente debido a algunos productos químicos cromóforos acumulados en las raíces. Pero las raíces con actividad de GFP aun se pudieron identificar porque la fluorescencia verde producida por la proteína GFP era más brillante y pareció más uniforme. Bajo la luz azul producida por el estereomicroscopio de fluorescencia, la fluorescencia roja es claramente visible en los tejidos vegetales verdes no transformados que están enriquecidos con clorofila tal como hoja y tallo. En los tejidos de planta verde positivos a GFP, también se detectó fluorescencia amarilla debido a la superposición de fluorescencia roja y verde. Sin embargo, la expresión del gen de GFP en pétalo y antera fue más pobre en comparación con las otras partes de las plantas.

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Ejemplo 6 Análisis de Plantas Transgénicas

El ADN genómico de las líneas transformadas putativamente y de las plantas control no transformadas se purificó de acuerdo con Paterson et al. (1993). Después de la digestión con EcoRI, que corta inj-entre el límite izquierdo de ADN-T y el terminador Nos-3' del gen GFP quimérico (Fig. 1), se separó el ADN en un gel de agarosa con 0,8% de TAE y se transfirió a una membrana Hybond-N de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se fijó a la membrana por ligamiento cruzado UV antes de hibridar a la región codificadora marcada con DIG del gen de GFP. La sonda hibridada se detectó con el conjugado anti-DIG-AP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BOEHRINGER MANNHEIM).

Las muestras de ADN genómico de 11 líneas transgénicas seleccionadas aleatoriamente y 1 planta control no transformada se analizaron por hibridación Southern, usando la región codificadora del gen de GFP como sonda de hibridación. Los datos indican que 7 de 11 líneas tienen una copia única, 3 líneas tienen 2 copias y 1 línea tiene 6 copias de la inserción de ADN-T. El alto porcentaje de líneas transgénicas con una sola copia de la inserción de ADN-T sugiere que este protocolo de transformación tiene menos riesgo de silenciamiento génico y de mutantes por inserción indeseables.

Referencias citadas

Altman, D. W. et al. 1990. Economic Botany 40, 106.

Bajaj, Y. P. S. 1985. Theor. Appl. Genet. 70, 363.

Beasley, C. A. 1971. In vitro culture of fertilized cotton ovules. Biosci. 21, 906-7.

Chen Z.X., Liewellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J., Guo S.D., Jiao G.L., and Zhao J.X. 1994. 2,4-D Resistant Transgenic.

Cotton Plants Produced by Agrobacterium-mediated gene Transfer. Scientia Agriculture Sinica 27(2): 3 1-37.

Chen, 2. X., Li, S. J., Yue, J. X., Jiao, G. L. and Liu S. X. 1989. Plantlet regeneration from protoplasts isolated from an embryogenic suspension culture of cotton (Gossypium hirsutum L.). Acta Botanica Sinica 31, 966-9.

Chen, Z. X., Trolinder, N.L. et al., 1987. Some characteristics of somatic embryogenesis and plant regeneration in cotton cell suspension culture. Scientia Agriculture Sinica 20, 6-11.

Chlan, C. A., Lin, J., Cary, J. W. and Cleveland, T. E. 1995. A procedure for biolistic transformation and regeneration of transgenic cotton from meristematic tissue. Plant Mol. Biol. Rep. 13, 31-7.

Cousins Y.L., Lyon B.R., and Llewellyn D.J. 1991. Transformation of Australian cotton cultivar: prospects for cotton improvement through genetic engineering Aust. J. plant physiol., 18, 481-494.

Davidonis, G. H., and Hamilton, R. H. 1983. Plant regeneration from callus tissue of Gossypium hirsutum L. Plant Sci. Lett. 32, 89-93.

Davidonis, G. H., Mumma, R. O. and Hamilton, R. H. 1987. Controlled regeneration of cotton plants from tissue culture. US Patent No. 4,672,035.

de Framond et al. 1983. Mini-Ti: a new vector strategy for plant genetic engineering. Bio/technology 1, 262-9.

Finer, J. J. and McMullen, M. D. 1990. Transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) via particle bombardment. Plant Cell Reports 8, 586-9.

Finer, J.J., and Smith R.H. 1984. Initiation of callus and somatic embryos from explantes of mature cotton (Gossypium klotzschianum Anderss). Plant Cell Reports 3, 41-43.

Finer, J., 1988. Plant regeneration from somatic embryogenic suspension cultures of cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Rep. 7, 399-402.

Firoozababy E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halls E.J., Anderson I., N., Raska K.A., Murray E.E. 1987. Transformationof cotton, Gossypium hirsutum L. by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of plantas transgénicas. Plant Molecular Biology 10, 105 1 16.

Gawel N.J., Rao A.P., and Robacker C. 1986. Somatic embryogenesis from leaf and petiole callus cultures of Gossypium hirsutum L. Plant Cell Reports 5, 457-459.

Gawel, N. J. and Robacker, C. 1990. Genetic control of somatic embryogenesis in cotton petiole callus cultures. Euphytica 49, 249-53.

Gould, J., Banister, S., Hasegawa, O., Fahima, M. and Smith, R. H. 1991. Regeneration of Gossypium hirsutumand G. barbadense from shoot apex tissues for transformation. Plant Cell Reports 10, 12-6.

Hoekema et al. 1983. A binary plant vector strategy based on separation of Vir-and T-Region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plásmido. Nature 303, 179-80.

John, M. E. 1996. Structural characterization of genes corresponding to cotton fiber mRNA, E6: reduced E6 proteinin plantas transgénicas by antisense gene. Plant Mol. Biol. 30, 297-306.

John, M. E. and Keller, G. 1996. Metabolic pathway engineering in cotton: Biosynthesis of polyhydroxybutyrate infiber cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12768-73.

Keller G., Spatola L., McCabe D., Martinell B., Swain W.X. and John M.E. 1997. Transgenic cotton resistant to herbicide bialaphos. Transgenic Research 6, 385-392.

Kuo, C. C. et al., 1989. Proc. Beltwide Cotton Prod. Res. Confs, 638.

McCabe, D. E. and Martinell, B. J. 1993. Transformation of elite cotton cultivars via particle bombardment of meristems. Bio/technol. 11, 596-8.

Murashige T., and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15, 473-493.

Paterson, A.H., Brubaker, C.L., and Wendel J.F., 1993. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) Genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Mol. Biol. Rptr. 11, 122-127.

Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fuchs R.L., Sims S.R., Greenplate J.T., and Fischhoff D.A. 1990. Insectresistant cotton plants. Bio/Technology 8, 939-943.

Price, H. J. and Smith, R. H. 1979. Somatic embryogenesis in suspension cultures of Gossypium klotzschianumAnderss. Planta 145, 305-6.

Rangan, F. J. and Zavala, T. Ip. A. 1984. Somatic embryogenesis in tissue culture of Gossypium hirsutum L.). InVitro 20, 256.

Rangan, R. and Rajasekaran, K. 1996. Regeneration of cotton plant in cell suspension culture. US Patent
No.5,583,036 (continued from US Patent 5,244,802, 1993 and 122, 200, 1987).

Rajasckaran K., Grula J.W., Hudspeth R.L., Pofelis S., Anderson D.M. 1996. Herbicideresistant Acala and Cokercotton transformed with the native gene encoding mutant forms of acetohydroxyacid synthase, Mol. Breeding, 2:307-319.

Schilperoort, R.A., Hoekema, A., Hooykaas, P.J.J. 1990. Process for the incorporation of foreign DNA into thegenome of dicotyledmous plants. United States Patent No. 4,940,838.

Schilperoort, R.A., Hoekema, A., 1995. Process for the incorporation of foreign UNA into the genome of dicotyledmousplants. United States Patent No. 5,464,763.

Steward J. McD. 1991. Biotechnology of Cotton: Achievements and Perspectives. CAB International.

Stewart J. McD., and Hsu C.L. 1977. In ovule embryo culture and seedling development of cotton (Gossypium hirsutum L.). Planta 137, 113-117.

Stewart, J. McD. and Hsu, C. L. 1978. Hybridization of deploid and tetraploid cottons through in-ovulo embryo culture. J. Heridity 69, 404-8.

Trolinder, N. L. 1985a. Somatic embryogenesis and plant regeneration in cotton (Gossypium hirsutum L.). A Dissertationin Biology (Dec., 1985).

Trolinder, N. L., Chen, Z.X., 1989. Genotype specificity of the somatic embryogenesis response in cotton. Plant CellReports 8, 133-6.

Trolinder, N. L. and Goodin, J. E. 1987. Somatic embryogenesis and plant regeneration in cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Reports 6, 231-4.

Trolinder, N. L. and Goodin, J. E. 1988a. Somatic embryogenesis and regeneration in cotton. I. Effects of sourceof explant and hormone regime. Plant Cell Tissue Organ Culture 12, 31-42.

Trolinder, N. I. and Goodin, J. E. 1988b. Somatic embryogenesis and regeneration in cotton. IT. Requirements forembryo development and plant regeneration. Plant Cell Tissue Organ Culture 12, 43-53.

Trolinder N.L., Quisenberry J., Bayley C., Ray C., and Ow D. 1991. 2,4-D-resistant transgenic cotton. Proceedings, Beltwide Cotton Conferences. National Colon Council, Memphis, Tennessee, P840.

Turaev, A. M. and Shamina, Z. B. 1986. Soniet Plant Physiol. 33, 439.

Umbeck P. 1992. Genetic engineering of cotton plants and lines. United States Patent: 5,159,135.

Umbeck, P. F, Johnson, G., Barton, K. and Swain, W. 1987. Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutum L.) plants. Bio/technol. 5, 263-6.

Umbeck P., Johnson P., Barton K., and Swain W. 1987. Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutum L.) plants. Bio/Technology 5, 263-266.

Walkerpeach, C.R. and Veltern, J. 1994. Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: cointegrate and binaryvector systems. Plant Mol. Biol. Mannuel B1, 1-19.

Wendt-Gallitelli M.F., and Dobrigkeit I. 1973. Investigations implying the invalidity of octopine as a marker for transformationby Agrobacterium tumefaciens. Zeitschrift fur Naturforschung - Section C-Biosciences 28, 768-771.

Zhang, H.-B. 1994. The tissue culture of cotton (II). Plant Physiol. Commun. 30, 386-91.

Zhang, H.-B. and Feng, R. 1992. The tissue culture of cotton (I). Plant Physiol. Commun. 30, 386-91.

Zhou, G.-Y., Weng, J., Zeng, Y.-S., Huang, J.-G., Qian, S.-Y. and Liu, G.-L. 1983. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Methods in Enzymology 101,433-81.

Claims

1. Un procedimiento para producir una planta de algodón transgénica que comprende las etapas de:

(a) obtener explantes de pecíolo de algodón,

(b) exponer los explantes de pecíolo a un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que alberga un vector que comprende un gen exógeno y un gen marcador seleccionable, siendo el Agrobacterium capaz de efectuar la transferencia estable del gen exógeno y el gen marcador seleccionable al genoma de las células del explante de pecíolo,

(c) cultivar los explantes de pecíolo en un medio que contiene ácido 2,4-diclorofenoxiacético a una concentración que varía de más de 0 a 0,5 mg/l y quinetina a una concentración que varía de más de 0 a 1 mg/l para inducir la formación de callos,

(d) seleccionar el callo transformado que expresa el gen exógeno,

(e) cultivar el callo seleccionado en cultivo de suspensión en medio de diferenciación que no contiene hormona vegetal durante menos de 20 días para inducir la formación de embrioides,

(f) germinar los embrioides en un medio que tiene una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en asparagina, glutamina o tanto asparagina como glutamina y que no contiene hormona vegetal, para producir plantas de algodón transgénicas jóvenes, y

(g) cultivar las plantas de algodón transgénicas jóvenes en un medio que tiene 10 g/l de glucosa y 10 g/l sacarosa como fuente de carbono y que no contiene hormona vegetal, para producir plantas de algodón transgénicas,

en el que los medios de cultivo usados en las etapas (b)-(f) tienen glucosa como única fuente de carbono y en el que la etapa (e) se realiza a un pH entre 5,8 y 7,5.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los explantes de pecíolo se pre-cultivan durante un período de tiempo anterior a la exposición al cultivo de Agrobacterium tumefaciens.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucosa del medio de cultivo usado en las etapas (b)-(f) está en una cantidad de aproximadamente 10 g/l a aproximadamente 50 g/l.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la glucosa está en una cantidad de aproximadamente 30 g/l.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fuente de nitrógeno de la etapa (f) está en una cantidad de aproximadamente 700 mg/l a aproximadamente 5 g/l.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la fuente de nitrógeno está en una cantidad de aproximadamente 3,8 g/l.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la fuente de nitrógeno es asparagina y glutamina, y la asparagina está en una cantidad de aproximadamente 200 mg/l a aproximadamente 1 g/l y la glutamina está en una cantidad de aproximadamente 500 mg/l a aproximadamente 2 g/l.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la asparagina está en una cantidad de aproximadamente 500 mg/l y la glutamina está en una cantidad de aproximadamente 1 g/l.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el cultivo en suspensión de la etapa (e) tiene una duración de aproximadamente 10 días a menos de 20 días.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el cultivo en suspensión de la etapa (e) tiene una duración de aproximadamente 14 días.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ácido 2,4-diclorofenoxiacético está en una concentración de aproximadamente 0,05 mg/l y la quinetina está en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/l.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (e) se realiza a un pH entre 6,2 y 7,0.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la etapa (e) se realiza a un pH de 6,5.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la etapa (e) se realiza a un pH entre 6,5 y 7,0.