CN112725376A - 一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法 - Google Patents
一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，该方法包含：(1)农杆菌侵染液的制备：采用携带pHZM27质粒的根癌土壤农杆菌EHA105菌株；(2)根癌农杆菌介导的荞麦浸花转化：先将已经开放或受精的花朵移走，将荞麦的花序浸泡在农杆菌侵染液中，浸泡后的花序用纸袋包裹以保持湿度，置于室温暗培养；(3)对转化后荞麦筛选：在荞麦花序全部浸染后第3～5天对植物进行授粉，待种子成熟，收取转化种子；将转化种子播种，待萌发后进行Basta抗性筛选；对抗性植株进行PCR鉴定和荧光显微镜观察。本发明的转化方法将基因转化到荞麦中，不需要进行组织培养，为荞麦的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效遗传转化方法，具体涉及一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法。
背景技术
通过基因工程技术改变植物的遗传性状是成熟的技术手段。在植物基因工程中，科研人员多采用叶片、叶柄、叶芽等为侵染对象，建立遗传转化体系，应用于植物上的基因导入法主要有农杆菌介导法、基因枪法和电击法。
荞麦是传统的杂粮作物，具有生长期短、抗逆性强、适应性广泛等的特点，更重要的是荞麦属蓼科植物，是一种药食同用的作物，其种子中含有大量膳食纤维和微量元素，以及丰富的生物类黄酮、多酚活性物质，不仅参与人体脂代谢，还具有保护视力、降血脂、降血压以及减脂等保健功能。因此，基于荞麦重要的食用和药用价值，目前已成为国内外研究的热点，开发有效的遗传转化体系将促进其基因功能的研究。
然而，在荞麦中，基于植物细胞的全能性原理，中国专利CN 109349108 A采用组培苗的子叶和下胚轴切段作为外植体进行转化，中国专利CN 102352378 A选取叶龄2～30d、生长状况良好的苦荞麦无菌苗叶片作为外植体进行培养基预培养后进行农杆菌菌液侵染培养。但这些方法均存在费时、工作量大或转化效率低等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，不需要进行组织培养，消除了组织培养中发生不必要的微生物污染、体细胞突变或体细胞无性系变异的风险，为荞麦的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。
为了达到上述目的，本发明提供了一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，该方法包含：
(1)农杆菌侵染液的制备：
将活化的携带pHZM27质粒的根癌土壤农杆菌EHA105菌株接种到LB液体培养基中，该LB液体培养基中含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平，28℃过夜摇菌，接种至新的LB液体培养基中，重复过夜摇菌，直至菌液OD600为0.6～0.8；
将所述菌液离心，弃去上清液，剩下的加入至侵染液中，重悬细菌，以获得农杆菌侵染液；其中，所述侵染液包含：20×MS major salts stock、100×MS minor salt stock、Sucrose、BAP、乙酰丁香酮、Silwet L-77和水；所述20×MS major salts stock包含：KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和水；所述100×MS minor salt stock包含：硼酸、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MO4·2H2O、CoCl2·6H2O和水；
(2)根癌农杆菌介导的荞麦浸花转化：
在进行转化之前，先将已经开放或受精的花朵移走，然后将荞麦的花序浸泡在农杆菌侵染液中，浸泡后的花序进行标记，并用纸袋包裹以保持湿度，置于室温暗培养；
待暗培养24h后，去掉纸袋于室外环境下培养，每隔2天重复农杆菌侵染液浸泡程序3次；
待转化后，荞麦会继续发育出新的花序和花，进行第二轮转化，或者及时去除这些未转化的花序；
(3)对转化后荞麦筛选
在荞麦花序全部浸染后的第3～5天对植物进行授粉，待种子成熟，收取T0转化种子；
将收取的T0转化种子浸种，播种于营养土中，待萌发4～5天后，喷洒Basta溶液进行筛选，将Basta溶液喷洒到萌发幼苗的子叶上，转化苗对Basta表现出抗性，转化后的幼苗能够存活；
对抗性植株进行PCR鉴定和荧光显微镜观察：提取Basta抗性植株叶片基因组DNA，采用的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，以pHZM27质粒DNA为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照，进行PCR扩增，扩增出609bp的PCR条带，且利用荧光显微镜观察到转化植物表皮细胞中产生荧光基点。
优选地，所述荞麦的品种为‘北早生’，在开花期对健康强壮的植株进行转化。
优选地，所述侵染液包含：25mL 20×MS major salts stock、5mL 100×MS minorsalt stock、30g Sucrose、10μL BAP、100μL乙酰丁香酮和1mLSilwet L-77，用水定容至1L。
优选地，所述BAP的配制，为：将200mg 6-苄氨基腺嘌呤溶解于10mL1M/LNaOH中，加入90mL无菌水。
优选地，所述乙酰丁香酮为，浓度为40mg/mL的乙酰丁香酮的二甲基亚砜溶液。
优选地，所述20×MS major salts stock中，KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和水的用量比为38.0g：33.0g：3.4g：7.4g：6.64g：1L；所述100×MS minor saltstock中，硼酸、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MO4·2H2O、CoCl2·6H2O和水的质量比为310mg：845mg：430mg：12.5mg：1.25mg：500mL。
本发明的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，具有以下优点：
本发明的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，相对简单地将基因转化到荞麦中，不需要进行组织培养，消除了组织培养中发生不必要的微生物污染、体细胞突变或体细胞无性系变异的风险，为荞麦的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。
本发明的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，在开放花朵较少的植株中，转化频率更高，通过花序侵染后，通过Basta抗性筛选出阳性植株，并同构PCR检测和荧光显微镜观察，确定了阳性植株为转基因成功的株系。
附图说明
图1为含有Basta基因和GFP可选择标记的二元载体pHZM27的示意图。
图2为本发明荞麦浸花转化的示意图。
图3为本发明荞麦Basta抗性转化子的选择。
图4为本发明转化植株的PCR鉴定。
图5为本发明转化植株的GFP观察。
注：图2中，A：荞麦转化的最佳阶段；B：荞麦的花序浸在农杆菌接种液中；C：用纸袋覆盖感染的花序；图3中，A：禾苗喷Basta前；B：幼苗喷一次Basta；C：幼苗喷两次Basta；D：幼苗喷三次Basta；E：幼苗喷四次Basta；图4中，M：DL2000标记；第1泳道：阳性对照；泳道2-10：转基因荞麦；第11泳道：阴性对照；箭头指示609bp的目标波段；图5中，A：明亮的光线；B：GFP荧光；C：合并荧光。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1荞麦材料的获取
(1)种植荞麦材料，以荞麦品种“北早生”为转化受体植株，将其种子种植在塑料花盆中，在自然条件下生长。在开花期对健康强壮的植株进行转化。
(2)选取和处理荞麦材料：挑选正在开花的植株，初始开花3-5天，选取高度合适的植株，确保植株在花序不被损坏的情况下能够完成侵染。挑选好的植株在侵染前用毛刷刷掉荞麦花序表面的颗粒状疏水物质，并剪掉荞麦花序附近的叶片。
注意：(1)植物高度如果过高将无法将整个植株放入盛有侵染液的器皿中；(2)荞麦花序表面有大量的颗粒状疏水物质，如果去除不干净会导致农杆菌浸染液不能有效侵入荞麦花苞中。
实验例2制备农杆菌侵染液
根癌农杆菌菌株选取EHA105(购买自Transgen公司)，质粒选取pHZM27(含有绿色荧光蛋白报告基因(GFP)、Basta抗性基因和卡那霉素抗性基因(nptII)，由中国科学院生物遗传发育研究所胡赞民实验室提供)。具体步骤如下：
(1)取出-80℃保存的已经导入质粒pHZM27的根癌农杆菌，在LB平板上活化24-48小时。
(2)挑取菌斑接种到2mL的LB液体培养基中(卡那霉素50mg/L，利福平20mg/L)28℃过夜摇菌，取100μL菌液接种到100mL LB培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平20mg/L)28℃过夜摇菌，直至菌液OD600＝0.6-0.8。
(3)制备含有如下表1所示成分的侵染液：侵染荞麦花序时侵染液中加入1mL/L表面活性剂(如Silwet L-77)。
上述LB培养基：每升培养基加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g，摇动直到溶质溶解，用5mol/LNaOH(约0.2mL)调至pH 7.0，用双蒸水定容至1L，对于固体培养基再加入15g琼脂粉，在121℃高压灭菌消毒20min。
上述50mg/mL卡那霉素的配制，为：1g卡那霉素溶于20mL双蒸水，超净工作台过滤灭菌。上述50mg/mL利福平的配制，为：1g利福平溶于20mL双蒸水，超净工作台过滤灭菌。
表1为侵染液的配比
注：2mg/mLBAP的配制，为：将200mg 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)溶解于10mL 1M/LNaOH中，加入90mL无菌水，储存温度为-20℃；AS为乙酰丁香酮，40mg/mL乙酰丁香酮的配制，为：将0.8g乙酰丁香酮溶解于20mLDMSO(二甲基亚砜)中并过滤消毒，储存温度为-20℃；
表2为营养液的配比
(4)农杆菌侵染液的制备
将摇好的菌液4000rpm/min离心10min，弃上清，并加入配制好的侵染液，重悬细菌。在去上清后的沉淀中加少量侵染液，用枪头吹打混匀后加入与LB等体积的侵染液。
实验例3浸花法转化
(1)将植株的花序浸入农杆菌侵染液中，保持4min。为确定浸花法转化的最适宜发育阶段，对荞麦不同生长期的花序进行了转化，结果表明，在开放花朵较少的植株中，转化频率更高(图2的A)。由于感染会导致部分花朵败育，为了获得足够的转化种子，共感染35株，收获约300粒T0种子。
(2)暗培养：将被侵染过的荞麦花苞取出，用硫酸纸袋套住侵染过的花序，置于25℃左右暗培养24h后去掉纸袋于室外环境下培养，后续每隔2天重复浸花渍程序3次。转化后，荞麦可能会继续发育出新的花序和花，可以进行第二轮转化，或者及时去除这些未转化的花序，在花序全部浸染后的第3-5天也可对植物进行授粉。
(3)筛选：待种子成熟，收取种子，阳光下暴晒3-5天或放置于烘箱内50℃烘干2天。为了检验转化效率，随机选取96粒T0种子筛选Basta抗性植株，播种之前先浸种，浸种能够确保萌发一致，采用0.1％升汞消毒1次，70％酒精消毒两次，而后蒸馏水涮洗两次，前述这些操作时间为3～5min，然后将消毒完备的种子放置在铺上2层滤纸的10cm培养皿上，添加适量的蒸馏水使其萌发，而后挑选萌发一致的种子。播于营养土中，播撒后萌发的种子只有44粒(图3的A)，发芽率为45.83％，待萌发4-5天过后，喷洒Basta筛选剂进行筛选。经过筛选测试Basta对于荞麦的致死筛选浓度为50mg/L，将Basta喷洒到萌发幼苗的子叶上。喷1次后，转化苗很少出现慢萎蔫表型(图3的B)，未转化植株喷2次和3次后萎蔫表型更加严重(图3的C-D)。经4次喷施后，9个移栽植株对Basta表现出较高的抗性，处理后这些植株的子叶可见明显的绿色扩张(图3的E)。与转化苗不同，对照植株在喷施3次后出现完全坏死(图3的D)。
(4)鉴定：经筛选存活下来的荞麦幼苗，取叶片进行PCR鉴定和利用荧光显微镜观察转化植物表皮细胞中产生GFP基因的荧光基点。采用CTAB法提取Basta抗性植株叶片基因组DNA，以正向引物：5'-GACGTAAACGGCCACAAGTT-3'(SEQ ID NO.1)和反向引物：5'-GAACTCCAGCAGGACCATGT-3'(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，分别为2×PCR反应混合液(购自Takara,Japan)12.5μL，0.5μM的正向引物，0.5μM反向引物，模板DNA10ng。以pHZM27质粒DNA为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照。PCR扩增在美国Bia-RadPCR仪中进行，程序如下：95℃，5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min；35个循环；用1％琼脂糖凝胶对PCR产物在凝胶成像仪下紫外分析可见，扩增出609bp的PCR条带。利用荧光显微镜观察转化植物表皮细胞中产生GFP基因的荧光基点。
经PCR检测和荧光显微镜观察，在9株幸存苗中检测到GFP基因和大约609个荧光基点(图4)，指示向量已成功集成，这进一步证实了光强绿色荧光的观察到这些改变了植物的叶细胞(图5)。
(5)移栽：经分子鉴定为阳性植株的材料移栽到植物培养室中，准备收种检测下一代转基因是否可以遗传。
本发明的农杆菌侵染荞麦花序可以获得稳定的荞麦转基因植株，用该方法繁殖的每100粒T1种子可产生20-21株转基因阳性植株，转换效率约为20.45％(不考虑霉变的发芽种子)。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 长江大学
<120> 一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gacgtaaacg gccacaagtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaactccagc aggaccatgt 20
Claims (6)
1.一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，该方法包含：
(1)农杆菌侵染液的制备：
将活化的携带pHZM27质粒的根癌土壤农杆菌EHA105菌株接种到LB液体培养基中，该LB液体培养基中含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平，28℃过夜摇菌，接种至新的LB液体培养基中，重复过夜摇菌，直至菌液OD600为0.6～0.8；
将所述菌液离心，弃去上清液，剩下的加入至侵染液中，重悬细菌，以获得农杆菌侵染液；其中，所述侵染液包含：20×MS major salts stock、100×MS minor salt stock、Sucrose、BAP、乙酰丁香酮、Silwet L-77和水；所述20×MS major salts stock包含：KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和水；所述100×MS minor salt stock包含：硼酸、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MO4·2H2O、CoCl2·6H2O和水；
(2)根癌农杆菌介导的荞麦浸花转化：
在进行转化之前，先将已经开放或受精的花朵移走，然后将荞麦的花序浸泡在农杆菌侵染液中，浸泡后的花序进行标记，并用纸袋包裹以保持湿度，置于室温暗培养；
待暗培养24h后，去掉纸袋于室外环境下培养，每隔2天重复农杆菌侵染液浸泡程序3次；
待转化后，荞麦会继续发育出新的花序和花，进行第二轮转化，或者及时去除这些未转化的花序；
(3)对转化后荞麦筛选
在荞麦花序全部浸染后的第3～5天对植物进行授粉，待种子成熟，收取T0转化种子；
将收取的T0转化种子浸种，播种于营养土中，待萌发4～5天后，喷洒Basta溶液进行筛选，将Basta溶液喷洒到萌发幼苗的子叶上，转化苗对Basta表现出抗性，转化后的幼苗能够存活；
对抗性植株进行PCR鉴定和荧光显微镜观察：提取Basta抗性植株叶片基因组DNA，采用的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，以pHZM27质粒DNA为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照，进行PCR扩增，扩增出609bp的PCR条带，且利用荧光显微镜观察到转化植物表皮细胞中产生荧光基点。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述荞麦的品种为‘北早生’，在开花期对健康强壮的植株进行转化。
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述侵染液包含：25mL 20×MS major salts stock、5mL 100×MS minorsalt stock、30g Sucrose、10μL BAP、100μL乙酰丁香酮和1mLSilwet L-77，用水定容至1L。
4.根据权利要求3所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述BAP的配制，为：将200mg 6-苄氨基腺嘌呤溶解于10mL 1M/LNaOH中，加入90mL无菌水。
5.根据权利要求3所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述乙酰丁香酮为，浓度为40mg/mL的乙酰丁香酮的二甲基亚砜溶液。
6.根据权利要求3所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述20×MS major salts stock中，KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和水的用量比为38.0g：33.0g：3.4g：7.4g：6.64g：1L；所述100×MS minor salt stock中，硼酸、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MO4·2H2O、CoCl2·6H2O和水的质量比为310mg：845mg：430mg：12.5mg：1.25mg：500mL。
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