CN108642066B - 一种来源于野生大豆的蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐性中的应用 - Google Patents

一种来源于野生大豆的蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于野生大豆的蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐性中的应用。本发明保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入GsMYB15基因，得到耐盐性高于所述出发植物的转基因植物。本发明还保护一种培育耐盐植物的方法，包括如下步骤：增加植物中GsMYB15蛋白的水平和/或活性，从而提高植物的耐盐性。将GsMYB15基因导入植物并表达后，植物的耐盐性显著增加，本发明对于培育耐盐转基因植物具有重大应用推广价值。

Description

一种来源于野生大豆的蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐 性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于野生大豆的蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐性中的应用。
背景技术
大豆是世界性的重要食用油和优质植物蛋白质来源。栽培大豆在整个生长发育过程中要不断的面对各种环境不利因素的影响，其中土壤盐碱化是对其生长影响比较大的一个非生物胁迫。世界上有相当一部分的地区存在土壤盐碱化，在此类土地上种植生长的农作物普遍存在植株长势弱，最终减产的影响。
野生大豆是栽培大豆的近缘种，野生大豆具有良好的抗逆性状，但是由于野生大豆种子小，且植株形态和栽培大豆相比差异较大一般不能直接用于杂交育种。同时，传统的杂交育种需要不断地利用亲本组合，从下一代中选出具有优良抗性的后代进行繁育筛选，这种方法费时费力，工作量非常大。利用现代转基因技术可以快速的将具有确定提高植物耐盐性功能的基因特定导入到栽培大豆中，即可获得具有抗盐性的优良转基因栽培大豆。这种方法简单，快速，具有明显的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于野生大豆的蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐性中的应用。
本发明保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入GsMYB15基因，得到耐盐性高于所述出发植物的转基因植物。所述GsMYB15基因为编码GsMYB15蛋白的基因。所述GsMYB15基因通过重组表达载体导入所述出发植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双子叶植物具体可为大豆。
本发明还保护一种培育耐盐植物的方法，包括如下步骤：增加植物中GsMYB15蛋白的水平和/或活性，从而提高植物的耐盐性。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双子叶植物具体可为大豆。
本发明还保护GsMYB15蛋白的应用，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)调控植物的耐盐性；(Ⅱ)提高植物的耐盐性。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双子叶植物具体可为大豆。
本发明还保护GsMYB15基因、GsMYB15基因的表达盒或GsMYB15基因的重组表达载体的应用，为制备耐盐性提高的转基因植物。所述GsMYB15基因为编码GsMYB15蛋白的基因。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双子叶植物具体可为大豆。
本发明还保护一种提高植物耐盐性的产品，包括：GsMYB15蛋白、GsMYB15基因、GsMYB15基因的表达盒或GsMYB15基因的重组表达载体。所述GsMYB15基因为编码GsMYB15蛋白的基因。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双子叶植物具体可为大豆。
所述GsMYB15蛋白为如下(a)或(b)或(c)：
(a)序列表的序列1所示的蛋白质；
(b)将序列1进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
(c)在(a)或(b)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述标签具体如表1所示。
表1
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
所述GsMYB15基因为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)与(1)具有75％以上同一性且编码植物耐盐相关蛋白的DNA分子；
(3)来源于大豆且与(1)具有90％以上同一性且编码植物耐盐相关蛋白的DNA分子；
(4)在严格条件下与(1)杂交且编码耐盐相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为：在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min。所述严格条件可为：在0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。所述严格条件可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
所述重组表达载体中，具有GsMYB15基因的表达盒。所述表达盒中，启动子包括但不限于组成型启动子、特异性启动子(组织特异性启动子、器官特异性启动子、发育特异性启动子等)和诱导型启动子。所述重组表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端。所述重组表达载体还可包含增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。所述重组载体中还可包括筛选标记基因，例如抗生素抗性基因、编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。从转基因植物安全性考虑，也可以不采用任何筛选标记基因，通过表型筛选转基因植物。所述重组表达载体具体可为以pB2GW7.0载体为骨架且具有序列表的序列2所示的DNA分子的重组质粒。
将GsMYB15基因导入植物并表达后，植物的耐盐性显著增加，本发明对于培育耐盐转基因植物具有重大应用推广价值。
附图说明
图1为GsMYB15基因的相对水平。
图2为分组处理前和完成分组处理后的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
GsMYB15蛋白，来源于野生大豆品种ED059，如序列表的序列1所示。将编码GsMYB15蛋白的基因命名为GsMYB15基因，cDNA中的开放阅读框如序列表的序列2所示。
pGWC载体，为Gateway克隆载体。提及pGWC载体的文献：Huang et al.,Cloningand Expression Analysis of the Soybean CO-Like Gene GmCOL9，Plant Mol Biol Rep(2011)29:352–359。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
pB2GW7.0载体，为Gateway表达载体。提及pB2GW7.0载体的文献：Fibrillin 5IsEssential for Plastoquinone-9Biosynthesis by Binding to Solanesyl DiphosphateSynthases in Arabidopsis。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
哥伦比亚生态型拟南芥，用Col-0表示。
实施例1、转GsMYB15基因植株的获得和耐盐性鉴定
一、重组表达载体的构建
1、以人工合成的序列表的序列2所示的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-AGGCTTTGACTTTAGGTC ATGAGAACTCCATCTTCCTCTCACAA-3’；
R1：5’-GTCTAGAGACTTTAGGTC TCATTGCAATAAGCCCACGTG-3’。
2、采用无缝克隆技术，步骤1得到的PCR扩增产物与载体pGWC发生同源重组，得到具有序列表的序列2所示DNA分子的重组质粒，将其命名为重组质粒GsMYB15-pGWC。
3、重组质粒GsMYB15-pGWC与pB2GW7.0载体进行gateway反应(LR重组)，得到重组质粒GsMYB15-pB2GW7.0。根据测序结果，对重组质粒GsMYB15-pB2GW7.0进行结构描述如下：以pB2GW7.0载体为骨架，具有序列表的序列2所示的DNA分子。重组质粒GsMYB15-pB2GW7.0中，具有草胺膦抗性基因。
二、转基因拟南芥的获得
1、将重组质粒GsMYB15-pB2GW7.0导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌接种至含50ng/L利福平和50ng/L壮观霉素的液体LB培养基，28℃、200rpm振荡培养至OD600nm值为1.2-1.5，然后4000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
3、取步骤2得到的菌体沉淀，用侵染缓冲液重悬，得到OD600nm值为0.6的菌液，即为侵染液。侵染缓冲液(pH5.6)：含5g/100mL蔗糖、0.02％(体积比)silwet77、10mM MES、100μM乙酰丁香酮，余量为水。
4、取哥伦比亚生态型拟南芥种子，用70％乙醇溶液消毒2-3min，然后用10％次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水冲洗5-6次，然后平铺在固体1/2MS培养基上，4℃黑暗条件下春化4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养一周，然后将生长健壮的幼苗移栽到培养土中(每周浇一次液体1/2MS培养基)培养至幼苗抽苔出现花苞(尚未开花)。
5、取步骤4得到的幼苗，花苞倒置浸没于步骤3得到的侵染液中浸泡5分钟，然后用吸水纸吸弃花苞上的侵染液，然后将植株置于黑暗、21℃条件下培养24小时，然后将幼苗转移至16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养，直至收获种子，即为T1代种子。
6、取T1代种子，4℃春化4天后播种于装有灭菌营养土的培养钵中并适量喷水以湿润土壤，然后用塑料薄膜盖上，置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养，待种子萌发后揭开塑料薄膜继续在相同条件下培养至两片子叶打开，此时将0.1g/100mL草胺膦水溶液均匀喷洒在小苗上，然后在相同条件下培养一周，此时存活下来的植株即为抗性植株(T1代植株)。
7、将步骤6得到的抗性植株分株移栽，在16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养，直至收获种子，即为T2代种子。
8、取T2代种子，4℃春化4天后播种于装有灭菌营养土的培养钵中并适量喷水以湿润土壤，然后用塑料薄膜盖上，置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养，待种子萌发后揭开塑料薄膜继续在相同条件下培养至两片子叶打开，此时将0.1g/100mL草胺膦水溶液均匀喷洒在小苗上，然后在相同条件下培养一周，此时存活下来的植株即为抗性植株(T2代植株)。对于某一T1代植株来说，如果其T2代植株的存活株数量与死亡株数量的比值为3:1，存活的T2代植株即为单拷贝插入的植株。
9、将步骤8得到的单拷贝插入的植株分株移栽，在16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养，直至收获种子，即为T3代种子。
10、取T3代种子，4℃春化4天后播种于装有灭菌营养土的培养钵中并适量喷水以湿润土壤，然后用塑料薄膜盖上，置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养，待种子萌发后揭开塑料薄膜继续在相同条件下培养至两片子叶打开，此时将0.1g/100mL草胺膦水溶液均匀喷洒在小苗上，然后在相同条件下培养一周，此时存活下来的植株即为抗性植株(T3代植株)。对于某一T2代植株来说，如果其T3代植株均为抗性植株，该T2代植株为单拷贝插入的纯合植株。单拷贝插入的纯合植株的自交后代，为单拷贝插入的纯合株系。
11、取T3代植株(随机取的4个单拷贝插入的纯合株系)，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，将AtActin2基因作为内参基因，通过PCR检测GsMYB15基因的相对表达量。将重组质粒GsMYB15-pB2GW7.0作为阳性对照(+)。将哥伦比亚生态型拟南芥的总RNA的cDNA作为阴性对照。将无菌水作为空白对照(-)。以哥伦比亚生态型拟南芥中GsMYB15基因的相对表达量为1，计算在各个T3代植株中GsMYB15基因的相对水平。
用于检测GsMYB15基因的引物对如下：
F2：5’-CCCAACATAAAAAGAGGGAAC-3’；
R2：5’-GGGACAAAGGGACAGAATCAG-3’。
用于检测AtActin2基因的引物对如下：
F3：5’-GGATCTGTACGGTAA-3’；
R3：5’-AACCACCGATCCAGACACTGT-3’。
GsMYB15基因的相对水平见图1。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，4个单拷贝插入的纯合株系的T3代植株中的GsMYB15基因的表达量有显著的增加。
将上述4个单拷贝插入的纯合株系，分别命名为GsMYB15-OE1株系、GsMYB15-OE2株系、GsMYB15-OE3株系、GsMYB15-OE4株系。
三、转空载体拟南芥的获得
用pB2GW7.0载体取代重组质粒GsMYB15-pB2GW7.0，其它同步骤二，得到转空载体株系。
四、转基因拟南芥的鉴定
待测种子为：GsMYB15-OE2株系的T4代种子、GsMYB15-OE3株系的T4代种子、GsMYB15-OE4株系的T4代种子、转空载体株系的T4代种子、哥伦比亚生态型拟南芥种子。T4代种子即T3代植株自交获得的种子。
在装有灭菌营养土的培养钵(底部有通孔)中播种并培育待测种子，幼苗萌发4周后进行如下分组处理：
第一组：利用150mM NaCl水溶液处理7天；
第二组：利用250mM NaCl水溶液处理7天；
利用NaCl水溶液处理7天的方法为：将生长有幼苗的培养钵转移到装有NaCl水溶液的培养盘中(NaCl水溶液浸没培养钵底部的通孔)，放置7天。
分组处理前和完成分组处理后的照片见图2。图2中，A为分组处理前的照片，B为第一组分组处理后的照片，C为第二组分组处理后的照片。150mM NaCl水溶液处理7天后，哥伦比亚生态型拟南芥存在黄化萎蔫等现象，GsMYB15-OE2株系、GsMYB15-OE3株系、GsMYB15-OE4株系的植株均长势良好，转空载体株系植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥一致。250mM NaCl水溶液处理7天后，哥伦比亚生态型拟南芥均死亡，GsMYB15-OE2株系、GsMYB15-OE3株系、GsMYB15-OE4株系的植株中仍有大量植株存活，转空载体株系植株均死亡。
第二组处理后的存活率(100株植株的平均值)结果：哥伦比亚生态型拟南芥的存活率是0；转空载体株系植株的存活率是0；GsMYB15-OE2株系植株的存活率是42％；GsMYB15-OE3株系植株的存活率是49％；GsMYB15-OE4株系植株的存活率是57％。
结果显示，过表达GsMYB15基因可以增加植株的耐盐性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种来源于野生大豆的蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐性中的应用
<130> GNCYX181452
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 313
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 1
Met Arg Thr Pro Ser Ser Ser His Lys Ser Gly Leu Asn Lys Gly Thr
1 5 10 15
Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ala Lys Leu Ile Ala Tyr Ile Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Ser Trp Asn Trp Arg Gln Leu Pro Arg Phe Ala Gly Leu Ala Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asn
50 55 60
Ile Lys Arg Gly Asn Tyr Thr Lys Glu Glu Glu Glu Ile Ile Ile Arg
65 70 75 80
Leu His Glu Lys Leu Gly Asn Lys Trp Ser Val Ile Ala Thr His Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn His Trp His Thr Thr Leu
100 105 110
Lys Lys Arg Phe Gly Lys Asn Thr Val His Pro Asn Lys Lys Val Lys
115 120 125
Ala Thr Lys Ser Asn Ser Ser Gly Ser Lys Glu Ile Gln Lys Val Gly
130 135 140
Phe Phe His Ser Ser Ser Thr Ile Thr Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ser
145 150 155 160
Val Pro Leu Ser Pro Arg Glu Phe Ser Ser Thr Thr Ser Asp Tyr Thr
165 170 175
Thr Val Val Thr Asn Glu Asn Phe Leu Leu Glu Asp Gly Phe Asp Phe
180 185 190
Leu Glu Ala Cys Leu Glu Asp Val Asn Glu Asn Ile Trp Thr Glu Thr
195 200 205
Asn Ala Ala Ser Ile Ser Asn Ser Lys Thr Pro Met Leu Asp Asn Gly
210 215 220
Asn Gly Ser Asn Phe His Gly Ser Asp Ala Ala Gly Pro Ile Met Glu
225 230 235 240
Tyr Asn Glu Asn Leu Val Leu Glu Asn Asp Glu Phe Ala Phe Leu Glu
245 250 255
Ala Leu Gln Pro Thr Val Thr Thr Glu Asn Phe Leu Thr Asp Met Ser
260 265 270
Leu Val Pro Asn Glu Leu Leu Ala Pro Leu Val Asn Glu Ser Glu Glu
275 280 285
Tyr Phe Ser Ser Leu Tyr Asp Val Asp Leu Trp Cys Pro Ser Asn Phe
290 295 300
His Asp Leu His Val Gly Leu Leu Gln
305 310
<210> 2
<211> 942
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 2
atgagaactc catcttcctc tcacaaaagt ggacttaaca aaggcacttg gactccagag 60
gaagatgcca agttaatagc ttatatcact cgttatggct cttggaattg gcgccaactc 120
ccaagatttg caggactggc aaggtgtgga aagagctgca ggcttaggtg gctaaattat 180
ctcaggccca acataaaaag agggaactat actaaagaag aagaagagat tataatcaga 240
ctgcatgaaa agctgggtaa caaatggtct gtgattgcca ctcatttacc cggaagaaca 300
gataacgaaa taaagaacca ctggcacacc actctcaaaa aacgttttgg aaagaacaca 360
gttcacccca ataaaaaagt gaaagccaca aaatcaaata gttctggatc caaggaaatt 420
cagaaagttg gtttctttca cagtagttct acaataacaa cttctgaaac ctctgattct 480
gtccctttgt ccccaagaga attctcgtcc acaacctcgg actataccac agttgtcact 540
aacgaaaatt tcttactgga agacgggttc gattttctag aagcatgctt agaggacgtg 600
aacgagaata tttggacaga gacaaatgca gctagcattt ccaattccaa gaccccaatg 660
ctagataatg gtaatggtag taattttcat ggttcagatg ctgcagggcc catcatggaa 720
tataacgaaa atttggttct ggagaatgat gaatttgcgt ttctagaagc attgcagcca 780
acagtaacaa ctgagaattt tttgacagac atgtcccttg ttccaaacga attacttgcc 840
cctttggtga acgaatctga ggaatacttt tcttccttgt acgatgtgga cctttggtgt 900
cccagtaatt tccatgattt gcacgtgggc ttattgcaat ga 942

Claims (3)

1.GsMYB15蛋白的应用，为提高植物的耐盐性；
所述GsMYB15蛋白为序列表的序列1所示的蛋白质；
所述植物为拟南芥或大豆。
2.GsMYB15基因、GsMYB15基因的表达盒或GsMYB15基因的重组表达载体的应用，为制备耐盐性提高的转基因植物；
所述GsMYB15基因为编码GsMYB15蛋白的基因；
所述GsMYB15蛋白为序列表的序列1所示的蛋白质；
所述植物为拟南芥或大豆。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述GsMYB15基因为编码区如序列表中序列2所示的DNA分子。
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